TW520297B

TW520297B - Fusogenic liposome composition and method

Info

Publication number: TW520297B
Application number: TW086114833A
Authority: TW
Inventors: Francis J Martin; Samuel Zalipsky
Original assignee: Sequus Pharm Inc
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2003-02-11
Also published as: JP2001504093A; IL129292A0; WO1998016202A3; AU715063B2; WO1998016202A2; EP0932391B1; CA2267904C; EP0932391A2; DK0932391T3; HK1047550A1; AU4987897A; CA2267904A1; PT932391E; ES2191833T3; ATE232086T1; BR9712230A; DE69718924D1; US5891468A; DE69718924T2

Description

520297 Λ7 B7 五、發明説明（1 ) 1明領域本發明是有關將作用物遞送至細胞胞質部份之融合性脂質體组合物，及與之相關之方法。參考文獻

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Zhang, Z., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 8 8:10407-10410 (1991)。 -5- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX2()7公慶） 520297 五、發明説明（3 Λ 7 "Τ ^ / 經濟部中央標準局員工消費合作社印製發明許多化合物之治療益處受限於化合物爲/曰、攝取，或於攝入後化合物；έ A、·、、Τ、细胞低量之田月良内Jf解。一.^ 最大的治療益處，總希望將， ’又而T，爲達 ^ , 知化合物遞送至細胎；所、 '、中進行著mRNA之轉譯作用及蛋白m 貝玄’ 接之連擊。對件彡j、Μ i ' 且與核有直逆泎夕小的未*電化合物，可有相當有效率之吸收。炊r Λ胞膜使細胞 ^ 然而，對各種大及/戈苻兩仆物而言，如蛋白質，核酸，、、，及何私化、 _ 及南度水溶性荷電有機仆物，經由穿越細胞膜之被動攝取較受限。改進此化合物攝入細胞，已有許多方法被提出。例如藥物可以經修飾或前藥型式投予以轉運至細胞，再於細内行酵素轉化成爲活性型式。另外，也可採用呑噬作用或細胞·攝粒作用，其中含有物之粒子爲細胞所捲入。然而，此方式受限於某些細胞式，如吞噬作用限於單核細胞系及其他某些骨髓樣細胞如a中性球’且知粒作用限於間質細胞，如囊内皮細胞纖維母細胞。此方式的另外限制是在正常的細胞内處理飾過程中，粒子曝於酸性内囊胞/溶酶體室，及降解酵之宿主，包括蛋白酶，脂酶及核酸酶，造成治療性化合物之降解，除非將自此處理修飾中逃脱之方式遺傳操作至統之内。又將藥物加強攝入細胞的另一方式是使用融合性粒子其經設計可與標的細胞之表面細胞膜融合，將粒子内釋入細胞之胞質室内。經失活且再重構之病毒粒子已合合胞藥型及修素系容物被建 ]i ?rw5i I! -. 1— I i 請先_讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--- 4. -6 ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公慶）經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 520297 A7 --_____B7 五、發明説明（4 ) 議應用於此目的，特別是在基因治療中，此中大的核酸股被引入細胞中。由融合一促進性病毒蛋白質，其包埋在人造脂質雙層膜内，所組成之類病毒粒子爲另一實例。然而，安全性考量及和病毒組份生長，分離及失活等有關之費用限制了此一途徑。登明要點本發明於一方面是有關可與細胞之標的膜，脂質體等融合之脂質體組合物。組合物中包括有脂質體之懸液，其經 «又计可對準標的膜。各脂質體含有治療劑包陷於脂質體内，外脂質體表面則有化學可釋出之親水性聚合物鏈包衣’在爿曰、體外表面有疏水性聚合物。聚合物最初由親水性聚合物外衣所遮蔽，再曝露後於親水性聚合物外衣被化學性釋出時與標的膜融合。親水性聚合物及疏水性聚合物較好形成二段的共聚物，其中二個聚合物組份以化學可釋出鍵連接，如雙硫键，對 PH敏感之鍵，酵素可解離之鍵，或光化學可解離之鍵。當脂質體經設計有延長的血液環時間時，親水性聚合物外衣較好由以下之聚合物鍵所組成，包括：聚乙二醇，聚乙烯吡咯啶酮，聚乙烯曱醚，聚曱基噁性啉，聚乙基噁唑琳’聚每基丙基噁唑啉，聚羥基丙基異丁烯醯胺，聚異丁晞I胺，一甲基丙晞臨胺，聚輕基丙基異丁晞酸g旨，聚务基乙基丙烯酸酯，輕基甲基纖維素，幾乙基纖維素，聚乙二Sf·或聚天冬醯胺。聚合物鏈具有介於約5〇〇_1〇,〇〇〇道耳吞間之較佳分子量。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A#規格（21 〇 X 297公;$ ) (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 訂 520297 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ 7 Β7 五、發明説明（5 ) 疏水性聚合物較好是聚氧丙晞，聚乙烯，聚丙晞，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚颯，聚苯醚或是聚氧丁撑。聚合物鏈具有500-3,000道耳呑間之較佳分子量。較好，疏水性聚合物是可有效造成血液細胞溶血之線性聚合物，此係當含有疏水性聚合物及親水性聚合物鏈經由雙硫鍵連接至疏水性聚合物鏈相反端之水溶性三段共聚物與細胞共培育時，且培育物以還原劑處理。組合物可進一步含有未遮蔽配位體，粘附至親水性聚合物外衣上，使配位體可有效且特異地結合至標的細胞表面之受體分子，此係在親水性聚合物外衣被化學釋出之前。示範例，此未遮蔽的配位體可爲⑴葉酸鹽，其中組合物可以治療具有細胞表面葉酸鹽受體之腫瘤細胞，（ii) ?比今基，其中組合物可以治療爲毒感染之CD4+淋巴細胞，或 (iii)唾液基Lewisx，其中组合物可治療發炎區域。另外，或額外的，組合物可進一步包括枯附至脂質體之經遮蔽配位體，其僅在親水性聚合物包衣被化學釋出後才可有效地與標的細胞表面受體分子結合。在相關具體貫例中’月曰貝骨豆含有經遮蔽的陽離子性脂質，可有效地授予脂質體表面之正電荷，且僅在親水性聚合物外衣被化學性釋出後才可加強脂質與標的細胞之結合〇欲遞送之作用物可爲可表現所選定蛋白質之聚核答酸 (當爲標的細胞所吸收），經設計可與在標的細胞中之特異一序列核酸結合之寡核菩酸或寡核苷酸同系物，或其他任 -8· 本纸張尺度適用十國國家標準（Gvs ) A4規格（2丨〇：<297公^ ---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

520297 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ 7 ----------Β7 五、發明説明（7 ) 配合附圖將可更加了解。附圖説曰1 圖1示出依據本發明一個具體實例所製備之脂質體；圖2 Α及2 Β示出可用於本發明之二段共聚物脂質共扼物；圖3示出加有粘附之配位體之囊-形成脂質；圖4示出製備PEG-PP〇-PEG三段共聚物之反應流程；圖5説明許多-S-S鏈結及其爲親核劑解離的相對感受性。圖6説明製備甲氧基PEG及pp〇之二段共聚物脂質共軛物之反應流程，其經由雙硫鍵結共價鏈結並粘附至二硬脂醯基；圖7説明製備甲氧基聚乙二醇（mPEG)及聚氧丙烯（pp〇): 段共聚物脂質共軛物之反應流程，共經由雙硫鏈結共價連接並粘附至囊-形成脂質之二硬脂基磷脂醯基乙醇胺；圖8A-8B示出製備mPEG及PP0二段聚合物的另一反應流程’其經由雙硫鏈結共價連接並枯附至二酸基脂質·，圖9示出鏈結mPEG及PP0聚合物片段之不穩定的雙硫鍵；圖10A-10B示出粘附葉酸（圖i〇A)及吡哆醛（圖1〇B)至官能化之聚乙二醇再粘附至二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺之反應流程；及圖11A-11B是將脂質體/質體複合物於活體内投予至老氣後在肺（圖11A)及肝（圖11B)中每毫克蛋白質之相對蟲螢光素酶單位（RLU)之繪圖，其中脂質體有聚乙二醇之外表面 -10- (請先M讀背面之注意事V15再填寫本頁)

、1T 1- —1 ·:1 fm nn m 曝本紙張尺度適用中國國家榡举（CNS ) Λ4規格（210X：W公釐） 520297 A 7 --W —_ 五、發明説明（9 ) 〜一—~ 請先閱讀背面之>1意¥項再填寫本頁) 共聚物脂質共軛物2 0之遠端，其含有一個囊-形成脂質部份2〇a，及一個二段共聚物部份20b。依次，二段共聚物部份20b由疏水性鏈2 2所组成，其在近端共價鍵結上脂質部伤2〇a之極性頭基。疏水性鏈2 2在遠端經由化學可釋出鍵 2 4 ’結合上親水性聚合物鏈1 6。相反的，親水性1 8經由化學可釋出鍵2 8，直接連接上囊-形成脂質2 6之極性頭基。如上文所示的，親水性聚合物鏈，如共軛物2 〇中之片段 1 6 ’係包含在脂質體1 〇中，成爲囊-形成脂質二段聚合物邵份中的一部份，位於脂質體之外表面。應了解，在二段共扼物中之親水性聚合物，其作用是加強所連接之疏水性鏈之水溶性，預防疏水性鏈分配在脂質體雙層區域時脂質體膜之不穩定性。如下文所示，此種不穩定性對於促進脂貝眼/細胞膜融合上是有益的，但在融合之前，即脂質體貯存，投藥及生物分佈於標的位置期間，此點則是不希望發生的。以下將討論達到這些作用適合之親水性及疏水性片段型式之分子量。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝除了其在’’增溶溶解”疏水性鏈，及防止其與其他雙層膜有父互作用之角色外，親水性鏈較好有充份的表面密度，以生成可有效且實質避免血清蛋白質與脂質體表面交互作用之分子障壁。如此，親水性鏈之外衣可有效地延長脂質體在血流中之循環時間，由數小時延長至數天。在後一具貝例中’存在於脂質體外脂層之親水性鏈含量較好相當於脂質體表面脂質之約；μ2〇莫耳百分率，低分子量聚合物如 -12- 尺度制 t s --- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 五、發明説明（i〇 ) 5 0 0道耳呑以較南备度存在’如2 0莫耳百分率，而較高八子量之聚合物鏈，如10,000道耳吞以較低密度存在，如1_5 莫耳百分率。疏水性鏈之百分率，即在脂質體中二段脂質共軏物之百分率’通常在含有共軏親水性聚合物之總表面脂質之約5 100%。因此例如在含有5莫耳％親水性聚合物脂質體一表面脂質及50%二段脂質共軛物之脂質體調和物中，疏水性聚合物占表面脂質之5 0 % X 5 %，或2 · 5莫耳％。脂質體1 0可進一步包含有未遮蔽的表面配位體，如配位體3 0，以將脂質體對準特異的標的膜-例如對準異的組織區域或細胞型式，或對準攜有適當的表面受體分子之脂質體或平面膜。如圖2 B最佳所見，配位體分子3 〇攜於親水性聚合物鏈3 2之遠端，如在圖丨所述型式之二段共聚物脂質共軛物34中之鏈。將配位體共軛至親水性聚合物鏈遠端之方法是熟知的。在將親水性鏈自脂質體中移去之前，配位體置於聚合物鏈遠端處或近處之安排，即不爲親水性聚合物外衣所遮蔽，使得配位體可與含有配位體一特異的表面受體之標的細胞交互作用。除了才述之脂質體組份之外，脂質體可進一步含有一種以上的脂質體-表面組份，其被遮蔽使不與標的細胞交互作用直到親水性聚合物移去之後。在一個一般具體實例中，並參知、圖1及3，被遮蔽的組份是一種配位體，如配位體3 6，並偶合至囊-形成脂質4 〇之極性頭基3 8上。配位體之目的疋在親水性聚合物外衣被移去後可與細胞受體特異 -13- L張尺度適用t國i家操準（CNS ) Λ4規格~*---- 請先閲讀背面之注意事項再填寫木頁} -訂 520297 Λ 7 Β7 五、/發明説明（11 經濟部中央標準局員工消费合作社印製地結合，以強迫脂質體可盘仏πΑϊ ν η 貝把了與細胞扠接近，加強脂質體上疏水性聚合物鏈與標的_細胞脂質雙層之交互作用。另外’或疋I付加地，被遮蔽的表面組份可包括具有正電荷極性基之囊-形成脂質，如圖1中之42。於脂質體生物分佈至標的位置期間’月旨質體表面上之正表面電荷爲親水 =衣所遮蔽。在親水性外衣被移去後，在脂質體表面正黾兩及標的細胞負電荷間士轉命丄 ^ 仃間< ^电父互作用可將脂質體更爲罪近細胞，並促進由疏水性聚合物鏈最後，可製備脂質體以本有μΑΑ 曰貝也以3有一種以上的治療或診斷劑，其作用可遞送至標的細胞位置。…所用的，治療或診斷劑’化合物及藥物可互換使用。作用物可包陷在脂質體〈内部水性室中或在脂質雙層中，依其本質而定。供示範之治療劑述於下。 A ·囊-j彡成脂質組份本發明二脂質體組合物主要由囊，成脂質所組成。此一郅U)了自王地在水中形成雙層囊，以磷脂馬例’或⑻穩定地納入脂質雙層，其中疏水性部份盘雙層 :=丄疏水性區域接觸，且其頭基部份方向對著膜的外側極性表面。此型式之囊.形成脂質較好具有二個烴鏈（典型地是酿基 ,)+及固θ基，可a極性或非極性。有各樣的合成石夕囊-形成脂質及自然生成的囊形成脂質，包括磷脂自，如磷脂臨基膽驗，嶙脂醯基乙醇胺，❸旨酸，靖脂醯基肌醇及神經朝崎脂’其中：個烴鏈通常長约14_22個破原子，且有 (讀先閱請背面之泛意事項再填寫本頁) - ίί k 訂 ' -14 本紙張尺度適用t國M規格（ 210:><297公免、, 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 A7 ~7—___ B7 五、發明説明（12 ) '一^ 不1的不鮑和程度。具有不同飽和程度醯鏈之上述的脂質 =外爿曰可買得到或依據已發表之方法製備。其他適合的脂貝包括糖脂及固醇類，如膽固醇。庐I應用於本發明的較佳二醯基鏈脂質包括二醯基甘油，外月曰駚基乙醇胺（ΡΕ)及磷脂醯基甘油（PG)。這些脂質在充 ^襄-形成脂質上較佳（即主要的脂質體組份），且可用於水a物-爿曰質二段共軛物，及直接連接至親水性聚合物鏈 <脂質’其一起較好包括在脂質體外層中，莫耳濃度比例介於約1-20莫耳％之間。另外，囊-形成脂質之選擇是達到特異的流動性或剛性私度’以控制血漿中脂質體之穩定性及控制脂質體中包陷別 < 釋出率。由囊形成脂質所決定之脂質體之剛性，在脂貝體與標的細胞融合之中也扮演重要角色，此點在下文中將詳述。將具有相當剛性之脂質，如具有相當高之相轉變溫度 (如问達6 0 C )之脂質，納入其中可達成具有較剛性脂質雙層或液態結晶雙層之脂質體。剛性的，即飽和的脂質可使月曰雙層更具膜剛性。其他的脂質組份，如膽固醇，也已知可使脂質雙層結構更具膜剛性。在另一方面，將具相當流動性的脂質納入也可達到脂誓流動性’通常是其脂質相具相當低的液體之液-晶相轉變溫度，如室溫以下，之脂質。在本發明的一個具體實例中，脂質體由相當剛性之脂質所製備，以對脂質雙層提供剛性。在此具體實例中，形成 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準（〇阳）八4钱1格（210>< 297公焓；~~' --- (請先聞讀背而之注意事項再填寫，\4頁)

