CN109517036A - 肺癌细胞特异性结合多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了以高的亲和力和特异性结合肺癌细胞的多肽，可用于指示肺癌细胞以及肺癌诊断。还提供了编码多肽的核酸分子、制备多肽的方法以及包含该多肽的癌症诊断偶联物以及试剂盒。

Description

肺癌细胞特异性结合多肽及其制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质多肽技术领域，具体涉及一种可与肺癌细胞特异性结合的多肽及其制备方法。

背景技术

肺癌发生于支气管黏膜上皮，其发病率和死亡率增长很快。近50年来肺癌的发病率显著增高，在欧美工业发达国家和我国的一些工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位；女性发病率也迅速增高，位居女性常见恶性肿瘤的第2位。因此，肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。由于肺癌发病的隐匿性，发病早期多无症状，导致几乎2/3的肺癌患者在就诊时已是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。目前，我国肺癌早期诊断率较低，导致患者5年生存率仅有10％，而国外发达国家是15％-20％。因此，急需提高肺癌早期诊断率。

传统的肺癌临床诊断方法如胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法缺乏足够的特异性和敏感性，因此急需开发出一种新的用于临床诊断肺癌、特别是早期肺癌的方法。

随着肿瘤分子生物学研究的进展，越来越多的肺癌标记物及筛查手段被应用于临床。肿瘤标志物是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并释放到血液、细胞、体液中而反映肿瘤存在和生长的一类物质。标志物检测肺癌具有高效率、高灵敏性、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此筛选、鉴定及检测肿瘤标志物一直是肺癌早期诊断研究的重点。

当前被认为有意义的肺癌肿瘤标志物有如下几类：

癌胚抗原(CEA)；

糖蛋白类抗原：糖抗原(carbohydrate antigen)19-9、糖抗原15-3、鳞状细胞癌抗原等；

角蛋白类抗原：细胞角蛋白片段抗原(cytokeratin fragment antigen)21-1、组织多肽特异性抗原(tissue polypeptide specific antigen)等。

酶类抗原：前胃液素肽(Pro-gastrinpeptide)、乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase)、谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases)等。

虽然这些标志物有一定的代表性，但其缺点是特异性不高，如就CEA而言，除在胚胎性肿瘤组织外，在成人胃肠、肺、乳腺等腺癌组织中均表达癌胚抗原CEA。所以，本领域需要寻找肺癌细胞特异性的靶点。

癌症诊断领域迫切需要开发灵敏度高，特异性强的体外诊断产品。采用特异性小分子肽识别实体肿瘤癌细胞作为一种新型的肿瘤鉴定手段，具有良好的商业发展前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，筛选一种既具备传统抗体分子的优点，而且分子量小，容易到达肿瘤组织部位，并以高的亲和力和特异性与肺癌细胞结合的多肽。

本申请将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合，使融合蛋白展示在噬菌体的表面。导入的多种多样的外源基因形成了一个库。以蛋白或细胞为靶点，对噬菌体库进行反复筛选，并随之对其进行扩增，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特异亲和性而不断地得到富集，从而能够快速、有效地将相对稀少的可以高效结合配体的克隆从文库中筛选出来。

本申请的第一方面提供了一种指示肺癌细胞的多肽，所述多肽具有SEQ.ID.No.1所示的氨基酸序列或与SEQ.ID.No.1具有80％-99％同源性的氨基酸序列。优选地，所述肺癌细胞是A549细胞。

本申请的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子具有编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列具有SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列或与SEQ.ID.No.2具有80％-99％同源性的核苷酸序列。

