CN105061559B

CN105061559B - 优化的靶向md-2的高效抗炎多肽

Info

Publication number: CN105061559B
Application number: CN201510408969.7A
Authority: CN
Inventors: 闫红; 李磊; 谭燕; 吴晓凤
Original assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: CN105061559A

Abstract

以T6、T11为基础，采用NNK策略构建突变肽库，以MD‑2全长蛋白为靶蛋白，通过对突变肽库进行亲和筛选，得到高亲和力的噬菌体克隆。通过细胞因子生成抑制实验和检测动物血清中的炎性介质的表达，发现1个噬菌体克隆所展示的融合肽可以模拟MD‑2的抗炎多肽，其氨基酸序列为KRKMRMNTRRL。其与MD2全长蛋白的结合高于原始T6、T11克隆，能够显著减轻脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞合成和释放炎症介质，具有明显强于原始多肽的抗炎效果。

Description

优化的靶向MD-2的高效抗炎多肽

技术领域

本发明属生物医药领域，特别涉及经优化的靶向MD-2的高效抗炎多肽，以及所述多肽在制备用于治疗因感染造成相关的过度炎症性损害类疾病，如脓毒症的药物中的应用。

背景技术

细菌感染，特别是革兰氏阴性菌感染所导致的脓毒症已成为当前临床病人，特别是外科ICU患者死亡的主要原因。细菌对机体造成的感染脓毒症通常由细菌外毒素及内毒素对机体的刺激产生。细菌毒素进入体内后，首先刺激免疫炎症细胞，通过机体模式识别受体，主要为TLR2和TLR4受体，启动机体的感染免疫反应，但当机体遭受过度刺激后，大量产生的炎症介质则可对机体造成一系列过度的炎症性损害。有鉴于此，采用恰当的免疫策略对脓毒症实施有效防治，已成为当前免疫学家、临床学家以及制药行业关注的重点问题之一。

对各种疾病的治疗都应集中在发病早期环节上，免疫细胞对细菌内毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)的识别是炎症反应发生的初始环节，如何调控免疫炎症细胞对LPS的识别，下调LPS所致的过度炎症反应，从而在减轻炎症性损害的同时，又不影响机体免疫细胞正常的抗感染免疫功能则应是针对脓毒症实施有效免疫治疗的理想策略。

在免疫炎症细胞LPS的膜式识别受体复合物(TLR4/MD2/CD14)中，任何一个功能结构域的破坏都导致LPS信号转导障碍。资料证实，CD14与TLR4/MD2的亲和力较弱，而TLR4/MD2的亲和力较强，并且MD2(myeloid differential protein2，髓样分化蛋白2)同TLR4(toll like receptor4，Toll样受体4)的结合发生在同LPS结合之前，丧失LPS结合功能的MD2即使结合在TLR4胞外区，也不能赋予TLR4对LPS的反应性。表明MD2分子中与LPS结合的结构域对整个复合体的功能乃至之后的信号转导强度都有决定性的作用。并且，MD2与TLR4的胞外区相耦联，是一个只含有160个氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且为可分泌型等特点，对MD2的调控更易于操作，因而成为治疗内毒素休克十分有潜力的靶点之一。

由于MD2在结合LPS及诱导其信号的胞内传导中都起着关键的作用。阻断LPS与MD2的结合，比阻断LPS与TLR4/MD2的结合要容易近100倍。因而发明人在申请号为CN200710092404.8的中国专利申请中已经成功筛选出2条针对MD-2的拮抗多肽：T6和T11，可部分阻断MD-2与LPS的结合。

发明人通过上述前期研究，发现T6和T11对MD-2与LPS结合的阻断的效率不高。为了获得具有更高抗炎活性的多肽，经过进一步研究证实，根据靶标蛋白在噬菌体展示肽库中筛选出阳性序列，再根据阳性序列构建突变肽库，进一步筛选靶标蛋白，筛选后得到的阳性克隆效果更佳。本研究旨在通过对原始多肽(MD-2拮抗多肽)进行突变多肽库的构建、筛选和功能鉴定，最终获得具有更高抗炎活性的多肽。

