JP2005519078A - 急性骨髄性白血病の治療方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、患者において、白血病を処置するための方法を提供する。この方法は、患者の白血病細胞においてフォレートレセプターβの発現を増加する物質(FR−βインデューサーと称される)を患者に投与する工程、および患者において白血病細胞を標的にするフォレート結合体化治療剤を投与する工程を包含する。本発明はまた、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤の1つまたは両方を含有する薬学的組成物を含む。本発明はまた、患者における白血病の処置に使用するためのキットを提供し、このキットは、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤を含む。
Description
本願は、米国仮特許出願番号60/360,408(2002年2月27日出願)(これは、本明細書中で参考として援用される)からの優先権を主張する。本発明は、少なくとも一部、National Institutes of Health R01 Grants CA80183およびCA70873の下で、政府の援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
(発明の分野)
本発明は、白血病を処置するための方法に関する。より具体的には、本発明は、骨髄性白血病、特に急性骨髄性白血病(AML)を有する患者を処置するための方法に関し、この方法は、フォレートレセプターβ(FR−β)のレベルを増大させる薬剤を投与し、次いで、フォレート結合体化抗癌治療剤で患者を処置することによる。
本発明は、白血病を処置するための方法に関する。より具体的には、本発明は、骨髄性白血病、特に急性骨髄性白血病(AML)を有する患者を処置するための方法に関し、この方法は、フォレートレセプターβ(FR−β)のレベルを増大させる薬剤を投与し、次いで、フォレート結合体化抗癌治療剤で患者を処置することによる。
(背景)
白血病は、血液形成器官の細胞を含む腫瘍性障害である。白血病は、骨髄性またはリンパ性のいずれかとして一般に分類される。骨髄性白血病は、骨髄の骨髄性要素−白血球、赤血球および巨核球を含む。全ての白血病の症例の半分を占める骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病(AML)または慢性骨髄性白血病(CML)として分類される。AMLは、成体における最も一般的な形態の白血病であり、分化の度合いおよび細胞成熟の程度に基づいて、French−American−British(FAB)基準に従って、クラスM0〜M7に分類される。標準的なAML化学療法(これは、しばしば、アントラサイクリンを含む)は、AML患者における70%の完全寛解(CR)率を生じる。しかし、アントラサイクリン療法は、骨髄抑制(myelosuppression)および用量制限心臓毒性(cardiotoxicity)、ならびに再発の有意な発生率を含む、重篤な副作用に関連する。20%未満のCRの患者は、長期生存する。
白血病は、血液形成器官の細胞を含む腫瘍性障害である。白血病は、骨髄性またはリンパ性のいずれかとして一般に分類される。骨髄性白血病は、骨髄の骨髄性要素−白血球、赤血球および巨核球を含む。全ての白血病の症例の半分を占める骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病(AML)または慢性骨髄性白血病(CML)として分類される。AMLは、成体における最も一般的な形態の白血病であり、分化の度合いおよび細胞成熟の程度に基づいて、French−American−British(FAB)基準に従って、クラスM0〜M7に分類される。標準的なAML化学療法(これは、しばしば、アントラサイクリンを含む)は、AML患者における70%の完全寛解(CR)率を生じる。しかし、アントラサイクリン療法は、骨髄抑制(myelosuppression)および用量制限心臓毒性(cardiotoxicity)、ならびに再発の有意な発生率を含む、重篤な副作用に関連する。20%未満のCRの患者は、長期生存する。
再発したAML疾患は、多剤耐性(MDR)を示し、この再発した疾患を、薬物を含む種々の化学療法剤でのさらなる処置に対してしばしば難治性にする。白血病において、MDRは、透過性糖タンパク質(permeability glycoprotein)(P−gp)として公知の、MDR−1遺伝子によってコードされる170kDaの膜貫通糖タンパク質に最も頻繁に関連する。P−gpは、AML患者の30〜50%で生じ、これらの患者のより高い割合が、再発したかまたは化学療法難治性(chemo−refractory)の疾患を有する。抗白血病薬物をP−gp調節因子と組み合わせることは、この調節因子の用量制限毒性および減少した薬物排出から生じる毒性の両方に起因して、この問題を克服することにおいて成功が限定されている。従って、新たな処置は、AMLに対して選択的であるだけでなく、MDRを回避すべきである。
AMLのサブセットについて、他の処置が見出されている。例えば、急性前骨髄球白血病(PML)(これは、AMLの10%を占める)は、細胞遺伝学的に、PML−レチノイン酸レセプターα(RARα)遺伝子融合産物の産生を生じる、t(15;17)染色体転座に関連する。完全な寛解は、PML細胞の分化を引き起こす、全てトランスの(all−trans)レチノイン酸(ATRAまたはトレチノイン)を使用して、PML患者の72〜95%で達成され得る。しかし、この治療はまた、後の再発の発生率が有意である。再発するPML疾患を有する患者は、しばしば、レチノイン誘導性の分化をブロックする変異に起因して、さらなるATRA治療に対して難治性である。PMLでないAMLの90%は、ATRA治療に全く応答しない。
これらの問題に取り組むための試みにおいて、骨髄性白血病について標的化された治療剤を開発するために、有意な研究がなされてきた。このような標的化された治療剤は、最も頻繁には、治療薬物、最も頻繁には細胞傷害性剤と連結された、目的の腫瘍細胞の表面上の分子に対して親和性を有するリガンドからなる。表面分子に対するリガンドの結合は、腫瘍細胞にもたらされる高濃度の細胞傷害性剤を生じる。このような治療剤が有効であるために、他の非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞に対してこの薬剤の特異性が存在する。
標的化治療剤の例としては、Gemtuzumab ozogamicin(CMA−676)が挙げられ、これは、骨髄細胞マーカーのCD33に特異的なヒトモノクローナル抗体(huMAb)に連結された、細胞傷害性薬物であるカリケアマイシン(calichaemicin)からなり、最近、FDAによって、臨床的使用について承認された。GleevecTM(bcr−ablチロシンキナーゼインヒビター)は、CMLに対して90%有効であり、そして最小の副作用を引き起こした。AMLの処置のための標的化免疫毒素とサイトカインとの融合毒素もまた、開発されている。これらには、以下が挙げられる:抗CD64−リシンA鎖、抗CD7および抗CD38−サポリン(Saporin)、抗Tac(Fv)−シュードモナス外毒素(PE38)(LMB−2)、抗CD33ゲロニン(gelonin)ならびにシュードモナス外毒素(PE38)およびジフテリア毒素との顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)融合タンパク質。これらの治療剤の全て特定の強さおよび弱さを有する。
標的化治療剤が開発された目的の1つの細胞表面分子は、フォレートレセプター(FR)である。FRの3つのヒトアイソフォームが存在する:FR−α、FR−βおよびFR−γ。FR−αおよびFR−βは、グリコシル−ホスファチジルイノシトール(GPI)膜アンカーを介して、細胞表面に結合している。FR−γは分泌され、従って、このような治療剤によって標的化され得ない。
正常組織におけるFR−αの発現は、特定の上皮細胞の管腔表面に限定されており、ここで、FR−αは、循環を介して接近不能である。FR−αは、特定の癌腫、特に、主要な婦人科学腫瘍(例えば、卵巣癌)において過剰発現され、ここで、FR−αは、血流を介した腫瘍選択的標的化のために接近可能である。
FR−βは、胎盤組織および造血細胞において通常見出され、ここで、FR−βは、骨髄単球性系統で発現され、そして好中球成熟の間、または単球もしくはマクロファージの活性化の間に、特に上昇される。しかし、正常な造血細胞上で発現されるFR−βは、活性化マクロファージ上のものとは異なり、フォレートに結合することもフォレートを内在化することもできない点で、非機能的である。FR−βは、CMLを有する患者由来の悪性細胞上で発現され、そしてAMLを有する患者の約70%に由来する悪性細胞上で発現される。
低い毒性を有し、そして他の方法および治療剤に対する耐性を発生させた患者の処置のために使用され得る、骨髄性白血病に対する新規標的化治療剤、および骨髄性白血病細胞を特異的に標的化する有効な治療剤を使用して骨髄性白血病(具体的にはAML)を有する個体を処置するための方法についての必要性が、存在し続ける。
(発明の要旨)
本発明は、骨髄性白血病、好ましくはAMLを有する患者を処置するための方法を提供する。この方法は、患者に、骨髄性白血病細胞(芽細胞、前駆細胞および幹細胞を含む)の原形質膜上のFR−βのレベルを増大させるのに十分な量のFR−βインデューサーを投与する工程、および生物学的有効量のフォレート結合体化治療剤(細胞傷害性薬物を含む)を患者に投与する工程を包含する。
本発明は、骨髄性白血病、好ましくはAMLを有する患者を処置するための方法を提供する。この方法は、患者に、骨髄性白血病細胞(芽細胞、前駆細胞および幹細胞を含む)の原形質膜上のFR−βのレベルを増大させるのに十分な量のFR−βインデューサーを投与する工程、および生物学的有効量のフォレート結合体化治療剤(細胞傷害性薬物を含む)を患者に投与する工程を包含する。
本発明者らは、FR−βの発現が、FR−βインデューサーによって骨髄性白血病患者由来の悪性細胞において増大したことを見出した。1実施形態において、FR−βインデューサーは、レチノイン酸レセプター(RAR)α、βまたはγの1つ以上のアゴニストである。1つの特に有用なアゴニストは、全てトランスのレチノイン酸(ATRA)である。別の実施形態において、レチノイン酸レセプターアゴニストおよびヒストンデアシラーゼ(deactylase)インヒビターが、患者に投与される。1つの特に適切なヒストンデアシラーゼインヒビターは、Trichostatin A(TSA)である。