520297 A 7 B7 五、發明説明（13 脂質體之脂質具有介於約37-42Ό之相轉變溫度。於較佳具ta實例中，形成囊之脂質爲二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼 (DSPC)，其具有42°C之相轉變溫度。在本發明另一具體實例中，形成雙層囊（即脂質體）之脂質可有效地授予正的脂質體-表面電荷。此脂質包括稱之爲陽離子脂質者，其具有親脂性部份，如固醇，醯基或二酿基鍵’且其中脂質有整體而言之淨正電荷。較好，脂質 (頭基攜有正電荷。供示範之陽離子脂質包括丨，2_二油基氧基-3-(三甲胺基）丙烷（D〇TAp) ; N-l>(2,3_雙十四碳氧基) 丙基]-Ν，Ν-二甲基羥基乙基銨化溴（DMRIE) ; N-[k(2,3_ 一油基氧基）丙基>Ν，Ν_二甲基_N-羥基乙基銨化溴 (DORIE)，N-[l-(2,3-一油基氧基）丙基三甲基按化氯（DOTMA) ; 3々[N_(N’，N，·:甲胺基乙垸）胺甲醯基]膽固醇（DC-Chol);及二甲基雙十八基銨（DDAB)。陽性的囊-形成脂質也可爲中性脂質，如二油醯基磷脂醯基乙醇胺（DOPE)或兩性脂質，如磷脂，以陽離子性脂質何生化，如聚賴胺酸或其他的聚胺脂質。例如，中性脂質 (DOPE)可以聚賴胺酸衍生化以形成陽離子性脂質。 B · _可釋出之聚合物外衣、經濟部中央標準局員工消費合作社印製如上述，亲見水性I合物外衣之形成係i少在脂質體之外脂質層中包括囊-形成脂質共軛物，其中含有如圖2八所示型式t二段式共聚物共軛物，及視所需的，如圖3所示之直接連接至囊-形成脂質頭基之親水性聚合物。可用於共軏物中之適合的親水性聚合物，其中聚合物也 -16 本纸張尺度適用中國國家iifr準（CNS ) A4規格（210X297公趋 520297 Λ 7 37 缠濟部中央榡準局員工消t合作衽印製五、發明説明（14 ) 欲以延長脂質體-循環時間’包括有··聚乙缔心錢，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，$乙基噁唑啉，聚羥基丙基噁唑啉，聚羥基丙基異丁晞基醯胺，聚異丁晞基醯胺，聚二異丁蹄基《，聚丙基異丁晞酸鹽，聚經基乙基丙晞酸鹽，羥甲基纖維素，羥乙基纖維素，聚乙二醇，及聚天冬醯胺。於較佳具體實例中，親水性聚合物是聚乙二醇，較好呈具有500-10,000迢耳呑間分子量之pEG鏈，通常爲介於 1，000-5,000道耳呑。、由親水性聚合物鏈所提供的脂質體上之表面外衣可提供膠體穩定性，且在充份的聚合物表面密度下，可保護脂質體免於爲網狀内皮系所吸收，提供脂質體有延長之血液循環壽命以到達標的細胞。如所共有的美國專利案ν〇· 5,〇13,556中所述一般，血液循環時間加強之程度較好是盔來合物外衣下所達成的數倍之多。以下描述製備二段且直接連接之脂質-親水性聚合物共軛物之方法。 C ·藏水性物如上文所述，融合性脂質體中包括有疏水性聚合物，以足進知貝體與標的細胞膜間之融合。疏水性聚合物包括在月旨質體中呈二段式共聚物脂質共軛物的一部份，且直接枯附至囊-形成脂質之頭基，如二醯基-鏈脂質，在下文中將參照圖6-8所示説明（實例2-4)。適用於二段式共聚物-脂質共軛物中共聚物中之疏水性聚合物實例包括聚氧丙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯， 17-

•丨士-- !1 i— · 許先閱讀背面之注:s事項再填言£.言C 訂

I 1·—11 --i-·— 1- -I I 木紙張尺度適财關家標準 (CNS ) A4规格（210x 297公犛：， 520297 五、發明説明（15 聚苯乙烯，聚砜，聚苯醚以及聚合物具有1〇〇-5，_道耳呑間之分撑。、較好’疏水性聚耳呑之間。里’較好是500-3,000道於-個較佳具體實例中，疏水 (PPO)，具有500_3,000道耳呑間之分子=物疋聚氧丙晞決定疏水性聚合物及適用於里分子量之方法，述於本發明另—方^1合性脂質體中之出之疏水性聚合物與標的膜之融在：万法中，所選性聚合物片段與疏水性聚合物：：二其：定係將親水 ==聚t物片段以如下述之可釋出鏈結連接至疏、、 '咖。二段共聚物加至標的細胞（如紅色球）之懸履中。、經由可釋出鏈結之解離，親水性聚合物片段可自疏水性片段中釋出，將疏水性片段曝於標的細胞之外膜。標的細胞再進行溶解分析，如紅血球之溶血。融共溶酯）經濟部中央標率局負工消費合作社印製實例1描述製備三段式共聚物以決定疏水性聚合物之合活性。如貫例1及圖4所示，由PPO及PEG組成的三段聚物’其製備是將甲氧基聚（乙二醇）胺，（化合物丨）與於二甲替甲醯胺（DMF)中之過量的二硫雙（琥珀醯基丙酸晒 (DTSP，化合物π )反應形成中間物mPEG-DTP-OSu(化合物 III)。PPO-二胺（化合物I V)與略過量的mPEG-PP〇-mPEG (化合物III)反應形成經二-PEG化之PPO產物（化合物V )，物如mPEG-PPO-mPEG，其中聚合物段以可解離之二硫化鏈結連接。係如實例1 C所述，測試此三段共聚物之融合促進活性， -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 520297 Λ7 ____ __37 五、發明説明（16 ) —^ 溶解聚合物於食鹽水中，再將其加至紅血球懸液中。加入二硫異赤絲藻醇（DTT)以還原雙硫鏈，釋出親水性聚合物片段，再將疏水性聚合物曝於紅血球下。樣品培育，且 PPO之溶血活性由光密度或其他適合的技術分析細胞之溶血以決定PPO之溶血活性。應了解，標的細胞可爲生物性細胞，如紅血球，脂質體或平面人造膜。脂質體可有包膠之發螢光物或其他在脂質體溶血後適於分析的物質。在篩選方法中之可釋出鏈結可爲化學可釋出之鏈結，對 pH値敏感的鍵結，對光敏感的鏈結，或對熱敏感的鏈結。鏈結經由與適合的刺激物曝露而解離，如化學還原劑，熱，pH値之變化或光。應了解如上述的任何疏水性聚合物可經由適合的末端基化學可釋出地粘附至親水性聚合物。於較佳具體實例中，疏水性聚合物是聚氧丙烯之線形聚合物片段，且親水性聚合物是具有1，000-5,000道耳呑間分子量之聚乙二醇。疏水性聚合物 < 活性及分子量之作用可以此方法容易地篩選。具有高溶血活性之疏水性聚合物可促進融合，且適用於本發明之二段聚合物-脂質共軛物。 D •可釋出之鏈結如上又所述，本發明之脂質體包括可釋出之親水性聚合物鏈之外表面外衣。即，親水性聚合物經由可解離之化學鏈結可釋出地粘附至脂質體。此化學鍵結包括在選擇性生理條件下可被解離者，如在 -19- *^^尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格 (210X29了公釐請先閱讀背面之注意事項再填本頁) 丨訂經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 520297 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 Λ 7 ______ 87__五、發明説明（17 ) 酵素或還原劑存在下。如，酯或肽鏈結可由水解酵素來解離’如酯酶或肽酶，且雙硫鏈可由還原劑解離，如穀胱甘肽’半硫胺酸或抗壞血酸鹽，存在於血槳及細胞内。其他的可釋出鏈結包括對pH敏感之键及曝於光或熱可被解離之鍵。於一個較佳具體實例中，親水性聚合物鏈經由對pH値敏感的键粘附至脂質體，且脂質體對準其pH値可有效解離該鍵之位置，並釋出親水性鏈，如在腫瘤區域。在另一較佳具體實例中，可解離鍵是雙硫键，在此廣義地指含有硫之鍵，如於圖5所示。如圖所示合成含硫之鍵以達到選定程度之不安定性，並包括二硫化物鍵，混合的硫化物-砜鍵及硫化物-亞颯鍵。在三種鍵中，二硫化物鍵最不受硫解作用影響，而硫化物-亞颯鍵最可感受此作用。此種鍵可用於修整親水性聚合物片段自脂質體表面之釋出速率。如’對於對準血球細胞或内皮細胞之脂質體，以極不足4的雙硫鍵爲較佳，因爲這些細胞易趨近且需有較短的脂質體血液循環壽命。在另一方面，當脂質體對準的是腫瘤組織時，以長效或較強壯的雙硫鍵爲較佳，此點在發炎位置或感染位置，皮膚或其他器官，及周邊淋巴組織亦然。在這些例子中，脂質體達到欲求的標的通常需要較長的脂質體血中循環壽命。將親水性聚合物鏈粘附脂質體之可解離鍵，通常由於環境之變化所放於活體内解離，如脂質體到達一個pH値略低 _ 20 - ϋ張尺度適用中國國家標^ 規格（210 x 297公势)：~ -- (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁 Γ 、言 W .......- - Is 1 二 ', s -I In 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 A 7 B7 五、發明説明（18 ) " ^特異位置，如腫瘤組織區域，或在還原條件下之位置，如缺氧之腫瘤。活體内之還原狀況也可經由投予還原劑而達成，如抗壞血酸鹽，半胱胺酸或穀胱甘肽。可解離的鍵也可反映外來剌激而打斷，如光或熱。在進行研咒以支持本發明的下文中，製備具有聚乙二醇可釋出之表面外衣之脂質體，其中聚乙二醇鏈經由不安定的雙硫鍵枯附至脂質體。脂質體在還原劑配合下投予至老乳以達成合物鏈之釋出。老鼠肺及肝之組織分析顯示，可釋出親水性聚合物外衣以達到脂質體在這些器官中之滯留。 E .座位體分子如上示，本發明的脂質體包括未被遮蔽（表面曝露出來） <配位體’其可與標的細胞膜上之特異細胞表面受體有效地結合。配位體分子攜於親水性聚合物鏈上，其經由共價粘附至二醯基脂質而固定至脂質體上。親水性聚合物鏈可經由傳統鍵結共價粘附至脂質體_鍵結之脂質上，如不可逆的粘附，或經由化學可釋出之鍵，如上文所述。通用於對準本發明之脂質體至特異細胞型式之配位體實例列於表1中。 -21 - 本，氏張尺度適;f]中關家標準（) Μ規格（2⑷^297公石 .?i?t閱讀背面之立意事項再填寫本頁)