目前在我国尚无准确的脓毒症发病率数据，但参考美国近期统计数据，每年脓毒症发生病例约为75万例，我国人口为美国人口4-5倍，加之我国目前的医疗条件与欧美发达国家相比尚有较大差距，推测我国每年发生脓毒症的病例约1千万例。因此，市场前景十分广阔。经推断，2014年度我国在抗感染方面实际费用大约为：4800亿元人民币。因此，有关脓毒症药物一旦全面推向市场，其经济效益不可估量。

目前国内外医疗市场尚无直接针对脓毒症的发生、发展而研制的新型生物制剂，一旦完成基础和临床实验，获准进入临床应用，必将具有非常明显的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化的靶向MD-2的抗炎多肽，所述多肽包括如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列；优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。然而，本领域技术人员理解，可在SEQ ID NO:6中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，所产生的变体保留其生物学特性。

根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的优化的靶向MD-2的抗炎多肽)的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-9个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽的必要特性可以指，靶向MD-2的抗炎特性。

根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

根据本发明，优化的靶向MD-2的抗炎多肽与其他蛋白的连接可包括例如融合和缀合等。特别地，优化的靶向MD-2的抗炎多肽可通过接头与其他蛋白连接。根据本发明，术语“接头”是指用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。通常，通过将编码该短肽的多核苷酸序列引入(例如，通过PCR扩增或连接酶)分别编码所要连接的两种目的蛋白的2个DNA片段之间，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白，例如目的蛋白1-接头-目的蛋白2。如本领域技术人员公知的，接头包括但不限于柔性连接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃。

在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。

在另一个方面，本发明涉及编码优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体或其融合蛋白的多核苷酸及含有该多核苷酸的载体。优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。

在另一方面，本发明还涉及包含优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体、其融合蛋白、其编码多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体或宿主细胞的药物组合物。

在另一方面，本发明还涉及优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体或其融合蛋白及其编码多核苷酸在用于制备治疗感染引起的过度炎症性损伤的药物中的应用。优选地，所述感染为革兰氏阴性菌所致的感染；优选地，其中所述感染引起的过度炎症性损伤为脓毒症。

在另一方面，本发明还涉及优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体或其融合蛋白及其编码多核苷酸在制备抑制炎症因子生成的药物中的应用。优选地，其中所述炎症因子为TNFα和IL-6。

在另一方面，本发明还涉及优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体或其融合蛋白及其编码多核苷酸在制备治疗由脂多糖通过TLR/MD2所诱导的炎症疾病的药物中的应用。优选地，其中所述炎症疾病为脓毒症。

本发明的有益效果是：

以申请号为CN200710092404.8的中国专利申请中公开的T6、T11为基础，采用NNK策略构建突变肽库，通过亲和筛选、细胞因子生成抑制实验及动物实验，获得一种优化的靶向MD-2的抗炎多肽，与原始T6、T11多肽相比，其具有对MD-2全长蛋白更高的亲和力，更显著的减轻LPS刺激巨噬细胞合成和释放炎症介质的效果，及具有更强的抑炎效果。这为MD2抗炎药物的进一步优化奠定了基础。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1为载体M13KE与目的片段酶切结果。

图2表示5个筛选出的阳性结合的多肽A8、F5、H2、H5、H9和T6、T11原始多肽与MD2亲和力的比较结果，柱状图中左侧为MD2组的OD450值，右侧为BSA对照组的OD450值。其中*表示与T6比较，p<0.05；#表示与T11比较，p<0.05。

图3表示5个筛选出的阳性结合的噬菌体展示多肽A8、F5、H2、H5和H9对RAW264.7以及THP-1细胞的细胞因子生成抑制效果的测定结果，其中*表示实验组与LPS组比较，p<0.05。

图4表示优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11对RAW264.7以及THP-1细胞的细胞因子生成抑制效果的比较结果，其中*表示实验组与LPS组比较，p<0.05；#表示优化多肽与T6、T11比较，p<0.05。

图5表示动物模型中优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11抗炎活性的比较结果，其中*表示实验组与LPS组比较，p<0.05；#表示优化多肽与T6、T11比较，p<0.05。

