BR112019022016A2 - Lipossomas fusogênicos, composições, kits e uso dos mesmos no tratamento do câncer - Google Patents

Lipossomas fusogênicos, composições, kits e uso dos mesmos no tratamento do câncer Download PDF

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Kaneti Galoz
Gershon David
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Abstract

lipossoma fusogênico compreendendo uma bicamada lipídica que compreende uma pluralidade de moléculas lipídicas tendo de 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específico capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação; e opcionalmente compreendendo adicionalmente um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional. também são fornecidos métodos de tratamento de câncer usando o lipossoma fusogênico.

Description

Relatório Descritivo do Pedido de Patente para: LIPOSSOMAS FUSOGÊNICOS, COMPOSIÇÕES, KITS E SEUS USOS DOS MESMOS NO TRATAMENTO DO CÂNCER
[001]O arquivo ou pedido de patente contém pelo menos um desenho feito em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
CAMPO DE INVENÇÃO
[002]A presente invenção se refere em geral aos conjuntos supramoleculares incluindo construtos de lipossomas para uso em terapia de câncer.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003]A imunoterapia é considerada uma das áreas mais promissoras na terapia do câncer, pois utiliza o sistema imunológico do corpo para combater o câncerig. Foi sugeridos que a formação do tumor começa com as células tumorais heterogênicas (contendo as mutações tipo motorista e tipo passageiro suficientes)4 que são atacadas pelas células imunológicass, resultando em um nicho tumorale menos heterogênico que, então, evita a identificação eficaz pelas células imunológicas e recruta as células antiinflamatórias, como as células T reguladoras e os macrófagos infiltrantes de tumores (TAMs)7. Diferentes tipos de câncer empregam mecanismos que permitem que estes evitem a detecção
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2/102 imunológica e, consequentemente, escapar da morte pelas células imunológicas. As alternativas, que geralmente são empregadas como primeira linha de tratamento, a quimioterapia, geralmente incluem efeitos colaterais fora do alvo que afetam gravemente a qualidade de vida dos pacientes, desde danos à mucosa, pele, medula óssea e outros tecidos.
[004]As terapias imunológicas predominantes contra o câncer incluem as células quiméricas do receptor T do antígeno (CAR-T) s, leucócitos infiltrantes de tumores (TIL) usados contra cânceres primário e metastáticog, e bloqueio do ponto de verificação imunológica usando anticorpos bloqueadores da inibiçãoio. Essas abordagens dependem da identificação de células cancerígenas pelas células imunológicas para permitir a morte do câncer?. Por exemplo, a abordagem de células CAR-T requer um marcador existente na célula cancerígena (por exemplo, células cancerígenas YescartaTM e CD19 positivas), a abordagem TIL requer uma alta abundância de mutações associadas a tumores e o bloqueio do ponto de verificação imunológica exige altos níveis de expressão de câncer de moléculas inibidoras (por exemplo, níveis de PD1L/PD2L acima de 50%) 3,11· Essas abordagens contêm vários efeitos colaterais graves que duram muito. As células CAR-T requerem o isolamento e a transfecção das células T para expressar um receptor de célula T modificado com uma proteína de ligação ao câncer (FV de cadeia única, SCfv),
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3/102 crescer e expandir as mesmas em condições ex vivo. Além disso, o CAR-T é desprovido de uma função de desligamento para permitir que os pacientes que sofrem de efeitos colaterais graves melhorem o bem-estar geral. A abordagem TIL requer a biópsia do tumor para permitir o isolamento de células T, sua ativação, expansão e reinserção nos pacientesi. Ambas abordagens de células CAR-T e TIL promovem a atividade imunológica ao câncer. Os inibidores do ponto de verificação imunológico permitem que as células imunológicas ataquem um câncer evasivo, expressando os níveis elevados de PD1L, por exemplo. Ao empregar a terapia anti-PDl, o sinal inibitório mediado por PD1 é impedido de maneira sistêmica e demonstrou incluir os efeitos colaterais autoimunes. Todas as abordagens acima mencionadas requerem a identificação das células T killer de células cancerígenas como um prérequisito para a eficácia (isto é, as células cancerígenas devem apresentar os peptídeos que a célula T killer reconhece e, portanto, é ativada e mata as células cancerígenas).
[005]Permanece, portanto, uma necessidade urgente de técnicas que contornem a seleção natural limitada de antígenos específicos de tumores, enquanto utilizam a capacidade natural do sistema imunológico de atacar e matar as células tumorais.
STTMÁRTO ΠΆ TNVF.NÇAO
[006]O presente pedido descreve as modalidades de uma
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4/102 plataforma de marcação imunológica que permite a morte de células cancerígenas ativando especificamente o sistema imunológico. O conceito inclui a modificação das membranas celulares para marcar as células específicas com os agentes ativadores imunológicos pelo uso de lipídeos capazes de integrar ou reagir com uma célula alvo, em que os lipídeos formam conjuntos como lipossomas, micelas e cubossomos, que podem se fundir com membranas; e um conjunto supramolecular projetado para liberar os lipídeos dentro ou nas proximidades de um tumor, como um gel lipídico, uma esponja lipídica, uma folha lipídica de bicamada ou monocamada, uma estrutura lipídica filamentosa e um cocleado lipídico. As partículas lipídicas que reagem com uma célula alvo se referem a uma reação de grupos reativos encontrados no conjunto supramolecular ou no agente de ativação do sistema imunológico com grupos reativos na superfície da célula (como aminas de proteínas na superfície ou outros grupos reativos). Por exemplo, Tosil-PEG4-Azida pode reagir com as proteínas após a liberação dos lipossomas na superfície de células cancerígenas/alvo.
[007]Em um exemplo não limitativo, os lipossomas da presente invenção se fundem com as células cancerígenas e resultam na exibição dos anticorpos nas membranas das células cancerígenas. Adicionamos um novo alvo nas células cancerígenas que permite que as células T killer reconheçam
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5/102 as células cancerígenas. A célula cancerígena imune marcada se liga, por exemplo, a uma célula T killer efetora/de memória especifica para um peptideo viral/não próprio. O conjunto de anticorpos ativa a célula T, que mata a célula cancerígena, secreta as citocinas pró-inflamatórias (IL2, IFNy etc.) e inicia a expansão clonal. Os clones resultantes são células T killer efetoras que são específicas apenas para matar as mesmas células apresentadoras de vírus/peptídeos não próprios. As células T expandidas procurarão essas células e matarão apenas essas células ou as células marcadas lipossômicas.
[008]Alternativamente, quando a célula cancerígena tratada com lipossoma encontra uma célula T killer ingênua específica para um peptideo próprio, o conjunto de anticorpos se liga à célula T killer ingênua através de receptor de célula T. Como a célula T ingênua não foi legitimamente ativada (por um antígeno apresentador de célula com moléculas co-estimuladoras), esta sofrerá anergia, o que significa que não será ativada e, portanto, incapaz de matar, secretar as citocinas pró-inflamatórias ou ser ativada.
[009]Além do efeito de permeabilidade aprimorada (RES), que melhora a chegada de lipossomas aos tumoresi2, usamos a carga negativa geral intrínseca nas células tumorais, em oposição à natureza neutra das células saudáveisis-is como
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6/102 elemento de aprimoramento da seletividade em nossa plataforma lipossômica.
[010]Em um aspecto, a presente invenção fornece um conjunto supramolecular compreendendo uma pluralidade de lipídeos, em que a cabeça hidrofílica de pelo menos um lipídeo do conjunto supramolecular é funcionalizada com um grupo funcional ou com um ou mais agentes ativadores do sistema imunológico. Este grupo funcional é um membro de um par de ligação, como tiol-maleimida, azida-alquino, aldeídohidroxilamina etc.
[011]Em outro aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma fusogênico compreendendo uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de ligação a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação.
[012]Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha externa, o referido método compreendendo a reação de um lipossoma fusogênico funcionalizado compreendendo uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas possuindo (a) 14 a 24 átomos de carbono e (b) um
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7/102 primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação com um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação, em que o referido segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional, produzindo assim o referido lipossoma fusogênico com o referido agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha externa.
[013]Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado às folhas interna e externa, o referido método compreendendo as etapas de (i) reação de uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica, com um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação, em que o referido segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, produzindo assim as moléculas lipídicas ligadas ao agente de ativação do sistema imunológico; e (ii) preparar o referido lipossoma fusogênico a partir das referidas moléculas lipídicas obtidas na etapa (i), desse
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8/102 modo produzindo o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação do sistema imunológico ligado às folhas interna e externa.
[014]Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológica ligado à folha interna com um agente do sistema imunológico praticamente mínimo ligado à folha externa.
[015]Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento de câncer pela marcação de células cancerígenas com um agente de ativação do sistema imunológico, o referido método compreendendo a administração de um lipossoma fusogênico a um paciente com câncer, em que o método compreende as etapas de (i) administração de lipossoma fusogênico ativador do sistema imunológico ao referido paciente com câncer compreendendo: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono e um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; e (b) um agente de ativação do sistema imunológico compreendendo o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional; ou (ii) administrar um lipossoma fusogênico funcionalizado ao referido paciente com câncer
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9/102 compreendendo uma bicamada lipídica que compreende uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; e subsequentemente à etapa (ii) administrar um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas.
[016]Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit compreendendo (a) um primeiro recipiente compreendendo um lipossoma fusogênico gue compreende (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; (b) um segundo recipiente compreendendo um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas; e (c) um panfleto com instruções para um método para o tratamento de
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10/102 câncer compreendendo a administração do lipossoma fusogênico a um paciente com câncer (a) e subsequentemente o agente de ativação de células T de (b).
[017]Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo o lipossoma fusogênico conforme definido em qualquer uma das modalidades acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[018]Várias modalidades podem permitir vários benefícios e podem ser usadas em conjunto com várias aplicações. Os detalhes de uma ou mais modalidades são apresentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens das técnicas descritas serão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[019]As modalidades divulgadas serão entendidas e apreciadas mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas. Os desenhos incluídos e descritos neste documento são esquemáticos e não estão limitando o escopo da divulgação. Note-se também que nos desenhos, o tamanho de alguns elementos pode ser exagerado e, portanto, não ser dimensionado para fins ilustrativos. As dimensões e as dimensões relativas não correspondem necessariamente a
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11/102 reduções reais na prática da divulgação.
[020]A Fig. IA mostra de forma esquemática: no lado esquerdo, uma molécula de lipídeo de formação de uma bicamada lipidica e modificada com um primeiro grupo funcional Fi; e à direita, um agente de ativação do sistema imunológico modificado com um segundo grupo funcional F2.
[021]A Fig. IB mostra de forma esquemática: no lado esquerdo, uma molécula de lipídeo de formação de uma bicamada lipidica e modificada com um primeiro agente de reticulação que compreende um primeiro grupo funcional Fi e um primeiro espaçador; e à direita, um agente de ativação do sistema imunológico modificado com um segundo agente de reticulação que compreende um segundo grupo funcional F2 e um segundo espaçador.
[022] As Figs. 2A-F mostram o modo de ação e marcação imunológica lipossômica de células cancerígenas. A. Layout da plataforma lipossômica: o par de ligação (I) é covalentemente ligado à molécula ligante (II) e conectado ao grupo principal lipídico. O lipídeo modificado é usado juntamente com outros lipídeos que melhoram a fusão para compreender o lipossoma. B. Anticorpo monoclonal (mAb) com ligante contendo um grupo funcional do par de ligação (I) ligado ao ligante com outro par de ligação (II), covalentemente conectado à cabeça lipidica (III) . C. Exemplo de ligação de ligante ao anticorpo e ao grupo lipídico: O
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NHS é adicionado a uma extremidade do ligante e a azida ou BCN (biciclo [6.1.0]-non-4-ine) é adicionada à outra extremidade do ligante, resultando em dois agentes de reticulação clicáveis. A amina primária (do grupo lateral diacil-fosfatidil-etanolamina ou lisina do anticorpo) ataca o SNS (grupo de saída, LG) e marca o grupo lipidico e o anticorpo com ligantes clicáveis. A azida e o BCN reagem, resultando na formação de ligações covalentes entre a cabeça lipidica e o anticorpo através do ligante formado pelos dois agentes de reticulação clicáveis. D. Ensaio de fusão versus absorção: um lipossoma marcado com FITC (fluorescência verde) (formulação N8 : DOTAP: DOPC: DOPE: DOPE-FITC: DSPEPEG2K 35 : 52,5 : 10 : 0,2 : X em que X é 5, 2,5, 1,25, 0, 625, proporção molar) foi usado com azida Ligada ao ligante PEG (194 Da). Os lipossomas foram incubados com células cancerígenas a 0,5 mM de lipídeos, lavados e corados usando uma sonda fluorescente vermelha marcada com DBCO (dibenzociclooctino)-Cy5 que é reativo com azida. E. Ilustração de diferentes abordagens usadas para liberar os anticorpos ativadores de células T para os tumores: A abordagem IN (I) é alcançada ligando o mAb à folha interna do lipossoma e alcançada usando uma reação de Click dependente de cobre para permitir a remoção de reagentes, catalisadores e mAbs não ligados durante o processo de produção. A abordagem OUT (II) é alcançada ligando o mAb à
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13/102 folha externa dos lipossomas após a produção de lipossomas. A abordagem IN/OUT é obtida pela ligação do mAb às folhas interna e externa do lipossoma. F. Marcação imunológica das células cancerígenas - modo de ação: Liposomas N8 (DOTAP: DOPC: DOPE: DOPE-FITC: DSPE-PEG2K 35:52,5:10:0,2:2,5, proporção molar) foram usados com azida ligada com ligante PEG4 (194 Da). Os lipossomas foram incubados com células cancerígenas a 5 mM de lipídeos por 1 hora, lavados e marcados usando anti-CD3-PEG4-BCN e anti-CD8-PEG4-BCN por 1 hora e lavados. As células cancerígenas marcadas imunologicamente ativam as células T killer e são mortas (ilustradas pela seta vermelha da degranulação e pontos vermelhos).
[023]As Figs. 3A-C mostram a calibração da preparação de lipossomas conjugados com Calceína. A. Cromatografia em camada fina da síntese de 6-Heptinoico-PE para a conjugação de lipossomas via química 'Click'. B. O efeito do comprimento da cauda hidrofóbica fosfolipídica na captação das células lipossômicas (37 °C) e na fusão das células lipossômicas (4 °C) . C. O efeito da concentração de colesterol na formulação lipossômica na captação de células lipossômicas (37 °C) e na fusão celular lipossômica (4 °C).
[024]A Fig. 4 mostra o estudo da atividade da composição lipossômica: fusão com células cancerígenas. Os lipossomas modificados por DSPE\DOPE-PEG4-N3 ou lipossomas de controle
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14/102 (DSPE não modificado) foram incubados com células 4TlmCherry por 1 hora a 37°C com 0,5mM de lipídeos, lavados e corados usando DBCO-Cy5 após análises usando citometria de fluxo (laranja e azul, respectivamente). São apresentados os percentuais médios de células marcadas com Cy5 para cada composição lipossômica. Barras de erro representam desvio padrão.
[025]As Figs. 5A-B são células positivas para fluorescência e a intensidade média fluorescente de um painel de células cancerígenas tratadas com formulação N8 usando diferentes proporções DSPE-PEG2000 em comparação com DOXIL e lipossomas não marcados (sem FITC e sem azida) . A. A captação de lipossomas e a marcação mediada por fusão foram determinadas para diferentes linhagens celulares de câncer e são apresentadas como percentual de células bloqueadas positivas para o sinal fluorescente. B. O índice/intensidade fluorescente média (MFI) das células tratadas com lipossomas é apresentado. O aumento da fluorescência é proporcional ao número de grupos fluorescentes dentro ou nas células cancerígenas. A média das células marcadas com fluorescência do total de células bloqueadas (10.000 por tubo, em triplicatas, em duas repetições independentes) é apresentada em gráficos de barras. Barras de erro representam desvio padrão.
[026]A Fig. 6 mostra a pilha Z de células 4TlmCherry
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15/102 tratadas com lipossomas marcados com FITC. As células 4TlmCherry foram incubadas com (DOTAP: DOPC: DOPE: DOPEFITC: DSPE-PEG2K 35:52,5:10:0,2:2,5) em 5mM de lipídeos por 1 hora a 37oC. Os núcleos foram corados usando Hoechst. As células foram lavadas e fotografadas usando microscópio confocal de varredura a laser (LSM 710). A barra de escala representa 20 pm.
[027]As Figs. 7A-C mostram os lipossomas direcionados para as membranas citoplasmáticas das células cancerígenas. A. As células de câncer de pulmão humano A549 foram coradas usando o corante PKH26 antes do experimento e foram incubadas com lipossomas (DOTAP: DOPC: DOPE: DOPE-FITC: DSPE-PEG2K 35:52,5:10:0,2:2,5) em 5mM de lipídeos por 1 hora. Os núcleos foram corados usando Hoechst (azul). As células foram lavadas e fotografadas usando microscópio confocal de varredura a laser (LSM 710). B. O carcinoma de pulmão Louis (murino) foi tratado de forma idêntica às células em B. C. As células de melanoma murino B16 foram tratadas de forma idêntica às células em A. Barra de escala 20 pm.
[028]A Figura 8 mostra o lapso de tempo confocal das células 4TlmCherry tratadas com lipossomas de marcação imunológica, concomitantemente incubadas com células T killer. Células 4TlmCherry (vermelhas, células aderentes maiores- vistas como cinza claro em escala de cinza, pois cada canal é separado em uma coluna diferente) tratadas com
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5mM de lipideos por 1 hora e suplementadas com anti-CD3 e anti-CD8, modificadas usando PEG4-BCN (abordagem 2STEP), foram concomitantemente incubadas com células T killer primárias marcadas com CFSE (verde) (células menores, não aderentes). A cultura concomitante foi mantida a 5% de CO2, a 37°C. São apresentadas imagens confocais tiradas a cada 50 minutos. A barra de escala representa 20 pm.