520297 A 7 87 五、發明説明（19 表1 配位體-受體對及相關之標的細胞配位體葉酸水溶性維生素 p比今基碍酸脱輔基脂蛋白騰島素鐵傳遞蛋白半乳糖唾液基-Lewisx

Mac-1

VEGF

鹼性FGF

EGF VCAM-1 CAM-1 PECAM-1/CD31 纖維網蛋白骨海綿質

基質蛋白質之RGD HIVGP 120/41 或 GP120C4區域肽群 HIV/GP 120/41 (T 細胞熱帶分離物）或 SDF-1化學動素葉酸受體受體

上皮腫瘤，骨髓幹細胞維生素受體 CD4

LDL 胰島素受體鐵傳遞蛋白受體無唾液基糖蛋白質體 E，P選擇素 L選擇素

Flk-1,2 ’GF受體 EGF受體 “4/? 1整合素 L/5 2整合素 v/? 3整合素 β v/? 3整合素整合素 v/? 3整合素 CD4 融合素先間 CD4+淋巴細胞肝細胞，血管内皮細胞内皮細胞(腦）肝細胞活化的内皮細胞嗜中性球，白血球腫瘤上皮細胞腫瘤上皮細胞上皮細胞血管内皮細胞血管内皮細胞血管内皮細胞活化的血小板内皮細胞及在動脈粥樣硬化斑中之平滑肌重瘤内皮細胞胞 CD4+淋巴細胞 CD4+淋巴細胞面注再填寫太頁 έ

訂 I 血管平滑肌肉細 % 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 HIV GP 120/41 (巨电細胞熱帶分離物）抗-細胞表面受體抗體(或其片段）抗細胞表面受體抗體(或段）本紙張尺度適用中國國家標準匕學動素受體CC-CRK-5 巨噬細胞，樹突細胞細胞表面受體紅血球/血小板細胞表面受體如CD-34 骨髓幹細胞 22 CNS ) Λ4規格（2Κ)Χ297公釐經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 Λ7 ---—________ 37 五、發明説明（20 ) 在本發明的一個具體實例中，葉酸配位體粘附至p E 〇 _衍生化之囊-形成脂質，如DSPE，之遠端上。葉酸配位體可有政地與上皮細胞上之葉酸受體結合，以將包陷之治療劑投予至標的細胞，例如，投予贅瘤作用物以治療上皮腫瘤。在另一具體貫例中’將唾液基_Lewisx枯附至PEG-DSPE 並包括在脂質體組合物中，以對準脂質體於發炎部位，較特異地是對準可表現Elam-Ι之細胞。唾液基·Lewis、pEG_ dspe共軛物之製備已有所述（DeFrees，1996)。在本發明另一具體貫例中，將吡哆基配位體，包括吡哆醛，吡哆醇，吡哆胺，吡哆醛5，_磷酸及N-(4、吡哆基）胺，粘附至PEG-DSPE共軛物以將脂質體對準於CD4受體。製備這些配位體共軏物之合成的反應流程述於下文。在另一具體實例中，標的膜是脂質體，且各種受體可納入標的脂質體，以與本發明的脂質體融合。 II·厘_質體製備 A · i釋出聚合物外衣之製備如上文所述，在本發明組合物中之脂質體包括親水性聚合物〈化學可釋出外衣，其中組成外衣之聚合物鍵由可釋出 < 鍵粘附在二段共聚物共軛物上，且視所需經由在囊_ 形成脂質極性端所形成之可釋出鍵。在進行研究以支持本發明之中，製備二段共聚物-脂質共軛物，其中二段聚合物由聚環氧丙烷（pp〇)及曱氧基（聚乙二醇）（mPEG)所組成，經由脂族的二硫化物鍵鏈結，且 -23- ^纸浪尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297^ ； “一^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標率局員工消費合作社印製 520297 Λ 7 Β7 五、發明説明（21 ) ~ ~一-—— 經由ΡΡΟ段枯附至二硬醯基或二硬脂基鱗脂醯基乙_ (DSPE)。這些共軛物之製備分別述於實例2及3。女如實例2所示及圖6中所說明的，溶於四硼酸鉀四水合之半胱胺酸二鹽酸鹽（化合物VII)與“ 咪唑]-基）羰/ 甲氧基·聚（環氧乙院）（化合物VI，依Beaucham二二:_ 1983)混合，且生成的溶液在室溫下攪拌4小時。在此時，’ 落液以6 N HC1調至pH 1，並加氯化鈉至飽和程度。水、容液以氯仿萃取，有機萃取物混合，於硫酸鎂上^燥並= 濾。落劑於眞空下蒸發，且生成之無色凝膠溶於乙酸乙酯中。緩慢地加入二乙醚可生成白色沉澱物，“ _[2_胺基乙基二硫乙基胺甲醯基_ ω _甲氧基-聚（環氧乙烷）鹽酸蹄 (化合物VIII)。 | 在繼續參照圖6下，α，ω -雙（4 '硝基苯醯基碳酸酯卜聚 (環氧丙燒）（化合物IX)依實例2C所述製備，並如實例2〇所述與化合物VIII在TEA存在下反應。經過6〇分鐘反應時間之後’由TLC分析顯示化合物VIII完全消耗，且因此形成主產物之mPEG-S-S-PPO -硝基苯基碳酸g旨（化合物X)及呈次要產物之mPEG-SS-PPO-SS-mPEG。經過在氮下進一步反應時間後，溶劑蒸發且黃色殘留物接受管柱層析以溶離mPEG-S-S-PPO -胺基丙说二Sf·(化合物XI)。化合物X I溶液與硬脂酸及4 -(二甲胺基）吡錠甲苯磺酸鹽在二氯甲坑中及1,3 -二環己基碳化二亞胺（DCC)存在下反應。反應後，過濾及管柱層析，可得綿絮狀白色固體，經鑑知爲mPEG-S-S-PPO-DS(化合物XII)。依據本發明如下， -24- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇〆^^公發) ~ ""一" 哪衣—.—- .請先閱讀背面之注意寧If再填寫本頁} T JI 、-5 !% 520297 A7 B7 五、發明説明（22 ) 此共軛物適用於製備脂質體。實例3描述相似的二段-共聚物脂質共軛物之製備，除了其中的脂質是囊-形成脂質，二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺 (DSPE)。如圖7所述，DSPE(化合物XIII)與雙-硝基苯基碳酸酯聚-環氧丙烷（化合物I X，如實例2 C所述地製備）在 CHC13中反應。將N -經基-S -原福晞-2,3 -二複酸醯亞胺 (HONB)及三乙胺（ΙΈΑ)加至反應混合物中，於進一步反應及處理後（詳述於實例3 A)，可得化合物XIV (DSPE-PPO-對位-硝基苯基胺基甲酸酯）。化合物VIII(依實例2 B所述製備）與化合物XIV在CHC13中反應以形成欲求的mPEG-S-S-PPO-DSPE共軛物，化合物XV(實例3B)。製備mPEG-S-S-PPO-DSPE共軛物之另一反應流程述於實例4，並説明於圖8A-8B。在此，二硬脂基磷脂醯基甘油 (DSPG，化合物XVI)以高破酸鈉（NaI04)氧化，再以聚環氧丙烷二胺（化合物XVIII)還原性胺化以形成胺基-PPO-DSPE (化合物XIX)。依實例1 A所述製備的mPEG-DTP-OSu(化合物III)與胺基-PPO-DSPE(化合物XIX)偶合以形成二段共聚物-脂質共軛物，mPEG-DTP-醯胺基-PP〇-DSPE(化合物 XX)。化合物XX具有PEG之親水性末端段聚合物，及一個至疏水性聚環氧丙烷段之内部可解離之雙硫鏈結，其粘附至末端脂質，DSPE。於上示之實例中（實例2-4)，可解離键是二硫鍵；然而，其他的鏈結也適合，如肽或酯，其可在選擇性生理條件下解離，如肤酶或醋酶存在下。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29?公釐） ¾¾.¾讀背νδ之注意事項耳填寫本頁 .kr 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 A 7 ________S7 五、發明説明（23 ) 如上文所述，可合成雙硫鍵結以變化對還原作用之感變性，以整修親水性聚合物外衣之釋出速率。圖9示出合成聚合物脂質表面劑分子之反應流程，其中二段聚合物片段 (PEG及PPO)以不安定性增加之雙硫鍵連接。mPEG-SH(化合物XXI)及Ellman’s試劑（化合物ΧΧΠ)反應，如實例5所述，以形成mPEG-3-羧基-4-硝基酚二硫化物（化合物 XXIII) 〇此化合物與依實例4 A所述製備之胺基-PPO-DSPE (化合物XIX)及二環己基碳化二亞胺（化合物XXIV)反應。二段共聚物脂質共軛物（化合物XXV)具有一個末端mPEG 片段，其經由一個對硫解作用感受性增加之可解離的含硫鏈結連接至PPO片段。此共軛物（化合物XXV)可如實例8所述用於脂質體之製備及活體内測試。 B .配位體至親水性聚合物之粘附如上文所述，在本發明的一個具體實例中，於融合性組合物中之脂質體包括一個配位體，其使脂質體可對準所選擇之細胞型式，或含有適當受體之另一脂質體。配位體經由共價粘附至脂質-固定的親水性聚合物鏈之自由態遠端而結合至脂質體。在本發明的一個具體實例中，親水性聚合物鏈是PEG，且將配位體粘附至peg鏈遠端的許多方法也已描述（Allen, Zalipsky (1993), Zalipsky (1994), Zalipsky (1995a), Zalipsky (1995b))。在這些方法中，mPEG的惰性末端甲氧基以適於共軏反應之反應性基取代，如胺基或醯胼基。末端官能化之PEG粘附至脂質，通常是DSPE。在脂質體形成中應用經 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公廣）聲衣！許先閱讀背面之注意-F項再填寫本頁：訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 A 7 B7 五、發明説明（24 ) 苢能化之PEG- DSPE衍生物，且在脂質體形成之前或之後’將欲求之配位體粘附至pEG鏈之反應性末端。 —ί · 請先閲讀背面之注意事項再填寫\4頁: 表1 (上文討論）列出可用於脂質體組合物之供示例配位體。經由實例，圖10A-10B分別示出將葉酸及吡哆基粘附至PEG-衍生化DSPE遠端之反應流程。葉酸是分子量44 1道耳呑之造血維生素（化合物χχνι)。葉酸結合至葉酸受體，也已知爲膜葉酸結合蛋白質，其爲種膝蛋白貝具有涉及受體-I周介之細胞攝粒作用之受體的某些特性。受體可在葉酸-耗盡之組織培養細胞表面上有最大的表現，且負責5 -甲基四氫葉酸在這些細胞之胞質中之高親和力累積（Rothberg)。也有報告指出，在某些癌細胞上葉酸之南親和力受體被大大地加豐（Lee)。經由枯附至脂質一固定之親水性聚合物鏈而納入脂質體之葉酸配位體，可使脂質體對準至該癌性細胞。經濟郎中央標隼局員工消費合作社印製葉酸對DSPE-PEG共軛物之粘附述於實例6，並於圖10A 中説明。葉酸與胺基- PEG-DSPE(化合物χχνΐΙ，依 Zalipsky (1994)所述製備）混合，並在Ν -羥基- S-原福晞-2,3-二叛酸醯亞胺（11€^6)及二環己基-碳化二亞胺（〇(^)存在下反應，以形成葉酸- PEG-DSPE共軛物（化合物 XXVIII)。此共軛物在脂質體製備之中包括在脂質混合物中以形成包括有葉酸標的配位體之脂質體。圖10B説明粘附叶t吟酸至酿肼，活化的PEG-DSPE。已研究吡哆酿及相關同系物於有助生物活性化合物運送（Zhang) 及於AIDS治療（Salhany)之研究。於AIDS治療中，p比哆酸 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21〇X2l)7公楚） ____ 37 ____ 37 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 Λ7 五、發明説明（25 ) 5、磷酸結合至CD4蛋白質，即在τ -輔助細胞上之HIV-1受體。ρ比哆酸5、鱗酸以每莫耳蛋白質約1莫耳Ρ比哆酸5，-騎酸之計量化學略結合至可溶CD4蛋白質。此親和力及對準 CD4蛋白質之特性，可用於AIDS治療中線脂質體對準Τ細胞之用。吡哆酸（化合物XXIX)至醯肼活化之PEG-DSPE(化合物XXX)之粘附已述於實例7及示於圖1〇b中。至於另一實例，配位體唾液基_Lewisx粘附至PEG-DSPE，並納入融合性脂質體組合物中。發炎可造成血管内皮細胞表面上多肽-内皮白血球粘附分子_1 (ELAM-1或 E -選擇素）之表現’其鄰近發炎位置。依序地，el AM-1可確3忍及結合嗜中性球表面之多酷部份，唾液基_Lewisx，並使嗜中性球再回至發炎位置。唾液基-Lewisx可使脂質體對準表現ELAM-1之細胞，以遞送治療劑。唾液基-Lewisx_ PEG- DSPE衍生物之製備已有所述（DeFrees)。參見圖1及圖3所述，脂質體視所需含有配位體，經由與表面脂質組份粘附結合至脂質表面。此配位體最初爲親水性表面外衣所遮蔽以兄與標的細胞交互作用，直到親水性聚合物移去之後。一般而言，此配體與囊_形成脂質之極性頭基偶合，且對於配位體與脂質之粘附已有各種方法描述〇於一個車父佳方法中’親和力部份經由下述之偶合反應偶合至脂質，以形成親和力部份-脂質共軛物。此共概物加至脂質溶液中以形成脂質體，下文將加以描述。在另一方法中，將經活化以共價粘附親和力部份之囊-形成脂質納 -28- 本紙張尺度適用十國國家標進（CNS ) A4規 -— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 A7 —-----___ B7 . 五、發明説明（26 ) 一入脂質體中。所形成的脂質體曝於親和力部份，以達成親和力那份與經活化脂質之粘附。在製備由親和力部份及囊-形成脂質所組成之共軛物上有各種方法可應用。例如，水溶性含胺之親和力部份可共仏枯附至脂質，如磷脂醯基乙醇胺，係將含胺部份與脂質反應’後者已經過衍生化含有N -羥基琥珀醯亞胺之活化酯。至於另一實例，生物分子，且特別是大的生物分子如蛋白質’可依據所報告之方法偶合至脂質。其一方法涉及脂貝上（通常是5粦脂）酸基及親和力部份之一級胺基酸間之 Schiff-驗之形成。醛基較好由脂質之高碘酸鹽氧化作用所形成。於氧化劑移去後之偶合反應於還原劑存在下進行，如二硫異赤絲藻醇，如Heath所述（1981)。通用於方法中之典型酸-脂質前軀體包括乳糖基神經醯胺，三己糖基神經 S篮胺’半乳糖基腦菩脂，麟脂醯基甘油，磷脂醯基肌醇及神經節荅脂。第二種一般的偶合方法是應用含硫之親和力部份，並涉及脂質及親和力部份間雙硫化物或硫醚鍵之形成。於二硫化物反應中，脂質胺，如磷脂醯基—乙醇胺，經修飾含有叶匕症基二硫衍生物，其可與在親和力部份曝出之硫醇基反應。用於此方法之反應條件可見於Martin (1981)。硫醚偶合方法，由Martin所述（1982)，由形成氫硫基-反應性鱗脂而進行，如Ν-(4)Ρ·馬來醯亞胺基-苯基（丁醯基）磷脂醯基乙醇胺’並將脂質與含有硫醇之親和力部份反應。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS )八4規格（210X297公雩|! 请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，\i 口

