CN112266408B - 特异结合ncl-h460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异结合NCL‑H460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途。七肽的氨基酸序列为Ala Gly Thr Lys Phe Thr Ser，其编码基因的核苷酸序列为taattatcacgacaactacct。通过噬菌体展示技术筛选出能特异性结合NCL‑H460细胞表面抗原的多肽Ala Gly Thr Lys Phe Thr Ser，该多肽能抑制NCL‑H460细胞的生长，进而对细胞增殖的抑制来抑制肺癌的发展。该多肽特异性强、亲和性高、活性好。

Description

特异结合NCL-H460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及特异结合NCL-H460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，肺癌在早期阶段，是很难被检测到的，而且这种癌症也很难治疗。因此，它是世界癌症死亡的主要原因。肺癌最常见的病因是吸烟。由于对早期NSCLC诊断难度较大，为此大部分NSCLC患者确诊时已为晚期，丧失手术切除机会，传统化疗则进入平台期，尤其是分子技术发展，靶向治疗逐渐开展起来，使得NSCLC治疗有了个体化的方案。
近几年，生物免疫治疗逐渐开展起来，成为晚期NSCLC治疗的新方法。NSCLC生物免疫治疗主要有三类方案：(1)被动免疫治疗：主要经体外免疫活性物质且不依赖宿主自身免疫而发挥作用，比如细胞因子、过继细胞免疫治疗等。(2)主动免疫治疗：通过特异性启动机体免疫系统来对肿瘤进行识别，从而提高抗肿瘤淋巴细胞，将免疫抑制环境转变为免疫刺激环境，这种治疗方案主要是经免疫疫苗实现，比如EGF疫苗、Mucin疫苗、树突细胞疫苗等，特异性启动免疫系统来识别肿瘤后提高淋巴细胞，但关于肿瘤疫苗3期还在研究中，并无明确开展相关研究，也未能有效证实其疗效剂。(3)肿瘤及其周围细胞免疫抑制状态是其微环境主要特点，T细胞数目、活性受损则是造成免疫抑制最为直接的一个原因，同时T细胞活性细胞关闭存在免疫相关检查点，比T细胞免疫球蛋白黏蛋白、细胞毒性T淋巴细胞免疫相关抗原等，属于T细胞聚集、效用功能调节的共阻碍因子，若与配体结合会造成T细胞效应下降，持续信号会造成其枯竭，丧失分化、分泌细胞因子等功能，改变T细胞免疫抑制作用
目前的靶向药物递送系统中的给药载体包括单克隆抗体、多肽、脂质体和纳米粒等，其中的多肽因具有高亲和性、较好的特异性和安全性的特点而受到广泛关注，目前已成为一种发展迅速且应用日益广泛的新型靶向给药载体。靶向的多肽偶联药物递送系统，首先要发现具有靶向结合活性的多肽载体，可以通过噬菌体展示肽库筛选、化学合成活性肽的方法获取靶向多肽载体。因为NCL-H460细胞是非小细胞癌中主要的细胞，它的发生发展决定着癌症的发生发展，因此我们希望能通过噬菌体展示技术筛选出能特异性结合NCL-H460细胞表面抗原的多肽，以抑制NCL-H460细胞的生长，希望能通过对细胞增殖的抑制来抑制癌症的发展。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供特异性强、亲和性高、活性好的特异结合NCL-H460细胞的七肽及编码基因。
本发明另一目的是提供所述七肽及编码基因的制备方法。
本发明最后一目的是提供所述七肽及编码基因的用途。
技术方案：本发明提供一种特异结合NCL-H460细胞的七肽，氨基酸序列为Ala GlyThr Lys Phe Thr Ser，其编码基因的核苷酸序列为taattatcacgacaactacct。
进一步地，所述七肽以融合蛋白的形式融合表达在噬菌体外壳蛋白PVIII或PIII的N端。
所述的特异结合NCL-H460细胞的七肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将NCL-H460细胞包被在平板上，封闭平板，将噬菌体展示随机七肽库加入包被和封闭后的平板中，进行至少4轮生物学淘选并测定每轮淘选后的噬菌体滴度；
(2)从至少第4轮计数平板上随机选择数珠噬菌体，挑选每一个噬菌体至OD0.5的E.coli ER2738菌液中，培养4-5h，后离心，取上清，重复两次，加入PEG-8000/NaCl对噬菌体进行沉淀，后离心，取上清，用TBS溶液溶解，得到每一个噬菌体单克隆的扩增产物；
(3)将噬菌体单克隆扩增产物加入到已经包被好NCL-H460的平板上，通过噬菌体ELISA测定各株噬菌体对结核分支杆菌的结合强度，并进行测序。
所述的特异结合NCL-H460细胞的七肽在制备肺癌靶向药物递送系统中的用途。
所述的特异结合NCL-H460细胞的七肽在肺癌检测中的用途。
有益效果：本发明通过噬菌体展示技术筛选出能特异性结合NCL-H460细胞表面抗原的多肽Ala Gly Thr Lys Phe Thr Ser，该多肽能抑制NCL-H460细胞的生长，进而对细胞增殖的抑制来抑制肺癌的发展。该多肽特异性强、亲和性高、活性好。
附图说明
图1是挑选的20个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD450值；
图2是竞争ELISA检测NCL-H460细胞，OD值与NCL-H460细胞浓度曲线，横坐标为NCL-H460细胞的浓度，纵坐标为OD450值；
图3是将EVA-2注射NCL-H460细胞肺癌小鼠模型的肺部的免疫组化图，A图为对照组，B图为肺癌组。
具体实施方式
实施例主要试剂如下：
(1)LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，高压灭菌，室温贮存；
(2)LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；
(3)顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
(4)四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于70％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；