[029]A Fig. 9 mostra o lapso de tempo confocal de células 4TlmCherry não tratadas, concomitantemente incubadas com células T killer. As células 4TlmCherry (células aderentes maiores e vermelhas - vistas como cinza claro em escala de cinza, pois cada canal é separado em uma coluna diferente) foram concomitantemente incubadas com células T killer primárias marcadas com CFSE. A cultura concomitante foi mantida a 5% de CO2, a 37°C. São apresentadas imagens confocais tiradas a cada 50 minutos. A barra de escala representa 20 pm.
[030]A Fig. 10 mostra a análise de imagem do percentual de pixels vermelhos em imagens de lapso de tempo confocal. São apresentados os percentuais de pixels vermelhos em imagens tiradas de lapsos de tempo em diferentes momentos (0, 300, 600 e 900 minutos) mostrados nas Figs. 8 e 9. O percentual de pixels vermelhos (sinal de células cancerígenas) é apresentado para 2STEP (círculos pretos) ou para controle não tratado (círculos cinza). A quantificação
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17/102 da imagem foi realizada usando o software de análise de imagem FIJI sob parâmetros idênticos.
[031]As Figs. 11A-C mostram a eficácia sistêmica e a biodistribuição de lipossomas de marcação imunológica em modelo de camundongo com câncer de mama triplo negativo. Duas abordagens foram comparadas em camundongos portadores de tumor; abordagens de uma etapa e de duas etapas. As formulações lipossômicas foram injetadas por via intravenosa nos dias 3 e 10 (setas vermelhas). Os lipossomas marcadores 2STEP compreendendo DOPE-PEG4-BCN foram injetados e 3 horas após a injeção4-BCN foram injetados e 3 horas após a injeção de mAbs clicáveis (mAbs marcados com PEG-azida) foram injetados IV; 1STEP: Os MAb IN- ligados à folha interna; ou mAbs IN+ OUT- ligados às folhas interna e externa; controle de 2STEP - contém a mesma formulação lipídica que 2STEP, mas com mAbs não marcados. A. Médias de tamanho de tumor e barras de erro (erro padrão) são apresentadas. B. Plots spider individuais (cada gráfico apresenta um grupo, cada série apresenta dados de tamanho do tumor de um camundongo) são apresentados. C. Biodistribuição de lipossomas N8 (DOTAP:DOPC: DOPE :DSPE-PEG2000 35:52,5:10:2,5 onde DOPE foi modificado usando PEG-azida (N8) ou com anti-CD3 e anti-CD8 (N8 + OUT) ) com ou sem mAbs anti-CD3 e anti-CD8 ligados à folha externa (OUT) em comparação com a formulação DOXIL 24 horas após a injeção.
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[032]As Figs. 12A-C mostram análises imunohistoquímicas e histológicas de tumores, rins e fígados isolados de animais em 72 horas a partir da marcação imunológica de lipossomas. A. Tumores, rins e fígados foram isolados, fixados em formalina de base neutra, embebidos em parafina e corados com hematoxilina e eosina (H&E) ou com anti-CD3. As manchas de H&E são geralmente usadas para detectar alterações na morfologia do tecido, o que indica dano no tecido. A coloração com anti-CD3 foi usada para detectar as células T nos tecidos selecionados (marrom escuro, alguns destacados com pontas de seta verdes). A inserção à esquerda de cada micrografia representa a visão geral da lâmina. B. Tumores, rins, fígados, pulmões e baços foram isolados de camundongos com tumor 4T1 e foram digeridos em células únicas. As células foram incubadas com 0,5 mM de lipideos da formulação N8 (2STEP ou OUT) por 1 hora e foram lavadas e coradas usando DBCO-Cy5. As células primárias de 2 camundongos em triplicatas foram analisadas utilizando a citometria de fluxo para a fluorescência Cy5. C. Os pixels marrons (sinal de célula T) foram quantificados usando FIJI e são apresentados como o percentual da região de interesse testada (ROI) . As imagens de tumor, fígado e rim foram divididas em pelo menos 10 ROIs (aproximadamente 100 μπΐ2, excluindo o núcleo necrótico do tumor) e analisadas quanto à coloração de CD3. Barras de erro representam desvio padrão.
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DESCRTÇAO DETAT.HADA DA TNVF.NÇAO
[033]Na descrição a seguir, vários aspectos do presente pedido serão descritos. Para fins de explicação, as configurações e os detalhes específicos são estabelecidos para fornecer um entendimento completo do presente pedido. No entanto, também será evidente para um especialista na técnica que o presente pedido pode ser praticado sem os detalhes específicos aqui apresentados. Além disso, os recursos conhecidos podem ser omitidos ou simplificados para não obscurecer o presente pedido.
[034]O termo compreendendo, usado nas reivindicações, é aberto e significa os elementos mencionados, ou seus equivalentes em estrutura ou função mais qualquer outro elemento ou elementos que não tenham sido mencionados. Este não deve ser interpretado como restrito aos meios listados a seguir; não exclui outros elementos ou etapas. Este precisa ser interpretado como especificando a presença dos recursos, o todo, etapas ou componentes mencionados, mas não impede a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, o todo, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, o escopo da expressão um dispositivo compreendendo x e z não deve ser limitado aos dispositivos constituídos apenas pelos componentes x e z. Além disso, o escopo da expressão um método compreendendo as etapas x e z não deve ser limitado aos métodos que consistem apenas nessas etapas.
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[035]A menos que seja especificamente indicado, como aqui usado, o termo cerca de é entendido como estando dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de dois desvios padrão da média. Em uma modalidade, o termo cerca de significa dentro de 10% do valor numérico reportado do número com o qual está sendo usado, preferencialmente dentro de 5% do valor numérico reportado. Por exemplo, o termo cerca de pode ser entendido imediatamente como 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. Em outras modalidades, o termo cerca de pode significar uma maior tolerância à variação dependendo, por exemplo, da técnica experimental usada. As referidas variações de um valor especificado são entendidas pelo técnico especialista no assunto e estão dentro do contexto da presente invenção. Como ilustração, uma faixa numérica de cerca de 1 a cerca de 5 deve ser interpretada para incluir não apenas os valores explicitamente mencionados de cerca de 1 a cerca de 5, mas também inclui valores e sub-faixas individuais dentro da faixa indicada. Assim, estão incluídos nesse faixa numérica os valores individuais como 2, 3 e 4 e as subfaixas, por exemplo, dela3a2a4e3a5, além de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, individualmente. Esse mesmo princípio se aplica às faixas que mencionam apenas um valor numérico como mínimo ou máximo. Salvo disposição em contrário do contexto, todos
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21/102 os valores numéricos aqui fornecidos são modificados pelo termo cerca de. Outros termos semelhantes, como substancialmente, geralmente, até e semelhantes devem ser interpretados como modificando um termo ou valor de modo que não seja absoluto. Tais termos serão definidos pelas circunstâncias e pelos termos que eles modificam à medida que esses termos são entendidos pelos técnicos especialistas no assunto. Isso inclui, pelo menos, o grau de erro experimental esperado, erro técnico e erro instrumental para um determinado experimento, técnica ou instrumento usado para medir um valor.
[036]Conforme aqui usado, o termo e/ou inclui toda e qualquer combinação de um ou mais dos itens listados associados. Salvo definido em contrário, todos os termos (incluindo os termos técnicos e os científicos) aqui utilizados possuem os mesmos significados que os comumente entendidos por um técnico especialista no assunto aos quais a presente divulgação pertence. Será entendido ainda que termos, como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado consistente com seu significado no contexto da especificação e da técnica relevante e não devem ser interpretados de maneira ideal ou excessivamente formal a menos que expressamente definido aqui. As funções ou as construções conhecidas não podem ser descritas em detalhes por questões
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22/102 de brevidade e/ou clareza.
[037]O conjunto supramolecular da invenção, sua preparação e uso do mesmo, são descritos com relação aos seguintes aspectos, frases e modalidades. Salvo indicação em contrário, todos os aspectos, frases e modalidades devem ser lidos como capazes de serem combinados com quaisquer outros aspectos, frases e modalidades, a menos que essa combinação não faça sentido técnico ou seja explicitamente declarado de outra forma.
[038]Para maior clareza, as modalidades especificas do conjunto supramolecular são definidas no contexto da configuração especifica de lipossomas fusogênicos, mas também são aplicáveis a outras configurações dos conjuntos supramoleculares.
[ 039] Verificou-se, de acordo com a presente invenção, que certas combinações de lipideos com diferentes proporções de lipideos carregados positivamente (como DOTAP) e zwitterion (como DAPE, diacil fosfatidiletanolamina, DAPC) melhoraram significativamente a fusão com células cancerígenas. A plataforma de marcação lipossômica da invenção foi usada para marcar preferencialmente as células cancerígenas com um grupo funcional de um par de ligação, como a química de Click (Fig. 2A) . Este grupo funcional é usado para adicionar um agente de ativação imunológica, como anticorpo monoclonal (mAb) (Exemplos 1 a 4) . Foi ainda
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23/102 mostrado aqui que a administração do lipossoma da presente invenção a modelos animais de câncer resulta em um perfil de biodistribuição semelhante ao da formulação DOXIL (doxorrubicina encapsulada em um lipossoma), que é prescrita rotineiramente para tratamento de câncer e é usada como referência ou padrão-ouro para o tratamento (Exemplo 5). Além disso, a administração do lipossoma da presente invenção transportando anticorpos ativadores de células T resulta em recrutamento significativo de células T para tumores, mas não para fígado e rins. Além disso, verificou-se que os lipossomas incubados com células tumorais primárias, rins, pulmão do fígado ou células do baço e testados quanto à fusão sofreram fusão eficiente com as células tumorais, enquanto que as células derivadas de tecidos saudáveis apresentaram fusão muito baixa com os lipossomas de marcação imunológica (Fig. 11B). Coletivamente, os dados mostrados na Fig. 10C, com as Figs. 11A-C, enfatizam a seletividade dos lipossomas em relação às células tumorais, em oposição a tecidos saudáveis, como o fígado, apesar de sua presença aumentada devido a diferentes modos de ação. Finalmente, o crescimento do tumor foi significativamente inibido em animais tratados com o lipossoma da presente invenção em comparação com animais tratados com um lipossoma de controle sem o grupo funcional dos anticorpos ativadores das células T.
[040]Em um aspecto, a presente invenção fornece um
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24/102 conjunto supramolecular compreendendo uma pluralidade de lipídeos, em que a cabeça hidrofílica de pelo menos um lipídeo do conjunto supramolecular é funcionalizada com um grupo funcional ou com um ou mais agentes ativadores do sistema imunológico. Este grupo funcional é um membro de um par de ligação.
[041]O termo par de ligação, conforme aqui utilizado, refere-se a um par de moléculas diferentes, cada uma compreendendo seu próprio grupo funcional específico, ambos os grupos funcionais têm especificidade particular para (ou complementar a) um ao outro. Em outras palavras, estes grupos, em condições normais, são capazes de se ligar um ao outro, de preferência a se ligar a outras moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. Exemplos não limitativos de tais pares de ligação são tiol-maleimida, azida-alquino, aldeído-hidroxilamina etc.
[042]Em geral, um grupo funcional é um grupo ou porção específica de átomos ou ligações dentro de moléculas que é responsável pelas reações químicas características dessas moléculas. Em particular, um grupo funcional, ou um grupo funcional de um par de ligação, como aqui definido, referese a um grupo reativo específico ou fração de átomos ou ligações do par de ligação (doravante um primeiro grupo funcional) capaz de se ligar a outro grupo funcional do referido par de ligação (daqui em diante um segundo grupo
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25/102 funcional). Como mencionado acima, o primeiro e o segundo grupos funcionais são complementares entre si. Nos exemplos não limitativos acima, os primeiros grupos funcionais são tiol, azida ou aldeído e seus (segundos) grupos funcionais complementares são maleimida, alquino ou hidroxilamina, respectivamente.
[043]Em geral, os reagentes de reticulação (ou agentes de reticulação), como aqui definidos, referem-se a moléculas que contêm duas ou mais extremidades reativas (grupos funcionais) capazes de se ligar quimicamente a grupos reativos específicos (aminas primárias, sulfidrilas, etc.) em proteínas ou outras moléculas. Em particular, os agentes de reticulação como aqui definidos compreendem grupos funcionais e espaçadores.
[044]Em certas modalidades, o primeiro grupo funcional, como aqui definido, constitui uma extremidade reativa do primeiro agente de reticulação, e o segundo grupo funcional, como aqui definido, constitui uma extremidade reativa do segundo agente de reticulação (Fig. 1B) . Em outras modalidades, os espaçadores dos agentes de reticulação são omitidos, deixando apenas grupos funcionais no par de ligação (Fig. IA).
[045]Em certas modalidades, o conjunto supramolecular é selecionado a partir de uma partícula lipídica, capaz de se fundir ou reagir com uma célula alvo, como um lipossoma,
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26/102 uma micela e um cubossomo; e um conjunto supramolecular projetado para liberar lipideos dentro ou nas proximidades de um tumor, tal como um gel lipidico, uma esponja lipidica, uma folha lipidica de bicamada ou monocamada, uma estrutura lipidica filamentosa ou um cocleado lipidico.
[046]Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento de câncer pela marcação de células cancerígenas com um agente de ativação do sistema imunológico, o referido método compreendendo a administração a um paciente com câncer de um lipossoma fusogênico, em que o método compreende as etapas de (i) administração de lipossoma fusogênico ativador do sistema imunológico ao referido paciente com câncer compreendendo: (a) uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono e um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; e (b) um agente de ativação do sistema imunológico compreendendo o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional; ou (ii) administrar um lipossoma fusogênico funcionalizado ao referido paciente com câncer compreendendo uma bicamada lipidica que compreende uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas
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27/102 lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; e subsequentemente à etapa (ii) administrar um agente de ativação do sistema Ímunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas.
[047]Da mesma forma, a presente invenção fornece (1) um lipossoma fusogênico para uso no tratamento de câncer pela marcação de células cancerígenas com um agente de ativação do sistema Ímunológico, em que o referido lipossoma fusogênico compreende: (a) uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono e um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; e (b) um agente de ativação do sistema Ímunológico compreendendo o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional; ou (2) uma combinação de um lipossoma fusogênico funcionalizado e um agente de ativação do sistema Ímunológico funcionalizado para uso no tratamento de câncer, em que o referido lipossoma fusogênico funcionalizado compreende uma bicamada lipidica
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28/102 compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação, e o referido agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado é funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar da ligação par capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, e a combinação é para administração por um regime de dosagem compreendendo a administração do referido lipossoma fusogênico funcionalizado antes da administração do referido agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado.
[048]O termo lipossoma, como aqui utilizado, se refere a uma nanopartícuia ou construto lipídico compreendendo uma bicamada lipidica composta por um folhas interna e externa, que encapsula um interior aquoso dos lipossomas.
[049]O termo lipossoma fusogênico, como aqui utilizado, se refere a um construto lipossômico que se funde preferencialmente com a membrana plasmática de uma célula alvo e é absorvida por endocitose em menor grau.
[050]Em geral, como aqui definido, o termo marcação (de) células se refere a qualquer modificação das células
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29/102 que as diferenciam estruturalmente das células não modificadas. Em particular, as células na presente invenção são modificadas ou marcadas com um grupo funcional de um lipossoma fusogênico ou com um agente de ativação do sistema imunológico.
[051]Em uma modalidade, o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[052]Em uma modalidade, o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[053]Em uma modalidade, o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa e interna do lipossoma fusogênico.
[054]Em uma modalidade, o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado a partir de um agente de ativação de células T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de células T killer de memória; antígeno leucocitário humano solúvel (sHLA) apresentando um peptídeo
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viral; e um superantígeno. Em particular, o agente de
ativação do sistema imunológico pode ser um agente de
ativação de células T, como uir l anticorpo anti-CD3, um
anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D ou uma combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de se ligar a CD3 e NKG2D, ou um anticorpo dimerizante anti-NKG2D, ou fragmentos funcionais dos referidos anticorpos (scFv ou Fab); a citocina pró-inflamatória é selecionada a partir de IL2, IL-6, IL-17, IL-1, TNFa e ΙΕΝγ, ou uma combinação dos mesmos, opcionalmente ligada reversivelmente ao lipídeo através de um ligante hidrolisável; o peptídeo ativador de células T killer de memória é um peptídeo antimicrobiano, como uma adefensina; e o superantígeno é a toxina estafilocócica da síndrome do choque tóxico-1, TSST-1 ou antígenos de ação semelhante que podem ligar o receptor de células T ao MHC/HLA da célula alvo e induzir uma cascata que culmina na ativação das células T killer.
[055] Os anticorpos ou fragmentos funcionais dos mesmos aqui descritos se referem também a um fragmento variável de cadeia única (scFv); um fragmento funcional de um anticorpo; um anticorpo de domínio único, como um Nanobody; e um anticorpo recombinante; (11) um anticorpo mimético, tal como uma molécula de anticorpo; um afiliado; um afímero; uma afitina; um alfabody; uma anticalina; um avímero; uma
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DARPina; um finômero; um peptídeo do domínio Kunitz; e um monobody; ou (iii) um aptâmero.
[056]Deve ficar claro que os anticorpos ou os fragmentos funcionais dos mesmos utilizados na presente invenção não cumprem a função de agente de direcionamento (levar o lipossoma a uma determinada célula alvo), mas cumprem a função de agente de ativação do sistema imunológico.
[057]Em certas modalidades, o agente de ativação imunológica pode atuar liberando a repressão imunológica exercida pelos pontos de verificação imunológica. Os pontos de verificação que podem ser manipulados para liberar a imunossupressão de acordo com a presente invenção podem ser selecionados do grupo que consiste em PD1-PDL1, PD1-PDL2, CD28-CD80, CD28-CD86, CTLA4-CD80, CTLA4-CD86, ICOS- B7RP1, B7H3, B7H4, B7H7, molécula semelhante a B7-CD28, BTLA-HVEM,
KIR-MHC classe I ou II, LAG3-MHC classe I ou II, CD137-
CD137L, OX40-OX40L, CD27-CD70, CD40L-CD40, TIM3-GAL9,
supresso r de Ig do domínio V da ativação de células T
(VISTA), estimulador dos genes de Interferon (STING),
imunoglobulina de células T e domínio do motivo inibitório baseado em tirosina (TIGIT), A2aR-adenosina e indoleamina2,3-dioxiigenase (IDO)-L-triptofano.
