CN1560073A - 碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽及其筛选与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽生物技术领域。本发明的目的在于提供一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽及其筛选方法与用途。本发明所述的一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽，其多肽序列为Leu Pro Pro Gly His Phe Lys，即LPPGHFK。本发明利用噬菌体展示技术，通过与bFGF单克隆抗体筛选阳性克隆，采用梯度洗脱，最终在随机7肽库中得到7个氨基酸构成的bFGF抗原表位模拟短肽。本发明可用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂、肿瘤导向药物。

Description

碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽及其筛选与用途

技术领域

本发明属于多肽生物技术领域。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是广泛存在于人和动物体内具有多种生物学活性的一种重要的多肽生长因子，也是成纤维细胞生长因子(FGF)家族目前已知的19个成员中发现最早、研究最多的因子。它通过自分泌或/和外分泌形式与其受体结合，对多种细胞有不同程度的促有丝分裂作用，在促进血管形成、创伤愈合、胚胎发育、矽肺形成以及在肿瘤形成过程中发挥重要作用。近年研究发现bFGF在恶性肿瘤组织中有强烈表达，并与肿瘤病理分级、分期呈正相关，同时血清中bFGF水平亦明显增高，这提示bFGF表达增强与肿瘤恶性程度增高、侵袭力增强有密切关系，可作为恶性肿瘤的早期诊断与预后指标。bFGF在血管新生肿瘤形成过程中的作用尤其引起研究者们的重视。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)在20世纪80年代中期产生，Smith Georgep第一次描述了在丝状噬菌体表面展示外源多肽片段的原理。该办法主要是用DNA重组技术将大量的多肽编码顺序导人噬菌体的衣壳蛋白基因中，从而使表达出的各种多肽以与PIII或PVIII蛋白融合的形式出现在噬菌体的表面，即首先构建噬菌体多肽展示文库。近年来，在识别蛋白或受体的小肽顺序的鉴定上、在结构和功能上模拟已知蛋白的多肽模拟物的研究上、在筛选鉴定能与人类病毒、细胞、组织及肿瘤等生物靶系统结合的多肽研究日益增加。噬菌体多肽展示库提供了这样的可能胜：可从多肽展示库中分离出一个能与重要蛋白如与炎症有关的抗体、与介导细胞粘着的整合蛋白等特异性结合已具有相应生物活性的多肽。特别是有可能发现一些多助配基而导致多肽模拟药物的产生。

噬菌体肽库是噬菌体展示技术的一个非常重要的分支。肽库是由大量带有不同肽段的单个噬菌体组成的重组噬菌体库。噬菌体肽库的基本原理是将随机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上形成融合蛋白而展示出来，并利用噬菌体能大量复制的特点，得到不同重组噬菌体的多拷贝，为不同的研究提供有利的工具。通过目标受体来筛选与其相互作用的噬菌体肽，经过洗脱、扩增，从而富集到特异性的重组噬菌体，并分析所筛选到的肽的结构和序列，为蛋白质分子之间(如抗原与抗体、受体与配体、酶与底物)的相互作用机理提供理论依据。噬菌体肽库技术应用范围很广，可用于表位的确定、描述蛋白之间的作用、确定非蛋白配体的蛋白模拟表位、受体的活性作用分子筛选、酶底物的确立、分析DNA结合蛋白等，随着生物技术的发展，其应用领域也越来越广，其技术也得到了充分发展。

Baird等1988年发现含有bFGF的25-69和24-121位氨基酸残基的两个短肽序列可竞争bFGF与受体结合。更小的短肽定位于bFGF的35-51和107-116位氨基酸残基的两段区域，也可竞争bFGF与受体结合。Kurokawa等1989年研究证明，bFGF亲受体位点在105-115位氨基酸序列上。Ray等1997年认为，bFGF的68-77位氨基酸序列为bFGF在神经祖细胞上与受体结合的表位。因此，如果能用噬菌体展示技术，研究模拟小肽竞争与bFGF受体结合或小分子抗原肽作为疫苗，针对bFGF而产生抑制作用，将具有巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽。

本发明所述的一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽，其多肽序列为Leu Pro Pro Gly His Phe Lys，即LPPGHFK。

本发明的另一目的在于提供一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽的筛选方法。

本发明所述的一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽的筛选方法，包括以下步骤：

A.将稀释的抗碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体包被ELISA板，4℃过夜，加入BSA封闭缓冲液4℃封闭2-3小时，用TBS-Tween(Tris缓冲液-吐温)洗涤，吸干液体；

B.每孔加入用TBS-吐温溶液稀释的噬菌体随机七肽库，使加入噬菌体数量为2×10¹¹pfu/100μl，室温下摇晃5～7小时，吸去液体，用TBS-吐温溶液洗去非特异性结合的噬菌体；

