CN105017385B - 基于模拟人组胺受体4（hr4）表位的疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于模拟人组胺受体4(HR4)表位的疫苗及其构建方法，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：TFKFTLSYRQVH。本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，测序获得一条多肽序列，命名为PT2，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽，确定多肽PT2模拟了HR4表位，进而构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4模拟表位为基础的疫苗，将会在临床的变应性鼻炎治疗，及HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。

Description

基于模拟人组胺受体4（HR4）表位的疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种基于模拟人组胺受体4(HR4)表位的疫苗及其构建方法。

背景技术

HR4分子及其拮抗剂的相关研究：1.HR4分子组胺受体 -4(histamine receptor-4,HR4)是一种新发现的组胺受体，为跨膜G蛋白耦连受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)，功能在于抑制腺苷酰环化酶活性，活化磷酸蛋白酶C(phospholipase C)和诱导钙离子流动。HR4优先分布于免疫器官和造血细胞上，涉及到变应性鼻炎 (allergicrhinitis,AR)的病理性免疫应答的所有免疫细胞。肥大细胞、 CD4+T、CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞都可以检测到HR4的表达，并被证明具有介导免疫调节功能。 2.HR4拮抗剂HR4拮抗剂对TLR配体诱导树突细胞的活化过程产生的IL-6、KC、MIP-α和IP-10等细胞因子和趋化因子表现为抑制作用，HR4的拮抗剂、负性激动剂已经在体外实验中获得了很好的抗炎前景。体外研究发现当HR4信号途径无作用的时候，在抗原刺激过程时，IFN-γ和特异性IgG2a均不增加,而且炎性细胞因子IL-6和 IL-17A也都表现为被抑制。这说明针对HR4信号途径的治疗在抑制 Th2细胞应答时，机体内的微环境并不向Th1类过度反应偏离，体内微环境处于相对稳定状态。JNJ-7777120是第一个，有效的，选择性非咪唑histamine H4receptor拮抗剂，Ki为4.5nM，比作用于其他组胺受体选择性高1000倍以上，其作用表现在嗜酸性粒细胞的趋化，肥大细胞的趋化以及变应性鼻炎及变应性气道炎症，并在变应性鼻炎皮炎动物模型获得良好的治疗作用。JNJ 7777120具有口服生物利用度，处理大鼠为30％，处理犬为100％，处理这两个品种的半衰期都为3小时。JNJ 7777120处理小鼠骨髓衍生的肥大细胞，抑制组胺诱导的趋化性和钙流入。JNJ 7777120处理小鼠，抑制组胺诱导的气管肥大细胞从结缔组织向上皮细胞的迁移。JNJ-7777120为化学合成，价格昂贵，3030RMB/50mg,存在口服生物利用度，对肝肾影响尚未明确。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供一种噬菌体随机十二肽库筛选 HR4表位模拟肽及其筛选方法，本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4 单抗的亲和力，获得30个噬菌体克隆，测序获得一条多肽序列，筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽，进而构建HR4表位模拟肽疫苗。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种噬菌体随机十二肽库筛选HR4表位模拟肽，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为： TFKFTLSYRQVH。

噬菌体随机十二肽库筛选HR4表位模拟肽的筛选方法，包括以下步骤：

S1、HR4单克隆抗体IgG纯化，用pH值为6.8～7.1的20mmol/L 磷酸缓冲液稀释HR4单克隆抗体，并包被ELISA板；

S2、用封闭缓冲液室温封闭，用TBS和Tween20的混合液进行洗涤；

S3、向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，缓慢振摇，使噬菌体与包被抗体充分接触，用TBS和Tween20的混合液洗涤去除未结合的噬菌体；

S4、用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和液中和后在宿主菌大肠杆菌ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，同时测定洗脱物和投入物的滴度；

S5、重复上述步骤共进行三轮筛选，从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑选30个噬菌体克隆，进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选，得到本发明物。