[058]Os agentes capazes de bloquear os pontos de verificação imunológica são conhecidos na técnicaie e estes agentes podem ser utilizados de acordo com a presente
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32/102 invenção. Cada uma das publicações citadas abaixo e Pardoll, 201217, é incorporada por referência como se aqui fosse totalmente divulgada.
[059]Por exemplo, anticorpos contra o ponto de verificação imunológica, como anticorpos anti-PDl, ligados aos lipossomas, podem melhorar o tempo de meia-vida dos anticorpos. Alternativamente, os inibidores do ponto de verificação imunológica de pequenas moléculas podem estar contidos nos lipossomas e liberados no ambiente do tumor. Espera-se que a liberação direcionada de tais anticorpos ou inibidores de pequenas moléculas reduza significativamente os efeitos colaterais.
[060]Por exemplo, o anticorpo anti-PD-1, usado de acordo com a presente invenção, pode ser selecionado dentre os divulgados em Ohaegbulam etl al.is, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência, isto é, CT-011 (pidilizumabe; IgGl humanizado; Curetech), MK-3475 (lambrolizumabe, pembrolizumabe; IgG4 humanizado; Merck), BMS-936558 (nivolumabe; IgG4 humano; Bristol-Myers Squibb), AMP-224 (proteína de fusão PD-L2 IgG2a; AstraZeneca), BMS936559 (IgG4 humana; Bristol-Myers Squibb), MEDI4736 (IgG humanizado; AstraZeneca), MPDL3280A (IgG humana; Genentech), MSB0010718C (IgGl humana; Merck-Serono); ou o anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção pode ser MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca) um mAb IgG4 humanizado.
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[061]O anticorpo anti-CTLA4 pode ser Tremelimumabe (Pfizer), um anticorpo monoclonal IgG2 totalmente humano; ou ipilimumabe, um anticorpo monoclonal IgGl humano totalmente humano.
[062]Os receptores semelhantes a anti-imunoglobulina de célula killer (KIR) pode ser o Lirilumabe (BMS-986015; desenvolvido pela Innate Pharma e licenciado pela BristolMyers Squibb), um anticorpo monoclonal totalmente humano.
[063]O anticorpo anti-LAG-3 é direcionado contra o gene 3 de ativação de linfócitos. Um desses anticorpos que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é o anticorpo monoclonal BMS-986016 (pembrolizumabe; IgG4 humanizado; Merck).
[064]Uma lista representativa de inibidores do ponto de verificação imunológica de pequenas moléculas é apresentada na Tabela 2.
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Tabela 2
Alvo Inibid or Empresa/Inst ituição las indicações Desenvolví mento Referên cias
IDO 1MT, MTH- Trp Newlink Oncologia/HIV Descoberto 15, 28
ARG BCE, ABH Universidade da Pensilvânia Oncologia Descoberto 54
INSO L-NMMA Fuj isawa Sepse Descontinu ado 51, 133
os- 891160 Farmacopeia Inflamação Descoberto IDDB*
ARG/ONOS NCX- 4016 NicOx SA Oncologia/Car dio Fase II 52
COX2 Celebr ex Pfizer Inflamação Oncologia Lançado 134
rofeco xibe Merck Inflamação/On cologia Retirado 63, 66
EP2/ EP4 CP- 533536 Pfizer Osteoporose Fase I 62, 135
TGPRI SB- 505124 GlaxoSmithKl ine Inflamação/On cologia Descoberto IDDB
SD-208 J&J/Scios Inflamação/On cologia descoberto 96
LYS580 276 Lilly Inflamação/on cologia Descoberto 137
JAK/STAT JSI- 124 H. Lee Moffitt Oncologia Descoberto 101-103
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Cancer Center
GPA-7 H. Lee Moffitt Cancer Center Oncologia Descoberto 100, 138
VEGFR1(F LT1) SU5416 Pfizer Oncologia Descontinu ado 116, 139
AG- 13736 Pfizer Oncologia Fase II IDDB
CCR4 IC- 487892 IGOS Inflamação Descoberto IDDB
CXCR4 AMD310 0 AnorMed Oncologia/HIV Descoberto 140
CCR2 INCB33 44 Pfizer Inflamação Descoberto 141
* Base de dados de drogas sob investigação, ABH, ácido 2(S)-amino-
6-borohexanoico; ARG, arginase ; BEG, S-(2-b oroetil)-L-cisteina;
COX2, ciclo-oxigenase 2; EP2, receptor de prostaglandina 2, FLT1,
tirosona quinase s emelhante à FMS 1; IDO, indolamina 2,3-dioxigenase;
iNOS, óxido nítri co sintase induzível; JAK, Janus quinase; 1-NMMA,
Nc-monometil-L-arginina; 1MT, 1-metil-tri ptofano; MTH-Trp,
metiltiolhidantoína; NCX-4016, nitroaspirina; STAT, transdutor de
sinal e ativador de transcrição; TGFpRI, receptor β de fator de
crescimento de transformação tipo I; VEGFR1, receptor de crescimento endotelial vascular 1. fator de
Muller et al. Nature Reviews Cancer 6, 613-625 (August 2006)
[065]Em uma modalidade, o lipossoma compreende uma fração catiônica em pH fisiológico. Assim, em uma modalidade,
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36/102 a pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreende ainda um grupo catiônico, um polímero natural ou sintético catiônico, um amino-açúcar catiônico, um poliaminoácido catiônico ou um peptideo catiônico anfifílico de ligação às células cancerígenas.
[066]Em particular, pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico é selecionada a partir de cloreto dei,2-dioleoyl-3- cloreto de trimetilamôniopropano (DOTAP), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 1,2-di-Ooctadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA),
Dimetildioctadecilamônio (18:0 DDAB), e NI—[2—( (1S)—1— [ (3— aminopropil) amino]-4-[di(3-amino-propil) amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5); o polímero sintético é selecionado a partir de polietilenoiminas (PEI) e poli(2-(dimetilamino)etil metacrilato; o polímero natural é polissacarídeo, como a quitosana; o açúcar aminado é a glicosamina, o poliaminoácido catiônico é selecionado a partir depoli(L-lisina), poli(Larginina), poli(D-lisina) , poli(D-arginina) , poli(Lornitina) e poli(D-ornitina); ou o referido peptideo de ligação à célula cancerígena anfifílica é selecionado a partir de Cecropina A (KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK; (SEQ ID NO: 1); Cecropina A 1-8 (KWKLFKKI; (SEQ ID NO: 2) e CNGRC cíclico
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37/102 (SEQ ID NO: 3).
[067]Em uma modalidade mais particular, a referida molécula lipídica compreendendo um grupo catiônico é DOTAP.
[068]Em uma modalidade, a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é um fosfolipídeo selecionado do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina, uma fosfatidiletanolamina, uma fosfatidilserina, um ácido fosfatídico ou uma combinação dos mesmos, cada um dos quais compreende um ou dois resíduos de ácidos graxos idênticos ou diferentes, em que os resíduos de ácido graxo na fração fosfatidil são saturados, monoinsaturados ou poliinsaturados e possuem um comprimento de cadeia de carbono de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 carbonos, tais como miristoil, estearoil, palmitoil, oleoil, linoleoil, linolenoil (incluindo linololoil conjugado), araquidonolo na configuração fosfolipídica e liso-fosfolipídica e as combinações dos mesmos.
[069]Em modalidades particulares, o referido fosfolipídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-dimiristoil-3fosfatidilcolina (DMPC) ; 1,2-distearoil-3-fosfatidilcolina (DSPC); 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC); 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3Petição 870190132863, de 13/12/2019, pág. 42/109
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fosfocolina (16:1 (ã9-Cis) PC); 1,2-dipalmitelaidoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (16:1 ( ã9-Trans) PC); 1,2-
dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δδ-Cis) PC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (18:1 (A9-Cis) PC (DOPC)); 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δ9Trans) PC); 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC (DLPC)); 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC); 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC); 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3fosfocolina (20:4 (Cis) PC); 1,2-didocosahexaenoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC); 1,2-dierucoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (22:1 (Cis) PC) ; 1,2-dinervonoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (24:1 (Cis) PC) ; 1,2-dimiristoil-3--
3-fosfatidiletanolamina (DMPE) ; 1,2-dipalmitoil-3-
fosfatidiletanolamina (DPPE); dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-
distearoil-3-fosfatidiletanolamina (DSPE); 1,2-dimiristoil-
3-fosfatidilserine (DMPS); 1,2-dipalmitoil-3-
fosfatidilserine (DPPS); palmitoiloleoil
fosfatidiletanolamina (POPE); e 1,2-dioleoil-3-
fosfatidilserina (DOPS). Mais particularmente, o referido fosfolipídeo é selecionado de DOPC, POPC, DMPC, DPPC, DOPE, POPE, DSPE, DMPE e DPPE.
[070]Em uma modalidade, o lipossoma fusogênico compreende ainda uma fração de estabilização conectada a
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39/102 pelo menos uma das referidas moléculas lipidicas.
[071]O termo fração estabilizadora, como aqui utilizado, se refere a uma fração que, quando incorporada na bicamada lipidica do lipossoma, fornece meia-vida prolongada de circulação sanguínea dos lipossomas, em comparação com um lipossoma idêntico sem a fração estabilizadora.
[072]Em uma modalidade específica, a referida fração estabilizadora é selecionada a partir de polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano, um poliaminoácido, metil-polioxazolina, poliglicerol, poli (acrililil morfolina) e poliacrilamida. Por exemplo, a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa, por exemplo: 106 Da (PEG2) , 194 Da (PEG4) , 600Da (PEG600), 2kDa (PEG2000) e 4kDa (PEG4000). Em uma modalidade mais particular, a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 2kDa.
[073]Em uma modalidade, a referida fração estabilizadora é conectada a pelo menos uma das referidas moléculas lipidicas por meio de um ligante peptídico clivável, como VPMSMRGG (SEQ ID NO: 4) para metaloproteinase da matriz (MMP)-1, IPVSLRSG (SEQ ID NO: 5) ou GGGGPLGVRGGGGK (SEQ ID NO: 6) para MMP-2, RPFSMIMG (SEQ ID NO: 7) para MMP3, VPLSLTMG (SEQ ID NO: 8) para MMP-7, VPLSLYSG (SEQ ID NO: 9) para MMP-9 e IPESLRAG (SEQ ID NO: 10) para
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40/102 metaloproteinase de matriz 1 de membrana tipo (MT1-MMP), todas as quais podem ser modificadas no terminal N e/ou C com resíduos de aminoácidos, PEGs e outros ligantes.
[074]Em certas modalidades, o ligante clivável é um ligante clivável sensível ao pH, como ditiodipropionatoaminoetanol (DTP) ou ditio-3-hexanol (DTH).
[075]Em certas modalidades, o conjunto supramolecular projetado para liberar lipídeos, mas não o lipossoma fusogênico, compreende um polímero, como PEG, poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e alginato.
[076]Em certas modalidades, a cabeça hidrofílica de pelo menos um lipídeo da pluralidade de lipídeos é cada uma funcionalizada com um primeiro grupo funcional ou um segundo grupo funcional de um par de ligação capaz de se ligar um ao outro em condições normais, em preferência à ligação a outras moléculas ou formando entre si uma ligação covalente ou um conjugado não covalente de alta afinidade, em que o primeiro grupo funcional e o segundo grupo funcional do par de ligação são, por exemplo, mas não limitados a, (i) grupos reativos de uma química de reação de Click; ou (ii) uma biotina e um peptídeo de ligação à biotina ou proteína de ligação à biotina.
[077]O termo alta afinidade, conforme aqui usado, se refere a uma associação química ou biofísica, como acoplamento quelante e metal (por exemplo, Ni e uma sequência
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41/102 peptidica compreendendo vários resíduos His, como His 6) , ou uma conjugação entre dois membros de um par de ligação, por exemplo, um anticorpo e o seu epítopo alvo ou biotina e estreptavidina, etc., em que a associação entre os dois pares de ligação tem um Kd de 10-4 M a lO-so M, por exemplo, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, lO-io Μ, 10-n Μ, IO-12 M ou 12-13 M.
[078]Em uma modalidade, o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação.
[079]Em uma modalidade particular, o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação através de uma reação química de Click.
[080]Em uma modalidade particular, i) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alquino ou fosfina, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é azida, ou vice e versa; ii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é cicloalqueno, cicloalquino, ciclopropano, isonitrila (isocianeto) ou ácido vinilborônico , e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tetrazina ou vice e versa; iii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alquino ou maleimida, e o segundo grupo funcional do referido par de
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42/102 ligação é tiol, ou vice e versa; iv) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é dieno conjugado e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alqueno substituído ou vice e versa; v) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alqueno, alquino ou acetileto de cobre, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é nitrona, ou vice e versa; vi) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é aldeído ou cetona, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alcoxiamina, hidroxilamina, hidrazina ou hidrazida, ou vice e versa; ou vii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é aldeído, cetona, isotiocianato, ácido carboxílico ou seu derivado, como éster, anidrido, haleto de acila, tosil e N-hidrosuccinimida (NHS), e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é amina ou vice e versa. Em uma modalidade mais particular, o par de ligação específica é alquino-azida.
[081]Em uma modalidade, o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação não covalente com o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação.
[082]Em uma modalidade particular, o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é biotina, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é seu parceiro de ligação selecionado a partir de um peptídeo de ligação à
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43/102 biotina ou proteína de ligação à biotina, ou vice e versa. Por exemplo, a referida proteína de ligação à biotina pode ser selecionada a partir de avidina, estreptavidina e um anticorpo anti-biotina; e o referido peptídeo de ligação à biotina é selecionado a partir de AEGEFCSWAPPKASCGDPAK (SEQ
ID NO: 11) , CSWRPPFRAVC (SEQ ID NO: : 12) , CSWAPPFKASC (SEQ ID
NO: 13 ) e CNWTPPFKTRC (SEQ ID NO: 14) [Saggio and Laufer .
Biotin bi nders selected from a random peptide library
expressed on phage. Biochem. J :1993) 293, 613-616; aqui
incorporado por referência como se estivesse totalmente incluído]. Os resíduos de cisteína podem formar uma ligação dissulfeto e os ligantes podem ser ligados ao terminal N ou C ou a ambos os terminais.
[083]Em uma modalidade, o lipossoma fusogênico compreende ainda um primeiro espaçador entre a bicamada lipídica e o primeiro grupo funcional (Fig. 1B).
[084]Em uma modalidade, o agente de ativação do sistema imunológico compreende ainda um segundo espaçador entre o agente de ativação do sistema imunológico e o segundo grupo funcional (Fig. 1B).
[085]Em uma modalidade, o primeiro ou segundo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, (CeC12) alquil, ácido fenólico, benzoico ou naftoico mono-, diou tricarboxílicos, ácido tetrahidropireno mono-, di- ou tri-carboxílico, ou sais dos mesmos, éter cíclico, ácido
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44/102 glutárico, ácido succinato, ácido mucônico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, e ácido sebácido, e um peptídeo, como um peptídeo poli-Gly de cerca de 2-20 resíduos de aminoácido em comprimento, por exemplo, 3 resíduos de aminoácido em comprimento.
[086]Em uma modalidade específica, o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa, por exemplo: 106 Da (PEG2), 194 Da (PEG4) , 600Da (PEG600), 2kDa (PEG2000), e 4kDa (PEG4000); e mais particularmente o primeiro ou o segundo espaçador é PEG tendo um peso molecular de cerca de 194 Da (PEG4) .
[087]Alternativamente, em uma modalidade particular, o primeiro ou segundo espaçador é (C6-C12) alquil, de preferência heptil ou dodecanoil.
[088]Em uma modalidade, o lipossoma fusogênico compreende ainda colesterol (CHO) ou seus derivados.
[089]Em uma modalidade, o lipossoma tem um tamanho de até 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, cerca de 100 nm.
[090]Em certas modalidades, o lipossoma fusogênico compreende ainda em seu núcleo hidrofílico um ou mais agentes ativadores do sistema imunológico, como uma citocina pró
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45/102 inflamatória, por exemplo, IL2, IL-6, IL-17, IL-1, TNFa e ΙΕΝγ; pelo menos uma molécula estimulante, por exemplo, ionomicina; e pelo menos um peptídeo ativador de células T killer de memória.
[091]Em certas modalidades, o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa, folha interna ou folha externa e interno do lipossoma fusogênico; o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado a partir de um agente de ativação de células T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de células T killer de memória; e um superantígeno; pelo menos alguns dos referidos lipídeos compreendem ainda um grupo catiônico, um polímero natural ou sintético catiônico, um açúcar aminado catiônico, um poliaminoácido catiônico ou um peptídeo anfifílico de ligação a células cancerígenas; pelo menos alguns dos lipídeos são fosfolipídeos selecionados do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina, uma fosfatidiletanolamina, uma fosfatidilserina, um ácido fosfatídico ou uma combinação dos mesmos, cada um dos quais compreendendo um ou dois resíduos de ácidos graxos idênticos ou diferentes, em que os resíduos de ácido graxo na fração fosfatidil são saturados, monoinsaturados ou poliinsaturados e possuem um comprimento de cadeia de carbono de
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14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 carbonos, como miristoil, estearoil, palmitoil, oleoil, linoleoil, linolenoil (incluindo linolinoil conjugado), araquidonoil na configuração fosfolipídica e liso-fosfolipida e as combinações dos mesmos; o referido lipossoma compreende ainda uma fração estabilizadora conectada a pelo menos um dos referidos lipídeos ou dos referidos polímeros catiônicos; o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação ou o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação não covalente com o referido segundo funcional do referido par de ligação; o primeiro ou segundo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, (CeC12) alquil, ácido fenólico, benzoico ou naftoico mono-, diou tricarboxílico, tetrahidropireno mono-, di- ou tricarboxílico, ou sais dos mesmos, éter cíclico, ácido glutárico, ácido succinato, ácido mucônico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, e ácido sebacico, um peptídeo como um peptídeo poli-Gly de cerca de 2-20 resíduos de aminoácidos em comprimento, por exemplo, 3 resíduos de aminoácidos em comprimento; e o lipossoma tem um tamanho de até 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de
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47/102 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, cerca de 100 nm.