(5)LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；
(6)PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
(7)IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；
(8)TBS：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl。高压灭菌，室温贮存；
(9)PBST溶液：在PBS溶液中加入体积比为0.05％/0.02％的吐温20
(10)碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，4M NaI。室温避光贮存；
(11)0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1M Tris-HCl(pH 9.1)，高压灭菌，室温贮存。
实施例1.噬菌体文库的扩增及纯化
接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床孵育至对数中期(OD 0.5)；加入10ul噬菌体，37℃，200rpm摇床震荡4-5h，10000g离心10min，取上清；再次10000g离心10min，取80％上清，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，4℃静置过夜。次日取出，白色沉淀即为噬菌体。10000g离心15分钟，倒掉上清，瞬时离心后轻轻吸出残留溶液；加入1ml TBS溶液溶解白色沉淀。实施例2.结合NCL-H460细胞的七肽的淘选及鉴定
实施例2.结合NCL-H460细胞的七肽的淘选及鉴定
(1)噬菌体滴度测定
接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD600：～0.5)；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104)；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pifu)滴度。
(2)NCL-H460细胞特异性噬菌体的富集
以50μg/mL浓度的NCL-H460细胞包被免疫试管并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/LGlycine-HCl(pH 2.2)1mL振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μL 1mol/L Tris-HCl(pH 9.1)中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定后进入下一轮筛选程序。
(3)特异性结合噬菌体的筛选
重复步骤2的方法再进行四轮淘选，每一轮的滴度如表1所示，第1轮洗涤条件是体积比0.1％的Tween20，第2和第3轮Tween-20浓度变为0.3％(v/v)，第4轮Tween-20浓度为0.5％(v/v)。
表1特异性噬菌体富集第一轮至第四轮噬菌体投入产出表
投入滴度(pfu/ml) 产出滴度(pfu/ml)
第一轮 2×1011 8.5×109
第二轮 2×1011 3.7×1010
第三轮 1×1011 7.5×1011
第四轮 1×1011 -
实施例3.NCL-H460细胞特异性噬菌体的鉴定
随机挑取第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落20个，经过分别培养纯化后，用噬菌体ELISA检测各株噬菌体对NCL-H460细胞的结合活性。具体步骤如下为：分别以NCL-H460细胞和Blocking包被酶标板，每组三个平行，并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次，加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值，以P/N≥2.1为阳性。
检测结果如图1显示，有15株噬菌体表现出对NCL-H460细胞的结合。提取这15株噬菌体ssDNA，阳性克隆的菌液DNA测序由上海生工生物技术公司完成，引物为-96g III。实施例中涉及的核苷酸序列：taattatcacgacaactacct使用DNANCL-H460N和Swiss数据库序列进行分析。获得相应的氨基酸序列：Ala Gly Thr Lys Phe Thr Ser。
实施例4.序列的结合活性测定
分别以不同浓度NCL-H460细胞和Blocking包被平板并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次，加入展示有EVA-1序列的噬菌体2*1011(以相同滴度的无关噬菌体为对照)，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加TMB室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于490nm波长测定OD值。结果如图2所示，展示有EVA-1序列的噬菌体表现出对NCL-H460细胞的特异性结合。
实施例5.序列体内结合实验
取C57小鼠5只，采用支气管接种方法接种NCL-H460细胞，建立肺癌小鼠模型，称作肺癌组；另取C57小鼠5，采用支气管接种方法接种等量的PBS溶液，作为肺癌组对照组。分别选取不同组的C57小鼠的肺组织切片，进行特异性噬菌体免疫组化检测，如图3所示，可以发现肺癌组小鼠模型病变部位出现典型的黄色或棕色颗粒，并且有显著差异。提示可以应用该七肽靶向作用于NCL-H460细胞。

Claims (4)

1.一种特异结合NCL-H460细胞的七肽，氨基酸序列为Ala Gly Thr Lys Phe Thr Ser。
2.根据权利要求1所述的七肽，其特征在于：其以融合蛋白的形式融合表达在噬菌体外壳蛋白PVIII或PIII的N端。
3.权利要求1所述的特异结合NCL-H460细胞的七肽在制备肺癌靶向药物递送系统所需试剂中的用途。
4.权利要求1所述的特异结合NCL-H460细胞的七肽在制备肺癌检测试剂中的用途。
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