BR112016016802B1 - Processo para fabricar um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) - Google Patents

Abstract

CARREADOR BIOCOMPATÍVEL HÍBRIDO (HIBRIDOSSOMA); PROCESSO PARA FABRICAR UM CARREADOR BIOCOMPATÍVEL HÍBRIDO (HIBRIDOSSOMA); E MÉTODO PARA ENTREGAR UM OU MAIS BIOAGENTES ATIVOS A UMA CÉLULA GLIAL A presente invenção fornece um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) que compreende elementos estruturais e bioativos originados de pelo menos um módulo de entrega biocompatível (BDM) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajus-tável. A invenção fornece, ainda, composições de produto farmacêutico que compre-endem os ditos hibridossomas, o processo para sua fabricação, bem como usos do produto farmacêutico e métodos do produto farmacêutico com base nesses.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção se refere ao campo de carreadores biocompatíveis farmacêuticos e à entrega direcionada de agentes ativos para aplicações terapêuticas, profiláticas, de imaginologia e de diagnóstico. Mais especificamente, a invenção se refere a um carreador híbrido biocompatível resultante da união controlada de um módulo de entrega biocompatível naturalmente secretado (BDM) e um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM).

Antecedentes da invenção

[002] As abordagens contemporâneas de terapia com fármacos são principalmente baseadas no desenvolvimento de novas moléculas terapêuticas, bem como no avanço de programações de tratamento combinadas. No entanto, a eficácia clínica dessas abordagens é inerentemente limitada por seus atributos físico-químicos, farmacocinéticos e de reatividade cruzada, provenientes de modo inesperado de uma concentração restrita no local de ação pretendido e uma biodistribuição geral extensiva.

[003] Em uma tentativa de solucionar esse desafio, o comando emergente da nanotecnologia está facilitando a entrega de moléculas de fármacos para órgãos, tecidos e/ou células não saudáveis. As plataformas de entrega de fármaco mais avançadas inspiradas em nanotecnologia são focadas no aprisionamento de moléculas terapeuticamente ativas em sistemas de carreador à base de lipídeo sintético. A encapsulação facilita o isolamento de um fármaco do ambiente in vivo, superando, desse modo, as propriedades não ideais de um fármaco, incluindo solubilidade limitada, estabilidade de soro, meia-vida de circulação e biodistribuição.

[004] O nanocarreador sintético ideal que é composto por constituintes não tóxicos e é especificamente internalizado por células-alvo permanece inatingível até o presente momento. Portanto, esses sistemas não utilizam o potencial total que a nanotecnologia pode fornecer. Insights sobre como as moléculas são transmitidas na natureza podem fornecer o plano de projeto para veículos de entrega de fármaco eficientes e biocompatíveis.

[005] Sabe-se que as células trocam informações através da secreção de fatores solúveis ou por interação direta. Estudos recentes chegaram às conclusões de que as células também liberam vesículas derivadas de membrana que têm um impacto tanto em células próximas quanto em células distantes (Marcus & Leonard, 2013). Essas vesículas extracelulares são secretadas pela maioria das células e são constituintes fisiológicos da maioria dos fluidos biológicos (Vlassov, Magdaleno, Setterquist, & Conrad, 2012). As vesículas extracelulares implicam os subtipos corpos apoptóticos, microvesículas e exossomas (EL Andaloussi, Mâger, Breakefield, & Wood, 2013).

[006] Embora a pesquisa sobre como as vesículas extracelulares podem atuar como mediadores de comunicação intercelular ainda esteja em seus estágios iniciais, a exploração de sua função herdada na entrega de carga bioativa das células “doadoras” para as células “recipientes” tem contribuído com insights valiosos sobre a complexidade de uma entrega de fármaco ideal. Vários estudos identificaram várias condições em que as vesículas extracelulares podem funcionar como carreadores terapêuticos. Há cada vez mais evidências de que esses carreadores possuem características distintas, tornando-os farmaceuticamente superiores a carreadores sintéticos de fármaco. É de particular relevância para essa superioridade uma coleta de proteínas membranares e lipídeos distintos integrados na composição de superfície de vesículas extracelulares.

[007] Existem diversos obstáculos que prejudicam a exploração ou a imitação de carreadores da natureza para sistemas eficientes de entrega de fármaco. De modo mais notável, transformar as vesículas extracelulares de carreadores de mensagem para carreadores de fármaco exige a introdução de moléculas exógenas terapêuticas ou diagnósticas para a célula “doadora”. As respectivas metodologias de engenharia propostas até o presente momento incluem o uso de procedimentos de bioengenharia em células “doadoras” (isto é, modificação genética, transfecção viral, lipofecção catiônica tóxica, etc.), bem como mecanismos de manipulação vigorosa ou prejudicial aplicada a vesículas isoladas (isto é, eletroporação, química de conjugação, etc.). Esses métodos levantam, em última análise, questões de segurança, bem como de escalabilidade e dificultam a tradução na clínica. Outros problemas importantes que ainda precisam ser solucionados incluem controle sobre a integridade estrutural do carreador, encapsulação eficiente de carga ativa e a incorporação de porções químicas de direcionamento adicionais.

[008] De modo ideal, abordagens complexas de funcionalização biomimética que exigem muitos componentes de membrana bioativos incorporados em um nanocarreador sintético poderiam ser evitadas caso membranas de vesícula extracelular intactas fossem exploradas. Por outro lado, a fim de superar as severas consequências de protocolos biotecnológicos, estratégias para introduzir componentes terapêuticos, bem como componentes de direcionamento exógenos às vesículas extracelulares, devem ser independentes, de preferência, de manipulação celular. Com base nessas premissas, pode ser benéfico substituir técnicas de bioengenharia por estratégias nanotecnológicas empregadas em sistemas de entrega de fármaco nanoparticulares modernos.

[009] Tendo em vista as desvantagens mencionadas acima, é um objetivo da invenção fornecer um novo carreador farmacêutico com atributos altamente definidos, sem as desvantagens dos carreadores da técnica anterior, enquanto mantém a sinergia com as vantagens de nanocarreadores sintéticos gerados ex-vivo e vesículas extracelulares de ocorrência in vivo.

[010] Outro objetivo da invenção consiste em fornecer uma composição farmacêutica que compreende o dito novo carreador farmacêutico.

[011] Um objetivo adicional da invenção consiste em fornecer usos e métodos com base no dito novo carreador farmacêutico ou um produto farmacêutico que compreende o mesmo para tratamento, monitoramento, prevenção, estadiamento e/ou diagnóstico de uma doença ou afecção.

[012] Um objetivo adicional da invenção consiste em fornecer um processo para produção do dito novo carreador farmacêutico de maneira controlada envolvendo módulos responsivo a estímulos.

[013] Um objetivo adicional da invenção consiste em fornecer um método para entregar um ou mais bioagentes ativos a uma célula, mais particularmente uma célula selecionada a partir de um leucócito, uma célula glial e uma célula-tronco.

[014] Um objetivo adicional da invenção consiste em fornecer um método para produzir o carreador farmacêutico acima de maneira controlada envolvendo módulos responsivo a estímulos.

[015] Demais propósitos e vantagens desta invenção se surgirão à medida que a descrição prossegue.

Sumário da invenção

[016] A presente invenção fornece um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) que compreende elementos estruturais e bioativos originados de pelo menos um módulo de entrega biocompatível (BDM) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável.

[017] A invenção fornece, ainda, uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma, como definido acima, e pelo menos um carreador, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[018] A invenção ainda fornece adicionalmente um processo para produzir um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) que compreende elementos estruturais e bioativos originados de pelo menos um módulo de entrega biocompatível (BDM) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável, em que o dito processo compreende: (a) fornecer pelo menos um EDEM que tem pelo menos uma porção química fusogênica ou uma composição que compreende o mesmo; (b) fornecer pelo menos um BDM ou uma composição que compreende o mesmo; (c) colocar o dito pelo menos um EDEM em contato com o dito pelo menos um BDM a um pH abaixo 7,4 e a uma temperatura dentre 0 °C e 60 °C, unindo, desse modo, o dito pelo menos um EDEM ao dito pelo menos um BDM e produzindo-se o dito hibridossoma; e, opcionalmente (d) purificar o dito hibridossoma a partir de EDEMs e/ou BDMs não fundidos.

[019] A invenção ainda fornece adicionalmente um método para entregar um ou mais bioagentes ativos a um leucócito, sendo que o dito método compreende colocar uma composição que compreende um hibridossoma, incluindo os dito um ou mais bioagentes ativos em contato com uma composição que compreende o dito leucócito, em que o dito hibridossoma resulta da fusão de pelo menos um EDEM que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável com pelo menos um BDM derivado de leucócito.

[020] A invenção ainda fornece adicionalmente um método para entregar um ou mais bioagentes ativos em uma célula glial, sendo que o dito método compreende colocar uma composição que compreende um hibridossoma, incluindo os dito um ou mais bioagentes ativos em contato com uma composição que compreende a dita célula glial, em que o dito hibridossoma resulta da fusão de pelo menos um EDEM que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável com pelo menos um BDM derivado de célula glial.

[021] A invenção ainda fornece adicionalmente um método para entregar um ou mais bioagentes ativos em uma célula durante uma expansão ex-vivo, sendo que o dito método compreende colocar uma composição que compreende um hibridossoma, incluindo os ditos um ou mais bioagentes ativos, em contato com uma composição que compreende a dita célula, em que o dito hibridossoma resulta da fusão de pelo menos um EDEM que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável com pelo menos um BDM derivado da dita célula.

Breve descrição dos desenhos

[022] As características e vantagens acima e outras características e vantagens da invenção se tornarão mais prontamente aparentes através dos exemplos a seguir e com referência aos desenhos anexos, nos quais:

[023] A FIG. 1 é um gráfico que mostra os espectros de absorção de UV-Vis de Au-iLNPs, Estoque de Au e iLNPs;

[024] A FIG. 2 é uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de Au-iLNPs (barra de escalas: 100 nm);

[025] A FIG. 3 é um histograma de GBM-exos e diâmetros de iLNPs vazias (obtidas por análise de rastreamento de nanopartícula (NTA));

[026] A FIG. 4 é um gráfico que mostra o tamanho médio de partícula após misturar GBM-exos e iLNPs sob condições não ionizantes (pH 7,4), ou em tampão de fusão (pH 5,5) (obtido por meio de difusão dinâmica da luz (DLS));

[027] A FIG. 5 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de GBM-exos e iLNPs com condições de pH tampão variantes;

[028] A FIG. 6 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de GBM-exos e iLNPs que contém 0, 30, 40 ou 50 % de teor de DLinDMA;

[029] A FIG. 7 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de GBM-exo e iLNPs que contém o DODAP ou DLinDMA de lipídio ionizável;

[030] A FIG. 8 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de GBM-exos e iLNPs que contém teor de lipídio PEG variante;

[031] A FIG. 9 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 deGBM-exos e iLNPs em temperaturas variantes;

[032] A FIG. 10 é um gráfico obtido por meio de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência (FCCS) de uma mistura de GBM-exos e iLNPs a um pH 5,5;

[033] A FIG. 11 é um gráfico que mostra a mudança dependente de tempo do diâmetro médio de partícula de uma mistura de GBM-exos e iLNPs a um pH 5,5 monitorado por difusão dinâmica da luz (DLS);

[034] A FIG. 12 é um gráfico que mostra a mudança dependente de tempo do diâmetro médio de partícula e o índice de polidispersidade de uma mistura de MCL-exos e iLNPs a um pH 5,5 monitorado por difusão dinâmica da luz (DLS);

[035] A FIG. 13 exibe cinco histogramas que mostram as distribuições de partícula de iLNPs e misturas de exossomas após 3, 5, 7, 9 e 18 minutos de mistura a um pH 5,5;

[036] A FIG. 14 é um gráfico que mostra a sobreposição de distribuições de tamanho de NTA de iLNPs, exossomas e hibridossomas.

[037] A FIG. 15 é um gráfico que mostra a análise por citometria de fluxo de células que expressam GFP 72 h após a transfecção de quantidades equivalentes de pDNA em iLNPs, iLNPs não fundidas com exossomas e hibridossomas. O tempo indica os momentos de transfecção;

[038] A FIG. 16 é um gráfico que mostra os fótons médios de DLS por segundo indicativos da presença de nanopartículas em cada fração de densidade de gradiente de sacarose de pDNA-iLNPs;

[039] A FIG. 17 é um gráfico que mostra os resultados de uma análise por citometria de fluxo de células que expressam GFP 72 h após a transfecção com densidade de partícula agrupada;

[040] A FIG. 18 é um gráfico que mostra os resultados de uma análise por citometria de fluxo de células que expressam GFP 72 h após a transfecção de quantidades equivalentes de hibridossomas purificados. O tempo indica momentos de transfecção;

[041] A FIG. 19 é um gráfico que mostra os resultados de citometria de fluxo de 24 h de incubação de hibridossomas de IgG purificados identificados com anticorpos secundários IgG (controle: cinza claro, anticorpo secundário IgG: cinza);

[042] A FIG. 20 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de exossomas e iLNPs que contém oligonucleotídeos;

[043] A FIG. 21 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de exossomas e nanopartículas sólidas que encapsulam iLNPs ou oligonucleotídeo/nanopartículas que coencapsulam iLNPs;

[044] A FIG. 22 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de exossomas e proteína que encapsula iLNPs;

[045] A FIG. 23 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de exossomas e iLNPs de superfície modificada;

[046] A FIG. 24 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de pireno de MCL-exossomas por si sós ou misturados com iLNPs produzidos por mistura rápida microfluídica ou por extrusão;

[047] A FIG. 25 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de iLNPs vazias e PMN-MVs identificados em tampão de fusão ou tampão de pH 7,4, bem como iLNPs que encapsulam diferentes espécies de carga;

[048] A FIG. 26 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de fusão de R18 de iLNPs vazias e PLT-MVs identificados em tampão de fusão ou tampão de pH 7,0; e

[049] A FIG. 27 é um histograma que mostra a intensidade média de fluorescência de células Jeko1 transfectadas por 1 h com hibridossomas produzidos com iLNPs identificados com NBD ou iLNPs identificados com NBD por si sós (n=160 células, barra de erro indica o erro padrão).

[002] Descrição detalhada

[001] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) que compreende elementos estruturais e bioativos originados de pelo menos um módulo de entrega biocompatível (BDM) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável.

[002] Como usado no presente documento, os termos “carreador biocompatível híbrido” ou “hibridossoma” se referem a um carreador biocompatível híbrido que compreende elementos estruturais e bioativos (por exemplo, lipídios, carboidratos, ácidos graxos, polinucleotídeos ou polipeptídeos) originados de pelo menos um módulo de entrega biocompatível (BDM) (por exemplo, exossomas, microvesículas, corpos apoptóticos) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende uma porção química fusogênica ajustável. Em uma modalidade específica, o volume interno do hibridossoma contém pelo menos um bioagente ativo originado de um BDM secretado in vivo (por exemplo, polinucleotídeos endógenos, enzimas ou polipeptídeos) e pelo menos um bioagente ativo encapsulado em um EDEM produzido in vitro. Em outra modalidade, o volume interno do hibridossoma compreende apenas componentes naturais originados dos BDMs e pode ser tratado adicionalmente. O hibridossoma da invenção resulta da união de um BDM com um EDEM, diversos BDMs com um EDEM, diversos EDEMs com um BDM, ou diversos BDMs com diversos EDEMs. O evento de união pode ser controlado por meio do tamanho dos BDMs e EDEMs, suas cargas respectivas e as condições aplicadas durante uma reação de união, como a razão BDM/EDEM, o pH, a temperatura e o tempo de reação. Tal estratégia modular para fornecer uma nova composição de unidades separadas pode oferecer um novo nível de flexibilidade de engenharia. Essa união de componentes mensageiros e terapêuticos poderia conferir características únicas ao carreador híbrido resultante, as quais não são possíveis pelos sistemas únicos.

[003] Como usado no presente documento, “Módulo de entrega biocompatível (BDM)” se refere a uma vesícula naturalmente secretada que compreende uma bicamada lipídica, a qual é produzida in vivo e é liberada no ambiente extracelular. BDMs são secretados por vários tipos de células, incluindo, mas sem limitação, células epiteliais, células tumorais e outras células imunológicas (por exemplo, mastócitos, linfócitos T e B, células dendríticas). Os BDMs usados na presente invenção são isolados de fluidos fisiológicos ou uma amostra de tecido obtida de um indivíduo, de preferência, um indivíduo humano, ou são isolados de meios de cultura. Em uma modalidade específica, os BDMs usados na presente invenção são derivados de uma cultura celular em que as células são naturais ou foram imortalizadas e/ou modificadas anteriormente. A cultura celular pode ser homogênea (um tipo de células) ou heterogênea (diversos tipos de células) e pode ser composta por células isoladas e/ou tecido. Os BDMs podem ser isolados ou derivados de um organismo, incluindo procariontes, eucariontes, bactérias, fungos, levedura, invertebrados, vertebrados, répteis, peixe, insetos, plantas e animais. Os meios obtidos de células cultivadas (“meios condicionados”, meios celulares ou meios de cultura celular) podem ser um fluido biológico.

[004] Os BDMs podem ser coletados e isolados com o uso de métodos conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Por exemplo, os BDMs podem ser coletados de uma cultura celular ou um sobrenadante de tecido por uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em, porém, sem limitação, ultracentrifugação diferencial, ultracentrifugação gradiente, filtração, filtração de fluxo tangencial (TFF), filtração por membrana gravada (track-etched) de baixa pressão e combinações dessas. Em uma modalidade, os BDMs usados na presente invenção são preparados por centrifugação de sobrenadante de cultura para peletizar resíduos de célula indesejados, sucedida por ultracentrifugação para peletizar exossomas, ultracentrifugação gradiente de densidade (por exemplo, com gradiente de sacarose) ou uma combinação desses métodos.

[005] Os BDMs úteis para a presente invenção variam de tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 2000 nm e podem conter moléculas biologicamente ativas (por exemplo, polinucleotídeo e/ou polipeptídeos). Exemplos de BDMs incluem, porém, sem limitação, “exossomas” (cerca de 30 nm a cerca de 200 nm de diâmetro), “microvesículas” (cerca de 100 nm a cerca de 2000 nm de diâmetro) e “corpos apoptóticos” (cerca de 300 nm a cerca de 2000 nm de diâmetro). O termo BDM é usado de modo alternável com “exossoma”, “microvesícula” ou “corpo apoptótico”, “partículas membranares”, “vesículas membranares”, “vesículas similares a exossoma”, “vesículas similares a ectossoma”, “ectossomas” ou “exovesículas”. A bicamada lipídica de BDM é derivada de membranas da célula doadora. Os BDMs derivados de diferentes tipos de célula podem mostrar diferenças em composição de lipídio em comparação à membrana plasmática. Durante a gênese de exossomas, as proteínas transmembranares e as proteínas membranares periféricas podem ser integradas na membrana vesicular e, ao mesmo tempo, componentes citosólicos também podem ser incorporados nas vesículas.

[006] Como usado no presente documento, o termo “endógeno” se refere a um composto naturalmente produzido por uma célula e derivado da célula. Por exemplo, um BDM contém um polipeptídeo endógeno se esse polipeptídeo for produzido na célula da qual o BDM é derivado.

[007] Como usado no presente documento, o termo "naturalmente secretado", como aplicado a um carreador, uma partícula, uma vesícula ou molécula, se refere a um carreador, uma partícula, uma vesícula ou molécula que é liberada para o ambiente a partir de uma célula, um organismo ou tecido por um processo encontrado na natureza. Por exemplo, o exossoma que pode ser isolado de uma fonte e que não foi fisicamente deslocado dos limites da fonte por um ser humano no laboratório é naturalmente secretado. Um exemplo não limitante adicional para o processo para secretar partículas na natureza é a fusão de uma organela intracelular com a membrana celular ou borbulhamento da membrana celular.