[092]Em uma modalidade particular, o sistema imunológico é um agente de ativação de célula T; a referida pelo menos uma das moléculas lipídicas compreende um grupo catiônico que é selecionado a partir de 1,2-dioleoil-3trimetilamôniopropano cloreto (DOTAP), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 1,2-di-Ooctadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA),
Dimetildioctadecilamônio (18:0 DDAB) e NI-[ 2-( (IS)-1-[(3aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil) amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), o referido polímero sintético é selecionado a partir de polietilenoiminas (PEI) e poli(2 -(dimetilamino)etil metacrilato, o referido polímero natural é quitosana, o referido açúcar amino é glicosamina, o referido ácido poliamino catiônico é selecionado a partir de poli(Llisina), poli(L-arginina), poli(D-lisina), poli(Darginina) , poli(L-ornitina) e poli(D-ornitina) , ou o referido peptídeo anfifílico de ligação à célula cancerígena é selecionado de Cecropin A; Cecropin A 1-8; e CNGRC cíclico; a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é selecionada a partir do grupo que consiste em 1-palmitoil2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-3
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48/102 fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-dimiristoil-3fosfatidilcolina (DMPC); 1,2-distearoil-3-fosfatidilcolina (DSPC); 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC); 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dipalmitelaidoil-snglicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC); 1,2dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δδ-Cis) PC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (18:1 (A9-Cis) PC (DOPC)); 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δ9Trans) PC); 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC (DLPC)); 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC); 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC); 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3fosfocolina (20:4 (Cis) PC); 1,2-didocosahexaenoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (22 : 6 (Cis) PC) ; 1,2-dierucoil-sn-
glicero-3-fosfocolina ( 22 : 1 (Cis) PC) ; 1,2-dinarvonoil-sn-
glicero-3-fosfocolina ( 24 : 1 (Cis) PC) ; 1,2-dimiristoil-3--
3-fosfatidiletanolamina (DMPE) r 1,2-dipalmitoil-3-
fosfatidiletanolamina (DPPE); dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ; 1,2-dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2distearoil-3-fosfatidiletanolamina (DSPE); 1,2-dimiristoil3-fosfatidilserina (DMPS); 1,2-dipalmitoil-3fosfatidilserina (DPPS); palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE); and 1,2-dioleoil-3
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49/102 fosfatidilserina (DOPS); a referida fração de estabilização é selecionada a partir de polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano, um ácido poliamino, metil-polioxazolina, poliglicerol, poli(acriloil morfolina) e poliacrilamida; o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específica é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional do referido par de ligação através de uma reação química de clique, i) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alquino ou fosfina, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é azida ou vice e versa; ii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é cicloalqueno, cicloalquino, ciclopropano, isonitrila (isocianida) ou ácido vinil borônico e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tetrazina ou vice e versa; iii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alquino ou maleimida e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tiol, ou vice e versa; iv) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é dieno conjugado, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alqueno substituído, ou vice e versa; v) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é alqueno, alquino ou acetileno de cobre, e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é nitrona, ou vice e versa; vi) o primeiro grupo funcional do
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50/102 par de ligação específica é aldeído ou cetona e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alcoxiamina, hidroxilamina, hidrazina ou hidrazida, ou vice e versa; ou vii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é aldeído, cetona, isotiocianato ou ácido carboxílico ou derivado do mesmo tal como um éster, anidreto, acil haleto, tosil e N-hidrosuccinimida (NHS) e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é amina, ou vice e versa, ou o primeiro grupo funcional do par de ligação específica é biotina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação e seu parceiro de ligação selecionado a partir de um peptideo de ligação à biotina ou proteína de ligação à biotina, ou vice e versa; e o primeiro ou segundo espaçador é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa, ou (C6-C12) alquil, preferencialmente heptil ou dodecanoil.
[093]Em uma modalidade mais particular, o agente de ativação de célula T é selecionado a partir de um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D, ou uma combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e NKG2D; a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico é DOTAP; o referido fosfolipídeo é selecionado a partir de DOPC, POPC, DMPC, DPPC, DOPE, POPE, DSPE, DMPE e DPPE; a fração de estabilização é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a
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51/102 cerca de 4kDa; o referido par de ligação especifica é alquino-azida, a referida proteína de ligação à biotina é selecionada a partir de avidina, estreptavidina e um anticorpo anti-biotina, ou o referido peptídeo de ligação à biotina é selecionado a partir de AEGEFCSWAPPKASCGDPAK (SEQ ID NO: 11), CSWRPPFRAVC (SEQ ID NO: 12), CSWAPPFKASC (SEQ ID NO: 13) e CNWTPPFKTRC (SEQ ID NO: 14); e o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de um peso molecular de cerca de 194 Da (PEG4) .
[094]Em uma modalidade mais particular, a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 2kDa.
[095]Em certas modalidades particulares, o lipossoma fusogênico compreende (a) DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4N3 ou DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN; ou (b) DMPC : Colesterol:DMPE-PEG4-N3 ou DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-BCN, PEG em que PEG2K representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa e PEG4 representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 194 Da e a quantidade molar relativa de DOPC é de até cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DOTAP é de até cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DSPEPEG2K é de até cerca de 20%, a quantidade molar relativa de DOPE-PEG4 é de até cerca de 20%, a quantidade molar relativa de HSPC é de até cerca de 65%, a quantidade molar relativa de colesterol é de até 40%, e a quantidade molar relativa de DMPC é de até cerca de 70%, e o lipossoma fusogênico tem um
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52/102 tamanho de cerca de 80 nm ou 100 nm.
[096]Em uma segunda determinada modalidade particular, o lipossoma fusogênico compreende (i) DOPC:DOTAP:DSPEPEG2K:DOPE-PEG4-N3 ou DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN, na proporção molar 52,5:35:0,6:10, 52,5:35:1,25:10, 52,5:35:2,5:10, 52,5:35:5:10, 52,5:35:0,6:5, 52,5:35:1,25:5, 52,5:35:2,5:5, 52,5:35:5:5, 65:20:5:10, 50:35:5:10, 52,5:35:1,25:7, 52,5:35:1,25:5, ou 52,5:35:2,5:7: ou (ii) DMPC: Cholesterol:DMPE-PEG4-N3 ou DMPC: Cholesterol:DMPE-PEG4-BCN, na proporção molar 60:35:5.
[097]Em uma terceira determinada modalidade particular, o lipossoma fusogênico compreende DOPC: DOTAP: DSPE-PEG2K: DOPE-PEG4-N 3 na proporção molar 52,5: 35: 2,5: 5 ou 52,5: 35: 2,5: 10.
[098]Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado através do referido segundo agente de reticulação ao primeiro agente de reticulação de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[099]Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado via o referido segundo agente de reticulação ao primeiro agente de reticulação de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna do lipossoma
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53/102 fusogênico
[0100] Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado via o referido segundo agente de reticulação ao primeiro agente de reticulação de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folhas interna e externa do lipossoma fusogênico.
[0101] Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[0102] Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[0103] Na primeira a terceira determinadas modalidades particulares, o referido agente de ativação de células T é conjugado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folhas interna e externa do lipossoma fusogênico.
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[0104] Em determinadas modalidades, a primeira etapa de (11) é realizada imediatamente, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias ou até 1 semana antes da segunda etapa de (ill)
[0105] Em determinadas modalidades, a temperatura de fusão (Tm) do lipossoma de qualquer uma das modalidades citadas acima é menor do que 45 °C, na qual o lipossoma fusogênico é mantido em uma fase de transição não cristalina, fornecendo assim a fluidez da membrana necessária para a fusão do lipossoma com as membranas celulares.
[0106] Em determinadas modalidades, o câncer sendo tratado usando o método de qualquer uma das modalidades citadas acima, é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, como câncer de mama triplo-negativo, melanoma e câncer de pulmão.
[0107] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma fusogênico compreendendo uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de ligação a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação.
[0108] Os componentes e o tamanho do lipossoma fusogênico, como moléculas lipídicas, grupos funcionais,
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55/102 espaçadores, agente de ativação do sistema imunológico, grupo catiônico, polímero natural ou sintético catiônico, amino-açúcar catiônico, poliaminoácido catiônico ou peptídeo de ligação às células cancerígenas anfifílicas e porção estabilizadora são como definidos nas modalidades acima relacionadas ao método de tratamento no qual elas podem ser usadas.
[0109] Em determinadas modalidades, o lipossoma fusogênico compreende ainda um primeiro espaçador entre a bicamada lipidica e o primeiro grupo funcional.
[0110] Em determinadas modalidades, o lipossoma fusogênico compreende ainda um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional.
[0111] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossoma fusogênico.
[0112] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna do lipossoma fusogênico.
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[0113] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico é ligado via o segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas em ambas as folhas interna e externa do lipossoma fusogênico.
[0114] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico compreende ainda um segundo espaçador entre o agente de ativação do sistema imunológico e o segundo grupo funcional.
[0115] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado a partir de um agente de ativação de células T; uma citocina próinflamatória; um peptídeo de ativação de células T killer de memória; e um superantígeno.
[0116] Em determinadas modalidades, o agente de ativação do sistema imunológico é um agente de ativação de células T.
[0117] Em determinadas modalidades, o agente de ativação de células T é selecionado a partir de um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8 ou uma combinação dos mesmos; e um anticorpo capaz de se ligar a CD3 e CD8.
[0118] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha externa, o referido método compreendendo a reação de
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57/102 um lipossoma fusogênico funcionalizado compreendendo (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos moléculas com 14 a 24 átomos de carbono e um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação com um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação, em que o referido o segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional, produzindo assim o referido lipossoma fusogênico conjugado ao referido agente de ativação de células T ligado à folha externa.
[0119] Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado às folhas interna e externa, o referido método compreendendo as etapas de (i) reação de uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica, com um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação, em que o referido segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, produzindo assim as moléculas lipídicas ligadas
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58/102 ao agente de ativação das células T; e (11) preparar o referido lipossoma fusogênico a partir das referidas moléculas lipídicas obtidas na etapa (1), desse modo produzindo o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação de células T ligado às folhas interna e externa.
[0120] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha interna. O método é baseado no conceito de controle de reação cinética. Os lipossomas são auto-montados a partir de bicamadas lipídicas a uma taxa de reação muito maior do que a ligação química formada entre dois grupos funcionais. Assim, um agente de ativação do sistema imunológico que não reagiu e outros reagentes ou catalisadores, como o catalisador de cobre para a reação química de Click dependente de cobre são encapsulados dentro do interior aquoso do lipossoma antes que ocorra qualquer reação química significativa na solução. O agente de ativação do sistema imunológico e/ou outros reagentes necessários para a reação química não são encapsulados no interior do lipossoma e são fisicamente removidos da solução, por exemplo, lavando os lipossomas formados. Alternativamente, as condições da reação, como o pH da solução, podem ser alteradas em algum momento para interromper ou inibir a
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59/102 reação química que ocorre fora do lipossoma, enquanto as condições da reação no interior aquoso do lipossoma permanecem inalteradas devido à barreira da bicamada lipídica. Exemplos não limitativos de catalisadores para a reação química de Click para formar os lipossomas da presente invenção são acetilacetonato de cobre (II), isonitrila de cobre (I) e qualquer outro catalisador ativo de cobre (I) gerado a partir de sais de cobre (I) ou sais de cobre (II) usando ascorbato de sódio como agente redutor. O agente de ativação do sistema imunológico e outros reagentes ou catalisadores podem ser removidos por exemplo, por diálise ou filtração em gel ou reagindo um ou ambos os grupos funcionais do agente de ativação imunológico ou lipídeos com um excesso de um grupo funcional livre correspondente que esgota os grupos funcionais do agente de ativação imunológica ou lipídeos e, portanto, interrompe ou inibe a reação.
[0121] Assim, o método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha interna compreende as etapas a seguir. Na primeira etapa, uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica, é misturada em uma solução com um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do
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60/102 par de ligação capaz de se ligar em condições de reação adequadas ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas. Sem a introdução de reagentes ou catalisadores, a reação química entre os dois grupos funcionais é relativamente lenta. Como resultado, as moléculas lipídicas são auto-montadas em lipossomas na primeira etapa da reação, encapsulando assim uma fração das referidas moléculas do agente de ativação de células T dentro do interior aquoso dos lipossomas. Na segunda etapa, as moléculas do agente de ativação das células T que não foram encapsuladas e permaneceram na solução fora dos lipossomas, são removidas ou lavadas. Opcionalmente, a reação das moléculas lipídicas com as moléculas do agente de ativação de células T não encapsuladas pode ser inibida como descrito acima. Na terceira etapa, a reação das moléculas lipídicas com o agente de ativação de célula T encapsulado dentro do interior aquoso dos lipossomas preparados na primeira etapa é realizada, em que o referido segundo grupo funcional do referido agente de ativação de célula T se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, produzindo assim o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação de células T ligado à folha interna.
[0122] Em determinadas modalidades, o método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de
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61/102 ativação do sistema imunológico ligado à folha interna compreende as etapas de (i) preparação de lipossomas em uma solução compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica e um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, encapsulando assim uma fração do referido agente de ativação de células T; (ii) remoção do agente de ativação de células T não encapsulado da solução e todos os reagentes e catalisadores opcionais; (iii) reação das moléculas lipídicas com o agente de ativação de célula T encapsulado no interior aquoso dos lipossomas preparados na etapa (i), em que o referido segundo grupo funcional do referido agente de ativação de célula T se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, produzindo assim o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação de células T ligado à folha interna.
[0123] Em determinadas modalidades, a solução compreende ainda pelo menos um catalisador de redução de oxidação. Em modalidades particulares, o pelo menos um catalisador de redução de oxidação é um sal de cobre (I), que é removido na etapa (ii) além do agente de ativação de
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62/102 células T não encapsulado, e a reação na etapa (iii) é uma reação química de Click dependente de cobre.
[0124] Os métodos de preparação de lipossomas são bem conhecidos na técnicai9. Por exemplo, uma solução lipidica em um solvente orgânico pode ser injetada em uma solução aquosa com uma temperatura acima da Tm em condições que conduzam à formação de lipossomas, por exemplo, por meio de um montador de nano-montadores ou outros dispositivos semelhantes, produzindo os lipossomas fusogênicos; ou injetar a solução lipidica em uma solução aquosa com temperatura acima da Tm e misturar, obtendo, assim, uma solução lipossômica e extrudando a solução lipossômica através de uma extrusora compreendendo pelo menos um suporte e pelo menos uma membrana gravada com poros com um diâmetro entre 50 e 400 nm.
[0125] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit compreendendo (a) um primeiro recipiente compreendendo um lipossoma fusogênico gue compreende (a) uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específica capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar do referido par de ligação; (b) um segundo recipiente compreendendo um agente de ativação de células T
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63/102 funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas; e (c) um panfleto com instruções para um método para o tratamento de câncer compreendendo a administração do lipossoma fusogênico a um paciente com câncer (a) e subsequentemente o agente de ativação de células T de (b).
[0126] Em determinadas modalidades, a montagem supramolecular compreende dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), opcionalmente colesterilhemisuccinato (CHEMS) e opcionalmente distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) ligado ao metoxi-PEG (mPEG) via ditiodipropionateaminoetanol (DTP) ou ácido 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DSPA) ligado ao mPEG via dithio-3-hexanol (DTH), em que a montagem supramolecular é desestabilizada em pH ácido, ou seja, passam por desestabilização disparada por ácido. A formulação sensível ao pH pode ter uma proporção molar de DOPE: CHEMS de 6:4 e 5-15% de mPEG-DTP-DSPE ou mPEG-DTH-DSPA.
[0127] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo o lipossoma fusogênico conforme definido em qualquer uma das modalidades acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0128] Em determinadas modalidades, o lipossoma fusogênico de qualquer uma das modalidades acima não possui
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64/102 um agente de direcionamento.
[0129] O termo carreador se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o agente ativo é administrado. Os carreadores na composição farmacêutica podem compreender um aglutinante, como celulose microcristalina, polivinilpirrolidona (polvidona ou povidona), goma tragacanta, gelatina, amido, lactose ou lactose mono-hidratada; um agente desintegrante, tal como ácido algínico, amido de milho e semelhantes; um lubrificante ou surfactante, tal como estearato de magnésio ou lauril sulfato de sódio; e um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal.
[0130] As composições podem ser formuladas para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua ou injeção direta ao tumor. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um conservante ou estabilizador adicionado. As composições podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização.
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[0131] Para a administração oral, a preparação farmacêutica pode estar na forma liquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou pode ser apresentada como um medicamento para a reconstituição com água, isotônico injetável ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-phidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho prégelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); diluentes (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser
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66/102 revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.
[0132] As preparações para a administração por via oral podem ser adequadamente formuladas para conferir a liberação controlada do composto ativo.
[0133] Para a administração por via bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos, adesivos/adesivos muco-adesivos ou pastilhas formuladas de maneira convencional.
[0134] As composições também podem ser formuladas em composições retais, como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositórios convencionais, como manteiga de cacau ou outros glicerideos.
[0135] Para a administração por inalação, as composições para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente liberadas na forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodi fluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para fornecer uma quantidade medida. As cápsulas e os cartuchos de, por exemplo, gelatina ou glicerol, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, como
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67/102 lactose ou amido.
[0136] O termo tratamento, como aqui utilizado, se refere aos meios para obter um efeito fisiológico desejado. O efeito pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou total de uma doença e/ou sintomas atribuídos à doença. O termo se refere à inibição da doença, isto é, interrompe seu desenvolvimento; ou melhorar a doença, ou seja, causar a regressão da doença.
[0137] Embora determinadas características do presente pedido tenham sido ilustradas e descritas aqui, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes serão evidentes para aqueles técnicos especialistas no assunto. Portanto, deve-se entender que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas as modificações e alterações que se enquadram no verdadeiro espírito do presente pedido.
Aplicações da plataforma_de pintura_celular:
[0138] A plataforma permite ao usuário final modificar a superfície celular das células-alvo usando lipossomas com diferentes grupos funcionais ou diretamente por meio de modificação química.
