JP2020517750A - 癌処置のための融合性リポソーム、組成物、キットおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に癌治療に使用するためのリポソーム構築物を含む超分子集合体に関する。
免疫療法は、癌と戦うために、生体本来の免疫系を利用するため、癌治療の最も有望な領域の一つと考えられる1, 2。腫瘍形成について示唆されたのは3、異型遺伝子性腫瘍細胞(十分なドライバーおよびパッセンジャー変異を含む)4で開始し、これが免疫細胞により攻撃され5、低異型遺伝子性腫瘍ニッチェ6がもたらされ、次いで、これが免疫細胞による有効な同定を逃れ、制御性T細胞および腫瘍浸潤性マクロファージ(TAMs)などの抗炎症性細胞を動員することであった7。種々の癌タイプは、免疫検出を逃れ、結果的に免疫細胞による致死から逃れる機構を用いる。第一選択治療として通常用いられる対抗手段は、通常、粘膜、皮膚、骨髄および他の組織の損傷により患者のクオリティ・オブ・ライフに重大に影響するオフターゲット副作用を有する。
本出願は、免疫系の特異的活性化による癌細胞の死滅を可能とする免疫標識プラットフォームの実施態様を記載する。概念は、標的細胞に統合されるまたは標的細胞と反応することができる脂質であって、膜と融合できるリポソーム、ミセルおよびキューボソームなどの集合体を形成する脂質;および脂質ゲル、脂質スポンジ、二重層または単層脂質シート、線維状脂質構造および脂質渦巻形などの腫瘍内または近傍に脂質を放出するよう設計された超分子集合体の使用による、免疫活性化剤での特異的細胞の標識のための細胞膜の修飾である。標的細胞と反応する脂質粒子は、超分子集合体または免疫系活性化剤に見られる反応基と、細胞表面の反応基(タンパク質表面のアミンまたはその他反応基など)の反応をいう。例えば、トシル−PEG4−アジドは、リポソームからの放出により、癌/標的細胞表面のタンパク質と反応できる。
開示する実施態様は、添付する図面と併せて、次の詳細な記載からより完全に理解および認識される。ここに含まれ、記載する図面は模式的であり、本開示の範囲を限定しない。図面において、要素のサイズは誇張していることがあり、それ故に、説明目的で原寸に比例していない。寸法および相対的寸法は、本開示の現実の実施化に必ずしも対応していない。
次の記載の中で、本出願の種々の態様を記載する。説明の目的で、特定の配置および詳細を、本出願の完全な理解を提供するために示す。しかしながら、本出願は、ここに呈示する特定の詳細がなくても実施し得ることは当業者には明らかである。さらに、周知の事項は、本出願を不明瞭にしないために省くかまたは単純化していることがある。
プラットフォームは、末端使用者が、異なる官能基を有するリポソームを使用してまたは化学修飾の手段により直接、標的細胞の細胞表面を修飾することを可能とする。
1.1. 抗癌:
1.1.1. 免疫系細胞による癌細胞致死のための標識。例えば、キラーT細胞による癌細胞致死を誘発するための、癌細胞上のアルキン基の提示およびアルキンまたはアジド−抗CD3およびアルキンまたはアジド−抗CD8の全身注射による提示。
1.1.2. 抗癌ペプチドによる癌細胞致死のための標識。例えば、癌細胞上のそれぞれアルキンまたはアジド基の提示および細胞致死のために膜アンカーを必要とするアジド−抗癌ペプチドの注射による提示。
1.2. 抗自己免疫性疾患:免疫系細胞による致死のための自己反応性細胞の標識。
2.1. 患者由来キラーT細胞を、標的細胞認識および続く標的細胞致死のために新規化学基でエキソビボで標識し得る。例えば、抗CD3−アルキンまたはアジドを、B細胞リンパ腫処置に使用できる標的指向化ペプチド−アジドまたはアルキン(エピトープ)または抗CD19抗体−アジドまたはアルキン、または黒色腫細胞致死のためのHLA−MART1抗体−アジドまたはHIV感染T細胞致死のための抗GP120抗体−アジドまたはアルキンと共有結合させ得る。
2.2. 初代制御性T細胞を、MS、関節炎、乾癬などで炎症進行を阻止するために慢性炎症部位標的指向化抗体−アジドまたはアルキンまたはペプチド−アジドまたはアルキンに共有結合できる抗CD3−アルキンまたはアジドを使用して標識し得る。
2.3. 循環腫瘍細胞修飾:腫瘍細胞を、新規癌ワクチン製剤をもたらす、これらの細胞に対する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす免疫活性化部分で標識し得る。
エタノール注入を使用する免疫標識リポソームの産生:
脂質(アバンティ極性脂質またはリポイド)を必要な組成に従い秤量し、必要なリポソーム体積の10%の最終体積で無水EtOHに可溶化した。脂質−EtOH混合物を、脂質のTm(融解温度)を超えて加熱した。EtOH注入を、同一温度で適切な緩衝液中で実施し、脂質−緩衝液を混合し、押出器を使用して、所望のサイズ分布でリポソームを得るために押し出した。
エタノールアミン基含有リポソームを、NHSエステル化学反応(N−ヒドロキシスクシンイミド)を使用して、リンカーおよびアジド(結合対の一方のメンバー)で押し出し後化学修飾した。一般に、NHS−ポリエチレングリコール(PEG)4−アジド(NHS基)を、1級アミン基(DOPE脂質)あたり5モル当量で使用した。未結合過剰物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
あるいはリポソームを、銅依存的または非依存的クリック反応を可能とする類似のリポソーム製品を得るために、前修飾脂質を使用して製造した。簡潔には、PEG4−アルキンまたはアジドで前修飾したDSPEまたはDOPE脂質を、EtOH注入前に脂質混合物に封入した。
PEG4は、約194Daの分子量を有するPEGを表す。
抗体は、リポソーム化学修飾と同じ方法を、わずかに改変して使用して、日常的に修飾され、浄化される。簡潔には、抗体あたり、50モル過剰のNHS−PEG4−BCN(この結合対の他方のメンバー)を加える。未結合過剰物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
2STEP:結合対の一方のメンバー(例えばアジド)に共有結合したリポソームを、適切な希釈で直接細胞に使用し(または動物モデルではIV注射)、続いて処理細胞を洗浄し(インビボ設定下では適用不可)、結合対の相補的メンバー(例えばBCN)で修飾した抗体と反応させた。検出目的で、免疫リポソーム標識細胞を結合対の相補的メンバー(例えばDBCO)を伴う蛍光色素と反応させた。
細胞株を、37℃で5%CO2下、ペニシリンおよびストレプトマイシン、アンフォテリシンB、熱不活性化ウシ胎児血清およびL−グルタミンを添加した、ATCCにより推奨される培地、一般にRPMIまたはDMEMで増殖させる。細胞をHBSS中のトリプシン溶液を、5〜10分、37℃で使用して回収し、ピペットを使用して集め、400gで5分間遠心分離する。ペレット化細胞をパイロジェンフリーPBS−−緩衝液(カルシウムおよびマグネシウム不含)または増殖培地に再懸濁し、トリパンブルーを生死判別色素として使用し、位相差顕微鏡下、血球計算盤で計数する。細胞を、10継代まで継代培養し、マイコプラズマについて定常的に試験する。
一般に、チューブあたり500,000細胞を使用し、実験を、トリプリケートで2生物学的反復で実施する。細胞を、増殖培地でFITC標識リポソームと、0.5mM脂質で必要な時間(一般に1時間)、37℃で5%CO2下インキュベートする。次いで細胞をパイロジェンフリーPBS−−を使用して3回洗浄する。細胞を、その後1時間、PBS−−中で、DBCO−Cy5(クリッカブル蛍光色素)を使用して染色する。細胞をPBS−−でさらに3回洗浄し、PBS−−中1.6%PFAを使用して15分間固定し、洗浄し、PBS−−に再懸濁する。固定細胞を、数分間から最大7日間、4℃で貯蔵し、その後BD FACSCaliburを使用してFACS分析する。
細胞を、側方散乱および前方散乱検出シグナルの手動ゲーティングを使用して分析し、インタクト細胞と残骸を区別するために、それに応じてゲート開閉する。チューブあたり10,000細胞を計数し、必要な蛍光チャネル:FL1チャネル:緑色蛍光チャネル(530±15nm、FL1)を使用して分析する。使用するレーザーは488nm、15mW;FL4チャネル:赤色蛍光チャネル(661±8nm、FL4)である。使用するレーザーは635nm、9mWである。シグナル閾値を対照リポソーム(または無リポソーム)処理細胞を使用して決定し、ゲートを未染色対照の蛍光シグナルより高く設定し、陽性シグナルを決定し、陽性細胞パーセントを計算する。
クエン酸三ナトリウム(希釈1:9 クエン酸0.11M対血液)を添加した初代マウス脾細胞または静脈血を、パイロジェンフリーFicoll(1.077)を使用して分離し、IL2および抗CD3および抗CD28を5〜13日間、37℃で5%CO2下使用して刺激した。これらを初代エフェクター/記憶キラーT細胞源として使用した20。
フローサイトメトリー用途:1μlのCFSE原液(DMSO中2.5mg/ml)を1mlの100万〜800万細胞を含む増殖培地に加える。細胞をすぐにボルテックス処理し、組織培養インキュベーターで30分間インキュベートする。染色細胞を増殖培地を使用して3回洗浄する(1洗浄:細胞を400gで5分間遠心分離し、ペレット化細胞を培地に再懸濁する)。
蛍光顕微鏡用修飾プロトコール:1μlのCFSE原液(DMSO中2.5mg/ml)を1mlの100万〜800万細胞含有パイロジェンフリーPBSに加える。細胞をすぐにボルテックス処理し、組織培養インキュベーターで30分間インキュベートする。染色細胞を増殖培地を使用して3回洗浄する。
