JP2003507348A - 標的設定人工遺伝子送達 - Google Patents

標的設定人工遺伝子送達

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JP2003507348A JP2001516578A JP2001516578A JP2003507348A JP 2003507348 A JP2003507348 A JP 2003507348A JP 2001516578 A JP2001516578 A JP 2001516578A JP 2001516578 A JP2001516578 A JP 2001516578A JP 2003507348 A JP2003507348 A JP 2003507348A
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ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア
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Abstract

(57)【要約】 遺伝子治療に対する新規で改良された組成物と方法が提供される。とりわけ標的設定人工遺伝子送達（ＴＡＧＤ）ベクターが提供され、それは遺伝子送達のための組換えウイルス粒子（ヌクレオカプシド）または組換えコアを取り囲む多機能人工表面成分より成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
１．発明の属する技術分野 本発明は標的細胞への細胞特異的遺伝子送達のための改良されたベクターを提
供する。本発明に基づくベクターは送達される遺伝物質を含む組換えコアと、コ
アを包含する人工的に再構築された表面より成る。この表面はベクターの標的設
定と細胞融合を促進し、またベクターに免疫防御機能を提供する。ベクターを調
製する方法およびベクターを用いる真核細胞を形質移入する方法も同じく開示さ
れる。
【０００２】 ２．背景技術の説明 遺伝子治療は、希有な相続遺伝子欠損から癌、エイズ、高血圧、アテロームお
よび糖尿病などの一般の疾病までに及ぶ多くのヒトの疾病に有効な処置を提供す
るその潜在能力に対して多大の関心を引きつけた。遺伝子治療の大きな可能性は
、これまでの所、遺伝子構築物を生体内および生体外で細胞に送達するための有
効なベクターシステムの欠除によりこれまで妨げられてきた。
【０００３】 従来の薬剤での標的送達については、遺伝子治療の目標の一つは、遺伝子送達
の局所治療効果を最大にし、一方全身の逆事象の可能性を最少にすることである
。この目標を達成するために、理想的な遺伝子送達ベクターはいくつかの属性を
持たねば成らない。まず第１にベクターは生体内で標的部位に到達できるのもで
なければならず、望ましくは特異的な細胞型を認識できねばならない。これはベ
クターが特性を標的設定するのと同じく低い免疫原性を持つことを必要とする。
第２に、ベクターは、その治療遺伝物質を細胞内部に送達するために宿主細胞の
膜障壁を交差することができなければならない。現在のベクターシステムの能力
は、大抵の場合は大き過ぎて望ましい遺伝子構築物の送達に順応することができ
ない。第３に、細胞内で一度ベクターは有効な遺伝子発現を行えるようにその遺
伝荷重を降ろすことができなければならない。その発現は望ましくは細胞特異的
であり、全体として無害である。殆どの適用でベクターはそれ自身のＤＮＡを自
動的に複製する能力を欠いていなければならない。第４に、必要であればベクタ
ーは延長された時間にわたり制御され持続する遺伝子発現を提供しなければなら
ない。第５として、ベクターは商業的規模で製造が容易にできねばならず、また
薬理的に送達できる濃縮形態で利用できねばならない。
【０００４】 遺伝子治療で現在利用できる送達システムは、これらすべての属性に関して満
足なものは何もない。従って遺伝子治療の進歩は、新しく改良された遺伝子ベク
ターシステムの発展に重く依存している。
【０００５】 現在生体内治療用遺伝子でもっとも普通に使用されている方法は、ウイルス送
達システムと陽イオンポリマーシステムまたは脂質ベイストシステムである。ウ
イルスベイストシステムでは、ウイルスの天然細胞浸透能力が治療用遺伝子を送
