CN100417662C - 无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用，属于生物医学技术领域。本发明通过常规的生物化学手段，从无指盘臭蛙皮肤分泌液中分离纯化得到胰岛素释放促进肽并测定其序列，按照所得的序列合成该多肽。无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽是一种单链多肽，分子量2632.3道尔顿，等电点10.32，多肽全序列为：苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱苷酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-甘氨酸。本发明具有很好的促进胰岛素释放的作用，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可作为制备治疗糖尿病药物的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
糖尿病是多遗传基因和环境因素引起的以糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，而导致多系统，多脏器功能损害的一种多发的内分泌，代谢性疾病。统计显示，我国80年代＜1％，目前升到3.6-5％，其中90％以上(约3800万人)属II型糖尿病。截至2000年，全球共有糖尿病患者1.35亿人，预计2025年将增加到2.99亿。糖尿病本身不可怕，可怕的是并发症，糖尿病并发症包括癌、睡眠呼吸暂停、抑郁、心肌梗死、外周血管病、高血压和最常见的II型糖尿病。II型糖尿病又称“非胰岛素依赖型糖尿病”，主要病理表现为胰岛素抵抗和由胰岛细胞功能失调所致的胰岛素分泌相对不足，形成持久的高血糖，并可产生多种致命性并发症。其临床表现症状大多与机体产生胰岛素抗性、自身分泌的胰岛素少或滞后等有关。至今为止，该病尚无根治的办法.它不仅会加重患者经济负担，还可使患者致残、早亡。
目前，世界上治疗II型糖尿病以磺酰脲类药物为主，辅以双胍类、a-糖苷酶抑制剂等药物。但是，由于磺酰脲类药物的副作用大，长期使用会因为胰岛素过度分泌而导致胰岛β细胞衰竭，服用此类药物的糖尿病人中，每年有10％的病人会因治疗失效而改用胰岛素等其他类药物。而且目前的药理研究和治疗方法尚不能涵盖该疾病所涉及的所有代谢性缺陷。自1984年美国波士顿总医院发现人的肠道内存在一类促进胰岛素分泌的多肽(统称GLP-1)以来，为糖尿病的治疗提供新的方向。与目前的糖尿病治疗药物，尤其是磺酰脲类药物相比，GLP-1类似物具有一些新的作用靶点，如延缓胃排空，抑制胰高血糖素产生，增加胰岛素的生物合成及β细胞数量等，已成为治疗II型糖尿病的新亮点。目前，exenatide已进入注册前阶段，DPP-IV抑制剂亦显示对II型糖尿病具有潜在的治疗作用。相信在不久的将来，随着GLP-1用药剂量的确定及给药方式的进一步完善，无疑将成为II型糖尿病治疗的新手段。
现阶段产生先导化合物的主要方法还是依赖于对大量化合物进行随机筛选。而中国博大的多物种天然生物资源是结构多样性小分子有机化合物的重要来源，其中一些生物活性物质早已被中医记载和采用。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，除了具有生物碱等一系列有机药用小分子外，两栖类皮肤还含有大量的活性肽类物质，这是新药发现的一个重要来源。
发明人将本发明的无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较未发现有任何相同的多肽。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种新的具有促进胰岛素释放的无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽采用常规方法制备，即：乙醚刺激无指盘臭蛙，收集的皮肤分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经一系列的生物化学手段分离纯化得到该多肽，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构，根据所得到的氨基酸序列合成该多肽。采用飞行时间质谱法测定分子量，等电聚焦测定等电点，自动氨基酸测序仪确认氨基酸序列结构。
无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽为我们从中国两栖类动物无指盘臭蛙皮肤分泌液中分离得到的一种单链多肽，分子量2632.3道尔顿，等电点10.32，多肽全序列为：苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱苷酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-甘氨酸；或：
Phe Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu
1 5 10 15
Phe Cys Lys Ile Thr Arg Lys Gly
20
本发明的无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽是从天然生物资源得到的产物，具有很好的促进胰岛素释放的作用，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可作为制备治疗糖尿病药物的应用。
附图说明：
附图显示本发明无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽促进胰岛素释放的作用。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
无指盘盘臭蛙胰岛素释放促进肽的制备：
将活体无指盘臭蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从棕点湍蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后保存。
第一步，Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，按上述方法获得的原材料无指盘臭蛙皮肤分泌液冻干粉300mg溶解于5ml纯净水，10000rpm 4℃离心10min去除沉淀。SephadexG-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液平衡，充分后将样品上于该柱。用同样缓冲液洗脱，收集活性峰。
于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(长300mm，直径5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从0％至80％的梯度洗脱。收集具有促进胰岛素释放的活性峰。
第三步.纯化的无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用飞行时间质谱法(Flight of time mass spectrometry，TOF-MAS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽是从中国两栖类动物无指盘臭蛙皮肤分泌液中分离得到的一种单链多肽，分子量2632.3道尔顿，等电点10.32，多肽全序列为：苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱苷酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-甘氨酸；或：