4T1mCherry細胞を、N8リポソーム(PEG4−アジドで修飾)で、5mM脂質で1時間、37℃で5%CO2下、処理した。細胞をパイロジェンフリーPBSを使用して3回洗浄し、100μlの100mM脂質あたり12.5μgの各mAbの比で、増殖培地で1時間、PEG4−BCNを使用して標識した抗体と反応させた。癌細胞をCFSE染色初代キラーT細胞と、37℃で5%CO2下共インキュベートし、LSM 710共焦点顕微鏡の緑色および赤色チャネルで、5分毎に24時間造影した。対照を、同一条件下、癌細胞をリポソームに曝さずに、しかし、同じドナーのキラーT細胞を使用して行った。
マウスをHarlan(Envigo, Israel)から得て、SPF(特定の病原微生物がいない)施設で、12時間明/暗サイクルで、餌および水は自由にして維持する。全ての実施した実験は、施設内動物実験倫理審査委員会により承認された。4T1マウス癌細胞株(50μlのPBS−−中300,000細胞)を、7〜8週齢雌balb/Cマウスの乳房脂肪体に30G針を使用して注射した。触知可能腫瘍は、細胞注射5〜10日後に現れる。一般に、100mm3の平均腫瘍サイズで処置を開始する。施設内動物実験倫理審査委員会により決定されるとおり、1000mm3の腫瘍サイズでまたは動物が処置体重の15%を失ったら、動物をCO2を使用して屠殺する。腫瘍サイズを、腫瘍の最長寸法(L)およびそれに垂直な寸法(W)を測定するためにノギスを使用して決定する。腫瘍体積(V)を下式を使用して推定する:
V=W*W*L/2
全処置を、腫瘍担持マウスへのIV注射により全身的に行う。
0.72grのビオチン(2.94mmol)に、40mlのジメチルホルムアミドを加え、続いて1.69gr NHS(14.68mmol)を加えた。反応溶液2.00grのDCC(14.80mmol)を加え、18時間、環境温度で撹拌し、その後完了させた。反応をTLC(TLC移動相:80%酢酸エチル:20%メタノール;染色PMA)で試験した。反応溶液を濾過し、次いで100mlの溶液(30%酢酸エチル:70%ヘキサン)で希釈した。生成物を濾過して、微量のいくつかの反応材を含む600mgの生成物を得た。次いでさらに50mlの溶液を加えて、さらに多く沈殿させた。沈殿を濾過により取り、66mgの純粋生成物(TLCおよびNMRにより試験)を得た。次いで反応溶液にさらに100mlの同溶液を加えて、さらに多く沈殿させた。単離後、ある尿素副産物と混合した600mgの生成物を単離した。純粋生成物(66mg)を、生物学的適用のための反応に使用した。
30mgのBCN−NHS(0.10mmol)に、5mlのクロロホルムを加え、続いて0.2ml トリエチルアミンを加えた。反応物に、100mgのNH2−Peg1100COOH(0.09mmol)を加え、反応物を2時間撹拌し、その後TLC(TLC移動相:80%クロロホルム、20%メタノールおよび100%クロロホルム;染色PMA)で試験した。反応は完了していなかった(NH2−PEG1100COOH残存)。それ故にさらに15mgのBCN−NHS(0.05mmol)を加え、反応物をさらに1時間撹拌した。TLC試験によれば反応は完了していた(反応後NH2−PEG1100COOH残存なく、新規の低極性スポットが観察される)。トリエチルアミンをロータリーエバポレーターにより蒸発させた。次いで、反応物を3ml クロロホルムで希釈した。生成物を30mlのジエチルエーテルを加えて沈殿させた。粗製生成物120mgを蒸発により得て、そのまま次工程で使用した。
120mgのBCN−PEG1100COOH(0.09mmol)に、5mlのアセトニトリルを加え、続いて0.2ml トリエチルアミンを加えた。反応溶液に、50mgのDSC(0.20mmol)を加え、反応物を2時間撹拌した。TLC(TLC移動相:80%クロロホルム、20%メタノール;染色PMA)で反応を試験した。反応は完了した(反応後BCN−PEG1100COOHは残存せず、新規低極性スポットが観察される)。反応溶液を、減圧下ロータリーエバポレーターにより蒸発乾固した。次いで、残留物を、10mlの溶液(5ml:5ml ジクロロメタン:ジエチルエーテル)に溶解した。反応混合物を15分間撹拌し、反応溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固しながら、残渣をフラスコに残した。得られた固体−120mg(収率約93%)−を、TLCおよびNMRにより試験した。生成物を冷凍庫で保存した。
105mgの脂質(DSPEまたはDOPE)に、10mlのクロロホルムを加え、続いて50mgのFITCおよび1.0mlのトリエチルアミンを加えた。反応物を、15分間、環境温度で撹拌し、その後5mlのDMFを加えた。反応物を1時間、環境温度で撹拌し、TLC(TLC移動相:25%メタノール、75%クロロホルム;染色PMA)によると完了した。次いで、反応物をクロロホルムで10倍に希釈し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を30%メタノール:70%クロロホルムで溶出した。純粋生成物フラクションを合わせ、蒸発乾固した。95mgのDOPE−FITCおよび70mgのDSPE−FITCを単離した。生成物構造をNMR、TLCにより確認した。
10gr PEG200または20gr PEG400(0.05mole)に、不活性条件下、150mlの乾燥THFを加え、溶液を氷浴で0℃に冷却した。15分後、水素化ナトリウム1.8grを、各反応物について各約0.6grずつ3回で加えた。反応物をさらに30分間、環境温度で撹拌し、その後プロパルギルブロマイドを加えた(各反応物に2.8ml)。次いで、反応物を、一夜撹拌した。全例で、TLC(5%MeOH:95%酢酸エチル)によると生成物が得られた。4mlのHCl 32%を加えて反応を中和させ、続いて蒸発乾固した。次いで、微量のプロパルギルブロマイドをヘキサン洗浄により除去した。シリカゲルフラッシュカラムで生成物を精製した。生成物を、酢酸エチル〜90%酢酸エチル:10%MeOHで溶出した。合わせたフラクションを蒸発乾固し、MS分析に付した。最良の生成物フラクションを次工程にそのまま使用した。PEG200−プロパルギルの場合、フラクションは1.2grであり、PEG400−プロパルギルの場合、フラクションは2.7grであった。
各反応物に10mlのTHFおよび2mlのトリエチルアミンと共に0.5grのPEG200−プロパルギルおよび1.0grのPEG400−プロパルギルを加えた。両反応物を15分間撹拌し、その後0.4grのトシルクロライドを各反応物に加えた。TLC(20%メタノール:80%クロロホルム)によると、一夜撹拌後、反応は完了した。両反応物に、2mlのトリエチルアミン、0.5grのDSPEおよび5mlのクロロホルムを加え、反応物を、TLCで観察して完了するまで、40℃で一夜撹拌した。両反応物を濾過して不溶性粒子を除去し、蒸発乾固した。シリカゲルフラッシュカラムで生成物を精製した。反応混合物を各5ml クロロホルムに溶解し、カラムに載せ、20%MeOH:80%クロロホルムまでの勾配により溶出した。DSPE−PEG200−プロパルギルおよびDSPE−PEG400−プロパルギルを蒸発させて、NMRで同定して、約400mgの各生成物を得た。
200mgの脂質(DSPEまたはDOPE)に、10mlのクロロホルムを加え、続いて1.50grの粗製NHS−PEG2000−アジドおよび2.0mlのトリエチルアミンを加えた。反応物を一夜撹拌し、TLCによると反応は完了した(TLC移動相:10%メタノール、90%クロロホルム;染色PMA)。400mgの2−アジドエチルアミンを加え、両反応物をさらに4時間撹拌した。次いで、反応物をロータリーエバポレーターで蒸発させて、トリエチルアミンおよび微量の2−アジドエチルアミンを除去した。粗製反応物を20mlの溶液(5%MeOH:95%クロロホルム)で希釈し、シリカカラムで精製した。生成物を8%メタノール:92%ジクロロメタンで溶出した。TLCで純度≧90%の生成物フラクションを合わせ、蒸発乾固した。純粋化合物を得るために、結晶化を行った。両生成物を最小量のジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテルを加え、生成物は溶存しながら、不純物を沈殿させた。次いで、生成物溶液を濾過し、生成物脂質の沈殿が観察されるまで、さらにジエチルエーテルを加えた。合計280mgの純粋DOPE−PEG2000−アジドおよび75mgの純粋DSPE−PEG2000−アジドが結晶化後に得られた。生成物の構造をNMRで確認した。
200mgの脂質(DPPE、DMPEまたはDSPE)に、10mlのクロロホルムを加え、続いて2.5mlのトリエチルアミンを加えた。各反応物を15分間、環境温度で撹拌し、その後100mgの6−ヘプチン酸NHSエステルを加えた。反応物を2時間、RTで撹拌し、ロータリーエバポレーターにより最小量まで濃縮した。次いで、反応残渣を150mlの酢酸エチル、ジエチルエーテル溶液(100ml酢酸エチル、50ml ジエチルエーテル)に溶解した。反応の変換レベルを試験するためにTLC(TLC移動相:20%メタノール、80%クロロホルム;染色PMA)を行った。全例で反応は完了していた(脂質は反応後残存しなかった)。反応溶液を、50mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液と共に15分間撹拌し、次いで水層を除去し、有機層を50ml塩化ナトリウム溶液で洗浄した。水層廃棄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。226mgのDPPE−6ヘプチン(収率98%)、200mgのDPPE−6ヘプチン(収率98%)および150mgのDSPE−6ヘプチン(収率70%)の固体生成物が得られた。すべての生成物は、NMRおよびTLCにより同定された。