本発明者らはまた、骨髄性白血病細胞、特にAML細胞において発現されるFR−βが、正常造血細胞の大多数において発現される非機能的なFR−βとは異なり、フォレートに結合し、そして内在化する点で、機能的であることを見出した。このような機能的FR−βは、本発明のフォレート結合体化治療剤についての標的である。1実施形態において、フォレート結合体化治療剤は、リポソームに結合または結合体化されたフォレートを有するリポソームであり、このリポソームは、治療薬物、好ましくは腫瘍細胞に対する薬物細胞毒素を含むか、または会合している。好ましくは、フォレートは、リポソームの脂質二重層の一部である分子に共有結合している。好ましくは、フォレートは、可撓性親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))を介して、リポソームの一部である脂質に結合される。
(発明の詳細な説明)
(定義)
本明細書中で、「白血病細胞」、「AML細胞」および「CML細胞」とは、特定の疾患(それぞれ、白血病、AMLおよびCML)を有する患者由来の悪性細胞をいう。
(定義)
本明細書中で、「白血病細胞」、「AML細胞」および「CML細胞」とは、特定の疾患(それぞれ、白血病、AMLおよびCML)を有する患者由来の悪性細胞をいう。
本明細書中で、「FR−βインデューサー」とは、白血病の患者に投与した場合、患者における白血病細胞上のフォレートレセプター−β(FR−β)量の増加を引き起こす物質をいう。
本明細書中で、「フォレート結合体化治療剤」とは、少なくとも1つのフォレート分子および少なくとも1つの関連した治療物質、化合物、薬物またはキャリアを有する物質をいう。治療物質は、毒素、酵素、抗体、放射性医薬品または他の物質であり得る。治療物質は、好ましくは、細胞傷害性因子である。フォレート結合体化治療剤は、フォレートが治療物質に結合された分子を含み得るか、あるいはフォレートがキャリア(例えば、リポソーム)または他の生体適合性粒子を介して治療物質に間接的に接着するか、または会合する分子を含み得る。例えば、治療物質は、粒子、ポリマーまたは他の生物適合性材料に接着し得るか、またはそれらの中に含まれ得る。粒子、ポリマーまたは生体適合性材料は、フォレート結合体化治療剤の少なくとも1つのフォレート分子に接着される。この治療物質は、好ましくは、リポソームに接着されるか、またはその中に含まれる。治療物質、粒子、ポリマー、他の生体適合性材料またはリポソームのフォレートへの接着は、直接的であっても、別の物質(好ましくは、親水性物質)を介してであってもよい。好ましい実施形態において、例えば、フォレート結合体化治療剤のリポソームは、ポリエチレングリコール(PEG)を介してフォレートに接着される。フォレートに接着されるリポソームは、このフォレートがリポソームに直接接着していようと、PEGのような分子を介していようと、「フォレートでコーティングされたリポソーム(folate−coated liposime)」といわれる。
本発明は、白血病、好ましくは、骨髄性白血病、より好ましくは、急性骨髄性白血病(AML)を有する患者を処置する方法を提供する。この方法は、患者における癌の悪性細胞上のフォレートレセプターβ(FR−β)の発現増加を引き起こす物質を、患者に投与する工程を包含する。このような物質は、FR−βインデューサーといわれる。
この方法はまた、患者においてFR−βを発現する白血病の悪性細胞に対して細胞傷害性であるか、または少なくともそれらの増殖を阻害する物質と会合したフォレートを含むフォレート結合体化治療剤を、患者に投与する工程を包含する。フォレート結合体化治療剤のフォレート部分は、患者における白血病細胞のFR−βに結合する。フォレート部分によるこの結合は、フォレート結合体化治療剤の細胞傷害性部分を、患者の白血病細胞に密接に近接させる。好ましくは、これらの白血病細胞は、治療剤の細胞傷害性部分を内在化させる。治療剤の細胞傷害性部分は、好ましくは、白血病細胞を殺傷する。
これらの方法は、多くの利点を有する。1つの利点は、白血病細胞ではない細胞に比べた、患者の白血病細胞の処置に対する特異性である。例えば、正常造血細胞上のFR−βは、フォレートに結合しないが、白血病細胞上のFR−βは、フォレートに結合して、内在化させる。さらに、本発明の方法は、要求される物質を使用して、患者の白血病細胞上のFR−βのレベルまたは量の増加を提供する。FR−βインデューサーの1つの好ましい種類としては、レチノイン酸レセプターアゴニストが挙げられる。1つの好ましいレチノイン酸レセプターアゴニストは、全トランスレチノイン酸(all−trans retinoic acid(ATRA))である。
本方法の別の利点は、これが従来の治療がない、ある場合において効果的であることである。例えば、ATRAによる増加したレベルの機能的FR−βの誘導は、ATRAに応答して分化しないAML細胞(すなわち、AMLについてのATRA分化治療に不応性である細胞)においてでさえ生じる。FR−βのATRA誘導は、全AMLサブタイプにおいて生じる。本発明の有効性の別の例は、患者の白血病細胞が、MDR−1遺伝子によってコードされるP−gpに起因して、多剤耐性(MDR)を獲得している場合である。このような白血病細胞は、遊離のドキソルビシン(DOX)を使用する処置に対して抵抗性である。本発明の1つの実施形態を使用して、詳細には、フォレート結合化治療剤(フォレートでコーティングされたリポソーム、DOX含有リポソームを含む)を使用して、白血病細胞のMDR表現型が、回避される(すなわち、このような白血病細胞は、フォレートでコーティングされたリポソームを使用して誘導されたDOXに耐性ではない)。また、フォレートでコーティングされたリポソームは、免疫原性ではない。
本発明および本発明が基づくこれらの知見は、以下により詳細に記載される。
(正常な造血細胞におけるFR−βの非機能性)
他の研究と一致して、本発明者は、正常造血細胞におけるFR−βが、フォレートに結合せず、これを内在化しないことを示した。好中球は、正常造血細胞において最も高いレベルのFR−βを発現するので、これらの細胞におけるリガンド結合特性がある研究において試験された。細胞溶解物は、正常な末梢血好中球から作られ得る。これらの細胞溶解物は、精製されたFR−βに対して生成された抗血清を使用して、ウェスタン分析または免疫ブロット分析に供された。これらの結果(図1A)は、組換えCHO−FR−β細胞(短縮型FR−β遺伝子を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞)由来のFR−βとほぼ同じ大きさの見かけの分子量を有する拡散したバンドを示した。好中球に発現したFR−βのレベルは、組換えCHO−FR−β細胞におけるレベルと匹敵した。
他の研究と一致して、本発明者は、正常造血細胞におけるFR−βが、フォレートに結合せず、これを内在化しないことを示した。好中球は、正常造血細胞において最も高いレベルのFR−βを発現するので、これらの細胞におけるリガンド結合特性がある研究において試験された。細胞溶解物は、正常な末梢血好中球から作られ得る。これらの細胞溶解物は、精製されたFR−βに対して生成された抗血清を使用して、ウェスタン分析または免疫ブロット分析に供された。これらの結果(図1A)は、組換えCHO−FR−β細胞(短縮型FR−β遺伝子を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞)由来のFR−βとほぼ同じ大きさの見かけの分子量を有する拡散したバンドを示した。好中球に発現したFR−βのレベルは、組換えCHO−FR−β細胞におけるレベルと匹敵した。
好中球上のFR−βの機能性を、細胞からGPIで係留されたFR−βを放出するように、FR−βのGPI膜アンカーについて一般的に使用される診断試験(ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC)で細胞を処理することを含む)を用いて試験した。これらの結果(図1B)は、CHO−FR−β細胞におけるFR−βとは対照的に、好中球におけるレセプターがPI−PLCを用いて細胞表面から放出され得なかったことを示した。いくつかの組織は、GPIアンカーのイノシトール環上に改変(PI−PLCに対する耐性を引き起こす)を付与することが知られている。このような場合、このアンカーは、亜硝酸によって切断され得る。従って、これらの細胞由来の膜調製物はまた、GPIアンカーを切断するために、新たに調製した亜硝酸で処理される。これらの結果(図1B)は、これらの細胞から調製された膜が亜硝酸で処理された場合、FR−βが放出されることを示し、このことは、これらの細胞におけるFR−βに対する改変GPIアンカーの存在を示す。
好中球上のFR−βがフォレートを結合し得たか否かを試験するために、これらの細胞を、競合因子としての非標識葉酸1μMの存在下または非存在下で、4℃で30分間にて、PBS中10nMのフルオレセイン−(FITC)結合体化フォレートと共にインキュベートした。細胞表面結合FITCの蛍光を、フローサイトメトリー分析によって測定した。これらの結果(図1C)は、好中球におけるFR−βが、CHO−FR−β細胞におけるFR−βとは違って、FITC−フォレートに結合し得なかったことを示した。
さらなる研究において、好中球由来のcDNAのヌクレオチド配列を決定した。配列相違は、FR−βの既知のcDNA配列から観察されなかった。従って、このデータは、正常造血細胞(特に、好中球)におけるFR−βが、フォレートへの結合において機能しないことを示した。
(AML細胞におけるFR−βの機能性)
背景の節において議論したように、FR−βは、CML患者由来の悪性細胞および約70%のAML患者由来の細胞で発現している。ある研究において、本発明者らは、FR−βの発現について78人の患者由来のAML細胞を分析した。以下の表1は、この研究の概要であり、これは、患者の骨髄から得、そして免疫蛍光フローサイトメトリーによって分析したAML細胞におけるFR−β発現を示す。これらの細胞におけるCD34発現もまた、記載する。これらの結果は、患者の大部分(68%)に由来するAML細胞が、FR−βについてポジティブであったことを示した。さらに、AML細胞を有した患者の72%(53人の患者のうち38人)が、FR−βについてポジティブであり、100%のAML細胞がFR−βを発現した。さらに、FR−βについてポジティブであったAML細胞の66%はまた、CD34+であった。