[008] Como usado no presente documento, “Módulo de Encapsulação de Fármaco Modificado (EDEM)” se refere a uma vesícula que compreende uma ou mais membranas que foram produzidas in vitro. Os EDEMs úteis na presente invenção são selecionados, porém, sem limitação, a partir de nanopartículas à base de lipídios (LNPs), lipossomas, LNPs estabilizados por polímero, cerassomas, esfingossomas, niossomas, polimersomas, LNPs estabilizadas por nanopartícula sintética, nanopartículas híbridas de lipídio-polímero do tipo núcleo e casca, LNPs derivadas de membrana natural, nanopartículas de lipídio rapidamente eliminadas (reLNPs) e LNPs revestidas por membrana natural. Os EDEMs usados na presente invenção têm pelo menos uma propriedade estrutural que permite sua união controlada com BDMs. Em uma modalidade, a dita propriedade estrutural é fornecida por um ou mais constituintes da(s) bicamada(s) lipídica(s) do EDEM. Em uma modalidade específica, o EDEM usado na presente invenção é uma LNP ionizável (iLNP).

[009] Os EDEMs usados na presente invenção podem ter várias morfologias. Podem compreender uma bicamada lipídica (vesícula unilamelar), uma série de bicamadas concêntricas separadas por compartimentos aquosos estreitos (vesícula multilamelar ou MLV) ou polímeros formadores de membrana. Além disso, ao contrário dos BDMs, os EDEMs são substancialmente homogêneos em distribuição de tamanho e densidade. Os EDEMs usados no presente documento têm um diâmetro (diâmetro médio de partícula) de cerca de 15 a cerca de 500 nm. Em algumas modalidades, os EDEMs têm um diâmetro de cerca de 300 nm ou menos, 250 nm ou menos, 200 nm ou menos, 150 nm ou menos, 100 nm ou menos ou 50 nm ou menos. Em uma modalidade específica, o EDEM usado na invenção tem um diâmetro de cerca de 15 a cerca de 150 nm.

[010] Os EDEMs úteis na presente invenção são produzidos de modo a exibir características físico-químicas específicas. As características físico-químicas de cada EDEM específico podem variar de acordo com a natureza e a concentração do(s) agente(s) ativo(s) aprisionados nesse, a composição membranar da membrana polimérica ou bicamada(s) lipídica(s), a natureza do meio em que os EDEMs foram dispersos, seu tamanho e polidispersidade. Em uma modalidade específica da invenção, os EDEMs compreendem uma membrana de bicamada lipídica, incluindo lipídios catiônicos ionizáveis e lipídios auxiliares. Em algumas modalidades específicas, os EDEMs usados para gerar o hibridossoma da invenção são produzidos com base em uma razão molar de DlinDMA:Chol:DSPC:PEG-Cer (razão molar de 40:40:17,5:2,5).

[011] A fabricação de EDEMs pode ser realizada através de uma variedade de maneiras conhecidas na técnica, como apresentado, por exemplo, nas referências a seguir. Essas incluem, por exemplo, sonicação, extrusão, alta pressão/homogeneização, microfluidização, diálise detergente, fusão induzida por cálcio de pequenos lipossomas e métodos de hidratação de filme lipídico. Por exemplo, as LNPs podem ser produzidas com o uso do método de vesícula pré-formada descrita anteriormente (Maurer et al., 2001). Tipicamente, o método consiste em extrusar LNPs através de uma membrana de policarbonato de poro pequeno para reduzir tamanhos de LNPs até uma distribuição de tamanho bem definida e, em um estágio posterior, se for assim exigido, agentes terapêuticos são carregados nas vesículas pré-formadas. De modo alternativo, os EDEMS podem ser preparados por meio de automontagem espontânea em um sistema microfluídico. Os Protocolos para produzir uma distribuição de tamanho bem definida com tais técnicas de fabricação são conhecidos na técnica (Belliveau et al., 2012). De preferência, os EDEMs usados na presente invenção são substancialmente homogêneos em distribuição de tamanho e densidade para facilitar a separação de subpopulações de BDMs e hibridossomas. A separação é produzida com o uso de técnicas bem conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho e centrifugação de gradiente de densidade. Em uma modalidade específica, a densidade dos EDEMs é menor do que aquela do hibridossoma, facilitando, desse modo, a separação das vesículas híbridas dos EDEMs por meio de centrifugação de gradiente de densidade de sacarose.

[012] Como usado no presente documento, a “porção química fusogênica” se refere a lipídios fusogênicos ou quaisquer outros componentes fusogênicos do EDEM ou hibridossoma. Tal porção química fusogênica melhora ou permite a disrupção da membrana ou a mistura lipídica entre uma membrana e uma bicamada lipídica. Por exemplo, a primeira membrana pode ser do EDEM, enquanto a segunda membrana abrange o BDM. De modo alternativo, a primeira membrana pode ser aquela do hibridossoma, enquanto a segunda membrana é uma membrana celular de superfície externa, uma membrana endossomal, uma membrana lisossomal ou uma membrana nuclear. A porção química fusogênica aumenta a interação do EDEM ou do hibridossoma que compreende a dita porção química fusogênica com uma segunda membrana, promovendo, desse modo, a mistura dos lipídios membranares e a mistura do volume interno e do conteúdo encapsulado. De modo alternativo, a porção química fusogênica pode aumentar a entrada em, ou saída de, um compartimento celular. Tais compartimentos podem ser, por exemplo, endossomas ou os núcleos. Em determinadas modalidades, a porção química fusogênica pode ser, por exemplo, um fator de direcionamento, como um polímero sintético disruptor de membrana ou, por exemplo, um polipeptídeo de translocação de membrana responsivo a pH (por exemplo, Melitina). Em algumas modalidades, a porção química fusogênica pode compreender um segmento fusogênico (por exemplo, a cabeça polar de um lipídio, o grupo de cauda de um lipídio, bloco ou região de um polímero, um segmento de um peptídeo).

[013] O termo “ajustável”, como usado no presente documento, significa que, variando-se as condições de reação (por exemplo, pH, temperatura, sais) do método da presente invenção e/ou variando-se as quantidades dos componentes fusogênicos (por exemplo, lipídios ionizáveis, lipídio fusogênico, polímero responsivo a pH, lipídios auxiliares, porção química fusogênica de direcionamento) do EDEM, é possível conferir seletivamente altas propriedades fusogênicas ao EDEM e/ou ao BDM durante a reação de união, enquanto se mantém uma fusogenicidade relativa mais baixa antes ou após a união. De preferência, em cada caso, a porção química fusogênica pode ter fusogenicidade ajustável a uma quantidade desejada (por exemplo, concentração) dessa. Uma característica fusogênica de uma porção química fusogênica pode ser determinada por ensaios adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, a fusogenicidade de um polímero pode ser determinada em um ensaio celular in vitro, como o ensaio de hemólise de hemácias. Uma atividade polimérica endossomalítica pode ser determinada em um ensaio celular in vitro.

[014] O termo “lipídio fusogênico” pode ser usado para se referir a lipídios que são submetidos a uma mudança de estrutura e/ou carga a um baixo pH (isto é, pH de cerca de 5,5), em comparação a sua carga ou estrutura a um alto pH (isto é, pH de cerca de 7,4), o que resulta no fato de que o lipídio se torna mais fusogênico. Esses lipídios fusogênicos podem ser lipídios aniônicos, lipídios neutros ou lipídios sensíveis a pH que são caracterizados por, quando o pH é alterado de aproximadamente pH 7 para aproximadamente pH 4, o lipídio ser submetido a uma mudança na carga ou estrutura de tal modo que se torne mais fusogênico. A mudança na carga ou estrutura também pode ocorrer vice-versa de um pH aproximado de 4 para aproximadamente 6. Em outras modalidades, quando a temperatura é elevada para acima da temperatura de transição de fase, por exemplo, 20 °C, o lipídio fusogênico é submetido a uma mudança na estrutura de tal modo que assuma uma estrutura hexagonal ou forme um cone. Lipídios fusogênicos adicionais desse tipo são conhecidos na técnica e podem ser usados nas formulações, complexos e métodos descritos no presente documento. Alguns exemplos desses lipídios “fusogênicos” mudam de estrutura para adotar uma estrutura hexagonal, enquanto outros exemplos desses lipídios são submetidos a uma mudança de carga. Esses lipídios fusogênicos também podem incluir aqueles denominados como lipídios “formadores de cone” na técnica. O termo “lipídio fusogênico” também pode ser usado para se referir a lipídios que exibem propriedades de formato molecular de formação de cone de tal modo que o framework de lipídio compreende uma pequena cabeça polar em corte transversal e uma maior área em corte transversal de cadeia de acila. Sem se ater a nenhuma teoria específica, acima de uma temperatura específica (por exemplo, 20 °C), acredita-se que esses lipídios induzem uma transição de fase HII hexagonal não bicamada.

[015] Como usado no presente documento, os termos “lipídio” e “lipoide” se referem a um grupo de compostos orgânicos que compreendem uma cabeça polar que é ligada a um gripo de cauda lipofílico por meio de um grupo ligante. Lipídios são caracterizados, em geral, por serem insolúveis em água, porém, solúveis em muitos solventes orgânicos. Os lipídios são usualmente divididos em pelo menos três classes: “lipídios simples” que incluem gorduras e óleos; “lipídios compostos” que incluem fosfolipídeos e glicolipídios; e “lipídios derivados”, como esteroides. Os termos “lipídio” e “lipoide” podem ser usados de modo alternável.

[016] Como usado no presente documento, “lipídio auxiliar” se refere a lipídios de estabilização, incluindo lipídios neutros e lipídios aniônicos. Alguns EDEMs usados na presente invenção compreendem ou podem ser enriquecidos com um ou mais lipídios auxiliares, como colesterol e 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC). Um lipídio neutro se refere a diversas espécies de lipídio que existem em uma forma zwiteriônica neutra ou não carregada a um pH fisiológico. Os lipídios representativos incluem, porém, sem limitação, distearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil- fosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoil- fosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE) e dioleoil- fosfatidi-letanolamina, dipalmitoil-fosfatidil-etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfo-etanolamina (DMPE), distearoil- fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometila PE, 16-O- dimetila PE, 18-1-trans PE, 1-estearioil-2-oleoil- fosfatidietanolamina (SOPE) e 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (transDOPE). Um lipídio aniônico é um lipídio que é negativamente carregado a um pH fisiológico. Esses lipídios incluem fosfatidilglicerol, diacilfosfatidilserina, cardiolipina e lipídios neutros modificados com grupos modificadores aniônicos.

[017] Como usado no presente documento, um “lipídio catiônico ionizável” se refere a um lipídio que porta uma carga líquida positiva a um pH selecionado (por exemplo, abaixo do pH fisiológico). Tais lipídios incluem, porém, sem limitação, 1,2-DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]- dioxolano (DLin-KC2-DMA), heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen- 19-il4-(dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA), dioctadecil- dimetilamônio (DODMA), Distearildimetilamônio (DSDMA), cloreto de N,N-dioleil-N,N-dimetil-amônio (DODAC); cloreto de N-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetil-amônio (DOTMA); 1,2- dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), N-(4- carboxibenzil)-N,N-dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOBAQ), YSK05, ácido 4-(((2,3-bis(oleoiloxi)propil)- (metil)amino)metil)benzoico (DOBAT), N-(4-carboxibenzil)-N,N- dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOBAQ), ácido 3- ((2,3-bis(oleoiloxi)propil)(metil)amino)propanoico (DOPAT), N-(2-carboxipropil)-N,N-dimetil-2,3-bis-(oleoiloxi)-propan-1- amínio (DOMPAQ), N- carboximetil)-N,N-dimetil-2,3- bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOAAQ), Alni-100, 3- (dimetilamino)-propil(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12- dien-1-il]-henicosa-12,15-dienoato (DMAP-BLP) e 3-(N—(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol).

[018] Em algumas modalidades, o lipídio catiônico ionizável pode ser um lipídio amino. Como usado no presente documento, o termo "lipídio amino" pretende incluir aqueles lipídios que têm uma ou mais cadeias de ácido graxo ou de alquila graxa e uma cabeça polar de amino (incluindo um grupo alquilamino ou dialquilamino) que pode ser protonada para formar um lipídio catiônico. Em determinadas modalidades, lipídios amino ou catiônicos da invenção têm pelo menos um grupo protonável ou desprotonável, de tal modo que o lipídio seja positivamente carregado a um pH igual ou abaixo do pH fisiológico (por exemplo, pH 7,4), e neutro a um segundo pH, de preferência, igual ou acima do pH fisiológico. Será compreendido, evidentemente, que a adição ou remoção de prótons como um função de pH é um processo de equilíbrio, e que a referência a um lipídio carregado ou neutro se refere à natureza das espécies predominantes e não exige que todo o lipídio esteja presente na forma carregada ou neutra. Os lipídios que têm mais de um grupo protonável ou desprotonável, ou que são zwiteriônico, não são excluídos do uso na invenção.

[019] Em uma modalidade, o lipídio catiônico pode ser sintetizado por métodos conhecidos na técnica e/ou como descrito nas Publicações Internacionais nos WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 WO201021865 e WO2014089239; bem como a Publicação no US US20140309277; sendo que cada uma é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[020] Deve-se observar que o termo "ionizável" se refere a um composto que tem pelo menos um local ionizável em sua estrutura molecular e não significa necessariamente "ionizado", isto é, o lipídio catiônico ionizável pode estar na forma ionizada ou não ionizada. Em algumas modalidades específicas, os EDEMs usados na presente invenção compreendem uma combinação de lipídios catiônicos ionizáveis apresentados acima (por exemplo, DLinDMA, DLin-KC2-DMA e/ou DLin-MC3-DMA) para personalizar precisamente a carga líquida de superfície catiônica dos hibridossomas a um pH fisiológico.

[021] O termo “polímero responsivo a pH” se refere a um polímero que a um baixo pH é submetido a uma mudança de estrutura ou carga, em comparação à sua carga ou estrutura ao pH fisiológico (pH de cerca de 7,4), o que resulta no fato de que o polímero se torna mais fusogênico. Em algumas modalidades não limitantes da invenção, os polímeros podem ser produzidos a partir de homopolímeros de ácidos alquil acrílicos, como ácido butil acrílico (BAA) ou ácido propil acrílico (PAA), ou podem ser copolímeros de ácido etil acrílico (EAA). Polímeros de derivados de alquil amina ou alquil álcool de copolímeros de anidrido maleico com éter metil vinílico ou estireno também pode ser usado. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser produzidos como copolímeros com outros monômeros. A adição de outros monômeros pode melhorar a potência dos polímeros, ou adicionar grupos químicos com funcionalidades úteis para facilitar a associação com outras entidades moleculares, incluindo a porção química de direcionamento e/ou outros materiais adjuvantes, como poli(etilenoglicol). Esses copolímeros podem incluir, porém, sem limitação, copolímeros com monômeros que contém grupos que podem ser reticulados a uma porção química de direcionamento.

[022] Em geral, o polímero responsivo a pH é composto por resíduos monoméricos com propriedades particulares. Resíduos monoméricos aniônicos compreendem uma espécie carregada ou carregável a um ânion, incluindo uma espécie aniônica protonável. Resíduos monoméricos aniônicos podem ser aniônicos a um pH aproximadamente neutro de 7,2 a 7,4. Resíduos monoméricos catiônicos compreendem uma espécie carregada ou carregável a um cátion, incluindo uma espécie catiônica desprotonável. Os resíduos monoméricos catiônicos podem ser catiônicos a um pH aproximadamente neutro de 7,2 a 7,4. Os resíduos monoméricos hidrofóbicos compreendem uma espécie hidrofóbica. Os resíduos monoméricos hidrofóbicos compreendem uma espécie hidrofílica.

[023] Em geral, cada polímero pode ser um homopolímero (derivado de polimerização de um único tipo de monômero que tem essencialmente a mesma composição química) ou um copolímero (derivado de polimerização de dois ou mais monômeros diferentes que tem diferentes composições químicas). Polímeros que são copolímeros incluem cadeias de copolímero aleatórias ou cadeias de copolímero de bloco (por exemplo, copolímero de dibloco, copolímero de tribloco, copolímero de bloco de maior ordem, etc.). Qualquer cadeia de copolímero de bloco dada pode ser convencionalmente configurada e realizada de acordo os métodos conhecidos na técnica. Em geral, cada polímero pode ser um polímero linear ou um polímero não linear. Polímeros não lineares podem ter várias arquiteturas, incluindo, por exemplo, polímeros ramificados, polímeros escova, polímeros estrela, polímeros dendrímeros, e podem ser polímeros reticulados, polímeros semirreticulados, polímeros de enxerto e combinações desses.

[024] Como usado no presente documento, o termo “unir”, “unindo”, “união” ou “fusão” se refere a uma interação direta entre a membrana e/ou constituintes da membrana de um ou mais EDEMs e BDMs. O termo “interações diretas” pode se referir a uma simples agregação, troca lipídica, disrupção estrutural, hemifusão e fusão. Os termos "hemifusão" e "fusão" se referem à mistura parcial ou completa dos componentes das membranas do BDM e EDEM e a formação de um espaço interno comum que compreende o material originalmente contido em cada um dos BDMs/EDEMs que formam a partícula fundida (por exemplo, agente ativo, proteína ou ácido nucleico). O termo "eficiência de fusão " se refere à quantidade relativa de hibridossomas gerados de EDEMs e BDMs que são submetidos à fusão.

[025] Como usado no presente documento, o termo “membrana” se refere a uma “casca” que compreende moléculas alifáticas, como ácido graxo, moléculas lipídicas ou polímeros e encerra um compartimento interno. Como tal, esse termo pode ser usado para definir a membrana de uma nanopartícula lipídica, de um polimerossomo, de uma partícula naturalmente secretada, ou de qualquer tipo de célula, incluindo células bacterianas, fúngicas, vegetais, animais ou humanas (por exemplo, células epiteliais). O termo membrana também inclui bicamadas lipídicas intracelulares, como, por exemplo, membranas endossomais ou lisossomais, bem como membranas nucleares.

[026] O inventor constatou surpreendentemente que o hibridossoma da invenção apresenta diversas vantagens sobre os outros carreadores farmacêuticos conhecidos na técnica, os quais são obtidos unindo-se fisicamente EDEMs com BDMs e sinergizando as vantagens mostradas por cada um desses módulos. Por outro lado, os EDEMs podem ser projetados para terem propriedades físico-químicas precisamente definidas, fusogenicidade ajustável, altas eficiências de encapsulação para uma ampla gama de agentes ativos, resistência a ambientes adversos necessários para química de conjugação e conformidade com exigências de fabricação clínica. Por outro lado, os BDMs têm uma toxicidade e perfis de imunogenicidade seguros, mostram especificidade inata para um alvo (por exemplo, uma célula, tecido ou órgão) e são otimizados em relação a propriedades de circulação de organismos. Portanto, o hibridossoma da invenção é de particular interesse para aplicações de terapia, imaginologia e diagnóstico. Uma ampla variedade de agentes ativos pode ser facilmente encapsulada in vitro em EDEMs e, unindo-se os ditos EDEMs com BDMs específicos originados do indivíduo, um hibridossoma biocompatível personalizado, incluindo os agentes ativos, é gerado. O hibridossoma da invenção também pode apresentar uma ou mais das seguintes vantagens: (a) uma redução de sequestro dos macrófagos do sistema reticuloendotelial (RES); (b) uma redução da resposta do sistema imunológico; (c) uma vida útil de circulação aumentada; (d) a entrega com direcionamento específico e melhorado; e (e) um aumento nos efeitos terapêuticos e/ou de monitoramento.

[027] De modo vantajoso, as dimensões do hibridossoma da invenção podem ser personalizadas de modo a se ajustar a aplicações muito específicas e direcionadas. Consequentemente, em algumas modalidades da presente invenção, as características estruturais específicas dos EDEMs e BDMs usados para produzir o hibridossoma podem ser selecionadas para facilitar a distribuição do hibridossoma em tecidos-alvo. Por exemplo, a fim de direcionar tecidos de tumor sólido, um ou mais dos módulos básicos (EDEM ou BDM) podem ser selecionados para que as dimensões do hibridossoma resultante sejam menores do que vãos fenestrados encontrados na vasculatura “permeável” em tumores sólidos. Desse modo, esse hibridossoma personalizado pode ser extravasado prontamente através de fenestrações da vasculatura e direcionam diretamente as células tumorais do espaço intersticial. De maneira similar, a fim de direcionar hepatócitos, um ou mais dos módulos básicos podem ser selecionados/modificados para que o hibridossoma resultante seja menor do que as fenestrações da camada endotelial que reveste sinusoides hepáticos no fígado. Desse modo, o hibridossoma seria capaz de penetrar facilmente as fenestrações endoteliais para alcançar os hepatócitos direcionados. Ao contrário, o hibridossoma da invenção pode ser projetado de tal modo que suas dimensões limitem ou impeçam sua distribuição para determinadas células ou tecidos. Em algumas modalidades específicas, o hibridossoma tem um tamanho compreendido entre 20 e 800 nm, de preferência, entre 50 e 400 nm e, mais preferencialmente, entre 100 e 200 nm.