方法を、文献法(molecules 2013, 18, 7346-7363)を少し変更して実施した。400mgのBCN−OH(2.66mmol)に、10mlのアセトニトリルを加え、続いて1.5ml トリエチルアミンを加えた。反応溶液に1.70grのDSC(6.64mmol)を加え、不活性条件下反応物を撹拌した。反応溶液を、環境温度で一夜撹拌し、その後TLC(TLC移動相:50%酢酸エチル、50%ヘキサン;染色PMA)で反応完了を観察した。反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させた。次いで、反応残渣を5mlのクロロホルムに溶解し、50mlのジエチルエーテルを加えた。反応混合物を15分間撹拌し、反応溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固しながら残渣をフラスコに残した。得られた固体−950mg(収率約95%)−TLCによると純度は90〜95%を超えており、この生成物を次の1以上の工程にそのまま使用した。
300mgのBCN−NHS(1.03mmol)に、10mlのアセトニトリルを加え、続いて1.0ml トリエチルアミンを加えた。反応溶液に先ず0.3mlのOH−PEG4−NH2を加え、反応物を半時間撹拌し、その後TLCで試験して、反応は完了していなかった。次いでさらに0.2mlのOH−PEG4−NH2を加え、計0.5mlのOH−PEG4−NH2(2.83mmol)を使用したことになり、TLC(TLC移動相:90%クロロホルム、10%メタノール;染色PMA)で反応完了が観察されるまで、半時間反応物を撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発乾固し、続いてシリカカラムで精製した。反応溶液を5%MeOH:95%ジクロロメタンで溶出した。純粋フラクションをロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた生成物−200mg(53%)−をTLCで試験した。TLCによると純度は約90%であり、この生成物を次の1以上の工程にそのまま使用した。
200mgのBCN−PEG4−OH(0.54mmol)に、5mlのアセトニトリルを加え、続いて1ml トリエチルアミンを加えた。反応溶液に400mgのDSC(1.56mmol)を加え、反応物を2時間、環境温度で、TLC(TLC移動相:10%メタノール、90%ジクロロメタン;染色PMA)で観察して反応完了まで撹拌した。次いで、反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させ、続いてシリカカラムで精製した。カラムをジクロロメタンで洗浄し、生成物を100%酢酸エチルで溶出した。純粋フラクションをロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた生成物−250mg(91%)−をTLCで試験し、TLCおよびNMRにより同定した。TLCおよびNMRによると、純度は95%を超え、この生成物を次工程にそのまま使用した。生成物を−20℃で保存した。
55grのpeg4(0.283mole)に、400mlの乾燥クロロホルムを加え、溶液を氷浴で0℃に冷却した。15分後、100mlのトリエチルアミンを加え、反応物をさらに15分間撹拌した。次いで、25grのトシルクロライド(0.132mole)を加え、反応物を、一夜、環境温度で撹拌した。一夜後、反応をTLC(100%酢酸エチル)で試験した。次いで、反応をロータリーエバポレーターにより蒸発させ、続いて残渣をヘキサン:エーテル(2:1)溶液で洗浄して、微量のトシルを除去した。次いで、残渣に酢酸エチルを加え、5%HCl水溶液、10%NH4Acおよび5%NaClで洗浄し、続いて有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルをロータリーエバポレーターにより蒸発させて、18.6grのHOpeg4OTs(収率41%)を得た。TLCによると純度は約90%であり、生成物を次の1以上の工程にそのまま使用した。生成物を4℃に保存した。
6.0grのHOPEG4OTs(17.2mmol)に、60mlのエタノールを加え、溶液を5分間撹拌した。次いで、6.0grのナトリウムアジド(92.3mmol)を加え、反応混合物を65℃に加熱し、TLC(TLC移動相:90%クロロホルム、10%メタノール;染色PMA)で観察して反応完了まで一夜撹拌した。次いで、混合物を濾過して、不溶性ナトリウムアジドを除去した。エタノール溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発させ、残渣をジエチルエーテルに溶解した。生成物を含有するエーテル層を濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗製生成物を得て、続いてフラッシュシリカカラムでさらに精製した。生成物を5%MeOH:95%クロロホルムで溶出した。純粋フラクション(TLCで≧90%)を合わせ、蒸発乾固して、0.50grのHOPeg4N3を得て、それを次の1以上の工程にそのまま使用した。
450mgのHOPeg4N3(2.05mmol)に、15mlのアセトニトリルを加え、続いて1ml トリエチルアミンを加えた。反応溶液に800mgのDSC(3.12mmol)を加え、反応物を、一夜、環境温度にてTLC(TLC移動相:10%メタノール、90%ジクロロメタン;染色PMA)で観察ながら、反応完了まで撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させ、続いて残渣をジクロロメタンに溶解した。ジクロロメタン層を3mlまで濃縮し、30mlの石油エーテルを加えた。反応混合物を15分間撹拌し、石油エーテル溶液を廃棄した。残渣をジクロロメタン:ジエチルエーテル(各10ml、1:1)に溶解した。得られた溶液を蒸発乾固して、370mgのNHSPeg4N3(収率50%)。TLCおよびNMRによると、純度は95%を超え、この生成物を次工程にそのまま使用した。生成物を−20℃で冷凍保存した。
インビトロ:
飽和(二重結合の存在)およびアシルテイル長により決定して、種々のTm(融解温度)値を有する種々の脂質を使用して、免疫標識リポソームプラットフォームを作成した。種々の比率の正荷電および双性イオン性脂質(例えばDAPE、ジアシルホスファチジルエタノールアミン)のこのような脂質組成物の組み合わせは、癌細胞との融合を顕著に改善した。このリポソーム標識プラットフォームを使用して、癌細胞をクリック化学などの結合対の一官能基で標識した(図2A)。この官能基を、数化学合成工程を使用してモノクローナル抗体(mAb)などの免疫活性化剤の付加に使用し(図2BおよびCに示す例)、リン脂質頭部基およびmAb両者へのクリック反応可能なリンカーの付加を可能とした。
リポソームを次の製剤で製造した。HSPC:コレステロール:6−Heptynoic−PE(DSPE/DPPE/DMPE) 60:35:5を製造し、安定であることが判明した。
全ての材料は、合成が記載されていなければ、市販されている。リポソームを次の製剤で製造した:HSPC:コレステロール:6−Heptynoic−PE(DSPE/DPPE/DMPE) 60:35:5を製造し、安定であることが判明した。
HSPC − 水素化大豆ホスファチジルコリン;
PE − ホスファチジルエタノールアミン
DSPE − ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
DPPE − 1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン
DMPE − 1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン
6−ヘプチン酸リンカーは、内層にのみ結合したmAbを有するリポソームの製造に使用した銅依存的アルキンのサンプルである。このリンカーを後に無銅アルキンリンカーと置き換えた。BCNまたはDBCOは、インビボ条件下でアジドと共有結合形成可能な銅非依存的アルキン基である。
これらのアルキン官能化リンカー担持リポソームを、ペプチド、抗体、フルオロフォア、ビオチンおよび糖類などの種々のアジド修飾分子の結合に使用し得る。我々は、フルオロフォア、カルセイン−アジド(社内産生)をアルキンリンカー含有リポソームと結合させた(図3A)。結合効率は17〜20%であった。これらの蛍光リポソームを使用して、細胞取り込みまたはリポソームとの融合について種々のリポソーム製剤の効果を試験した。疎水性テイルの長さおよびリポソーム製剤中のコレステロールのパーセンテージは、細胞によるリポソーム取り込みまたは融合に顕著な影響を有しなかった(図3B〜C)。
頭部基修飾は、標的細胞に対するリポソームの効果に影響した:頭部基の修飾により、我々は、エンドサイトーシスによるリポソーム取り込みに対するリポソーム標的細胞融合の有効性を微調整できる。
種々の脂質組成物を、図2Dに説明するとおり、癌細胞と融合する能力について、リポソームとして試験し、DOPE−FITCを有しないリポソームも使用した。我々は、脂質混合物の正味正電荷、アシルテイル飽和およびそれ故にTm(融解温度)を修飾した。我々は、癌細胞の膜に官能基(結合対の一方のメンバー)を付加する、調節可能癌標識リポソームを得た(図4)。