优选的，步骤S1中所述磷酸缓冲液pH为6.9～7.0。

优选的，步骤S4所述甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液pH为2.6～2.8。

HR4表位模拟肽疫苗的构建方法，包括以下步骤：S1、HR4的模拟表位PT2的人工合成，按照上述的多肽表位氨基酸序列结果，采用固相合成法合成多肽表位PT2(TFKFTLSYRQVH)合成由辉源生物科技(上海)有限公司，纯度为98％以上，同时合成对照多肽；

S2、PT2与HR4单抗特异性结合实验，以2mg/L PT2和对照多肽包被96孔酶联板，每孔100μl，4℃孵育过夜，倾去包被液，于每孔中加入封闭液，4℃封闭2h，倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体，将人HR4单克隆抗体，人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中，室温反应1h，TBST 洗6次，各孔分别加入HRP标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠IgG，室温孵育1h。TBST洗3次，1min/次，用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数；

S3、构建PT2-CTB-脂质体复合物，以0.9％无菌氯化钠溶液溶解多肽和CTB，然后加入相同体积的脂质体Lipofect，使每200μl含多肽100μg，含CTB 5μg，4℃静置过夜，次日晨取出，升至室温(25℃)，即可。

优选的，所述HR4表位模拟肽疫苗用于治疗应变性的过敏性疾病。

(三)有益效果

本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力，获得30个噬菌体克隆，测序获得一条多肽序列，命名为PT2，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，而不与人CEA单抗和BSA结合，筛选获得的人 HR4单克隆抗体特异性多肽，进而构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4模拟表位为基础的疫苗，将会在临床的变应性鼻炎治疗，及HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。

附图说明

图1、随机十二肽pⅢ融合蛋白的N末端序列；

图2、噬菌体12肽库与HR4单克隆抗体各轮筛选产物滴度，其中A：第一轮稀释102倍测滴度约1.2x 104pfu；B：第二轮稀释103 倍测滴度，约2.7x 105pfu；C：第三轮稀释104倍测滴度,约3.9x 106pfu。

图3、Elisa检测第三轮筛选噬菌体克隆与HR4单克隆抗体的亲和力：横坐标1，2，3，…，30分别代表噬菌体克隆 phage-1,phage-2,phage-3,…,phage-30。Con代表随机对照克隆。

图4、Elisa检测噬菌体克隆与HR4单克隆抗体的亲和力。

图5、阳性噬菌体克隆与HR4单抗特异性结合的分析图。

图6、ELISA检测血清与HR4的结合结果分析图。

图7、ELISA检测血清中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平结果分析图。

图8、Real-time PCR检测血细胞中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平结果分析图。

图9、ELISA检测支气管灌洗液与HR4的结合结果分析图。

图10、Real-time PCR检测黏膜组织中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平结果分析图。

图11、Western-blotting检测黏膜组织中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平结果分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、主要实验材料

⑴靶分子：Anti-HR4antibody(ab178704)单克隆抗体前期进行了 ProteinA/G纯化，得到高纯度的(>95％)可用于噬菌体肽库筛选的单克隆抗体。

⑵噬菌体肽库：噬菌体随机十二肽库(Ph.D-12TM phage display peptidelibrary)购自NewEngland Biolabs公司，100ul，1.5×1013 pfu/ml，复杂度2.7×109个转化子，贮存于含50％甘油的TBS溶液中。

⑶-28gIII测序引物：5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’,100pmol,1pmol/μl

⑷-96gIII测序引物：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’,100pmol,1pmol/μl

⑸宿主菌：E.coli ER2738宿主菌，购自New England Biolabs公司F’lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+zzf::Tn 10(TetR)/fhuA2supE thiΔ (lac-proAB)。