I 520297 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 87 五、發明説明（27 ) 親和力邵份與脂質反應的另一個方法涉及親和力部份與月曰貝之反應，後者經衍生化合物含有N -超基琥珀醯亞胺之活化酯。反應通常在緩和的去污劑存下進行，如去氧膽酸鹽。就如同上述之反應，此偶合反應較妤在脂質納入脂質體之前進;f亍。上述的偶合技術爲示範且應了解其他適合的方法是技藝中已知的且已有所述，如在美國專利案N〇s. 6,6〇5,63〇， 4,731，324，4,429,008，4,622,294及4,483,929 0 C .脂質體製備月曰貝體可以各樣技術製備，如Szoka，et al.，1980所述。多層囊（MLVs)可由單純的脂質-薄膜水合作用技術形成。在此步驟中，溶於適合有機溶劑中之上述型式的脂質體-形成脂質混合物於容器中蒸發以形成薄膜，其再以水性介質覆蓋。脂質薄膜水合可形成ML Vs，大小通常在約〇. 1至 1 0微米之間。用於形成本發明融合性脂質體之脂質組份，其含量較好爲約7 0 - 9 0 %囊-形成脂質莫耳濃度比例，^20%二段共聚物脂質共耗物及0 · 1 - 5 %有配位體分子枯附其上之脂質。如上示，所加入之親水性聚合物可完全含有二段共聚物脂質共軛物或二段共聚物脂質共軛物及直接連接至脂質之聚合物之組合。就理想而言，二段脂質共軛物在此混合物中之百分率爲符合脂質體穩定性之最大百分率。因此，針對特殊二段脂質組合物使調和物更臻完善時，吾等可選擇各種比例的二型式親式性聚合物脂質，且採用可得到良好脂質 -30- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐）零T! (請先闐讀背面之注意箏項再填舄本頁) 、1Τϋ ϋ In 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 520297 A 7 __— 一 —_^_ 五、發明説明（28 ) 體穩定性之最鬲比例，此可由螢光告知劑自脂質體之最低滲漏率證知。較好，二段共聚物脂質共軛物之含量爲包括於脂質製劑中親水性聚合物脂質總量之5_1 〇〇%之間。一個供示範之調和物中含有80-90莫耳％磷脂醯基膽鹼， 1 -20莫耳％聚合物-脂質共|厄物及〇· 1莫耳％配位體_ peG-DSPE ’以二段聚合物脂質共軛物占親水性聚合物脂質共軏物總量之20-100%。膽固醇可以約1-5〇莫耳。/q包括在調和物中。供示範之月曰貝體调和物，其製備述於實例9中。適於製備本發明融合性脂質體之另一步驟涉及聚合物-脂質共軛物擴散至預形成之脂質體中。在此方法中，自囊形成脂質中製備包陷有治療劑之脂質體。預形成之脂質體加至含有聚合物-脂質二段共軛物微球之濃縮分散相，及視所需的配位·體-PEG-DSPE之溶液中，且混合物在可使微球脂質有效嵌入預成形脂質體之條件下培育。此方法之優點是二段脂質之疏水性聚合物部份受限於脂質體之外脂質層，且因此當二段組份納入形成脂質體之所有脂質層時可能較不致不安定。另外，脂質體可預先形成，即將親水性聚合物月旨質直接鍵結至親水性聚合物脂質，並在脂質交換條件下與二段聚合物共軛物培育以交換二段脂質至外脂質體層。依據本發明欲經由細胞融合投予至細胞之治療或診斷劑，可以標準方法納入脂質體中，包括⑴以作用劑之水溶液水合脂質薄膜使水溶性化合物可被動包陷，（ii)水合含有作用劑之脂質薄膜使親脂性化合物可被動包陷，及（iii) -31 - 本紙張尺度適用中國®2Η)Χ297ϋ----- 聲衣.— (請，'-G間讀背而之注意事項再填寫本頁)

-II ^20297 Λ 7 _______Β7 五、發明説明（29 ) 填加可離子化的藥物以拮抗内部/外部之脂質體pH梯度。其他方法，如逆蒸發相脂質體製備法，也可應用。請先閲讀f面之注意事項再填寫本頁本發明之融合性脂質體較好製成在所選定之大小範圍内有貫質的均勻大小者，通常介於約0 03至〇5微米之間。對於RE Vs及ML Vs的一個有效篩選大小方法涉及將脂質體之水性懸液經由一系列具所選定之均勻孔徑之聚碳酸酯膜擠壓而得，孔徑在〇·〇3至〇·2微米範圍，通常爲〇.05，0.08，〇· 1或0.2微米。膜之孔徑大略相當於由經膜擠壓所產生之脂質體最大孔徑，特別是製劑經由相同的膜擠壓二次以上。勻漿方法也可用於向下篩選大小至1 〇〇毫微米以下之脂質體（Martin)。訂 1 •示範脂質體之製備及活體内測試經濟部中央標準局員工消費合作社印製進行研究以支持本發明，其中採用的脂質體由於納入化合物XXV具有PEG可釋出之外衣（圖9)。這些脂質體於活體内測試PEG鏈之釋出。如實例8所述，製備複合物其含有具有PEG鏈可釋出外衣之陽離子性脂質體及攜有蟲螢光素之質體。複合物之製備係形成陽離子脂質體-縮合之質體複合物，並將複合物與PEG-DTP-DSPE(化合物XXV，圖 9)微球或與PEG-DSPE微球共培育（如PEG經由傳統的不可解離鍵粘附至 DSPE (Zalipsky 1992a))。PEG-DSPE及 PEG-DTP-DSPE微球係在室溫下培育並緩和渦旋5分鐘而嵌入陽離子性脂質體内。

依實例8所述製備三種脂質體調和物，在第一調和物中，PEG外衣係不可釋出的，即PEG不可逆地粘附至DSPE -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X 297公逄、〇297

五、發明説明（3〇而納入脂質體内。在第二調和物中，脂負ώ有一個P E G表面外衣，其中一半的PEG鏈可釋出地粘附至脂質體之表面，而另一半則是不可釋出之枯附。在第二调和物中’在脂質體上之PEG表面外衣是可釋出的。這三種調和物示於 _11A-11B 分另 U 爲，，PEG”，”PEG+R-PEG"及 R-PEG’’。脂質體複合物靜脈内投予至老鼠。投予後5分鐘，加入還原劑半胱胺酸以還原雙硫鍵，由是可釋出脂質體中之可釋出PEG。注入後2 4小時，分析肺及肝之蟲螢光素酶活性。示於圖1 1A-1 1B之結果顯示，對具有可釋出PEG鏈之月旨質體而T其蟲螢光素酶活性較高，即組織中保留較多的月旨質體。很重要的，數據證明經由可釋出鏈結之還原， peg鏈之活體内釋出。PEG鏈之釋出可曝露出陽離子性脂質體之正表面電荷，可加強與陰性細胞膜之結合並改善組織中脂質體之滯留，此由可釋出一 PEG脂質體調和物有較高的蟲螢光素酶活性可證知。

