CN109021077A

CN109021077A - 一种与耐atra急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN109021077A
Application number: CN201810734934.6A
Authority: CN
Inventors: 缪凤琴; 张建琼; 张莹; 张亚芬; 叶梦滢
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明公开了一种与耐ATRA急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用。一种与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，命名为pepNo.5R5，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明筛选得到了一种与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，填补了目前缺乏与ATRA耐药性AML细胞结合的多肽的空白。本发明筛选得到多肽为可通过人工方法合成的小分子多肽，分子量小、活性高、穿透力强、亲和力高、特异性高、毒性低，适合作为靶向治疗的载体；本发明筛选得到的多肽具有良好的肿瘤靶向性，为该多肽的临床前深入研究奠定了坚实的基础。

Description

一种与耐ATRA急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种与耐ATRA急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成年人最常见的血液系统的恶性肿瘤。化疗是目前最重要的治疗手段，也是造血干细胞移植的基础。但大多数患者最终仍因治疗失败而死亡。即使对于治疗最为成功的急性早幼粒细胞白血病(APL)，采用ATRA联合蒽环类药物或三氧化二砷(ATO)的优化治疗方案能够达到90％的初始完全缓解，但仍有20～30％的患者对全反式维甲酸(ATRA)产生耐药反应，三年总体生存率仅为50％左右。导致治疗失败的原因是多方面的，其中多药耐药是最重要的原因之一。目前研究认为，白血病细胞多药耐药的产生涉及诸多机制，包括以ABC转运蛋白为代表的膜分子介导的药物摄取减少和外排增多；药物在细胞内分布的改变等。大量研究发现，虽然肿瘤耐药的机制十分复杂，并且到目前为止仍不断有新的机制被发现，但很多机制殊途同归，最终导致胞内有效药物浓度低于治疗浓度阈值，无法达到治疗效果。并且已有研究表明，如果肿瘤细胞内部的抗肿瘤药物能够达到较高浓度，仍然能够有效地逆转大部分的肿瘤耐药。而耐药细胞特异性靶向多肽可以实现药物的靶向输送，进而有效提高肿瘤部位药物浓度。

全反式维甲酸(ATRA)联合以蒽环类药物为主的化疗是临床上急性早幼粒细胞白血病(AML)诱导缓解的首选疗法。然而ATRA耐药性的产生常常导致AML化疗失败，严重影响了ATRA的治疗效果。

噬菌体展示随机肽库筛选技术是筛选细胞特异性结合多肽的一种有效方法。通过将文库与靶细胞进行几轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选富集过程，即可将展示有与靶细胞特异性结合多肽的噬菌体克隆从文库中筛选出来，但是传统的噬菌体展示随机肽库筛选技术存在技术层面的缺陷，其中尤为突出的是，洗涤效率低下导致无法彻底清除非特异性结合噬菌体，而且会使得筛选结果的重复性差。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种与耐ATRA急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽，该多肽是一种能与ATRA耐药性AML细胞特异性结合，而且具有良好的肿瘤靶向性的多肽。

本发明的另一个目的在于提供上述与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述多肽在制备用于多药耐药AML的靶向治疗药物的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，命名为pepNo.5R5，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，命名为pepNo.5R5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的产生与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽得细胞株，所述细胞株的为保藏编号为CCTCC NO.C2018139，命名为HL-60R，即人原髓细胞白血病耐药细胞HL-60R。

本发明所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)以ATRA对HL-60进行体外诱导筛选，成功获得了具有稳定耐药性状的细胞株HL-60R；

(2)以构建的HL-60R细胞作为正筛细胞、亲代HL-60细胞作为负筛细胞，进行了全细胞消减筛选和多轮全细胞消减筛选，筛选出与HL-60R细胞特异性结合的噬菌体克隆；

(3)挑选噬菌体克隆进行测序，选择展示有高频率一致性外源插入序列的噬菌体克隆，鉴定挑选出的噬菌体克隆与ATRA耐药性AML细胞的结合水平，其中一种噬菌体克隆的氨基酸序列为权利要求1所述的多肽pepNo.5R5；

