CN108341854A - 一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种对人卵巢癌细胞有靶向作用的新型多肽及其用途。该多肽为（1）多肽的氨基酸序列为：WNPLLLTRLLPA（SEQ ID No.1），（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。具有相对分子质量小、渗透性高、特异性高、成本低等诸多优点，已经在肿瘤靶向诊断和治疗方面显示出独特的优势。

Description

一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种对人卵巢癌细胞有靶向作用的新型多肽及其用途。
背景技术
卵巢癌是女性恶性肿瘤中最常见的肿瘤之一 , 其发病率位于妇科肿瘤第 2 位，而其死亡率却是妇科恶性肿瘤首位。由于卵巢位于盆腔深部，起病较隐匿，病变早期难以发现且病情发展迅速，加之缺乏有效地筛查及早期诊断的手段，70%以上患者就诊时已是晚期。目前晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为20％～40％，而早期患者却可以达到70％～90％，所以卵巢癌无论在早期诊断和治疗上都是目前研究的热点。
多年来许多研究者致力于寻求一种或多种组合的检测方法以便发现易于治疗的早期卵巢癌。然而，至今并没找到一种理想的方法可筛查卵巢癌，降低其死亡率。目前，基本的治疗方法是手术辅以化疗，现有的抗癌药物主要有金属抗癌药物、天然产物中提取抗癌活性成分、抗癌药物靶向制剂、基因工程药物、纳米控释抗癌药物等五类，这些药物通常具有毒副作用较大、药物用量大、容易产生后天耐药性等缺点，对肿瘤的治疗造成影响。而随着肿瘤在分子领域的研究，分子靶向治疗等治疗方法给中晚期的卵巢癌患者提供了新的选择。因此，早期卵巢癌检测、开发敏感诊断技术，靶向治疗是研究的重点。
噬菌体展示技术是分子生物学领域一种重要的筛选分子间相互作用的技术。噬菌体展示技术的主要原理是目的基因或编码蛋白质和多肽的基因通过基因工程技术克隆到噬菌体表面蛋白基因的适当位置上，让其随着噬菌体DNA的扩增而表达在噬菌体表面，由于外源基因和噬菌体基因的兼容性，外源基因的表达产物多肽或蛋白质仍可以保持其原有的空间结构和相应的生物学活性。然后，我们利用靶细胞或靶分子对噬菌体进行减数筛选，最终从噬菌体肽库中筛选出能够与靶细胞或靶分子特异性结合的目的噬菌体，并对其DNA进行测序，即可得到相应多肽的编码序列。这一技术实现了蛋白质或多肽基因型和表现型之间的联系，并且具有操作简便，可以高通量检测的特点，从而成为筛选肿瘤细胞特异性结合肽的高效手段，为肿瘤的早期检测和药物治疗的靶向载体研究提供了新的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途，能特异性与人卵巢癌细胞靶向结合，而对人卵巢上皮细胞没有影响，这在卵巢癌的早期诊断和靶向药物的研发等方面具有重要作用。
本发明的原理在于：以人卵巢上皮细胞为对照，采用人卵巢癌细胞SK-OV-3对噬菌体展示肽库进行减数筛选，用蓝白筛选试验挑选出能够与人卵巢癌细胞发生特异性结合的阳性噬菌体克隆，并用ELISA实验验证噬菌体与人卵巢癌细胞结合的特异性。然后以大肠杆菌为载体，扩增纯化噬菌体后提取其DNA进行测序，即得到能够与人卵巢癌细胞发生特异性结合的多肽编码序列，并人工合成荧光标记的阳性多肽，进行荧光标记-多肽与人卵巢癌细胞和荷瘤鼠的结合作用的验证，进而为卵巢癌的早期诊断和靶向治疗提供实验基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种肿瘤靶向的新型多肽，该多肽为（1）多肽的氨基酸序列为：WNPLLLTRLLPA（SEQ ID No.1），（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。
该多肽对肿瘤细胞有靶向作用，与肿瘤细胞特异性结合。
所述的肿瘤细胞为人卵巢癌细胞。
多肽在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，该试剂盒中包含所述多肽或多肽偶联物。
多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，该药物包含所述的多肽与药物活性成分，或包含所述的多肽与递药载体。该药物为任何药物治疗学上可接受的剂型，该药物优选的剂型为注射制剂。
该药物为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