達するように操作された遺伝子修飾ウイルスで保持される。ポリマーまたは脂質
ベイストシステムでは、治療用ＤＮＡが１個またはそれ以上の陽イオンポリマー
およびまたは陽イオン脂質で濃縮され、細胞送達が負に電荷された細胞と正に電
荷された遺伝子送達粒子の間の吸引を利用する。現在の適用方法の殆どでは、特
異的細胞型の標的設定は達成されてはいない。
【０００６】 クラスとしてのウイルスベクターはいくつかの著しい欠点、例えば宿主免疫系
から有効に逃れられないこと、感染できる細胞の型での制約、高力価のベクター
を産生することの困難性、大型ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージする能力で
の制約、および宿主ゲノムへの組込みなどに苦労しており、この組込みは安定し
た発現には有利であるが、それでも限定された低いものではあるけれども機能的
ゲノム部位への望ましくない挿入の機会を産生する。ポリマーまたは脂質などの
作用薬への被包された核酸を用いる遺伝子導入は広い範囲での試験管内宿主細胞
を形質移入する能力をもつが、それはまた免疫系を逃れることのできないという
こと、細胞特異性の欠失、侵入メカニズムの欠除による細胞侵入の低能率、また
細胞内で一度ベクターのアンパッケージングが行われるとその低能率などの生体
送達での問題に悩むことになる。
【０００７】 ウイルスおよび非ウイルスエレメントの組合せを、細胞への遺伝子導入の効率
を高めるために使用することができる。例えばファスベンダー他（ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７２巻：６４７９−６４８９ページ（
１９９７年））は、被包ＤＮＡの送達効率を高めるためにアデノウイルスリボソ
ーム分解回避機能の人工パッケージＤＮＡ処方への取り込みを記載した。ウイル
ス及び非ウイルスエレメントの組合せのも一つの例は、陽イオンリポソームを複
合化されたアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を
含むプラスミドを使用し、ここで遺伝子導入と続くインターロイキン−２遺伝子
発現は、ＩＴＲｓの欠除で得られた水準よりも３−１０倍高かった。フィーヴェ
ーク他、キャンサー・リサーチ、５５巻２３６６−２３７２ページ（１９９５年
）を参照されたい。も一つの例においては、アデノウイルスカプシドタンパク質
またはアデノウイルス線維タンパク質がリボソームと組合わされ、レポーター遺
伝子の増加した遺伝子導入効率を提供する。ホン他、チャイニーズ・メディカル
・ジャーナル、１０８巻、３３２−３３７ページ（１９９５）。
【０００８】 最近のこれらの発展にも拘らず、低い免疫原性、増大したベクターの安定性、
十分な標的設定の多様性、および増加した遺伝子発現効率を同時に提供すること
を満足させる標的設定遺伝子送達のための現在利用可能な方法は一つもない。従
って、本発明の目標は、従来の技術におけるこれらの困難に打ち勝ち、標的設定
遺伝子送達および発現のための多様なベクターを提供することにある。
【０００９】
【発明の概要】
従って本発明の目的は、核酸の標的細胞への細胞特異的送達のための改良され
た非天然発生遺伝子治療ベクターを提供することできる。
【００１０】 更に、本発明の目的は、患者にこのようなベクターの治療に有効量を投与する
ことにより、患者の疾病を処置する方法を提供することである。
【００１１】 これらおよび他の目的を達成するために、本発明の一つの見地に従って、組換
えおよび非天然発生機能表面成分より成る非天然発生遺伝子治療ベクターが提供
され、ここで前記コアは核酸分子より成り、またベクターの少なくとも１個の発
現産物は治療用核酸、ペプチドまたはタンパク質であり、ここで機能表面成分は
免疫防御エレメント、標的設定エレメント、および細胞侵入エレメントより成る
グループから選択された少なくとも１個の機能エレメントを含み、またここでベ
クターはコアを標的細胞に特異的に結合し、またコアを細胞に送達できるもので
ある。
【００１２】 本発明の一実施例に従って、コアは更に少なくとも１個のウイルスカプシドタ
ンパク質を含む。も一つの実施例では、機能表面成分は免疫防御エレメントを含