Ui.聲合性脂質體組合物之利用性此中所述之融合性脂質體*且合糾、 9貝、、凡口物可用於遞送診斷或生物〆性之治療劑’如藥物，蛋白質古Λ Α曰貝堤傳物質或其他作用物 $受體分子，或進入細胞膜，香，營ώ、也胺又岐脂質體或於活體内或試吕内 < 細胞胞質中。依據本發明，脂質體中包陷之跑之融合而直接遞送至標的細胞之&、、、☆ ^由^貝把與細攝粒作用或吞料用機制。因此在a，而非經由細胞別有益，如基因構體，_酸或治療劑上脂質體特务核苷酸同系物，肽， -33- 本纸張尺度 (CNS) 請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁丁 -5 -- 經濟部中央榡準局員工消費合作社印Μ 520297 A7 B7 五、發明説明（31 ^白質及其他生物性大分子’其不會經由被動或主動運送谷易地穿透細胞膜。融合性脂質體組合物可經由各種路徑活心投予，包括·皮下，肌内，傷處内（至腫瘤），以吸入經由氣管，局邵’鼻内，眼内，經直接注射至器官及靜脈内。口 A .嚴質體組合物之投予融合性脂質體組合物經設計可用於遞送作用物或化合物至標的細胞，可在活體内位置或於試管内之細胞培養:作用物之遞送係將囊與標的細胞之漿膜融合，將作用物釋出至細胞之胞質室内。以下討論許多應用。 1 · il皇1 各遞良。各樣的治療性化合物，包括一般的藥物，肽及核酸，由於標的細胞攝入率低之問因此治療應用有限。利用本發明之脂質體組合物，包陷之治療性化:物經由囊-細胞融合可以高的攝入率遞送至標的細胞。在此一般應用中，投予含有包膠之藥物之融合性脂質把，如靜脈内方式。如上述之融合性脂質體可包括有特異的配位體以對準對包陷之藥物有需求之細胞。例如，攜有抗-腫瘤藥物，如doxorubicin，之脂質體經由在其中納入 VEGF配位體可對準腫瘤之血管内皮細胞，以選擇性粘附在增殖中之腫瘤内皮細胞上所表現之nk“，2受體。在脂質體上之親水性外衣可保護脂質體免於網狀内皮系統之攝入，提供較長的血液循環壽命以有更有效之對準目標。在此同時，粘附至脂質_固體的親水性聚合物鏈之遠端曝露出來以供受體結合及對準目的。 -34 li in In It . 釋 Γ-v先!v:ai背^之注意事項再填寫本¥、} τ ________ 、!n 31 經濟部中準局員工消費合异社印製本紙張尺度適用中國國私標準（CNS ) Λ4規格（21 〇 X f 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 A 7 ----- 37 五、發明説明（32 ) 另外’對準所選定的標的細胞或組織可以是被動的，即投藥後經由正常的生物分佈，而勿需未遮蔽的配位體。例如，在I V投藥後，具大小在較好少於約0·2微米之長_循環性脂質體可在固體腫瘤區位置或在發炎位置，經由受損血管之外溢可予以累積。 g月曰貝fa到達所選擇之標的位置時，如脂質體經由配位體-特異的結合至標的細胞，或脂質體經由所注入脂質體之生物分佈累聚在標的細胞之臨近，脂質體在標的細胞與化學劑接觸，其可有效釋放該鏈形成該表面外衣。此種釋出可將脂質體表面之疏水性聚合物與標的細胞曝露在一起，如下述促進脂質體與標的細胞表面之融合。在一個一般具fa貫例中’親水性聚合物鏈結合雙硫鏈結連接至疏水性鏈（或直接至脂質體脂質）。在此具體實例中’個體經由如I V投予，以還原劑處理，如抗壞血酸鹽，半胱胺酸或穀胱甘肽。在另一具體實例中，化學可釋出之鏈結可爲一種對pH値敏感之鍵，其中脂質體對準一區域，如固體腫瘤區域，在此通常降低pH値可促進親水性聚合物遠離。全部或部份地移去親水性聚合物鏈，使脂質體表面之疏水性聚合物可與標的細胞膜表面曝露在一起。目前在水性環境中之疏水性片段，可在脂質體雙層及在臨近的標的細胞膜中尋求一個較有益，如疏水性的，環境。疏水性鏈分配至標的細胞内，其作用可增加脂質體至標的細胞膜之接近，及可穩定標的細胞雙層，使其更可感受與脂質體雙層 -35- -1 ·.*- I·!- i «κι ί. i 4— - -1-- --- 請先間讀背南之注意事項再填寫本I-o 訂 —51 I =1 1- 本紙張尺度適用中國國表標率（〔从$)八4規格（210:><297公慶） 520297 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 Λ 7 ：----- 37 ____ 五、發明説明（33 ) 之融合。在使融合作用更臻完善或加強效率上可使用各種策略。首先，希望可增加所曝露出之疏水鏈分配至標的細胞雙層而非脂質體雙層之傾向。此點一部份可由增加脂質體中高的相轉變脂質濃度而達成。其次，希望可將脂質體更靠近標的膜。爲達成此點可如上述’在釋出疏水性聚合物之後，提供經遮蔽之配位體或可與標的膜交互作用之正電荷脂質組份，如此迫使二個雙層更爲接近。最後，可使疏水性聚合物鏈之型式及大小更臻完善以加強融合效率。可使用上述檢查疏水性聚合物鏈溶解紅血球之能力之方法，來鑑定最佳之聚合物大小及型式。 2 ·基且治療。含有經包陷基因（cdNA質體）之融合性脂質體可遞送至標的細胞，以供活體外或活體内基因治療。在後一例子中’將基因直接引入（靜脈内，腹膜内，氣霧劑等）個體内。於活體外（或於試管内）基因轉移中，於細胞自個體特殊組織移去後將基因引入細胞内。經轉感的細胞再引回個體内。關於各種狀況之處理已有各樣基因被提及，且針對所感興趣之特異基因之編碼序列可自DNA序列資料庫中修補= 得，如GenBanhtEMBL。所選定之編碼序列，依據^殊應用可編碼各種不同蛋白質或多肽型式中任一者。例如，融合性脂質體可用於將編碼酵素之序列引入受酵素缺失症2 苦之個體的幹細胞或淋巴細胞内。舉例而言，對有腺苷胺 -36 - 讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、-口 j Ή氏張尺度逍用中國國(CNS) A4規格 ----^ 520297 A 7 B7 五、發明説明（34 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製酶（ADA)缺失症之個體，編碼ADA之序列可轉感至個體之幹細胞或淋巴細胞内。在相關之應用方面，脂質體可含有編碼各樣循環性蛋白質中任一者之基因，如α广抗胰蛋白酶，凝血因子（如第 VIII因子，第I X因子）及球蛋白（如卢-球蛋白，血紅素）以治療血友病，鐮刀型貧血及其他與血液相關之疾病。適用於本發明的其他基因編碼序列之實例包括編碼結構蛋白質之序列；受體，如低密度脂蛋白受體（LDL-R)以轉感於肝細胞治療LDL-缺失之病人，人類CD4及其可溶型式等；跨膜蛋白質如纖維囊腫跨膜傳導調節物（CFTR)以治療纖維腫之病人；發信號分子；細胞動素如各種生長因子（ TGFi，TGFJ，EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，CGF CSF，SCF)，間白素，干擾素，促紅素等，以及針對此胞動素之受體；抗體，包括後合型抗體；可應用於對準性腫瘤之基因（如由腫瘤-浸潤的淋巴細胞，TIL所轉形之惡性黑色素瘤），腫瘤抑制基因，如p53或尺6基因其可v 控細胞自動死亡如Bcl-2基因於胸苷激酶，繼以gancicl〇vi 基因於胞：y：去胺酶，繼以5 -氟胞嘧啶基因於MDR-丨基因物之過度表現，以保護正常細胞免於胞毒之化學治療，用對腫瘤有害之基因，如腫瘤壤死因子，白血病抑制子，或其他各種毒性基因；激素，如胰島素及生長激素轉錄及轉譯調控要件；及其他。脂質體也可編碼酵素，在腫瘤細胞或腫瘤鄰近的内皮細胞將無胞毒性之前藥轉成具胞毒性之藥物。囊如惡成調請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 、νύ -37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公席、 520297 A 7 87 五、發明説明（35 ) 在本發明一個具體實例中，脂質體含有聚核苷酸，其經设计可納入標的細胞之基因體中，或經設計可在細胞内類似地複製。在另一具體實例中，包陷在脂質少囊内之化合物是寡核菩酸片段，其經設計可以序列-特異地結合至細胞 RNA或DNA。聚核甞酸，寡核甞酸，其他核酸如DN A質體，可經由縮合核酸或單分子型式而包陷在脂質體中。核酸懸浮在含有精胺，亞精胺，組織蛋白，賴胺酸，其混合物，或其他適合的聚陽離子性縮合劑之水性介質中，其所在之條件可有效地將核酸縮合成小的粒子，如實例1 〇所述。以經縮合核酸分子之溶液再水化經乾燥的脂質薄膜，以形成有縮合核酸（呈經包陷型式）之脂質體。 B .於試管内分析之用法融合性脂質體組合物可於試管内對準至細胞或標的脂質體，以應用於同質的免疫分析法型式中。在本案中，融合作用可將效應物分子（攜於融合性脂質體）引入標的細胞内，如引入生物細胞或另外的脂質體。效應物分子可與含於標的細胞中之化合物交互作用，產生可偵測之訊號。經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁W I V .實例以下實例説明本發明融合性脂質體製備，特性化及使用的方法。實例不欲在任一方式下限制本發明範圍。實例1 製備Di-PEG-PPO共聚物以應用於融合活性篩選 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公f ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 Λ 7 Β7 五、發明説明（36 ) Α.製備Ν-琥珀醯亞胺-(2-(ω-甲氧基聚氧乙烯）_α-胺基羰基）乙基-二硫丙酸酯中間物，（mPEG-DTP-OSu) 此合成流程於圖4中説明。依Kirpotin，1996之方法製備 N -琥珀醯亞胺-(2-( ω -甲氧基-聚（氧乙晞）-α ·胺基羰基）乙基-二硫丙酸酯（化合物III)。製備自二硫二丙酸（Aldrich, Milwaukee，WI)的二硫雙（琥珀Si亞胺基丙酸S旨）（873毫克，2毫莫耳）（DTSP，化合物II) 於二甲替曱醯胺（1 0毫升）之溶液，以甲氧基聚（乙二醇）胺 (2克’ 1¾吴耳）’ mPEG-NH2(化合物I)，依Zalipsky之方法製備（Zalipsky, 1983)及三乙胺（140毫升）處理。生成的 N -琥珀酿亞胺基S旨聚合物中間物，N -琥珀酿亞胺基-(2-(ω -甲氧基聚（氧乙烯）-泛-胺基羰基）乙基-二硫丙酸酯 (mPEG-DTP-OSu，化合物III)再自異丙醇中再結晶二次而純化，繼而於眞空下於五氧化轉上乾燥以移去殘留的水。中間物以1H NMR特性化，並以氘化的曱醇爲溶劑。1；^- NMR (CD3OD)j 2.6 (m，SCH2CH2CON)，2.85 (s，Su, 4Η)， 3.0 (重疊白勺 m，SCH2CH2C02-Su 及 SCH2CH2CON)，3.38 (s， CH3，#h)，3.64 (s，PEG，《 1 80H)。產物混合物之組成，即單一 PEG-化（mPEG-DTP-OSu)對二-PEG化之二硫二丙酸酯產物（mPEGhDTP之相對含量，由比較在2.6 ppm及2.85 ppm TMS下游範圍處峰的相對積分（此屬於欲求之琥珀酸鹽）對在3.0 ppm之共軛（此屬於（mPEG)2DTP)而決定。 B.丢段共聚物製劑將含有二個末端一級胺基之pp〇_二胺（化合物IV)在二氯 -39- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) Μ規袼（21():< 297公慶） —^ (請先閒讀背面之注意事項再填寫本頁)

520297 Λ7 _______37 五、發明説明（37 ) ~~ 甲烷中攪拌直到溶解。在此溶液中加入略過量（1.2當量）的 mPEG-DTP-OSu(化合物in)。反應混合物再於室溫下攪拌數小時。反應之進行以TLC追踪；由相當於PPO-二胺之點消失顯示反應之完全。二- PEG化的PPO產物，二（mPEG-驢胺基-DTP-醯胺基）pp〇(化合物从）以碎膠管柱層析純化，再以巾NMR光度計特性化CDC13)以證實無任何留下的單-PEG化PPO產物之存在。 C .疏水性聚合物融合促進活性之篩選方法經濟部中央標準局員工消费合作社印製 ’1丨丨€1 (請¾¾讀背面之注意事項再填寫本頁) 如上述，製備PEG2_及pp〇2_之三段共聚物（化合物 V)。將50毫克溶於1.2亳升PBS中。取0.5毫升置於各10支的二排試管的前二管内，其中各含有0.5毫升的PBS。在二排試管進行共聚物丨〇組連續2倍稀釋。對此2 〇支試管各加入0.5毫升1 〇% w/v的新鮮人類〇型血紅血球懸液（其被抽入肝素管中並以PBS洗三次）。也製備細胞對照組，即將〇.5 毫升PBS及0.5毫升紅血球細胞懸液混合於單一管中。所有試管均置於冰箱中i 〇分鐘，之後加〇·1毫升的〇·5Μ DTT至一組稀釋液中，而同時0.1毫升的PBS加入另一組稀釋液中。在含有細胞對照組之管中加入〇· 1毫升DTT。試管置冰箱中2小時。培育後，管置離心機中，以2000 X G離心1 0 分鐘使細胞成團塊。

小心移去上清液，置另外的管中。第5稀釋液（即管中含有0.78愛克/亳升濃度之三段共聚物）單獨加上三段共聚物及三段共聚物加上DTT，在480毫微米下測及之吸光度値分別爲0.037及2.12。在相同波長下，細胞對照組加上DTT -40- 獻7!適用中國 ' 520297 __________87 五、發明説明（38 ) 之吸度値爲0.063。細胞也在相差顯微鏡下，以χ630放大倍率顯微鏡檢細胞。在細胞對照組加上DTT及細胞與單獨的三段共聚物無DTT下培育之細胞是完整的，無細胞溶解之跡象。相反的，與三段共聚物及DTT共培育的細胞，有 80%以上被溶解。在所有的稀釋倍數下，有三段共聚物加上DTT存在下之細胞會類似地溶解，而在所有稀釋倍數之三段共聚物但無DTT下之細胞則是完整的。這些結果顯示，DTT加至三段共聚物可解離peg及PPO間之雙硫鍵，釋出自由態的PPO。自由態的PPO可侵犯鄰近的紅血球細胞膜，並導致溶血。單獨的DTT則對細胞無作用，且不致謗導細胞溶解。這些結果進一步説明，PP〇2〇()() 是可用來製備下述之二段共聚物-脂質共軛物之候選的疏水性聚合物。實例2 ϋ二段共聚物-脂質共扼物·· mPEG-S-S-PPO-DS(化合物XII) A .材料及方法經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ί 詩先闊讀背面之注意事項再填寫本頁) 材料：除非另有所示，材料得自商業來源且以所提供的型式使用。π -(咪唑-1 -基）羰基-ω -甲氧基-聚（環氧乙烷）以已知方法合成（Beauchamp, et al.，1 983)。方法·· ’’於眞空下蒸發’’ 一詞表示以浴溫不超過4 〇 °c之旋轉条發器進行，利用吸水器。薄層層析（TLc)在Analtech 60F-254矽膠板上進行，並在TLC上偵測組份，係以碘蒸汽染色，以Dragendorf試劑（於聚醚偵測）染色，或以硫酸銅/ 硫故溶液處理再加熱。溶劑系統以相較於總體積之較極性 -41 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) Λ4規格（2丨0:< 297公慶） 520297 B/ 五、發明説明（39 ) 組份之曰分率來表示（v/v %)。於層析中採用Merck級9385 (讀先閱讀背面之注意?>項再填寫本頁石夕膠 230-400 孔篩（60A)(Merck Sharpe & Dohme，Philadelphia, PA)，其利用Still et al· (1978)列出之準則來進行。NMR 光譜在360 MHz的GE儀器上獲得，Acorn NMR Inc. (Fremont, CA)，且化學位移殖以△•値（每百萬份之一）表示，並以四甲基矽烷爲内部標準品。基質-支持的雷射解吸離子化時間之飛行質譜（MALDI-TOFMS)以飛行質譜儀之 PH-EVANS MALDI三倍靜電分析儀時間得到,Charles Evans & Associated (Redwood City，CA)。