二、主要实验试剂

胰蛋白陈、酵母提取物：购自OXOID公司

琼脂糖、琼脂粉：购自广东环凯微生物科技有限公司

PEG8000、Tris、BSA：购自北京鼎国生物有限公司

IPTG、Xgal：购自北京鼎国生物有限公司

四环素：购自北京鼎国生物有限公司

Tween20：购自天津市福晨化学试剂厂

多聚甲醛：购自北京鼎国生物有限公司

HRP/anti-M13 antibody：购自Amersham Biosciences公司

TMB：购自北京鼎国生物有限公司

Tris-饱和酚：购自北京鼎国生物有限公司

Tris碱：购自北京鼎国生物有限公司

EDTA：购自北京鼎国生物有限公司

三、主要工作液配制

(1)PBS：称取下列试剂，置于1L烧杯中：8.00g NaCl、2.90g Na2HPO4·12H2O、0.20g KCl、0.20g KH2PO4；加入约800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml；高压或0.22μm滤膜过滤除菌， 4℃保存。

(2)LB培养基：称取10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl，加入约800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml。高压灭菌，室温贮存。

(3)LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。

(4)顶层琼脂：称取10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl, 1gMgCl2.6H2O,7g琼脂粉，加入约800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml。高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。

(5)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。

(6)LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。

(7)封阻缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6),5mg/ml BSA,0.02％ NaN3。过滤除菌，4℃贮存。

(8)TBS：50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。

(9)PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl。高压灭菌，室温贮存。

(10)链霉亲和素贮液：将1.5mg链霉亲和素冻干粉(本试剂盒提供)溶于1ml10mM磷酸钠(pH7.2)、100mM NaCl、0.02％NaN3溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。

(11)IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside) 和1gXgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25ml二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存。

(12)1M Tris-HCI(pH9.1)中和缓冲液：150ml去离子水溶解24.22g Tris碱，用浓HCI调节pH值至9.1，加水至200ml，过滤除菌，4℃贮存。

(13)0.2M Gly-Hcl(pH2.2)洗脱缓冲液：900ml去离子水溶解1.4g Glycine，用浓HCI调节pH值至2.2，加水至1000ml，过滤除菌，4℃贮存。

(14)4％多聚甲醛：称取多聚甲醛4g，加入80ml PBS，水浴锅50℃加热溶解后，PBS定容至100ml。

(15)0.1％Triton：先将100％Triton配成30％保存，需要时现配现用。

(16)0.05％PBST：称取下列试剂，置于1L烧杯中：8.00g NaCl， 2.90gNa2HPO4·12H2O，0.20g KCl，0.20g KH2PO4；加入约800ml 蒸馏水，充分搅拌溶解，定容至1000ml，加入0.5ml Tween 20摇匀，现配现用。

(17)2％BSA：2g BSA溶解在100ml PBS中，现配现用。

(18)HRP/anti-M13antibody：用2％BSA 1：5000稀释，每20ml BSA加入5μl抗体。

(19)TMB反应液：A液：TMB 1mg/ml DMSO，B液：柠檬酸： 1.02g/100mlNaHPO4-12H2O：3.68g/100ml PH：5.0-5.4，C液：30％过氧化氢A：B：C＝100：900：1，50μl/孔，显色8-15分钟。

(20)TMB反应终止液：2M HCl。

(21)TE(PH8.0)：称取10mmol Tris-base、1mmol EDTA用800ml ddH2O溶解，定容，用HCl调pH至8.0，灭菌。

(22)乙酸钠:无水乙醇：将3mol/L乙酸钠(已过滤)与无水乙醇按1:25的体积比混匀。

(23)70％冷乙醇：将无水乙醇用灭菌水稀释成70％，-20℃保存备用。

四、实验方法：

1、HR4单克隆抗体IgG纯化实验

Anti-HR4antibody(ab178704)单克隆抗体进行前期ProteinA/G纯化。

2、受体菌E.coli ER2738的复苏及培养

从E.coli ER2738的甘油冻存物中挑取一接菌环，涂布于LB-Tet 平板上，37℃颠倒培养过夜后，挑取单一菌落，置于20ml含有1ug/ml Tet的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，使OD600值达0.6左右 (实测值：0.612)。LB-Tet平板及细菌扩增液置于4℃保存，备用。