(4)将上述pepNo.5R5多肽通过人工方式合成。

其中，步骤(1)所述ATRA对HL-60进行体外诱导筛选为采用浓度递增间歇诱导法。

其中，步骤(2)所述进行了全细胞消减筛选和多轮全细胞消减筛选为采用基于微流控的噬菌体筛选方法。

其中，步骤(3)所述鉴定挑选出的噬菌体克隆与ATRA耐药性AML细胞的结合水平为通过滴度测定法、免疫荧光法和流式细胞术。

本发明所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽在靶向多药耐药AML的药物制备中的应用。

本发明所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的在多药耐药AML诊断试剂盒制备中的应用。

本发明先采用浓度递增间歇诱导法，以ATRA对AML细胞(HL-60)进行体外诱导筛选，成功获得了具有稳定耐药性状的细胞株HL-60R。然后利用噬菌体展示技术，以构建的HL-60R细胞作为正筛细胞、亲代HL-60细胞作为负筛细胞，采用基于微流控的噬菌体筛选方法进行了全细胞消减筛选，进行多轮全细胞消减筛选，初步筛选出与HL-60R细胞特异性结合的噬菌体克隆。噬菌体单克隆化后随机挑出若干个噬菌体克隆，测序后选择出现频率较高的噬菌体克隆，将其中占有绝对优势的噬菌体克隆的氨基酸序列命名为pepNo.5R5，通过滴度测定法、免疫荧光法、流式细胞术鉴定pepNo.5R5与ATRA耐药性AML细胞的结合水平；其中一种噬菌体克隆的氨基酸序列为pepNo.5R5。

本发明将获得的噬菌体克隆展示外源多肽序列，合成了荧光基团5-TAMRA标记的相应多肽，并通过细胞免疫荧光结合实验、竞争抑制试验、流式细胞术等实验进一步证实了pepNo.5R5与HL-60R细胞的结合特异性。

本发明还进一步证实了所述多肽与HL-60R细胞结合呈现浓度及温度(能量)依赖性。

本发明提出一种新型基于微流控原理的噬菌体展示肽库筛选系统。整个筛选过程(包括封闭、孵育)是在一个封闭、高度自动化的装置中完成，省时、省力，不仅使得筛选结果的重复性好，同时也大大降低了野生型噬菌体的污染几率。为我们筛选急性早幼粒白血病细胞多药耐药株的靶向结合肽提供了一个高效的技术平台。

本发明采用一种新型基于微流控原理的噬菌体筛选体系对ATRA耐药性AML细胞进行筛选，以获得与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，为ATRA耐药性AML细胞的靶向治疗提供特异性药物运输载体，这将为ATRA耐药性AML的治疗奠定实验基础。

本发明的微流控是指以微米级(10-100μm)的通道对液体进行处理或控制的系统，将该技术与噬菌体筛选技术相结合，构建出的基于微流控的噬菌体筛选体系能够克服传统噬菌体筛选方法的缺陷，在血液系统肿瘤细胞靶向分子的筛选中具有独特优势：①整个筛选过程均在微流动通道内得液相流动过程中完成，能够模拟体内血液流动的生理现象，更接近体内筛选模式，但不存在体内筛选时血管等造成的干扰作用；②孵育时细胞与噬菌体的结合更充分，使得最终获取高亲和力结合克隆的几率大大提高；③洗涤液与细胞的接触更充分，且可通过控制洗涤液的流速使洗涤过程更加彻底，充分去除非特异性结合的噬菌体。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明筛选得到了一种与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，填补了目前缺乏与ATRA耐药性AML细胞结合的多肽的空白。