与现有技术相比，本发明的效果在于：（1）短肽类小分子药物具有相对分子质量较小、免疫原性弱、活性高等优点。（2）它能够靶向在体肿瘤，具有特异性地传递抗癌药物、显像剂、无机纳米粒子、脂质体等到达肿瘤组织等方面的应用前景。（3）我们筛选出的肽能够与人卵巢癌细胞特异性结合，而与人卵巢上皮细胞无特异性作用。相比于抗体导向药物具有相对分子质量小、渗透性高、特异性高、成本低等诸多优点，已经在肿瘤靶向诊断和治疗方面显示出独特的优势。
附图说明
图1 为40个噬菌体克隆与人卵巢上皮细胞HOSEpiC和人卵巢癌细胞SK-OV-3的结合作用。
图2 为阳性噬菌体与人卵巢上皮细胞HOSEpiC和人卵巢癌细胞SK-OV-3的靶向结合作用。
图3为阳性噬菌体DNA的测序结果。
图4 为本发明FITC-WA12与人卵巢上皮细胞HOSEpiC和人卵巢癌细胞SK-OV-3的靶向结合作用。
图5为本发明FITC-WA12与荷瘤鼠人卵巢癌细胞SK-OV-3的靶向结合作用。
具体实施方式
以下所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
1.实验材料
1.1噬菌体肽库、细胞和宿主菌。
噬菌体12肽库、大肠杆菌E.coli ER2738、人卵巢上皮细胞HOSEpiC、人卵巢腺癌细胞SK-OV-3、荷瘤鼠。
1.2 实验试剂
McCoy’s 5A培养基、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、FITG标记兔抗鼠、胎牛血清、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、四环素贮存液、吐温-20（tween-20)、牛血清蛋白BSA、HRP-抗M13丝状噬菌体抗体、M13噬菌体单链DNA提取试剂盒、IPTG、X-gal、PEG-8000、TMB。
1.3 实验工作液
1×PBS、LB液体培养基、LB-Tet固体平板、顶层琼脂、IPTG/X-gal工作液、IPTG/X-gal平板、PEG-NaCl、TBS缓冲液、0.1%TBST、0.5%TBST、4%多聚甲醛固定液、TBS-NaN3液的配制、3%BSA封闭液、碘化钠缓冲液、TE缓冲液、TMB工作液、四环素贮存液。
2.实验方法
2.1大肠杆菌的培养。
（1）大肠杆菌的复苏：从-80ºC冰箱中取出大肠杆菌甘油冻存液，用接种环取少量划线于LB/Tet固体平板上，然后将此LB/Tet固体平板倒置于37ºC的电热恒温培养箱中培养过夜，使用时挑取单菌落即可。
（2）大肠杆菌的培养：在15ml离心管中加入10ml LB/Tet液体培养基，挑取大肠杆菌单菌落加入其中。然后将离心管置于恒温振荡器中培养过夜，待菌液的OD600值为0.5时即可进行相关实验。
2.2 噬菌体展示肽库的减数筛选。
（1）准备细胞：先将6孔培养板经poly-lysine预处理,取人卵巢上皮细胞HOSEpiC、人卵巢腺癌细胞SK-OV-3,分别用胰蛋白酶处理后铺于其中,培养至细胞成功贴壁且生长状态良好后进行筛选。
（2）制备菌液：筛选当天,将大肠杆菌ER2738接种于20ml LB/Tet液体培养基中，置于37ºC恒温振荡器中震荡培养, 待菌液的OD600值为0.5时，用于扩增筛选洗脱的噬菌体。
（3）无血清培养：吸掉细胞培养基，用PBS洗涤1次后加入无血清培养基，置于通有5%CO2的37ºC恒温细胞培养箱中1h。
（4）洗涤:吸掉封闭液,用0.1%TBST较轻地洗涤5次,每次均需旋转以使微孔的底部及边缘都被洗涤,甩干。至第2、3轮筛选时分别用0.5%TBST、1.0%TBST。
（5）封闭细胞:吸掉细胞培养基,将平板倒置于干净的纸巾上用力拍甩去除残存的培养基,用含1%BSA的培养基封闭人卵巢上皮细胞HOSEpiC、人卵巢腺癌细胞SK-OV-3，置于通有5%CO2的37ºC恒温细胞培养箱中1h。
（6）吸附: 取原始肽库10μl，加入到990μl 0.5% BSA/ PBS缓冲液中，将噬菌体稀释为1.5×1011pfu/ml，并将其加入到已封闭的人卵巢上皮细胞HOSEpiC中,37ºC 1h,吸附可以和人正常肠上皮细胞HIEC结合的噬菌体，留取上清。
（7）结合:将吸附后的噬菌体上清液与人卵巢腺癌细胞SK-OV-3共同孵育1h。
（8）洗涤:弃掉未结合的噬菌体,将微孔板倒置于干净的纸巾上用力拍甩，以去除残存的溶液。按上述方法用0.1%TBST洗板5次。
（9）洗脱:加入0.2M Glycine-HCl(pH2.2)1mg/mlBSA洗脱液1ml,冰上慢摇10min，然后将洗脱液吸出并转移至预先已准备好的150μl中和液（1M Tris-HCl，pH9.1）中。
（10）按照上述步骤重复操作2次。