. 1 .Marcação__de__cél ii 1 as__a 1 vo__(modi f i cação__de.
células in vivo):
[0139] 1.1 Anticâncer!gena:
[0140] 1.1.1 Marcar as células cancerígenas para
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68/102 matar pelas células do sistema imunológico. Por exemplo, ao apresentar um grupo alquino nas células cancerígenas e a injeção sistêmica de alquino ou azida-anti-CD3 e alquino ou azida-anti-CD8 para induzir a morte por células T killer.
[0141] 1.1.2 Marcação de células cancerígenas para matar por peptídeos anticancerígenos. Por exemplo, apresentando grupo alquino ou azida, respectivamente, em células cancerígenas e injetando azida-peptídeo anticancerígeno que requer ancoragem em membrana para a morte celular.
[0142] 1.2 Doenças anti-auto-imunes: marcação de células autorreativas para matar pelas células do sistema imunológico.
2. Marcação de células efetoras_(modificação ex vivo de células):
2.1 As células T killer derivadas do paciente podem ser marcadas ex vivo com um novo grupo que permite o reconhecimento da célula alvo, seguido pela morte da célula alvo. Por exemplo, o anti-CD3-alquino ou azida pode ser covalentemente ligado ao peptídeo de direcionamento-azida ou alquino (epítopo) ou anticorpo anti-GDI9-azida ou alquino, que pode ser usado para tratar linfoma de células B ou anticorpo HLA-MARTl-azida para matar as células de melanoma, ou anticorpo anti-GP120-azida ou alquino para matar as células T infectadas com HIV.
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2.2 As células T reguladoras primárias podem ser marcadas usando anti-CD3-alquino ou azida que pode ser covalentemente ligado ao anticorpo de direcionamento-azida ou alquino para o sítio de inflamação crônica ou peptídeoazida ou alquino para inibir a progressão da inflamação para MS, artrite, psoríase, etc.
2.3 Modificação de células tumorais em circulação: as células tumorais podem ser marcadas com uma fração de ativação imunológica que causará a ativação de células efetoras imunológicas contra essas células, resultando em uma nova formulação de vacina contra o câncer.
[0143] A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLOS
Ma teri ai s_e Métodos:
Produção_de_lipossomas_de marcação_imunológica usando injeção de etanol:
[0144] Os lipídeos (lipídeos polares Avanti ou lipoide) foram pesados de acordo com a composição requerida e foram solubilizados em EtOH absoluto no volume final de 10% do volume lipossômico requerido. A mistura de lipídeosEtOH foi aquecida acima da Tm (temperatura de fusão) dos lipídeos. A injeção de EtOH foi realizada no tampão apropriado em temperatura idêntica e o tampão lipídico foi misturado e extrudido para produzir os lipossomas na
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70/102 distribuição de tamanho desejada utilizando uma extrusora.
Pós-produção de modificação de lipossomas:
[0145] Os lipossomas contendo o grupo etanolamina foram modificados quimicamente após a extrusão com um ligante e azida (um membro de um par de ligação) usando a reação química do éster NHS de (N-hidroxissuccinimida). Tipicamente, o NHS-polietileno glicol (PEG)4-Azida (grupo NHS) é utilizado em 5 equivalentes molares por grupo amina primário (lipídeo DOPE) . O excesso não ligado foi removido utilizando a cromatografia de exclusão por tamanho.
[0146] Os lipossomas foram feitos alternativamente usando um lipídeo pré-modifiçado para produzir um produto lipossômico semelhante que permite uma reação de Click dependente ou independente de cobre. Resumidamente, um lipídeo DSPE ou DOPE pré-modifiçado com PEG4-alquino ou azida foi incorporado na mistura lipidica antes da injeção de EtOH.
[0147] PEG4 representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 194 Da.
Modificação do anticorpo:
[0148] Os anticorpos são rotineiramente modificados e limpos usando o mesmo método, de acordo com a modificação química dos lipossomas com pequenas modificações. Resumidamente, um excesso de 50 molares de NHS-PEG4-BCN (o outro membro deste par de ligação) é adicionado por anticorpo. O excesso não ligado foi removido utilizando
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71/102 cromatografia de exclusão por tamanho.
Criando_abordagens_2STEP,__OUT,__IN_±_OUT,__IN_usando anticorpos modificados e_lipossomas modificados:
[0149] 2STEP: Os lipossomas ligados covalentemente a um membro do par de ligação (por exemplo, azida) foram usados diretamente nas células na diluição apropriada (ou injetados IV em modelos animais), seguidos por lavagens das células tratadas (não aplicável em ambientes in vivo) e foram permitidos reagir com anticorpos modificados com o membro complementar do par de ligação (por exemplo, BCN). Para fins de detecção, as células marcadas com imuno-lipossomas foram deixadas reagir com um membro complementar do par de ligação (por exemplo, DBCO).
[0150] OUT: Os lipossomas ligados covalentemente a um membro do par de ligação (por exemplo, azida) , foram deixados reagir com anticorpos com o membro complementar do par de ligação (por exemplo, BCN). Os lipossomas modificados foram então utilizados diretamente nas células na diluição apropriada (ou injetados IV em modelos animais), seguidos por lavagens das células tratadas (não aplicável em ambientes in vivo) . Para fins de detecção, as células marcadas com imuno-lipossomas foram deixadas reagir com um membro complementar do par de ligação (por exemplo, DBCO).
[0151] TN+OUT: Os lipídeos ligados covalentemente a um membro do par de ligação foram misturados com anticorpos
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72/102 com o membro complementar do par de ligação antes da extrusão. Os lipossomas foram então criados usando extrusora e permitiram que a reação fosse concluída (18 horas a 400 rpm a 25 °C). Os lipossomas modificados foram usados diretamente nas células na diluição apropriada (ou injetados IV em modelos animais), seguidos por lavagens das células tratadas (não aplicável em ambientes in vivo) e foram deixadas reagir com um corante fluorescente com o membro complementar do par de ligação.
[0152] TN: Os lipideos ligados covalentemente a um membro do par de ligação foram misturados com anticorpos com o membro complementar do par de ligação e foram necessários catalisadores ou reagentes antes da extrusão. Os lipossomas foram então criados usando extrusora e limpos imediatamente usando exclusão por tamanho ou diálise para inibir a reação com anticorpos na folha externa. A reação da folha interna foi deixada completa em um tampão livre de catalisador ou reagente (18 horas a 400 rpm em temperatura ambiente) . Os lipossomas modificados foram usados diretamente nas células na diluição apropriada (ou injetados IV em modelos animais), seguidos por lavagens das células tratadas (não aplicável em ambientes in vivo) e foram deixadas reagir com um corante fluorescente com o membro complementar do par de ligação.
Crescimento e seleção de células:
[0153] As linhagens celulares são cultivadas a 37°C
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73/102 sob 5% de CO2 usando o meio recomendado pela ATCC, tipicamente RPMI ou DMEM, suplementado com penicilina e estreptomicina, anfotericina B, soro de bezerro bovino inativado pelo calor e L-Glutamina. As células são coletadas usando solução de tripsina em HBSS, por 5-10 minutos a 37°C, coletadas com pipeta e centrifugadas a 400g por 5 minutos. As células peletizadas são ressuspensas em PBS isento de pirogênios- tampão (sem cálcio e magnésio) ou em meio de crescimento e são, em seguida, contados em um hemocitômetro sob um microscópio de contraste de fase, utilizando o azul de tripano como corante discriminador vivo-morto. As células são sub-cultivadas em até 10 passagens e são rotineiramente testadas para micoplasma.
Análise de pintura de células baseadas em citometria de fluxo de células únicas:
[0154] Normalmente, 500.000 células são usadas por tubo, e os experimentos são feitos com duas repetições biológicas, em triplicatas. As células foram incubadas com lipossomas marcados com FITC a 0,5 mm de lipídeos durante o tempo necessário (tipicamente 1 hora) a 37 °C sob 5% de CO2 em meio de crescimento. As células são então lavadas 3 vezes usando PBS— livre de pirogênio. As células são posteriormente coradas usando DBCO-Cy5 (um corante fluorescente clicável) por 1 hora em PBS—. As células passam por mais 3 lavagens com PBS— e são fixadas usando PEA a 1, 6%
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74/102 em PBS— por 15 minutos e lavadas e ressuspensas em PBS—. As células fixas são armazenadas a 4 °C por vários minutos até 7 dias antes da análise do FACS usando BD FACSCalibur.
[0155] As células são analisadas usando a abertura manual dos sinais detectados por dispersão lateral e dispersão direta e são bloqueados, por conseguinte, para distinguir entre as células intactas e os debris. Dez mil (10.000) células são contadas por tubo e analisadas usando os canais fluorescentes necessários: Canal FL1: canal verde fluorescente (530 ± 15nm, FL1). O laser usado é 488nm, 15mW; Canal FL4: canal fluorescente vermelho (661 ± 8nm, FL4) . O laser usado é 635nm, 9mW. O limiar do sinal é determinado usando as células tratadas com lipossomas de controle (ou sem lipossomas), definir o portão acima do sinal de fluorescência do controle não corado para determinar o sinal positivo e calcular o percentual de células positivas.
isolamento de células_T killer pri mári as :
[0156] Os esplenócitos primários de camundongo ou o sangue venoso suplementado com citrato de sódio (citrato diluído 1:9, 0,11 M no sangue) foram separados usando Ficoll livre de pirogênio (1,077) e foram iniciados com IL2 e antiCD3 e anti-CD28 por 5 a 13 dias a 37 °C sob 5% de CO2. Estes foram usados como fonte de células2o T efetoras primárias/destruidoras de memória.
Coloração de células CFSE:
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[0157]
Para a citometria de fluxo usar: Um (01) μΐ de estoque de CFSE (2,5 mg/ml em DMSO) é adicionado a 1 ml de meio de crescimento contendo 1 a 8 milhões de células. As células são imediatamente submetidas a vórtice e incubadas por 30 minutos na incubadora de cultura de tecidos. As células coradas são lavadas 3 vezes usando meio de crescimento (1 lavagem: as células são centrifugadas a 400 g por 5 minutos, as células peletizadas são ressuspensas em meio).
[0158] Protocolo modificado para microscopia fluorescente: Um (01) μΐ de CFSE estoque (2,5 mg/ml em DMSO) é adicionado a 1 ml de PBS livre de pirogênio contendo 1 a 8 milhões de células. As células são imediatamente submetidas a vórtice e incubadas por 30 minutos na incubadora de cultura de tecidos. As células coradas são lavadas 3 vezes usando meio de crescimento.
Geração de imagem de células killing de câncer marcadas com imuno-lipossomas por células imunológicas primárias
[0159] As células 4TlmCherry foram tratadas com lipossomas (N8 modificados com PEG4-azida) em 5 mM de lipideos durante 1 h a 37 °C sob 5% de CO2. As células foram lavadas 3 vezes usando PBS livre de pirogênio e foram deixadas reagir com anticorpos marcados usando PEG4-BCN em meio de crescimento por 1 hora a uma proporção de 12,5 pg cada mAb por 100 pL de lipideos 100 mM. As células
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76/102 cancerígenas foram concomitante incubadas com células T killer primárias coradas com CFSE a 37 °C sob 5% de CO2 e foram fotografadas a cada 5 minutos ao verde e os canais vermelho do microscópio confocal LSM 710, para a duração de 24 horas. O controle foi realizado sem expor as células cancerígenas aos lipossomas, mas utilizando as mesmas células T killer doadoras, em condições idênticas.
Tndução__de_model o__de__câncer__de_mama__t r i p 1 o -nega t i vo ortotrópico in vivo em camundongos:
[0160] Os camundongos são obtidos de Harlan (Envigo, Israel) e são mantidos em instalações SPF (livres de patógenos específicos) com 12 horas de ciclos claro/escuro, com comida e água ad libitum. Todos os experimentos realizados foram aprovados pelo comitê institucional de ética em estudos com animais. A linhagem de células de câncer de murino 4T1 (300.000 células em 50 μΐ de PBS — ) foi injetada usando uma agulha 30G na almofada de gordura mamária de camundongos fêmeas balb/C com 7-8 semanas de idade. Os tumores palpáveis aparecem 5 a 10 dias após a injeção das células. Normalmente, o tratamento começa no tamanho médio do tumor de 100 mm3. Os animais são sacrificados no tamanho de um tumor de 1000 mm3 ou se houver perda de 15% do peso corporal inicial, conforme ditado pelo comitê de ética dos estudos institucionais em animais, usando CO2. O tamanho do tumor é determinado usando um paquímetro para medir a
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77/102 dimensão mais longa (L) do tumor e a dimensão perpendicular a ele (W). O volume tumoral (V) é estimado usando a fórmula abaixo:
[0161] V=W*W*L/2
[0162] Todos os tratamentos são administrados sistemicamente usando as injeções IV nos camundongos portadores de tumor.
[0163] As estruturas dos compostos químicos sintetizados e usados para obter os resultados aqui apresentados e seus protocolos de síntese estão abaixo:
Composto estrutura
DOPE/DSPE-PEG200 propargil ,··< Ã ? ü
DSPE-PEG200, 400 propargil 0 < 1 0 0
DMPE, DPPE, DSPE-ácido heptinoico ' a X—0 NH·· 'X'
OTS-PEGX -PROPARGIL 200, 400, 600
NHS-PEGX-PROPARGIL 200, 400, 600 ο
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Composto estrutura
NHS-ÁCIDO HEPTINOICO o 0
NHS-PEG200/1100-BCN Ο M Λ o \ 4
DOPE-PEG4-200, 600, 1000, 2000-N3, DSPE-PEG4-2 00, 2000N3, , ' 1 “ 0 ü a .0 «H ' b fí 0
NHS-PEG600/1000/2000/200-N3 o fS *oy’0^X0-^M-o's^ozx^^3 o 11
DSPE-PEG200-AZIDA O ; , 1 Η!). o .:—xÇ ______ < , Γ if w A - * ò
OTS-PEGX-N3 TsO^v^o -'xj# \ZXC 3·
NHS-PEG200-BIOTINA NHS-NC8-BIOTINA NHS-BIOTINA LIPIDEOS E REAGENTES DE MARCAÇÃO DE BIOTINA
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Composto estrutura
DOPE-FITC LÍPIDOS FLUORESCENTEMENTE MARCADOS
DSPE-FITC
Síntese de Biotina-NHS:
[0164] Em 0,72 g de biotina (2,94 mmol) foram adicionados 40 ml de dimetilformamida, seguidos pela adição de 1,69 g de NHS (14,68 mmol) . À solução de reação foram adicionados 2,00 g de DCC (14,80 mmol) e a reação foi agitada por 18 horas em temperatura ambiente antes da conclusão. A reação foi testada por TLC (fase móvel da TLC: 80% de acetato de etila: 20% de metanol; Coloração PMA). A solução de reação foi filtrada e depois diluída com 100 ml de solução (30% de acetato de etila: Hexano a 70%). O produto foi filtrado para obter 600 mg de produto contendo alguns traços de reagentes. Em seguida, foram adicionados 50 ml de solução para obter mais precipitação. O precipitado foi removido por filtração para obter 66 mg de produto puro (testado por TLC e RMN) . Depois, à solução de reação foram adicionados mais 100 ml da mesma solução para obter mais precipitado. Após o isolamento, 600 mg de produto em mistura com algum subproduto de ureia foram isolados. O produto puro (66 mg) foi utilizado para as reações para aplicações biológicas.
Síntese de BCN-PEG1100-NHS:
[0165] Aos 30 mg de BCN-NHS (0,10 mmol) foram adicionados 5 ml de clorofórmio seguidos pela adição de 0,2
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80/102 ml de trietilamina. Para a reação, 100 mg de NH2-PegllOOCOOH (0,09 mmol) foram adicionados e a reação foi agitada por 2 horas antes de ser testada por TLC (fase móvel da TLC: 80% de clorofórmio, 20% de metanol e 100% de clorofórmio; Coloração PMA) . A reação não estava completa (NH2PEGllOOCOOH restante). Portanto, 15 mg adicionais de BCN-NHS (0,05 mmol) foram adicionados e a reação foi agitada por mais 1 hora. A reação foi concluída de acordo com o teste de TLC (nenhum NH2-PEGHOOCOOH foi deixado após a reação e foi observado novo ponto menos polar). A trietilamina foi evaporada por rotavapor. Em seguida, a reação foi diluída em 3 ml de clorofórmio. O produto foi precipitado por adição de 30 ml de éter dietílico. O produto em bruto foi evaporado para gerar 120 mg e foi utilizado na etapa seguinte como é.
[0166] Aos 120 mg de BCN-PEGllOOCOOH (0,09 mmol) foram adicionados 5 ml de acetonitrila, seguidos pela adição de 0,2 ml de trietilamina. À solução de reação foram adicionados 50 mg de DSC (0,20 mmol) e a reação foi agitada durante 2 horas. A reação foi testada por TLC (fase móvel da TLC: 80% de clorofórmio, 20% de metanol; Coloração PMA). A reação foi concluída (nenhum BCN-PEGllOOCOOH deixado após a reação e foi observado novo ponto menos polar). A solução de reação foi evaporada até a secura por rotavapor sob pressão reduzida. Em seguida, o resíduo da reação foi dissolvido em 10 ml de solução 5 ml: 5 ml de diclorometano: éter dietílico.
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A mistura de reação foi agitada por 15 minutos e o resíduo permaneceu no balão enquanto a solução de reação foi evaporada até a secura por rotavapor. O sólido obtido - 120 mg (rendimento de 93%) foi testado por TLC e RMN. O produto foi mantido no congelador.
Síntese de lipídeos fluorescentes DSPE-FITC, DOPE-FITC:
[0167] Em 105 mg de lipídeo (DSPE ou DOPE) foram adicionados 10 ml de clorofórmio, seguidos pela adição de 50 mg de FITC e 1,0 ml de trietilamina. As reações foram agitadas durante 15 minutos em temperatura ambiente antes da adição de 5 ml de DMF. As reações foram agitadas por 1 hora em temperatura ambiente e foram concluídas de acordo com a TLC (fase móvel da TLC: 25% de metanol, 75% de clorofórmio; Coloração PMA) . Em seguida, as reações foram diluídas *10 por clorofórmio e purificadas por cromatografia flash. Os produtos foram eluídos com 30% de metanol: 70% de clorofórmio. As frações dos produtos puros foram combinadas e evaporadas até a secura. Foram isolados 95 mg de DOPE-FITC e 70 mg de DSPE-FITC. As estruturas do produto foram confirmadas por RMN, TLC.