2、本发明筛选得到多肽为可通过人工方法合成的小分子多肽，分子量小、活性高、穿透力强、亲和力高、特异性高、毒性低，适合作为靶向治疗的载体；

3、本发明筛选得到的多肽具有良好的肿瘤靶向性，为该多肽的临床前深入研究奠定了坚实的基础。

4、本发明筛选得到的多肽可有效递呈AML治疗药物至靶细胞，在降低毒副作用的同时，大大地增强了治疗效果。

附图说明

图1为HL-60R细胞的耐药谱示意图；

图2为每轮筛选之后的噬菌体次级库与HL-60及HL-60R的结合情况示意图；

图3为滴度测定法检测噬菌体单克隆(pepNo.5R5)与耐药细胞的结合特异性示意图；

图4为免疫荧光法检测噬菌体单克隆(pepNo.5R5)与耐药细胞的结合特异性(放大倍数400×)示意图；

图5为流式细胞术检测噬菌体单克隆(pepNo.5R5)与耐药细胞的结合特异性示意图；

图6为pepNo.5R5-5-TAMRA与不同细胞系的结合(放大倍数400×)示意图；

图7为流式细胞术检测pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R的特异性结合示意图；

图8为pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R细胞特异性结合的浓度依赖性示意图；

图9为不同浓度pepNo.5R5、GK裸肽对pepNo.5R5-5-TAMRA的竞争抑制作用(放大倍数400×)示意图；

图10为pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R细胞特异性结合的温度(能量)依赖性(放大倍数400×)示意图。

具体实施方式、

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：

主要实验材料：

1、细胞株：人原髓细胞白血病细胞系HL-60、人类T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat、人类慢性髓原白血病细胞K562、人单核细胞白血病细胞THP-1、人类胚肾细胞293-T均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2、噬菌体展示12肽库Ph.D.-12及宿主菌ER2738：购自New England Biolabs；

主要试剂及配方：

主要试剂：

细胞培养试剂：胎牛血清(GIBCO)、DMEM培养基(GIBCO)、DMSO(Sigma)；

2、噬菌体展示肽库筛选主要试剂：X-gal、DMF、NaN3、Tween-20、BSA、甘氨酸、四环素均购自Amresco；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID；

3、特异性鉴定主要试剂：HRP标记鼠抗M13抗体(GE Healthcare)、Alexa Fluor555标记羊抗鼠抗体(Invitrogen)。

主要试剂配方：

1、LB培养基：每升含10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；

2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；

3、顶层琼脂：每升含10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl,1gMgCl2·6H2O,7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；

4、四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；

5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；

封阻缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6),5mg/ml BSA,0.02％NaN3，过滤除菌，4℃贮存；

7、TBS:50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl，高压灭菌，室温贮存；

8、PBS：每升含NaCl:8.00g，KCl:0.20g，Na2HPO4·12H2O:3.58g、KH2PO4:0.24g，PH＝7.2，高压灭菌，室温存储；

9、PEG/NaCl:20％(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；

10、碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI。室温避光贮存；

11、IPTG/X-gal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ–D-thiogalactoside)和1g X-gal溶于25ml二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存；

实施例1

急性髓系白血病细胞全反式维甲酸(ATRA)耐药株的构建及鉴定

本实施例通过下述方法和步骤构建及鉴定急性早幼粒白血病细胞全反式维甲酸耐药株

一、浓度递增间歇诱导法诱导ATRA耐药细胞株

1、取对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为1×10⁴个/mL。

2、向1640培养液中加入ATRA使其终浓度为10^-9mol/L，培养48h后弃去含ATRA培养液，以RPMI-1640培养液培养细胞2～3代。

3、以含ATRA的1640培养液培养细胞48h，其中ATRA浓度提高1倍，即2×10^-9mol/L。

4、如此反复换液、传代，逐步提高ATRA浓度，最终诱导出在含10-6mol/L ATRA培养液中仍能保持增殖和分化状态的细胞系，命名为HL-60R。

该细胞株为人原髓细胞白血病耐药细胞(ATRA-resistant acute promyelocyticleukemia cell)HL-60R，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2018年6月20日，保藏编号为CCTCC NO.C2018139。

二、HL-60R细胞对ATRA耐药性的鉴定

1、取对数生长期HL-60、HL-60R细胞，浓度为5×10⁴个/mL。

2、取96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬液，用药组中加入倍比稀释成5种浓度的ATRA，对照组中加等量1640培养液，并同时设立只加培养液的空白对照组，置于细胞培养箱内培养48h。

3、每孔加入10μL CCK8溶液，于细胞培养箱内继续培养4h，酶标仪读取450nm波长时的吸光度值(A值)。

4、计算各浓度ATRA对细胞的抑制率(inhibition rate，IR)，公式如下：

IR(％)＝(A对照组-A用药组)/(A对照组-A空白组)×100％

5、参照药敏试验评价标准，若IR﹥50％，认为细胞对该药敏感；若IR为30％～50％，认为细胞对药物部分耐受；若IR﹤30％，认为细胞对该药耐受。

6、根据IR，以SPSS软件计算ATRA对细胞的半数抑制浓度(half inhibitoryconcentration，IC50)；并计算细胞的耐药指数(resistant index，RI)，公式如下：