背景の節において議論したように、FR−βは、CML患者由来の悪性細胞および約70%のAML患者由来の細胞で発現している。ある研究において、本発明者らは、FR−βの発現について78人の患者由来のAML細胞を分析した。以下の表1は、この研究の概要であり、これは、患者の骨髄から得、そして免疫蛍光フローサイトメトリーによって分析したAML細胞におけるFR−β発現を示す。これらの細胞におけるCD34発現もまた、記載する。これらの結果は、患者の大部分(68%)に由来するAML細胞が、FR−βについてポジティブであったことを示した。さらに、AML細胞を有した患者の72%(53人の患者のうち38人)が、FR−βについてポジティブであり、100%のAML細胞がFR−βを発現した。さらに、FR−βについてポジティブであったAML細胞の66%はまた、CD34+であった。
(表1.フローサイトメトリーによって決定した場合の、AMLを有する患者から吸引した骨髄由来細胞上のFR−βおよびCD34の発現)
試験したAMLサンプルの総数:78
100%の細胞がFR−β(+)であったサンプル数:38
80−90%の細胞がFR−β(+)であったサンプル数:4
30−60%の細胞がFR−β(+)であったサンプル数:8
FR−β(+)AMLサンプルの総数:53;FR−β(+)サンプルの%:68
さらに、本発明者らは、抗FR−β抗体(106個の細胞あたり、0.72±0.13pmole)を使用して、フローサイトメトリーからのFR−βの相対的な発現レベルによって予測される程度まで、FR−β(+)AML細胞が、[3H]葉酸に結合することを見出した。さらに、このFR−β(+)AML細胞による[3H]葉酸の結合は、10nMの葉酸との前インキュベーションによってブロックされ得る。このことは、この結合がFR特異的であることを示している。
(FR−βインデューサー)
本発明者らは、FR−βインデューサーが、白血病細胞(芽細胞、前駆体細胞および幹細胞を含む)の原形質膜上のFR−βレベルを上昇させることもまた見出した。FR−βインデューサーの1つのこのような群は、レチン酸レセプターアゴニストである。このようなレチン酸レセプターアゴニストとしては、レチン酸レセプターα、レチン酸レセプターβおよびレチン酸レセプターγのうちの1つ以上のアゴニストである物質が挙げられる。特に有用なレチン酸レセプターアゴニストは、オール−トランスレチン酸(ATRA)である。他の有用なレチン酸レセプターアゴニストは、テトラメチルナフタレニルプロペニル安息香酸(TTNPB)、9−シスレチン酸(9−シスRA)、CD336、LG101093およびCD2781などとして、当該分野で公知である。さらなるアゴニストは、Wang,Zheng,BehmおよびRatnam,2000,Blood 96:3529−3536において記載されている。
本発明者らは、FR−βインデューサーが、白血病細胞(芽細胞、前駆体細胞および幹細胞を含む)の原形質膜上のFR−βレベルを上昇させることもまた見出した。FR−βインデューサーの1つのこのような群は、レチン酸レセプターアゴニストである。このようなレチン酸レセプターアゴニストとしては、レチン酸レセプターα、レチン酸レセプターβおよびレチン酸レセプターγのうちの1つ以上のアゴニストである物質が挙げられる。特に有用なレチン酸レセプターアゴニストは、オール−トランスレチン酸(ATRA)である。他の有用なレチン酸レセプターアゴニストは、テトラメチルナフタレニルプロペニル安息香酸(TTNPB)、9−シスレチン酸(9−シスRA)、CD336、LG101093およびCD2781などとして、当該分野で公知である。さらなるアゴニストは、Wang,Zheng,BehmおよびRatnam,2000,Blood 96:3529−3536において記載されている。
別の実施形態において、レチン酸レセプターアゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビターを、患者に投与する。1つの特に有用なヒストンデアセチラーゼインヒビターは、Trichosatatin A(TSA)である。他の有用なヒストンデアセチラーゼインヒビターは、Marks,Richon,BreslowおよびRiflkind,2001,Curr.Opin.Oncol.13:477−83;Yoshida,Furumai,Nishiyama,Komatsu,NishinoおよびHorinouchi,2001,Cancer Chemother.Pharmacol.48 補遺1:S20−6;ならびに、Jung,2001,Curr.Med.Chem.8:1505−11において記載されている。このFR−βインデューサーは、RARアゴニストを、単独でかまたはヒストンデアセチラーゼインヒビターと組み合わせて含み得る。
1研究において、FR−β発現は、末端分化も細胞増殖阻害もない状態で、用量依存性の可逆的様式において、KG−1において骨髄性白血病細胞中、ATRAの20倍まで上昇した(図4)。FR−β発現におけるレチノイ誘導性増加が、末端分化も細胞増殖阻害も引き起こすことなく、これらの細胞において生じた。さらに、患者の骨髄由来の骨髄性白血病細胞において、ATRAは、インビトロでFR−β発現を増加させた(図5)。FR−βのATRA誘導は、初代AML芽細胞(M2型およびM4型のAML)がATRA分化治療に対して不応性であることが知られている場合でさえも生じた。これらの結果は、FR標的化治療を容易にするために、FR−βインデューサーを使用して、FR−βレベルを増加させ得ることを示した。さらに、FR−βインデューサーは、レチノイド分化治療に対して不応性のAML細胞においてFR−β発現を調節し得る。
他の研究において、培養細胞中でのFR−βのアップレギュレーションに対する、ATRAおよびヒストンデアセチラーゼインヒビター(Trichosatatin A(TSA))の効果を試験した。1セットの研究において、293細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子(この遺伝子の転写を、FR−βプロモーターによって調節した)からなるDNA構築物を用いて安定にトランスフェクトした。これらの細胞内でのルシフェラーゼレベルの分析は、FR−βプロモーターの転写活性を示している。このFR−βプロモーターの活性は、細胞内でのFR−βレベルを示している。これらの研究からのデータ(図13および図14に示す)によって、ATRAとTSAとの間に相乗作用効果が存在し、その結果、ATRAおよびTSAの存在下でのFR−βプロモーターの活性は、ATRA単独またはTSA単独のいずれかの存在下でのFR−βプロモーターの活性よりも高かったことが示された。
第二セットの研究において、ヒトAML KG−1細胞(これらの細胞は、FR−βに対してポジティブである)を、ATRA、TSAまたはATRA+TSAで処理し、次いで、リアルタイムPCRを使用してFR−β mRNAレベルについて試験し(図15)、ウエスタンブロッティジングを使用してFR−βタンパク質について試験した(図16)。このデータは、さらに、ATRAとTSAとの間の相乗作用効果を示し、その結果、ATRAおよびTSAの存在下でのFR−βレベルは、一般に、ATRA単独またはTSA単独のいずれかの存在下でのFR−βレベルよりも高かったことが示された。これらのデータは、レチン酸レセプターアゴニストとヒストンデアセチラーゼインヒビターとの組み合わせが、白血病細胞におけるFR−βレベルを増加させるために有利であることを示している。
(FR−β発現細胞を標的化するためのフォレート結合体化治療剤)
FR−βは、葉酸について、約1nMのKd値を有する。葉酸は、そのγカルボキシル基の共有結合性の誘導体化後に、FRについて高い活性を保持する。例えば、フォレート結合体化ポリエチレングリコール(PEG)は、FRに対して、葉酸の親和性のわずか5倍未満の親和性しか有さないことが報告されている。FRへの結合後、フォレート結合体は、レセプター媒介エンドサイトーシスを介して、細胞によって内在化されることが示されている。さらに、レセプター結合後のフォレート結合体の細胞内経路(intercellular routing)は、非分解性経路を追従するようである。
FR−βは、葉酸について、約1nMのKd値を有する。葉酸は、そのγカルボキシル基の共有結合性の誘導体化後に、FRについて高い活性を保持する。例えば、フォレート結合体化ポリエチレングリコール(PEG)は、FRに対して、葉酸の親和性のわずか5倍未満の親和性しか有さないことが報告されている。FRへの結合後、フォレート結合体は、レセプター媒介エンドサイトーシスを介して、細胞によって内在化されることが示されている。さらに、レセプター結合後のフォレート結合体の細胞内経路(intercellular routing)は、非分解性経路を追従するようである。
FR−αを標的化することによって、主として婦人科学的腫瘍を処置するための種々のフォレート結合体化化合物が、開発されている。例えば、フォレートは、タンパク質毒素、酵素、抗体、放射性薬品、アンチセンスデオキシリボヌクレオチド化学治療剤、星形デンドリマー(starburst dendrimer)、および遺伝子移入ベクターに結合体化されている。さらに、フォレート結合体は、他の細胞毒性薬物、ポリマー、ナノ粒子、ミセル、他の生体適合性材料などを含み得る。
上記のフォレート結合体化治療剤のいずれかを、本発明において使用し得る。このような治療剤は、この治療剤が標的化されるべき細胞上でFRに結合し得るフォレートを含むのが、一般的である。このような治療剤はまた、細胞上で作用し得るようにフォレートが結合する細胞に近接している1種以上の治療物質を含むのが、一般的である。好ましい治療物質は、白血病細胞に近接した場合に細胞を殺傷することができる、細胞障害性因子である。
本発明において好ましいフォレート結合体化治療剤は、フォレートでコーティングされたリポソームである。これらの治療剤が、薬物の高いペイロード(payload)を保有し、長期全身循環時間を保有し、かつ多価相互作用を介して高い親和性でFRに結合する能力に起因して、フォレートでコーティングされたリポソームは、特に、本方法における使用に十分に適している。フォレートが、白血病細胞の表面上でのFR(特に、FR−β)との相互作用にもFR(特に、FR−β)への結合にも利用可能であるように、このフォレートをリポソームに結合させる。このフォレートでコーティングされたリポソームはまた、このリポソームに結合するかまたはこのリポソーム内に含まれる、1種以上の治療物質を有する。