Síntese de conjugados alquino-PEG-DSPE.
[0168] Em 10 g de PEG200 ou 20 g de PEG400 (0, 05 mol) foram adicionados 150 ml de THE seco em condições inertes e as soluções foram resfriadas a 0 °C por banho de gelo. Após 15 minutos, foi adicionado 1,8 g de hidreto de
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82/102 sódio em três porções, cada uma com cerca de 0,6 g em cada reação. As reações foram agitadas durante 30 minutos adicionais em temperatura ambiente antes da adição de brometo de propargil (2,8 ml para cada reação) . Em seguida, as reações foram agitadas durante a noite. Em todos os casos, os produtos foram obtidos por TLC (5% de MeOH: Acetato de etila a 95%). As reações foram neutralizadas por adição de 4 ml de HC1 a 32%, após evaporação até a secura. Em seguida, os traços de brometo de propargila foram removidos por lavagem com hexano. A purificação dos produtos foi realizada em colunas flash de silica gel. Os produtos foram eluidos com acetato de etila a 90% de acetato de etila: 10% de MeOH. As frações combinadas foram evaporadas até a secura e levadas à análise de MS. As melhores frações de produtos foram usadas como nas etapas seguintes. No caso da fração PEG200-propargil foi de l,2gr e no caso da fração PEG400-propargil foi de 2,7gr.
[0169] Foram adicionados 0,5 g de PEG200-propargil e 1,0 g de PEG400-propargil com 10 ml de THE e 2 ml de trietilamina a cada reação. Ambas as reações foram agitadas durante 15 minutos antes de serem adicionados 0,4 g de cloreto de tosila a cada reação. As reações foram concluídas após a agitação durante a noite de acordo com a TLC (20% de metanol: 80% de clorofórmio). Para ambas as reações de 2 ml de trietilamina, 0,5 g de DSPE e 5 ml de clorofórmio foram
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83/102 adicionados e a reação foi agitada a 40 °C durante a noite até conclusão como foi observado a partir de TLC. Ambas as reações foram filtradas para remover as partículas insolúveis e evaporadas até a secura. A purificação dos produtos foi realizada em colunas flash de silica gel. As misturas de reação foram dissolvidas em 5 ml de clorofórmio cada uma e carregadas em colunas e eluídas gradualmente até 20% de MeOH: 80% de clorofórmio. O DSPE-PEG200-propargil e o DSPE-PEG400-propargil foram evaporados para gerar cerca de 400 mg de cada produto que foram identificados por RMN.
Síntese de DOPE-PEG2000azida e DSPE-PEG2OOOazida
[0170] Em 200 mg de lipídeos (DSPE ou DOPE) foram adicionados 10 ml de clorofórmio seguidos pela adição de 1,50 g de NHS-PEG2000-Azida em bruto e 2,0 ml de trietilamina. As reações foram agitadas durante a noite, as reações foram completas de acordo com a TLC (fase móvel da TLC: 10% de metanol, 90% de clorofórmio; Coloração PMA) . Foram adicionados 400 mg de 2-azidoetilamina e ambas as reações foram agitadas por mais 4 horas. Em seguida, as reações foram evaporadas por rotavapor para remover a trietilamina e os traços de 2-azidoetilamina. As reações brutas foram diluídas com 20 ml de solução de 5% de MeOH: Clorofórmio a 95% e purificado em colunas de silica. Os produtos foram eluídos com 8% de metanol: 92% de diclorometano. As frações do produto com pureza > 90% de
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84/102 acordo com a TLC foram combinadas e evaporadas até a secura. Para obter o composto puro, foram realizadas cristalizações. Ambos os produtos foram dissolvidos em volume mínimo de diclorometano após a adição de éter dietílico, causando precipitação de algumas impurezas enquanto os produtos são solúveis. Por conseguinte, as soluções do produto foram filtradas e adicionadas com éter dietílico adicional até se observar a precipitação dos lipideos do produto. Total de 280 mg de DOPE-PEG2000-Azida puro e 75 mg de DSPE-PEG2000Azida puro foram obtidos após cristalizações. A estrutura dos produtos foi confirmada por RMN.
Formação do conjugado de ácido 6-hepinoico NHS com 14 DMPE, 16 DPPE ou 18 DSPE:
[0171] Em 200 mg de lipídeo (DPPE, DMPE ou DSPE) foram adicionados 10 ml de clorofórmio seguidos pela adição de 2,5 ml de trietilamina. Cada reação foi agitada por 15 minutos em temperatura ambiente antes da adição de 100 mg de éster NHS de ácido 6-heptinoico. As reações foram agitadas durante 2 horas em RT e concentradas até um volume mínimo por rotavapor. Em seguida, os resíduos das reações foram dissolvidos em 150 ml de acetato de etila, a solução de éter dietílico (100 ml de acetato de etila, 50 ml de éter dietílico) . A TLC foi realizada para testar o nível de conversão das reações (fase móvel da TLC: 20% de metanol, 80% de clorofórmio; Coloração PMA) . Em todos os casos, a
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85/102 reação foi completa (nenhum lipídeo foi deixado após a reação). As soluções de reação foram agitadas por 15 minutos com 50 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, depois as camadas de água foram removidas e as camadas orgânicas foram lavadas com 50 ml de solução de cloreto de sódio. Após descartar as camadas de água, as camadas orgânicas foram secas com sulfato de sódio e evaporadas até a secura por rotavapor. Foram obtidos 226 mg de DPPE-6 heptinoico (rendimento de 98%), 200 mg de DPPE-6 heptinoico (rendimento de 98%) e 150 mg de DSPE-6 heptinoico (rendimento de 70%) de produtos sólidos. Todos os produtos foram identificados por RMN e TLC.
Síntese de BCN-NHS:
[0172] O procedimento foi realizado de acordo com as moléculas de procedimento publicadas 2013, 18, 7346-7363, com várias alterações. Em 400 mg de BCN-OH (2,66 mmol) foram adicionados 10 ml de acetonitrila, seguidos pela adição de 1,5 ml de trietilamina. À solução de reação foram adicionados 1,70 g de DSC (6,64 mmol) e a reação foi agitada sob condições inertes. A solução de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite antes da conclusão, como foi observado por TLC (fase móvel da TLC: Acetato de etila a 50%, hexano a 50%; Coloração PMA). A solução de reação foi evaporada até a secura por rotavapor. Em seguida, o resíduo da reação foi dissolvido em 5 ml de clorofórmio e adicionado
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86/102 com 50 ml de éter dietilico. A mistura de reação foi agitada por 15 minutos e o resíduo permaneceu no balão enquanto a solução de reação foi evaporada até a secura por rotavapor. O sólido obtido - 950 mg (rendimento de cerca de 95%) . De acordo com a TLC, a pureza era superior a 90-95%, por isso o produto foi utilizado como está na etapa/etapas seguintes.
Síntese de BCN-PEGá- OH:
[0173] Em 300 mg de BCN-NHS (1,03 mmol) foram adicionados 10 ml de acetonitrila, seguidos pela adição de 1,0 ml de trietilamina. À solução de reação os primeiros 0,3 ml de OH-PEG4-NH 2 foram adicionados e a reação foi agitada durante meia hora antes de ser testada por reação de TLC que não estava completa. Em seguida, 0,2 ml adicionais de OHPEG4- NH2 foram adicionados ao total de 0,5 ml de OH-PEGáNH2 (2,83 mmol) e a reação foi agitada por meia hora até a conclusão, como foi observado por TLC (fase móvel da TLC: 90% de clorofórmio, 10% de metanol; Coloração PMA) . A solução de reação foi evaporada sob pressão reduzida até a secura por rotavapor seguido de purificação por coluna de silica. A solução da reação foi eluída com 5% de MeOH: 95% de diclorometano. As frações puras foram evaporadas até a secura por rotavapor. O produto obtido- 200 mg (53%) foi testado por TLC. De acordo com a TLC, a pureza era de cerca de 90%, portanto, o produto foi usado como tal na etapa/etapas seguintes.
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Síntese de BCN-PEG4-NHS
[0174] Em 200 mg de BCN-PEG4-OH (0,54 mmol) 5 ml de acetonitrila foram adicionados, seguidos pela adição de 1 ml de trietilamina. À solução de reação foram adicionados 400 mg de DSC (1,56 mmol) e a reação foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente até a conclusão, como foi observado por TLC (fase móvel da TLC: 10% de metanol, 90% de dicolorometano; Coloração PMA). Depois a solução de reação foi evaporada até à secura por rotavapor após a purificação na coluna de silica. A coluna foi lavada com diclorometano e o produto foi eluído com 100% de acetato de etila. As frações puras foram evaporadas até a secura por rotavapor. O produto obtido - 250 mg (91%) foi testado por TLC e identificado por TLC e RMN. De acordo com TLC e RMN, a pureza era superior a 95%, portanto o produto foi utilizado como tal na etapa seguinte. O produto foi guardado a-20 °C.
Formação de p-toluenossulfonato de tetraetileno glicol (HOPeg4 OTs)
[0175] Em 55 g de peg4 (0,283 mol) foram adicionados 400 ml de clorofórmio seco e as soluções foram resfriadas a 0 °C por banho de gelo. Após 15 minutos foram adicionados 100 ml de trietilamina e a reação foi agitada por mais 15 minutos. Em seguida, foram adicionados 25 g de cloreto de tosila (0,132 mol) e a reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A conversão foi testada por TLC após
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88/102 o overnight (100% de acetato de etila). Depois a reação foi evaporada por rotavapor após a lavagem do resíduo com solução de hexano: éter (2: 1) para remover os traços de tosila. Em seguida, o resíduo foi adicionado com acetato de etila e lavado com soluções aquosas de HC1 a 5%, 10% de NHáAc e NaCl a 5%, seguido por secagem da camada orgânica com sulfato de sódio. O acetato de etila foi evaporado por rotavapor para gerar 18,6 g de HOpegá OTs (rendimento 41%). De acordo com a TLC, a pureza era de cerca de 90%, portanto, o produto foi usado como tal na etapa/etapas seguintes. O produto foi guardado a4 °C.
Formação de azida de tetraetilenoglicol (HOPEG4N3)
[0176] Em 6,0 g de HOPEGáOTs (17,2 mmol) foram adicionados 60 ml de etanol e a solução foi agitada durante 5 minutos. Em seguida, 6,0 g de azida de sódio (92,3 mmol) foram adicionados e a mistura de reação foi aquecida a 65 °C e agitada durante a noite até a conclusão conforme foi observado por TLC (TLC de fase móvel: 90% de clorofórmio, 10% de metanol; Coloração PMA). Depois a mistura foi filtrada para remover a azida de sódio insolúvel. A solução de etanol foi evaporada por rotavapor e o resíduo foi dissolvido em éter dietílico. O produto contendo a camada de éter foi filtrado e concentrado por rotavapor para gerar o produto bruto após a purificação adicional por coluna de silica flash. O produto foi eluído com 5% de MeOH: 95% de
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89/102 clorofórmio. As frações puras (>90% de pureza por TLC) foram combinadas e evaporadas até a secura para dar origem a 0,50 g de HOPEG4 Na que foi utilizado como é na etapa/etapas seguintes.
Formação de N3-peg4-NHS:
[0177] Em 450 mg de HOPegáNs (2,05 mmol) 15 ml de acetonitrila foram adicionados, seguidos pela adição de 1 ml de trietilamina. À solução de reação foram adicionados 800 mg de DSC (3,12 mmol) e a reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente até a conclusão, como foi observado por TLC (fase móvel da TLC: 10% de metanol, 90% de dicolorometano; Coloração PMA) . A solução de reação foi evaporada até a secura por rotavapor após a dissolução do resíduo em diclorometano. As camadas combinadas de diclorometano foram concentradas para 3 ml e adicionadas com 30 ml de éter de petróleo. A mistura de reação foi agitada por 15 minutos e a solução de éter de petróleo foi descartada. O resíduo foi dissolvido em diclorometano: éter dietílico (10 ml cada, 1: 1). A solução obtida foi evaporada até a secura para gerar 370 mg de NHSPegáNs (rendimento de 50%). De acordo com TLC e RMN, a pureza era superior a 95%, portanto o produto foi utilizado como tal na etapa seguinte. O produto foi mantido em freezer a -20 °C.
Exemplo 1.Marcação de células usando lipossomas fusogênicos
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Τη vi fro :
[0178] Uma plataforma lipossômica de marcação imunológica foi desenvolvida usando diferentes lipídeos com vários valores de Tm (temperaturas de fusão), conforme determinado pela saturação (presença de ligações duplas) e comprimento da cauda de acila. A combinação de tais composições lipídicas com diferentes proporções de lipídeos zwitteriônicos carregados positivamente (como DAPE, diacil fosfatidiletanolamina) melhorou significativamente a fusão com as células cancerígenas. Nossa plataforma de marcação lipossômica foi usada para marcar as células cancerígenas com um grupo funcional de um par de ligação, como a química de Clicks (Fig. 2A) . Esse grupo funcional é usado para adicionar um agente de ativação imunológica, como anticorpo monoclonal (mAb), usando várias etapas de síntese química (exemplos apresentados em Fig. 2B e C) para permitir a adição de ligantes clicáveis ao grupo cabeça de fosfolipídeo e ao mAb.
Exemplo 2. Composição lipossômica, absorção lipossômica e fusão lipossômica.
[0179] Os lipossomas preparados com a seguinte formulação HSPC: colesterol: 6-Heptinoico-PE (DSPE/DPPE/DMPE) 60: 35: 5 foram produzidos e considerados estáveis.
[0180] Todos os materiais não sintetizados como
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91/102 descrito estão disponíveis comercialmente. Lipossomas preparados com a seguinte formulação: HSPC: colesterol: 6heptinoico-PE (DSPE/DPPE/DMPE) 60: 35: 5 foram produzidos e considerados estáveis.
[0181] HSPC- fosfatidilcolina de soja hidrogenada;
[0182] PE- fosfatidiletanolamina
[0183] DSPE - distearoilfosfatidiletanolamina
[0184] DPPE - 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3fosfoethanolamina
[0185] DMPE - 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3fosfoethanolamina
[0186] O ligante de ácido 6-heptinoico é uma amostra de um alquino dependente de cobre usado para a preparação de lipossomas com mAbs ligados apenas à folha interna. Este ligante foi posteriormente substituído por ligantes alquinos sem cobre. BCN ou DBCO são grupos alquino independentes de cobre que permitem a formação de ligações covalentes com azida em condições in vivo.
[0187] Como uma primeira etapa, o ácido 6-heptinico foi conjugado ao NHS para criar um ligante bi-funcional com o NHS e os grupos alquino. Utilizando este ligante, o grupo amina no PE foi conjugado com 6-Heptinico-NHS através do grupo NHS e o PE funcionalizado foi purificado para a preparações de lipossomas.
[0188] Estes lipossomas portadores de um ligante
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92/102 funcionalizado alquino podem ser utilizados para a conjugação de várias moléculas modificadas com azida, tais como peptídeos, anticorpos, fluoróforos, biotina e sacarídeos. Conjugamos um fluoróforo, calceína-azida (produção in-house) aos lipossomas gue contêm o ligante alquino (Figura 3 A). A eficiência da conjugação foi de 17 a 20%. Estes lipossomas fluorescentes foram utilizados para testar o efeito de diferentes formulações de lipossomas na absorção ou fusão celular com lipossomas. O comprimento da cauda hidrofóbica e o percentual de colesterol na formulação de lipossomas não tiveram um efeito significativo na captação ou fusão de lipossomas pelas células (Figura 3B-C).
[0189] A modificação do grupo principal afeta o efeito dos lipossomas nas células alvo: modificando o grupo cabeça, podemos ajustar a eficácia da fusão de lipossomacélulas alvo versus a absorção lipossômica por endocitose.
[0190] A linhagem de células 4T1 (células de câncer de mama triplo negativo disponíveis no ATCC (ATCC® CRL-2539™) foi investigada para a marcação da célula alvo usando nossa plataforma. As células 4T1 foram incubadas com novas formulações de lipossomas marcados com fluorescência que melhoram a fusão com as células alvo. A fusão com as células alvo é determinada usando diferentes ligantes que estão ligados à folha da membrana lipossômica externa ou às folhas internas e externas do lipossoma.
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Exemplo 3. Efeito da composição lipossômica na fusão de células cancerígenas.
[0191] Diferentes composições lipídicas foram testadas como lipossomas quanto à sua capacidade de se fundir com as células cancerígenas, como ilustrado na Fig. 2D, mas utilizando um lipossoma sem DOPE-FITC. Modificamos a carga líquida positiva, a saturação da cauda de acila e, portanto, a Tm (temperatura de fusão) da mistura lipídica. Obtivemos lipossomas de marcação de câncer ajustáveis, que adicionaram um grupo funcional (um membro do par de ligação) na membrana das células cancerígenas.
Exemplo 4. Otimização da formulação
[0192] O DSPE-PEG2000 é usado como estabilizador e melhora o tempo de meia-vida da circulação em condições in vivo, mas também pode resultar na redução da fusão câncerlipossoma devido a impedimentos esféricos. Portanto, testamos uma gama mais ampla de DSPE-PEG2000 em nossa formulação de marcação imunológica lipossômica N8, formulação central DOTAP: DOPC: DOPE: DOPE-FITC: DSPE-PEG2K 35:52,5:10:0,2:X onde X é 5, 2,5, 1,25, 0, 625, proporção molar). A fim de determinar o efeito do PEG2000 na absorção e fusão com as células cancerígenas, os lipossomas foram marcados com fluorescência usando DOPE-FITC (ex 488 nm, em 530 nm) e foram conectados ao ligante PEG4-N3 pós-produção usando NHS-PEG4-N3 (Fig. 2D). As células cancerígenas foram
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94/102 expostas aos lipossomas a 0,5 mM de lipideos por 1 hora a 37 °C, lavadas e coradas com DBCO-Cy5 (FL4) . O sinal no canal fluorescente verde (FL1) é indicativo da absorção lipossômica pelas células cancerígenas. O sinal no canal fluorescente vermelho (FL4) é indicativo da fusão dos lipossomas da nossa pintura com a membrana das células cancerígenas. As células foram fixadas com paraformaldeído a 1,6% em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente e mantidas a 4 °C até a análise FACS. A apresenta o percentual médio das células cancerígenas positivas para o sinal FITC, indicando a absorção de lipossomas, e para o sinal Cy5, clicado no grupo azida nessas células, indicando fusão. Além disso, B, as médias da intensidade fluorescente média são apresentadas e são proporcionais ao número de fluoróforos por célula cancerígena. Coletivamente, quantidades elevadas de DSPE-PEG2000 na formulação de marcação imunológica apresentaram uma inibição tanto na fusão quanto na absorção.