本申请的第三方面提供了一种筛选第一方面所述的多肽的方法，所述方法包括步骤：

(1)将随机肽噬菌体展示文库先与正常肺细胞孵育，然后将不与正常肺细胞结合的噬菌体上清液再与肺癌细胞孵育；

(2)对与肺癌细胞结合的噬菌体进行滴度测定；

(3)通过扩增淘选结合肺癌细胞的噬菌体单克隆；

(4)挑选以高亲和力结合肺癌细胞的噬菌体单克隆；

(5)通过测序获得所挑选的噬菌体单克隆中展示的多肽的序列。

优选地，步骤(4)中所述的以高亲和力结合肺癌细胞的噬菌体单克隆的挑选采用细胞水平的ELISA检测方法。

本申请在第四方面提供了包括第一方面所述的多肽的癌症诊断偶联物。优选地，所述偶联物包括放射性核素、同位素、光学标记、磁性物质或以上的任意组合。更优选地，所述放射性核素选自¹²⁴I、¹⁸F、¹¹C、^99mTc、¹²³I及以上的任意组合；所述光学标记包括荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物或酶联免疫显色剂；所述磁性物质选自含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒及其组合。最优选地，所述荧光标记物选自异硫氰酸荧光素酯(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、碳花氰甙x(CYx家族)、氨甲基香豆素乙酸(AMCA)；所述化学发光标记物选自：鲁米诺(luminol)、吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物；所述生物发光标记物选自：萤光素酶底物或其衍生物；所述酶联免疫显色剂包括：辣根过氧化物酶(HRP)。

本申请在第五方面提供了包括第一方面所述的多肽或第四方面所述的癌症诊断偶联物的试剂盒。

本申请在第六方面提供了第一方面所述的多肽或第四方面所述的癌症诊断偶联物在制备用于肺癌诊断的试剂盒中的用途。

附图说明

图1是筛选高亲和力肺癌细胞结合性噬菌体克隆的流程图。

图2显示了筛选到的全部噬菌体单克隆对A549肺癌细胞的亲和力。

图3显示了所选择的噬菌体单克隆对正常肺细胞(16HBE)和A549肺癌细胞的结合亲和力。

图4显示了278号噬菌体克隆被送至金唯智生物科技有限公司用96gIII测序引物测序的结果。

图5是Snapene_viewer软件对图4的DNA序列所编码的氨基酸序列进行分析的结果。

具体实施方式

本申请通过噬菌体展示方法筛选到以高亲和力和特异性结合肺癌细胞的肽(SEQ.ID.NO.1)。

重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。用于鉴定结合多肽所用的噬菌体载体为M13单链噬菌体。M13噬菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集上清液并进行培养，再向培养液中加入沉淀剂即可将大量的噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含有外源基因产物的重组噬菌体。

下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。

实施例

材料

Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit试剂盒(购自NEW ENFLANDBioLabs货号：E8110S)，所述试剂盒含有：

1.随机十二肽噬菌体展示文库

100μl，浓度1.5×10 ¹³pfu/ml，复杂度～2.7×10⁹，贮存于含50％甘油的TBS溶液中。

2.测序引物

·28gIII测序引物:5’-GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’(SEQ ID NO:4)，100pmol，使用浓度1pmol/μl

·96gIII测序引物：5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’(SEQ ID NO:5)，100pmol，使用浓度1pmol/μl3.试剂

·链霉亲和素(Streptavidin)，冻干粉1.5mg

·生物素，10mM，100μl

4.菌株：

·E.coli ER2738宿主菌(F’lacI qΔ(lacZ)M15proA+B+zzf::Tn 10(Tet R)/fhuA2supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk–mk–McrBC–))。该菌株以含50％甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。

5.ER2738培养基：

LB培养基：

每升含：10g细菌用胰蛋白胨(购自OXOID，货号：LP0042)，5g酵母提取物(购自OXOID，货号：LP0021)，5g NaCl(购自索莱宝，货号：S8211)。高压灭菌，室温贮存。

LB/IPTG/Xgal平板：

IPTG/Xgal配制：

将0.25g IPTG(购自索莱宝，货号I8070)溶于5ml X-gal溶液中(购自索莱宝，货号X1010)。溶液于-20℃避光贮存。

向LB培养基中加入琼脂粉(15g/L)，高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀后平铺在无菌的细菌用培养平板中。琼脂凝固后将平板于4℃避光贮存。

顶层琼脂：

每升含：10g细菌用胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，1gMgCl₂·6H₂O，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份。将凝固后的固体培养基贮存于室温，用时微波炉融化。

