CN111269288A

CN111269288A - 一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途

Info

Publication number: CN111269288A
Application number: CN202010068337.1A
Authority: CN
Inventors: 马赫遥; 魏敏杰; 徐娇; 范悦; 姜凯
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111269288B

Abstract

本发明涉及一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途，所述多肽如以下通式所示：CX₁X₂X₃X₄SX₅X₆C。其可以特异性靶向HSP60，尤其是基于HSP60在大多数肿瘤中高表达的特点，进而为高效靶向识别肿瘤组织，预测和提高肿瘤靶向治疗提供新的可能性；本发明提供了一种有效筛选HSP60靶向结合多肽的方法，特点为选高通量，效率高，筛选出的亲和多肽，分子量小、特异性强、稳定性好；本发明还涉及了该多肽作为多肽分子探针、多肽制剂、肿瘤导向多肽或显影剂的药物组合及其用途。本发明所述多肽能对HSP60具有特异性靶向作用，对肿瘤细胞选择性强，应用广泛且安全可靠，生产成本低。

Description

一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽(HSP60)及其筛选方法与用途，其具有良好的亲和性、敏感性及对肿瘤细胞特异靶向性，可制备药物或显影剂，应用于肿瘤的诊断、预防及治疗。

背景技术

恶性肿瘤是全球公认的公共健康问题，其发病率和致死率呈逐年上升趋势。根据国际癌症研究中心估计，未来全球癌症发病人数将以年均3％-5％的速度增长，预计到2020年全球将有2000万新发癌症病例，死亡病例将达到1200万。我国癌症呈现明显的高发态势，且癌症年轻化趋势愈发明显，这严重影响着人们的生活质量和水平。随着分子机制的不断发展和丰富，人类发现癌症和基因密切相关。在分子水平上，靶向作用于突变的癌基因，能精准杀伤癌细胞，于是肿瘤的个体化治疗与靶向治疗应运而生。虽然放化疗和靶向治疗都是全身治疗，但是传统的抗肿瘤化疗药物靶向性差，选择性低，有较大的毒性和不良反应，对正常细胞有一定程度的损伤。随着现代医学的不断研究发展和科学技术日新月异的变化，癌症治疗已经从传统疗法转向分子靶向治疗，治疗的特异性、安全性及有效性将极大的提高，而毒副反应则相对于传统药物较低。

靶向治疗是通过定向阻断癌细胞的增殖转导信号，破坏了癌细胞的代谢，阻止肿瘤血管生成，切断营养物质的供给，从而抑制癌细胞的生长。靶向药物通过特异性作用于靶点，减少或消除了对正常细胞的杀伤作用，治疗效果得到大幅度提高。对于不能耐受化疗或不愿意接受化疗的患者，靶向治疗是首选的方法。靶向给药系统可将药物选择性富集于靶器官，靶组织或靶细胞中。由于抗体药物分子量大，较难渗入到实体瘤组织中且易产生耐药性等问题，因此限制了抗体类药物的临床应用。而多肽类药物以其分子量小、靶向性高、成药性强、活性好、低免疫原性和毒性、易于装载等优势在抗肿瘤的实验研究及临床应用中得到了广泛关注；且多肽在体内不易蓄积，与其他药物的相互作用少，与体内受体的亲和力好。环七肽由于有二硫键的存在，构象更加稳定,在体内不易被降解，可以应用于肿瘤靶向肽的筛选。

热休克蛋白60(HSP60)是线粒体中主要的ATP依赖性伴侣蛋白，属于热休克蛋白家族成员，广泛存在于细菌和哺乳动物中，是细胞在应激条件(如热刺激，高温，高压，低氧)下合成的一类蛋白质。HSP60是由低聚物形成的双环结构，每一个亚基包含3个结构域：顶端域、赤道域、中间域。每七个亚基构成一个环状，双环结构的中央形成了一个巨大的腔隙，将未折叠的蛋白质通过疏水作用绑定。其主要功能有参与热激反应；帮助多肽折叠；促进细胞凋亡，也可促进细胞的存活等。近些年来研究发现HSP60在胶质母细胞瘤、前列腺癌、大肠癌，胰腺癌，卵巢癌等多种癌症中表达异常，因此开发靶向作用于HSP60的肿瘤靶向肽具有十分重要的意义，为开发新型肿瘤靶向治疗提供了新的依据。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽，其特点在于特异性亲和细胞表面的热休克蛋白60(HSP60)，从而选择性地结合肿瘤细胞，特别是这种多肽的筛选方法及上述多肽或其衍生产品在制备靶向HSP60抗肿瘤药物或显像制剂中的用途。