2.3噬菌体的滴度测定。
将IPTG/X-gal平板预热于37ºC的电热恒温培养箱中；取出适量的顶层琼脂在微波炉中加热，待其完全融化后取出，在每个10ml离心管中分装3ml；将待筛选的噬菌体进行等比稀释后，取10μl与200μl的大肠杆菌菌液充分混合反应5min后，加入到3ml的顶层琼脂中，然后均匀地铺在预热的IPTG/X-gal平板上，待冷凝后置于37ºC的电热恒温培养箱过夜，观察滴定结果。
2.4噬菌体的扩增和纯化。
（1）噬菌体的扩增：在锥形瓶中加入20mlLB/Tet液体培养基，然后按1:100加入大肠杆菌菌液和待扩增的噬菌体，置于37ºC，恒温振荡器中剧烈震荡4.5h，得到噬菌体的扩增液。
（2）噬菌体的纯化：将经上述步骤得到的噬菌体扩增液4ºC、12000r/min，离心10min，取上清并加入1/6体积PEG-NaCl沉淀过夜后，12000r/min离心15min，弃去上清液，用TBS缓冲液溶解沉淀，再次给予1/6体积PEG-NaCl，冰上孵育1h。 4ºC、14000r/min，离心15min，弃去上清，将得到的沉淀用TBS-NaN3溶解后置于4ºC冰箱保存。
2.5 酶联免疫吸附试验
（1）制备细胞96孔板，铺板规则：96孔板边缘两列16个孔各加入100μl×PBS作为空白组；然后1、2、3、4行的每个小孔按照蛇形各铺布100μ人卵巢上皮细胞HOSEpiC悬液，5、6、7、8行的每个小孔按照蛇形各铺布100μ人卵巢腺癌细胞SK-OV-3悬液，然后将铺好的细胞平板置于通有5%CO2的37ºC细胞恒温培养箱中过夜即可进行ELISA实验。
（2）固定：取出过夜铺有细胞的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，然后加入4%多聚甲醛固定20min。
（3）阻断：取出固定后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，然后加入3%过氧化氢,于37ºC细胞恒温培养箱中封闭30min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。
（4）封闭：取出阻断后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，再加入3%BSA/PBS于37ºC细胞恒温培养箱中封闭1h。
（5）加噬菌体样品：取出封闭后的96孔板，拍干孔中液体后，加入纯化得到的阳性噬菌体，于37ºC细胞恒温培养箱中反应1h。
（6）加一抗：取出反应后的96孔板， 拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次后加入1:4000的M13抗体，4ºC过夜。
二抗： 取出反应后的96孔板， 拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次后加入二抗,于37ºC细胞恒温培养箱中反应30min。
（7）加底物TMB：将PBS洗涤3次后的96孔板于避光条件下加入TMB显示剂，避光置于37ºC细胞恒温培养箱中15min。
（8）终止：取出反应后的96孔板，加入2M硫酸终止反应。
（9）结果的测定：将完成全部反应的96孔板置于酶标仪中，于405nm处测定其OD值，保存结果并进行分析。
2.6 细胞与阳性噬菌体的免疫荧光实验
（1）细胞铺板：将人卵巢上皮细胞HOSEpiC、人卵巢腺癌细胞SK-OV-3铺于六孔板中待用。
（2）固定：用4%多聚甲醛固定15min。
（3） 封闭：弃去4%多聚甲醛，PBS洗2次，用3%BSA/PBS于37℃封闭30min。
（4）阳性噬菌体孵育：将封闭液擦拭后加入阳性噬菌体，37℃ 1h。
（5）DAPI染色：用PBS洗涤3次后加DAPI 100μl，室温，15min
（6）封片:PBS洗3次后，封片。
2.7 阳性噬菌体DNA的提取及测序
（1）在上述纯化的噬菌体沉淀中加入100ul碘化物缓冲液,再加入250ul无水乙醇, 充分混匀,室温作用20min。
（2）离心：4℃，14,000rpm，10min,弃上清。
（3）清洗：用500ul 70%乙醇洗涤沉淀,短暂离心后真空干燥。
（4）30ulTE(10mM Tris-HCl,pH5.0,1mMEDTA)缓冲液重悬沉淀,制成DNA测序模板液，送与上海生工测序。