C.用TBS-吐温溶液稀释使含碱性成纤维细胞生长因子800ng/ml，进行竞争洗脱，收集洗脱液；

D.收集的噬菌体洗脱液经计数、扩增后，重复进行A至C步骤的筛选，在第二轮和第三轮筛选中，改变TBS-吐温溶液中的吐温浓度，其余同第一轮筛选；

E第三轮筛选的噬菌体扩增后随机挑选多个克隆进行点杂交检验和DNA测序，得到与抗碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的的噬菌体多肽，鉴定多肽序列为Leu Pro Pro Gly His Phe Lys，即LPPGHFK。

点杂交：把每轮筛选洗脱的噬菌体作单个克隆扩增，用点杂交的方法检验阳性率。用野生型噬菌体vesm13作阴性对照。与阴性对照颜色一致的克隆可视为阴性。点杂交结果显示，除第一轮筛选第一次洗脱3个克隆与阴性结果颜色相近外，其余的都比阴性对照颜色深，表明噬菌体上的随机态能与抗bFGF单抗GF22结合。

测序：经三轮筛选后，取最后一次洗脱的10个噬菌体克隆扩增后，提取单链DNA，用引物5’HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’进行测序。测序结果发现该抗原表位有很保守的氨基酸序列LPPGHFK，其中PPGHFK与bFGF上22-27位氨基酸完全一致。表明抗bFGF单抗GF22可结合此抗原表位。

竞争ELISA：取含有抗原表位模拟短肽LPPGHFK的噬菌体克隆作竞争ELISA，确定此短肽与抗bFGF单抗GF22的结合为抗体-抗原的方式。用野生型噬菌体vesm13作阴性对照，由于在其gIII蛋白N-端没有GF22的抗原表位，vesm13与bFGF没有竞争与GF22结合。结果表明，含有序列LPPGHFK的噬菌体克隆表现出明显的竞争结合曲线。

噬菌体阳性克隆序列的免疫原性分析：用带有序列LPPGHFK的噬菌体克隆进行免疫。阳性对照小鼠用bFGF免疫。噬菌体的免疫量为10ng bFGF(1012个分子)。由于噬菌体和bFGF的免疫量大致都在同一个摩尔数量级，所以免疫效果可作比较。结果表明，以免疫bFGF小鼠的血清抗bFGF的平均活性作为100％，则免疫含有LPPGHFK短肽的小鼠血清相当于原bFGF的11％，免疫vesm13小鼠血清抗bFGF的平均活性为0。在免疫bFGF的小鼠中90％抗bFGF活性超过对照，免疫带有LPPGHFK序列阳性噬菌体的小鼠抗bFGF活性有40％。

细胞免疫组化及免疫荧光分析：用细胞免疫组化及免疫荧光技术，对筛选所得的能模拟bFGF抗原表位(决定簇)的噬菌体短肽LPPGHFK与NIH 3T3细胞表面的bFGF受体进行间接的亲和性分析。结果表明，含有LPPGHFK七肽的噬菌体克隆能结合到NIH 3T3细胞表面的bFGF受体，此噬菌体能作为检测FGF受体的特异标记。免疫荧光与细胞免疫组化的结果一致，表明所检测的噬菌体阳性克隆序列免疫原能结合NIH 3T3细胞表面的bFGF受体。

以上鉴定实验表明，本发明所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽，可以作为一个较佳的抗原以诱发机体产生抗bFGF活性。

本发明的另一目的是提供该碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽的用于制备多肽疫苗或者肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物的用途。

抗体并不总是对应于一个蛋白中的线性氨基酸顺序，而是能识别一个间断的决定簇所折叠的蛋白的特殊的构型。用某种抗体去筛选一个噬菌体文库，产生的多肽将模拟折叠蛋白的结构。这些配基被称为模拟簇。一个能展示出适当构型的小肽，可以替代天然蛋白的功能。随机噬菌体展示多肽文库，结合一些其他方法可以提供非常好的程序去研究蛋白的有效的模拟物以及有活性的最小的肽段顺序，如多肽激素EPO和TPO的模拟多肽对人类疾病有很好的治疗作用，14个氨基酸的环形的TPO模拟多肽的二聚体有着332个氨基酸TPO的活性，而仅13个氨基酸构成的模拟配基可模拟162个氨基酸组成的EPO的性质。本发明利用噬菌体展示技术，通过与bFGF单克隆抗体筛选阳性克隆，采用梯度洗脱，最终在随机7肽库中得到了一种能与中和bFGF活性的单克隆抗体GF22结合的保守序列，即仅7个氨基酸构成的bFGF抗原表位模拟短肽。通过此短肽，可以在bFGF分子上找出该抗原决定簇的位点，分析其序列，以及结构与功能的关系；同时检验这种抗原决定簇能否作为一种免疫抗原诱发机体产生能与bFGF结合的抗体，以及该抗原决定簇是否直接结合到bFGF受体上，寻找比天然bFGF分子有更强抗原性的多肽序列，为进行多肽疫苗的设计提供理论和实验依据。