本发明采用以下技术方案实现发明目的：

本发明提供了一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽，其氨基酸序列通式为：CX₁X₂X₃X₄SX₅X₆C；

上述肽链中单字母符号代表的氨基酸残基定义如下：C为半胱氨酸，S为丝氨酸，X_1-6为可变的氨基酸残基。

作为优选技术方案，X₁是脂肪族氨基酸，优选为蛋氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸或赖氨酸；

X₂优选为精氨酸、酪氨酸或脯氨酸；

X₃是非极性氨基酸，优选为丙氨酸、蛋氨酸或亮氨酸；

X₄是极性氨基酸残基，优选为甘氨酸、苏氨酸或组氨酸；

X₅优选为组氨酸、丙氨酸或精氨酸；

X₆是极性氨基酸残基，优选为天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸或丝氨酸。

作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4之一所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码上述本发明通式的肽的氨基酸序列。

作为优选技术方案，所述DNA片段包含编码所述本发明如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4之一所示的多肽的核苷酸序列。

本发明提供了一种筛选与HSP60靶向识别多肽的筛选方法，包括以下步骤：重组HSP60，将纯化后的HSP60固定于细胞培养皿上，然后将噬菌体展示文库与HSP60结合，再将与HSP60结合的阳性噬菌体洗脱、测序翻译成氨基酸序列。

优选地，本发明所述多肽来源于噬菌体展示环七肽文库，文库容量为1×10¹¹。

本发明还进一步提供了包含上述多肽的二聚体/多聚体。

优选地，上述二聚体或多聚体是通过连接分子共价连接或与多聚体混合、非共价连接形成的。

如上所述的二聚体或多聚体具有HSP60特异性靶向作用。本发明还进一步提供了一种多肽药物，包含上述通式所述多肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述多肽，或上述的二聚体/多聚体和显像制剂。该多肽药物增强其在肿瘤细胞的聚集或杀伤肿瘤细胞，或可阻断HSP60与相关的蛋白相互作用。

一种多肽分子探针，包含上述通式所述多肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述多肽，或上述的二聚体/多聚体。

优选地，所述多肽探针分子量相对较小，纯度高，靶向性强，活性好，低免疫原性和低毒性，安全可靠，可成为具有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内，后与癌细胞表面靶蛋白HSP60发生特异性结合并产生某种信号，实现特异性的诊断或靶向治疗作用。

更优选的，连接杀伤多肽或者穿膜肽等作为多肽制剂，增强其在肿瘤细胞的聚集或杀伤肿瘤细胞的制剂。

本发明提供了一种药物组合物，包含抗肿瘤制剂和上述通式所述多肽、SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所述多肽，或上述的二聚体/多聚体。

优选的，所述的多肽或二聚体/多聚体作为靶向多肽，与抗肿瘤制剂相缀合或混合。

优选的，所述抗肿瘤制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

优选的，所述为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

本发明通式所述多肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述多肽，或上述的二聚体/多聚体具有靶向HSP60的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在细胞中的浓度，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗肿瘤药物。

更优选的，所述的细胞为肿瘤细胞，所述靶向多肽作为肿瘤导向多肽。

本发明提供了一种显像剂，包含本发明氨基酸序列为通式所述肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所述的肽、多肽形成的二聚体或多聚体的氨基酸序列，用于多种过表达HSP60肿瘤的靶向治疗和成像。

本发明提供了一种多肽抑制剂，包含本发明氨基酸序列为通式所述肽、SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所述的肽、多肽形成的二聚体或多聚体的氨基酸序列，可阻断HSP60与相关的蛋白相互作用。