.1T B ·製備胺基乙基二硫-N -乙基胺甲酿基-Gj -曱氧基-聚（環氧乙烷）鹽酸鹽（化合物vim 以下反應示於圖6。250毫升圓底燒瓶，裝入溶於5 0毫升 0.01 Μ四硼酸鉀四水合物中之胱胺二鹽酸鹽（化合物vi，經濟部中央標準局負工消費合作社印製 4.5克，2 0 ^:莫耳）。在此攪:拌溶液中，一次地加入α _ (咪唑-1-基）羰基-ω -甲氧基-聚（環氧乙烷）（化合物vi，η=45)，此依Beauchamp，et al·，1983所述製備，且生成的澄清溶液在室溫下攪掉4小時。此時，溶液以6 N HC1調至pH 1，再加氯化鈉至飽和限度。水溶液以氯仿萃取（2 X 75毫升），有機萃取物混合，硫酸鎂上乾燥並過滤。溶劑在眞空下蒸發’且生成的無色凝膠溶於約7 0毫升乙酸乙醋中。在此澄清溶液中緩緩加入120愛升二乙醚，以生成1.97克（88%)白色沉澱物’ α -[2-胺基乙基二硫基乙基-胺甲酿基-ω -甲氧基-聚（環氧乙虎）鹽酸鹽（化合物VIII)，其具有充份純度可應用於下一反應。Rf=0.49 (2:18:90水/曱醇/氯仿）。4 -42 - 本纸張尺度適用中g國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公慶） 520297 Λ7 ----- ____ 五、發明説明（40 ) NMR (360 MHz，DMSO-d6)^7.74 (bs, 3)，7.38 (t，1，J二5.1 Hz)，4,〇5 (pt，2，J = 4.5 Hz)，3.69 (pt，1，j：=4.7 Hz)，3.50 (bm, 〜180)，3.41 (m，2)，3.23 (s，3)，3.08 (pt，2，J=46.7 Hz, 7.1

Hz), 2·90 (pt，2, J = 7.6 Hz)，2.79 (pt，2, J = 6.9 Hz，6.6 Hz)。 C . 盤雙對位-硝基苯基碳酸酯I丙烯（化合物I x ) 將氯氧丙烯（PPO，1克，0.5毫莫耳）與苯共沸乾燥，再加對位-硝基苯基氯甲酸酯（6〇4毫克，3毫莫耳，6當量）及三乙醇胺（TEA，418毫升，3毫莫耳，6當量）於CH2C12 (3毫升）中之PPO中。30分鐘後TLC顯示反應已完全。溶液過濾並Γ备發至乾。粗製產物溶於DHC13:CH3COCH3(90:10)，填加至矽膠管柱（淤漿以相同溶劑製成），並以下列溶劑溶離，CHC13:CH3COCH3 = 90:10(對位·硝基苯基溶離）， CHClsXHsCOCHsKhSO (產物溶離）。適合的因素混合，蒸發並於P2〇5上眞空乾燥可生成純的產物，呈澄清油狀。產率：1 克（86%)。4 NMR (d6-DMSO): (M.05 (d, CH3CHCH2, 105H); 1.15 (d，CH3CHCH2,及6H); 3.30 (m，CHdCHCH2, 35H); 3.45 (m，CH3CHCH2, 70H); 4.90 (m，末端CH3CHCH2, 2H); 7.50 (d，N02C6H4 PP〇，4H)，8·30 (d，N02C6H4 PPO, 4H)。 D·製備 mPEG-S-S-PPO-DS(化合物 Xin 在一個於烘箱上乾燥過的2 5毫升圓底燒瓶中，於氮下裝入α - ω -雙（4-硝基苯醯基碳酸酯聚（氧丙烯），（化合物 1又，111 = 35,611毫克，236微莫耳）（依上實例2(：所述製備，依Veronese，et al.，（ 1985)之方法）及於4.G毫升無水二甲替甲醯胺中之化合物VIII (5 12毫克，230微莫耳）。再加二乙 -43- 本紙悵尺度適用中國國家標準（〇奶）,\4規格（210:< 297公釐）請先闊讀背面之注意事項再填寫本頁 T ! 、一呑經濟部中央標準局員工消資合作社印裝 r· f—31 fl if —m· ___ 87 ___ 87 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 Λ 7 五、發明説明（41 ) 胺（98微升，700微莫耳）至此淺黃色溶液中，以生成混濁，亮黃色混合物，再於氮下及室溫下攪拌6 〇分鐘。此時以TLC分析顯示化合物VIII已完全耗盡（及mpEG-S-S-PPO-硝基苯基碳酸酯[化合物X，主產物]及mPEG-SS-PP〇-SS-mPEG[次產物]之形成。令反應在室溫及氮下攪拌2丨小時。溶劑再蒸發，黃色殘留物接受管柱層析（Si〇2，25 X 1 50 c|：米’（1) 1 〇%丙酮/氯仿以溶離對位-石肖基紛，再（2) 5%甲醇/氯仿以溶離第一混合物，（3) 8%甲醇/氯仿）以溶離含有mPEG-S_S-PPO-胺基丙二醇之第二混合物（化合物 X I)。適當流份之溶劑蒸發後可生成260毫克，此以TLC分析品含有二種物質，1^=〇.58及11〖、=0.57 (10%甲醇/氯仿），其對碘染色及聚醚-特異的Dragendorf染色呈陽性。此物質可直接使用勿需再純化。在經烘箱乾燥之5毫升燒瓶中，於亂下裝入硬脂酸（52毫克，182微莫耳），4-(二甲胺基） p比鍵甲苯績酸鹽（Moore and Stupp, 1990) (9毫克，30微莫耳）及於2.0毫升無水二氯甲烷之化合物χι (26〇毫克混合物）溶液。在此澄清溶液中加入i，3_二環己基碳化二亞胺（5毫克，2 5微莫耳），且令反應在室溫及氮下攪拌。3 〇分鐘後，沉澱物開始形成，且TLC分析顯示新產物點之形成， Rf-0.57 (9%甲醇/氣仿，起始物r严〇·49)。反應在室溫及氮下攪拌一夜。混合物經由塞里過濾，以二氯甲烷洗滌，溶劑再蒸發，殘留物接受管柱層析（si〇2，25 X 1〇〇毫米，㈤ 10-50%的2 -丙醇/氯仿梯度，[b] 2:48:5〇甲醇/ 2 -丙醇/氣仿，[c] 5 :45:50甲醇/2-丙醇/氯仿，[d] 5%甲醇/氯仿，[e] -44 - 本纸張尺度適用中國國家標举（CNS ) A4規格（2ίΟχ 297公後) ""— "~ --- (請先閱讀背面之注意爭項再填寫本頁訂 il 520297 Λ 7 Β7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（42