将序列LPPGHFK与人源bFGF分子作比较，在天然bFGF分子上所对应的序列是21-27位氨基酸FPPGHFK，该定位序列高度保守。两序列非常相似，只是以一个亮氨酸代替了天然分子上的苯丙氨酸，而亮氨酸与苯丙氨酸的性质类似，都是一个大的疏水氨基酸，所以，可以认为近似序列LPPGHFK所引起的免疫反应能反映由bFGF分子上相应序列所引起的免疫反应。

BFGF的生物学效应，包括在病理条件下参与多种肿瘤的生长，促进肿瘤血管的新生，加速肿瘤细胞的转移过程，所以抑制bFGF的生物活性有可能抑制肿瘤的生长和发展。然而，重组抗体用于治疗的缺点是抗体的异源性和用量太大，而噬菌体展示技术筛选到具有抑制bFGF生物学活性的单克隆抗体个体型抗原表位，并具有竞争性抑制bFGF受体结合或具有疫苗特点的模拟短肽诱导体内产生抗bFGF抗体，是抑制bFGF生物学活性的合理途径。

bFGF发挥生物活性的关键是与其受体结合，阻碍bFGF与其受体结合就能完全抑制bFGF的活性。能中和bFGF生物活性的单克隆抗体很大程度上可能是结合在bFGF受体结合区域。所以，用该抗体作为目标筛选到的短肽就很有可能可以直接结合到bFGF受体上。本发明所述的能模拟bFGF抗原决定簇的噬菌体短肽，与bFGF受体进行亲和性分析，对于以bFGF受体为目标，诊断、预测肿瘤的发生和发展、探讨小分子短肽作为肿瘤血管生长抑制剂和肿瘤导向药物等研究都有十分重要的参考价值。

具体实施方式

一、碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽(LPPGHFK)的筛选

1、材料与试剂

(1)抗bFGF单克隆抗体GF22，购自Calbiochem公司；

(2)偶联辣根过氧化物酶(HRP)-抗噬菌体抗体，购自Pharmacia公司；

(3)偶联辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠IgG抗体，购自华美公司；

(4)噬菌体随机七肽库，购自New England Biolabs公司，复杂度为2.8×10⁹。

测序引物购自基因公司；

(5)昆明小鼠，购自广州第一军医大学动物中心；

(6)PEG8000，购自华美公司；

(7)硝酸纤维膜、IPTG/X-gal，购自天象人公司；

(8)96孔酶标板，购自Greiner公司；

(9)重组人bFGF(155氨基酸)，暨南大学生物工程研究所提供。

2、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗原表位模拟短肽的筛选方法

A.将稀释的抗bFGF单克隆抗体包被ELISA板，10μg/ml，100μl，4℃过夜，加入BSA封闭缓冲液200μl，4℃封闭2～3小时，用灭菌的TBS-0.1％吐温溶液洗3次，每次3分钟，吸干液体；

B.每孔加90μl TBS-0.1％吐温溶液和10μl噬菌体随机七肽库，使加入噬菌体数量为2×10¹¹pfu/100μl，室温下摇晃7小时，吸去液体，用TBS-0.1％吐温溶液洗涤10次，每次2分钟，以洗去非特异性结合的噬菌体；

C.用TBS-0.1％吐温溶液(pH7.4)稀释使含bFGF 800ng/ml，进行竞争洗脱2次，每次1小时，收集洗脱液；

D.收集的噬菌体洗脱液经计数、培养液扩增后，重复进行A至C步骤的筛选，在第二轮和第三轮筛选中，除洗涤时用TBS-0.5％吐温溶液，其余同第一轮筛选；

E.第三轮筛选的噬菌体扩增后随机挑选多个克隆进行点杂交检验和DNA测序，得到与抗bFGF单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的的噬菌体多肽。

二、碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽(LPPGHFK)的鉴定

1、点杂交

用点杂交的方法检验阳性率，把每轮筛选洗脱的噬菌体作单个克隆扩增：3ml的LB培养液中加入30μl的培养过夜的TG1培养液，挑选单个噬菌体克隆到培养液中，37℃振摇5小时，1000rpm离心10分钟。上清液移入另一离心管中，用20％PEG8000/NaCl沉淀噬菌体，把噬菌体溶于50μl TBS。把1μl噬菌体溶液点在硝酸纤维膜上的小格，室温干燥。用BSA封闭液封闭1小时，加入1∶5000的抗bFGF单抗GF22，4℃放置3小时。用1∶1000 HRP-羊抗鼠IgG抗体检测，DAB显色。用野生型噬菌体vesm13作阴性对照。与阴性对照颜色一致的克隆可视为阴性。