具体实施方式

材料

1.主要试剂：

MD2蛋白(1787-MD/CF，R&D system)，PMA(P1585,sigma)，回收试剂盒(Wizard SVGel and PCR Clean-Up System，promega)，限制性内切酶EagⅠ和KpnⅠ(Thermo)，KlenowFragment(Thermo)，T4连接酶和引物(上海锐劲生物技术有限公司)，DNA ladder:DL2000和λhindIII digest DNA Marker(TAKARA),小鼠TNF-αELISA试剂盒和IL-6ELISA试剂盒(博士德)，LPS(O11B4,Sigma)，胎牛血清和1640培养基(Hyclone)，RAW264.7细胞株(ATCC)，THP-1细胞株(第三军医大学野战外科研究所第四研究室馈赠)，C57小鼠(第三军医大学大坪医院实验动物中心)。

2.主要仪器：

小型离心机(Thermo Heraeus Pico17，Thermo Fisher)；金属恒温加热器(HB-032，上海博彩生物科技有限公司)，基因扩增仪(MyGeneTM Series Peltier Thermalcycler，杭州朗基科技仪器有限公司)，电泳仪(EPS100，上海天能科技有限公司)，节能型智能恒温槽(SDC-6，宁波新芝生物科技股份有限公司)，电转仪(BIO-RAD，上层：CAP EXTENDERPLUS，中层：PULSE CONTROLLER PLUS，下层：GENE PULSEII)，酶标仪(ELX800，Bioteck)，细胞培养箱(AERA CEU240，Thermo)。

实施例1、噬菌体突变肽库的构建

1.1基础引物以及突变引物

基础引物：

96Etp:CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCT(用于构建和菌落PCR鉴定)

T6:TTTCGGCCGAACCTCCACCATGATTATCCGGCACCGTCTTAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11:TTTCGGCCGAACCTCCACCATTCCTAGTCAACGGAGAATCAGAGTGAGAATAGAAAGGT

96gIIIsp:CCCTCATAGTTAGCGTAACG(用于测序和菌落PCR鉴定)

突变引物的合成策略：

T6和T11结合多肽是针对huMD2模拟短肽(FSKGKYKCV)筛选得到，该序列位于huMD2蛋白的β折叠链一端及相邻的无规则卷曲区域，基本呈线性分布。为得到更高结合能力的多肽，分别以T6和T11序列为基础，每次随机突变相邻的3-5个氨基酸，保留原来的2-4个氨基酸，并同时在肽链的氨基端和羧基端引入额外的两个氨基酸，以期望获得更大的结合面。

引物中引入的氨基酸突变是采用NNK策略，这种策略包含32个密码子，20种氨基酸全包含，不含终止子。对应的，因为这些密码子在反向引物上，所有都是MNN。我们共合成了10条突变引物，其中T6和T11的突变引物各5条，分开进行DNA操作，最后每种等量合在一起，用于建库(引物由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成)。

突变引物序列分别为：

T6am1：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATGATTATCCGGMNNMNNMNNMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T6am2：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATGATTATCMNNMNNMNNCTTMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T6am3：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATGATTMNNMNNMNNCGTCTTMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T6am4：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATGMNNMNNMNNCACCGTCTTMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T6am5：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNMNNMNNMNNCGGCACCGTCTTMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11am1：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATTCCTAGTCAAMNNMNNMNNMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11am2：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATTCCTAGTMNNMNNMNNATCMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11am3：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATTCCTMNNMNNMNNAGAATCMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11am4：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNATTMNNMNNMNNCGGAGAATCMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT

T11am5：

TTTCGGCCGAACCTCCACCMNNMNNMNNMNNMNNCAACGGAGAATCMNNMNNAGAGTGAGAATAGAAAGGT。

其中M代表碱基(A/C)出现的概率均等各为50％，N代表碱基(A/T/C/G)出现的概率均等各为25％

1.2目的基因片段的合成

将96Etp分别与等摩尔的突变引物(T6am1，T6am2，T6am3，T6am4，T6am5，T11am1，T11am2，T11am3，T11am4或T11am5，各约3molar)直接退火，50ul体系,从96℃直到最后保温于35℃；再用klenow补平两端得到目的基因片段(100ul体系，37℃30min，75℃10min)。