Phe Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu
1 5 10 15
Phe Cys Lys Ile Thr Arg Lys Gly
20
无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽促进胰岛素释放的作用：
无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽的胰岛素释放促进活性采用葡萄糖诱导的胰岛素释放活性检测方法(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)
一.胰岛细胞的分离与培养(Islet isolation and culturing)
1.取胰腺：
取禁食一日的SD大鼠5-6只，体重200-250g/只，雌雄不限，过量乙醚麻醉后，断颈处死。将上述处死的大鼠以70％酒精全身消毒，在超净工作台上无菌条件下取出胰腺，置于于HBSS(购自JRH)平衡盐溶液中，漂洗血迹，并剪去多余的组织和脂肪。
2.消化：
将胰腺在20ml胶原酶IV(购自sigma)消化液(浓度为0.167％)中37℃震荡消化30分钟，至组织块被消化成细沙状，4℃或冰冷的HBSS平衡盐溶液终止消化。1000r/min离心5分钟，去上清液中的胶原酶，同样方法再洗涤2次。
3.纯化：
以Ficoll400(分子量40,000，购自Pharmacia)不连续密度梯度离心法纯化胰岛细胞。在15ml离心管加入25％Ficoll400 2ml同消化后的胰岛细胞混匀，在其上轻轻加入23％Ficoll400 2ml，20％Ficoll400 1ml，
11％Ficoll400 1ml，3000r/min离心20分钟；吸出11％-20％，20％-23％两层界面的细胞，以RPMI1640培养液(购自HYCLONE)洗涤两次。取少量胰岛细胞悬液，以双硫腙(DTZ，dithizone)染色，并拍照。
4.手工挑选：
将纯化并洗涤后的胰岛置于培养皿中，在解剖镜下手工挑选胰岛。接种96孔细胞培养板，每孔接种10个胰岛，加入200ul RPMI1640培养液(含有10％胎牛血清，青霉素，100单位/ml链霉素)，在37℃，5％C02条件下培养12小时以上，使所分离的胰岛恢复正常的生理状态，以便于胰岛素释放检测。
二.葡萄糖诱导的胰岛素释放活性检测(GSIS)
1.在超净工作台上，将96孔细胞培养板中的细胞培养液吸出。
2.加入混有PBS(阴性对照)或生物活性肽样品(实验组)的HBSS平衡盐溶液(葡萄糖浓度为5.6mM——低糖条件；16.7mM高糖条件)200ul，在37℃，5％CO2条件下继续孵育1小时。每个样品都做3个重复。
3.取上清液，1000r/min离心5分钟，-20℃冻存。胰岛素含量由南京军区总医院临床检验科放免室检测。结果见说明书附图。
由说明书附图可见，无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽具有显著的促进胰岛素释放的作用，胰岛细胞所释放出的胰岛素随着无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽浓度的增加呈现上升的趋势。
上述试验表明：无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽可作为制备治疗糖尿病药物的应用。
无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用
<130>1
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>PRT
<213>无指盘臭蛙
<400>1
Phe Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu
1 5 10 15
Phe Cys Lys Ile Thr Arg Lys Gly
20
Claims (2)
1. 一种无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽，其特征在于该无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽是从无指盘臭蛙中分离得到的一种单链多肽，分子量2632.3道尔顿，等电点10.32，多肽全序列为：苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱苷酸-赖氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-甘氨酸。
2. 权利要求1所述无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽的应用，其特征在于该无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽作为在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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| Characterization of naturally occurring peptides in the skinsecretion of Rana pipiens frog reveal pipinin-1 as the novelinsulin-releasing agent. L. Marenah.Journal of Peptide Research,Vol.66 No.4. 2005 |
| Characterization of naturally occurring peptides in the skinsecretion of Rana pipiens frog reveal pipinin-1 as the novelinsulin-releasing agent. L. Marenah.Journal of Peptide Research,Vol.66 No.4. 2005 * |
| Skin secretions of Rana saharica frogs reveal antimicrobialpeptides esculentins-1 and -1B and brevinins-1E and -2ECwith novel insulin releasing activity. L Marenah.Journal of Endocrinology,Vol.188 No.1. 2006 |
| Skin secretions of Rana saharica frogs reveal antimicrobialpeptides esculentins-1 and -1B and brevinins-1E and -2ECwith novel insulin releasing activity. L Marenah.Journal of Endocrinology,Vol.188 No.1. 2006 * |
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