DSPE−PEG2000を安定化剤として使用し、インビボ条件下の循環半減期を改善するだけでなく、立体障害による癌−リポソーム融合の減少ももたらす。それ故に、我々は、広範なDSPE−PEG2000を、我々のリポソーム免疫標識製剤N8、コア製剤DOTAP:DOPC:DOPE:DOPE−FITC:DSPE−PEG2K 35:52.5:10:0.2:X(ここで、Xは5、2.5、1.25、0.625モル比である)で試験した。癌細胞の取り込みおよび融合に対するPEG2000の効果を決定するために、リポソームをDOPE−FITC(励起488nm、発光530nm)を使用して蛍光標識し、NHS−PEG4−N3を使用して産生後にリンカーPEG4−N3と結合した(図2D)。癌細胞をリポソームに0.5mM脂質で1時間、37℃で曝し、洗浄し、DBCO−Cy5(FL4)を使用して染色した。緑色蛍光チャネル(FL1)のシグナルは、癌細胞によるリポソーム取り込みの指標である。赤色蛍光チャネル(FL4)のシグナルは、この塗布リポソームと癌細胞の膜の融合の指標である。細胞を1.6%パラホルムアルデヒドのPBS溶液を使用して、15分間、室温で固定し、FACS分析まで4℃で維持した。図5Aは、FITCシグナル(リポソームの取り込みの指標)およびCy5シグナル(これらの細胞のアジド基にクリックされ、故に融合の指標)に対する陽性癌細胞の平均化パーセントを示す。さらに、図5Bにおいて、平均蛍光強度の平均が示され、癌細胞当たりのフルオロフォア数に比例する。纏めて、免疫標識製剤中のDSPE−PEG2000の増加した量は、融合および取り込み両方の阻害を示した。
フローサイトメトリーを使用して得られた上記結果を補完するために、我々は、種々の癌細胞における我々の蛍光標識リポソームの局在化を試験した。図6は、免疫標識リポソームの4T1mCherry細胞膜への空間的局在化を示し、これは、我々の脂質の膜局在化とよく相関する。我々は、図7に見られ得るとおり、肺癌細胞株(ヒトおよびマウス)および黒色腫細胞株(マウス)の他の癌細胞型を免疫標識する我々の能力を試験した。
我々は、腫瘍へのキラーT細胞活性化mAb送達のために、4つの異なるアプローチを使用した。我々が使用した最初のアプローチは、「2STEP」なる名称であり、図2Aに記載するリポソームを注射し、結合対の一方の官能基(例えばアジド基)で癌細胞を標識し、リポソーム注射3時間後、我々は、結合対の他方の官能基で標識したmAbを注射する。第二のアプローチ(図2E、I)は「IN」なる名称であり、内層を、結合対の他方の官能基と共有結合した1以上のmAbの結合に使用する。第三のアプローチ、「OUT」(図2E、II)は、結合対の他方の官能基と共有結合した1以上のmAbの結合にリポソームの外層を使用する。第四のアプローチ、「IN+OUT」(図2E、III)は、合対の他方の官能基と共有結合した1以上のmAbの結合に内層および外層両者を使用する。
図11Aに示すとおり、我々は、2STEP、INおよびIN+OUTアプローチ対2STEP対照(同じ2STEPリポソーム、非クリッカブル抗体と結合)を使用して、我々の免疫標識リポソームの有効性を試験した。個々のマウスのレーダーチャートを図11Bに示し、そこで、マウスあたりの腫瘍サイズ対時間を、各処置群グラフにおける単一シリーズとして示す。我々は、腫瘍担持動物における注射24時間後の我々のリポソーム製剤の生物学的分布をさらに試験した(図11C)。リポソーム標識体内分布プロファイルは、基準または「ゴールドスタンダード」として使用されるDOXIL製剤のものに類似する。
我々のリポソームで処置した腫瘍担持動物は、図12Aに見られ、2STEPおよびOUTアプローチについて図12Cで定量されるとおり、腫瘍へのT細胞動員が増加されるが、肝臓または腎臓へはされないことが示される。ここに示すデータは、エキソビボ選択性試験と合わせたとき、リポソームが腫瘍由来細胞との融合に選択的であり、健常臓器由来初代細胞とほとんど融合しないことを示す(図12B)。このデータは、体内分布試験と合わせたとき、肝臓組織スライドがT細胞浸潤の増加を示さないかを説明する。機構的に、リポソームは負荷電癌細胞と融合し、キラーT細胞を活性化し、これが走化性によりさらなるT細胞を癌部位に動員させる。肝臓におけるクッパー細胞などの貪食細胞による取り込みにより、融合はないが、リポソームは存在し、それ自体、癌組織に対するようにはキラーT細胞を活性化しない。
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Claims (76)
- 免疫系活性化剤で癌細胞を標識することにより癌を処置する方法であって、該方法は、癌患者に融合性リポソームを投与することを含み、ここで、
(i)該癌患者に(a)14〜24炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層;および(b)該第一官能基に結合できる該結合対の該相補的第二官能基を含む免疫系活性化剤を含む免疫系活性化融合性リポソームを投与するか;または
(ii)該癌患者に14〜24炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームを投与し;そして過程(ii)に続いて
(iii)該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を投与する
過程を含む、方法。 - 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項1に記載の方法。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項1に記載の方法。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項1に記載の方法。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤;炎症誘発性サイトカイン;記憶キラーT細胞活性化ペプチド;ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(sHLA);およびスーパー抗原から選択される、請求項1に記載の方法。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤である、請求項5に記載の方法。
- T細胞活性化剤が抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗NKG2D抗体またはこれらの組み合わせ、CD3およびCD8両者と結合できる抗体およびCD3およびNKG2D両者と結合できる抗体から選択される、請求項6に記載の方法。
- 該脂質分子の少なくとも一つがカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(DOTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(18:0 DDAB)およびN1−[2−((1S)−1−[(3−アミノプロピル)アミノ]−4−[ジ(3−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−3,4−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(MVL5)から選択される、請求項8に記載の方法。
- カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがDOTAPである、請求項9に記載の方法。
- 該合成ポリマーがポリエチレンイミン(PEI)およびポリ(2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択される、請求項8に記載の方法。
- 該天然ポリマーがキトサンである、請求項8に記載の方法。
- 該アミノ糖がグルコサミンである、請求項8に記載の方法。
- 該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(L−リシン)、ポリ(L−アルギニン)、ポリ(D−リシン)、ポリ(D−アルギニン)、ポリ(L−オルニチン)およびポリ(D−オルニチン)から選択される、請求項8に記載の方法。
- 該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンA;セクロピンA1〜8;および環状CNGRCから選択される、請求項8に記載の方法。