リポソームに対する代替物が、本発明において使用され得ることに留意すべきである。例えば、生体適合性材料から作製される種々の粒子もまた、使用され得る。このような粒子は、一般に、0.1ミクロンと5ミクロンとの間の直径である。これらの粒子は、好ましくは、生分解性である。これらの粒子は、治療物質を含むかまたは治療物質に結合される。これらの粒子は、直接的にかまたは以下に記載される別の分子(例えば、疎水性分子)(例えば、ポリエチレングリコールまたはPEG)を介してかのいずれかによって、フォレートに結合される。
(リポソーム)
種々の異なる型のリポソームが、当該分野で周知である。一般に、リポソームは、内部キャビティを含む球状粒子である。リポソームの壁は、一般に、二層の脂質(特に、リン脂質)から構成される。リポソームを作製するために使用され得る、多数の脂質およびリン脂質が存在している。これらの脂質およびリン脂質は、当該分野で周知である。多数の型のリポソーム、ならびに脂質およびリン脂質が、米国特許第5,049,389号、ならびにStormおよびCrommelin、1998、Pharmaceutical Science and Technology Today、1:19−31(これらの参考文献中の記載は、本明細書中で参考として援用される)のような参考文献において記載されている。
種々の異なる型のリポソームが、当該分野で周知である。一般に、リポソームは、内部キャビティを含む球状粒子である。リポソームの壁は、一般に、二層の脂質(特に、リン脂質)から構成される。リポソームを作製するために使用され得る、多数の脂質およびリン脂質が存在している。これらの脂質およびリン脂質は、当該分野で周知である。多数の型のリポソーム、ならびに脂質およびリン脂質が、米国特許第5,049,389号、ならびにStormおよびCrommelin、1998、Pharmaceutical Science and Technology Today、1:19−31(これらの参考文献中の記載は、本明細書中で参考として援用される)のような参考文献において記載されている。
本発明のリポソームは、リポソームを作製するための当該分野で公知の任意の標準的な方法によって、調製され得る。種々のこのような方法は、公知である。このような方法のいくつかとしては、乾燥脂質の水和、水溶液中への脂質の有機溶液の導入、その後の有機溶液のエバポレーション、ならびに洗浄剤または界面活性剤を除去するための、脂質および洗浄剤または界面活性剤の水溶液の透析が挙げられる。これらの方法の多くは、米国特許第5,049,389号、StormおよびCrommelin、1998、Pharmaceutical Science and Technology Today、1:19−31、ならびにSzokaおよびPapahadjopoulos、1978、Proc Natl Acad Sci U S A、75:4194−8(これらの記載は、それら全体が本明細書中で参考として援用される)において記載されている。
ポリエチレングリコールまたは他の親水性ポリマー誘導体化脂質が、長期全身循環を提供するために組み込まれ得る(通常、1〜20mole%)。二層安定性を改善するために、コレステロールが、50mole%まで組み込まれ得る。リポソームは、凍結防止剤(例えば、グルコース、スクロース、ガラクトースなど)の存在下で凍結および/または凍結乾燥され得、そして後日、再構成され得る。これは、リポソームの有効期間を延長させる。
全身薬物送達について、高い相転移温度の合成脂質およびコレステロールから構成される、100〜200nmの範囲の直径を有する適切な巨大単層小胞(LUV)が、循環におけるそれらの優性な安定性に起因して、しばしば使用される。代表的なリポソーム調製物は、ジステアロイルホスファチジルコリン/コレステロール(DSPC/Chol)の60:40(mol/mol)の塩基性脂質組成物を有する。さらに、ペグ化(PEGylated)脂質mPEG2000−DSPEを、4〜10mole%にて二層に組み込み、血清タンパク質オプソニン化に対してリポソームを立体的に安定化し得、これによって、細網内皮系(RES)の単核食細胞によるリポソームの迅速な除去が生じる。これは、リポソームの全身循環時間を延長し、かつ肝臓および脾臓によるリポソームの取り込みを減少させる。
リポソームを作製した後、本発明の実施においてもまた使用され得る、リポソームを操作するための当該分野で周知の技術が存在している。例えば、標準的な技術によって作製されたリポソームの調製物は、それらを作製した後のサイズおよび層板(lamellarity)(すなわち、壁厚)が変動し得る。技術(例えば、リポソームを高剪断力に供すること、膜を通したリポソームの押出し、またはリポソームの超音波処理)を使用して、所望のサイズのリポソームを選択し得るか、またはリポソームが所望のサイズを有するように、それらを改変し得る。これらの方法によるリポソームの操作後、それらのリポソームのサイズ分布を測定して、所望のサイズのリポソームを得るのを確実にし得る。
(フォレートでコーティングされたリポソーム)
葉酸は、好ましくは、疎水性アンカー(例えば、リポソームの脂質二層の一部である分子)に結合または連結させることによって、リポソームに組み込まれるかまたはリポソームに結合される。フォレートは、疎水性アンカーに直接結合され得る。例えば、葉酸は、ホスファチジルエタノールアミン(PE)脂質アンカーのヘッド基に直接連結され得る。しかし、好ましくは、フォレートは、別の親水性分子を介して、疎水性アンカーに結合される。この目的のために好ましい親水性分子は、ポリエチレングリコール(PEG)である。本発明者らは、この目的のために、分子量3,350のPEGを使用したが、他の分子量のPEGが使用され得る。これらの様式のいずれかでフォレートが結合したリポソームは、本明細書中で、用語「フォレートでコーティングされたリポソーム」と呼ばれる。
葉酸は、好ましくは、疎水性アンカー(例えば、リポソームの脂質二層の一部である分子)に結合または連結させることによって、リポソームに組み込まれるかまたはリポソームに結合される。フォレートは、疎水性アンカーに直接結合され得る。例えば、葉酸は、ホスファチジルエタノールアミン(PE)脂質アンカーのヘッド基に直接連結され得る。しかし、好ましくは、フォレートは、別の親水性分子を介して、疎水性アンカーに結合される。この目的のために好ましい親水性分子は、ポリエチレングリコール(PEG)である。本発明者らは、この目的のために、分子量3,350のPEGを使用したが、他の分子量のPEGが使用され得る。これらの様式のいずれかでフォレートが結合したリポソームは、本明細書中で、用語「フォレートでコーティングされたリポソーム」と呼ばれる。
手順において、フォレートのリポソームへの結合は、フォレートを予め形成したリポソームに結合させるか、またはリポソームを作製した際に、フォレートをこのリポソームに結合させるかのいずれかによって、行われ得る。後者の方法が好ましく、そして好ましくは、リポソーム処方物に、予め合成した脂肪親和性フォレート誘導体(すなわち、リポソームの脂質二層の一部となる脂質に結合したフォレート)を組み込むことによって達成される。さらに、フォレートは、脂質に直接結合され得るか、または、PEGのような分子を介して間接的に結合され得る。1つのこのようなフォレート−PEG−脂質分子は、フォレート−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(フォレート−PEG−DSPE)である(図2)。別のこのような分子は、フォレート−ポリエチレングリコール−コレステロール(フォレート−PEG−Chol)である。類似の構造の他の分子もまた、使用され得、そして種々の方法を使用して作製され得る。
概して、このような分子は、化学組成物「フォレート−リンカー1−ポリマー−リンカー2−疎水性アンカー」の分子であり得る。「リンカー1」および「リンカー2」は、任意の型(例えば、エステル、エーテル、アミド、ヒドロゾン、チオエーテル、ジスルフィドなど)であり得る。「ポリマー」は、任意の型(好ましくは、水溶性)であり得る。「疎水性アンカー」は、任意の脂肪アルキル、アシル、もしくはアミドの誘導体またはコレステロール誘導体であり得る。
予め形成されたリポソームにフォレートを接着させるための方法は、ホスファチジルエタノールアミン上のアミン基のような脂質の反応性官能基を介してのリポソーム表面の共有結合誘導体化によってか、あるいは予め形成されたリポソームとの脂肪親和性フォレート結合体のミセル懸濁液を混合して、これらの結合体が、リポソーム二重層の外側リーフレットに自然に分割するのを可能にすることによってかのいずれかで実施され得る。
リポソームを作製する際に、予め合成された脂肪親和性フォレート誘導体をリポソーム組成物に組み込むことによってリポソームにフォレートを接着させるための方法は、標準的なリポソーム調製プロセスの開始時に、フォレート−PEG−DSPEまたはフォレート−PEG−Cholと、他の脂質成分とを単一の有機溶媒または有機溶媒混合物に同時溶解することによって実行され得る。これらには、超音波、ホモジナイズ、逆相エバポレーション、高圧溶出、有機溶媒注入、または界面活性剤溶解に続く透析による界面活性剤の除去が挙げられ得る。このような分子を合成するための1つの方法は、実施例1に詳細に記載される。
(リポソーム含有治療剤)
本発明のフォレートでコーティングされたリポソームは、治療剤を含むか、治療物質に接着されるか、または治療物質に会合される。その結果、これらの物質(このフォレートはフォレート結合体化治療剤の一部である)は、白血病細胞に送達される。このようなリポソームは、治療物質で「充填され(loaded)」ているといわれる。リポソームが治療物質で充填されたことによって、この方法は「充填(loading)」といわれる。
本発明のフォレートでコーティングされたリポソームは、治療剤を含むか、治療物質に接着されるか、または治療物質に会合される。その結果、これらの物質(このフォレートはフォレート結合体化治療剤の一部である)は、白血病細胞に送達される。このようなリポソームは、治療物質で「充填され(loaded)」ているといわれる。リポソームが治療物質で充填されたことによって、この方法は「充填(loading)」といわれる。