本发明提供了一种显像剂，其包含显像制剂和前述多肽和/或前述二聚体/多聚体。

所述的多肽、二聚体/多聚体与显像制剂相缀合或混合。

优选的，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

作为优选技术方案，本发明所述肿瘤细胞为HSP60过表达的细胞。

更优选为结肠癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌细胞。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提出的多肽具有HSP60特异靶向的特性，在临床实践中，可广泛应用于高表达HSP60的细胞，特别是肿瘤细胞。因此，这种靶向多肽及其衍生物在高表达HSP60肿瘤分子诊断，筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。

(2)本发明应用的噬菌体展示技术有效的筛选出靶向结合HSP60多肽，其特点为高通量，文库种类较多，筛选的多肽稳定性高，水溶性好，为靶向多肽的筛选提供有效的方法。

(3)本发明提供的多肽对高表达HSP60的肿瘤细胞有特异性结合作用，为进一步寻找新的HSP60配体，研究分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了更多启发和方法。

(4)本发明提供的多肽为寡肽，与传统药物及大分子抗体相比，寡肽具有相对分子质量小、靶向性强，活性高，低免疫原性和低毒性，成药性好等优点，再加上本发明中的多肽为环状多肽，更容易在大规模化生产制备中保持其稳定性。

附图说明

图1为HSP60的重组与纯化结果图；其中图1(A)为构建的HSP60表达质粒全图谱，图1(B)为HSP60蛋白纯化结果图。

图2为HSP60特异性结合阳性多肽的筛选结果。利用噬菌体展示技术对HSP60特异性结合阳性噬菌体的三轮靶向筛选滴度实验结果图，其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝斑平板图。

图3为阳性单克隆噬菌体的DNA测序结果图。图中依次为YB401，YB402，YB403，YB404的测序结果。

图4为阳性多肽与HSP60亲和力的验证结果。利用MST鉴定多肽与HSP60蛋白亲和力结果，依次为YB401，YB402，YB403，YB404的亲和力结果。

图5为多肽FITC-YB401、FITC-YB402、FITC-YB403、FITC-YB404与高表达HSP60的结肠癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图，其中图5(A)为Western Blotting方法鉴定结肠癌细胞株SW620，SW480和正常人肠上皮细胞HIEC的HSP60表达量的实验结果图和柱状图，图5(B)为流式细胞术鉴定多肽FITC-YB401、FITC-YB402、FITC-YB403、FITC-YB404分别与结肠癌细胞SW480特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1 HSP60的重组与纯化

1.1转化构建的HSP60表达质粒

将构建的HSP60表达质粒转移到到冰上使其融化。用玻璃棒蘸取液体并均匀涂布到含有卡那霉素的平板上。将平板倒置于37℃孵箱中过夜。次日，检查菌落生长情况，4℃冰箱保存备用。

1.2大量扩增HSP60

从平板挑选单克隆菌接种到卡那霉素抗性的液体培养基中。37℃摇床培养过夜，转速130rpm。次日，在锥形瓶中加入LB培养液、过夜菌和卡那霉素，37℃，130rpm摇菌约4小时。测菌液的OD值，当OD₆₀₀值在0.6左右时，在菌液中加IPTG进行诱导，22℃，200rpm摇菌过夜。取无菌离心管，分装菌液。4℃，12000g离心10min，弃上清，-20℃保存。

1.3纯化HSP60

在细菌沉淀中加入非变性裂解液5ml/g，充分重悬菌液。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰上放置30min。冰上超声裂解细菌，200w超声6次，每次超声处理10秒，间隔10秒。4℃，10000g离心20min，收集细菌裂解液上清于冰上。取1ml混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tagPurification Resin，4℃，1000g离心10秒，弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，平衡重复3次，4℃，1000g离心10秒，弃去液体。将上清与BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin混匀，4℃旋转结合过夜。次日，将混合物装入亲和层析柱空柱管中。用非变性洗涤液洗柱4次，每次0.2ml，留第4次100ul上样。然后用0.5ml非变性洗脱液洗脱10次，将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。

结果如图1所示，图1为HSP60的重组与纯化结果图，其中图1(A)为构建的HSP60表达质粒全图谱。图1(B)为HSP60蛋白纯化结果图，结果显示在60KDa处有明显纯化的HSP60蛋白。

实施例2 HSP60特异性结合阳性多肽的靶向筛选

2.1宿主菌E.coli ER2738的复苏、培养

制备LB+Tet平板：1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g氯化钠，1.5g琼脂粉，加双蒸水定容为1000ml，高压灭菌，当温度降为70℃以下时，加入100uL的四环素(Tet)储存液。