RI＝IC50(耐药细胞)/IC50(亲代细胞)

本发明历时4.5个月，成功建立了在10^-6mol/L ATRA作用下生长良好的耐药细胞株，命名为HL-60R，并测得HL-60R细胞对ATRA的耐药指数分别为7.36(表1)，说明HL-60R为中度耐药；且HL-60R经冻存复苏后仍能稳定生长增殖、说明其耐药性稳定。

表1HL-60R细胞的ATRA耐药性鉴定

本实施例同时采用CCK8法检测HL-60R细胞对于其它与ATRA化学结构不同的化疗药物的耐受性(图1)，参照药敏试验评价标准可以判断：HL-60R细胞对VP-16、ADM具有耐药性，对VCR、Ara-C具有部分耐药性。由此构建的耐药细胞株HL-60R具有一定的多药耐药性状。

实施例2

噬菌体-肽(pepNo.5R5)的筛选和制备

本实施例通过下述方法和步骤筛选和制备pepNo.5R5。

一、与ATRA耐药性AML细胞系结合的噬菌体克隆的初步筛选

采用基于微流控的噬菌体展示多肽文库筛选技术，进行多轮全细胞消减筛选，初步筛选出与ATRA耐药性AML细胞系HL-60R特异性结合的噬菌体克隆，具体步骤如下：

1、噬菌体滴度测定

(1)接种单菌落于LB-Tet培养液中，37℃摇床培养至对数生长中期(OD600≈0.5)。

(2)细菌生长时，水浴融化高层琼脂，每个噬菌体稀释度一管。保存于55℃备用。

(3)37℃预温LB/IPTG/X-gal平板，每个噬菌体稀释度准备一个平板备用。

(4)用LB培养液将噬菌体原液进行10倍系列稀释，一般设4个稀释度。

(5)取对数中期的细菌培养物以200μL分装于EP管，每个噬菌体稀释度一管。

(6)每管菌液中加入10μL各稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。

(7)加入55℃预温的高层琼脂管中，快速混匀后倾注经预温的LB/IPTG/X-gal平板上，轻轻水平晃动平板使高层琼脂均匀铺开。

(8)待平板冷却凝固后，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

(9)次日检查平板，计数有～10²个噬菌斑的平板上的蓝斑数，然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)

2、基于微流控的噬菌体展示多肽文库筛选

以HL-60为负筛细胞，ATRA耐药株HL-60R为正筛细胞，以基于微流控的方法，对噬菌体展示十二肽库进行四轮消减筛选，筛选程序如下：

(1)用75％乙醇以10rpm循环2h对微流动通道进行灭菌处理；并以双蒸水10rpm循环40min除去通道内残留的乙醇。

(2)收集负筛、正筛细胞各1mL，TBS洗涤后，以800μL封闭液重悬。

(3)将800μL含负筛细胞的封闭液在微流动通道中封闭，2.4rpm循环30min。

(4)将封闭后的负筛细胞1200rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入经稀释的800μL噬菌体肽库，将细胞悬液充分混匀，在微流动通道内以10rpm孵育90min。

(5)将噬菌体、负筛细胞混合液轻轻转移至有机相上方，10000g离心10min，收集上清置于4℃，待正筛细胞封闭完成后进行正筛。

(6)以800μL含正筛细胞的封闭液在微流动通道中封闭，2.4rpm循环30min。

(7)将封闭后的正筛细胞1200rpm离心5min，弃上清，向管中沉淀加入(5)中所得上清，充分混匀后，在微流动通道内以10rpm孵育90min。

(8)将噬菌体、正筛细胞混合液1200rpm离心5min，弃上清。

(9)TBST重悬沉淀后在微流动通道内10rpm循环5min，离心弃上清，重复3次。

(10)将洗涤液轻轻转移到200μL有机相上方，10000g离心10min，收集沉淀。

(11)以1mL LB重悬沉淀，吹打混匀，取10μL用于测定洗脱液中噬菌体的滴度。

(12)其余洗脱液加入到20mL处于对数生长前期的ER2738培养物中，37℃剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，410000rpm℃离心10min，上清液转入另一离心管，再离心。将上清的上部80％转入一新管中，加入1/6体积PEG/NaCl，充分混匀，4℃过夜，使噬菌体充分沉淀。