四环素(Tet)(购自索莱宝，T8180)贮液：

以20mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。

LB-Tet培养基：

1L LB培养基加入1ml四环素贮液。

LB-Tet平板：

向LB培养基中加入琼脂粉(15g/L)，高压灭菌，冷却至低于60℃时，加入1ml四环素贮液，混匀后平铺在无菌的细菌用培养平板中。凝固后将平板于4℃避光贮存。如果平板显棕色或黑色则不宜使用。

6.溶液：

PBS:(购于HyClone，货号：SH30256.01)

封闭缓冲液：以3％(w/v)的浓度将脱脂奶粉(购于BD，货号232100)溶于PBS中。过滤除菌，4℃贮存。

PEG/NaCl：含2.5M NaCl的20％(w/v)PEG-8000(购于索莱宝，p8260)。高压灭菌，室温贮存。

细胞系：

A549：由中国科学院生物物理研究所王盛典课题组惠赠

16HBE：购自广州吉妮欧生物技术有限公司，货号：16HBE

仪器耗材：

超净工作台、细菌摇床、37℃细菌培养箱、一次性带滤芯吸头、免疫管、离心管、250ml玻璃锥形瓶。

筛选和制备以高亲和力结合肺癌细胞的噬菌体单克隆的流程的示意图如图1所示。

第一轮淘筛

一.癌细胞与噬菌体库的结合孵育

1、细胞消化和封闭：

取于T175瓶中生长达90％汇合的16HBE肺正常细胞，用0.25％的EDTA消化，计数取1*10⁷个细胞，300g离心5分钟，用1.5ml封闭缓冲液重悬，封闭1小时；

取于T175瓶中生长达90％汇合的A549肺癌细胞，用0.25％的EDTA消化，计数取1*10⁷个细胞，300g离心5分钟，1.5ml封闭缓冲液重悬，封闭1小时。

2.取10μl随机十二肽噬菌体展示文库，即1.5×10¹¹pfu稀释到1.5ml封闭缓冲液内，封闭1小时。

3.癌细胞与噬菌体库的结合孵育

将封闭的噬菌体文库与16HBE细胞混合，孵育2小时；孵育结束后，400g离心5分钟，小心吸出上清液，向该上清液中加入封闭过的A549细胞，孵育2小时；孵育结束后，300g离心5分钟，弃掉上清液，加入5mlPBS轻轻吹洗细胞，再离心，重复洗涤10次，将被噬菌体结合的A549细胞重悬于1ml PBS中。

二.淘筛噬菌体滴度滴定

①接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600～0.5)。

②用微波炉融化顶层琼脂后分成3ml等份于无菌15ml离心管中并保存于45℃备用，供形成噬菌体系列稀释度。

③37℃预热LB/IPTG/Xgal平板，针对每个噬菌体稀释度准备一个备用LB/IPTG/Xgal平板。

④取10μl第一部分孵育得到的结合有A549细胞的特异性噬菌体的溶液，做10倍比系列稀释，稀释范围为10¹-10⁴。每个稀释度使用新的带滤芯吸头以避免交叉污染。

⑤将生长至对数中期的E.coli ER2738宿主菌培养物分成200μl等份于1.5ml微量离心管中，对于每个噬菌体稀释度准备相同份数的E.coliER2738宿主菌。

⑥向每个1.5ml离心管的E.coli ER2738宿主菌中加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。

⑦将以上与不同倍数稀释的噬菌体温育的E.coli ER2738宿主菌分别加入45℃预温的顶层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，共加入n管，其中n＝lg(稀释倍数)，然后立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上，适当倾斜平板将顶层琼脂均匀铺开。

⑧待平板冷却5min后，倒置平板并于37℃培养过夜。

⑨计算噬菌斑数。计数方法为：计算含有～10²个噬菌斑(以保证噬菌斑不重叠)的平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)，并进而推算得到噬菌体滴度(pfu/ml)。

三.噬菌体扩增

1.向20ml LB培养基中加入200μl对数生长期的E.coli ER2738宿主菌和500μl第二部分淘筛的噬菌体，倒入250ml容积的灭菌锥形瓶中，37℃振荡过夜。