如图1所示，随机挑取40个携带噬菌体的大肠杆菌克隆,经细胞酶联免疫分析初步鉴定结果显示实验组SK-OV-3与对照组HOSEPIC之比大于2的克隆共有31个,分别是1、2、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、20、21、22、24、25、26、27、29、30、31、32、33、36、38、39、40。它们能与卵巢癌细胞较强结合,而与正常卵巢上皮细胞HOSEPIC结合较弱。于是进一步进行噬菌体的免疫荧光染色实验以验证噬菌体与人卵巢癌细胞的靶向结合作用，如图2结果显示，阳性噬菌体能够与人卵巢腺癌细胞SK-OV-3靶向结合，而对人卵巢上皮细胞HOSEpiC结合能力较弱，两者有显著性差异，说明阳性噬菌体对人卵巢癌细胞有靶向作用。然后进一步对显示阳性结合的噬菌体克隆进行测序，证明共有20个噬菌体测序结果显示同样序列，分别为1、5、6、7、8、9、11、12、14、18、20、22、24、26、27、30、32、36、38、39号。如图3所示，按照三联密码子的原则，翻译出多肽序列：WNPLLLTRLLPA（SEQ ID No.1），即WA12。
再进一步用免疫荧光染色实验检测该多肽与人卵巢癌细胞的靶向结合作用，用荧光标记多肽FITC-WA12，然后用荷瘤鼠验证了该多肽与人卵巢腺癌细胞SK-OV-3的靶向作用。
2.8 细胞与FITC-WA12的免疫荧光实验
（1）细胞铺板：将人卵巢上皮细胞HOSEpiC、人卵巢腺癌细胞SK-OV-3铺于六孔板中待用。
（2）固定：用4%多聚甲醛固定15min。
（3） 封闭：弃去4%多聚甲醛，PBS洗2次，用3%BSA/PBS于37℃封闭30min。
（4）FITC-WA12孵育：将封闭液擦拭后加入FITC-WA12，37℃ 1h。
（5）DAPI染色：用PBS洗涤3次后加DAPI 100μl，室温，15min
（6）封片:PBS洗3次后，封片。
实验结果如图4所示，该多肽序列能够与人卵巢腺癌细胞SK-OV-3靶向结合，而对人卵巢上皮细胞HOSEpiC结合能力较弱，两者有显著性差异，提示该多肽具有靶向卵巢癌细胞的作用。
2.9 荷瘤鼠实验
（1）荷瘤：实验用裸鼠四周龄，腋下接种人卵巢癌细胞SK-OV-3使其成瘤。
（2）成像：将多肽用PBS配置成100μM/ml的溶液备用，给与荷瘤鼠尾静脉注射FITC-WA12多肽溶液0.1ml，10分钟后于小动物成像仪上成像。
实验结果如图5所示，构建人卵巢癌荷瘤鼠后，将多肽荧光标记后尾静脉注射后，结果发现荧光主要在荷瘤组织聚集，提示该多肽体内给药可能具有靶向卵巢癌组织的作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学
<120> 一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Asn Pro Leu Leu Leu Thr Arg Leu Leu Pro Ala
1 5 10

Claims (9)

1.一种肿瘤靶向的新型多肽，其特征在于，该多肽为以下任意：
（1）多肽的氨基酸序列为：WNPLLLTRLLPA（SEQ ID No.1）；
（2）在（1）所述的多肽分子中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（1）所述的多肽分子具有相同生物学功能的多肽衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向的新型多肽，其特征在于，该多肽对肿瘤细胞有靶向作用，可与肿瘤细胞特异性结合。
3.根据权利要求2所述的一种肿瘤靶向的新型多肽，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人卵巢癌细胞。
4.如权利要求1所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒中包含所述多肽或多肽偶联物。
5.如权利要求1所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该药物包含所述的多肽与药物活性成分，或包含所述的多肽与递药载体。
7.根据权利要求5所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。
8.根据权利要求5所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该药物优选的剂型为注射制剂。
9.根据权利要求5所述的肿瘤靶向的新型多肽在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该药物为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
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