[028] Em algumas modalidades específicas, o BDM e/ou o EDEM usados para gerar o hibridossoma compreende um ou mais dentre endocitose mediada por receptor, endocitose mediada por clatrina e mediada por cavéola, fagocitose e macropinocitose, fusogenicidade, disrupção endossomal ou lisossomal e/ou propriedades liberáveis que conferem a tais hibridossomas vantagens relativas a outros sistemas de entrega classificados de maneira similar.

[029] A citotoxicidade e/ou biocompatibilidade do EDEM usado na presente invenção são reduzidas selecionando-se especificamente os lipídios compreendidos em sua(s) bicamada(s) lipídica(s), melhorando adicionalmente, desse modo, a biocompatibilidade do hibridossoma resultante. Portanto, o EDEM usado na presente invenção não tem lipídios tóxicos de transfecção, como Lipofectamine e HiPerFect, os quais são substituídos de modo vantajoso por um ou mais lipídios catiônicos ionizáveis, como DLinDMA, DLin-KC2-DMA e/ou Dlin-MC3-DMA. Os lipídios catiônicos ionizáveis podem ser usados como o único lipídio ionizável do EDEM (por exemplo, iLNPs) ou podem ser combinados com lipídios auxiliares e/ou lipídios modificados com PEG.

[030] Como mencionado acima, o uso de EDEMs como um componente do hibridossoma da invenção oferece vantagens substanciais: (1) os EDEMs podem ser produzidos por métodos de ampla escala e quantidades substanciais de agente(s) ativo(s) encapsulado(s) podem ser produzidas; (2) a eficiência de encapsulação de agente ativo é alta; (3) o tamanho dos EDEMs produzidos pode ser controlado para que os hibridossomas resultantes possam ser produzidos com um tamanho terapeuticamente ideal; (4) devido ao fato de que os EDEMs são produzidos in vitro, algumas características estruturais específicas podem ser mentidas a fim de facilitar a separação de subpopulações não unidas; (5) EDEMs não são capazes de resistir a ambientes adversos necessários para química de conjugação; e (6) os EDEMs usados na invenção têm uma fusogenicidade ajustável. Como diversos EDEMs podem ser unidos a um ou mais BDMs, pode ser possível geral separadamente EDEMs que encapsulam diferentes agentes ativos (que não puderam ser encapsulados juntamente por algum motivo, como solubilidade diferente em solvente, etc.) e, então, então, unir cada um dos ditos diferentes EDEMs a um ou mais BDMs, gerando, desse modo, um hibridossoma que compreende todos os agentes ativos desejados.

[031] Em algumas modalidades particulares, o EDEM usado na invenção é modificado com uma porção química de direcionamento e/ou uma porção química de estabilização.

[032] Os EDEMs usados na presente invenção exibem estabilidade física e química melhorada em comparação a subunidades de BDM. Consequentemente, enquanto os BDMs mostram uma boa estabilidade em um ambiente fisiológico, os EDEMs são capazes de resistir a ambientes versáteis exigidos para química de conjugação e pós-inserções. Por exemplo, os EDEMs podem preservar a estabilidade quando em contato com agentes de redução (por exemplo, ditiotreitol (DTT)). Em conjunto com essa estabilidade melhorada, a presente invenção contempla a modificação de superfícies de EDEM com o uso de excipientes adicionais. Em uma modalidade, o termo “modificado” pode ser usado para caracterizar um EDEM modificado em relação ao EDEM produzido a partir do qual aquele EDEM modificado foi preparado. Consequentemente, “modificado” também pode se referir a alterações em formulações de EDEM já que composições de EDEM da presente invenção podem ser enriquecidas com porções químicas fusogênicas ou lipídios adicionais catiônicos, não catiônicos e modificados por PEG a demais tecidos-alvo ou células-alvo.

[033] Os EDEMs usados na presente invenção podem ser preparados para conferir o direcionamento preferencial dos hibridossomas a tecidos, células ou órgãos específicos, como o coração, pulmões, rins e/ou cérebro. Por exemplo, os EDEMs como os iLNPs podem ser preparados para alcançar uma entrega melhorada para as células-alvo e tecidos-alvo.

[034] Como usado no presente documento, "porções químicas de direcionamento" são excipientes que podem ser ligados (covalente ou não covalentemente) in vitro ao EDEM para incentivar a interação do hibridossoma com determinadas células-alvo ou tecidos-alvo. Como usado nessa revelação, “ligado” ou “conjugado” significa que duas entidades (no presente documento, uma porção química de direcionamento e uma vesícula carreadora) são associadas com afinidade suficiente para que o benefício terapêutico/diagnóstico da associação entre as duas entidades seja realizado. Por exemplo, o direcionamento pode ser mediado pela inclusão de um ou mais ligantes de direcionamento (por exemplo, anticorpo monoclonal) no interior ou no hibridossoma para incentivar a entrega às células-alvo ou aos tecidos-alvo. O reconhecimento do ligante de direcionamento pelos tecidos direcionados facilita ativamente a distribuição de tecido e a absorção celular do conteúdo do hibridossoma pelas células-alvo e tecidos-alvo. Os ligantes adequados são selecionados com base em suas propriedades físicas, químicas ou biológicas (por exemplo, afinidade seletiva e/ou reconhecimento de marcadores celulares de superfície alvejados ou recursos).

[035] Os ligantes de direcionamento são selecionados de tal modo que as características únicas de uma célula-alvo sejam exploradas, permitindo, desse modo, que o hibridossoma discrimine entre células-alvo e células-não alvo. Tais porções químicas de direcionamento podem incluir, porém, sem limitação, qualquer membro de um par de ligação específico, anticorpos, anticorpos monoclonais, bem como derivados ou análogos desses, incluindo fragmentos de domínio variável (Fv), fragmentos de cadeia única Fv (scFv), fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, anticorpos de domínio único; fragmentos de anticorpo, anticorpos humanizados, fragmentos de anticorpo; versões multivalentes daqueles mencionados.

[036] São contemplados hibridossomas que compreendem um ou mais ligantes (por exemplo, peptídeos, aptâmeros, oligonucleotídeos, uma vitamina ou outras moléculas) que são capazes de melhorar a afinidade das composições com uma ou mais células-alvo ou tecidos-alvo. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento pode abranger a superfície de uma nanopartícula de lipídio (por exemplo, um glicosaminoglicano) que é integrada ou encapsulada no hibridossoma. Em uma modalidade, os hibridossomas incluem reagentes de ligação multivalentes, incluindo, sem limitação: anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos, como fragmentos Fv estabilizados por dissulfeto, fragmentos scFv em tandem ((SCFV)2), diacorpos, tricorpos ou tetracorpos, os quais são tipicamente fragmentos scFv ligados covalentemente ou, de outro modo, estabilizados (isto é, estabilizado por hélice ou zíper de leucina); e outras porções químicas de endereçamento (homing) incluem, por exemplo, aptâmeros, receptores e proteína de fusão.

[037] Em algumas modalidades, o hibridossoma pode ser utilizado para regimes de afinidade multiespecíficos. Pelo presente documento, o hibridossoma compreende pelo menos duas porções químicas de direcionamento distintas covalentemente ligadas à superfície do hibridossoma. A primeira porção química de direcionamento se liga especificamente a um antígeno ou molécula na superfície celular (isto é, antígeno de superfície celular), e a segunda porção química de direcionamento se liga a um alvo intracelular. Em algumas modalidades, a primeira porção química de direcionamento e a segunda porção química de direcionamento estão incluídas em uma única cadeia de polipeptídeo. Em determinadas modalidades, uma parte ou toda uma porção química de direcionamento é composta por aminoácidos (incluindo aminoácidos naturais, não naturais e modificados), ácidos nucleicos e aptâmero ou sacarídeos. Em determinadas modalidades, uma porção química de direcionamento é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, a porção química de direcionamento intracelular é exógena e conjugada ao EDEM, enquanto a porção química de direcionamento extracelular está presente no BDM e é produzida in vivo. Em outra modalidade, a porção química de direcionamento intracelular gerada in vivo está presente no BDM, enquanto uma porção química de direcionamento extracelular é conjugada ao EDEM.

[038] A “primeira porção química de direcionamento” em uma modalidade biespecífica pode ser um anticorpo, molécula similar a anticorpo, peptídeo, ou uma molécula pequena, tais como vitaminas, por exemplo, folato, açúcares tais como lactose e galactose, ou outras moléculas pequenas. O antígeno de superfície celular pode ser qualquer molécula de superfície celular que passa por internalização, tal como uma proteína, açúcar, grupo polar do lipídio ou outro antígeno na superfície celular. Exemplos de antígenos de superfície celular úteis no contexto da presente invenção incluem, porém, sem limitação, as tetraespaninas, o receptor de EGF, HER2/Neu, receptor de VEGF, integrinas, CD38, CD33, CD19, CD20, CD22 e o receptor de asialoglicoproteína.

[039] A “segunda porção química de direcionamento”, em uma modalidade biespecífica, reconhece um alvo intracelular. Essa porção química de direcionamento se liga especificamente a um antígeno ou superfície de membrana intracelular, tal como uma proteína. Em determinadas modalidades, uma porção química de direcionamento intracelular melhorará a localização de uma substância a um local intracelular desejado. Em algumas modalidades, a segunda porção química de direcionamento é proteinácea e, em determinadas modalidades, é um anticorpo ou molécula similar a anticorpo. Outras segundas porções químicas de direcionamento incluem peptídeos, tais como, por exemplo, os análogos de peptídeo melitina sintéticos, e macromoléculas orgânicas que, em virtude de seu tamanho (um peso molecular de >500 g) , carga, ou outras propriedades físico-químicas, não têm capacidade ou têm capacidade insuficiente de entrar nas células independentemente. Em algumas modalidades, a segunda porção química de direcionamento é um aptâmero de ácido nucleico. A segunda porção química de direcionamento pode se ligar a proteínas citosólicas; proteínas ligadas à face interna da membrana plasmática, ou a membrana nuclear, mitocondrial ou outras membranas na célula; ou proteínas nucleares ou proteínas em outros compartimentos subcelulares. Estará evidente para aqueles versados na técnica que a porção química de direcionamento que bloqueia as funções críticas de sinalização intracelular serão boas candidatas para o uso como segundas porções químicas de direcionamento. As segundas porções químicas de direcionamento podem diretamente inibir a atividade de uma proteína, ou bloquear uma interação com um substrato de proteína, ou essas podem bloquear as interações proteína-proteína.

[040] Uma modalidade adicional abrange a incorporação de porções químicas de direcionamento funcionais complementares para melhorar o transporte intracelular de hibridossoma ativo. Um exemplo para o transporte intracelular melhorado é alcançado empregando-se porções químicas de direcionamento com capacidade para “sequestrar”, ligar ou participar de sistemas de transporte intracelular ativo naturais. Por exemplo, a ligação de uma dessas proteínas do complexo de motor de microtúbulos com um peptídeo de ligação de proteína motora permite o transporte ativo ao longo da rede de transporte de microtúbulos. Proteínas motoras exemplificativas incluem, porém, sem limitação, dineína e cinesina.

[041] Em determinadas modalidades, a segunda porção química de direcionamento possui um duplo papel, a saber, capacidades de penetração membranar e funcionalidades de direcionamento intracelular. Por exemplo, o peptídeo melitina ou análogos desse possuem uma capacidade de interação com membrana em baixo pH e uma funcionalidade de endereçamento nuclear no citosol. Esse duplo papel pode ser atribuído a um segmento da segunda porção química de direcionamento. Por exemplo, funções de direcionamento nuclear mediadas através de sequências de localização nuclear (por exemplo, sequência de peptídeos “KRKR”) e segmentos de hélice α anfipática contidos na mesma segunda porção química de direcionamento. Por isso, em determinadas modalidades o duplo papel de uma segunda porção química de direcionamento pode mediar duas funções complementares ao hibridossoma. Composições de hibridossoma exemplificativas modificadas com segunda porção química de direcionamento de duplo propósito são descritas nos Exemplos abaixo.

[042] Além disso, os EDEMs da invenção podem ser modificados para exibir moléculas com propriedades anfipáticas tais como peptídeos de penetração celular em sua superfície. Esses peptídeos são distinguidos por sua capacidade de perturbar a integridade da bicamada membranar, gerando-se defeitos, disrupção, ou formando-se poros, o que leva a uma interação entre EDEMs e BDMS. Exemplos de tais peptídeos podem ser derivados de proteínas tais como Tat e Rev bem como peptídeos derivados de toxinas tais como crotamina ou melitina. Uma classe preferencial de peptídeos de penetração celular adequados para o uso na presente invenção inclui domínios hidrofóbicos que são “inertes” em pH fisiológico, mas são ativos no ambiente de baixo pH. Mediante a exposição e desdobramento induzido por pH do domínio hidrofóbico, a porção química se liga a bicamadas lipídicas e efetua a interação entre EDEMs e BDMs ou hibridossomas e compartimentos endossômicos. A conjugação exemplificativa de um peptídeo fusogênico é descrita nos Exemplos abaixo.

[043] Também é contemplada pela presente invenção a incorporação de moléculas funcionais complementares bio- ortogonais e quimiosseletivas nos ou sobre os EDEMs para melhorar a união específica de sítio com BDMs. Por exemplo, a incorporação de peptídeos de fusão na bicamada lipídica de EDEM, tais como proteínas SNARE (receptores de proteína de ligação de fator sensível à N-etilmaleimida) ou mímicos sintéticos desses, permitem uma interação específica de receptor entre EDEMs e BDMs.

[044] Em uma modalidade, para facilitar a conjugação de porções químicas de direcionamento ao EDEM, uma porção da razão molar de lipídio modificado por PEG pode ser substituída por lipídios modificados por PEG com uma entidade funcional tal como uma maleimida (por exemplo, 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [maleimida(polietileno glicol)-2000]) ou um grupo amina (por exemplo, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [amino(polietileno-glicol)-2000]) na extremidade distal do PEG. Métodos de conjugação exemplificativos são descritos nos Exemplos abaixo.

[045] Os EDEMs descritos no presente documento podem compreender adicionalmente uma porção química de proteção ancorada na bicamada lipídica. Como usado no presente documento, o termo "porção química de estabilização" se refere a uma molécula que pode modificar as propriedades de superfície do hibridossoma através do componente de EDEM incluído nesse. Uma porção química de estabilização pode evitar que o hibridossoma se fixe a outro ou se fixe a células sanguíneas ou paredes vasculares. Em determinadas modalidades, os hibridossomas com porções químicas de estabilização têm imunogenicidade reduzida quando são administrados a um indivíduo. Em uma modalidade, porções químicas de estabilização também podem aumentar o tempo de circulação sanguínea dos hibridossomas em um indivíduo. Porções químicas de estabilização para o uso na presente invenção podem incluir aquelas geralmente bem conhecidas na técnica.

[046] Exemplos de porções químicas de estabilização incluem, porém, sem limitação, compostos que compreendem polietileno glicol e outros compostos tais como, porém, sem limitação, dendrímeros, óxido de polialquileno, álcool polivinílico, policarboxilato, polissacarídeos, e/ou amido de hidroxialquila, que reduzem a interação ou ligação do complexo a espécies presentes in vivo ou in vitro, tais como proteínas complementares séricas, cofatores, hormônios ou vitaminas. O termo “lipídio modificado por PEG” se refere, a porém, sem limitação, a uma cadeia de polietileno glicol de até 20 kDa de comprimento, conjugado de modo covalente a um lipídio com cadeia(s) de alquila de C6-C20 de comprimento. Em determinadas modalidades, polietilenoglicol-lipídios adequados incluem fosfatidiletanolamina (PEG-PE) modificada por PEG, ceramidas modificadas por PEG (por exemplo, PEG- CerC20), dialquilaminas modificadas por PEG, diacilgliceróis modificados por PEG e dialquilgliceróis modificados por PEG. Em uma modalidade, o polietileno glicol-lipídio é (Metóxi Polietileno Glicol)2000-dimiristolglicerol (PEG-s-DMG). Outros exemplos não limitantes de lipídios modificados por PEG incluem PEG-dialquiloxipropila (DAA), R-3-[(o-metoxi- poli(etileno glicol)2000)carbamoil)] -1,2-dimiristiloxipropil- 3-amina (PEG-c-DOMG) e N-Acetilgalactosamina-((R)-2,3- bis(octadeciloxi)propil-1-(metóxi poli(etileno glicol)2000)propilcarbamato)) (GalNAc-PEG-DSG).

[047] A invenção contempla que, visto que o PEG é exibido na superfície do EDEM, BDM e/ou hibridossomas, compostos diferentes de lipídios, tais como, por exemplo, peptídeos, polímeros ou âncoras hidrofóbicas, carboidratos, metais ou outros íons podem ser usados para a conjugação com PEG para ancorar esses compostos na bicamada lipídica.

[048] Voltando-se para BDMs, a presente invenção contempla que moléculas bioativas no citosol e membrana plasmática são incorporados durante a gênese de BDMs, resultando em BDMS que têm propriedades funcionais únicas que permitem que os BDMs sejam utilizados como carreadores de nanopartículas eficazes de agentes ativos. Em relação a isso, os BDMs têm capacidade para entregar um agente ativo a células-alvo e tecidos, ao mesmo tempo que retêm a atividade biológica de carga endógena, bem como os agentes ativos. Em particular, os BDMs mostram meia-vida de soro otimizada evolucionária e interação com células e/ou tecidos-alvo. A capacidade de entrega vantajosa de um ou mais BDMs é transferida para o hibridossoma da invenção após a união dos BDMs com um ou mais EDEMs. Além disso, os BDMs têm capacidade para transferir componentes bioativos endógenos para o hibridossoma. Em uma modalidade específica, um ou mais BDMs são coletados e usados para promover a liberação de miRNA endógeno, polinucleotídeos e polipeptídeos produzidos in vivo por células doadoras, no volume encerrado pelo hibridossoma da invenção. Em uma outra modalidade, um ou mais BDMs são coletados e usados para promover a transferência de moléculas bioativas e/ou polipeptídeos integrados na membrana de BDM como constituintes da membrana do hibridossoma.

[049] Em algumas modalidades, os BDMs usados na invenção são derivados de um indivíduo doador que sofre de uma doença ou um distúrbio, tal como câncer. Sem se ater a qualquer teoria particular, espera-se que pelo menos alguns dos BDMs coletados do indivíduo tenham a capacidade de direcionar especificamente as células associadas à dita doença ou distúrbio e, portanto, possam ser vantajosamente usados para monitorar ou tratar a doença. Além disso, componentes dos BDMs usados na invenção podem interagir com células específicas e facilitar a endocitose, permitindo, desse modo, a entrega direcionada de material encapsulado para uma célula específica, tipo de célula ou tecido. Sem se ater a qualquer teoria particular, a especificidade de célula-alvo dos BDMs usados na invenção depende do tipo de célula da qual o BDM é derivado. Por exemplo, os BDMs derivados de células B ou células de Glioblastoma podem ser usados para produzir os hibridossomas da invenção. Tais BDMs podem transferir uma ou mais células B endógenas ou porções químicas de direcionamento de Glioblastoma produzidas in vivo para o hibridossoma, tornando específica, desse modo, a célula B de hibridossoma ou glioblastoma. Também, se espera que o hibridossoma reintroduzido no indivíduo de quem o BDM usado para produzir o hibridossoma é derivado, os componentes de BDM transferidos para o hibridossoma o tornam compatível com o sistema imune do dito indivíduo.

[050] Em algumas modalidades, a célula da qual o BDM é derivado é uma célula tumoral. A célula tumoral pode ser uma célula tumoral primária, ou pode ser produzida a partir de uma célula tumoral, por exemplo, através de passagem, cultura, expansão, imortalização etc. Desse modo, a célula tumoral pode ser de um tumor em um paciente com câncer ou pré-câncer, ou pode ser de uma linha celular de câncer ou tumor. A célula tumoral pode ser de um tumor benigno ou um tumor maligno.

[051] Em outras modalidades, a célula da qual o BDM é derivado é uma célula infectada, isto é, uma célula que contém um patógeno.