3、噬菌体扩增

挑取ER2738单菌落置于20ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜，使OD600值达0.6左右，加入噬菌体液10μl，250rpm，37℃摇床培养4.5-5h；培养物转入离心管中，10000rpm，离心5min，将80％上清转入新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl,37℃沉淀过夜， 10000rpm，离心10min，沉淀用1ml TBS重悬，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。

4、噬菌体滴度的测定

受体菌ER2738培养至对数中期(OD600实测值：0.496)，分成200μL每等份；将待测噬菌体用LB培养基进行100倍比稀释(稀释方法：首先取10μL待测噬菌体，加LB培养基稀释至1mL，混匀，标记为管①；从管①中取10μL至新的离心管中，加LB培养基稀释至1mL，混匀，标记为管②；从管②中取10μL至新的离心管中，加LB培养基稀释至1mL，混匀，标记为管③；依次稀释。每浓度取 10μL与对数生长早期的ER2738菌液200μL混匀，加入到3mL 于45℃保温的LB顶层琼脂后迅速倾倒于含有IPTG/Xgal的LB固体平板，37℃过夜，计数蓝色噬菌斑。计算公式：噬菌体效价(pfu/10 μL)＝噬斑数×稀释倍数，即每10μL的噬菌体形成单位。

噬菌体滴度测定结果为：在1014稀释倍数平板，噬菌斑数计数为330个左右，根据公式计算效价为：3.3x 1016pfu。

5、噬菌体12肽库的筛选

⑴筛选前一天在96孔板中按照40μg/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，4℃孵育包板过夜。

⑵弃去包被液，加入1％BSA，37℃封闭2h；加入噬菌体12 肽库(滴度约为2x1011pfu)，37℃孵育1h。

⑶TBST(0.1％)冲洗6次，1min/次。

⑷用1ml甘氨酸洗脱缓冲液(PH2.2)冰上洗脱10min，加入150μl 洗脱液Tris-HCL(PH9.1)中和，收集上清，即为第一轮筛选得到的噬菌体。

⑸回收噬菌体的滴定(方法同4)

⑹回收噬菌体的体外扩增：将回收的噬菌体洗脱液加入含有 1μg/ml Tet的LB培养液40ml中，并加入过夜培养的ER2738宿主菌 1ml，于37℃、250rpm振荡培养4-6h；将培养物全部移入离心管中， 4℃、10000rpm离心5min；将上清移入新的三角锥形瓶中，加入约 1/6体积的PEG/NaCl溶液，混匀后4℃静置过夜；将混合液4℃、 10000rpm离心15min，弃去上清，用1mlTBS重悬沉淀，4℃、10000rpm 离心3-5min，将上清移入新的EP管，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，冰浴1h；4℃、10000rpm离心15min，弃去上清，以200μl 0.02％ NaN3溶液重悬沉淀物，微离心后取上清，即为第一轮回收扩增的噬菌体，用于滴定和下一轮筛选。

⑺扩增后噬菌体数量的滴定(方法同4)

⑻取扩增后的噬菌体5x1010pfu，用于下一轮的筛选。第二、三轮筛选洗涤液Tween-20浓度依次提高到0.5％和1.0％，孵育时间依次减少至45min和30min，并且洗涤次数增加至8次和10次，其余条件、步骤与第一轮相同。结果如图1所示。

表一 3轮筛选对阳性噬菌体克隆的富集效应

结果显示：第一轮筛选得率约为6x10^-8，第二轮筛选得率约为 5.4x10^-6，第三轮筛选得率约为7.8x10^-5，3轮筛选后阳性噬菌体富集了约1300倍。

6、噬菌体单克隆的挑取

⑴将第3轮筛得的噬菌体测定滴度。

⑵将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分成1ml每等份，挑取分离良好的单个蓝色噬菌斑到上述1ml培养管中进行扩增，250rpm/min，37℃摇床培养4h。