2.将噬菌体扩增液倒入适当数量的50ml离心管中，4℃8000rpm离心15min，将上清液移入新的锥形瓶中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上放置3小时，然后4℃10000rpm离心15min，弃上清液，将离心管倒置在吸水纸上至完全干燥。

3.用1ml PBS重悬沉淀物，加入160μl PEG/NaCl溶液，冰浴1h，4℃10000rpm离心10min，弃上清液，以200μl PBS溶液重悬沉淀物，得到扩增噬菌体。

四.扩增后噬菌体滴度测定

按第二部分所述的进行滴度测定，稀释范围为10⁸-10¹¹。

第二轮到第四轮淘筛：

取第一轮扩增噬菌体进行第二轮淘筛，并依次取前一轮扩增噬菌体进行第三至四轮淘筛。淘筛方法如以上对于第一轮淘筛描述的方法相同。

将第四轮淘筛得到的噬菌体转移到新的离心管内4℃保存。

四轮差减筛选富集效应见以下表1。

表1

扩增第四轮滴度测定平板上的噬菌斑

1.取300只无菌15ml离心管，每管内加入5ml LB培养基，然后用无菌滤芯吸头挑取噬菌斑单克隆分别加到一只离心管内，37℃振荡过夜培养。

2.然后将第1步得到的每管扩增后的噬菌体取1ml到1.5ml离心管内置于4度保存菌种。

3.将剩余噬菌体4700rpm，离心10min。保留上清液。用于以下的亲和力鉴定实验。

高亲和力单克隆鉴定

(1)将A549细胞以5×10⁴/孔的密度接种于96孔板，置于37℃下的含有5％CO₂的细胞培养箱培养24h后，用PBS洗涤细胞以去除血清，然后用4％多聚甲醛在37℃下固定30分钟，再用封闭缓冲液封闭1小时，然后加入100μl以上得到的噬菌体单克隆孵育2小时，加HRP-anti M13抗体，37℃孵育1h；然后用100μl TMB显色，之后加入50μl 2N H₂SO₄终止反应，于酶标仪450nm处读数。以m13k07做空白对照，P/N≥3为阳性。共筛选394个克隆，初步筛到10个高亲和力单克隆，分别为140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。(参见图2)

(2)然后分别将16HBE细胞、A549细胞，用0.25％的EDTA消化，计数取每份5×10⁶个于2ml离心管内，各取9份，300g离心5分钟，1ml封闭缓冲液重悬于2ml离心管内，4℃摇动封闭1小时。同时，将以上得到的每个噬菌体克隆取0.5ml于2ml离心管，再分别加入0.5ml封闭缓冲液，孵育1小时。另取M13k07辅助对照噬菌体同样方法做封闭处理。将封闭结束的细胞与封闭结束后的噬菌体混合到15ml离心管内，4℃摇动孵育2小时。将细胞300g离心5分钟，小心吸除上清液，加入1ml PBS吹洗均匀，再300g离心5分钟。如此反复洗涤细胞5次。将经封闭缓冲液2500倍稀释的HRP-anti M13抗体分别取0.5ml加到各份细胞内重悬，4℃摇动孵育1小时。再洗涤5遍。用100μl TMB显色，之后加入50μl 2N H₂SO₄终止反应，于酶标仪450nm处读数。重复3次实验，显示278号克隆均呈现高亲和力(参见图3)。

(3)将278号克隆送至金唯智生物科技有限公司用试剂盒自带96gIII测序引物(5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3′)测序(订单号80-69967104)，测序结果如图4所示，测得36bp的目的片段，其序列为AGTGATTGGAAGCTTTATACGCAGCCTATTACTCTG(SEQ ID NO.2)，其所编码的12个氨基酸的多肽的氨基酸序列为SDWKLYTQPITL(SEQ ID NO.1)(参见图5)。

序列表

<110> 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司

<120> 肺癌细胞特异性结合多肽及其制备方法

<130> 1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Ser Asp Trp Lys Leu Tyr Thr Gln Pro Ile Thr Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

agtgattgga agctttatac gcagcctatt actctg 36

<210> 3

<211> 808

<212> DNA

<213> M13噬菌体(M13 phage)