制备大肠杆菌平板：取LB+Tet平板于37℃孵箱预热1小时，待E.coliER2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。次日取出平板观察长菌情况，封口，4℃避光保存。

2.2噬菌体展示环七肽库靶向筛选

以HSP60作为靶蛋白，利用噬菌体展示技术靶向筛选方法，参照噬菌体展示环七肽库试剂盒的操作说明，通过三轮靶向筛选，并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下：

2.2.1准备HSP60

准备体积为150ul，浓度为100ug/ml的HSP60(溶于0.1M NaHCO₃(pH 8.6))，铺于96孔板，在4℃微摇30min，之后4℃静置过夜。

2.2.2准备菌液

从大肠杆菌平板中挑选单一菌落，置于四环素的LB培养基中，在锥形瓶中摇菌，37℃，130rpm，达到对数生长期(OD₆₀₀＝0.6)约需4.5h。

2.2.3蛋白固定

吸弃96孔板中的液体，并在无菌滤纸上将96孔板中液体拍甩干净。用0.5％BSA封闭，4℃静置1h。

2.2.4肽库结合

弃掉96孔板里的封闭液，用TBST(0.1％)快速洗涤6次，弃掉溶液，拍干。加入用TBST(0.1％)稀释100倍的Ph.D.-C7C原始噬菌体展示环七肽库，室温下缓慢摇动1h。

2.2.5洗涤

吸弃掉第一轮未结合的噬菌体液，把96孔板放到无菌滤纸上拍干。用TBST(0.1％)洗涤10次。

2.2.6洗脱

96孔板里加入100uL的洗脱液(0.2M Glycine-HCl，pH2.2)，冰浴微摇15min。把洗脱液吸到1.5ml离心管中，并加入15uL的中和液(1M Tris-Hcl pH9.2)混匀，此为第一轮吸附后中和洗脱液(或扩增前噬菌体上清液)，4℃保存。

2.3测定噬菌体滴度

将LB/IPTG/Xgal平板置于37℃孵箱预热1h以上。准备顶层琼脂，微波加热至融化，分装在10ml离心管中，放在水浴锅中保温备用。取吸附后中和洗脱液，用LB培养基按倍数稀释噬菌体。每个EP管中加入备好的200uL菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后的噬菌体液加到融化的顶层琼脂中，立即将混悬液加至已预热的LB/IPTG/Xgal平板里，用玻璃棒均匀涂开(每个稀释倍数一个平板，并做好标记)。让平板冷却将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数(即数每个平板上的噬菌体斑个数)。

2.4噬菌体扩增纯化

摇过夜菌：从大肠杆菌平板中挑选单一菌落，置于含有四环素的LB培养基中，在50ml离心管中摇菌，37℃，130rpm，过夜。

取过夜菌和剩余的吸附后洗脱液于20ml的LB培养基中，37℃，200rpm快速振荡4.5h进行扩增。把扩增后的噬菌体液于4℃、12000g离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80％的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的PEG/NaCl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀的50ml离心管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心5min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的TBS重悬后转移到无菌EP管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的EP管里，再次加入六分之一体积的PEG/NaCl，冰上沉淀1h。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200ul的TBS重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的EP管(此为扩增后噬菌体液)，-20℃冰箱储存。

2.5第二到三轮筛选

筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮靶向筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。

2.6阳性单克隆噬菌体挑选与单链DNA提取及测序

2.6.1高纯度单克隆噬菌体制备及扩增

选择第三轮筛选后的滴定平板，该平板内蓝斑大小及密度适中。随机挑取分隔良好，大小均一的蓝斑于1.5ml的LB培养基中，再在LB培养基中加入过夜菌，于37℃、250rpm快速振荡4.5h进行扩增使达到对数生长期。将扩增的单克隆噬菌体液分别于4℃、10000rpm离心10min，取上清液转到新管中，4℃、1000rpm离心10min，取上清的80％转移到新的无核酸酶离心管里，此即为扩增的单克隆噬菌体储存液。