⑶培养物转入微量离心管中，10000r离心5min。

⑷用移液器将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，置于4℃贮存。

7、ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力

⑴96孔板中按照1μg/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，4℃孵育包板过夜；

⑵PBS稍洗，1％PBS-BSA封闭2h后，加入滴度约1010pfu的噬菌体，37℃孵育2h，PBST-0.05％洗6次，1min/次；

⑶加HRP-anti M13抗体，37℃孵育1h，PBST-0.05％洗3次， 1min/次；

⑷用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数。随机挑取噬菌体原库蓝斑作为对照，P/N>2.1为阳性。

噬菌体肽库经过连续三轮筛选后,随机挑选30个噬菌体克隆,分别命名为phage-1、phage-2、phage-3、…、phage-30。噬菌体原库蓝斑作为对照,利用ELISA初步鉴定噬菌体克隆对HR4单克隆抗体的亲和力，检测图片如图2、图3所示。

当P/N(OD克隆/OD随机对照克隆)>2.1时，即可说明此克隆对HR4单克隆抗体有高亲和力。ELISA结果显示P/N>2.1的阳性克隆有23个。

8、扩增噬菌体单克隆

⑴将大肠杆菌ER2738单菌落接种到20ml LB培养基中，摇床培养至对数生长前期(OD600值达到0.485左右，即37℃，250rpm培养3-4h)；

⑵将上一步鉴定的噬菌体阳性克隆保存液取10ul加入ER2738 菌液，37℃、250rpm培养3.5h，10000rpm离心5分钟，上清加入 1/6体积的20％PEG/NaCl室温沉淀1h；

⑶10000rpm离心10分钟，去上清，沉淀用1ml TBS重悬，4℃保存备用。

9、提取噬菌体单链DNA、测序

⑴取噬菌体克隆扩增液500μL，10000转离心15s，去沉淀(清除残余大肠杆菌ER2738)；

⑵加200μL 20％PEG/NaCl，混匀室温放置15min以上， 10000rpm离心10min，取沉淀；

⑶用100μL TE(PH＝8.0)溶解沉淀，加100μL Tris饱和酚，上下颠倒1min，再静置1min，再上下颠倒约1min混匀；

⑷10000rpm离心5min，取上层加入300μl 3mol/L乙酸钠:无水乙醇(1:25)沉淀DNA，混匀后静置约30min，10000rpm离心10 min，去上清，加100μL 70％乙醇，10000rpm，10min，吸去上清，风干残余乙醇，用40μL TE(PH＝8.0)溶解，琼脂糖凝胶电泳鉴定；

⑸用肽库自带测序引物-96gⅢ引物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

测序引物为:5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’距目的片段相距96bp。

10、推导获得外源多肽核苷酸及氨基酸序列

测定出的序列是与引物-96Ⅲ连接的随从链,先找出引物-28gⅢ (5’-GTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3’)的位置，再找到引物-28g Ⅲ后6个碱基的Egal酶切位点CGGCCG；从Egal酶切位点向后数 10个碱基，就可以找到12肽的插入序列；插入序列后是KPnl酶切位点GGATCC。阅读出随从链5′HO端到3′端的插入序列，并把三连密码子分开，按照A-T、G-C互补原则，得到模板链的碱基序列 (换方向)按照三联密码子翻译成多肽。

11、氨基酸序列的比对分析

利用Primer软件将插入序列的DNA转换成氨基酸序列，初步分析比对各个序列之间是否有共有序列。

测序结果显示：23个噬菌体阳性单克隆插入的外源多肽序列为一条不同的序列，我们将这条序列分别命名为PT2。

用肽库自带测序引物-96gⅢ引物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

测序引物为:5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’距目的片段相距96bp。用DNAStar软件分析测序获得的噬菌体外源基因，以下为PT2的序列信息：