[052] Em outras modalidades, a célula da qual o BDM é derivado é uma célula mutada. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula mutada expressa proteínas mutantes ou mal dobradas. Em algumas modalidades, a célula mutada superexpressa uma ou mais proteínas. Em algumas modalidades a célula mutante está envolvida em um distúrbio degenerativo, tal como um distúrbio proteopático. Em algumas modalidades, a célula é uma célula do sistema nervoso central.

[053] Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção compreende um hibridossoma que não contém quaisquer agentes terapêuticos e/ou agentes de diagnóstico em seu compartimento interno. Tal hibridossoma pode ser produzido, por exemplo, unindo-se um EDEM “vazio” com um BDM. Em algumas modalidades particulares, o EDEM “vazio” compreende algum elemento estrutural em sua membrana que facilita o carregamento adicional de agentes ativos através de um conjunto de procedimentos conhecidos na técnica (por exemplo, eletroporação).

[054] Como usado no presente documento, “agente ativo” ou “agente bioativo” se refere a qualquer composto ou mistura de compostos que produz um resultado fisiológico, por exemplo, um resultado benéfico ou útil, mediante o contato com um organismo vivo, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano. Agentes ativos são distinguíveis de outros componentes das composições de entrega, tais como carreadores, diluentes, ligantes, corantes etc. O agente ativo pode ser qualquer molécula, bem como porção de ligação ou fragmento dessa, que tem capacidade para modular um processo biológico em um indivíduo vivo. Em determinadas modalidades, o agente ativo pode ser uma substância usada no diagnóstico, tratamento, ou prevenção de uma doença ou como um componente de uma medicação. Em algumas modalidades, um agente ativo pode se referir a um composto que facilita a obtenção de informações de diagnóstico a respeito de um sítio direcionado no corpo de um organismo vivo, tal como um mamífero ou em um ser humano. Por exemplo, agentes de imaginologia podem ser classificados como agentes ativos, na presente invenção, visto que são substâncias que fornecem informações de imaginologia necessárias para o diagnóstico.

[055] Em algumas outras modalidades, o hibridossoma da composição compreende um ou mais agentes terapêuticos e/ou agentes de diagnóstico. Como descrito acima, esses agentes terapêuticos e/ou agentes de diagnóstico são primeiramente encapsulados em um EDEM e depois transferidos para o compartimento interno do hibridossoma unindo-se o dito EDEM com um BDM.

[056] Como usado no presente documento, um “agente terapêutico” é uma substância fisiológica ou farmacologicamente ativa que pode produzir um efeito biológico desejado em um sítio direcionado em um animal, tal como um mamífero ou em um ser humano. O agente terapêutico pode ser qualquer composto inorgânico ou orgânico. Um agente terapêutico pode diminuir, suprimir, atenuar, diminuir, deter ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença, distúrbio, ou crescimento celular em um animal tal como um mamífero ou ser humano. Exemplos incluem, porém, sem limitação, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos (incluindo siRNA, miRNA e DNA), polímeros, e moléculas pequenas. Em diversas modalidades, os agentes terapêuticos podem ser distinguidos ou não distinguidos.

[057] Em uma modalidade, um agente terapêutico pode estar presente no EDEM ou no BDM antes da união de ambos. Por exemplo, BDMs podem conter um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, miRNA) endógenos à célula da qual o BDM é derivado, e EDEMs podem compreender um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, um agente antineoplástico) antes da união com um BDM. Métodos para encapsular agentes ativos em EDEMs são conhecidos na técnica (Bao, Mitragotri & Tong, 2013) . Alternativamente, um hibridossoma pode ser carregado com um agente terapêutico após a união de EDEMs e BDMs, por meio de ligação covalente e não covalente à superfície celular, pós inserção na membrana do hibridossoma ou através de abertura de poros na membrana do hibridossoma para permitir que agentes ativos entrem no volume encapsulado (por exemplo, eletroporação).

[058] Os agentes terapêuticos da presente invenção também podem estar em diversas formas. Tais formas incluem, porém, sem limitação, moléculas não modificadas, complexos moleculares e sais farmacologicamente aceitáveis (por exemplo, cloridrato, bromidrato, sulfato, fosfato, nitreto, nitrato, borato, acetato, maleato, tartrato, oleato, salicilato e similares). Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos podem ser modificados com sais de metais, aminas ou cátions orgânicos (por exemplo, amônio quaternário). Derivados de fármacos, tais como bases, ésteres e amidas também podem ser usados como um agente terapêutico. Um agente terapêutico que é insolúvel em água pode ser usado em uma forma que é um derivado solúvel em água desse, tal como um derivado de base. Em tais casos, o agente terapêutico derivado pode ser convertido na forma terapeuticamente ativa original mediante a entrega a um sítio direcionado. Tais conversões podem ocorrer através de diversos processos metabólicos, incluindo clivagem enzimática, hidrólise através do pH do corpo, ou através de outros processos semelhantes.

[059] Como contemplado pela invenção, agentes terapêuticos adequados incluem, porém, sem limitação, agentes quimioterápicos (isto é, agentes antineoplásticos), agentes anestésicos, bloqueadores beta-adrenérgicos, agentes anti- hipertensivos, agentes antidepressivos, agentes anticonvulsivos, agentes antieméticos, agentes anti- histamínicos, agentes antiarrítmicos, agentes antimalária, agentes antiproliferativos, agentes antivascularização, agentes de reparação de ferimentos, agentes de reparação de tecido, agentes termoterapêuticos e combinações desses.

[060] Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos adequados também podem ser, sem limitação, agentes imunossupressores, citocinas, agentes citotóxicos, compostos nucleolíticos, isótopos radioativos, receptores e enzimas de ativação de pró-fármaco. Os agentes terapêuticos da presente invenção podem ser secretados naturalmente ou produzidos através de métodos sintéticos ou recombinantes ou qualquer combinação desses.

[061] Um amplo espectro de agentes terapêuticos pode ser usado em conjunto com os EDEMs descritos no presente documento. Exemplos não limitantes de tais agentes terapêuticos incluem agentes antineoplásticos, agentes anti- infecciosos, anestésicos locais, antialérgicos, antianêmicos, angiogênese, inibidores, bloqueadores beta-adrenérgicos, antagonistas de canal de cálcio, agentes anti-hipertensivos, antidepressivos, anticonvulsivos, antibacterianos, antifúngicos, antivirais, antirreumáticos, anti-helmínticos, agentes antiparasíticos, corticosteroides, hormônios, antagonistas de hormônio, imunomoduladores, antagonistas de neurotransmissor, agentes antidiabéticos, antiepiléticos, anti-hemorrágicos, anti-hipertônicos, agentes antiglaucoma, citocinas imunomoduladoras, sedativos, quimiocinas, vitaminas, toxinas, narcóticos, agentes derivados de plantas (por exemplo, extratos de folhas, raízes, flores, sementes, caules ou ramos) e combinações desses.

[062] Em diversas modalidades, fármacos que são afetados por resistência a múltiplos fármacos clássica podem ter utilidade particular como agentes terapêuticos na presente invenção. Tais fármacos incluem, porém, sem limitação, alcaloides da vinca (por exemplo, vimblastina), as antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina) e inibidores de transcrição de RNA.

[063] Em modalidades adicionais, o agente terapêutico pode ser um agente quimioterápico de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos de câncer incluem, porém, sem limitação: mostardas nitrogenadas, nitrosureias, etilenoimina, alcano sulfonatos, tetrazina, compostos de platina, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabólitos, análogos de folato, antraciclinas, taxanos, alcaloides da vinca e inibidores de topoisomerase e agentes hormonais.

[064] Fármacos quimioterápicos de câncer adicionais que podem ser usados como agentes terapêuticos na presente invenção incluem, porém, sem limitação: agentes de alquilação, tais como ciclosfosfamida; alquil sulfonatos; aziridinas; etileniminas e metilamelaminas; antimetabólitos; análogos de pirimidina; antiadrenais; repositor de ácido fólico; ácido retinoico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos citados acima.

[065] Agentes terapêuticos adicionais que são adequados para o uso na presente invenção incluem, porém, sem limitação, agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores. Exemplos não limitantes de tais agentes anti-hormonais incluem antiestrogênios, incluindo, por exemplo, Tamoxifeno e Toremifeno; antiandrógenos, tais como Leuprolida e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos citados acima.

[066] Em modalidades adicionais da presente invenção, citocinas podem ser também usadas como agentes terapêuticos. Exemplos não limitantes de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormônios polipeptídicos tradicionais. Exemplos adicionais incluem hormônios de crescimento, tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireoide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteína, tais como hormônio estimulante do folículo (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator α e β de necrose tumoral; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tais como NGF-β; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformadores (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento I e II similar a insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como interferon α, β e Y; fatores estimuladores de colônias (CSFs), tais como CSF de macrófago (M-CSF), CSF de granulócito/macrófago (GM- CSF), e CSF de granulócito (GCSF); interleucinas (ILs); fatores de necrose tumoral, tais como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos, incluindo ligante LIF e kit (KL) . Como usado no presente documento, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de fontes recombinantes (por exemplo, de culturas de célula T e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa).

[067] Em modalidades adicionais, o agente terapêutico também pode ser um agente terapêutico à base de anticorpo, exemplos não limitantes incluem Herceptina, Erbitux, Avastina, Rituxano, Simulect, Enbrel, Adalimumabe e Remicade.

[068] Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser uma nanopartícula. Exemplos não limitantes de tais nanopartículas incluem qualquer nanopartícula à base de semicondutor e metal, incluindo, porém, sem limitação: ouro, prata, óxido de ferro, pontos quânticos ou nanotubos de carbono. Por exemplo, em algumas modalidades, a nanopartícula pode ser uma nanopartícula que pode ser usada for uma ablação térmica ou uma terapia térmica.

[069] Em algumas modalidades, o EDEM é carregado com agentes terapêuticos aniônicos. Agentes terapêuticos aniônicos incluem qualquer agente terapêutico com uma carga líquida negativa, ou que tem um grupo carregado negativamente que tem capacidade para interagir com um lipídio ionizável do hibridossoma. Tais agentes terapêuticos incluem qualquer agente terapêutico conhecido ou potencial, incluindo fármacos e compostos tais como, porém, sem limitação, oligonucleotídeos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados (incluindo ácidos nucleicos de proteínas e similares), proteínas e peptídeos com grupos de carga negativa, fármacos convencionais tais como análogos e alcaloides de plantas que têm grupos de carga negativa e similares. Agentes terapêuticos que são não inerentemente aniônicos podem ser derivados com grupos aniônicos para facilitar seu uso na invenção. Por exemplo, paclitaxel pode ser derivado com um grupo ácido poliglutâmico.

[070] Em uma modalidade, o hibridossoma compreende ácidos nucleicos negativamente carregados a serem introduzidos nas células. Exemplos não limitantes de ácidos nucleicos que se destinam a ser usados na presente invenção são siRNA, micro RNA (miRNA), RNA em forma de grampo curto ou pequeno (shRNA), RNA guia (gRNA), RNA de agrupamento de repetição palindrômica curta e regularmente interespaçada (crRNA), RNA de agrupamento de repetição palindrômica curta e regularmente interespaçada transativador (tracrRNA), oligonucleotídeos imunoestimulantes, plasmídeos, ribozimas e ácidos nucleicos e antissenso. A presente invenção contempla que ácidos nucleicos contidos em um hibridossoma podem ser endógenos à célula da qual o BDM era derivado e/ou um ácido nucleico exógeno encapsulado pelo EDEM.

[071] Em algumas modalidades, polinucleotídeos encapsulados pelo hibridossoma codificam um pequeno RNA de interferência (siRNA) ou RNA antissenso para o propósito de modular ou, de outro modo, diminuir ou eliminar a expressão de um gene ou ácido nucleico endógeno. Em determinadas modalidades, tais polinucleotídeos encapsulados podem ser de natureza recombinante ou natural e podem exercer sua atividade terapêutica com o uso de mecanismos de ação senso ou antissenso (por exemplo, modulando-se a expressão de um ácido nucleico ou gene-alvo). Como usado no presente documento, o termo "modulação" se refere à alteração da expressão de um polipeptídeo ou polinucleotídeo-alvo. A modulação pode significar aumentar ou melhorar, ou pode significar diminuir ou reduzir.

[072] Em algumas outras modalidades, o hibridossoma da invenção compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos ou proteínas de interesse, tais como um hormônio, enzima, receptor ou peptídeos moduladores. Em algumas modalidades específicas, o hibridossoma compreende bioagentes ativos que, além da transfecção, têm capacidade para produzir polipeptídeos funcionais que podem facilitar o direcionamento/transfecção de outro hibridossoma para as células-alvo. Em determinadas modalidades, os hibridossomas descritos no presente documento empregam uma estratégia multifuncional para facilitar a entrega de materiais encapsulados (por exemplo, um ou mais polinucleotídeos) e liberação subsequente quando interagem com uma célula-alvo.

[073] Tipicamente, uma composição farmacêutica para o uso como uma vacina para um tipo de câncer particular compreende BDMs derivados de células tumorais/cancerosas daquele tipo de câncer particular. Por exemplo, uma composição farmacêutica para o uso em uma vacina contra câncer glioblastoma tipicamente compreende BDMs purificados de células de câncer/tumor glioblastoma. Desse modo, o BDM compreende antígenos associados a tumor que provocam uma resposta imune adaptativa a antígenos presentes nas células de tumor/câncer a serem tratadas/protegidas. A mesma origem/intenção correspondente se aplica a outras doenças.

[074] Em uma modalidade, BDMs úteis com a invenção podem ser quaisquer vesículas proteolipossômicas obtidas através da disrupção ou formação de bolhas de uma membrana externa bacteriana ou parasita para formar vesículas que retêm antígenos da membrana externa (consultar Publicações Internacionais no WO2014122232 e WO201108027, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade). BDMs derivados de bactérias e parasitas têm várias propriedades que os tornam candidatos atrativos para plataformas de entrega imunoterápica incluindo: (i) imunogenicidade forte, (ii) autoadjuvante, (iii) capacidade para interagir com células de mamíferos e ser absorvido através de fusão membranar ou fixação celular através de receptores de adesão, e (iv) a possibilidade de incorporar expressão de antígeno heterólogo através de engenharia recombinante.

[075] Uma composição farmacêutica que compreende o hibridossoma da invenção e pelo menos um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável pode ser, portanto, usado para o tratamento ou profilaxia de várias doenças e distúrbios.

[076] Como usado no presente documento, "agente de diagnóstico" se refere a um componente que pode ser detectado em um indivíduo ou amostra de teste e é adicionalmente descrito no presente documento. Em algumas modalidades, os agentes de diagnóstico na presente invenção podem ser substâncias que fornecem informações de imaginologia em relação a um sítio direcionado no corpo de um animal, tal como um mamífero ou em um ser humano. Um agente de diagnóstico usado na presente invenção pode incluir qualquer agente de diagnóstico conhecido na técnica.

[077] Um agente de diagnóstico pode ser detectado através de uma variedade de maneiras, incluindo como um agente que fornece e/ou melhora um sinal detectável que inclui, porém, sem limitação, sinais de emissão de gama, radioativos, ópticos, de absorção de fluorescência, ecogênicos, magnéticos ou tomográficos. Técnicas para imagear o agente de diagnóstico podem incluir, porém, sem limitação, tomografia computadorizada (CT), imaginologia de ressonância magnética (MRI), imaginologia óptica, tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia por emissão de pósitrons (PET), imaginologia de raio X, imaginologia de raios gama e similares.

[078] Em uma modalidade, um radioisótopo pode atuar como um agente de diagnóstico e ser incorporado no hibridossoma descrito no presente documento e pode incluir radionuclídeos que emitem raios gama, pósitrons, partículas beta e alfa e raios X. Radionuclídeos adequados incluem, porém, sem limitação, 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188 Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y e 90Y.

[079] Em algumas modalidades, a carga útil pode ser um agente detectável, tal como, porém, sem limitação, diversas moléculas pequenas orgânicas, compostos inorgânicos, nanopartículas, enzimas ou substratos de enzima, materiais fluorescentes, materiais luminescentes (por exemplo, luminol), materiais bioluminescentes (por exemplo, luciferase, luciferina e aequorina), materiais quimioluminescentes). Tais identificações opticamente detectáveis incluem, por exemplo, sem limitação, octadecil rodamina B, 7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-ila, ácido 4- acetamido-4 ‘-isotiocianatoestilbeno-2,2 ‘ dissulfônico, acridina e derivados, ácido 5-(2‘-aminoetil)aminonaftaleno-1- sulfônico (EDANS), sal de 4-Amino-N-(3- [vinilsulfonil]fenil)naftalimida-3,6-dissulfonato de dilítio, N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY, amarelo brilhante, cumarina e derivados, corantes de cianina, cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), vermelho de bromopirogalol, 7-dietilamino-3-(4 ‘-isotiocianatofenil)-4- metilcumarina, dietilenotriamina pentaacetato, ácido 4,4'- diisotiocianatodiidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de dansila, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), eosina e derivados, eritrosina e derivados, etídio, fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6- diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi- 4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, X-rodamina-5-(e 6)-isotiocianato (QFITC ou XRITC), fluorescamina, ten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3- sulfopropil)-,hidróxido, composto de sal interno com n,n- dietiletanamina(1:1) (IR144), perclorato de 5-cloro-2-[2-[3- [(5-cloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol-ilideno)etilideno]-2- (difenilamino)-1-ciclopenten-1-il]etenil] -3-etil benzotiazólio (IR140), isotiocianato de verde malaquita, 4- metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho fenol, B-ficoeritrina, o- ftaldialdeído, pireno, butirato de pireno, succinimidil 1- pireno, pontos quânticos de butirato, vermelho reativo 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B-A), rodamina e derivados, 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), cloreto de rodamina de lissamina rodamina B sulfonil (Rod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, cloreto de sulfonila derivado de sulforrodamina 101 (Texas Red), N,N,N‘,N‘tetrametil-6- carboxirrodamina (TAMRA) tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio, Cianina-3 (Cy3), Cianina-5 (Cy5), Cianina-5.5 (Cy5.5), Cianina-7 (Cy7), IRD 700, IRD 800, Alexa 647, azul La Jolta, ftalo cianina e naftalo cianina.

[080] Para modalidades que envolvem a imaginologia óptica, o agente de diagnóstico pode ser agentes de contraste, por exemplo, nanocristais semicondutores ou pontos quânticos. Para a imaginologia de tomografia de coerência óptica, o agente de diagnóstico pode ser um metal, tal como partículas de nanogaiola de prata ou ouro. Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico pode ser nanopartículas metálicas, tais como nanopartículas de ouro ou prata.

[081] Em algumas modalidades, um agente de diagnóstico pode incluir um agente de imaginologia de ressonância magnética (MR). Agentes de ressonância magnética exemplificativos incluem, porém, sem limitação, agentes paramagnéticos, agentes superparamagnéticos e similares. Agentes paramagnéticos exemplificativos podem incluir, porém, sem limitação, ácido gadopentético, gadolínio, gadoteridol ou ácido gadoxético. Agentes superparamagnéticos podem incluir, porém, sem limitação, óxido de ferro superparamagnético e ferristeno. Em determinadas modalidades, os agentes de diagnóstico podem incluir agente de contraste de raio X. Exemplos de agentes de contraste de raio X incluem, porém, sem limitação, iopamidol, iomeprol, iohexol, iopentol ou metrizamida.

[082] De modo semelhante aos agentes terapêuticos descritos acima, os agentes de diagnóstico podem ser associados ao hibridossoma em uma variedade de maneiras, incluindo, por exemplo, estar integrados, encapsulados, ou aglutinados ao hibridossoma. Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico pode ser um conjugado/complexo de íon de metal que pode ser ligado de modo covalente ou não covalente a uma superfície de partícula. Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico pode ser um radionucleotídeo que pode ser ligado de modo covalente ou não covalente a uma superfície de hibridossoma. De modo semelhante, o carregamento dos agentes de diagnóstico pode ser executado através de uma variedade de maneiras conhecidas na técnica. Um exemplo de agentes de diagnóstico de carregamento em EDEMs é encontrado na Seção de Exemplos.