リポソームを使用して送達される物質は、延長された全身性循環時間および遊離薬物(すなわち、リポソームを用いて送達されない)(これらは、迅速な尿排出にしばしば供される)の濃度と比較して減少した血漿濃度を示す。従って、リポソーム送達は、血漿半減期(t1/2)、平均存在時間(MRT)、および薬物の血漿濃度対時間曲線下の領域(area under the plasma concentration versus time curve)(AUC)における大きな増加に関連する。
リポソームに治療物質または薬物を充填するための、当該分野で公知の種々の方法が存在する。概して、本質的に親水性である薬物は、リポソーム粒子の内腔(internal cavity)に局在するか、または会合される。概して、本質的に脂肪親和性である薬物は、リポソーム粒子の脂質二重層に局在するか、または会合される。受動的充填において、リポソームは使用される薬物の溶液中で形成される。能動的充填において、種々の方法が当該分野で公知である。能動的充填の1つの型(pHベースの充填といわれる)において、プロトンは、薬物分子から溶解され、これは、薬物をリポソームに入り込ませ維持させる(CehおよびLasic,1997,J Colloid Interface Sci,185:9−18.)。硫酸アンモニウム充填において、この薬物は、硫酸アンモニウム勾配の存在に起因して、リポソームに入り込ませる(CehおよびLasic,1997,J Colloid Interface Sci,,185:9−18.)。別の方法において、リポソーム中のキレート剤は、リポソーム中への薬物の捕捉、およびリポソームへの薬物のさらなる拡散を生じる(特許番号WO 0023052)。
リポソームへの薬物の充填後、リポソームに充填されていない薬物およびリポソームに会合されていない薬物を除去するための工程が使用され得る。このような工程は、イオン交換、ダイアフィルトレーション、または超遠心分子を使用する粒子もしくはアグロマレイトの洗浄のような技術を含み得る。
種々の治療剤または薬物は、本発明のフォレートでコーティングされたリポソームにおいて使用され得る。ドキソルビシン、ドナルビシン(donarubicin)、ビンクリスチンおよび他の多くの因子が、単独または組み合わせて使用され得る。好ましくは、これらの薬物は、これらが密接に接触される細胞に対して細胞傷害性である。
好ましい化学療法剤は、ドキソルビシン(DOX)である。DOXは、膜貫通pH勾配に基づくリモート−充填(remote−loading)手順を介して予め形成されたリポソームに定量的に充填され得る。他の因子が、当該分野で周知の方法を使用してリポソームに充填され得る。
(薬学的組成物)
FR−βインデューサーおよびフォレートでコーティングされた治療剤は、好ましくは、患者に投与されることが意図される薬学的組成物の一部分である。好ましくは、別個の薬学的組成物は、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤を含むが、単一の薬学的組成物は、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤の両方を含み得る。特定の薬学的組成物は、この組成物が患者に投与される方法に依存する。しかし、薬学的組成物は、通常、塩、緩衝剤、保存剤、他のビヒクルならびに必要に応じて、そこに含まれるFR−βインデューサーおよび/またはフォレート結合体化治療剤に加えてさらに他の治療剤を含む。
FR−βインデューサーおよびフォレートでコーティングされた治療剤は、好ましくは、患者に投与されることが意図される薬学的組成物の一部分である。好ましくは、別個の薬学的組成物は、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤を含むが、単一の薬学的組成物は、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤の両方を含み得る。特定の薬学的組成物は、この組成物が患者に投与される方法に依存する。しかし、薬学的組成物は、通常、塩、緩衝剤、保存剤、他のビヒクルならびに必要に応じて、そこに含まれるFR−βインデューサーおよび/またはフォレート結合体化治療剤に加えてさらに他の治療剤を含む。
非経口投与に適切な組成物が好ましく、好都合なことには、FR−βインデューサーおよび/またはフォレート結合体化治療剤の、滅菌した、発熱物質を含まない(pyurogen−free)、水性または油性の調製物(これは、好ましくはレシピエントの血液に等張である)を含む。この水性調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の方法に従って処方され得る。滅菌の注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈物または溶媒(例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液)中で、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リガー溶液および等張の塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌した、不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として簡便に使用される。このために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意のブレンドの不揮発性油が、使用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射可能物の調製において使用され得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適切なキャリア処方物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Paにおいて見出され得る。薬学的組成物は、単一投薬形態にて簡便に存在され得、そして薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。
さらに、薬学的組成物の非経口的に受容可能な溶液の調製(pH、等張性、安定性などに起因する)は、薬理学分野における当業者のレベルの範囲内である。注射のために好ましい薬学的組成物は、ベクターに加えて、以下のような等張なビヒクルを含み得る:Sodium Chloride Injection、Ringer’s Injection、Dextrose Injection、Dextrose and Sodium Chloride Injection、Lactated Ringer’s Injection、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、または当該分野で公知の他のビヒクル。本発明の方法において使用され得る薬学的組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加剤を含み得る。
(薬学的組成物の投与)
本発明は、1つ以上のFR−βインデューサーおよび1つ以上のフォレート結合体化治療剤の、好ましくは、1つ以上の薬学的組成物の一部分としての患者への投与を包含する。
本発明は、1つ以上のFR−βインデューサーおよび1つ以上のフォレート結合体化治療剤の、好ましくは、1つ以上の薬学的組成物の一部分としての患者への投与を包含する。
処置される患者は、概して、白血病を有する患者である。好ましくは、この処置は、AMLを有することが既知の患者になされる。一般的な白血病そして特にAMLの診断は、医学および腫瘍学の分野において公知であり、そして1人以上の臨床医によって一般に実施される。
概して、FR−βインデューサーは、フォレート結合体化治療剤が患者に投与される前の時点で患者に投与されるが、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤を、同時に患者に投与することも可能である。好ましくは、FR−βインデューサーが最初に投与され、その後、患者の白血球細胞におけるFR−βの発現が最大のときに、フォレート結合体化治療剤が投与される。
薬学的組成物は、一般的に、医学的に受容可能な任意の様式を使用して投与され得る。これは、臨床的に受容不可能な有害な効果を引き起こすことなく、FR−βレセプターおよび/または抗白血病活性における所望の増加を生じる任意の様式を意味する。薬学的組成物は、以下に記載する投与経路を使用して局所投与または全身投与され得る。このような投与様式としては、非経口経路(例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、粘膜または注入)が挙げられるが、経口経路、直腸経路、局所経路、鼻腔経路または皮内経路も挙げられ得る。他の送達系は、時間放出(time−release)、遅延放出(delayed release)または持続放出(sustained release)送達系を含み得る。このような系は、反復投与を回避し得、被験体および臨床医に対する便利性を増大させる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。薬学的組成物は、治療有効量または生物学的有効量で、1回または繰り返し投与される。
当業者は、注入による送達が、薬学的組成物を部位に送達する、シリンジ、カテーテルまたは類似のデバイスの使用を意図することを理解する。好ましくは、送達は、FR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤を、患者の循環系に通して全身に分布する。
フォレート結合体化法(folate−conjugated method)によって投与された薬物は、細胞傷害性薬物であり得るが、他の薬物もまた、この方法において投与され得る。このような薬物としては、診断画像化剤、プロドラッグ転換酵素、免疫調節因子、サイトカイン、増殖因子、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、および他の薬物が挙げられ得る。