CTTTGGCCGTTATGTAATCAGCAATAAGTTGAAATGTGGTAATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCAGTAATAAATGTGTCCCGTAGTCGATTTATAACGTAGATTTTACTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCATAAAATCGCATAAGGTAATTCACAACATTAAAGTTGAAAATAAAACCATCTCAAGCCAAATTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCTACTTTTAAGTTTACGTTGAGTTATCGTCAGGTGCATGGTGGAGGTTCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATCATTACTG ACGTCTGGGAGACGCCAAATTTCAGGTGT

两标志性酶切位点之间序列为：

ACTTTTAAGTTTACGTTGAGTTATCGTCAGGTGCAT

即噬菌体外源核苷酸序列为:

5’-ACTTTTAAGTTTACGTTGAGTTATCGTCAGGTGCAT-3’

转换为氨基酸序列为：TFKFTLSYRQVH

12、阳性噬菌体克隆与HR4单抗特异性结合的分析

⑴96孔板中按照1μg/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，人CEA 单抗和BSA分别包板，4℃孵育包板过夜；

⑵PBS稍洗，1％PBS-BSA封闭2h后，分别加入滴度约1010pfu 的纯化噬菌体PT2,纯化噬菌体PT2,对照噬菌体(第一轮淘洗中未结合的噬菌体)，37℃孵育2h，PBST-0.05％洗6次，1min/次；

加HRP-anti M13抗体，37℃孵育1h，PBST-0.05％洗3次，1min/ 次；用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数。

结果如图4所示，实验结果表明phage-PT2可以特异性的与人 HR4单克隆抗体结合，而不与人CEA单抗和BSA结合。

根据以上实验结果，确定多肽PT2模拟了HR4表位，为进一步的疫苗构建工作打下基础。

13、HR4表位模拟肽疫苗的构建

1.HR4的模拟表位PT2的人工合成

多肽表位PT2(TFKFTLSYRQVH)，PT2(TFKFTLSYRQVH) 由辉源生物科技(上海)有限公司采用多肽固相合成技术进行化学合成，纯度95％以上。同时合成对照多肽。

2.PT2与HR4单抗特异性结合实验

⑴以2mg/L PT2和对照多肽包被96孔酶联板，每孔100μl，4℃孵育过夜。

⑵倾去包被液，于每孔中加入封闭液(5mg/L BSA,0.1M NaHCO3,pH8.6),4℃封闭2h。

⑶倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

⑷将人HR4单克隆抗体，人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中(100ng/100μl/well),室温反应1h。TBST洗6次，各孔分别加入 HRP标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠IgG，室温孵育1h。TBST 洗3次，1min/次。用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数。

3.构建PT2-CTB-脂质体复合物，以0.9％无菌氯化钠溶液溶解多肽和CTB，然后加入相同体积的脂质体Lipofect，使每200μl含多肽 100μg，含CTB 5μg，4℃静置过夜，次日晨取出，升至室温(25℃)，备用。

14、疫苗免疫效果鉴定

1实验材料和仪器

1.1实验材料

雄性Wistar大鼠30只，体重250～300g(北京华阜康)。

1.2主要试剂

1.3仪器

2.实验方法及结果

2.1变应性鼻炎(AR)动物模型构建及分组

适应环境7d后,所有实验组均于第1天给予腹腔注射OVA生理盐水溶液0.5ml(100mg/ml)和Al(OH)3胶体(40mg/ml)0.5ml。第8天腹腔加强注射OVA生理盐水溶液0.5ml(10mg/ml)和Al(OH) 3胶体(40mg/ml)0.5ml。对照组于第1天和第8天各给予腹腔注射生理盐水1ml。第22天起，实验组每侧鼻腔给予5％OVA生理盐水溶液25μl点鼻，每日1次，连续1周，之后每周2次給予5％OVA 生理盐水溶液25μl点鼻，直至第85天。对照组自第22天起连续1 周和至第85天的2次/周的生理盐水点鼻。