(13)次日4℃10000rpm℃离心15min。弃上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入Eppendorf管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀，上清转入另一新鲜Eppendorf管，加入1/6体积的PEG/NaCl冰上孵育60min再沉淀。然后4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200μL TBS中，离心1min，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新的Eppendorf管中。此即为扩增后的洗脱物。

(14)根据方法1对扩增后的噬菌体进行滴度测定。其余4℃贮存。

(15)进行第二轮淘选：根据滴度测定结果，计算1×10¹¹pfu噬菌体所需扩增液体积，重复步骤(1)-(14)。每一轮的筛选得率通过以下公式计算：

(洗脱液滴度×洗脱液体积)÷(投入肽库或上一轮扩增液滴度×投入液体积)

四轮淘选中通过逐轮增加负筛细胞数、减少正筛细胞数、提高洗涤液中Tween-20浓度，以逐渐增强筛选时的选择压。随着筛选的进行，噬菌体得率逐渐增大，表明与HL-60R细胞特异性结合的噬菌体克隆得到了有效富集(表2)。

表2每轮筛选的噬菌体富集结果(HL-60R为靶细胞)

二、滴度测定法检测各次级库与耐药细胞的结合能力

(1)取负筛、正筛细胞各1×10⁶个，TBS洗涤后，以800μL封闭液重悬。

(2)分别加入各轮轮噬菌体次级库1×10¹¹pfu，充分混匀后，4℃缓慢摇动孵育1h。

(3)将孵育后的混合液1200rpm离心5min，弃上清。

(4)以0.1％TBST洗涤沉淀，1200rpm离心5min，重复3次。

(5)将洗涤液轻轻转移到200uL有机相的上方，10000g离心10min，收集沉淀。

(6)以1mL LB重悬沉淀，吹打混匀，取10μL用于测定与细胞结合的噬菌体滴度。

按以上方法分别检测了筛选所得各轮次级库与耐药细胞及亲代细胞的结合能力，结果发现：次级库与耐药细胞的结合能力明显强于相应的亲代细胞，且随着筛选的进行与耐药细胞的结合能力越来越强，第四轮次级库中与耐药细胞结合的噬菌体数是亲代细胞的3-4倍，表明与耐药细胞结合的噬菌体克隆得到了特异性富集(图2)。

三、噬菌体单克隆序列的生物信息学分析及初步鉴定

1、DNA提取及测序

以HL-60R为正筛细胞，HL-60为负筛细胞，经四轮筛选后，随机挑取53个单克隆离心去除细菌，取500ul噬菌体上清加入200ul PEG/NaCl，混匀室温静置10min，4℃14000rpm/min离心10min，沉淀物彻底重悬于100ul碘化物缓冲液，加250ul乙醇，室温温育10min后，离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，短暂真空干燥后沉淀重悬于30ul TE，进行测序。本实验测序均由华大基因完成，测序引物为文库自带-96gIII测序引物为SEQ ID NO.3：5’-hoccctcatagttagcgtaacg-3。

利用SeqMan软件分析噬菌体克隆测序结果，统计发现测序成功的53个噬菌体克隆共有6种序列，其中一致性最高的序列出现百分比为40.38％，命名为pepNo.5R5,其碱基序列为SEQ ID NO.1：TGGGCGATTACGAAGCCGGCGCCGGCGGCGCATCCG。

根据遗传密码表将碱基序列翻译为氨基酸序列，得到噬菌体pIII蛋白上展示的外源十二肽序列为SEQ ID NO.2：WAITKPAPAAHP。

2、pepNo.5R5的生物信息学分析

本实施例利用ExPASy网站提供的ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析上述pepNo.5R5多肽理化性质。如表3所示，该多肽分子量为1259.47，理论等电点为8.76,是由180个原子构成，在哺乳动物网织红细胞半衰期约为2.8h，该多肽不稳定，亲脂性指数为65.83，总平均疏水性为-0.150。