む。更にも一つの実施例では、機能表面成分は標的設定エレメントを含む。更に
またも一つの実施例では、機能表面成分は、細胞侵入エレメントを含む。更なる
実施例では、機能表面成分は免疫防御エレメント、標的設定エレメント、および
細胞侵入エレメントを含む。
【００１３】 本発明の一つの見地に従って、免疫防御エレメントは合成ポリマー成分である
。この合成ポリマー成分はポリ（エチレングリコール）を含む。合成ポリマー成
分は更にグルタミン酸とロイシンのコポリマーを含む。
【００１４】 本発明のも一つの見地に従って、標的設定成分は、正常細胞よりも疾病細胞で
より高度に発現されるレポーターと結合する。標的設定成分は、ペプチドまたは
細胞表面レセプターのペプチド擬態リガンドである。
【００１５】 本発明の更にも一つの見地において、細胞侵入エレメントは膜不安定化成分で
ある。膜不安定化成分は両親媒性αらせんを含む。両親媒性αらせんはウイルス
ｅｎｖタンパク質のＣ末端ドメインから誘導される。特定の実施例において、Ｃ
末端ドメインはモロニー白血病タンパク質ｅｎｖタンパク質のＣ末端ドメインで
ある。このＣ末端ドメインはモロニー白血病ウイルスｅｎｖタンパク質のアミノ
酸５９８−６１６を含む。も一つの実施例では、膜不安定化成分はグルタミン酸
とロイシンのコポリマーを含む。
【００１６】 本発明の他の目的、特性および利点は以下で述べる詳細な説明から明らかとな
るであろう。しかし詳細な説明および特異的な実施例は一方で本発明の望ましい
実施例を示しているが単に説明のみにより与えられており、何故ならば本発明の
性質と範囲内で各種の変化と修飾がこの詳細な説明から発明の属する技術の分野
で通常の知識を有するものにとって明らかとなるであろう、ということは理解さ
れねばならない。
【００１７】
【望ましい実施例の詳細な説明】
本発明は遺伝子治療のための新規に改良された組成物と方法を提供する。とり
わけ標的人工遺伝子送達（「ＴＡＧＤ」）ベクターが提供され、これは組換えウ
イルス粒子（ヌクレオカプシド）または組換えコアを取り巻く多機能人工表面成
分より成る。
【００１８】 機能表面は分子状エレメントを含み、これはベクターに宿主の免疫系を回避し
、特異的標的細胞を認識してそれと結合し、また標的細胞と効果的に結合しコア
遺伝子によりコード化された導入遺伝子を標的に送達することを可能にする。表
面分子エレメントは例えば多重ペプチドおよび免疫防御エレメントを含むことが
できる。本発明は更に新規な組成物と方法を使用して遺伝子疾病を処置するため
の方法を提供する。
【００１９】 一つの実施例においては、本発明は組換えウイルスの現存する脂質被包成分が
ウイルス粒子の望ましい特性を高めまた提供するベクターを提供する。例えば、
ウイルス表面は免疫防御エレメント、例えばポリ（エチレングリコール）などの
ポリマーグループを加えるように操作することができ、これはウイルス粒子の免
疫原性を減少し、更に血液循環でのベクターの安定性を増加させる。このウイル
ス表面は更にウイルスの細胞特異性を高める標的設定リガンドの追加により修飾
することができる。例えば以下により詳細に記載する方法を用いて、この表面は
標的細胞の表面で好みのレセプターと特異的に相互作用することのできるリガン
ド分子を含むように遺伝子操作することができる。
【００２０】 も一つの実施例では、この表面はベクターの細胞侵入性を高めるエレメントを
含むように修飾される。とりわけ融合誘導ペプチド、タンパク質またはポリマー
が標的細胞へのベクターの侵入を高めるために使用される。融合誘導成分はウイ
ルスコアの細胞質への侵入を促進し標的細胞の細胞膜へのベクターの融合を促進
する。融合誘導成分はウイルス融合誘導ペプチドなどのような天然発生融合誘導
因子であり、あるいは膜不安定性を提供する膜活性両親媒性αらせんまたは他の
配座特性を含むペプチドなどのような遺伝子操作（非天然発生）成分であること
もある。選択肢として、融合誘導成分は膜不安定性を提供するポリマーであるこ
ともできる。
【００２１】 これら実施例のそれぞれにおいて、遺伝子送達粒子の現存する表面に対する修
飾は、非共有結合で作られており、ここでは機能成分を含むように化学接合で修
飾された脂質は粒子を含むコアの表面に取り込まれている。この取り込みは、例
えば望ましい修飾成分を含むミセル形式により行われ、ここでミセルは従来公知