[0193] Para complementar os resultados acima mencionados, obtidos por citometria de fluxo, testamos a localização de nossos lipossomas marcados com fluorescência em diferentes células cancerígenas apresenta a localização espacial dos lipossomas com marcação imunológica na membrana das células 4TlmCherry, que se correlaciona bem com a localização de membrana de nossos lipideos. Testamos nossa capacidade de marcar imunologicamente outros tipos de
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95/102 células cancerígenas, como pode ser visto em para linhagens celulares de câncer de pulmão (humana e murina), uma linhagem de células de melanoma (murina).
[0194] Em seguida, testamos a capacidade de nossos lipossomas de marcação imunológica de induzir a morte de células cancerígenas pela ativação de células T killer. Isso foi realizado usando experimentos de lapso de tempo confocal para as células cancerígenas tratadas versus as células cancerígenas não tratadas com células T killer primárias de camundongo do mesmo doador apresentado. Realizamos a quantificação da imagem usando os pixels vermelhos como marcador para progressão/morte de células cancerígenas (10).
[0195] Utilizamos quatro abordagens diferentes para a liberação de mAbs ativadores de células T killer ao tumor. A primeira abordagem que usamos é denominada 2STEP, onde o lipossoma descrito na (Fig. 2A) é injetado e marca as células cancerígenas com um grupo funcional do par de ligação (por exemplo, grupo azida) e 3 horas após a injeção do lipossoma, injetamos o mAb marcado com o outro grupo funcional do par de ligação. A segunda abordagem (Fig. 2E,
I) é denominada IN, onde a folha interna é usada para ligar o mAb ou mAbs covalentemente ligado ao outro grupo funcional do par de ligação. A terceira abordagem, OUT (Fig. 2E,
II) , usa a folha externa do lipossoma para ligar o mAb ou mAbs covalentemente ligado ao outro grupo funcional do par
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96/102 de ligação. A quarta abordagem, IN + OUT (Fig. 2E, III) usa folhas interna e externa do lipossoma para ligar o mAb ou mAbs covalentemente ligados ao outro grupo funcional do par de ligação.
Exemplo 5. Tratamento do câncer em modelos animais
[0196] Testamos a eficácia de nossos lipossomas com marcação imunológica usando as abordagens 2STEP, IN e IN + OUT versus o controle 2STEP (os mesmos lipossomas 2STEP, acoplados com anticorpos não clicáveis), conforme apresentado em A. Plots spider de camundongos individuais são apresentados em 1B, em que o tamanho do tumor versus o tempo por camundongo é apresentado como uma única série em cada gráfico do grupo de tratamento. Testamos ainda a distribuição biológica de nossas formulações lipossômicas em animais portadores de tumor 24 horas após a injeção (C). O perfil de biodistribuição da marcação lipossômica é semelhante ao da formulação DOXIL usada como referência ou padrão ouro.
[0197] Análises histológicas e imuno-histoquímicas foram realizadas em camundongos em 72 horas do tratamento, a fim de testar o tumor e outros danos nos tecidos, bem como o recrutamento de células T. Os dados mostram um recrutamento significativo de células T para tumores, mas não para fígado e rins (a análise de danos está pendente de caspase e coloração com TUNEL). Os estudos in vivo foram complementados
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97/102 usando um estudo de seletividade ex vivo, onde os órgãos dos camundongos portadores de tumor 4T1 foram coletados e digeridos em células únicas. Essas células originando tecidos e tumores normais foram expostas aos lipossomas N8 (2STEP ou OUT) em 0,5 mM de lipídeos e foram coradas usando um corante clicável (DBCO-Cy5). As células únicas foram analisadas por citometria de fluxo, apresentada em B. Esses dados, quando considerados ao lado dos perfis de biodistribuição de N8 (2STEP ou OUT) e as análises histológicas, mostram que nossa plataforma lipossômica atinge vários órgãos, mas se funde seletivamente e recruta as células T para tumores.
[0198] Os animais portadores de tumor tratados com nossos lipossomas mostraram aumento no recrutamento de células T para tumores, mas não para fígado ou rins, como visto na Fig. 12A e quantificados na Fig. 120 para abordagens 2STEP e OUT. Os dados mostrados aqui, quando combinados com o estudo de seletividade ex vivo, mostram que os lipossomas são seletivos para a fusão com células derivadas de tumores e mostram pouca fusão com as células primárias derivadas de órgãos saudáveis (Fig. 12B) . Os dados, quando combinados com o estudo de biodistribuição, explicam por que as lâminas do tecido hepático não apresentam aumento na infiltração de células T. Mecanicamente, os lipossomas se fundem com as células cancerígenas carregadas negativamente e ativam as
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98/102 células T killer, que recrutam as células T adicionais para o local do câncer por quimiotaxia. Após a absorção de fagócitos, como as células de Kuepfer no fígado, não há fusão, mas há presença de lipossomas, que por si só, não ativam as células T killer como no tecido do câncer.
[0199] Coletivamente, nossos dados mostram que a invenção aqui descrita pode ser usada para diferentes tipos de câncer sistemicamente e induz a reação imunológica destinada a matar as células tumorais sob condições in vivo.
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Claims (34)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para o tratamento de câncer pela marcação de células cancerígenas com um agente de ativação do sistema imunológico, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente com câncer de um lipossomo fusogênico, em que o método compreende as etapas de:
    (i) administrar ao referido paciente com câncer um lipossomo fusogênico de ativação do sistema imunológico que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipidicas tendo de 14 a 24 átomos de carbono e um primeiro grupo funcional de um par de ligação específico capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação; e (b) um agente de ativação do sistema imunológico compreendendo o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional; ou (ii) administrar ao referido paciente com câncer um lipossomo fusogênico funcionalizado compreendendo uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipidicas com 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipidicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específico capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar
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  2. 2/34 ao referido par de ligação; e subsequentemente para a etapa (ü) (ill) administrar um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas.
    2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossomo fusogênico.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado via o referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna do lipossomo fusogênico.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa e interna do lipossoma fusogênico.
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  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema ímunológico é selecionado a partir de um agente de ativação de células T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de células T killer de memória; um antígeno leucocitário humano solúvel (sHLA) apresentando um peptídeo viral; e um superantígeno.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema ímunológico é um agente de ativação de células T.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação de células T é selecionado a partir de anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D ou uma combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de ligar CD3 e NKG2D.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreende adicionalmente um grupo catiônico, um polímero natural ou sintético catiônico, um açúcar amino catiônico, um poliaminoácido catiônico ou um peptídeo anfifílico de ligação às células cancerígenas.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma das referidas moléculas de lipídeo que compreendem um grupo
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    4/34 catiônico é selecionado a partir de cloreto de 1,2-dioleoil3-trimetilamôniopropano (DOTAP), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), l,2-di-0octadecenil -3-trimetilamônio propano (DOTMA), Dimetildioctadecilamônio (18: 0 DDAB) e Nl- [2 - ((IS) -1 [(3-aminopropil) amino] -4- [di (3-amino-propil) amino] butil-carboxamido) etil] -3,4-di [oleiloxi] -benzamida (MVL5).
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico é DOTAP.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido polímero sintético é selecionado a partir de polietilenoiminas (PEI) e poli (2-
    (dimetilamino) etil metacrilato. 12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que c ) referido polímero natural é quitosano. 13. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido açúcar de amino é a glicosamina. 14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido poliaminoácido
    catiônico é selecionado a partir de poli (L-lisina), poli
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    5/34 (L-arginina), poli (D-lisina), poli (D-arginina), poli (Lornitina) e poll (D-ornitina).
    15. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo de ligação de células cancerígenas anfifílico é selecionado a partir de Cecropin A; Cecropin A 1-8; e CNGRC cíclico.
    16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é um fosfolipídeo selecionado do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina, uma fosfatidiletanolamina, uma fosfatidilserina, um ácido fosfatídico ou uma combinação dos dois, cada um dos quais compreende um ou dois ou resíduos de ácidos graxos diferentes, em que os resíduos de ácidos graxos na fração fosfatidil são saturados, monossaturados ou poli-insaturados e têm um comprimento de cadeia de carbono de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 carbonos, tais como miristoil, estearoil, palmitoil, oleoil, linoleoil, linolenoil (incluindo linololil conjugado), araquidonoil na configuração fosfolipídica e liso-fosfolipídica e as combinações dos mesmos.
    17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido fosfolipídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em 1-palmitoil2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-3-
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    fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-dimiristoil-3- fosfatidilcolina (DMPC) ) ; 1,2-distearoil-3-fosfatidilcolina
    (DSPC); 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dimiristelaidoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC); 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dipalmitelaidoyl-sn-
    glicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC); 1,2-
    dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δδ-Cis)
    PC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (18:1 (A9-Cis) PC (DOPC)); 1,2-dielaidoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δ9Trans) PC); 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC (DLPC)); 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC); 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina
    (20 : 1 (Cis) PC) ; 1,2-diarachidonoil-sn-glicero-3-
    fosfocolina (20:4 (Cis) PC); 1,2-didocosahexaenoil-sn-
    glicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC); 1,2-dierucoyl-sn- glicero-3-fosfocolina ( )22:1 (Cis) PC); 1,2-dinervonoil-sn- glicero-3-fosfocolina ( )24:1 (Cis) PC); 1,2-dimiristoil-3--
    3-fosfatidiletanolamina (DMPE) ; 1,2-dipalmitoil-3-
    fosfatidiletanolamina (DPPE); dipalmitoilfosfatidilcolina
    (DPPC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2distearoil-3-fosfatidiletanolamina (DSPE); 1,2-dimiristoil-
    3-fosfatidilserina (DMPS); 1,2-dipalmitoil-3- fosfatidilserina (DPPS); palmitoiloleoil
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    7/34 fosfatidiletanolamina (POPE); e 1,2-dioleoil-3fosfatidilserina (DOPS).
    18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido fosfolipídeo é selecionado dentre DOPC, POPO, DMPC, DPPC, DOPE, POPE, DSPE, DMPE e DPPE.
    19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma fração estabilizadora conectada a pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas.
    20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida fração estabilizadora é selecionada a partir de polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano, um poliaminoácido, metil-polioxazolina, poliglicerol, poli (acrilil morfolina) e poliacrilamida.
    21 . Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa. 22 . Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o PEG é de peso molecular de cerca de 2kDa. 23 . Método, de acordo com a reivindicação 19,
    caracterizado pelo fato de que a referida fração
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    8/34 estabilizadora está conectada a pelo menos uma das referidas moléculas lipidicas por meio de um ligante peptídico clivável.
    24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação.
    25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação através de uma reação química click.
    26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que i) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou fosfina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é azida ou vice e versa; ii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é cicloalqueno, cicloalquino, ciclopropano, isonitrila (isocianeto) ou ácido vinil borônico e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tetrazina ou vice e versa; iii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou maleimida e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tiol, ou vice e versa;
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    9/34 iv) o primeiro grupo funcional do par de ligação especifico é dieno conjugado e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alqueno substituído ou vice e versa; v) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alqueno, alquino ou acetileto de cobre e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é nitrona, ou vice e versa; vi) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído ou cetona e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alcoxiamina, hidroxilamina, hidrazina ou hidrazida, ou vice e versa; ou vii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído, cetona, isotiocianato, ácido carboxílico ou derivado do mesmo, como éster, anidrido, alquil haleto, tosil e Nhidrosuccinimida (NHS) e o segundo grupo funcional do
    referido par de ligação é amina ou vice e versa; viii) grupo funcional. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o par de ligação específico é alquino-azida. 28. Método, de acordo com a reivindicação 1,
    caracterizado pelo fato de que o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação não covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação.
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    10/34
    29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o primeiro grupo funcional do par de ligação especifico é biotina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é seu parceiro de ligação selecionado a partir de um peptideo de ligação à biotina ou proteína de ligação à biotina, ou vice versa.
    30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a referida proteína de ligação à biotina é selecionada a partir de avidina, estreptavidina e um anticorpo anti-biotina.
    31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido peptideo de ligação à biotina é selecionado a partir de AEGEFCSWAPPKASCGDPAK (SEQ ID NO: 11), CSWRPPFRAVC (SEQ ID NO: 12), CSWAPPFKASC (SEQ ID NO: 13) e CNWTPPFKTRC (SEQ ID NO: 14).
    32. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipossomo fusogênico compreende adicionalmente um primeiro espaçador entre a bicamada lipídica e o primeiro grupo funcional.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema imunológico compreende adicionalmente um segundo espaçador entre o agente de ativação do sistema imunológico e o segundo grupo funcional.
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    11/34
    34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou segundo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, (C6-C12) alquil, ácido fenólico, benzoico ou naftoico mono, di ou tricarboxílico, tetra-hidropireno, ácido mono, di ou tricarboxílico, ou os sais dos mesmos, éter cíclico, ácido glutárico, ácido succinato, ácido mucônico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico e ácido sebático e um peptídeo, como um poli-Gly peptídeo com cerca de 2-20 resíduos de aminoácidos em comprimento, por exemplo, 3 resíduos de aminoácidos em comprimento.
    35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa.
    36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o PEG tem um peso molecular de cerca de 194 Da (PEG4) .
    37. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou segundo espaçador é (Cs -C12) alquil, preferencialmente heptil ou dodecanoil.
    38. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipossomo fusogênico compreende colesterol (CHO) ou seus derivados.
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  12. 12/34
    39. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipossomo tem um tamanho de até cerca de 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, de cerca de 100 nm.
    40. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado através do segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa, interna ou ambas externa e interna do lipossoma fusogênico; o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado de um agente de ativação de célula T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de célula T killer de memória; um antígeno leucocitário humano solúvel (sHLA) apresentando um peptídeo viral; e um superantígeno; pelo menos alguns dos referidos lipídeos compreendem adicionalmente um grupo catiônico, um polímero catiônico natural ou sintético, um açúcar amino catiônico, um poliaminoácido catiônico ou um peptídeo anfifílico de ligação à célula cancerígena; pelo menos alguns dos lipídeos são fosfolipídeos selecionados do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina, uma fosfatidiletanolamina, uma fosfatidilserina, um ácido
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  13. 13/34 fosfatidico ou uma combinação dos mesmos, cada um dos quais compreende um ou dois resíduos de ácidos graxos idênticos ou diferentes, em que os resíduos de ácidos graxos na fração fosfatidil são saturados, mono-insaturados ou poliinsaturados e têm um comprimento de cadeia de carbono de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 carbonos, tais como miristoil, estearoil, palmitoil, oleoil, linoleoil, linolenoil (incluindo linolenoil conjugado), araquidonoil na configuração de fosfolipídeo e liso-fosfolipídeo e as combinações dos mesmos, os referidos lipossomas compreendem adicionalmente uma fração estabilizadora conectada a pelo menos um dos referidos lipídeos ou os referidos polímeros catiônicos; o referido grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação do referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação não covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação; o primeiro ou segundo espaçador é selecionado do grupo que consiste em PEG, (C6-C12)alquil, ácido fenólico, benzoico ou naftoico mono, di ou tricarboxílico, ácido tetra-hidropireno mono, di ou tricarboxílico, ou os sais dos mesmos, éter cíclico, ácido glutárico, ácido succinato, ácido mucônico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico e ácido
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  14. 14/34 sebácico, um peptídeo, como um peptídeo poli-Gly de cerca de 2-20 resíduos de aminoácidos em comprimento, por exemplo, 3 resíduos de aminoácido em comprimento; e o lipossoma tem um tamanho de até 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, de cerca de 100 nm.