结果如图2所示，图2为HSP60特异性结合阳性多肽的靶向筛选结果。利用噬菌体展示技术对HSP60特异性结合阳性多肽的三轮靶向筛选滴度实验结果图，其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝斑平板图。表1为三轮靶向筛选的噬菌体投入量，回收噬菌体滴度和噬菌体回收率，结果显示在第三轮阳性单克隆噬菌体富集。

表1三轮减性筛选的噬菌体投入量、回收噬菌体滴度和回收率

筛选轮次	投入量(pfu)	回收量(pfu)	回收率
				1	1*10<sup>11</sup>	3.4*10<sup>5</sup>	3.4*10<sup>-6</sup>
2	1*10<sup>11</sup>	5.7*10<sup>5</sup>	5.7*10<sup>-6</sup>
				3	1*10<sup>11</sup>	2.66*10<sup>6</sup>	2.66*10<sup>-5</sup>

实施例3阳性单克隆噬菌体的DNA提取及测序

3.1阳性单克隆噬菌体单链DNA提取

取30ul扩增的噬菌体储存液于20ml的LB培养基中，再加入对数生长期菌液，于37℃、130rpm振荡4.5h。4℃，12000rpm离心8min。取离心后的上清液，转移到另一50ml的离心管中，同等条件下离心3min。取离心后的80％上清液到另一离心管中，加入六分之一体积的PEG/NaCl,4℃过夜。次日，4℃，14000rpm离心10min，弃上清。加入1ml的TBS重悬沉淀，将混悬液转入1.5ml的离心管中，4℃，10000rpm离心5min。将上清转移到新的1.5ml离心管中，并加入400ul的PEG/NaCl，4℃静置2h。4℃，10000rpm离心15min。再离心，彻底弃掉上清液后加入100ul的NaI，混合均匀，加入250ul无水乙醇，室温静置10min。4℃，10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70％乙醇轻微洗3次，然后室温晾至干燥。用60ul TE溶解，即得到单克隆噬菌体DNA溶液。

3.2 DNA纯化

取上一步40ulTE溶液，向离心管里加入500ul Buffer B3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μl Wash Solution，9000g、离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的Elution Buffer，室温静置2min。9000g离心1min，对纯化后的DNA溶液进行测序。

图3为阳性噬菌体的DNA测序结果图。其氨基酸序列分别为CMRAGSHNC，CNYMTSAKC，CIRAGSHTC，CKPLHSRSC。根据测得的4个氨基酸序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性，结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性。其中表2为4个阳性多肽序列的重复频率。

表2阳性噬菌体DNA测序的序列重复频率

名称	序列	重复频率
			YB401	CMRAGSHNC	14
YB402	CNYMTSAKC	11
			YB403	CIRAGSHTC	6
YB404	CKPLHSRSC	3

同时在生工生物工程(上海)股份有限公司合成了FITC标记的以上阳性多肽片段FITC-YB401、FITC-YB402、FITC-YB403、FITC-YB404，并对合成的多肽进行鉴定，与理论结果一致。

实施例4阳性多肽与HSP60亲和力的验证

MST(微量热泳动仪)鉴定多肽YB401与HSP60的亲和力

HSP60以32uM为初始工作液1，作为结合力测定的最高浓度，然后用磷酸盐缓冲盐(PBS，pH7.4)以1:1稀释工作液，共得到16个工作液，工作液16的浓度为0.98nM，各工作液加入等体积的的100nM的FITC-YB401，在微量热泳动仪上测定平衡解离常数kd。

结果如图4所示，利用MST鉴定多肽与HSP60亲和力结果图，结果显示4条阳性多肽与HSP60具有亲和力，Kd值分别为63.9nM，107.4nM，148.5nM，203.1nM。

实施例5多肽与高表达HSP60结肠癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定

5.1蛋白印迹(Western Blotting)筛选高表达HSP60的结肠癌细胞株

培养结肠癌细胞株SW620，SW480及正常人肠上皮细胞HIEC，当三株细胞在大皿中长满后，用PBS洗三次，加裂解液并在冰上裂解30min。用细胞刮把细胞刮下来，14000g,4℃离心10min，弃去沉淀，上清即为蛋白，-80℃保存。用BCA法进行蛋白浓度定量，然后按比例在三种蛋白中加入上样缓冲液和PBS，100℃变性10min。配制SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳结束后，进行转膜。取出HSP60和β-actin的PVDF膜，TBST洗三次，每次10min。5％BSA封闭1h，TBST洗三次，每次5min。将这两个条带分别置于相对应的一抗，4℃摇床过夜孵育。次日，TBST洗三次，每次10min，室温孵育二抗1h，TBST洗三次，每次5min。ECl发光。