- 該脂質分子の少なくとも一つがホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が1個または2個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24炭素長の炭素鎖を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- 該リン脂質が1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC)および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルコリン(DMPC);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC);1,2−ジミリストレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジミリステライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジパルミトレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジパルミテライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジペトロセレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ6−Cis)PC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルコリン(18:1(Δ9−Cis)PC(DOPC));1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:2(Cis)PC(DLPC));1,2−ジリノレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:3(Cis)PC);1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:1(Cis)PC);1,2−ジアラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:4(Cis)PC);1,2−ジドコサヘキサエノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:6(Cis)PC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:1(Cis)PC);1,2−ジネルボノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(24:1(Cis)PC);1,2−ジミリストイル−3−−3−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE);ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルセリン(DMPS);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルセリン(DPPS);パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE);および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルセリン(DOPS)からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 該リン脂質がDOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPEおよびDPPEから選択される、請求項17に記載の方法。
- 該脂質分子の少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 該安定化部分がポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(PVP)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択される、請求項19に記載の方法。
- 安定化部分が約106Da〜約4kDaの分子量のPEGである、請求項20に記載の方法。
- PEGが約2kDaの分子量である、請求項21に記載の方法。
- 該安定化部分が切断可能ペプチドリンカーを経て該脂質分子の少なくとも一つに結合される、請求項19に記載の方法。
- 特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる、請求項1に記載の方法。
- 特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる、請求項24に記載の方法。
- i)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり;ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり;iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり;iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり;v)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり;vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり;またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびN−ヒドロスクシンイミド(NHS),であり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり;viii)官能基である、請求項24に記載の方法。
- 特定の結合対がアルキン−アジドである、請求項26に記載の方法。
- 特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成できる、請求項1に記載の方法。
- 特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆である、請求項28に記載の方法。
- 該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択される、請求項29に記載の方法。
- 該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号11)、CSWRPPFRAVC(配列番号12)、CSWAPPFKASC(配列番号13)およびCNWTPPFKTRC(配列番号14)から選択される、請求項29に記載の方法。
- 融合性リポソームが脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 免疫系活性化剤が免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第一または第二スペーサーがPEG、(C6−C12)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸および約2〜20アミノ酸残基長、例えば3アミノ酸残基長のポリ−Glyペプチドなどのペプチドからなる群から選択される、請求項32または33に記載の方法。
- 第一または第二スペーサーが約106Da〜約4kDaの分子量のPEGである、請求項34に記載の方法。
- PEGが約194Daの分子量(PEG4)のものである、請求項35に記載の方法。
- 第一または第二スペーサーが(C6−C12)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項34に記載の方法。
- 融合性リポソームがコレステロール(CHO)またはその誘導体をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- リポソームが最大200nm、例えば約15nm〜約200nm、約20nm〜約100nm、約50nm〜約150nm、約50nm〜約90nm、約80nm〜約100nm、約110nm〜約200nm、例えば約100nmのサイズを有する、請求項1に記載の方法。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソーム外層、内側または外側および内側両者で該第二官能基を経て該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合し;免疫系活性化剤がT細胞活性化剤;炎症誘発性サイトカイン;記憶キラーT細胞活性化ペプチド;ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(sHLA);およびスーパー抗原から選択され;該脂質の少なくとも一部がカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドを含み;該脂質の少なくとも一部がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が1個または2個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24炭素の炭素鎖長を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせであり;該リポソームが該脂質または該カチオン性ポリマーの少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含み;特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できるまたは特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成でき;第一または第二スペーサーがPEG、(C6−C12)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、約2〜20アミノ酸残基長、例えば3アミノ酸残基長のポリ−Glyペプチドなどのペプチドからなる群から選択され;そしてリポソームが最大200nm、例えば約15nm〜約200nm、約20nm〜約100nm、約50nm〜約150nm、約50nm〜約90nm、約80nm〜約100nm、約110nm〜約200nm、例えば約100nmのサイズを有する、請求項1に記載の方法。