7.5%甲醇/氯仿；10〇毫升總溶劑），在溶劑蒸發及自2•甲基-2-丙醇/水冷凍乾燥後可得5 8毫克u〇%)的叢毛狀之白色固體，鑑知爲mPEG-S-S-PP0_DS(化合物χπ)。lH NMR (360 MHz, CDCl3)tf 5.32 (bs，1)，6.20 (bs，1), 5.09 (m，1)， 4-91 (bm, 3), 4.28 (dd, 1, J=4.0 Hz, 12.2 Hz), 4.22 (pt, 2, J 4.7 Hz), 4.12 (dd, 1, J=5.6 Hz, 11.8 Hz), 3.83 (m, 1H)? 3.64 (m，〜180)，3.58-3.51 (bm，〜70)，3.39 (bm,〜35)，3.37 (s， 3), 2.80 (pt，4，占.8 Hz，5.9 Hz)，2.30 (pt，4，J=7.4 Hz, 7.5 Hz)，1.61 (bm，4)，1.32-1.22 (bm，〜62)，1.13 (d，〜99, J二6.9 Hz)，0.88 (t，6, J=6.6 Hz)。MALDI-TOF 質譜（DHB，2,5-二輕苯甲酸鹽充作基質）顯示共軛物之分子離子，以在48〇〇集中之分布線代表。質譜也顯示出代表共軛物片段的二個刀佈’其由雙硫鏈結解離而生成，21〇〇及2700 m/z。第一個由平均分佈在間隔44 m/z單位的光譜線組成（氧乙烯基重覆單位）’第二個分佈含有間隔5 8單位的分佈（氧丙烯基重覆單位）。實例3 1.備一逸旨質共軛物mPEG-S-S-PPO-DSPE(化合物XV) A’ -硝基笨某胺某甲酸酯（化合物 χννχ 以下反應説明於圖7。DSPE(化合物XIII，220毫克， 0·294尾莫耳）加至雙·硝基苯基碳酸酯聚氧丙烯（化合物 ’ 1克’ 0.482毫莫耳，3當量）於CHC13 (5毫升）。再加 N -技基-s-原福烯·2,3-二羧酸醯亞胺（HONB，79毫克， -45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格 (210:<297公.¾ (讀先閱讀背面之注意事項五；填寫本頁) m T f „, 二二17 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 520297 Λ 7 --— _ !3, 五、發明説明（43 ) 〇·441毫莫耳，1.5當量）及TEA (304毫升，2.19毫莫耳， 7.44當量）至反應混合物中。反應混合物成黃色混濁溶液。在4 2 °C，4小時後，反應混合物變成澄清（黃色）。TLC (CHC13: MeOH: Η20 = 90:18:2)顯示反應已完全。產物混合物與Amberlist 15離子交換樹脂（酸性，ι.5克，46毫當量/ 克）及Amberlist 21離子交換劑（鹼性，ι·5克，48毫當量/克）共於漿。產物混合物再溶於MeOH (3毫升）中，並加入矽石 (3 克，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，石夕石 60 A， 230-400孔篩），並蒸發。產物以下列溶劑溶離，CHC13: CH3COCH3 = 90:10 (100 毫升），CHCl3:iPr〇H=98:2 (100 毫升），CHCl3:iPrOH=96:4 (100 毫升），CHCl3:iPrOH二94:6 (100毫升），CHCl3:iPrOH=92:8 (100 毫升），CHCl3:iPrOH= 90:10 (200毫升）。含有純產物之流份混合及蒸發。加 tBuOH (5毫升）至產物中。產物（化合物χιν)於眞空中p2〇 5 上乾燥，可得白色固體（350毫克，41%)。1HNMR(CDC13); d 〇·88 (m，6H)，1.15 (s，PPO (CH3CHCH2),〜105H)，1.26 (s， CH2，56H)，1.58 (br m，CH2CH2C = 0，4H)，2.31 (2 x t， CH2C = 0, 4H)，3.38 (m，PPO (CH3CHCH2)，〜35 H)，3.54 (m， PPO (CH3CHCH2)，〜70H)，5.20 (m，P04CH2CH，1H)，7.38 (d， N02C6H4, PPO, 4H)，8.38 (d，N02C6H4 PPO, 4H)。 B .製備 mPEG-S-S-PPO-DSPE(化合物 I V) 繼續參見圖7 ，化合物VIII(實例2B: mPEG-O(OO) NHCH2CH2S-SCH2CH2-NH2 ; 5 6 毫克，0.027 毫莫耳，1.4 當量）羥基苯並三唑（HOBt，15.2毫克，0.113毫莫耳，6當 -46 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210 X Μ7公芨；请t閲讀背面之注意事項再填P本頁) 訂 -¾ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 A7 __ 87 五、發明説明（44 ) 量）刀子師（50¾克）及TEA (20¾升，〇」43毫莫耳，77 當量）加至化合物XIV (DSPE-PPO-對位-硝基苯基胺基甲酸酯（55毫克，0.019毫莫耳，！當量）於CHCi3(6〇〇毫升）。3小時後，TLC (CHC13; MeOH:IPA=50:l:49)顯示產物形成，但產物點十分淡。再加DMF (0.2毫升）至反應混合物中，並在室溫下攪拌。2 4小時後產物點較前一天更深些。產物混合物過濾，冷凍乾燥再以矽膠管柱層析純化。產物混合物溶於CH3C0CH3 = CHC13 (90:10)，再填加至管柱中。管柱以下列溶劑溶離：CHC13:CH3COCH3 = 9〇:1〇 (50毫升），CHC13: iPr*OH = 80:20 (20 毫升），CHCl3:iPr〇H=60:40 (20 毫升）， CHCl3:iPrOH:MeOH=50:49:l (20 毫升），CHCl3:iPr〇H-.MeOH= 50:48:2 (20 毫升），CHCl3:iPrOH=92:8 (100 毫升），CHC13: iPrOH = 92:8 (100 毫升），CHCl3:iPr〇H=90:10 (200 毫升）。含有純產物的Ά份混合並蒸發。加t-BuOH (5亳升）至產物。產物，化合物XV在P2〇5上於眞空下乾燥，可得白色固體（350 毫克，41%)。4 NMR (CDC13): β 0.88 (m, 6H)， 1·15 (s，CH3CHCH2，〜105 Η) 1·26 ((s，CH2, 56H)，1.58 br m， CHCH2),〜35 H)，3·54 (m，PPO CH3CHCH2，〜70 Η), 3·64 (s， PEG，180 H); 5.20 (m，P04CH2CH，1 H)。 MALDI-TOF質譜（DHB基質）顯示共軛物的分子離子，由集中在5000 m/z之線分佈代表。光譜也顯示二個分佈，代表共軏物的片段，其係由雙硫鍵結解離所產生，2 100及 3000 m/z。第一個由相等分佈間隔44 m/z單位之光譜:線組成（PEG重覆單位），但第二分佈含有在2 5單位分隔同等安 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0)< 297公釐7~" 一 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫衣頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 Λ 7 __ Β7 五、發明説明（45 ) 置之線（ΡΡΟ重覆單位）。實例4 . 製備二段共聚物-脂質共軛物 mPEG-DTP-SS 胺基-PPO-DSPE(化合物 XX) A,製備脂質化疏水性聚合物中間物，胺基-PPO- DSPE (化合物XIX) 二硬脂醯基磷脂醯基甘油（DSPG，化合物XVI，圖8A)以高碘酸鈉（NaI04)如Torchilin所述地處理。生成之氧化產物，經氧化的DSPE(化合物XVII)再以過量的聚氧丙晞-二胺還原性胺化（二胺- PPO，化合物XVII，n=10-20)(如 Jeffamine®，Texaco，Houston，TX)，在 NaCNBH3存在下形成欲求的胺基-鏈結之脂質官能化疏水性聚合物，胺基-ΡΡΟ-DSPE(化合物 XIX，圖 8 A)。 B ·製備二段共聚物-脂質共軛物，mPEG- DTP-醯胺基-PPO-DSPE(化合物 XX) 欲求的共軛物，mPEG- DTP-醯胺基-ΡΡΟ- DSPE(化合物 X X )，其具有一個疏水性末端聚合物，PEG，一個内部可解離之雙硫鍵，及一個粘附至末端脂質之疏水性聚環氧丙烯段，其製備是將依上實例1A及4 A所述製備之中間物， PEG-DTP-〇Su(化合物III)及胺基- PP〇-DSPE(化合物XIX) 偶合形成欲求之共聚物脂質共軛物產物，mPEG-DTP-醯胺基-PPO-DSPE(化合物 XX)。依上實例1 A所述製備之mPEG-DTP-OSu(化合物III)溶於 CHC13中。加等莫耳濃度量之胺基-PP0-DSPE(化合物XIX) -48 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（21〇ί 297公發) 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520297 A7 B7____ 五、發明説明（46 ) 至mPEG-DTP-OSu之CHC13溶液中，並在三乙胺存在下於 4 5 °C下培育直到澄明化。產物（化合物XX)依Zalipsky， 1993所述地純化，且經純化之產物再以1H NMR定特性。反應性琥珀酸酯基缺乏質子，顯示二個聚合物部份偶合形成欲求之產物。此反應流程综合於圖8A-8Β中。實例5 製備共聚物-脂質共軛物，由不安定性增加之雙硫鍵連接依下文所述及圖9所説明外，製備雙硫鍵結之mPEG-PPO-DSPE共軛物，其含有一個經修飾的雙硫鍵結，對於解離之感受性有所增加（如硫解作用及/或水解作用）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲氧基聚（乙二醇）硫醇，mPEG-SH(化合物XXI)依 Zalipsky之方法（1987)製備。對mPEG-SH(化合物XXI)於水或二甲替曱醯胺之溶液中加入過量的5二硫雙（2 -硝基苯曱酸）。令’’Ellmais試劑’’（化合XXII)及生成之反應混合物在室溫下攪拌（20-25°(：)。反應以丁1^追踪111?£〇-硫醇起始物是否消失，或另外取一份反應混合物進行IR分析（S-H 段長度）。生成的混合二硫產物，mPEG-3-羥基-4-硝基苯基二硫化物（化合物XXIII)再以矽膠管柱層析回收並純化。生成之二硫化物以1H NMR光譜特性化，且屬於分子PEG部份之上游共振之相對積分（峰之面積）及相當於經取代苯基上芳族質子之峰，均作比較以決定二-PEG化二硫化物副產物，二（mPEG)二硫化物形成之程度。混合的二硫化物，mPEG-3-羥基-4-硝基苯基二硫化物（化合物XXIII)完全溶於二氣甲烷中。對此生成之溶液中加入 -49 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚） 520297 Λ 7 Β7 五、發明説明（47 ) 依上貫例4 A所述製備之胺基-pp〇-DSpE(化合物χιχ)，且加入偶合劑，二環己基碳化二亞胺（DCC，化合物χχιν)。生成之反應混合物在室溫下攪拌一夜，直到觀察到（由TLc 決定）t^H-PPO-DSPE完全消失爲止。生成之共聚物-脂質界面產物，mPEG_(3-醯胺基_pp〇_DSPEh4-硝基苯基）二硫化物（化合物xxv)以矽膠管柱層析純化，並以NMR特性化。經修飾之二硫化物產物對於雙硫鏈結解離之感受性有所增強，如爲加入之硫醇所侵犯，如半胱胺酸或穀胱甘肽。實例6 製備葉酸-PFG-DSPF, 由於葉酸對光敏感，此過程在光保護之條件下進行。如圖10A所説明的，葉酸（化合物χχνί，25毫克，5.6X ΙΟ.5， 1.6當量），胺基-PEG-DSPE(化合物 XXVII，9 7 毫克，3.4 X 1(T5，1當量，如Zalipsky (1994)所述地製備）及N-羥基-S-原才白缔-2,3_*—複故酉篮亞胺（HONB，10¾克，5.5x 1〇·5，1.6 當量）溶於DMSO(1.0毫升）及吡啶（〇·5毫升）中。混合物攪拌直到完全溶解爲止。加入二環己基碳化二亞胺（DCC，3 2毫克，1.5 X 10-4，4.4當量）以啓動反應。混合物在室溫下攪拌4小時，且反應形成葉酸-PEG-DSPE(化合物XXVIII)之完全與否以TLC證實（胺基-PEG-DSPE應不存在）。再自反應混合物中蒸發叶I:咬。於TLC中，樣品溶於5 0微升DMSO中再以ΐ·〇毫升氣仿稀釋。反應混合物以氯仿稀釋以溶解葉酸。有DMSO之基質 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x297公廣）請先閱讀背面之；-意事項耳填寫本頁 s -i— , ·. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520297 Λ 7 Β7 五、發明説明（48 保持在樣品間之RF値。TLC進行中之溶劑爲：(1) 異丙醇/氨/水，1〇: 1:2(需4 0分鐘），及 (2) 氯仿/甲醇/水，75:3〇:5(需1 4分鐘）。以UV及Drogendorff噴霧使具象化。於tlC溶劑中之RF値及具象技術爲： RF値 U.V. 溶劑系統 ⑴ 溶劑系統 ⑵ Dragendorff 葉酸 0.21 0.0 + nh2peg-dspe 0.36 0.84 + 葉酸-PEG-DSPE 0.52 0.59 + + 讀先閱讀背ua之注意事項再填寫本頁) 衣------

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製實例7 製備吡哆醛-PEG-DSPF 吡哆醛（化合物XXIX)及醯肼_衍生化之PEG粘附至DSpE (化合物XXX，依Zalipsky所述製備，（1993))在室溫下（2〇_ 25°C )混合於DMF中以形成吡哆醛-PEG-DspE共軛物（化合物XXI)，示於圖10B。實例8 iff出之PEgj旨質體之活 A .脂質體調和物具有PEG表面外衣且複合至攜有蟲螢光素酶之質體之陽離子性脂質體，如下述般製備。 -51 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2!〇χ29Τ公發） 520297 經濟部中央榡隼局員工消費合作衽印製 Λ 五、發明説明（49 ) ~ Β · I離子脂質體/質體複合物之製備由脂質之二甲基雙十八基銨及膽固醇（Ddab:CH0L)所組成之陽離子脂質體，以標準步驟製備，係將1 〇微莫耳的 DDAB及1 〇微莫耳之ch〇L溶於含有主要是CHCl3之有機溶劑中。脂質經減壓旋轉乾燥或薄膜，脂質薄膜加入欲求之水相，如水，食鹽水或緩衝溶液而水化，形成脂質體（在 20微莫耳/毫升之總脂質濃度下），其經超音波震盪成型，或依序經由Nucleopore聚碳酸酯膜，〇·4微米，〇.2微米，〇·1微米及0.05微米孔徑，經擠壓得100_150毫微米大小之脂質體。以蟲螢光素酶質體爲告知基因。質體縮合以與陽離子性脂質體絡合，此係將含有1毫克/亳升總組織蛋白之1 微升溶液加至400微升經溶解質體之水性介質中（丨亳克質體/ 毫升）。經縮合之質體有約150毫微米之平均直徑，以由^ 力光掃描中測得。陽離子性脂質體/縮合質體複合物之製備，係將28〇的陽離子性脂質體懸液（2 0微莫耳/毫升）加至5 〇〇微升組織蛋白 ••縮合之質體粒子中。脂質體-質體複合物具有約2〇〇^微米之平均直徑，可由動力光掃描測得。 C.PEG之嵌入一硬月曰^^基骑脂驢基乙醇胺（dspe)以PEG衍生化士 Zalipsky，丨9 9 2 a中所述。叩①卯托微球製備自pEG°_ DSPE，係光溶解/mM於水中再音波震還之。 PEG-DTP-DSPE微球，即，PEG經由可解離之雙硫鏈結枯 52- 本紙張足度適用中國國家標準 (CNS ) A4規格（210X297公續

f請电閃讀背面之注意事項再填寫本頁)

520297 Λ 7 ____37 五、發明説明（5〇 ) " 附至DSPE(化合物XXV，如上實例5所逑製備），其製備係溶解，mM PEG-DTP-DSPE於水中再音波震堡之。含有2.5莫耳％ PEG-DSPE之脂質體，其製備係將丨4〇微升 PEG- DSPE微球懸液（1微莫耳脂質/毫升）加至5 6微莫耳陽離子性脂質-質體複合物之脂質中。微球_複合物懸液在緩和滿旋下在室溫培育5分鐘以達到PEG_dSPE嵌入陽離子性月曰貝骨豆中（Uster)。脂質體调和物示於圖1 1 11 b中，以，，PEG，，表示。在2.5% PEG-DSPE脂質體組合物中，如上述製備含有^莫 *%PEG-DSPE及1莫耳％ PEG-DTP-DSPE之脂質體，除了將陽離子性脂質體-質體複合物與PEG-DSPE微球及PEG-DTP-DSPE培育形成具有PEG鏈表面外衣之脂質體，其中一半的PEG鏈係可釋出地粘附至脂質體表面。此脂質體調和物示於圖 11A-11B，爲’’PEG+R-PEG，，。如上述製備含有2.5莫耳％ PEG-DTP-DSPE之脂質體，除了所包括之PEG總量爲PEG-DTP-DSPE。此脂質體調和物示於圖 11A-11B，爲，，R-PEG，，。 \! D .活體内投藥經濟部中央標準局員工消費合作杜印製將塗佈有PEG之陽離子性脂質體-質體複合物投予至得自