患者に投与されたFR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤の量は、生物学的に有効な量として記載されている。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的に有効な量」は、重要な被験体または患者の利益(すなわち、FR−βインデューサーの場合、白血病細胞におけるFR−βの発現増加)を示すのに十分な薬学的処方物または方法の各活性成分の総量を意味する。
フォレート結合体化薬物の生物学的有効量は、治療される白血病の性質および重症度、ならびに患者が受ける前処置の性質に依存する。最初に、主治医は、低用量の組成物を投与し、患者の応答を観察する。最適な治療効果が患者に対して得られるまで、より多い用量の組成物が投与され得、そしてその時点において投薬量はさらに増加されない。治療有効量の1つ以上の本発明の治療組成物を、単一の処置エピソードとして、1人の患者に、同時にかまたは連続的に投与することが望ましくあり得る。最後に、主治医は、各々の患者を処置するために使用する治療組成物の量を決定する。
フォレート結合体化治療剤の生物学的有効量は、好ましくは、患者の体からの白血病細胞の除去を生じる。好ましくは、本発明の処置の結果として、患者は、寛解し始め、そして寛解のままであり、そして、長期の生存者にし、好ましくは、白血病または本発明の処置以外のいくつかの苦痛により死亡する。しかし、寛解および長期生存が本発明の処置の結果である必要はない。本発明の処置を伴わない寿命と比較して、本発明の処置を伴う患者の寿命における任意の増加が、所望の目的である。あるいは、本発明の処置の効果は、患者(すなわち、苦しむ患者、その患者の寿命が増加しない患者)の生活の質において、改善として測定され得る。
本発明の方法において使用される、薬学的組成物を用いた治療の持続期間は、薬学的組成物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果の特有の特徴、処置される疾患の重症度ならびに個々の患者の状態および潜在的な特有の応答に依存して、変化する。最後に、主治医は、本発明の方法において使用される薬学的組成物を用いた治療の適切な持続期間を決定する。
食事制限が必要とされるべきではないが、患者は、FR-標的化治療を用いる処置の持続期間より前、またはその間に、フォレートを含有するビタミン剤を飲まないように助言されるべきである。なぜなら、これらの錠剤を摂取することは、正常より高いレベルへの、血清フォレートの一時的な上昇を生じ得ると考えられ得るからである。フォレートは、非常に迅速な腎浄化を有する、低分子量ビタミンであるので、血清フォレートに対する任意の食事効果は、短期間である。
本発明は、以下の実施例を参照してより理解され得、この実施例は、説明のために利用されるが、本発明を限定しない。
(実施例1.フォレート結合体化リポソーム治療剤の調製および試験)
(フォレートでコーティングされたリポソームの調製)
フォレート(γ)−PEG−DSPEを以下のように合成した(図12):(i)フォレートの活性化NHSエステルを、ヒドラジン水和物と反応させることにより、フォレート−γ−ヒドラジドを合成した(Guo,HinkleおよびLee,1999,J.Nucl.Med.,40:1563−1569を参照のこと);(ii)フォレート−γ−ヒドラジンを、NHS−PEG3400−DSPEと反応させることにより、フォレート−PEG−DSPEを合成した(Sheerwater Polymers,Inc.);および(iii)最終生成物(フォレート−PEG−DSPE;図2)を、確立した溶媒システムを用いる逆相調製用HPLC上で精製した。
(フォレートでコーティングされたリポソームの調製)
フォレート(γ)−PEG−DSPEを以下のように合成した(図12):(i)フォレートの活性化NHSエステルを、ヒドラジン水和物と反応させることにより、フォレート−γ−ヒドラジドを合成した(Guo,HinkleおよびLee,1999,J.Nucl.Med.,40:1563−1569を参照のこと);(ii)フォレート−γ−ヒドラジンを、NHS−PEG3400−DSPEと反応させることにより、フォレート−PEG−DSPEを合成した(Sheerwater Polymers,Inc.);および(iii)最終生成物(フォレート−PEG−DSPE;図2)を、確立した溶媒システムを用いる逆相調製用HPLC上で精製した。
DOX(f−L−DOX)を含有する、フォレートでコーティングされたリポソームを、以下に記載されるように作製した。リポソーム調製を、60℃で、N2駆動高圧LipexTM押出機(図3もまた参照のこと)を用いる、ポリカーボネート膜(100nmの孔サイズを有する)押出により実施した。DSPE/Chol/mPEG−DSPE/フォレート−PEG−DSPE(60:36:4:0.1、モル/モル)の組成物を使用した。全ての液体成分をAvanti Polar Lipidsより購入した。DOXを、膜貫通型pH−勾配に駆動される遠隔充填により、1:10の薬物:脂質の割合(w/w)で、リポソーム中に充填した。リポソームDOXを、Sepharose CL−4Bカラム上のゲル濾過により精製し、そして0.2μmのセルロースアセテートシリンジフィルターを介する濾過により滅菌した。充填効率を、産物の薬物:脂質の割合を出発物質の薬物:脂質の割合と比較することにより決定し、そして95%より多いあることを見出した。リポソーム調製物中のDOX濃度を、メタノール中でL−DOXを溶解し、そしてDOXの公知の吸光係数に基づいて、480nmでの吸光度を測定することにより決定した。脂質濃度を、アンモニウムチオシアン酸鉄(III)比色分析、または微量の[3H]コレステロールヘキサデシルエーテル(Amersham)で標識したリポソームについての脂質シンチレーションカウントにより決定した。リポソームサイズ分布を、Nicomp 370レーザーサブミクロン粒子サイズ測定器による相関分光学を用いて決定し、そして約100nmの平均直径を示した。PBS中または50%ヒト血清中に保存されているリポソームドキソルビシンの安定性を、ゲル濾過によりリポソームを再精製し、薬物:脂質の割合を決定することで決定した。この割合における有意な減少は、リポソームからのDOX放出を示す。漏出量は、1%未満であった。
(FR−β発現細胞による、フォレートでコーティングされたリポソームの取り込み)
組成物DSPC/Chol/フォレート−PEG−DSPE(60:40:0.1、m/m)および封入カルセインを有するフォレートでコーティングされたリポソーム、膜不透性蛍光色素(f−L−カルセイン)を、上記の手順を改変して調製した。フォレート−PEG−DSPEを引いた、非標的化カルセイン含有リポソーム(L−カルセイン)(本質的に同じ組成物を有する)をコントロールとして使用した。FR(+)細胞株(ヒトKG−1、CHO−FR−β、およびマウスL1210JF)ならびにFR(−)細胞株(KG−1a、CHO−K1およびL1210)を使用した。細胞上でのFR−β発現を、レセプター特異的抗体を用いる、フローサイトメトリーにより決定した。リポソーム結合研究のために、培地中、細胞をf−L−カルセイン(カルセインを含むフォレート結合体化リポソーム)または20μMの遊離L−カルセインにより3連で処理した。次いで、細胞を冷PBSで3回洗浄し、そして蛍光顕微鏡により調べた(図3)。データは、全体的な細胞蛍光が、遊離L−カルセインで処理した細胞と比較して、f−L−カルセインにより処理された細胞において、非常に強いことを示した。これらのデータは、f−L−カルセインが細胞により内在化されたことを示した。
組成物DSPC/Chol/フォレート−PEG−DSPE(60:40:0.1、m/m)および封入カルセインを有するフォレートでコーティングされたリポソーム、膜不透性蛍光色素(f−L−カルセイン)を、上記の手順を改変して調製した。フォレート−PEG−DSPEを引いた、非標的化カルセイン含有リポソーム(L−カルセイン)(本質的に同じ組成物を有する)をコントロールとして使用した。FR(+)細胞株(ヒトKG−1、CHO−FR−β、およびマウスL1210JF)ならびにFR(−)細胞株(KG−1a、CHO−K1およびL1210)を使用した。細胞上でのFR−β発現を、レセプター特異的抗体を用いる、フローサイトメトリーにより決定した。リポソーム結合研究のために、培地中、細胞をf−L−カルセイン(カルセインを含むフォレート結合体化リポソーム)または20μMの遊離L−カルセインにより3連で処理した。次いで、細胞を冷PBSで3回洗浄し、そして蛍光顕微鏡により調べた(図3)。データは、全体的な細胞蛍光が、遊離L−カルセインで処理した細胞と比較して、f−L−カルセインにより処理された細胞において、非常に強いことを示した。これらのデータは、f−L−カルセインが細胞により内在化されたことを示した。
(形質膜上の増強されたレベルのFR−βを有する、培養細胞への、フォレートでコーティングされたリポソーム中に含有される化合物の標的化)
FR−βを有するか、または有さない細胞による、ATRAの非存在下または存在下で、フォレートでコーティングされたリポソームの取り込みを研究した。カルセイン(リポソーム中に含有される)の取り込みを、フローサイトメトリーを用いて測定した。図6に示されるように、KG−1細胞の、ATRAを用いた処理は、FR−β発現(パネルAおよびB)における有意な増加を生じる。ATRA処理はまた、標的化されたカルセイン取り込みにおける有意な増加を生じる(パネルC)。FR(+)(KG−1細胞、L1210JF細胞およびCHO−FR−β細胞)、FR(−)(KG−1a細胞、L1210細胞およびCHO−K1コントロール)におけるカルセイン含有リポソームの細胞の取り込みに関するデータは、以下の表2に要約される。表2のデータは、細胞集団の相対的な蛍光指標(蛍光強度)を示す。
FR−βを有するか、または有さない細胞による、ATRAの非存在下または存在下で、フォレートでコーティングされたリポソームの取り込みを研究した。カルセイン(リポソーム中に含有される)の取り込みを、フローサイトメトリーを用いて測定した。図6に示されるように、KG−1細胞の、ATRAを用いた処理は、FR−β発現(パネルAおよびB)における有意な増加を生じる。ATRA処理はまた、標的化されたカルセイン取り込みにおける有意な増加を生じる(パネルC)。FR(+)(KG−1細胞、L1210JF細胞およびCHO−FR−β細胞)、FR(−)(KG−1a細胞、L1210細胞およびCHO−K1コントロール)におけるカルセイン含有リポソームの細胞の取り込みに関するデータは、以下の表2に要約される。表2のデータは、細胞集団の相対的な蛍光指標(蛍光強度)を示す。