表3 pepNo.5R55R5理化性质分析

实施例3

pepNo.5R5与耐药细胞的结合特异性

1、通过滴度测定法鉴定噬菌体克隆与多种细胞系的结合情况

本实验选取携带pepNo.5R5片段的噬菌体克隆，通过滴度测定法鉴定该噬菌体克隆与不同细胞系的结合能力，方法同实施例2中相同。

实验结果如图3所示，pepNo.5R5与耐药细胞HL-60R的结合能力明显强于相应的亲代细胞；与其它正常细胞系(HL-7702、GES-1、293T)及肿瘤细胞系(MCF-7、THP-1、HepG2、PC3)的结合能力非常弱。此外，5R5号噬菌体展示多肽还能够与急性淋巴细胞白血病细胞多药耐药株CEM/C1结合，表明该序列可能是耐药细胞的广谱结合肽。

2、免疫荧光法检测噬菌体单克隆与耐药细胞的结合能力

具体步骤如下：

(1)取负筛、正筛细胞各1×10⁶个，PBS洗涤后以800μL封闭液重悬。

(2)分别加入噬菌体单克隆1×10¹¹pfu，充分混匀后，4℃缓慢摇动孵育6h。

(3)PBS洗涤后将细胞滴于经多聚赖氨酸预处理的玻片上，4％PFA固定20min。

(4)PBS洗涤后滴加5％BSA-PBS室温封闭30min。

(5)甩去封闭液，滴加HRP-鼠抗M13抗体，4℃过夜孵育。

(6)PBS洗涤后滴加Alexa羊抗小鼠抗体，室温孵育3h。

(7)PBS洗涤后滴加DAPI(1:1000稀释)，37℃孵育2min。

(8)PBS洗涤后甘油封片，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

结果如图4显示，pepNo.5R5与耐药细胞HL-60R的结合能力明显强于相应的亲代细胞HL-60。

3、流式细胞术检测噬菌体单克隆与耐药细胞的结合能力

取负筛、正筛细胞各1×10⁶个，PBS洗涤后，以800μL封闭液重悬后加入噬菌体单克隆1×10¹¹pfu；4℃缓慢摇动孵育6h后加入1％1BSA-PBS洗涤后加HRP-鼠抗M13抗体，4℃过夜孵育；然后经1％BSA-PBS洗涤后加入Alexa羊抗小鼠抗体，4℃孵育1h；最后再用PBS洗涤后以500μL PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

结果如图5显示，pepNo.5R5与耐药细胞HL-60R的结合能力明显强于相应的亲代细胞HL-60。

实施例4

化学合成pepNo.5R5多肽与耐药细胞的结合特异性

本实施例将pepNo.5R5多肽化学合成并标记5-TAMRA荧光后，在体外鉴定多肽与耐药细胞结合的亲和力及特异性。

1、多肽荧光标记

化学合成pepNo.5R5多肽及其对照肽GK(GGGAGGGAGGGA，仅含Gly及Ala，氨基酸侧链不含任何功能基团)，修饰方式为在肽段羧基末端增加GGGSK模拟噬菌体尾丝，通过赖氨酸K其侧链氨基偶联5-TAMRA荧光染料(Abs/Em＝555/565nm。本发明将标记荧光pepNo.5R5及对照肽分别表示为pepNo.5R5-5-TAMRA和GK-5-TAMRA。上述多肽的化学合成由吉尔生化(上海)有限公司完成，通过高效液相色谱(HPLC)纯化，经质谱(MS)鉴定，所有5-TAMRA荧光标记肽的纯度均在98％以上。

2.pepNo.5R5多肽与不同细胞系的结合能力

将ATRA耐药细胞株HL-60R、人类急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60、人类T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat、人类慢性髓原白血病细胞K562、人单核细胞白血病细胞THP-1、人类胚肾细胞293-T按5×10^4/孔密度接种于24孔板，培养24h后，用PBS冲洗3次，然后分别加入1×10^-6mol/L的pepNo.5R5-5-TAMRA和GK-5-TAMRA后于37℃孵育20min。洗涤3次后用4％多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。洗涤3次，加入DAPI于37℃染细胞核15min，洗涤3次后于倒置荧光显微镜观察。实验设置3个复孔，重复3次。其中，荧光染料5-TAMRA的Abs/Em＝555/565nm，DAPI Abs/Em＝350/457nm。