5.2流式细胞术鉴定多肽与结肠癌SW480细胞的特异性结合能力

HIEC和SW480细胞在大皿中培养，待细胞长满后用胰酶消化，1000rpm离心5min。弃上清，加入1ml培养基混悬后进行细胞计数。每种细胞取330μl置于2个1.5ml离心管中(对照组、实验组)，1000rpm离心5min，弃上清，分别加入1ml的15μM多肽FITC-YB401、FITC-YB402、FITC-YB403、FITC-YB404和PBS，混合均匀，37℃孵育10min。1000rpm，离心5min，弃上清。加PBS混悬，室温1000rpm离心5min，弃上清。加330μlPBS混合均匀，用流式细胞仪检测。

结果如图5所示，其中图5(A)为用Western Blotting方法测定结肠癌细胞株SW620，SW480和正常人肠上皮细胞HIEC的HSP60表达量的实验结果图和柱状图，显示SW620和SW480较于HIEC表达HSP60有显著差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图5(B)为流式细胞术鉴定多肽与结肠癌SW480细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图。SW480和HIEC分别用15μM多肽孵育10min，在SW480细胞上观察到强荧光信号，而在HIEC细胞上检测到较弱的荧光信号。实验结果图和柱形图显示多肽与结肠癌SW480细胞具有特异性靶向结合能力，其中结合力最强的为FITC-YB401，为91.7％；其次为FITC-YB402，为85.8％；FITC-YB403，为70.2％；FITC-YB404，为68.3％。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

从实验例中可以得出，利用噬菌体展示技术筛选的多肽，重复频率越高，特异性亲和力越强，肿瘤细胞选择性越强，可以高效筛选与HSP60结合的多肽。另外，本发明中的多肽具有靶向HSP60的特性，既可以作为多肽分子探针以准确筛查过表达HSP60的肿瘤；也可以作为肿瘤导向多肽，与抗肿瘤的药物偶联，作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在过表达HSP60的细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。用于多种过表达HSP60肿瘤的靶向治疗和成像；还可以优化将多肽本身作为多肽抑制剂，阻断HSP60与相关的蛋白相互作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医科大学

<120> 一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Met Arg Ala Gly Ser His Asn Cys

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Asn Tyr Met Thr Ser Ala Lys Cys

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Ile Arg Ala Gly Ser His Thr Cys

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Cys Lys Pro Leu His Ser Arg Ser Cys

Claims

1.一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽，所述亲和多肽的氨基酸序列通式为：CX₁X₂X₃X₄SX₅X₆C；

其中，C为半胱氨酸，S为丝氨酸，X₁ -X₆为可变的氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的靶向热休克蛋白60的亲和多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ.ID.NO.1- SEQ.ID.NO.4任一所示的氨基酸序列。

3.一种DNA 片段，其特征在于，其包含编码权利要求1-2任一项所述多肽的核苷酸序列。

4.一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：重组HSP60，将纯化后的HSP60固定于细胞培养皿上，然后将噬菌体展示文库与HSP60结合，再将与HSP60结合的阳性噬菌体洗脱、测序翻译成氨基酸序列。

5.根据权利要求1-2所述的多肽形成的二聚体/多聚体。

6.一种多肽药物，包括权利要求1-2任一所述的多肽或权利要求5所述的二聚体/多聚体。

7.一种多肽分子探针，包括权利要求1-2任一所述的多肽或权利要求5所述二聚体/多聚体。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2任一所述的多肽和/或权利要求5所述二聚体/多聚体、具有抗肿瘤作用的药物和/或药学上可接受的辅料或佐剂。

9.一种显像剂，其特征在于，包含权利要求1-2任一所述的多肽和/或权利要求5所述二聚体/多聚体和显像制剂。

10.权利要求1-2任一所述的多肽和/或权利要求5所述二聚体/多聚体，在制备用于治疗、预防或诊断肿瘤的药物或显像制剂中的用途。