2.2动物实验分组

S1、PT2疫苗治疗组：常规OVA致敏动物，分别在14、21天经鼻给予疫苗；

S2、对照疫苗治疗组：常规OVA致敏动物，分别在14、21天经鼻给予对照疫苗；

S3、PT2疫苗预防组：经鼻给予疫苗一周后，常规OVA致敏动物；

S4、对照疫苗预防组：经鼻给予对照疫苗一周后，常规OVA致敏动物；

S5、HR4拮抗剂治疗组：常规OVA致敏动物，分别在0,7天经鼻给予HR4受体拮抗剂；

S6、对照组(单纯AR大鼠)

S7、正常大鼠

2.3取材

将Wistar大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.3～0.35g/Kg)进行麻醉, 麻醉完全后,将大鼠固定在手术台上,然后迅速开胸暴露心脏,从心脏采血5ml，采集的血液在室温下静置2h,离心1500g，15min,收集血清于干净的EB管中-20℃冷冻保存。

另外取支气管灌洗液并获取鼻腔粘膜组织。

2.4ELISA检测血清与HR4的结合

S1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。

S2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

S3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中加入含有相当于1mg 总蛋白的待测样本，再加样本稀释液至50μL；空白对照孔不加。

S4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

S5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

S6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。

S7、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

S8、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

S9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50 μL，平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37℃避光显色 15min。

S10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。

S11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。

S12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。

结果如图6所示，ELISA检测血清与HR4的结合，实验结果表明与对照疫苗及正常大鼠相比，PT2疫苗治疗及预防组均可以产生特异性抗体并与人HR4结合。

2.5ELISA检测血清中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平

实验方法同上述2.4。

如图7所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT2疫苗治疗及预防组IFN-r,IL-2表达水平均上调，IL-6表达水平下调。

2.6Real-time PCR检测血细胞中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平

RNA提取

①离心收集细胞，加入1ml Trizol液。

②室温放置5分钟。

③加入200μl氯仿，充分倒置混匀，14000rpm,4℃离心15min。

④小心吸出上清至新的Eppendorf管中，每管加入-20℃预冷的异丙醇600μl，室温放置30min。

⑤14000rpm,4℃离心10min，弃上清。

⑥每管加入1ml 75％的乙醇，弹起沉淀，12000rpm离心10min，弃上清。

⑦重复步骤6一次。

⑧室温静置5min干燥。

⑨每管加入20μl RNase-free水溶解5min。

⑩待沉淀完全溶解后，每管取出1μl溶解于9μl RNase-free水中.

采用紫外分光光度法测定RNA在260nm和280nm的吸光度，计算RNA含量(260nm的OD＝1相当于RNA含量40μg/ml)。各样本总RNA的A260/A280的值均在1.8－2.1范围内。取1μl样品，进行1％琼脂糖电泳。80V，10-15分钟，凝胶成像系统拍照。

⑵荧光定量PCR检测

①在0.5mL离心管中制备以下反应混合物：

RNA5μg，引物(oligo dT)(1μg/μl)1μL，DEPC水至13μL

②将上述混合物置于PCR仪中，65℃10分钟，立即冰上冷却 2分钟，短暂离心收集液体。

③在每个退火反应混合物中加入

混匀上述混合物(20μL)，短暂离心收集液体。

④42℃孵育60min。

⑤70℃作用10min(降解RNA链)。

⑥以上产物为模板，按照试剂盒说明书步骤进行RT-PCR实验。

⑦取0.5ul RT产物运用Premix Ex TaqTM(TaKaRa)进行实时定量PCR反应。反应条件如下：

Thermal Cycling

数据处理：

Folds＝2^–ΔΔCt

其中ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1:处理样品待测基因的临界循环数

Ct2:处理样品内参基因的临界循环数

Ct3:对照样品待测基因的临界循环数

Ct4:对照样品内参基因的临界循环数

如图8所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT2疫苗治疗及预防组IFN-r,IL-2表达水平均上调，IL-6表达水平下调。