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤であり;カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(DOTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(18:0 DDAB)およびN1−[2−((1S)−1−[(3−アミノプロピル)アミノ]−4−[ジ(3−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−3,4−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(MVL5)から選択され、該合成ポリマーがポリエチレンイミン(PEI)およびポリ(2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され、該天然ポリマーがキトサンであり、該アミノ糖がグルコサミンであり、該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(L−リシン)、ポリ(L−アルギニン)、ポリ(D−リシン)、ポリ(D−アルギニン)、ポリ(L−オルニチン)およびポリ(D−オルニチン)から選択されまたは該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンA;セクロピンA1〜8;および環状CNGRCから選択され;該脂質分子の少なくとも一つが1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC)および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルコリン(DMPC);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC);1,2−ジミリストレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジミリステライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジパルミトレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジパルミテライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジペトロセレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ6−Cis)PC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルコリン(18:1(Δ9−Cis)PC(DOPC));1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:2(Cis)PC(DLPC));1,2−ジリノレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:3(Cis)PC);1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:1(Cis)PC);1,2−ジアラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:4(Cis)PC);1,2−ジドコサヘキサエノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:6(Cis)PC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:1(Cis)PC);1,2−ジネルボノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(24:1(Cis)PC);1,2−ジミリストイル−3−−3−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE);ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルセリン(DMPS);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルセリン(DPPS);パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE);および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルセリン(DOPS)からなる群から選択され;該安定化部分がポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(PVP)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択され;特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成でき、i)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり;ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり;iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり;iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり;v)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり;vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり;またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒド、ケトン、イソチオシアネートまたはカルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびN−ヒドロスクシンイミド(NHS)であり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり;viii)または特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆であり;および第一または第二スペーサーが約106Da〜約4kDaの分子量のPEGまたは(C6−C12)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項40に記載の方法。
- T細胞活性化剤が抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗NKG2D抗体またはこれらの組み合わせ、CD3およびCD8両者と結合できる抗体およびCD3およびNKG2D両者と結合できる抗体から選択され;カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがDOTAPであり;該リン脂質がDOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPEおよびDPPEから選択され;安定化部分が約106Da〜約4kDaの分子量のPEGであり;特定の結合対がアルキン−アジドであり、該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択されまたは該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号11)、CSWRPPFRAVC(配列番号12)、CSWAPPFKASC(配列番号13)およびCNWTPPFKTRC(配列番号14)から選択され;そして第一または第二スペーサーが約194Da(PEG4)の分子量のPEGである、請求項41に記載の方法。
- 安定化部分が約2kDaの分子量のPEGである、請求項42に記載の方法。
- 融合性リポソームが:
a. DOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3またはDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−BCN;または
b. DMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−N3またはDMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−BCN、
を含み、ここで、PEG2Kが約2kDaの分子量を有するPEGを表し、そしてPEG4が約194Daの分子量を有するPEGを表し、そしてDOPCの相対的モル量が最大約80%であり、DOTAPの相対的モル量が最大約80%であり、DSPE−PEG2Kの相対的モル量が最大約20%であり、DOPE−PEG4の相対的モル量が最大約20%であり、HSPCの相対的モル量が最大約65%であり、コレステロールの相対的モル量が最大約40%であり、そしてDMPCの相対的モル量が最大約70%であり、そして融合性リポソームが約50nmまたは300nmのサイズを有する、請求項43に記載の方法。 - 融合性リポソームが
(i)モル比52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5または52.5:35:2.5:7でDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3またはDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−BCN;または
(ii)モル比60:35:5でDMPC:Chol:DMPE−PEG4−N3またはDMPC:Chol:DMPE−PEG4−BCN