Simonsen Laboratories (Gilroy, CA)之 BALB/c老鼠，係將於 0.2-0.25毫升中之約1〇〇毫微莫耳脂質（約1〇〇微克質體）注入3隻老鼠之尾靜脈内。投予脂質體5分鐘後，250微升100 mM半胱胺酸經由尾靜脈注入各老鼠。注入後2 4小時，老鼠犧牲且組織（肺，肝）收集後再於麻醉下灌注入經肝素化 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨()>:2<)7公I ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 520297 Λ 7 ________Β7 五、發明説明（51 ) --- 之 PBS (4°C ) 〇在0.4。。溫度間，於各組織中加入〇·75毫升之細胞溶解試劑（Promega，Madison，WI)，組織再以2〇,⑽〇 rpm勻漿化工: 鐘。上清液移至微量離心管中，以1〇,〇〇〇g自旋5分鐘。I 清液收集後進行蟲螢光素酶及蛋白質分析。各樣品取2〇微升立即以發光計偵測（100微升蟲螢光素及含Ατρ之分析緩衝落液，1 0秒之測度）。以萃取物中蛋白質之含量來常規化相對光單位。結果示於圖1 1A-1 1B。實例9 脂質體之製備依“準方法製備融合性脂質體，係將下列脂質溶於氯仿中：8 5莫耳％二硬脂醯基磷脂醯基甘油（DspG)，i 〇莫耳 %依實例2，3或4所製備之共聚物-脂質共軛物，1莫耳％配位體-PEG-DSPE，依實例6或7所製備，及4莫耳％膽固醇。脂質在減壓下經由旋轉乾燥成薄膜。脂質膜加水相水化以形成脂質體，其再經由音波震盪或依序經由孔徑爲 0.4彳政米’ 0.2微米，0.1微米及〇·5微米之Nucleopore聚碳酸酯膜擠壓而成型，可得到1 〇〇-1 50毫微米大小之脂質體。實例1 0 有經包陷之DN A質體之脂質體 DNA 質體 pGL3 (Promega Corporation，Madison，WI)與亞精胺（自由驗，Sigma Chemical Co (St Louis，MO))縮合，再如下述般包陷在融合性脂質體内。 -54- $紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XW7公起’) — !!♦!<· ri Ί— 1----I ? (#先牝讀背面之注意事項再填寫衣百c 訂-- 520297 Λ 7 Β7 者及五、發明説明（52 製備10 mM Tris緩衝溶液ρΗ 7 5，其中含有〇」mM亞精胺。對1毫升的緩衝溶液（14 52微克亞精胺）中，加入來自含有0.6微克PGL3/微克水溶液之3〇微克質體。含有約2微克質體/微克亞精胺之質體-亞精胺溶液混合以形成n 經縮合之單分子。如實例9所述製備經乾燥之脂質薄膜，再以質體_亞精胺溶液再水化以形成其中包陷有經稠合之啦3質體分子

合性脂質體。 T 雖然本發明就其特殊具體實例已加以描述，但對精狹應是顯而易見的即在不偏離本發明精義下可有各種變^匕修飾。 ¾¾讀背面之注意寧項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 55 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（21〇入29 7公聲

Claims

520297 8 8 88-. APQCql 句第086114833號專利申請案中文申請專利範圍修正本(91年11月）六、申請專利範園 1. -種用於與標的膜融合之脂質體組合物，ϋ含脂質體懸浮液經設計可對準標的膜，其中各脂質體（i)含有包陷在脂質體内之治療劑，及（π)其係由囊-形成脂質所組成，部分脂質係衍生自二段共聚物，該二段共聚物係由共價鍵結至該脂質之疏水性聚合物鏈及親水性聚合物M所組成，該疏水性及親水性鏈係係以化學釋出鍵相連，該鍵可釋出親水性聚合物鏈，且曝露出疏水性聚合物鍵。 2·根據申請專利範圍弟1項之組合物，其中該脂質體進’ 一步係由含親水性聚合物鏈之囊-形成脂質所組成，該親水性聚合物鍵係藉由化學釋出鍵與囊-形成脂質相連。 3·根據申請專利範圍弟1項之組合物，其中該可釋出键是二硫化物鍵或是對pH值敏感之化學鏈結。 4.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該親水性聚合物鏈係由選自下列之親水性聚合物所組成，包括聚乙婦峨咯啶酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基嗔吐啦，聚羥基丙基噁唑啉，聚羝丙基異丁埽醯胺，聚異丁烯醯胺，聚二甲基丙晞醯胺，聚獲基丙基異丁晞酸酯，聚幾基乙基丙烯酸酯，羥基甲基纖維素，羥基乙基纖維素，聚乙二醇及聚天冬醯胺。 5·根據申請專利範圍第4項之組合物，其中該親水性聚合物鏈由具分子量在50(M〇,〇〇〇道耳呑間之聚乙二醇鏈所組成。 6·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該疏水性聚合物選自下列包括··聚氧丙晞，聚乙婦，聚丙烯，聚碳酸本紙張尺度國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 520297 A BCD 申請專利範圍酯，聚苯乙晞，聚砜，聚苯醚及聚氧丁撐所組成之群組0 7·根據申請專利範圍第6項之組合物，其中該疏水性聚八物是聚氧丙烯具有介於500-3,000道耳呑間之分子量。 8·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該疏水性聚合物是一種線型聚合物可有效地造成紅血球細胞之溶血，此係當含有疏水性聚合物及親水性聚合物鏈，且經由二硫化物鍵連接至疏水性聚合物鏈相對端，之水溶性三^段共聚物與該細胞共培育時，且培育物以還原劑處理。 9·根據申清專利範圍弟1項之組合物，其中該脂質體進— 步含有配位體，其粘附至親水性聚合物鏈之末端，該配位體可在親水性聚合物鏈被化學釋出之前有效達成與標的細胞表面之受體分子之配位體-特異的結合。 10·根據申請專利範圍第9項之組合物，其中該配位體選自下列包括：⑴葉酸，其中組合物用於治療具有細胞_表面葉酸受體之腫瘤細胞，（ii)吡哆基，其中組合物用於治療有病毒感染之CD4+淋巴細胞？及（iii)唾液基_Lewisx，其中組合物用於治療發炎區域。 11·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中脂質體進一步包括配位體，其粘附至脂質體表面，該配位體可在親水性聚合物外衣被化學釋出之後，而非之前，有效地結合至標的細胞表面受體分子。 12·根據申凊專利範圍第1項之組合物，其中該脂質體進一步包括陽離子性脂質，可在親水性聚合物外衣被化學釋 -2 - 520297 A8 B8 C8 一____ D8 六、申請專利範圍出之後，而非之前，有效地傳達陽性脂質體-表面電荷’以加強脂質體與標的細胞之結合。 13·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中包陷在脂質囊中的作用物是一種聚核嘗酸，當其為標的細胞所吸收時可表現出所選定的蛋白質。 14·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中包陷在脂質體内的作用物是一種寡核甞酸或寡核甞酸同系物，可有效地達到與細胞RNA或DNA之序列-特異的結合。 * 15· —種將化合物遞送至個體標的細胞之醫藥組合物，其包括 · 脂質體經設計可經由血流達到標的細胞，各脂質體含有（i )呈經包陷型式之該化合物，且（i i )由囊-形成脂質所組成，部分脂質係衍生自二段共聚物，該二段共聚物係由共價鍵結至該脂質之疏水性聚合物鏈及親水性聚合物鏈所組成，該疏水性及親水性鏈係係以化學釋出键相連，該 -鍵可釋出親水性聚合物鏈，且曝露出疏水性聚合物鏈，其中當脂質體與化學作用物接觸時，會釋出形成該表面外衣之鍵，由是將该疏水性聚合物曝露出來，而可與標的細胞之外細胞膜交互作用，並促進脂質體與標的細胞之融合。 16·根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其中該接觸包括對個體投予可有效釋出該鏈之還原劑。 17·根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其中該化學鏈結是一種二硫化物鏈結，且該還原劑選自下列包括半胱 -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 520297 A8 B8 C8 ------- D8__ 六、中請專利範圍 ^ ~ ' 胺酸，穀胱甘肽及抗壞血酸鹽。 18·根據申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中該親水性聚合物鏈各自經由pH敏感性化學鏈結可釋出地粘附至脂質體，且該接觸包括將脂質體對準某部位，其具有可有效釋出該鏈之pH值。 !9·根據申請專利範圍第1 8項之醫藥組合物，其中該脂質體具有介於0.03-0.40微米間之大小-以可外溢至固體腫瘤。 2〇·根據申請專利範圍第i 5項之醫藥組合物，其中該脂質’體進一步含有配位體，其粘附至親水性聚合物鏈之末端，而該配位體於親水性聚合物鏈被化學釋出之前，可有效地達成與標的細胞表面之受體分子之配位體-特異的結合。 21·根據申請專利範圍第2 〇項之醫藥組合物，其中該配位體選自下列包括：⑴葉酸，其中組合物可用於治療具有細胞·表面葉酸受體之腫瘤細胞，（丨丨）吡哆基，其中組合物可用於治療被病毒感染的CD4 +淋巴細胞，及（in)唾液基· Lewisx ’其中組合物用於治療發炎區域。 22.根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其中脂質體進一步包括配位體，其粘附至脂質體表面，而該配位體於親水性聚合物鏈被化學釋出之後，而非之前，可有效地結合至標的細胞表面受體分子。 23·根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其中該脂質體進一步包括陽離子性脂質，而於親水性聚合物外衣被化學釋出之後，而非之前，可授予陽性脂質體-表面電 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Μ規格(21〇χ 297公爱) 520297 A BCD 、申請專利範圍荷’以加強脂質體與標的細胞之結合。 24· —種篩選疏水性聚合物其與標的膜之融合活性之此方法包括、在標的細胞之懸液中加入三段共聚物，其組成有欲試之疏水性聚合物片段，且經由化學可釋出鍵在聚入物片段之各端粘附親水性聚合物片段，後者可有效溶ς 水性聚合物片段於懸液中， "" 釋出該親水性聚合物，以將疏水性片段曝露至該栏% 細胞；及 ^ 分析懸液關於該標的細胞之溶血現象。。 25·根據中請專利範圍第24項之方法，其中該標的細胞是紅血球細胞。 26.根據申請專利範圍第24項之方法，纟中該可釋出之鏈結是-種二硫化物鏈結，且該釋出包括將還原劑加至懸液。 27·根據中請專利範圍第24項之方法，其中該親水性聚合物是具有介於1，000-5,000道耳呑間分子量之聚乙二醇。 28· —種聚合物-脂質共軛物，可用於促進標的膜之間之融合，其包括一個由親水性聚合物所組成之第一片段，一個由疏水性聚合物所組成之第二片段，該帛二片段經由化學可釋出键連接至該第一片段；且在該第二片段上粘附一個可形成囊之脂質膜。 29.根據申請專利範圍第28項之共軛物，其中該標的膜之一 -5-

為脂質體脂質雙層膜。 3〇·根據申請專利範圍第2 9項之共軛物，出脂質體表面之經定位元第一及第二質膜。其中該共輛物以伸片段併入脂質體脂 31·根f申請專利範圍第28至30項中任一項之共軛物，其中第二片段係為疏水性同質聚合物。 32·根據申請專利範圍第31項之共軛物，其中該同質聚合物 1選自下列包括：聚氧丙晞，聚乙烯，聚丙晞，聚^酸酯，聚苯乙烯，聚颯，聚苯醚及聚氧丁撐所組成之群 33·根^請專利範圍第31項之共輛物，其中該疏水性聚合物是聚氧丙埽具有介於500_3,〇〇〇道耳呑間之分子量。 34. 根據申请專利範圍第3丨項之共軛物，其中該键是含有硫之鍵。 35. 根據申請專利範圍第3 !項之共輛物，其中該鍵為pH敏感或對硫解作用或水解作用具感受性。 36·根據申請專利範圍第3丨項之共軛物，其中該疏水性聚合物鏈係由選自下列之親水性聚合物所組成，包括聚乙烯吡咯啶酮，聚乙晞甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羥基丙基噁唑啉，聚羥丙基異丁烯醯胺，聚異丁晞醯胺，聚二曱基丙綿·醯胺，聚經基丙基異丁晞酸酯，聚羥基乙基丙烯酸酯，羥基甲基纖維素，羥基乙基纖維素’永乙一鮮及聚天冬酿胺。 37·根據申請專利範圍第3 i項之共軛物，其中該親水性聚合 -6 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公董) 520297 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍物鏈由具分子量在500-10,000道耳呑間之聚乙二醇鏈所組成。 38. 根據申請專利範圍第3 1項之共軛物，其進一步含有配位體，其粘附至親水性聚合物鏈之末端，該配位體有效達成與標的細胞表面之受體之配位體一特異的結合。 39. —種製備脂質體組合物之方法，其包含：提供預成形脂質體之懸浮液，該脂質體包含有包陷之治療化合物；提供共軛物懸浮液，其中各共軛物包含（i )具有極性頭端基團及疏水性尾端之脂質，（ii)具有基部端及末端之親水性聚合物，其中該聚合物以其基部端與脂質之頭端基團相連，及（ii i)連接至該聚合物之末端標的配位體；及於可有效地將至少部分該共軛物插入預成形脂質體之條件下培養預形成脂質體與共軛物懸浮液。 40. —種用於根據申請專利範圍第3 9項方法之共軛物懸浮液，其中該懸浮液包含含有共軛物之微球，該共軛物包含（i)具有極性頭端基團及疏水性尾端之脂質，（i i)具有基部端及末端之親水性聚合物，其中該聚合物以其基部端與脂質之頭端基團相連，及（i i i )連接至該聚合物之末端標的配位體。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 520297 第86114833號專利申請案中文圖式倐正^(89年4月）

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