の方法を用いて粒子の表面に自発的に融合される。非共有結合修飾は更に静電相
互作用およびまたは疎水性（ファンデルワールス）相互作用による粒子表面への
機能成分の吸着により行うことができる。
【００２２】 選択肢として、修飾は遺伝子送達粒子の表面成分の共有結合修飾により行うこ
とができる。かくして例えば、被包ウイルスの場合では、ウイルス表面の膜脂質
は続く修飾グループの共有付着ができるように化学的活性化リンカーに連結する
ことができる。膜糖タンパク質上の炭水化物グループは反応性アルデヒド基を生
産する従来の技術で公知の方法を用いて化学的酸化することができ、それは例え
ば遊離アミノ基を含むポリマー物質またはペプチドでの共有結合修飾を可能にす
る。膜構成物質の共有結合修飾についての他の方法は十分に従来の技術で公知で
ある。
【００２３】 も一つの実施例では、現存するウイルス表面は活性化結合物での反応により脂
質およびまたはタンパク質化合物で化学的に修飾され得る。活性化リンカー化合
物は、必ずしもそれに限定されないが、高度に反応性の化学基の取り込み、例え
ばハロゲン化スルホニルおよびまたはアミノ基修飾のためのカルボン酸の各種活
性エステル、炭水化物修飾のためのヒドラジド，チオール基修飾のためのマレイ
ミドイルまたは反応性アルキルハロゲン化合物、および従来の技術で既知の光活
性化基を含む。当業者は他の化学活性化基の使用も本発明の範囲内にあることを
知るであろう。
【００２４】 も一つの選択肢として、遺伝子送達粒子の表面にある官能基が反応性およびま
たは化学的に選択できる基を生産するための従来公知の技術を使用して化学的に
修飾でき、これは例えば遊離アミノ基を含むポリマー物質またはペプチドでの共
有結合修飾を可能にする。一つの特異的な実施例は２−イミノチオレイン（トラ
ウト試薬）でのウイルス表面の修飾であり、これはウイルス表面のアクセス可能
なアミノ基をスルフヒドリル基（メルカプト基）に転換する。これは接合のチオ
ール選択的方法を使用することで修飾の選択性を高めることを可能にする。トラ
ウト試薬でのウイルス表面の修飾は更に各種ウイルスの化学的修飾の最適効率水
準を推定する非常に便利な手段を提供する。もし化学的修飾があまりにも低けれ
ば、ウイルス表面の性質は望まれるように変化せず、一方あまりにも高い修飾の
水準はウイルスを不活性化するであろう。本発明者は、たとえ不安定なモロニー
白血病ウイルスでもウイルス力価の機能的に著しい損失なしで著しく高い化学物
質の負荷を可能にするであろう。ウイルス力価の測定方法、続いて化学的修飾の
方法は、従来の技術で公知である。
【００２５】 も一つの実施例では、ＰＥＧまたは標的設定あるいは融合誘導ペプチドなどの
ベクターに導入される機能グループはまず活性化リンカーと接合される。このリ
ンカーは望ましくは遺伝子送達粒子の表面により優れた親和性を持つ疎水性遺伝
子座を持つ。例えばグルタミン酸とロイシンのコポリマーが（以下でより詳細に
説明されるが）使用される。リンカーはまた細胞表面へのより優れた親和性のた
めに正の電荷を運ぶ。活性グループのある部分は粒子の表面へのリンカーの共有
結合付着のために保持（あるいは新規に創出）することができる。例えばこのリ
ンカーは、壊れやすいウイルスを過大な化学的処置にさらすことなしに多くの方
法でウイルス表面を修飾するために使用することができる。図１は免疫防御エレ
メント（ＰＥＧ）、融合誘導エレメント（膜不安定ペプチド）および細胞結合エ
レメント（標的設定ペプチド）を含むＴＡＧＤ粒子の表面の図解略図を示す。図
２はリガンドをウイルス粒子に取り込むことのできる２種の異なった方法を示す
。
【００２６】 更なる実施例において、ベクターは、ベクターが新規に準備される表面の中に
組換えコアを含むように配設される。この実施例は、粒子が現存の膜を含むかど
うかに拘らずウイルスコア粒子との使用に適している。かくして例えば、外膜層
を欠く組換えウイルス粒子は人工生成脂質膜内に入ることができる。外膜を含む
組換えウイルス粒子は（ｉ）化学的方法により、（ｉｉ）新しい膜内での被包に
より、また（ｉｉｉ）現存する膜を新規に合成された新しい表面エレメントを含
むように置換により修飾することができる。かくして生成する粒子の表面は前に