图6显示：pepNo.5R5-5-TAMRA仅与人类急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株HL-60R结合，与其他细胞系均不结合，这说明pepNo.5R5在合成肽水平也具有良好的细胞结合特异性。

3、流式细胞术证明pepNo.5R5合成多肽在体外与ATRA耐药细胞株结合的特异性

将HL-60、HL-60R细胞调整细胞浓度1×10⁵/ml，用PBS冲洗3次，然后分别加入pepNo.5R5-5-TAMRA和GK-5-TAMRA(荧光合成肽孵育浓度10μM。)，37℃孵育1h；洗涤3次后，上机检测。实验重复3次。

本实验结果如图7所示，pepNo.5R5与急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株HL-60R有特异性结合，与细胞免疫荧光实验结果相一致，其结合率为分别达到了53.28％。

4、pepNo.5R5荧光多肽与HL-60R细胞浓度依赖性结合

将不同浓度的(2.5μM、5μM、20μM)pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R细胞37℃孵育1h后，免疫荧光检测发现随着浓度的增加，pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R的结合越强(图8)。

5、竞争抑制实验证明pepNo.5R5与ATRA耐药细胞株结合的特异性

为进一步验证pepNo.5R5多肽与HL-60R结合的特异性，利用免疫荧光方法开展竞争实验：将不同浓度的(20μM、40μM、80μM)未标记荧光的pepNo.5R5裸肽及GK裸肽分别与10μM pepNo.5R5-5-TAMRA混合，将混合液与HL-60R细胞37℃孵育1h，后续方法同前。

实验结果如图8显示，未标记荧光的对照GK裸肽不能抑制

pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R细胞的结合；未标记荧光的pepNo.5R5裸肽能够抑制pepNo.5R5-5-TAMRA与HL-60R细胞的结合；且随着pepNo.5R 5裸肽的浓度增加，抑制效果更加明显，即抑制效应呈现浓度依赖性。

这进一步表明pepNo.5R5合成荧光多肽与HL-60R细胞结合的特异性，且这种特异性是基于pepNo.5R5肽段的氨基酸序列，与荧光基团无关。

6、pepNo.5R5荧光多肽与HL-60R细胞温度(能量)依赖性结合

ATP是细胞的能量通货，ATP酶活性会受温度的影响。相较37℃的适宜反应温度，4℃条件下ATP酶活性明显下降。为了鉴定pepNOo.5R5多肽与HL-60R细胞结合的温度(能量)依赖性，本实例通过免疫荧光染色来检测不同温度(37℃及4℃)下合成荧光多肽与HL-60R细胞的结合情况。结果如图9所示：pepNo.5R5多肽在37℃与HL-60R细胞孵育1h可见明显的荧光结合信号，而4℃孵育1h并未见任何明显的荧光信号，这说明pepNo.5R5荧光多肽与HL-60R细胞结合呈现温度(能量)依赖性。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种与耐ATRA急性髓系白血病细胞特异性结合的多肽及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgggcgatta cgaagccggc gccggcggcg catccg 36

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ala Ile Thr Lys Pro Ala Pro Ala Ala His Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctcatagt tagcgtaacg 20

Claims

1.一种与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，命名为pepNo.5R5，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽，命名为pepNo.5R5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种产生权利要求1所述的与能够与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽的细胞株，其特征在于，所述细胞株的保藏编号为CCTCC NO.C2018139，命名为HL-60R。

4.一种权利要求1所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)将上述pepNo.5R5多肽通过人工方式合成。

5.根据权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述ATRA对HL-60进行体外诱导筛优选为采用浓度递增间歇诱导法。

6.根据权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述进行了全细胞消减筛选和多轮全细胞消减筛优选为采用基于微流控的噬菌体筛选方法。

7.根据权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述鉴定挑选出的噬菌体克隆与ATRA耐药性AML细胞的结合水平为通过滴度测定法、免疫荧光法和流式细胞术。

8.一种权利要求1所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽在靶向多药耐药AML的药物制备中的应用。

9.一种权利要求1所述的与ATRA耐药性AML细胞特异性结合的多肽在多药耐药AML诊断试剂盒制备中的应用。