FR−β(+)細胞中のFR媒介薬物送達に対する、生理学的フォレートのの潜在的な効果を研究するために、f−L−カルセイン取り込みを、KG−1細胞において、0〜10μM 6S−5−メチルテトラヒドロフォレート(6S−5MeTHF)の存在下、上記と同じフローサイトメトリー法を用いて、測定した。表3に示されるように、10μM(200倍より多い平均ヒト生理学的血清フォレートレベル)においてでさえも、6S−5MeTHFは、f−L−カルセイン取り込みを有意に阻害しなかった。
(培養白血病細胞に対するf−L−DOXの細胞毒性)
FR−標的化リポソームドキソルビシン(f−L−DOX)を、インビトロ細胞毒性に関して、FR(+)およびFR(−)の白血病細胞の両方において、標準細胞生存アッセイ(MTTアッセイ)を用いて評価した。FR−標的化リポソームドキソルビシン(f−L−DOX)を、上記のように調製した。f−L−Doxインビトロ細胞毒性を、2つのFR(+)細胞株(KG−1(FR−β(+)ヒトAML細胞株)およびL1210JF(L1210ネズミ急性リンパ性白血病細胞株のFR(+)亜系統))ならびにFR(−)細胞株(KG−1a(KG−1のFR−β(−)亜系統)およびFR(−)L1210細胞)において、生存アッセイを用いて、評価した。細胞を希釈のf−L−DOX、非標的化コントロールL−DOX、または遊離DOXにより4連で処理した。細胞生存度を決定し、そしてIC50値を計算した。KG−1およびKG−1a細胞に関し、MTTアッセイを、1μM ATRAを含む培地中で5日間培養した細胞を用いて反復した。
FR−標的化リポソームドキソルビシン(f−L−DOX)を、インビトロ細胞毒性に関して、FR(+)およびFR(−)の白血病細胞の両方において、標準細胞生存アッセイ(MTTアッセイ)を用いて評価した。FR−標的化リポソームドキソルビシン(f−L−DOX)を、上記のように調製した。f−L−Doxインビトロ細胞毒性を、2つのFR(+)細胞株(KG−1(FR−β(+)ヒトAML細胞株)およびL1210JF(L1210ネズミ急性リンパ性白血病細胞株のFR(+)亜系統))ならびにFR(−)細胞株(KG−1a(KG−1のFR−β(−)亜系統)およびFR(−)L1210細胞)において、生存アッセイを用いて、評価した。細胞を希釈のf−L−DOX、非標的化コントロールL−DOX、または遊離DOXにより4連で処理した。細胞生存度を決定し、そしてIC50値を計算した。KG−1およびKG−1a細胞に関し、MTTアッセイを、1μM ATRAを含む培地中で5日間培養した細胞を用いて反復した。
IC50値(表4)は、f−L−Doxが、ATRA非存在下で、FR−β(+)KG−1細胞に対するL−DOXより25倍の細胞毒性、およびATRA前処理をした場合、63倍の細胞毒性であったことを示す。対照的に、細胞毒性に対する、非治療的長所またはATRA誘導効果を、KG−1a細胞株(FR−β(−)である)において、f−L−DOXを用いてを観察した。L−DOXを越える、f−L−DOXの優れた細胞毒性はまた、FR(+)L1210JF細胞株で観察されたが、FR(−)L1210細胞株では観察されなかった。表4のデータは、遊離フォレート(1mM)が、KG−1細胞(ATRA処置および非処置)、およびL1210JF細胞中のf−L−DOXのIC50を、約1オーダー分増加させることをさらに示した。
フォレート結合体の特性を評価するために、放射標識されたフォレート結合体(ヒドラジノニコチンアミド−フォレート(HYNIC−フォレート))を合成し、そして、共リガンドとしてトリシンおよびトリフェニルホスフィリン(TPPS)を用いて、γ線放射放射性核種99mTcで標識した(図7)。
1つの研究において、この[99mTc]HYNIC−フォレートを、培養細胞の培地に添加した。次いで、この細胞を洗浄し、非結合[99mTc]HYNIC−フォレートを除去し、次いで、γ−カウンター中でカウントした。その結果(図7)は、放射性結合体が、培養FR−β(+)KB口内癌細胞およびFR−βトランスフェクトマウス肉腫24JK−FBP細胞(NCIにて、Patrick Hwu博士からの贈り物として得た)におけるFR−β媒介取り込みに関する高い特異性を示すことを示した(図7)。両方の細胞株における放射性リガンドの結合は、飽和性であり、そして1mM遊離フォレートによって完全に阻害された(図7)。
次いで、生体内分布研究を、移植された同系の24JK−FBP皮下腫瘍を保有するマウスにおいて行った。フォレート欠乏げっ歯類食餌の状態の、7〜8週齢の雌のC57BL/6マウスを、皮下に、2つの離れた部位で(右肩および左尻)、約2×106の24JK−FBP細胞を、研究の2週間前に接種した。研究の間、マウスに、100μLの99mTc HYNIC−フォレートを、外側の尾静脈を介して注射し、そして注射後4時間または24時間のいずれかで屠殺した。4時間の時点での動物のガンマカメラ画像(図8)を、屠殺する直前に取った。組織サンプルを回収し、重さを計り、そして自動ウェル型γ−カウンターにおいて計数した。55:1および81:1の腫瘍組織:バックグラウンド組織の割合を、放射活性シグナルに関し、それぞれ、4時間および24時間の時点で得た。
有意な放射性トレーサ取り込みを示した、唯一の正常組織は、腎臓であった(図8)。腎臓および腫瘍における放射性トレーサ取り込みは、それぞれ、組織1gあたりの61%および17%の注入用量(%ID/g)であった。放射性結合体での腫瘍の取り込みは、100μgの遊離フォレートの共注入により90%ブロックされた。腎臓において見出された高レベルの放射活性は、尖端近位管におけるFRの存在に起因する。というのは、腎臓での取り込みはまた、遊離フォレート共注入によりブロックされたからである。腎臓中の約50%の放射活性および24時間の時点で残った腫瘍中の30%は、フォレート結合体の有意な画分が、腫瘍および腎細胞によって内部移行されたことを示す。
体内分布研究の結果は、フォレート放射結合体が、正常組織(腎臓を除いて)には取り込まれないことを示す。別の研究において、125I−BSA−フォレート放射結合体は、非結合体BSAと比較して、増加した腎臓取り込みを示さなかった。さらに、フォレート結合体リポソームの生体分布研究は、腎臓による取り込みを示さなかった。
統合すると、これらの結果は、低分子量フォレート結合体が糸球体膜を容易に通り抜け、そして腎臓内に、FR−β−媒介吸収を介して、高いレベルで蓄積することを示す。しかし、高分子量の薬物または薬物キャリア(例えば、フォレート結合体化リポソーム)は、それらのサイズに起因して、糸球体膜濾過の対象ではなく、従って、腎臓内に蓄積しない。
(実施例3.放射標識された、フォレートでコーティングされたリポソームの実験動物における、培養細胞へのFR結合および腫瘍局在化特性)
新しいフォレート誘導体(フォレート−PEG−Chol)(図9A)を、フォレート−PEG(MW約3,350)−アミンを、コレステロールクロロ蟻酸と反応させることにより合成した。次いで、フォレート誘導体をリポソーム中に取り込んだ。フォレートでコーティングされたリポソームおよび非標的化コントロールリポソームのための脂質組成は、それぞれDSPC/Chol/mPEG2000−DSPE/フォレート−PEG−Chol(60/34/5/1、m/m)およびDSPC/Chol/mPEG2000−DSPE(60/34/6、m/m)であった。さらに1モル%のDTPA−DSPEを、処方物に添加し、リポソームを111Inで放射線標識することを可能にした。リポソームを、100nmの孔サイズポリカーボネート膜を有するAvestin携帯押出機を用いる高圧押出により調製した。リポソーム平均直径を、Nicomp 370サブミクロン粒子サイズ分析器での光子相関分光法により測定し、そして104nmであることを見出した。リポソームを、クエン酸緩衝液中で111InClと共にインキュベートすることにより放射標識し、そしてSepharose CL−4Bカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
新しいフォレート誘導体(フォレート−PEG−Chol)(図9A)を、フォレート−PEG(MW約3,350)−アミンを、コレステロールクロロ蟻酸と反応させることにより合成した。次いで、フォレート誘導体をリポソーム中に取り込んだ。フォレートでコーティングされたリポソームおよび非標的化コントロールリポソームのための脂質組成は、それぞれDSPC/Chol/mPEG2000−DSPE/フォレート−PEG−Chol(60/34/5/1、m/m)およびDSPC/Chol/mPEG2000−DSPE(60/34/6、m/m)であった。さらに1モル%のDTPA−DSPEを、処方物に添加し、リポソームを111Inで放射線標識することを可能にした。リポソームを、100nmの孔サイズポリカーボネート膜を有するAvestin携帯押出機を用いる高圧押出により調製した。リポソーム平均直径を、Nicomp 370サブミクロン粒子サイズ分析器での光子相関分光法により測定し、そして104nmであることを見出した。リポソームを、クエン酸緩衝液中で111InClと共にインキュベートすることにより放射標識し、そしてSepharose CL−4Bカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
リポソームを細胞に添加した。KB細胞におけるフォレート−PEG−Cholを含むリポソームの取り込みは、フォレート−PEG−DSPEを含むリポソームの取り込みと匹敵され、そして、非標的化コントロールリポソームの取り込みより約20倍高かった(図9B)。FR−標的化リポソームの細胞取り込みを、遊離フォレートにより競合的にブロックされた。FR−標的化リポソームに関する、見かけのKd(競合結合アッセイ(図9C)に基づき、そして式Ki=IC50/(1+[リポソーム]/Kd−app)を用いる)を計算し、1.5×10−15Mとした。FR(+)細胞に対するフォレートでコーティングされたリポソームの親和性は、葉酸単独の親和性より105倍高かった。