を含む、請求項44に記載の方法。 - 融合性リポソームがモル比52.5:35:2.5:5でDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3を含む、請求項45に記載の方法。
- 該T細胞活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項44〜46の何れかに記載の方法。
- 該T細胞活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項44〜46の何れかに記載の方法。
- 該T細胞活性化剤が融合性リポソームの内層および外層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項44〜46の何れかに記載の方法。
- リポソームの融解温度(Tm)が45℃未満であり、そこで融合性リポソームが非結晶転移相を維持し、それにより、リポソームの細胞膜との融合に必要な膜流動性を提供する、請求項1〜49の何れかに記載の方法。
- 癌がトリプルネガティブ乳癌などの乳癌、黒色腫および肺癌からなる群から選択される、請求項1〜50の何れかに記載の方法。
- 少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる、14〜24炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソーム。
- 融合性リポソームが脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む、請求項52に記載の融合性リポソーム。
- 該第一官能基に結合した相補的該結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤をさらに含む、請求項52に記載の融合性リポソーム。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項54に記載の融合性リポソーム。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項54に記載の融合性リポソーム。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項54に記載の融合性リポソーム。
- 免疫系活性化剤が免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む、請求項54に記載の融合性リポソーム。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤;炎症誘発性サイトカイン;記憶キラーT細胞活性化ペプチド;ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(sHLA);およびスーパー抗原から選択される、請求項52〜58の何れかに記載の融合性リポソーム。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤である、請求項59に記載の融合性リポソーム。
- T細胞活性化剤が抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗NKG2D抗体またはこれらの組み合わせ、CD3およびCD8両者と結合できる抗体およびCD3およびNKG2D両者と結合できる抗体から選択される、請求項60に記載の融合性リポソーム。
- 該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層、内側または外側および内側両者で該第二官能基を経て該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合され;免疫系活性化剤がT細胞活性化剤;炎症誘発性サイトカイン;記憶キラーT細胞活性化ペプチド;およびスーパー抗原から選択され;該脂質の少なくとも一部がカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドをさらに含み;該脂質の少なくとも一部がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が1個または2個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24炭素の炭素鎖長を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせであり;該リポソームが該脂質または該カチオン性ポリマーの少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含み;特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できるまたは特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成でき;第一または第二スペーサーがPEG、(C6−C12)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、約2〜20アミノ酸残基長、例えば3アミノ酸残基長のポリ−Glyペプチドなどのペプチドからなる群から選択され;そしてリポソームが最大200nm、例えば約15nm〜約200nm、約20nm〜約100nm、約50nm〜約150nm、約50nm〜約90nm、約80nm〜約100nm、約110nm〜約200nm、例えば約100nmのサイズを有する、請求項54に記載の融合性リポソーム。
- 免疫系活性化剤がT細胞活性化剤であり;カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(DOTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(18:0 DDAB)およびN1−[2−((1S)−1−[(3−アミノプロピル)アミノ]−4−[ジ(3−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−3,4−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(MVL5)から選択され、該合成ポリマーがポリエチレンイミン(PEI)およびポリ(2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され、該天然ポリマーがキトサンであり、該アミノ糖がグルコサミンであり、該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(L−リシン)、ポリ(L−アルギニン)、ポリ(D−リシン)、ポリ(D−アルギニン)、ポリ(L−オルニチン)およびポリ(D−オルニチン)から選択されまたは該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンA;セクロピンA1〜8;および環状CNGRCから選択され;該脂質分子の少なくとも一つが1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC)および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルコリン(DMPC);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC);1,2−ジミリストレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジミリステライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(14:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジパルミトレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Cis)PC);1,2−ジパルミテライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジペトロセレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ6−Cis)PC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルコリン(18:1(Δ9−Cis)PC(DOPC));1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:1(Δ9−Trans)PC);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:2(Cis)PC(DLPC));1,2−ジリノレノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(18:3(Cis)PC);1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:1(Cis)PC);1,2−ジアラキドノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:4(Cis)PC);1,2−ジドコサヘキサエノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:6(Cis)PC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(22:1(Cis)PC);1,2−ジネルボノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(24:1(Cis)PC);1,2−ジミリストイル−3−−3−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE);ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC);1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE);1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE);1,2−ジミリストイル−3−ホスファチジルセリン(DMPS);1,2−ジパルミトイル−3−ホスファチジルセリン(DPPS);パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE);および1,2−ジオレイル−3−ホスファチジルセリン(DOPS)からなる群から選択され;該安定化部分がポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(PVP)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択され;特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成でき、i)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり;ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり;iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり;iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり;v)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり;vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり;またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドであり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり;viii)官能基または特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆であり;そして第一または第二スペーサーが約106Da〜約4kDaの分子量のPEGまたは(C6−C12)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項62に記載の融合性リポソーム。
- T細胞活性化剤が抗CD3抗体、抗CD8抗体、抗NKG2D抗体またはこれらの組み合わせ、CD3およびCD8両者と結合できる抗体およびCD3およびNKG2D両者と結合できる抗体から選択され;カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがDOTAPであり;該リン脂質がDOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPEおよびDPPEから選択され;安定化部分が約106Da〜約4kDaの分子量のPEGであり;特定の結合対がアルキン−アジドであり、該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択されまたは該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号11)、CSWRPPFRAVC(配列番号12)、CSWAPPFKASC(配列番号13)およびCNWTPPFKTRC(配列番号14)から選択され;そして第一または第二スペーサーが約194Da(PEG4)の分子量のPEGである、請求項63に記載の融合性リポソーム。
- 安定化部分が約2kDaの分子量のPEGである、請求項64に記載の融合性リポソーム。
- 融合性リポソームが
a. DOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3またはDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−BCN;または
b. DMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−N3またはDMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−BCN、
を含み、ここで、PEG2Kが約2kDaの分子量を有するPEGを表し、そしてPEG4が約194Daの分子量を有するPEGを表し、そしてDOPCの相対的モル量が最大約80%であり、DOTAPの相対的モル量が最大約80%であり、DSPE−PEG2Kの相対的モル量が最大約20%であり、DOPE−PEG4の相対的モル量が最大約20%であり、HSPCの相対的モル量が最大約65%であり、コレステロールの相対的モル量が最大約40%であり、そしてDMPCの相対的モル量が最大約70%であり、そして融合性リポソームが約80nmまたは100nmのサイズを有する、請求項65に記載の方法。 - 融合性リポソームが
(i)モル比52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5または52.5:35:2.5:7でDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3またはDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−BCN;または
(ii)モル比60:35:5でDMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−N3またはDMPC:コレステロール:DMPE−PEG4−BCN
を含む、請求項66に記載の方法。 - 融合性リポソームがモル比52.5:35:2.5:5でDOPC:DOTAP:DSPE−PEG2K:DOPE−PEG4−N3を含む、請求項67に記載の融合性リポソーム。
- 請求項1〜68の何れかに定義された融合性リポソーム。
- 外層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法であって、請求項52に記載の融合性リポソームと、結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤の反応を含み、ここで、該第二官能基は該第一官能基に結合し、それにより外層で結合した該T細胞活性化剤を有する該融合性リポソームを産生する、方法。
- 内層および外層両者に結合した免疫系活性化剤を有する融合性リポソームを製造する方法であって:
(i)複数の請求項52に記載の脂質分子と、結合対の第二官能基で官能化されたT細胞活性化剤を反応させ、ここで、該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、T細胞活性化剤に結合した脂質分子を産生し;そして
(ii)工程(i)で得られた該脂質分子から該融合性リポソームを調製し、
それにより、内層および外層両者で結合した該T細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する
工程を含む、方法。 - 内層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法であって、
(i)請求項52に記載の脂質分子および該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を含むリポソームを溶液中で調製し、それにより、該T細胞活性化剤の一部を封入し;
(ii)溶液から非封入T細胞活性化剤を除去し;
(iii)工程(i)で調製したリポソームの水性内部で脂質分子と封入T細胞活性化剤を反応させここで、該T細胞活性化剤の該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、内層で結合した該T細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する
工程を含む、方法。 - 該溶液が少なくとも一つの酸化−還元触媒をさらに含む、請求項72に記載の方法。
- 該少なくとも一つの酸化−還元触媒が銅(I)塩であり、これが非封入T細胞活性化剤に加えて工程(ii)で除去され、工程(iii)の反応が銅依存的クリック化学反応である、請求項73に記載の方法。
- 融合性リポソームが最大200nm、例えば約15nm〜約200nm、約20nm〜約100nm、約50nm〜約150nm、約50nm〜約90nm、約80nm〜約100nm、約110nm〜約200nm、例えば約100nmのサイズを有する、請求項70〜74の何れかに記載の方法。
- a. 請求項52に記載の融合性リポソームを含む第一容器;
b. 該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されたT細胞活性化剤を含む第二容器;および
c. 患者に(a)の融合性リポソームおよび続いて(b)のT細胞活性化剤を投与することを含む、癌を処置する方法についての指示を含むパンフレット
を含む、キット。
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