    41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema imunológico é um agente de ativação de célula T; a referida pelo menos uma das moléculas lipídicas compreende um grupo catiônico que é selecionado a partir de 1,2dioleoil-3-trimetilamôniopropano cloreto (DOTAP), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 1,2-di-Ooctadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA),
    Dimetildioctadecilamônio (18:0 DDAB) e Nl-[2-( (IS)-1-[ (3aminopropil)amino]-4-[di(3-amino-propil) amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida (MVL5), o referido polímero sintético é selecionado a partir de polietilenoiminas (PEI) e poli(2-(dimetilamino)etil metacrilato, o referido polímero natural é quitosana, o referido açúcar amino é glicosamina, o referido poliaminoácido catiônico é selecionado a partir de poli(Llisina), poli(L-arginina), poli(D-lisina), poli(DPetição 870190105978, de 19/10/2019, pág. 61/99
  15. 15/34 arginina), poli(L-ornitina) e poli(D-ornitina), ou o referido peptídeo anfifílico de ligação à célula cancerígena é selecionado de Cecropin A; Cecropin A 1-8; e CNGRC cíclico; a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é selecionada a partir do grupo que consiste em 1-palmitoil-
    2- oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-3fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-dimiristoil-3fosfatidilcolina (DMPC) ; 1,2-distearoil-3-fosfatidilcolina (DSPC); 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC); 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dipalmitelaidoil-snglicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC); 1,2dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δδ-Cis) PC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (18:1 (A9-Cis) PC (DOPC)); 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δ9Trans) PC); 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC (DLPC)); 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC); 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC); 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3fosfocolina (20:4 (Cis) PC); 1,2-didocosahexaenoil-snglicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC); 1,2-dierucoil-snglicero-3-fosfocolina (22:1 (Cis) PC); 1,2-dinarvonoil-snglicero-3-fosfocolina (24:1 (Cis) PC); 1,2-dimiristoil-3--
    3- fosfatidiletanolamina (DMPE) ; 1,2-dipalmitoil-3
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  16. 16/34 fosfatidiletanolamina (DPPE); dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2distearoil-3-fosfatidiletanolamina (DSPE); 1,2-dimiristoil3-fosfatidilserina (DMPS); 1,2-dipalmitoil-3fosfatidilserina (DPPS); palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE); e 1,2-dioleoil-3fosfatidilserina (DOPS); a referida fração estabilizadora é selecionada a partir de polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, álcool polivinilico, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano, um poliaminoácido, metil-polioxazolina, poliglicerol, poll(acriloil morfolina) e poliacrilamida; o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional do referido par de ligação através de uma reação química click, i) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou fosfina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é azida ou vice e versa; ii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é cicloalqueno, cicloalquino, ciclopropano, isonitrila (isocianida) ou ácido vinil borônico e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tetrazina ou vice e versa; iii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou maleimida e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tiol, ou vice e versa; iv) o primeiro grupo funcional do par
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  17. 17/34 de ligação especifico é dieno conjugado e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alqueno substituído, ou vice e versa; v) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alqueno, alquino ou acetileto de cobre e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é nitrona, ou vice e versa; vi) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído ou cetona e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alcoxiamina, hidroxilamina, hidrazina ou hidrazida, ou vice e versa; ou vii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído, cetona, isotiocianato ou ácido carboxílico ou derivado do mesmo tal como um éster, anidreto, acil haleto, tosil e N-hidrosuccinimida (NHS) e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é amina, ou vice e versa, ou o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é biotina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação e seu parceiro de ligação selecionado a partir de um peptídeo de ligação à biotina ou proteína de ligação à biotina, ou vice e versa; e o primeiro ou segundo espaçador é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa, ou (C6-C12)alquil, preferencialmente heptil ou dodecanoil.
    42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação de célula T é selecionado a partir de um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D, ou uma
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  18. 18/34 combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e NKG2D; a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico é DOTAP; o referido fosfolipídeo é selecionado a partir de DOPC, POPC, DMPC, DPPC, DOPE, POPE, DSPE, DMPE e DPPE; a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa; o referido par de ligação específico é alquino-azida, a referida proteína de ligação à biotina é selecionada a partir de avidina, estreptavidina e um anticorpo anti-biotina, ou o referido peptídeo de ligação à biotina é selecionado a partir de AEGEFCSWAPPKASCGDPAK (SEQ ID NO: 11), CSWRPPFRAVC (SEQ ID NO: 12), CSWAPPFKASC (SEQ ID NO: 13) e CNWTPPFKTRC (SEQ ID NO: 14) ; e o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de um peso molecular de cerca de 194 Da (PEG 4).
    43 . Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 2kDa. 44 . Método, de acordo com a reivindicação 43,
    caracterizado pelo fato de que o lipossoma fusogênico compreende:
    a. DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 ou
    DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN; ou
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  19. 19/34
    b. DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-N3 ou
    DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-BCN, em que PEG2K representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa e PEG4 representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 194 Da e a quantidade molar relativa de DOPC é de até cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DOTAP é de cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DSPE-PEG2K é de até cerca de 20%, a quantidade molar relativa de DOPEPEG4 é de cerca de 20%, a quantidade molar relativa de HSPC é de até cerca de 65%, a quantidade molar relativa a quantidade de colesterol é de até cerca de 40% e a quantidade molar relativa de DMPC é de cerca de 70% e 0 lipossoma fusogênico tem um tamanho de cerca de 50 nm ou 300 nm.
    45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o lipossoma fusogênico compreende:
    (1) DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 ou DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN, na proporção molar de 52,5:35:0,6:10, 52,5:35:1,25:10, 52,5:35:2,5:10, 52,5:35:5:10, 52,5:35:0,6:5, 52,5:35:1,25:5, 52,5:35:2,5:5, 52,5:35:5:5, 65:20:5:10, 50:35:5:10, 52,5:35:1,25:7, 52,5:35:1,25:5, ou 52,5:35:2,5:7; ou (ii) DMPC : Col: DMPE-PEG4-N3 ou DMPC: Col: DMPE-PEG4-BCN, na proporção molar de 60:35:5.
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  20. 20/34
    46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o lipossomo fusogênico compreende DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 na proporção molar 52,5: 35: 2,5: 5.
    47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 4 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação de células T é ligado via o referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossomo fusogênico.
    48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 4 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação de células T está ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna do lipossomo fusogênico.
    49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 4 6, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação de células T é ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna e externa do lipossomo fusogênico.
    50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que a temperatura de fusão (Tm) do lipossomo é menor do que 45 °C,
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  21. 21/34 na qual o lipossomo fusogênico é mantido em uma fase de transição não cristalina, proporcionando assim a fluidez da membrana necessária para a fusão do lipossomo com as membranas celulares.
    51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, tal como câncer de mama triplo negativo, melanoma e câncer de pulmão.
    52. Lipossoma fusogênico caracterizado pelo fato de que compreende uma bicamada lipidica compreendendo uma pluralidade de moléculas lipídicas tendo de 14 a 24 átomos de carbono, em que pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas é funcionalizada com um primeiro grupo funcional de um par de ligação específico capaz de se ligar a um segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação.
    53. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o lipossomo fusogênico compreende adicionalmente um primeiro espaçador entre a bicamada lipidica e o primeiro grupo funcional.
    54. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um agente de ativação do sistema ímunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar
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  22. 22/34 ao referido par de ligação ligado ao referido primeiro grupo funcional.
    55. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa do lipossomo fusogênico.
    56. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado via o referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha interna do lipossomo fusogênico.
    57. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico está ligado através do referido segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa e interna do lipossoma fusogênico.
    58. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema imunológico compreende adicionalmente um
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  23. 23/34 segundo espaçador entre o agente de ativação do sistema imunológico e o segundo grupo funcional.
    59. Lipossoma fusogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 58, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado a partir de um agente de ativação de células T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de células T killer de memória; um antígeno leucocitário humano solúvel (sHLA) apresentando um peptídeo viral; e um superantígeno.
    60. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema imunológico é um agente de ativação de células T.
    61. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação de células T é selecionado a partir de anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D ou uma combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de ligar CD3 e NKG2D.
    62. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o referido agente de ativação do sistema imunológico é ligado através do segundo grupo funcional ao primeiro grupo funcional de pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas na folha externa, interna ou ambas externa e interna do lipossoma
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  24. 24/34 fusogênico; o agente de ativação do sistema imunológico é selecionado de um agente de ativação de célula T; uma citocina pró-inflamatória; um peptídeo de ativação de célula T killer de memória; e um superantígeno; pelo menos alguns dos referidos lipideos compreendem adicionalmente um grupo catiônico, um polímero catiônico natural ou sintético, um açúcar amino catiônico, um poliaminoácido catiônico ou um peptídeo anfifílico de ligação à célula cancerígena; pelo menos alguns dos lipideos são fosfolipídeos selecionados do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina, uma fosfatidiletanolamina, uma fosfatidilserina, um ácido fosfatídico ou uma combinação dos mesmos, cada um dos quais compreende um ou dois resíduos de ácidos graxos idênticos ou diferentes, em que os resíduos de ácidos graxos na fração fosfatidil são saturados, mono-insaturados ou poliinsaturados e têm um comprimento de cadeia de carbono de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 carbonos, tais como miristoil, estearoil, palmitoil, oleoil, linoleoil, linolenoil (incluindo linolenoil conjugado), araquidonoil na configuração de fosfolipídeo e liso-fosfolipídeo e as combinações dos mesmos, os referidos lipossomas compreendem adicionalmente uma fração estabilizadora conectada a pelo menos um dos referidos lipideos ou os referidos polímeros catiônicos; o referido grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o
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  25. 25/34 referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação do referido primeiro grupo funcional do par de ligação especifico é capaz de formar uma ligação não covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao referido par de ligação; o primeiro ou segundo espaçador é selecionado do grupo que consiste em PEG, (C6-C12)alquil, ácido fenólico, benzoico ou naftoico mono, di ou tricarboxílico, ácido tetra-hidropireno mono, di ou tricarboxílico, ou os sais dos mesmos, éter cíclico, ácido glutárico, ácido succinato, ácido mucônico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico e ácido sebácico, um peptídeo, como um peptídeo poli-Gly de cerca de 2-20 resíduos de aminoácidos em comprimento, por exemplo, 3 resíduos de aminoácido em comprimento; e o lipossoma tem um tamanho de até 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, de cerca de 100 nm.
    63. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação do sistema ímunológico é um agente de ativação de células T; a referido pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico que é selecionado a partir de 1,2-dioleoil-3-trimetilamôniopropano cloreto
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  26. 26/34 (DOTAP), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 1,2-di-Ooctadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA),
    Dimetildioctadecilamônio (18:0 DDAB) e Nl-[ 2-( (IS)-1-[ (3aminopropil)amino]-4-[di (3-amino-propil) amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxy]-benzamida (MVL5), o referido polímero sintético é selecionado a partir de polietilenoiminas (PEI) e poli(2-(dimetilamino)etil metacrilato, o referido polímero natural é quitosano, o referido amino açúcar é glicosamina, o referido poliaminoácido catiônico é selecionado a partir de poli(Llisina), poli(L-arginina), poli(D-lisina), poli(Darginina), poli(L-ornitina) e poli(D-ornitina), ou o referido peptídeo anfifílico de ligação à célula cancerígena é selecionado a partir de Cecropin A; Cecropin A 1-8; e CNGRC cíclico; a referida pelo menos uma das moléculas lipídicas é selecionada a partir do grupo que consiste em 1-palmitoil2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-3fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2-dimiristoil-3fosfatidilcolina (DMPC) ; 1,2-distearoil-3-fosfatidilcolina (DSPC); 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC); 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC); 1,2-dipalmitelaidoil-snglicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC); 1,2dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δδ-Cis)
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  27. 27/34
    PC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidilcolina (18:1 (A9-Cis) PC (DOPC)); 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (Δ9Trans) PC); 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC (DLPC)); 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC); 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC); 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3fosfocolina (20:4 (Cis) PC); 1,2-didocosahexaenoil-snglicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC); 1,2-dierucoil-snglicero-3-fosfocolina (22:1 (Cis) PC); 1,2-dinervonoil-snglicero-3-fosfocolina (24:1 (Cis) PC); 1,2-dimiristoil-3-3-fosfatidiletanolamina (DMPE) ; 1,2-dipalmitoil-3fosfatidiletanolamina (DPPE); dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); 1,2-dioleoil-3-fosfatidiletanolamina (DOPE); 1,2distearoil-3-fosfatidiletanolamina (DSPE); 1,2-dimiristoil3-fosfatidilserina (DMPS); 1,2-dipalmitoil-3fosfatidilserina (DPPS); palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE); e 1,2-dioleoil-3fosfatidilserina (DOPS); a referida fração estabilizadora é selecionada a partir de polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, álcool polivinilico, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano, um poliaminoácido, metil-polioxazolina, poliglicerol, poll(acriloil morfolina) e poliacrilamida; o referido primeiro grupo funcional do par de ligação específico é capaz de formar uma ligação covalente com o referido segundo grupo funcional complementar ao
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  28. 28/34 referido par de ligação via uma reação química de click, i) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou fosfina e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é azida, ou vice e versa; ii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é cicloalqueno, cicloalquino, ciclopropano, isonitrila (isocianida) ou ácido vinil borônico e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tetrazina ou vice e versa; iii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alquino ou maleimida e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é tiol ou vice e versa; iv) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é dieno conjugado e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alqueno substituído, ou vice e versa; v) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é alqueno, alquino ou acetileto de cobre e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é nitrona, ou vice e versa; vi) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído ou cetona e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é alcoxiamina, hidroxilamina, hidrazina ou hidrazida ou vice e versa; ou vii) o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é aldeído e o segundo grupo funcional do referido par de ligação é amina ou vice e versa; viii) grupo funcional, ou o primeiro grupo funcional do par de ligação específico é biotina e o segundo grupo funcional do referido par de
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  29. 29/34 ligação é seu parceiro de ligação selecionado de um peptídeo de ligação à biotina ou uma proteína de ligação à biotina, ou vice e versa; e o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa, ou (Ce— C12) alquil, preferencialmente heptil ou dodecanoil.
    64. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação de célula T é selecionado a partir de um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD8, um anticorpo anti-NKG2D, ou uma combinação dos mesmos, um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e CD8 e um anticorpo capaz de se ligar a ambos CD3 e NKG2D; a referida pelo menos uma das referidas moléculas lipídicas compreendendo um grupo catiônico é DOTAP; o referido fosfolipídeo é selecionado a partir de DOPC, POPC, DMPC, DPPC, DOPE, POPE, DSPE, DMPE e DPPE; a fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 106 Da a cerca de 4kDa; o referido par de ligação específico é alquino-azida, a referida proteína de ligação à biotina é selecionada a partir de avidina, estreptavidina e um anticorpo anti-biotina, ou o referido peptídeo de ligação à biotina é selecionado a partir de AEGEFCSWAPPKASCGDPAK (SEQ ID NO: 11), CSWRPPFRAVC (SEQ ID NO: 12), CSWAPPFKASC (SEQ ID NO: 13) e CNWTPPFKTRC (SEQ ID NO: 14) ; e o primeiro ou o segundo espaçador é PEG de um peso molecular de cerca de 194 Da (PEG 4).
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  30. 30/34
    65. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que fração estabilizadora é PEG de peso molecular de cerca de 2kDa.
    66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o lipossoma fusogênico compreende:
    a. DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 ou DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN; ou
    b. DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-N3 ou
    DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-BCN, em que PEG2K representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa e PEG4 representa PEG tendo um peso molecular de cerca de 194 Da e a quantidade molar relativa de DOPC é de até cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DOTAP é de até cerca de 80%, a quantidade molar relativa de DSPEPEG2K é de até cerca de 20%, a quantidade molar relativa de DOPE-PEG4 é de até cerca de 20%, a quantidade molar relativa de HSPC é de até cerca de 65%, a quantidade molar relativa de colesterol é de até 40% e a quantidade molar relativa de DMPC é de até cerca de 70% e o lipossoma fusogênico tem um tamanho de cerca de 80 nm ou 100 nm.
    67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o lipossoma fusogênico compreende:
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  31. 31/34 (I) DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 ou DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-BCN, na proporção molar de 52,5:35:0,6:10, 52,5:35:1,25:10, 52,5:35:2,5:10, 52,5:35:5:10, 52,5:35:0,6:5, 52,5:35:1,25:5, 52,5:35:2,5:5, 52,5:35:5:5, 65:20:5:10, 50:35:5:10, 52,5:35:1,25:7, 52,5:35:1,25:5, ou 52,5:35:2,5:7; ou (II) DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-N3 ou DMPC:Colesterol:DMPE-PEG4-BCN, na proporção molar de 60:35:5.
    68. Lipossoma fusogênico, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o lipossomo fusogênico compreende DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE-PEG4-N3 na proporção molar de 52,5:35:2,5:5.
    69. Lipossoma fusogênico caracterizado pelo fato de ser como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 68.
    70. Método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha externa, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a reação do lipossoma fusogênico, como descrito na reivindicação 52 com um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado com um segundo grupo funcional complementar do par de ligação, em que o referido segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional, produzindo assim o referido lipossoma fusogênico
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  32. 32/34 com o referido agente de ativação de células T ligado à folha externa.
    71. Método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha interna e externa, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as etapas de:
    (i) reagir uma pluralidade das moléculas lipídicas, como descritas na reivindicação 52, com um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação, em que o referido segundo grupo funcional se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas, desse modo produzindo as moléculas lipídicas ligadas ao agente de ativação de células T; e (ii) preparar o referido lipossoma fusogênico a partir das referidas moléculas lipídicas obtidas na etapa (i), produzindo desse modo o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação de células T ligado à folha interna e externa.
    72. Método para a preparação de um lipossoma fusogênico com um agente de ativação do sistema imunológico ligado à folha interna, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as etapas de:
    (i) preparar os lipossomas em uma solução compreendendo as moléculas lipídicas, como descrito na reivindicação 52 e um agente de ativação do sistema imunológico funcionalizado
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  33. 33/34 com um segundo grupo funcional do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipidicas, encapsulando assim uma fração do referido agente de ativação de células T;
    (ii) remover o agente de ativação de células T não encapsulado a partir da solução;
    (iii) reagir as moléculas lipidicas com o agente de ativação de células T encapsulado dentro do interior aquoso dos lipossomas preparados na etapa (i), em que o referido segundo grupo funcional do referido agente de ativação de células T se liga ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipidicas, desse modo produzir o lipossoma fusogênico funcionalizado com o referido agente de ativação de células T ligado à folha interna.
    73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a referida solução compreende adicionalmente pelo menos um catalisador de oxidaçãoredução.
    74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um catalisador de oxidação-redução é um sal de cobre (I), que é removido na etapa (ii) além do agente de ativação de células T não encapsulado e a reação na etapa (iii) é uma reação química click dependente de cobre.
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  34. 34/34
    75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 74, caracterizado pelo fato de que os lipossomas fusogênicos têm um tamanho de até 200 nm, por exemplo, de cerca de 15 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 110 nm a cerca de 200 nm, por exemplo, cerca de 100 nm.
    76. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a. um primeiro recipiente compreendendo um lipossoma fusogênico, como definido na reivindicação 52;
    b. um segundo recipiente compreendendo um agente de ativação de células T funcionalizado com um segundo grupo funcional do par de ligação capaz de se ligar ao referido primeiro grupo funcional das referidas moléculas lipídicas;
    c. um panfleto com instruções para um método para o tratamento do câncer, compreendendo a administração do lipossoma fusogênico a um paciente com câncer de (a) e subsequentemente o agente de ativação de células T de (b) .
BR112019022016-0A 2017-04-19 2018-04-17 Lipossomas fusogênicos, composições, kits e uso dos mesmos no tratamento do câncer BR112019022016A2 (pt)

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