体内分布研究を、FR(+)24JK−FBP細胞の皮下移植により生成されるC57BL/6マウス腫瘍モデルにおいて実施した。これは、実施例2において上記される。動物に、リン脂質の50μgおよび約25μCiを含む放射活性の111In標識化リポソームを、1mgの遊離葉酸の腹腔内注入とともにか、またはともなわずに、静脈内注入した。動物を、24時間で屠殺し、そして組織サンプルを放射活性に関して分析した。フォレート誘導化リポソームの腫瘍:周囲の正常組織取り込みは、高かった(腫瘍:筋肉の割合 60:1)けれども、全体的な腫瘍局在化における有意な差異は、フォレート結合体化リポソームと非標的化コントロールリポソームとの間で観察されなかった(それぞれ、6.5%ID/g:7.1%ID/g)。この結果は、両方の場合において、腫瘍によるリポソームの取り込みが、腫瘍内皮の増強された透過性およびリンパ性排液の不足に起因する増加された薬物保持に対し、EPRと称される効果によって、おそらく最初に決定されることを示唆した。これは、腫瘍中のリポソームの非特異的な蓄積を記載する(Yuan,Leunig,Huang,Berk,Papahadjopoulos,およびJain,1994,Cancer Res.54:3352−3356,ならびにHobbs,Monsky,Yuan,Roberts,Griffith,TorchilinおよびJain,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4607−4612)。このEPR効果は、固形腫瘍において観察されるが、白血病(本発明で処置される疾患)において発生しにくい。
(実施例4.マウス白血病モデルにおけるf−L−DOX、L−DOXおよび遊離DOXの治療効果)
f−L−DOXの抗白血病治療効果を、2つのFR(+)マウス白血病腹水腫瘍モデルにおいて評価した。腹水腫瘍を有するDBA/2Jマウスからなる第1のモデルは、腹腔内移植されたFR(+)マウスリンパ性白血病L1210JF細胞に由来した。雄性マウス(18〜22g、Charles River,Wilmington,MAより入手)を、フォレート欠乏食事状態(Dyets,Inc.,PAより入手したAIN−93G)におき、白血病細胞接種前の少なくとも1週間続けた。マウス(8匹の群)に、1×106個のL1210JF細胞を、0日目に、腹腔内注入した。次いで、動物は、1日目、5日目および9日目に、種々の薬物処方物の腹腔内注入(50μL)を3回与えた。処置群は以下である:1)生理食塩水(0.9% NaCl、USP)、2)遊離DOX(3mg/kg)、3)L−DOX(5mg/kg DOX)、および4)f−L−DOX(5mg/kg DOX)。この動物の体重および生存を、毎日モニタリングした。生理食塩水処理群において、目に見える腹水流体は、1週間後まで発達し始めなかった。これらの結果を図10に示す。
f−L−DOXの抗白血病治療効果を、2つのFR(+)マウス白血病腹水腫瘍モデルにおいて評価した。腹水腫瘍を有するDBA/2Jマウスからなる第1のモデルは、腹腔内移植されたFR(+)マウスリンパ性白血病L1210JF細胞に由来した。雄性マウス(18〜22g、Charles River,Wilmington,MAより入手)を、フォレート欠乏食事状態(Dyets,Inc.,PAより入手したAIN−93G)におき、白血病細胞接種前の少なくとも1週間続けた。マウス(8匹の群)に、1×106個のL1210JF細胞を、0日目に、腹腔内注入した。次いで、動物は、1日目、5日目および9日目に、種々の薬物処方物の腹腔内注入(50μL)を3回与えた。処置群は以下である:1)生理食塩水(0.9% NaCl、USP)、2)遊離DOX(3mg/kg)、3)L−DOX(5mg/kg DOX)、および4)f−L−DOX(5mg/kg DOX)。この動物の体重および生存を、毎日モニタリングした。生理食塩水処理群において、目に見える腹水流体は、1週間後まで発達し始めなかった。これらの結果を図10に示す。
マウスの4つの群についての中央生存時間は、それぞれ、25.5日、28.5日、35日および>80日であった(図10)。このデータは、おそらく、遊離DOXと比較したL−DOXの有利な薬物動態学的特性に起因して、L−DOXが、FR(+)L1210JF細胞の処理において、そして延長中央生存時間(ログ順位検定からのp値=0.0159)において、遊離DOXより効果的であったことを示した。一方で、f−L−DOXは、増加した中央生存において、L−DOXよりなお効果的であり(ログ順位検定からのp値=0.0259)、そして、FR媒介腫瘍細胞処理に起因して、長期間生存率を75%に増加させた。
ヒト白血病マウス腹水異種移植モデルにおけるf−L−DOXの治療効果を、さらに試験した。雌性CB.17SCID(scid/scid,18〜22g)マウスに、ヒトAML KG−1細胞(これは、FR−βを発現する)を腹腔内接種し、腹水腫瘍を発生させた。20%FBSを補充したフォレート欠損RPMI1640培地中で増殖したKG−1細胞(1×106)を、マウスに、0日目に腹腔内注入した。処置なしの場合、目に見える腹水流体(ascitic fluid)が、約30日で発生した。腹膜滲出細胞を、5mL ハンクス平衡塩溶液(HBSS)を用いる腹膜洗浄により回収し、ペレットにし、そしてRPMI1640培地中に再懸濁した。これらの細胞は、インビトロに維持されたKG−1細胞の形態に類似した形態(大きなサイズ、核/細胞質の高い割合、目に見える核小体を有する微細なクロマチン構造、塩基好性細胞質)を示した。マウスの検死は、拡大した脾臓およびを末梢血液および骨髄に明らかな浸潤を有さない腹膜中に散在した腫瘍節を示した。腫瘍細胞を、8匹のマウスの8つの群に接種した。その群のうち4群に、1日目から5日目に、10mg/kgのATRAの腹腔内注入を毎日与えた。以下の処方物を、第1日目、第5日目および第9日目の腹腔内注入(50μL)として投与した:1)生理食塩水、2)遊離DOX(3mg/kg)、3)L−DOX(5mg/kg)、4)f−L−DOX(5mg/kg)、5)生理食塩水+ATRA、6)遊離DOX+ATRA、7)L−DOX+ATRA、および8)f−L−DOX+ATRA。動物の体重および生存を、研究の経過の間、毎日モニタリングした。
このデータは、L−DOXが、延長した中央生存において、遊離DOXより効果的であることを示した(ログ順位検定からのp値<0.0001)が、長期間は生存できなかった(図11)。f−L−DOXは、L−DOXより効果的であることが見出され(ログ順位検定からのp値=0.0061)、これは、改善された治療効果および12.5%の長期間生存を生じた。ATRAの同時処理はさらに、f−L−DOX処置動物の長期間生存率を、12.5%〜60%に改善した(ログ順位検定からのp値=0.0190)。ATRA同時処置を用いた治療効果におけるはっきりした改善は、インビボのKG−1細胞におけるFR−β発現のアップレギュレーションにおそらく起因する。それは、ATRAが、KG−1細胞の顕著な分化または増殖阻害を誘導せず、そしてf−L−DOXまたはL−DOXコントロールの非存在下でのATRA処理が、生存を高めなかったからである(図11)。遊離DOXは、>3mg/kgの用量制限毒性を示した(データ示さず)。これらの結果は、FR−βの効果を増強するこの方法の有効性が、ATRAを用いるレセプターアップレギュレーションを介して、治療を標的化することを示す。
Claims (14)
- 患者において白血病を処置するための方法であって、該方法は:
(a)少なくとも1つのFR−βインデューサーを患者に投与し、該患者の白血病細胞のFR−βのレベルを増加する工程;および
(b)生物学的に有効な量のフォレート結合体化治療剤を患者に投与する工程
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記白血病は、急性骨髄性白血病(AML)または慢性骨髄性白血病(CML)である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記FR−βインデューサーおよび該フォレート結合体化治療剤が、静脈内または筋肉内に投与される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記FR−βインデューサーが、レチノイン酸アゴニストであるか、またはレチノイン酸アゴニストおよびヒストンデアセチラーゼインヒビターである、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記レチノイン酸アゴニストは、オールトランスレチノイン酸(ATRA)である、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、トリコスタチン(Trichostatin)A(TSA)である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記フォレート結合体化治療剤は、1つ以上の治療物質と結合したフォレートを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記フォレート結合体化治療剤が、粒子またはリポソームを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記フォレート結合体化治療剤が、フォレートでコーティングされたリポソームおよび1つ以上の治療物質を含む、方法。
- 請求項10に記載の方法であって、前記治療物質1つが、ドキソルビシン(DOX)である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記FR−βインデューサーが、前記フォレート結合体化治療剤が前記患者に投与されると同時にか、またはその前に、該患者に投与される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、該方法は、白血病を治療するための前記方法を、化学療法、外科手術、放射線治療、光線力学治療、遺伝子治療、アンチセンス治療、酵素プロドラッグ治療、免疫治療、融合毒素治療、抗血管形成治療、またはそれらの組み合わせと併用する工程をさらに包含する、方法。
- FR−βインデューサーまたはフォレート結合体化治療剤あるいはFR−βインデューサーおよびフォレート結合体化治療剤の両方を含む、薬学的組成物。
- 患者において、白血病の処置に使用するためのキットであって、該キットは、1つ以上のFR−βインデューサーおよび1つ以上のフォレート結合体化治療剤を含む、キット。
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