[083] Consequentemente, uma modalidade da presente invenção se refere a um hibridossoma que compreende pelo menos um EDEM, que pode conter um agente ativo, tal como um agente de diagnóstico e/ou um agente terapêutico. O hibridossoma pode ser usado como uma parte de uma composição para o tratamento, monitoramento, prevenção, estagiamento e/ou diagnóstico de uma doença ou afecção, incluindo uma doença, tal como câncer. Isso pode ser alcançado, por exemplo, combinando-se um agente terapêutico e um agente de diagnóstico no hibridossoma. Isso também pode ser alcançado administrando-se um hibridossoma que inclui uma primeira subpopulação carregada com um agente terapêutico e uma segunda subpopulação carregada com um agente de diagnóstico. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para diagnosticar uma doença ou afecção diagnosticável administrando-se um agente de diagnóstico, que compreende a administração de um hibridossoma da invenção a um indivíduo com necessidade desse.

[084] Uma composição farmacêutica que compreende o hibridossoma da invenção e pelo menos um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável pode ser, portanto, usada para aplicações de diagnóstico.

[085] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma, em que agentes ativos incorporados em BDMs provocam uma resposta imune a um ou mais antígenos associados a doença tais como, por exemplo, um antígeno de tumor. Contempla-se que uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma com capacidade para provocar uma resposta imune pode ser útil no contexto de imunoterapia, por exemplo, contra câncer ou infecções.

[086] Em algumas modalidades os BDMs compreendem antígenos associados a doença gerados in vivo, tais como um ou mais antígeno associado a tumor, um ou mais antígeno associado a patógeno ou um ou mais antígeno associado a distúrbio degenerativo. O termo “antígenos associados a doença” pode estar relacionado a proteínas produzidas em células associadas a doença que têm uma estrutura anormal e/ou um padrão de expressão anormal em comparação com células não associadas a doença. Proteínas anormais são também produzidas por células infectadas com oncovírus, por exemplo, EBV e HPV. Por exemplo, em algumas modalidades, os BDMs são bem adequados para apresentar antígenos que podem estimular respostas imunes desejáveis em indivíduos. Essa vantagem pode surgir devido ao fato de que os BDMs são produzidos por células, em vez de sintetizados artificialmente e, portanto, fornecem antígenos que são "naturais". Ou seja, os antígenos produzidos pelas células e encontrados nos BDMs podem ser peptídeos de comprimento total que são processados (por exemplo, glicosilados etc.) e dobrados pela célula até um ponto semelhante aos antígenos experienciados pelas células imunes em um indivíduo. Além de proteínas, outras substâncias como glicolipídeos de superfície celular e glicoproteínas também podem ter uma estrutura anormal em células associadas a doença e podem, desse modo, ser alvos do sistema imune. Desse modo, os antígenos de BDM podem ser utilizados em vacinas ou tratamentos contra, por exemplo, cânceres. Em algumas modalidades, portanto, os um ou mais antígenos podem, cada um, compreender um antígeno de célula cancerosa. Como exemplos não limitantes, o antígeno de célula cancerosa pode ser fosfatase alcalina do tipo placentário, p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1, cerB/HER2, NY-ESO- 1.SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-1 e c-myc.

[087] Em uma outra modalidade, os BDMs são derivados de células apresentadoras de antígenos. A invenção contempla particularmente BDMs derivados de células apresentadoras de antígenos doentes. Em uma modalidade específica, os BDMs compreendem antígenos associados a tumor de leucemia linfocítica crônica (CLL) e linfoma de célula do manto. Em um exemplo não limitante, os BDMs são derivados de células de linfoma de célula do manto que portam o receptor ROR1 de proteína tirosina quinase transmembranar.

[088] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma, em que agentes ativos incorporados em BDMs provocam capacidades de supressão imune à composição como, por exemplo, desejado no contexto de doenças autoimunes, infecções, alergias e transplantação para evitar a reação excessiva e/ou ativação prejudicial do sistema imune de um indivíduo. Esse aspecto pode ser realizado isolando-se os BDMs que apresentam um ou mais agentes imunossupressores. Em uma modalidade, os ditos BDMs inibem o desenvolvimento de reação imune como resultado de terapia genética ou transplante de células xenogênico/alogênico. Como mostrado na Seção de Exemplos, uma modalidade inclui BDMs imunossupressores isolados de trombócitos e neutrófilos polimorfonucleares ativados.

[089] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma para a entrega de agentes terapêuticos.

[090] Como usado no presente documento, "composição farmacêutica" se refere a uma composição que compreende unidades fisicamente distintas a serem administradas em dosagens únicas ou múltiplas, sendo que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de pelo menos um ingrediente farmaceuticamente ativo, e pelo menos um outro ingrediente selecionado a partir de excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende hibridossomas para a entrega direcionada de um ou mais agentes ativos a um tecido ou célula em um organismo vivo. Em um outro exemplo, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende hibridossomas para a entrega de um ou mais agentes ativos a um tecido ou célula in vitro.

[091] Em algumas modalidades, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado como sistemas para a entrega de um agente ativo, tal como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico, a um tecido ou célula-alvo em um animal tal como um mamífero ou em um ser humano. Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece métodos para introduzir um agente ativo em um tecido ou célula-alvo. As partículas da invenção podem incluir uma ampla variedade de agentes de diagnóstico e/ou terapêuticos. Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para administrar um agente de diagnóstico e/ou terapêutico a um indivíduo. No método, um hibridossoma da invenção que compreende um agente de diagnóstico e/ou terapêutico é administrado ao paciente com necessidade desse. Em determinadas modalidades, a entrega de um agente ativo, tal como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico, pode constituir um meio de terapia.

[092] O termo “terapia” ou “tratamento” se refere a um processo que se destina a produzir uma alteração benéfica na condição de um indivíduo como um mamífero, por exemplo, um ser humano, frequentemente denominado como paciente, ou animal. Uma alteração benéfica pode, por exemplo, incluir um ou mais dentre: restauração de função, redução de sintomas, limitação ou retardamento de progressão de uma doença, distúrbio, ou afecção ou prevenção, limitação ou retardamento de deterioração de uma afecção de um paciente, doença ou distúrbio. Tal terapia geralmente abrange a administração de um agente ativo por meio de um hibridossoma, dentre outros.

[093] O termo “tratar” é reconhecido na técnica e inclui prevenir que uma doença, distúrbio ou afecção ocorra em um organismo vivo, tal como um mamífero ou em um ser humano, que pode ser predisposto à doença, distúrbio e/ou afecção, mas ainda não foi diagnosticado como tendo essa; inibir a doença, distúrbio ou afecção, por exemplo, impedir seu progresso; e aliviar a doença, distúrbio, ou afecção, por exemplo, causando a regressão da doença, distúrbio e/ou afecção. Tratar a doença ou afecção inclui melhorar pelo menos um sintoma da doença particular ou afecção, mesmo se a patofisiologia subjacente não for afetada, tal como tratar a dor de um indivíduo administrando-se um agente analgésico, muito embora tal agente não trate a causa da dor.

[094] Como mencionado acima, o hibridossoma da presente invenção pode compreender agentes terapêuticos que podem ser selecionados dependendo do tipo de doença que se deseja tratar. Por exemplo, determinados tipos de cânceres ou tumores, tais como leucemia, linfoma, mieloma, carcinoma e sarcoma bem como tumores sólidos e tumores mistos, podem envolver a administração de agentes terapêuticos iguais ou possivelmente diferentes.

[095] Uma pessoa de conhecimento comum na técnica também reconhecerá que o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para vários propósitos. Os métodos da presente invenção têm diversas vantagens sobre os métodos da técnica anterior. Métodos para tratar pacientes com o uso de agentes ativos são usados por um longo tempo. No entanto, na maior parte dos métodos da técnica anterior, o agente ativo geralmente era entregue ao corpo inteiro do ser humano ou animal, sem ser direcionado a um sítio particular afetado por uma doença. Desse modo, nos métodos da técnica anterior, o agente ativo é distribuído de modo uniforme no organismo inteiro. Uma desvantagem dos métodos da técnica anterior é que regiões não afetadas do corpo do ser humano ou animal também pode ser afetado pelo agente ativo. Além disso, apenas uma pequena parte do agente ativo pode atuar em um sítio doente.

[096] Como contemplado pela invenção, um hibridossoma improves a probabilidade de que quantidades apropriadas de materiais encapsulados (por exemplo, agentes terapêuticos e/ou agentes de diagnóstico) seja entregue a células-alvo ou tecidos, minimizando subsequentemente a toxicidade ou efeitos adversos sistêmicos potenciais associados a módulos não unidos ou seu conteúdo encapsulado. Por exemplo, quando um EDEM (por exemplo, uma iLNP) compreende ou é, de outro modo, enriquecido com um ou mais dos lipídios ionizáveis, a transição de fase na bicamada lipídica das uma ou mais células-alvo pode facilitar a entrega dos materiais encapsulados (por exemplo, um ou mais agentes ativos encapsulados em uma nanopartícula de lipídio) para as células-alvo. De modo semelhante, em determinadas modalidades os compostos revelados no presente documento podem ser usados para preparar hibridossomas que são distinguidos por sua toxicidade reduzida in vivo. Em determinadas modalidades, a toxicidade reduzida é uma função das altas eficiências de transfecção associadas às composições reveladas no presente documento, de modo que uma quantidade reduzida de tal composição possa ser administrada ao indivíduo para alcançar um resultado ou resposta terapêutica desejada.

[097] O hibridossoma da invenção pode ser projetado para facilitar encapsulação e liberação de materiais encapsulados (por exemplo, um ou mais agentes ativos) para uma ou mais células-alvo e/ou tecidos. Por exemplo, quando um hibridossoma compreende ou é, de outro modo, enriquecido com um ou mais dentre lipídios fusogênicos, a transição de fase e disrupção potencial na bicamada lipídica de uma ou mais células-alvo pode facilitar a entrega dos materiais encapsulados (por exemplo, um ou mais ativos encapsulados em um hibridossoma).

[098] De modo semelhante, em determinadas modalidades, a incorporação de lipídios com grupos polares hidrofílicos ionizáveis nos EDEMs pode servir para promover a liberação endossômica ou lisossômica do conteúdo que está encapsulado no hibridossoma. Tal liberação melhorada pode ser alcançada através de um mecanismo de disrupção mediado por esponja de prótons, em que a capacidade de um composto no EDEM, pode tamponar a acidificação do endossoma, que, por sua vez, promove o intumescimento osmótico e a disrupção da membrana lipídica endossômica ou lisossômica e facilitar a liberação intracelular de carga encapsulada nessa na célula- alvo .

[099] Em modalidades adicionais, o hibridossoma da invenção também pode fornecer pelo menos uma das seguintes vantagens adicionais para o tratamento: (1) um tempo de circulação aumentado do sistema de entrega; (2) uma absorção de RES reduzida do hibridossoma usando-se BDMs derivados do paciente e opcionalmente adicionando-se porções químicas de estabilização; (3) a prevenção de liberação prematura de carga do hibridossoma devido à encapsulação estável; (4) uma resposta do sistema imune reduzida quando introduzido no corpo de um indivíduo devido à presença de componentes de BDM endógenos; (5) uma transcitose aumentada do hibridossoma através das barreiras biológicas (por exemplo, barreira endotelial, barreira hematoencefálica) na vasculatura devido às porções químicas de direcionamento endógenas no BDM ou porções químicas de direcionamento exógenas aglutinadas ao EDEM; (6) um acúmulo aumentado do hibridossoma em um sítio doente, tal como um sítio de tumor; (7) uma internalização aumentada nos endossomas da célula-alvo devido às porções químicas de direcionamento endógenas que se originam do BDM e liberação endossômica subsequente devido às propriedades fusogênicas supridas pelo EDEM.

[0100] Como discutido acima, em determinadas modalidades, o hibridossoma da presente invenção permite a entrega de um agente ativo preferencialmente a um sítio doente. Tal entrega direcionada também pode permitir que se evite altas doses de um agente ativo. Tal entrega direcionada pode melhorar a eficácia do agente ativo. Isso pode, por sua vez, auxiliar na prevenção de efeitos colaterais tóxicos que são associados à administração de altas doses de diversos agentes ativos ou efeitos associados ao carreador em si (por exemplo, lipídios, porções químicas de direcionamento exógenas). Em determinadas modalidades, pode ser possível tratar ou detectar doenças com baixas doses de um agente ativo de uma maneira direcionada sem afetar regiões não envolvidas do corpo.

[0101] A invenção também contempla hibridossomas que compreendem BDMs com porções químicas de direcionamento endogenamente disponíveis que podem facilitar a entrega bem- sucedida de agentes ativos para os tipos de célula conhecidos na técnica como sendo difíceis de transfectar in vivo e in vitro (por exemplo, células-tronco e células imunes). Por exemplo, BDMs que compreendem hibridossomas derivados de leucócitos podem mostrar absorção celular melhorada, enquanto os EDEMs por si sós mostram absorção celular reduzida.

[0102] O hibridossoma da presente invenção pode ser usado para tratar, monitorar, prevenir e/ou diagnosticar várias doenças e afecções (por exemplo, inflamações, tais como inflamação associada a um câncer). Determinadas modalidades podem envolver a entrega de agentes terapêuticos iguais ou possivelmente diferentes a um sítio afetado por uma doença ou afecção. Em algumas modalidades, os sistemas de entrega da presente invenção podem ser particularmente úteis para aplicações oncológicas, tais como para o tratamento, monitoramento, prevenção e/ou diagnóstico de uma afecção cancerosa (por exemplo, célula de tumor maligno). Em tais modalidades, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para entregar um agente ativo (por exemplo, um agente terapêutico e/ou um agente de diagnóstico) a um sítio afetado com câncer (por exemplo, um tumor). Exemplos não limitantes de afecções cancerosas que podem ser tratadas, monitoradas, prevenidas e/ou diagnosticadas incluem, porém, sem limitação, leucemia, linfoma, cânceres de pele (incluindo melanomas, carcinomas basocelulares e carcinomas de células escamosas), carcinomas epiteliais da cabeça e pescoço, cânceres de pulmão (incluindo carcinoma escamoso ou epidermoide, carcinoma de célula pequena, adenocarcinoma e carcinoma de célula grande), câncer de mama, cânceres do trato gastrointestinal, tumores malignos da tireoide, sarcomas dos ossos e tecidos moles, câncer ovariano, carcinoma da trompa de falópio, câncer uterino, câncer cervical, carcinoma prostático, câncer testicular, câncer da bexiga, carcinoma de célula renal, câncer pancreático e câncer hepatocelular. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com um câncer distinguido por tumores sólidos. Em algumas modalidades, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em um câncer e doença de Parkinson.

[0103] Em modalidades adicionais, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para entregar um agente ativo a células infectadas por vírus. Em tais modalidades, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para tratar, monitorar, prevenir e/ou diagnosticar infecções virais.

[0104] Em algumas modalidades, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para direcionar um sítio inflamado em um indivíduo. Portanto, em tais modalidades, o hibridossoma da presente invenção pode ser usado para tratar, prevenir, monitorar e/ou diagnosticar uma afecção ou doença associada a uma inflamação. Afecções representativas incluem, porém, sem limitação: alergias; asma; doença de Alzheimer; diabetes; desequilíbrios hormonais; doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide e psoríase; osteoartrite; osteoporose; aterosclerose, incluindo doença da artéria coronária; vasculite; afecções inflamatórias crônicas, tais como obesidade; úlceras, tais como úlcera de Marjolin; inflamações respiratórias causadas por asbesto ou fumaça de cigarro; inflamações do prepúcio; inflamações causadas por vírus, tais como papilomavírus humano, hepatite B ou C ou vírus de Epstein-Barr; esquistossomose; doença inflamatória pélvica; inflamação epitelial ovariana; metaplasia de Barrett; gastrite por H. pilori; pancreatite crônica; infestação de fascíola hepática chinesa; colecistite crônica e doença inflamatória da bexiga; cânceres associados a inflamação, tais como câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de mama; cânceres do trato gastrointestinal, tais como câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de nasofaringe, câncer de esôfago, colangiocarcinoma, câncer de vesícula biliar e câncer anogenital; câncer tegumentar, tal como carcinoma de pele; cânceres do trato respiratório, tais como câncer dos brônquios e mesotelioma; câncer do trato geniturinário, tal como fimose, carcinoma peniano e câncer de bexiga; e câncer do sistema reprodutivo, tal como câncer ovariano. O hibridossoma da invenção pode ser usado em conjunto ou concomitantemente com outros métodos de tratamento de doença conhecidos, incluindo, porém, sem limitação, quimioterapia e radioterapia.

[0105] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de modulação da expressão de um polipeptídeo ou polinucleotídeo-alvo. Esses métodos geralmente compreendem colocar uma célula em contato com um hibridossoma da presente invenção que é associado a um ácido nucleico com capacidade para modular a expressão de um polipeptídeo ou polinucleotídeo-alvo.

[0106] Em modalidades relacionadas, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio distinguido por superexpressão de um polipeptídeo em um indivíduo, que compreende fornecer, ao indivíduo, o hibridossoma da presente invenção, em que o agente terapêutico é selecionado a partir de um siRNA, um microRNA, um oligonucleotídeo antissenso, e um plasmídeo com capacidade para expressar um siRNA, um microRNA ou um oligonucleotídeo antissenso, e em que o siRNA, microRNA, ou RNA antissenso compreende um polinucleotídeo que se liga especificamente a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou um complemento desse.

[0107] Esses métodos podem ser executados colocando- se o hibridossoma da invenção em contato com as células por um período de tempo suficiente para que a entrega intracelular ocorra (por exemplo, dentro do núcleo). Aplicações típicas incluem o uso de procedimentos bem conhecidos para fornecer entrega intracelular de siRNA para submeter a knock down ou silenciar alvos celulares específicos. Alternativamente, aplicações incluem a entrega de sequências de DNA ou mRNA que codificam para polipeptídeos de uso terapêutico. Dessa maneira, a terapia é fornecida para doenças genéticas suprindo-se produtos genéticos ausentes ou deficientes.

[0108] Também é contemplada pela presente invenção a coentrega de um ou mais materiais encapsulados únicos para células-alvo pelo hibridossoma descrito no presente documento. Consequentemente, mesclando-se dois EDEMs únicos com agentes ativos únicos em um hibridossoma único, uma modalidade específica pode ser usada para tratar um único distúrbio ou deficiência, em que cada uma dessas funções de agente ativo através de um mecanismo de ação diferente. Por exemplo, o hibridossoma da presente invenção pode se mesclar tanto com um EDEM que compreende um polinucleotídeo encapsulado, destinado a desativar ou submeter a "knock-down" um polinucleotídeo endógeno com mau funcionamento e seu produto de proteína ou enzima, quanto com um segundo EDEM que compreende uma enzima encapsulada, destinada a fornecer substituição enzimática. Em determinadas modalidades, um EDEM que contém agentes de diagnóstico, tais como nanopartículas de ouro, pode ser fundido com um BDM em um hibridossoma para tratar um distúrbio e localizar órgãos ou células afetadas através de técnicas de visualização de diagnóstico. Alternativamente, modalidades específicas da presente invenção podem facilitar a coentrega, por exemplo, de dois polinucleotídeos endogenamente produzidos únicos (por exemplo, miRNA), mesclando-se dois BDMs únicos no EDEM idêntico.

[0109] Em uma modalidade da presente invenção, são adequadas para o tratamento de doenças ou distúrbios em relação à deficiência de proteínas e/ou enzimas na célula- alvo ou secretadas pela mesma, por exemplo, os sintomas de uma doença podem ser melhorados fornecendo-se as composições da invenção (por exemplo, fibrose cística). Distúrbios para os quais a presente invenção é útil incluem, porém, sem limitação, distúrbios tais como doença de Pompe, doença de Gaucher, talassemia beta, doença de Huntington, doença de Parkinson, distrofias musculares (tais como, por exemplo, Duchenne e Becker), doenças hemofílicas, atrofia muscular espinhal relacionada a SMN1 (SMA), esclerose lateral amiotrófica (ALS), galactosemia, fibrose cística (CF) , deficiências de galactocerebrosidase, ataxia de Friedreich, doença de Pelizaeus-Merzbacher e doença de Niemann-Pick.

[0110] Adicionalmente, a invenção fornece uma nova plataforma para o desenvolvimento de vacinas altamente imunogênicas com base na coentrega de um BDM com capacidade para apresentar um EDEM que contém antígeno e adjuvante. A entrega combinada de adjuvantes com BDMs que apresentam antígeno representa uma estratégia promissora para vacinas terapêuticas para provocar uma resposta imune inata explorando as propriedades principais dos dois componentes: (1) a forte adjuvanticidade fornecida pelo EDEM; e (2) a resposta imune adaptativa específica contra antígeno(s) apresentada pelo BDM e associada à doença direcionada. Por exemplo, o BDM pode apresentar qualquer antígeno associado a doença, tal como um ou mais antígenos associados a tumor para terapia de câncer, um ou mais antígenos patogênicos para o tratamento de infecção, ou qualquer outro antígeno ou combinação de antígenos associada a outras doenças, em particular para afecções imunocomprometedoras e/ou em que a forte potencialização da imunidade é necessária (por exemplo, nos idosos). Além disso, a invenção fornece hibridossoma composições que induzem uma forte resposta imune importante para vacinas tais como aquelas contra câncer, hepatite, gripe, malária e HIV. A invenção também é útil para qualquer terapia em que a apresentação de uma combinação de antígenos para o sistema imune de um paciente pode ser benéfica.

[0111] Em uma modalidade adicional, uma resposta imune pode ser provocada entregando-se um hibridossoma que pode incluir um antígeno associado a doença. (Publicação no U.S. 20120189700; que está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Em uma modalidade, o EDEM pode ser formulado para o uso em uma vacina tal como, porém, sem limitação, contra um patógeno ou câncer.

[0112] Em uma modalidade, o EDEM pode ser formulado para o uso como uma vacina. Em uma modalidade, o EDEM pode encapsular pelo menos uma molécula de ácido nucleico modificada e/ou mRNA que codifica pelo menos um antígeno. Como exemplo não limitante, o EDEM pode incluir pelo menos um antígeno exógeno e um excipiente para uma forma de dosagem de vacina (consultar Pub. Internacional no WO2011150264 e Pub. dos EUA no US20110293723, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade) . A forma de dosagem de vacina pode ser selecionada através de métodos descritos no presente documento, conhecidos na técnica e/ou descritos na Pub. Internacional no WO2011150258 e Pub. dos EUA no US20120027806, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[0113] Em uma modalidade, o EDEM pode compreender pelo menos um adjuvante. Em uma outra modalidade, o EDEM pode compreender pelo menos um agente terapêutico e pelo menos um adjuvante. Como exemplo não limitante, o EDEM que compreende um adjuvante pode ser formulado através dos métodos descritos na Pub. Internacional no WO2011150240 e Pub. dos EUA no US20110293700, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0114] Em uma modalidade, o EDEM pode encapsular pelo menos um antígeno exógeno associado a doença que codifica um peptídeo, fragmento ou região de um vírus. Como exemplo não limitante, o EDEM pode incluir, porém, sem limitação, os antígenos descritos na Pub. Internacional no WO2012024621, WO201202629, WO2012024632 e Pub. dos EUA no US20120064110, US20120058153 e US20120058154, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0115] O hibridossoma da presente invenção pode ser usado para entregar um agente terapêutico para uma célula ou tecido, in vitro ou in vivo. Os métodos e formulações podem ser prontamente adaptados para a entrega de qualquer agente terapêutico adequado para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio que seja aceitável para tal tratamento. Os métodos da presente invenção podem ser praticados in vitro, ex vivo, ou in vivo. Por exemplo, o hibridossoma da presente invenção também pode ser usado para a entrega de ácidos nucleicos para células in vivo, com o uso de métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um hibridossoma da invenção e um diluente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções para injeção intravenosa (por exemplo, solução salina ou dextrose). A composição também pode assumir a forma de um creme, pomada, gel, suspensão ou emulsão.

[0116] Para a administração in vivo, as composições farmacêuticas que compreendem o hibridossoma da invenção são preferencialmente administradas de modo parenteral (por exemplo, de modo intra-articular, intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo ou intramuscular). Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas são administradas de modo intravenoso ou intraperitoneal através de uma injeção de bolus. Outras vias de administração incluem tópica (pele, olhos, membranas mucosas), oral, pulmonar, intranasal, sublingual, retal e vaginal. Além disso, uma composição farmacêutica pode ser preparada, adequada para administração oftálmica. Tais formulações podem, por exemplo, estar na forma de gotas para os olhos incluindo, por exemplo, uma solução de 0,1/1,0 % (p/p) e/ou suspensão do ingrediente ativo em um excipiente líquido oleoso ou aquoso. Tais gotas podem adicionalmente compreender agentes de tamponamento, sais, e/ou um ou mais outros dentre quaisquer ingredientes adicionais descritos no presente documento.

[0117] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com o exposto acima para a entrega de agentes de diagnóstico.

[0118] Além da entrega de agentes ativos para tratamento, o hibridossoma da presente invenção pode fornecer um meio para a detecção de tecido e células afetadas por uma doença ou uma afecção, bem como a detecção de progressão ou recidiva pós-terapia. A imaginologia não invasiva atual se baseia no uso de agentes de contraste que se baseiam na atividade metabólica e metabolismo de aminoácido em tumores, mas esses são limitados por ruído de fundo e absorção não específica. Desse modo, a invenção fornece uma composição farmacêutica de acordo com o exposto acima para a entrega de agentes de diagnóstico diretamente ao sítio-alvo, tal como um sítio tumoral e/ou um sítio de inflamação, para possibilitar a imaginologia de diagnóstico e localização precisa desse.

[0119] Em um outro aspecto, a invenção fornece um processo para produzir um carreador biocompatível híbrido (hibridossoma) que compreende elementos estruturais e bioativos que se originam pelo menos de um módulo de entrega biocompatível (BDM) e pelo menos um módulo de encapsulação de fármaco modificado (EDEM) que compreende pelo menos uma porção química fusogênica ajustável, sendo que o dito processo compreende: (a) fornecer pelo menos um EDEM que tem pelo menos uma porção química fusogênica ou uma composição que compreende o mesmo; (b) fornecer pelo menos um BDM ou uma composição que compreende o mesmo; (c) colocar o dito pelo menos um EDEM em contato com o dito pelo menos um BDM em um pH abaixo de 7,4 e em uma temperatura entre 0 °C e 60 °C, unindo, desse modo, o dito pelo menos um EDEM com o dito pelo menos um BDM e produzir o dito hibridossoma; e opcionalmente (d) purificar o dito hibridossoma de BDMs e/ou EDEMs não fundidos.

[0120] O processo da invenção tem várias características importantes que fazem com que seja substancialmente útil para a técnica. A presente invenção fornece um processo para gerar hibridossomas unindo-se um ou mais EDEMs e um ou mais BDMs para produzir um componente híbrido que exibe as características dos componentes de BDM e EDEM originais. Unir EDEMs com BDMs envolve pelo menos uma espécie fusogênica presente em qualquer um dos dois componentes cuja fusogenicidade é ajustável alterando-se o ambiente de reação. Em determinadas modalidades, os EDEMs (por exemplo, iLNPs) exibem seletivamente uma capacidade melhorada (por exemplo, interação eletrostática) para a união com BDMs. Em determinadas modalidades, os BDMs (por exemplo, exossomas) seletivamente exibem uma capacidade melhorada (por exemplo, fluidez de membrana mais alta) para a união com BDMs. Consequentemente, são fornecidos, no presente documento, processos para gerar hibridossomas definindo-se os ambientes de reação. Tais processos geralmente compreendem a etapa de colocar os BDMs em contato com os EDEMs usados no presente documento (por exemplo, uma iLNP) , de modo que o contato cause a simples agregação e/ou disrupção de membrana com mistura de lipídio através de hemifusão e/ou fusão, resultando na mescla de algumas porções das populações de EDEM e BDM em uma subpopulação de hibridossomas. No presente documento, os processos contemplados têm vantagens substanciais devido ao meio de indução, controle, restrição e/ou terminação do respectivo mecanismo de união. Além disso, o processo da invenção permite que entidades modulares sejam substituídas ou redispostas para produzir uma arquitetura terapeuticamente relevante.

[0121] Em uma modalidade, uma mistura de EDEM aquosa que compreende vesículas pré-formadas com características físicas e morfologia definida, em que um ou mais lipídios têm ou assumem características fusogênicas, são adicionadas a uma câmara única através de uma entrada e uma mistura aquosa dos BDMs coletados é adicionada em uma segunda entrada. The componentes são, então, colocados em contato em uma câmara comum. Em uma modalidade, o dito contato é melhorado misturando-se as composições originais através de difusão. Em uma modalidade preferencial, a mistura ocorre por meio mecânico (por exemplo, agitação). Alternativamente, a união de BDMs e EDEMs pode ser facilitada através de dinâmica controlada de fluido tal como em um dispositivo de mistura microfluídico. Em tal modalidade, EDEMs e BDMs são injetados em entradas separadas de uma câmara microfluídica e a mistura controlada ocorre através da geometria da câmara e perfil de fluxo.

[0122] A invenção se refere a um processo para produzir hibridossoma em que o dito processo fornece controle sobre as propriedades fusogênicas de EDEMs e BDMs. Para a produção do hibridossoma desta invenção, a inclusão de um ambiente de reação em que componentes de EDEMs e/ou BDMs assumem atributos fusogênicos aumentados é uma modalidade preferencial. Em uma modalidade, o ambiente de reação ácido aumenta a carga de superfície catiônica líquida dos EDEMs e pode simultaneamente fazer com que os BDMs assumam carga de superfície aniônica líquida. Em uma modalidade preferencial, a união acontece em um tampão ácido com um pH entre cerca de 4 e cerca de 6. Sem se ater a qualquer teoria, em uma outra modalidade, a temperatura de reação pode ser modulada para causar uma transição de fase de lipídio nos EDEMs de bicamada para a fase hexagonal, ao mesmo tempo que simultaneamente diminui a rigidez membranar nos BDMs. A temperatura de reação é limitada a cerca de 60 °C devido à degradação potencial dos constituintes de BDM (por exemplo, proteínas). Em uma modalidade preferencial, uma temperatura de reação é ajustada a 37 °C. Em uma modalidade, o ambiente de reação exibe força iônica fisiológica. A presente invenção contempla, porém, sem limitação, o uso de misturas de NaCl ou KCl. Em uma modalidade adicional, a solução de reação pode ter íons de cálcio presentes.

[0123] A invenção, desse modo, fornece um processo para produzir hibridossoma em que a união de EDEMs e BDM é facilitada através de coincubação em um ambiente reativo por um período de tempo, incluindo, porém, sem limitação 5 minutos, 15 minutos, 3 0 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas ou mais. Em uma modalidade preferencial, a coincubação acontece por cerca de 1 hora.

[0124] Em variações particulares desse processo, o ambiente de mistura é alterado para limitar a unificação dos módulos. Em geral, a unificação de EDEM e BDM é controlada por vários parâmetros, que podem incluir carga de superfície líquida de concentração de partícula, densidade de carga, pH, força iônica, concentrações aditivas e temperatura. Métodos para alterar um ambiente de mistura são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, porém, sem limitação, a adição de soluções com capacidades de tamponamento mais altas ou misturas de módulo de diálise podem ser usadas para alterar as propriedades de solução de reação. Em uma modalidade preferencial, colunas de dessalinização podem ser empregadas para alterar as propriedades do soluto.

[0125] A invenção também se refere a um processo para produzir hibridossomas, em que o processo pode opcionalmente incluir a etapa de purificar esses hibridossomas de módulos individuais em excesso. Para a produção dos hibridossomas desta invenção, a inclusão da etapa de purificação é uma modalidade preferencial. Quando a purificação dos hibridossomas é desejada, a purificação pode ser alcançada por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose ou outros meios que sejam adequados para formar um gradiente de densidade. No entanto, entende-se que outros métodos de purificação tais como cromatografia, filtração, partição de fase, precipitação ou absorção também podem ser utilizadas. Os métodos de purificação incluem, por exemplo, purificação por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose, ou purificação através de uma coluna de exclusão de tamanho. O gradiente de sacarose pode variar de cerca de 0 % de sacarose a cerca de 60 % de sacarose, preferencialmente de cerca de 5 % de sacarose a cerca de 30 % de sacarose. O tampão em que o gradiente de sacarose é produzido pode ser qualquer tampão aquoso adequado para armazenamento da fração que contém os complexos e, preferencialmente, um tampão adequado para a administração dos hibridossomas a células e tecidos. Técnicas de separação alternada podem incluir, porém, sem limitação, focagem isoelétrica e/ou cromatografia de imunoafinidade. Por exemplo, EDEMs que compreendem lipídios ionizáveis exibem uma carga de superfície catiônica líquida e podem ser separados através de eletroforese. Em uma modalidade da presente invenção, a purificação de hibridossomas pode ser alcançada através de técnicas de purificação sequencial. Por exemplo, uma primeira cromatografia de imunoafinidade referente à afinidade a moléculas de superfície de BDM seguida por uma segunda cromatografia de imunoafinidade referente à afinidade de moléculas de PEG pode separar sequencialmente hibridossomas de BDMs e EDEMs em excesso. Uma outra técnica de separação pode abranger fracionamento por campo e fluido assimétrico em conjunto com espalhamento de luz de múltiplos ângulos para fracionar as vesículas de produto e reagente.

[0126] Os EDEMs usados no método da invenção facilitam ou melhoram a encapsulação e liberação de materiais encapsulados (por exemplo, um agente ativo) para um ou mais BDMs-alvo (por exemplo, através de permeação ou fusão com as membranas lipídicas de BDMs). Em determinadas modalidades, as características estruturais dos EDEMs e BDMs descritos no presente documento demonstram altas eficiências de fusão. O termo "eficiência de fusão" se refere à quantidade relativa de hibridossomas gerada a partir de EDEMs e BDMs que são submetidos à fusão. Em determinadas modalidades, as características estruturais de EDEMs e BDMs descritas no presente documento demonstram altas eficiências de fusão, melhorando, desse modo, a probabilidade de que quantidades apropriadas de materiais encapsulados (por exemplo, agente ativo) e biomaterial endógeno sejam combinados em um hibridossoma e subsequentemente minimizando a toxicidade ou efeitos adversos sistêmicos potenciais associados ao composto ou seu conteúdo encapsulado.

[0127] Em determinadas modalidades, as formulações do EDEM têm atributos ajustáveis para conferir a produção do hibridossoma, da qual tal módulo é um componente (por exemplo, compatibilidade membranar). Por exemplo, a incorporação de lipídios ionizáveis, lipídios auxiliares, lipídios modificados por PEG, polímeros responsivos a pH e/ou peptídeos penetradores de célula ativados por pH no EDEM revelados no presente documento, pode controlar a fusogenicidade de tal módulo (ou do hibridossoma do qual tal módulo é um componente) com a membrana lipídica de um ou mais BDMs-alvo, melhorando, desse modo, por exemplo, o controle sobre a unificação EDEM-BDM. Sem se ater a uma teoria específica, a razão molar relativa de lipídios de iLNP entre si é baseada nas características dos lipídios selecionados, na natureza do BDM-alvo, nas características dos materiais encapsulados e naquelas do alvo de entrega pretendido (por exemplo, célula, tecido ou órgão). Considerações adicionais incluem, por exemplo, a toxicidade, tamanho, carga, pKa, fusogenicidade e a saturação da cadeia de alquila dos lipídios selecionados.

[0128] Em determinadas modalidades, o teor de lipídio ionizável das composições de EDEM usadas no presente documento é distinguido como tendo uma ou mais propriedades que permitem tais vantagens de módulos em relação a outras subunidades classificadas. Por exemplo, em determinadas modalidades, os EDEMs usados no presente documento permitem o controle e personalização das propriedades de união (por exemplo, carga de superfície). Em particular, os compostos revelados no presente documento podem ser distinguidos pela natureza catiônica ajustável e definida, bem como sua capacidade de união com BDMs carregados de modo potencialmente oposto. Tais capacidades podem incluir, por exemplo, a formação de par iônico controlada, capacidades de fusogenicidade e/ou promoção da liberação de materiais encapsulados (por exemplo, agentes ativos) na composição gerada.

[0129] Em determinadas modalidades, as formulações do EDEM têm atributos ajustáveis para conferir a compatibilidade membranar entre EDEMs e BDMs. Por exemplo, a incorporação de lipídios auxiliares personalizada no EDEM revelado no presente documento pode permitir a rigidez membranar compatível de tal módulo para facilitar a união com a membrana lipídica de um ou mais BDMs-alvo. Especificamente, a razão molar relativa de lipídios e esteróis tais como colesterol pode ser combinada para ser semelhante às características do BDM-alvo. Considerações adicionais incluem, por exemplo, a rigidez resultante do hibridossoma, do qual tal módulo é um componente, para garantir a interação com o tecido ou célula-alvo.

[0130] Em uma modalidade da presente invenção, os BDMs têm atributos ajustáveis para conferir a compatibilidade membranar entre EDEMs e BDMs. Por exemplo, um teor mais alto de componentes de membrana de BDM, tais como, porém, sem limitação, esfingomielina, ácidos graxos saturados incorporados em fosfolipídios e colesterol podem contribuir para uma rigidez mais alta do que a célula doadora da qual deriva. Simultaneamente, visto que os componentes de membrana de BDM podem ser diferentes da membrana plasmática das células da qual um BDM é derivado, levando a uma maior rigidez, os BDMs podem mostrar estabilidade melhorada durante o processo de fabricação. No entanto, em um ambiente de pH ácido (por exemplo, cerca de pH 5) , contempla-se que a membrana de BDM da presente invenção exiba uma rigidez mais baixa (e fusogenicidade mais alta) e possa permitir a união com a membrana de EDEM.

[0131] Em determinadas modalidades, a incorporação de lipídios ionizáveis, por exemplo, com uma ou mais porções químicas ou grupos alquilamino nos EDEMs usados (por exemplo, como um grupo polar) pode adicionalmente promover a disrupção da membrana de BDM explorando sua fusogenicidade. Isso pode se basear não apenas no pKa otimizado e, portanto, na natureza catiônica dependente de pH do lipídio, mas também na temperatura de transição de fase otimizada, promovendo uma transição de uma fase de bicamada para a fase hexagonal Hn reversa altamente fusogênica (Semple et al., 2010). Acredita- se que o resultado promova a formação de pares iônicos entre os lipídios ionizáveis em seu estado catiônico e lipídios aniônicos, rompendo, desse modo, a estrutura de membrana de BDM e transferindo o conteúdo para o hibridossoma.

[0132] Os EDEMs usados no presente documento podem ser usados para produzir composições farmacêuticas que facilitam ou melhoram a encapsulação e liberação de materiais encapsulados (por exemplo, agentes ativos) para um ou mais BDMs-alvo (por exemplo, permeando-se ou fundindo-se com as membranas lipídicas dos BDMs). Por exemplo, quando uma composição à base de lipídio (por exemplo, uma iLNP) compreende ou é, de outro modo, enriquecida com um ou mais dos lipídios ionizáveis, a transição de fase na bicamada lipídica dos um ou mais BDMs pode facilitar a entrega dos materiais encapsulados (por exemplo, agentes ativos encapsulados em uma nanopartícula de lipídio) em um ou mais hibridossomas.

[0133] Em determinadas modalidades desta invenção, o controle sobre a quantidade total de lipídios ionizáveis nos EDEMs pode servir para controlar as características estruturais dos hibridossomas revelados no presente documento. Consequentemente, em determinadas modalidades da presente invenção, as características físicas dos EDEMs são proporcionais ao teor de lipídio ionizável. Por exemplo, os EDEMs com diâmetro pequeno podem ter um teor de lipídio ionizável mais baixo geral em comparação com os EDEMs com diâmetro maior. Consequentemente, um ou mais dos EDEMs revelados no presente documento podem se unir com o BDM idêntico até que uma carga de superfície líquida neutra e uma dimensão assim limitada seja alcançada.

[0134] Em uma modalidade desta invenção, os EDEMs podem ser fabricados para encapsular compostos catalíticos bioativos e enzimáticos que, mediante a integração no hibridossoma, têm capacidade para interagir com um ou mais compostos que se originam do BDM. Por exemplo, os EDEMs podem ser fabricados para conter ribonucleases, com capacidade para a degradação de quaisquer polinucleotídeos endógenos transferidos para um hibridossoma pelo BDM.

[0135] Os exemplos a seguir, que descrevem adicionalmente a invenção, são oferecidos a título de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de maneira alguma.