第一轮和第二轮筛选共6次洗脱，每次洗脱扩增20个克隆，最后一轮筛选每次洗脱扩增30个克隆，共扩增210个克隆。点杂交结果显示，除第一轮筛选第一次洗脱3个克隆与阴性结果颜色相近外，其余的都比阴性对照颜色深，表明噬菌体上的随机态能与GF22结合。

2、测序

经三轮筛选后，取最后一次洗脱的10个噬菌体克隆扩增后，提取单链DNA，用引物5’HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’进行测序。

测序结果发现该抗原表位有很保守的氨基酸序列LPPGHFK，其中PPGHFK与bFGF上22-27位氨基酸完全一致。表明抗bFGF单抗GF22可结合此抗原表位。

3、竞争ELISA

取含有抗原表位模拟短肽LPPGHFK的噬菌体克隆作竞争ELISA，确定此短肽与抗bFGF单抗GF22的结合为抗体-抗原的方式。用野生型噬菌体vesm13作阴性对照，由于在其gIII蛋白N-端没有GF22的抗原表位，vesml3与bFGF没有竞争与GF22结合。

结果表明，含有序列LPPGHFK的噬菌体克隆表现出明显的竞争结合曲线。

4、噬菌体阳性克隆序列的免疫原性分析

用带有序列LPPGHFK的噬菌体克隆进行免疫。阳性对照小鼠用bFGF免疫。噬菌体的免疫量为10ng bFGF(10¹²个分子)。由于噬菌体和bFGF的免疫量大致都在同一个摩尔数量级，所以免疫效果可作比较。

结果表明，以免疫bFGF小鼠的血清抗bFGF的平均活性作为100％，则免疫含有LPPGHFK短肽的小鼠血清相当于原bFGF的11％，免疫vesml3小鼠血清抗bFGF的平均活性为0。在免疫bFGF的小鼠中90％抗bFGF活性超过对照，免疫带有LPPGHFK序列阳性噬菌体的小鼠抗bFGF活性有40％。

5、细胞免疫组化及免疫荧光分析

用细胞免疫组化及免疫荧光技术，对筛选所得的能模拟bFGF抗原表位(决定簇)的噬菌体短肽LPPGHFK与NIH 3T3细胞表面的bFGF受体进行亲和性分析。

结果表明，含有LPPGHFK七肽的噬菌体克隆不能结合到NIH 3T3细胞表面的bFGF受体，此噬菌体不能作为检测FGF受体的特异标记。免疫荧光与细胞免疫组化的结果一致，表明所检测的噬菌体阳性克隆序列免疫原不能结合NIH3T3细胞表面的bFGF受体。

三、本发明所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽的氨基酸序列表(用Patentln Version 3.2生成，文件为bFGF抗原表位模拟短肽.ST25)

                     SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽及其筛选与用途

<130>

<141>2004-03-08

<160>1

<170>Patentln version 3.2

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>噬菌体(M13 Phage)

<400>1

Leu Pro Pro Gly His Phe Lys

1                5

Claims (4)

1、碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽，其特征在于：多肽序列为LeuPro Pro Gly His Phe Lys，即LPPGHFK。

2、如权利要求1所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.将稀释的抗碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体包被ELISA板，4℃过夜，加入BSA封闭缓冲液4℃封闭2～3小时，用TBS-吐温溶液洗涤，吸干液体；

B.每孔加入用TBS-吐温溶液稀释的噬菌体随机七肽库，使加入噬菌体数量为2×10¹¹pfu/100μl，室温下摇晃5～7小时，吸去液体，用TBS-吐温溶液洗去非特异性结合的噬菌体；

C.用TBS-吐温溶液稀释使含碱性成纤维细胞生长因子800ng/ml，进行竞争洗脱，收集洗脱液；

D.收集的噬菌体洗脱液经计数、培养液扩增后，重复进行A至C步骤的筛选，在第二轮和第三轮筛选中，洗涤时改变TBS-吐温溶液中的吐温浓度，其余同第一轮筛选；

E.第三轮筛选的噬菌体扩增后随机挑选多个克隆进行点杂交检验和DNA测序，得到与抗碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的的噬菌体多肽，鉴定为如权利要求1所述的抗原表位模拟短肽。

3、根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：第一轮筛选时的TBS-吐温溶液中吐温浓度为0.1％，第二轮和第三轮筛选时的用于洗涤的TBS-吐温溶液中吐温浓度为0.5％。

4、如权利要求1所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽用于制备多肽疫苗或者肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物的用途。