<400> 3

ttggtactgc acatccggtt ctcgtcaagt atatcttgat caagtcatac agcctatgtg 60

ccacgtcatt ataccgttct tccgcatgtt tcaaatgtag gtcagttcgg ttcctctatg 120

agtgtccgtg cgcgcctcgt tccggctaag taacatggag caggtcgcgg attttcgaca 180

caatttatca ctagattata caaatctccg ttgtattttg tttcccgctg ggtatactcg 240

ttgggggtca aagatgagtg ttttagtgta ttcttttgcc tctttcgttg taggttggtg 300

ccttggttgt ggcattacgt attttacccg tttaatggaa acttcctcat gaaaaagtct 360

ttagtcctca aagcctctgt agccgttgct accctcgttc cgatgctgtc tttcgctgct 420

gagggtgacg atcccgcaaa agcggccttt aactccctgc aagcctcagc gaccgaatat 480

atcggttatg cgtgggcgat ggttgttgtc attgtcggcg caactatcgg tatcaagctg 540

tttaagaaat tcacctcgaa agcaagctga taaaccgata caattaaagg ctccttttgg 600

agcctttttt ttggagattt tcaacgtgaa aaaattatta ttcgcaattc ctttagtggt 660

acctttctat tctcactcta gtgattggaa gctttatacg cagcctatta ctctgggtgg 720

aggttcggcc gaaactgttg aaagttgttt agcaaaatcc catatagaaa attcattact 780

aaacgtctga aagaccgaac caaacggc 808

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gtatgggatt ttgctaaaca ac 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ccctcatagt tagcgtaacg 20

Claims (12)

1.一种指示肺癌细胞的多肽，所述多肽具有SEQ.ID.No.1所示的氨基酸序列或与SEQ.ID.No.1具有80％-99％同源性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述肺癌细胞是A549细胞。

3.一种核酸分子，所述核酸分子具有编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的核酸分子，所述核苷酸序列具有SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列或与SEQ.ID.No.2具有80％-99％同源性的核苷酸序列。

5.一种筛选权利要求1所述的多肽的方法，所述方法包括步骤：

(1)将随机肽噬菌体展示文库先与正常肺细胞孵育，然后将不与正常肺细胞结合的噬菌体上清液再与肺癌细胞孵育；

(2)对与肺癌细胞结合的噬菌体进行滴度测定；

(3)通过扩增淘选结合肺癌细胞的噬菌体单克隆；

(4)挑选以高亲和力结合肺癌细胞的噬菌体单克隆；

(5)通过测序获得所挑选的噬菌体单克隆中展示的多肽的序列。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(4)中所述的以高亲和力结合肺癌细胞的噬菌体单克隆的挑选采用细胞水平的ELISA检测方法。

7.包括权利要求1所述的多肽的癌症诊断偶联物。

8.如权利要求7所述的癌症诊断偶联物，其中，所述偶联物包括放射性核素、同位素、光学标记、磁性物质或以上的任意组合。

9.根据权利要求8所述的癌症诊断偶联物，其中所述放射性核素选自¹²⁴I、¹⁸F、¹¹C、^99mTc、¹²³I及以上的任意组合；所述光学标记包括荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物或酶联免疫显色剂；所述磁性物质选自含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒及其组合。

10.根据权利要求9所述的癌症诊断偶联物，其中

所述荧光标记物选自异硫氰酸荧光素酯(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、碳花氰甙x(CYx家族)、氨甲基香豆素乙酸(AMCA)；

所述化学发光标记物选自：鲁米诺(luminol)、吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物；

所述生物发光标记物选自：萤光素酶底物或其衍生物；

所述酶联免疫显色剂包括：辣根过氧化物酶(HRP)。

11.包括权利要求1-2中任一项所述的多肽或权利要求7-10中任一项所述的癌症诊断偶联物的试剂盒。

12.权利要求1-2中任一项所述的多肽或权利要求7-10中任一项所述的癌症诊断检测偶联物在制备用于肺癌诊断的试剂盒中的用途。