Exemplo 1 Produção de iLNPs como e Módulos de Encapsulamento de Fármaco e Engenharia Materiais e Métodos para os exemplos 1 a 4 A) Produtos químicos

[0136] 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N-[amino(polietileno-glicol)-2000] (amina-PEG-DSPE), [1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3- benzoxadi azol-4-il)] (NBD-PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[maleimida (polietileno glicol)-2000] (mal-PEG-DSPE), Distearoil-fosfatidilcolina (DSPC), 1,2- dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP), N-palmitoil- esfingosina-1-succinil[metoxi(polietileno glicol)2000] (PEG- Cer) e colesterol foram adquiridos junto à Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). As sínteses de 1,2-dilinoleiloxi-3- dimetilaminopropano (DLinDMA) e PEG-lipídios foram descritos previamente (Heyes, Palmer, Bremner & MacLachlan, 2005) .

B) Formulação de iLNPs à base de Extrusão

[0137] Preparação de vesículas pré-formadas: Dependendo das propriedades desejadas da vesícula, o lipídio catiônico ionizável (DLinDMA ou DODAP), DSPC, colesterol e PEG-lipídio (PEG-s-DMG ou PEG-Cer) foram solubilizados em etanol em uma razão molar apropriadas (por exemplo, 40:17,5:40:2,5). Para formar vesículas, a formulação de lipídio foi misturada em um tampão aquoso de baixo pH (acetato 50 mM, pH 4) em vórtice até alcançar uma concentração final de aproximadamente 10 mM e uma razão de 3:7 de etanol para solução aquosa. As vesículas multilaminares geradas foram, então, extrudadas através de dois filtros (Whatman) de policarbonato Nuclepore™ conformados em poros de 80 nm ou 100 nm empilhados com o uso de uma miniextrusora (Avanti,) à temperatura ambiente.

[0138] Encapsulação de Oligonucleotídeo de Vesícula Pré-formada: A encapsulação de oligonucleotídeo foi alcançada com o uso do método de vesícula pré-formada previamente descrito (Maurer et al. , 2001). Em geral, o oligonucleotídeo foi solubilizado em uma solução aquosa correspondente àquela das vesículas extrudadas (acetato 50 mM, pH 4, 30 % de etanol) e subsequente adição por gotejamento às vesículas unilamelares em mistura por vórtice. A encapsulação de plasmídeo, siRNA e shRNA foi realizada em uma razão de peso/peso de 1:30 de plasmídeo para lipídio e em uma razão de peso/peso de 1:16 de RNA para lipídio, respectivamente. A mistura foi, então, incubada a 37 °C por 30 min seguida pela remoção do etanol residual e troca de tampão através de diálise extensiva em PBS (pH 7,4) a 4 °C. O shRNA e plasmídeo não encapsulados foram removidos através de uma coluna de rotação de troca de ânions (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.), equilibrada em PBS (pH 7,4). A eficiência de encapsulação de oligonucleotídeo foi determinada por 260 nm de absorção (Spectramax M5e, Molecular Devices) após a solubilização das vesículas carregadas em uma razão de volume de 1:5 com isopropanol ácido (10 % de HCl).

[0139] iLNPs de encapsulação de Proteína: Em comparação com o protocolo acima, iLNPs que encapsulam albumina sérica bovina (BSA, Sigma Aldrich) e hemoglobina humana (Sigma Aldrich) foram produzidas dissolvendo-se a proteína no tampão aquoso (acetato de sódio 50 mM, pH 5,5) antes de alcançar uma concentração final de 1,5 mg/ml e 1 mg/ml, respectivamente, seguida pela adição por gotejamento da solução etanólica (20 % do teor de EtOH final) da razão molar de mistura de lipídio (40:17,5:40:2,5 de DlinDMA:DSPC:Col:PEG-Cer) em mistura por vórtice. Essa solução foi incubada a 37 °C por 1 h. As vesículas de lipídio que encapsulam BSA foram extrudadas como descrito acima. A remoção da proteína livre, etanol residual e troca de tampão foi alcançada através de diálise extensiva (300 kDA de MWCO, Spectrumlabs) em PBS (pH 7,4, 4 °C). A eficiência de encapsulação de proteína foi determinada através de um kit de ensaio de proteína BCA™ (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.,) após a solubilização da iLNP com 10 % de Triton X-100 (Sigma Aldrich). A remoção extensiva de proteína livre foi monitorada retendo-se o detergente durante a quantificação proteica.

[0140] iLNPs que encapsulam Molécula Pequena: Semelhante ao protocolo acima, iLNPs que encapsulam carboxifluoresceína foram produzidas dissolvendo-se a molécula pequena no tampão aquoso (acetato de sódio 25 mM, pH 5,5) antes de alcançar uma concentração final de 1 mM, seguida pela adição por gotejamento da solução etanoica (20 % do teor final de EtOH) da mistura de lipídio (razão molar de 40:17,5:40:2,5 de DODAP:DSPC:Col:PEG-Cer) em mistura por vórtice. Essa solução foi incubada a 37 °C por 1 h seguida por extrusão, como descrito acima. A remoção de moléculas pequenas, etanol residual e troca de tampão foi alcançada através de diálise extensiva (300 kDA MWCO, Spectrumlabs) em PBS (pH 7,4, 4 °C).

[0141] iLNPs que encapsulam Nanopartícula de Au: Devido à instabilidade de nanopartículas de Au em tampão iônico, a encapsulação de nanopartículas de Au 20 nm (Nanocs Inc.) foi alcançada mantendo-se as nanopartículas de Au em solução de água desionizada em uma razão de peso de ouro para lipídio de 1:20. Como descrito acima, a mistura de lipídio etanólica foi adicionada, a solução foi extrudada e o tampão trocado em PBS através de diálise. Em PBS, nanopartículas de Au livres se agregaram e sedimentaram. A presença de nanopartículas de ouro encapsuladas foi monitorada por absorvância de UV-Vis de Au-iLNPs em torno de comprimento de onda de ressonância de plásmon de 525 nm bem como Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) . O aumento em 450 nm de absorção de UV-Vis em comparação com vesículas vazias foi usado para determinar as concentrações de ouro como previamente descrito (Haiss, Tanh, Aveyard & Fernig, 2007). Como mostrado na Figura 1, os espectros de absorção de UV-Vis tanto de estoque de nanopartículas de ouro quanto de iLNPs de Au mostram o pico de ressonância de plásmon de superfície característico em aproximadamente 550 nm. Em detalhes, uma eficiência de encapsulação de 30 % para iLNPs de Au e 26 % para iLNPs de DNA de Au foi determinada a partir do aumento relativo em 450 nm de leitura de absorção em comparação com iLNPs de DNA e iLNPs vazios. As micrografias eletrônicas mostradas na Figura 2 confirmaram a presença de nanopartículas de ouro encapsuladas.

C) Formulação de iLNPs de Base Microfluídica

[0142] Preparação de Nanopartículas de Lipídio carregadas com siRNA empregando-se um sistema microfluídico de mistura rápida: Nanopartículas de lipídio foram preparadas em um sistema microfluídico Nanoassemblr™ (Precision NanoSystems) de acordo com as instruções do fabricante. Dependendo da formulação desejada, uma solução de etanol semelhante àquela da abordagem de vesícula pré-formada, que consiste em DLinDMA, colesterol, DSPC e PEG-lipídio na razão molar apropriada (por exemplo, 40:40:18:2), foi preparada em concentrações de lipídio total 10 mM. Além disso, uma solução de siRNA aquosa com uma razão de peso/peso de 1:16 de siRNA para lipídio foi preparada em tampão de acetato 25 mM em pH 4,0. Dependendo do volume total de produção, seringas de 1 e 3 ml foram usadas para gerar a corrente de entrada com uma taxa de fluxo total de 12 ml/min. Para cada formulação, a solução de siRNA aquosa foi misturada com a solução de etanol-lipídio com uma razão de taxa de fluxo de 3:1 (Aq:Et) à temperatura ambiente. O produto foi, então, submetido à diálise em PBS para remover o etanol residual bem como para elevar o pH para 7,4, e o siRNA livre foi removido como descrito com o método de vesícula pré-formada acima.

Exemplo 2 Isolamento de Vesícula Extracelular (EV) Isolamento como Módulos de Entrega Biocompatíveis

[0143] Exossomas: Os exossomas foram isolados do sobrenadante do linfoma de células do manto (MCL-exo) e linhas de células de glioblastoma (GBM-exo) através de centrifugações diferenciais como previamente descrito por Thery et al. (Théry, Amigorena, Raposo & Clayton, 2006) . Os exossomas foram, então, medidos quanto a seu teor de proteína com o uso de um kit de ensaio de proteína BCA™ (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.) e alíquotas de exossoma foram armazenadas a -80 °C. Para a purificação adicional, o pélete de exossoma foi dissolvido em PBS, disposto em camada no topo de uma almofada de sacarose com o uso de protocolos-padrão.

[0144] Microvesículas: Amostras de microvesículas derivadas de neutrófilos polimorfonucleares e de plaquetas humanas (MVs de PLT e MVs de PMN) foram isoladas de espécimes humanos. Em suma, MVs de PLT foram isoladas por centrifugação diferencial de concentrados de plaquetas derivados de transfusões de sangue de doador saudável, como descrito anteriormente (Sadallah, Eken, Martin & Schifferli, 2011) . As MVs de PMN foram purificadas como recentemente publicado (Eken, Sadallah, Martin, Treves & Schifferli, 2013); os PMNs foram isolados de um creme leucocitário fresco de doador saudável. Essas foram ativadas com formil-metionil-leucil- fenilalanina e as microvesículas vertidas foram isoladas através de centrifugação diferencial.

Exemplo 3 Modificação de Superfície de iLNPs Unindo-se Lipídios Peguilados com fragmentos Fab‘, Fragmentos de Anticorpo, Peptídeos e Glicosaminoglicanos

[0145] A compatibilidade de engenharia de iLNPs foi demonstrada através da conjugação de um anticorpo reduzido, fragmento Fab’, peptídeo de fusão e glicosaminoglicano a um lipídio peguilado ancorado na membrana de iLNPs. Em comparação com a formulação do exemplo 1, 0,5 % em mol do lipídio peguilado foi substituído por lipídios modificados por PEG com um grupo maleimida ou grupo amina na extremidade distal do PEG. A conjugação foi realizada de acordo com protocolos-padrão com base em reações entre: (1) grupos maleimida nos terminais PEG distais e grupos tiol livres de do anticorpo reduzido, fragmento Fab’ ou peptídeos terminalmente tiolados; (2) grupos amina nos terminais PEG distais e os grupos carboxila ativados na cadeia de glicosaminoglicano do glicosaminoglicano (GAG).

Métodos:

[0146] Fragmento Fab’: Primeiramente, fragmentos Anti-CD38 F(ab)2 foram reduzidos com 2-Mercaptoetilamina (MEA) (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.) com o uso de um quinto da concentração final mencionada pelas instruções do fornecedor. 60 μg de F(ab)2 foram incubados com MEA 10 mM em tampão de reação (EDTA 1 mM, PBS) por 90 min a 3 7 °C. A MEA foi removida por troca de tampão para tampão de reação com uma coluna de dessalinização de rotação Zeba™ (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.). iLNPs carregadas com siRNA foram imediatamente adicionadas (razão de 2:1 de mal:Fab’) e incubadas em uma placa agitadora a 4 °C de um dia para o outro. Os anticorpos/fragmentos não ligados foram separados em uma coluna Sepharose CL-4B equilibrada com PBS (pH 7,4). Frações contendo fragmentos Fab' foram determinadas a partir da leitura de absorvância a 280 nm, agrupadas e concentradas em um filtro centrífugo de 10 kDa (Amicon® Ultra-0.5, Merck Millipore). Uma eletroforese de gel (SDS-PAGE) em condições não redutoras, com o uso de 10 % de acrilamida, foi conduzida para verificar a integridade dos fragmentos Fab’ seguindo o F(ab)2 a um processo de redução Fab’.

[0147] Anticorpo IgG: Os anticorpos IgG foram reduzidos com Ditiotreitol (DTT) (Sigma). Antes da reação de acoplamento, o anticorpo foi reduzido com DTT 25 mM por 1 h a 4 °C em PBS. O Ab reduzido foi separado do DTT em excesso através do uso de uma coluna de dessalinização de rotação 40 kDa Zeba™ Spin (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.) equilibrada com PBS (pH 7,4). A conjugação (razão de 1:4 de mal:anticorpo) foi realizada em PBS (pH 7,4) de um dia para o outro a 4 °C. Os anticorpos não ligados foram removidos em uma coluna Sepharose CL-2. A conjugação de anticorpo foi determinada a partir da leitura de absorvância a 280 nm, como descrito para fragmentos Fab‘.

[0148] Peptídeo: Um peptídeo análogo ao 26-aminoácido melitina com uma cisteína N-terminal foi conjugado a iLNPs de pDNA misturando-se com o peptídeo tiolado a uma razão molar de 1:1 de peptídeo para maleimida e incubado de um dia para o outro à temperatura ambiente.

[0149] Glicosaminoglicanos: Os glicosaminoglicanos (5 kMW) foram conjugados ao grupo amina dos terminais PEG distais através de reação de acoplamento EDC-Sulfo NHS convencional. Primeiramente, os glicosaminoglicanos foram ativados por EDC/NHS (razão de 1:1 de EDC:COOH, razão de 1:1 de EDC/NHS) em DIW para 1 h seguido pela adição de iLNPs (razão de 5:1 de glicosaminoglicano:amina) em PBS (pH 8,2). A reação foi continuada por 2 h e seguida por diálise em PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente com um corte de 10 kDa para remover os glicosaminoglicanos não ligados.

[0150] A conjugação bem-sucedida foi determinada adicionalmente pela medição de DLS do diâmetro hidrodinâmico. Como se pode consultar na Tabela 1, a comparação do diâmetro hidrodinâmico (Dh) por DLS, o diâmetro médio de iLNPs aumentou após o acoplamento de IgGs, peptídeos de fusão, fragmentos Fab’ e glicosaminoglicanos.

Exemplo 4 Caracterização de iLNPs e EVs Secretadas In Vivo

[0151] Após a fabricação de iLNPs e isolamento de EVs, como descrito nos exemplos 1, 2 e 3, as distribuições de tamanho de iLNPs e EVs foram registradas com o uso de DLS (Zetasizer NS, Malvern) e NTA (LM20, Nanosight) com o uso de protocolos-padrão. Como mostrado na Tabela 1, os tamanhos médios aumentaram com a encapsulação de carga ou modificação de superfície de iLNPs. Devido às condições de síntese controladas, as iLNPs podem ser geradas com um pequeno índice de polidispersidade (PDI), que também é refletido na distribuição de tamanho de NTA monomodal acentuada. Como as vesículas secretadas, os exossomas têm uma polidispersidade herdada. Como mostrado na Figura 3, a abordagem de partícula única da análise de NTA revela uma distribuição de tamanho monomodal para iLNPs vazias e subpopulações diferentemente dimensionadas de GBM-exo. Tabela 1: - Determinação de tamanho de iLNPs e exossomas, bem como eficiência de encapsulação de carga

Exemplo 5 Iniciação Controlada da interação de BDMs e EDEMs

[0152] Foi investigado se a interação entre iLNPs e exossomas pode ser induzida alterando-se o pH do ambiente. Como mostrado na Figura 4, o diâmetro médio de uma solução de iLNP/exossoma aumenta no tampão de fusão (MES 10 mM, pH 5,5, NaCl 145 mM, KCl 5 mM) , enquanto nenhuma alteração significativa é evidente em um pH 7,4. Visto que a natureza de conjunto de medições de DLS torna difícil deduzir positivamente a presença de interações entre as duas subunidades, o foco foi, em seguida, direcionado para a interação entre as membranas lipídicas tanto dos exossomas quanto das iLNPs.

[0153] Além das alterações de tamanho, a mistura de lipídio entre duas membranas apresenta um outro método para determinar um evento de fusão. Durante um processo de fusão, os lipídios das duas membranas se dispersaram na membrana recém-formada. A mistura de lipídio foi monitorada pelo aumento na fluorescência resultante da diluição de corante de rodamina bruscamente autoarrefecida lipofílica (R18). Exossomas (20 μg de proteína) foram identificados com 1 μl de uma solução etanólica de cloreto de octadecil rodamina B (R18) (Biotium) (1 mM) em tampão de MES (MES 10 mM, pH 5,5, NaCl 145 mM, KCl 5 mM). Essa solução foi incubada por 30 min à temperatura ambiente. A R18 não incorporada foi removida com o uso de uma coluna de dessalinização Zebaspin© (corte de 40 kDa) , equilibrada com um tampão de fusão de MES (MES 10 mM, pH 5,5, NaCl 145 mM, KCl 5 mM) . Exossomas identificados com R18 (5 μg de proteína total) foram suspensos no tampão apropriado em uma cubeta de quartzo agitada e a fluorescência de amostra foi medida através de um espectrofluorômetro LS55 (Perkin Elmer) em comprimentos de onda de emissão de 590 nm e excitação de 560 nm. Após um tempo de equilíbrio de 3 min, iLNPs não identificadas (30 μg de lipídio total) foram adicionadas aos exossomas, e a fluorescência foi monitorada por outros 30 min. A diluição de R18 máxima foi obtida adicionando-se Triton X-100 para romper as membranas. A extensão da mistura de lipídio foi medida como a diferença de fluorescência equilibrada de exossomas por si sós e expressa como a % de desarrefecimento brusco de fluorescência máxima após a disrupção de detergente. Analogamente a exossomas, amostras de microvesícula (0,25 μg de MVs de PLT e 1,2 μg de proteína total de MVs de PMN) foram identificadas com solução etanólica de R18, seguida pela remoção de corante livre e monitoramento do aumento na fluorescência como mencionado acima.

[0154] Mediante a fusão entre iLNPs não identificadas e exossomas identificados com R18, a rodamina incorporada na membrana do exossoma se dispersa nas porções de membrana lipossômica não identificadas, resultando em autoarrefecimento brusco de proximidade reduzido e subsequentemente a fluorescência aumenta proporcionalmente ao grau da fusão membranar. Como mostrado na Figura 5, o aumento rápido na fluorescência ocorreu em pH de 5,5, um aumento mais lento e contínuo na fluorescência em um pH de 6.6, enquanto a mistura de lipídio foi dificultada em pH 7,6. Para verificar que a natureza catiônica de iLNPs foi a força motriz por trás da mistura de lipídio e não uma alteração de pH, a Figura 6 mostra que a adição de 0 % de lipossomas de DLinDMA (DSPC/Col/PEG) resultou em desarrefecimento brusco inexistente. A fim de descartar que uma propriedade fusogênica específica para a DLinDMA de lipídio ionizável seja potencialmente a força motriz por trás da mistura de lipídio, iLNPs foram fabricadas, em que a DLinDMA foi substituída pelo DODAP de lipídio ionizável. A mistura de lipídio foi observada mediante a adição dessas iLNPs de DODAP a exossomas identificados com R18 (Figura 7). Adicionalmente, experimentos semelhantes foram conduzidos durante o aumento do teor de PEG-lipídio de iLNPs de 2,5 % em mol para 10 % em mol (Figura 8) e variação da temperatura (Figura 9).

Exemplo 6 Interação de BMD e EDEM sondada em Partículas Únicas

[0155] A investigação, em seguida, foi focada na interação entre exossomas e iLNPs no nível de partículas únicas. A emergência temporal de partículas que compreendem uma mistura de proteína exossômica e membranas lipossômicas foi quantificada em uma configuração de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência (FCCS). Na preparação para medições de FCCS, as membranas de iLNPs foram identificadas com Bodipy™ (630/650) lipofílico, enquanto as proteínas de superfície exossômicas foram identificadas através da conjugação com éster NHS Bodipy™ (493/502) . Tanto os exossomas quanto as iLNPs foram, então, misturados em tampão de fusão em números de partícula comparáveis e a emergência de flutuações de intensidade correlacionadas em ambos os canais foi registrada. Os sinais sincronizados em ambos os detectores representam iLNPs e exossomas carregados ou fundidos, enquanto partículas individuais geram sinais temporalmente independentes. Na Figura 10, o aumento no grau de correlação cruzada (θ) quando exossomas-Bodipy™ (493) e iLNP-Bodipy™ (630) foram misturados, é mostrado ao longo do tempo. Nenhuma correlação entre o canal verde e o vermelho foi observada logo após a mistura das duas partículas. Após o decurso de um tempo de 8 min, o grau de correlação cruzada das partículas individuais aumentou de 0 % a aproximadamente 70 %, implicando que cerca de 70 % dos picos de fluorescência total das partículas sondadas exibiram proteínas de superfície exossômicas e membrana lipossômica.