用KpnI/EagI对目的基因和载体M13KE进行双酶切，后再进行胶回收。

150ul体系

100ul体系

目的基因酶切后成功得到70bp左右的目的片段，载体M13KE酶切后成功得到7200bp左右的片段(见图1)。

1.3连接以及纯化

将M13KE与目的基因片段的酶切产物按照1:5的比例用T4连接酶进行连接，16℃过夜。连接产物PCR-clean up试剂盒进行清洁，用100ul水洗脱，备用。

1.4制备电转感受态ER2738并电转

将连接产物约100ul加入到制备好的电转感受态中，轻轻混匀，分装70ul/电转杯，静置10min，开始电击，立即加入400ul SOC培养基混匀(约38ml)，吸出于37℃150rpm摇床中1h孵育，涂平板(直径15cm)19个；提前取10ul(记为10^-2)进行梯度稀释并涂板，10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，37℃培养箱培养过夜；计数。

得到的突变肽库滴度经测定，10^-6长了100个蓝斑克隆，所以库容约为100×10⁶×38＝3.8×10⁹。

实施例2、噬菌体肽库的筛选

2.1富集与MD2蛋白具有结合活性的特异性噬菌体克隆

免疫管包被：用无菌TBS缓冲液稀释抗原huMD210μg至1ml，4℃过夜包被免疫管(Nunc，MaxiSorp)。免疫管封闭：用5ml 1％BSA封闭液封闭免疫管，37℃保温2h。洗涤：弃封闭液，用TBST(T:0.1％Tween-20)洗涤免疫管3次。Phage结合：加入phage样品3ml(含0.5％的BSA和0.1％的Tween-20)，37℃保温2h，每30分钟混匀一次。洗涤：用TBST(T:0.1％Tween-20)洗涤免疫管6次，洗去未结合的phage。洗脱：用Glycine-HCl(pH 2.1)洗脱结合的phage，1mL/次，每次5min，随后加入Tris中和液160μl。重复洗脱一次，然后合并。感染：从洗脱的phage样品中，取10μl用于梯度稀释和计数，感染对数中期的ER2738后，涂LB/IPTG/Xgal的Top-Agar平板，37℃培养箱倒置培养过夜，第二天计数。扩增：其余的2.3ml phage洗脱样品用于感染50ml对数早期的ER2738，37℃剧烈震荡培养4.5h，收集phage上清，沉淀浓缩后，用作下一轮筛选。重复2次，并将抗原huMD2依次降低为：5μg、1μg。共筛选三轮。

经过3轮筛选，每一轮结束后均记录噬菌体投入量及回收量,并计算回收率。结果见表1。可见富集率随着筛选轮数的增加而增加，说明与MD2蛋白具有结合活性的特异性噬菌体克隆得到有效富集。

表1用MD-2蛋白进行3轮亲和筛选中噬菌体回收率的改变

筛选轮数	筛选前滴度	洗脱液滴度	富集率
				1	3.8×10⁹	5.8×10³	1.52×10^-6
2	1.02×10⁹	7.2×10⁵	7.05×10^-4
				3	9.6×10⁸	8.3×10⁶	0.86×10^-2

2.2ELISA鉴定与MD2结合的噬菌体展示多肽

从2.1获得的噬菌体克隆中挑选94个克隆进行ELISA，以MD2为实验组，BSA为对照组，鉴定噬菌体展示多肽与MD2的结合力。采用SPSS17.0软件包处理各组数据，以x±s表示，进行t检验和单因素方差分析，两两比较采用LSD比较，p<0.05为差异具有统计学意义。本发明实施例所有数据均采用相同方法进行统计处理。

结果显示5个噬菌体克隆所展示的多肽与MD2全长蛋白有较高的结合力，OD₄₅₀值高于0.5，且均高于原始展示多肽T6、T11的克隆(结果见图2)。

2.3阳性克隆中噬菌体展示多肽的DNA测序

从结合活性高于T6、T11对照组的5个噬菌体克隆提取单链DNA，进行DNA测序，并推导DNA序列编码的氨基酸，即为噬菌体表达的多肽序列，5个克隆呈现出5种不同编码的氨基酸序列。

测序结果：

>MD-A8：AGGCGGCGCAACACTAGGACCACTCTTATACGG(SEQ ID NO：1)

>MD-F5：AGTAAAAGTAGTATTCCAACCAGGATGCTGATG(SEQ ID NO：3)

>MD-H2：AAGCGCAAGATGAGGATGAATACGAGGCGCCTG(SEQ ID NO：5)