2.7ELISA检测支气管灌洗液与HR4的结合

实验方法同2.4。

如图9所示，实验结果表明与对照疫苗及正常大鼠相比，在气道中，PT2疫苗治疗及预防组均可以产生特异性抗体并与人HR4结合。

2.8Real-time PCR检测黏膜组织中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平

实验方法同2.4。

如图10，实验结果表明与对照疫苗相比，,PT2疫苗治疗及预防组IFN-r,IL-2表达水平均上调，IL-6表达水平下调。

2.9Western-blotting检测黏膜组织中IFN-r,IL-2，IL-6表达水平

①蛋白裂解物的获取:从液氮中取出组织块，加入200ul裂解液，研磨至组织无肉眼可见碎片；吸取组织悬液至EP管中，用200ul裂解液冲洗研磨器，把组织混悬液尽量都冲下来，吸入EP管中，重复一次，共600ul组织混悬液，冰上裂解1h；4℃，20,000g离心30分钟，取上清即为总蛋白，-80℃保存。

②SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白：配制分离胶为10％的 SDS-PAGE凝胶。取32μl总蛋白+8μl的5×Loading Buffer经煮沸 3分钟后立即冰置3分钟后，上样。100V电压电泳。

③电转膜：电泳分离后的蛋白电转至硝酸纤维素膜上(Millipore, USA)，350mA,120min，在4℃进行。

④封闭：将硝酸纤维素膜做标记以区分正反面及左右侧，浸入 Blotto封闭液中，室温摇床上轻轻摇动1.5小时。

⑤与一抗的结合：在摇床上4℃轻轻摇动过夜。

⑥在1×TBST中摇动浸洗3次×5分钟，洗去非特异结合的一抗。

⑦与二抗的结合：将上膜和下膜分别浸入含相应HRP-羊抗兔IgG 的Blotto中，室温轻轻摇动2小时。

⑧在1×TBST中摇动浸洗3次×5分钟，洗去非特异结合的二抗。

⑨最后用Western–ECL,Enhanced Chemiluminescence Substrate(PerkinElmer，NEL100001EA)检测，显影。

如图11所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT2疫苗治疗及预防组IFN-r，IL-2表达水平均上调，IL-6表达水平下调。

综上，本发明的有益效果如下：本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对 HR4单抗的亲和力，测序获得1条多肽，其氨基酸序列为： TFKFTLSYRQVH，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，筛选获得的人HR4 单克隆抗体特异性多肽，进而构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4 表位模拟肽疫苗，对于在临床上治疗肥大细胞的趋化以及变应性鼻炎及变应性气道炎症等应变性疾病(过敏性疾病)具有重要意义，为进一步的HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种噬菌体随机十二肽库筛选HR4表位模拟肽，其特征在于，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：TFKFTLSYRQVH。

2.根据权利要求1所述的HR4表位模拟肽疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、HR4的模拟表位PT2的人工合成，按照上述的多肽表位氨基酸序列结果，采用固相合成法合成多肽表位PT2(TFKFTLSYRQVH)合成由辉源生物科技(上海)有限公司，纯度为98％以上，同时合成对照多肽；

S2、PT2与HR4单抗特异性结合实验，以2mg/L PT2和对照多肽包被96孔酶联板，每孔100μl，4℃孵育过夜，倾去包被液，于每孔中加入封闭液，4℃封闭2h，倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体，将人HR4单克隆抗体，人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中，室温反应1h，TBST洗6次，各孔分别加入HRP标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠IgG，室温孵育1h。TBST洗3次，1min/次，用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数；

S3、构建PT2-CTB-脂质体复合物，以0.9％无菌氯化钠溶液溶解多肽和CTB，然后加入相同体积的脂质体Lipofect，使每200μl含多肽100μg，含CTB 5μg，4℃静置过夜，次日晨取出，升至室温(25℃)，即可。

3.根据权利要求2所述的HR4表位模拟肽疫苗，其特征在于，所述HR4表位模拟肽疫苗用于治疗变应性的过敏性疾病。