[0156] O grau mínimo de detecção de correlação cruzada foi determinado com o uso de uma mistura de controle de dois corantes hidrofílicos (488 e 633) . Como controles positivos, padrões de IBA (IBA GmbH) de filamentos de DNA complementares duplamente identificados (488/633) foram usados para obter o grau alcançável máximo de correlação cruzada.

Exemplo 7 EDEMs Fusogênicos e Fusão de BDMs para formar Hibridossomas

[0157] A fim de descartar a possibilidade de ensaios de fusão de falso positivo, disrupção estrutural ou agregação simples devido à troca lipídica, o tamanho principal e distribuição de tamanho de uma mistura de iLNP/exossoma sem carga em um tampão de pH 5,5 foi registrado em pontos de tempo diferentes através de DLS e NTA. As mesmas condições experimentais foram usadas para monitorar o tamanho médio de média z por um período de 10 h. Como mostrado na Figura 11, durante a primeira hora de mistura, o tamanho médio de partícula aumentou rapidamente e permaneceu virtualmente não afetado durante as nove horas seguintes. No caso da agregação, vesículas opostamente carregadas têm a capacidade de agregação contínua em formações eletrostaticamente estruturadas, no entanto, não é esse o caso. Um outro indicador que regula a agregação é a extensão do aumento de diâmetro. O volume de duas esferas fundidas varia com o raio de uma maneira com l7^?'3, de modo que a fusão de uma esfera de 85 nm e de 130 nm dá origem a uma partícula de 141 nm. Na agregação, por outro lado, o raio varia linearmente com cada esfera adicional que se une a um agregado. Isso fica evidente através de um grande aumento de diâmetro na faixa de múltiplos do diâmetro da subunidade. Isso é confirmado adicionalmente como mostrado na Figura 12, uma mistura de siRNA-iLNPs e MCL-exos em tampão de fusão (armazenada à temperatura ambiente) não mostrou aumento significativo no diâmetro médio durante o período de 9 dias.

[0158] Para descartar que a alteração no tamanho médio ou distribuição de tamanho gaussiana revelada através de DLS não é um artefato de calcular a média de subpopulações, a distribuição de tamanho de exossomas, iLNPs e produtos de fusão com base em medições de NTA de partículas individuais foram avaliados. Antes da análise, iLNPs e exossomas foram diluídos em tampão de fusão (20000 vezes para iLNPs e 0,01 mg de proteína exossômica por ml). Para a reação de fusão, os exossomas e iLNPs foram incubados em uma razão de 1:1 e uma amostra obtida da mistura de reação foi registrada a cada 2 min. Por medição, um filme de 1800 quadros foi gravado. Os dados foram analisados com o uso de Software Analítico de NTA versão de suite 3.0 com um ajuste automático de desfocagem, comprimento de faixa mínimo e tamanho de partícula esperado mínimo.

[0159] O monitoramento da distribuição de tamanho em reações de fusão ao longo do tempo (Figura 13) mostrou que após 3 min de mistura uma população de 50 a 90 nm de iLNPs é amplamente reduzida e uma subpopulação em 90 a 125 nm aumenta. Após o decurso de um tempo de 18 min, a distribuição de tamanho mostra um pico de partículas de 144,2 nm e pode-se deduzir que o aumento da fusogenicidade de EDEMs na presença de BMDs dá origem a partículas que exibem uma distribuição de tamanho distinta. Esses perfis de tamanho único de exossomas, iLNPs e partículas recém-formadas são mostrados na Figura 14. A população de vesículas recém-formadas é denominada “hibridossomas”.

[0160] As distribuições de tamanho bem definidas na Figura 14 ou a estabilidade prolongada de diâmetro de vesícula mostradas na Figura 11 e Figura 12 são indicadores para uma carga de superfície líquida amortecida após a fusão. Como consequência, fusões consecutivas são prejudicadas e o sistema exibe um ciclo de retorno espontâneo.

Exemplo 8 Transferência Genética Mediada por Hibridossoma leva à Expressão de GFP

[0161] Para demonstrar a funcionalidade de entrega mediada por hibridossoma de carga genética, hibridossomas foram fabricados a partir de iLNPs e exossomas de linha celular de GBM que encapsulam um plasmídeo de GFP. A expressão de GFP repórter em células de GBM transfectadas com formulações de teste foi analisada através de citometria de fluxo e microscopia confocal. Células (50000 células semeadas no dia anterior) foram transfectadas com iLNPs (500 ng de GFP-pDNA por cavidade) e hibridossomas carregados (5 μg de proteína total/500 ng de GFP-pDNA por cavidade). Hibridossomas foram fabricados antes da transfecção misturando-se exossomas com iLNPs de pDNA em tampão de fusão por 30 min. A fim de descartar que a transfecção é resultado de internalização fortuita de iLNPs devido à endocitose induzida por exossoma, as células também foram cotransfectadas com iLNPs não fundidas (500 ng de GFP-pDNA por cavidade) e exossomas (5 μg proteína total por cavidade). Após tempos de transfecção de 0,5 h, 1 h, 2 h ou 24 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS, um meio fresco foi adicionado e as células foram cultivadas por 72 h. A quantidade de células que expressam GFP foi analisada por citometria de fluxo (consultar Figura 15). Os hibridossomas mostram taxas de transfecção mais altas em comparação com iLNPs de pDNA ou iLNPs de pDNA não fundidas que foram cotransfectadas com exossoma.

Exemplo 9 Purificação de Hibridossomas

[0162] Para excluir a interferência de iLNPs não fundidas em experimentos de transfecção, essas foram separadas dos hibridossomas através de centrifugação de gradiente de densidade de sacarose contínua. Para determinar a densidade de iLNPs de pDNA, essas foram centrifugadas em gradientes (190000 g, 14 h) de 0 a 55 % de sacarose contínua (peso/volume), e a coluna foi fracionada. A densidade de frações de sacarose foi determinada através de um refractômetro e a presença de partículas foi analisada através da contagem de fótons em DLS. Os dados revelam uma densidade máxima de 1,05 g/ml de iLNPs de pDNA (consultar Figura 16).

[0163] A centrifugação de misturas de fusão de pDNA- iLNP/exossoma (razão de proteína para plasmídeo de 1:0,1, peso:peso) em um gradiente de sacarose correspondente rendeu uma banda distintamente opalescente que contém as iLNPs não fundidas no topo do gradiente. As frações de sacarose que correspondiam a partículas com densidades de 1,06 a 1,08, 1,09 a 1,18 e 1,19 a 1,25 g/ml foram agrupadas e a sacarose foi removida através de diálise em PBS.

[0164] A capacidade de essas frações transfectarem GFP foi monitorada incubando-se com células (72 h, 50000 células/cavidade) e analisando-se o número de GFP que expressa células através de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 17 e Figura 16, todas as frações resultaram na expressão de GFP.

[0165] Os pDNA-hibridossomas (partículas abaixo de 1,05 g/ml) foram agrupados, a sacarose foi removida através de diálise e esses foram novamente testados em estudos de transfecção independentes. As células (50000 células) foram transfectadas com pDNA-hibridossomas (2,5 μg proteína/cavidade com base em ensaio de BCA da fração agrupada) para 0,5 h, 1 h, 2 h ou 24 h. Após os tempos de transfecção indicados, as células foram lavadas duas vezes com PBS e foi adicionado um meio de cultura fresco. A quantidade de células que expressam GFP após a cultura por 72 h foi analisada através de citometria de fluxo (consultar Figura 18)

Exemplo 10 Porções Químicas de Direcionamento Exógenas em Hibridossomas

[0166] As iLNPs modificadas em superfície por IgG mostradas acima foram usadas para preparar hibridossomas com fragmentos de IgG na superfície. Analogamente ao enriquecimento de hibridossomas carregados com plasmídeo no exemplo 9, as iLNPs aglutinadas com IgG foram misturadas com exossomas derivados de GBM em tampão de fusão por 30 minutos (razão de peso de 6:1 de lipídio para proteína exossômica), e as iLNPs não fundidas foram separadas em um gradiente de sacarose. Uma camada de particulado estava visível em uma densidade de 1,12 a 1,14 g/ml (Rf=0,62 em comparação com Rf=0,36 para hibridossomas carregados com plasmídeo). As frações abaixo de 1,08 g/ml foram agrupadas e a sacarose residual foi removida através de diálise em PBS. Eletroforese em gel (SDS-PAGE) em condições não redutoras com o uso de 10 % de acrilamida foi conduzida para verificar a presença tanto de IgGs quanto de proteína exossômica.

[0167] A linha celular de GBM (50000 células por cavidade semeadas no dia anterior) foi transfectada com hibridossomas de IgG purificados com gradiente de sacarose (1,4 μg de teor de proteína por cavidade como determinado através de ensaio de BCA). Após 24 h de incubação, as células foram lavadas e, como mostrado na Figura 19, a citometria de fluxo determinou grosseiramente 80 % de células positivas para o anticorpo identificado com anti-IgG secundário.

Exemplo 11 EDEMs Diversas para Hibridossomas Versáteis

[0168] A capacidade para produzir hibridossomas distintos variando-se a modificação de superfície ou a carga de EDEM foi determinada através de dois tipos de ensaio de fusão.

[0169] Um ensaio de R18 foi realizado como delineado no exemplo 5. Em suma, a fusão foi determinada misturando-se as diferentes espécies de iLNPs mostradas no exemplo 1 com exossomas derivados de linha celular de GBM identificada com R18 em tampão de fusão. A fusão com iLNPs que encapsulam oligonucleotídeos, proteína e nanopartículas de ouro (nanopartículas de ouro por si sós ou coencapsuladas com pDNA) é mostrada na Figura 20 a Figura 22. A fusão entre exossomas e iLNPs com modificação de superfície de IgG e peptídeo é mostrada na Figura 23.

[0170] Um ensaio de pireno foi empregado para determinar a fusão de exossomas de MCL com iLNPs carregadas com siRNA. Essas iLNPs de siRNA foram fabricadas por extrusão ou através de chip microfluídico de mistura rápida (como delineado no exemplo 1).

[0171] Esse ensaio se baseia no aumento de fluorescência monomérica (aproximadamente 400 nm) devido à diluição de excímeros de pireno mediante a fusão de membranas identificadas com membranas não identificadas. Os exossomas (35 μg de proteína total) em 100 μl de PBS foram identificados com 1 μl de uma solução etanólica 2,5 mM de ácido 1-pirenododecanoico (Life Technologies) por 30 min a 37 °C. O ácido 1-pirenododecanoico em excesso foi removido através de peletização por duas vezes e lavagem com tampão de MES (MES 0,2 M, NaCl 150 mM, pH 5,5) através de ultracentrifugação a 100000 g por 60 min. Após a remoção de do pireno livre, os exossomas identificados (10 μg proteína total/cavidade) foram suspensos em tampão de MES (MES 0,2 M NaCl 150 mM, pH 5,5) em uma placa de 96 cavidades. O aumento na fluorescência monomérica após a adição de iLNPs não identificadas (5 μg de lipídios totais) foi registrado a 37 °C com um leitor de microplaca Synergy HT (Biotek) . Como mostrado na Figura 24, uma elevação no sinal monomérico ocorre uma vez que os exossomas são misturados com iLNPs produzidas por extrusão (ext) e chip microfluídico (mf).

Exemplo 12 Vesículas extracelulares como Módulos de Entrega Biocompatíveis para Hibridossomas Versáteis

[0172] A fusão entre microvesículas secretadas por vários tipos de células, e diferentes iLNPs foi determinada através de um ensaio de fusão de R18.

[0173] Como mostrado no exemplo 2, microvesículas humanas foram isoladas de plaquetas (MVs de PLT) e neutrófilos polimorfonucleares (MVs de PMN).

[0174] Analogamente ao Exemplo 5, amostras de microvesícula (0,25 μg de MVs de PLT e 1,2 μg de proteína total de PMN-MV) foram identificadas com solução etanólica de R18, seguida pela remoção de corante livre. O aumento na fluorescência foi monitorado mediante a adição de diferentes espécies de iLNP.

[0175] Como mostrado na Figura 25, a mistura de iLNPs com MVs de PMN em tampão de fusão resultou em desarrefecimento brusco de R18. Uma iLNP dependente de pH com interação de PMN-MV foi determinada visto que a adição de iLNPs em pH 7,4 resultou em nenhum desarrefecimento brusco. A mistura com iLNPs de pDNA e ILNPs de BSA resultou em desarrefecimento brusco de R18.

[0176] Como mostrado na Figura 26, a mistura de MVs de PLT e iLNPs vazias é dependente de pH e semelhante àquela de exossomas e iLNPs vazias. As MVs de PMN e de PLT são de interesse particular como BDMs devido a suas propriedades imunossupressoras e anti-inflamatórias. Mostrou-se que as MVs de PMN podem inibir a liberação de citocina (fator α de necrose tumoral, fator de crescimento de transformação β1, interleucina 8, interleucina 10 e interleucina 12p70) e reduzir os receptores de ativação imune (CD40, CD80, CD83, CD86, CCR7, HLA-DP, HA-DQ e HA-DR) em células dendríticas derivadas de monócito humano (Sadallah, Eken & Schifferli, 2011).

Exemplo 13 Absorção Celular de Hibridossomas em Células de Difícil Transfecção

[0177] A microscopia fluorescente foi usada para determinar a absorção celular de hibridossomas por linha celular de linfócito de difícil transfecção (Jeko1). Os hibridossomas foram preparados a partir de MCL-exo e iLNPs identificadas com NBD e (formulação de iLNP DlinDMA:Col:DSPC:PEG-S-DMG:NBD-PC de formulação de 40:40:17,5:2:0,5). MCL-Exo (2 μg de proteína total por cavidade) foram misturados com iLNPs identificadas com NBD (1 μg de lipídios totais por cavidade) em um tampão de reação (MES 10 mM, pH 6,0, NaCl 145 mM, KCl 5 mM) e incubados em um agitador por 30 min a 37 °C.

[0178] Os hibridossomas e iLNPs foram transfectados com células-alvo por 1 h e, então, lavados duas vezes com PBS para remover vesículas não internalizadas e ligadas em superfície. As células foram então ressuspensas em PBS e imagens fluorescentes foram produzidas em configurações de instrumento idênticas. A intensidade de fluorescência média de corante de membrana de iLNP por célula foi determinada através da análise de imagem software de fonte aberta ImageJ. Como mostrado na Figura 27, as células Jeko1 (n=160) exibiram uma intensidade média aproximadamente 7 vezes mais alta do corante de membrana de iLNP após 1 h de transfecção com hibridossomas do que com iLNPs por si sós.

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Claims (15)

1. PROCESSO PARA FABRICAR UM CARREADOR BIOCOMPATÍVEL HÍBRIDO (HIBRIDOSSOMA), caracterizado por compreender: (a) fornecer uma primeira vesícula que compreende uma membrana e um ou mais agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico encapsulados dentro do dito primeiro veículo, em que a dita primeira vesícula foi produzida in vitro, em que a dita primeira vesícula é selecionada a partir do grupo que consiste em nanopartículas à base de lipídeos (LNPs), lipossomas, LNPs estabilizados por polímero, cerassomas, esfingossomas, polimersomas, LNPs estabilizadas por nanopartícula sintética, LNPs derivadas de membrana natural e LNPs revestidas por membrana natural, e em que a dita primeira vesícula compreende pelo menos uma porção química fusogênica que permite ou melhora a disrupção de uma mistura de membrana ou lipídeo entre uma membrana e uma bicamada de lipídeo, em que a pelo menos uma porção fusogênica é um lipídeo catiônico ionizável tendo pelo menos um grupo protonável ou desprotonável, de modo que o lipídeo seja carregado positivamente em um pH igual ou abaixo do pH fisiológico e neutro ou acima do pH fisiológico; (b) fornecer uma segunda vesícula que compreende uma bicamada lipídica, a qual é produzida in vivo e é liberada no ambiente extracelular; e (c) colocar a dita primeira vesícula em contato com a dita segunda vesícula a um pH abaixo de 7,4 e a uma temperatura entre 0°C e 60°C, unindo, desse modo, a dita primeira vesícula à dita segunda vesícula e produzindo o dito hibridossoma.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo contato ser realizado em um tampão com um pH no qual o lipídeo fusogênico, ionizável, catiônico está carregado positivamente.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo contato ser realizado em um tampão que tem um pH entre 4 e 6.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo contato ser realizado em uma temperatura de reação de 37°C.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito lipídeo catiônico ionizável ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2- DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2- DMA), heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il4- (dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA), 1,2-dioleoil-3- dimetilamônio-propano (DODAP), N-(4-carboxibenzil)-N,N- dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOBAQ), YSK05, ácido 4-(((2,3-bis(oleoiloxi)propil)- (metil)amino)metil)benzoico (DOBAT), N-(4-carboxibenzil)-N,N- dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOBAQ), ácido 3- ((2,3-bis(oleoiloxi)propil)(metil)amino)propanoico (DOPAT), N-(2-carboxipropil)-N,N-dimetil-2,3-bis-(oleoiloxi)-propan-1- amínio (DOMPAQ), N-(carboximetil)-N,N-dimetil-2,3- bis(oleoiloxi)propan-1-amínio (DOAAQ), Alny-100, 3- (dimetilamino)-propil(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12- dien-1-il]-henicosa-12,15-dienoato (DMAP-BLP)lipídeo.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita primeira vesícula compreender uma porção química de direcionamento, em que a porção química de direcionamento é selecionadas a partir do grupo que consiste em anticorpos, peptídeos, proteínas, aptâmeros, oligonucleotídeos e polissacarídeos.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira vesícula compreender um lipídeo modificado por PEG.

8. PROCESSO, de acordo com o reivindicação 7, caracterizado lipídeo modificado por PEG selecionado a partir do grupo que consiste em um PEG-fosfolipídeo, fosfatidiletanolamina modificada por PEG (PEG-PE), ceraminas modificadas por PEG, dialquilaminas modificadas por PEG, diacilgliceróis modificados por PEG, polietilenoglicol dipalmitoilglicerol (PEG-DPG), dialquilgliceróis modificados por PEG, (Metóxi Polietilenoglicol)-dimiristolglicerol (PEG- s-DMG), uma PEG-dialquiloxipropila (DAA), R-3[w-metoxi- poli(etilenoglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil- 3-amina (PEG-c-DOMG e N-Acetilgalactosamina-((R)-2,3- bis(octadeciloxi)propil-1-(metoxi- poli(etilenoglicol)2000)propilcarbamato)) (GalNAc-PEG-DSG).

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito um ou mais agentes terapêuticos ser(em) selecionado(s) a partir de: (a) um fármaco ou um sal farmaceuticamente aceitável; (b) um anticorpo à base de agente terapêutico; (c) um peptídeo ou uma proteína, e (d) um ácido nucleico.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito agente terapêutico ser um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA antissenso, micro-RNA (miRNA), RNA em forma de grampo curto ou pequeno (shRNA), RNA guia (gRNA), RNA de agrupamento de repetição palindrômica curta e regularmente interespaçada (crRNA), RNA de agrupamento de repetição palindrômica curta e regularmente interespaçada transativador (tracrRNA), oligonucleotídeos imunoestimulantes, plasmídeos, ácidos nucleicos e antissenso e ribozimas.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita primeira vesícula compreender uma molécula de ácido nucleico modificada e/ou mRNA que codifica pelo menos um antígeno.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita segunda vesícula compreender um antígeno associado à doença selecionado a partir de um antígeno associado a tumor e um antígeno associado a patógeno.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito agente de diagnóstico ser um radioisótopo incluindo um ou mais radionucleotídeo(s) selecionado(s) partir do grupo consistindo em: 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I, 131I, 111In, 117Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y e 90Y.

14. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito agente de diagnóstico ser selecionado a partir de um ponto quântico e uma nanopartícula de metal selecionada a partir de uma nanopartícula de ouro ou prata.

15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela a dita segunda vesícula ser derivada de: (i) uma célula tumoral de um paciente com câncer ou pré-câncer, ou ser derivada de um tumor ou linha celular cancerosa; (ii) uma célula de glioblastoma ou célula de linfoma de células do manto; (iii) uma célula selecionada do grupo que consiste em células B, células apresentadoras de antígenos, linfócitos, trombócitos, neutrófilos, neutrófilos polimorfonucleares ativados e leucócitos; (iv) um patógeno selecionado de um grupo que consiste em um patógeno bacteriano, patógeno amebiano, patógeno parasítico ou patógeno fúngico; ou (v) uma célula infectada por patógeno.