>MD-H5：CGCAAACCTAAGCTTAGCCGTAGGCATATTCGA(SEQ ID NO：7)

>MD-H9：CATACACGCATGACGAGGAGCCGGCTTCACACA(SEQ ID NO：9)。

对应的氨基酸序列：

>MD-A8：RRRNTRTTLIR(SEQ ID NO：2)

>MD-F5：SKSSIPTRMLM(SEQ ID NO：4)

>MD-H2：KRKMRMNTRRL(SEQ ID NO：6)

>MD-H5：RKPKLSRRHIR(SEQ ID NO：8)

>MD-H9：HTRMTRSRLHT(SEQ ID NO：10)。

实施例3、细胞因子生成抑制试验

3.1细胞培养

RAW264.7购自ATCC，人前单核细胞(THP-1)由第三军医大学野战外科研究所第四研究室惠赠。RAW264.7细胞和THP-1细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养,THP-1细胞需经佛波醇乙酯(Phorbol myristate acetate,PMA)刺激后才能分化为单核巨噬样细胞。THP-1经培养和计数后，加入PMA100ng/ml共同培养24h，调整细胞计数为1×10⁵个/孔。RAW264.7直接调整细胞计数为1×10⁵个/孔。

3.2初筛5个克隆对RAW264.7以及THP-1的细胞因子生成抑制效果的测定

RAW264.7以及PMA诱导后的THP-1以PBS液洗涤3遍后用含10％胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度为1×10⁵个/孔。设3个对照组:Ⅰ组为control组(RAW264.7/诱导后的THP-1)、Ⅱ组为LPS组(RAW264.7/诱导后的THP-1+LPS)、Ⅲ组为M13组(RAW264.7/诱导后的THP-1+LPS+对照组噬菌体M13),实验组为RAW264.7/诱导后的THP-1+LPS+噬菌体克隆(A8、F5、H2、H5、H9)。各组LPS的终浓度均为1μg/ml。孵育6h后收集上清液,-20℃冰箱保存待测。按ELISA试剂盒说明测定TNFα。多肽药物浓度均为200ug/ml。实验发现其中A8，H2有较好的抑炎作用，而F5、H5、H9均无明显抑制炎症的效果(结果见图3)。

3.3优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11对RAW264.7以及THP-1的细胞因子生成抑制效果的比较

将初步筛选出的优化多肽A8、H2以及原始多肽T6、T11序列送往上海锐劲生物技术有限公司进行多肽合成。以RAW264.7以及THP-1细胞模型为靶细胞，多肽浓度采用200ug/ml，通过细胞因子生成抑制实验，比较优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11对细胞的抗炎效果。结果证实，A8、H2对细胞的抑炎效果比原始多肽更好，提高了近一倍(结果见图4)。

实施例4、动物模型中优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11抗炎活性的比较

用6-8周龄雄性C57小鼠，体重20-22g。将小鼠分为6组(n＝5)，2个对照组(n＝5)，Ⅰ组(空白对照)：每只小鼠腹腔注射1ml生理盐水；Ⅱ组(阴性对照)：每只小鼠腹腔注射1mlLPS(400ug/ml)的盐溶液；4个实验组：实验组分为4条多肽(T6，T11，A8，H2)，每只小鼠在用LPS处理前1h分别注射多肽(200ug/ml)。在LPS注射后6h脱颈处死小鼠。抽取血液,血清贮存于-20℃待测。ELISA检测炎症因子TNFα和IL-6含量。

优化多肽A8、H2中只有一条H2有明显强于原始多肽T6、T11抑炎效果(结果见图5)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种靶向MD-2的抗炎多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.编码权利要求1所述多肽的多核苷酸，该多核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.包含权利要求2所述多核苷酸的载体。

4.包含权利要求2所述多核苷酸或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述多肽或权利要求2所述多核苷酸在制备治疗感染引起的过度炎症性损伤的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述感染为革兰氏阴性菌所致。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述感染引起的过度炎症性损伤为脓毒症。

8.权利要求1所述多肽或权利要求2所述多核苷酸在制备治疗由脂多糖通过TLR/MD2所诱导的炎症疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述炎症疾病为脓毒症。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：炎症因子为TNFα和/或IL-6。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1所述多肽或权利要求2所述多核苷酸。