述べたように免疫防御因子、融合誘導因子、および細胞特異性向上因子を含むよ
うに遺伝子操作することができる。加えて膜は宿主の血液循環でベクターの安定
性を高める成分を含むことができ、これによりベクターが意図された標的に到達
する機会を改善し、またベクターの作用の継続を増大する機会を提供する。
【００２７】 ウイルスコア ベクターのウイルスコア成分は遺伝子治療での使用に適したいずれかのウイル
スコアである。広くさまざまな適切なウイルスコアが従来の技術で公知の方法で
調製することができ、またＴＡＧＤベクターの内部成分として使用することがで
きる。遺伝子治療で使用されるウイルスの例としては、ジエーン、「遺伝子治療
のテキストブック」第４章、３５−６６ページ（ホグレフ・アンド・ヒューバー
、１９９８年）を参照されたい。適切なウイルススコアは組換えウイルス、例え
ばＨＩＶなどの複製欠損レンチウイルス、または他のレトロウイルス、例えばモ
ロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）もしくはフレンドＭＬＶなどのマウ
ス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ
）、単純疱疹タイプ１（ＨＳＶ−１）、ワクシニアウイルス、エプスタイン−バ
ーウイルス、狂犬病および仮性狂犬病ウイルス、シンドビスウイルス，ＳＶ４０
、およびサイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、バキュロウイルス、
セムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）、および小疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ
）などを含む。これらのウイルスは、もし必要とあれば機能ｅｎｖ遺伝子を欠く
ように遺伝子操作される。組換え方法によるｅｎｖ遺伝子の除去はウイルスの免
疫原性を減少させ、また更に細胞培養でビリオンの産生水準を増加させる。ｅｎ
ｖ遺伝子が除去されているウイルスは標的細胞に結合しまた融合する天然の能力
を欠いている。従って、これらの能力はＴＡＧＤベクターで提供されねばならな
い。
【００２８】 遺伝子治療での使用、および安全性を高めた天然ウイルスゲノムの進行性のよ
り大きなセグメントを除去または置換するのに適した外因性遺伝子を含むこれら
ウイルスコアそれぞれを遺伝子操作する方法は、従来の技術で公知である。例え
ば、ジェーン、前掲同書；アンダースン、ネイチャー、３９２巻（６６７９補遺
）、２５−３０ページ（１９９８年）；ヴァーマ他、ネイチャー、３８９巻、２
３９−２４２ページ（１９９７年）；ＷＯ ９１／１９７９８；ＷＯ ９７／１
２６２２；ＷＯ ９８／１２３１４；および合衆国特許番号５，６６５，５７７
号ならびに同５，６８６，２７９号を参照されたい。また更に、全般的にフィー
ルズ他、「ウイルス学」リッピンコット−レーブン、１９９６年）を参照された
い。
【００２９】 ここで記載された方法と組成物が、更に将来開発されるウイルスコア類似体（
核酸）コアとの使用に適していることを当業者は認識するであろう。
【００３０】 免疫防御エレメント 本発明の前後関係において、免疫防御エレメントはベクターの表面に配設され
それによりベクターの免疫原性を減少させる分子または分子の集合である。すな
わちベクターが患者に投与される時、このエレメントは患者の血清の成分とベク
ターとの相互作用を減少させ、従って、免疫系の活性化を回避し、患者内のベク
ターの生体内のクリアランス率を低下させる。
【００３１】 免疫防御戦略の例は薬剤送達粒子およびまたはその分子塊の電荷を減少させ、
グリコシル化による粒子の親水性を減少させることを含む。もっとも広く使用さ
れるアプローチは、血漿内でのオプソニンにより粒子の認識を減少させる粒子表
面に「免疫デコイ」（免疫おとり）エレメントを付着させ、これにより免疫系の
活性化を遅らせまたは完全に避ける方法である。デコイポリマーを薬剤送達ベク
ターに付着させる一つの方法はポリマーの脂質への接合を経るものである。この
目的にもっとも普通に使用されるポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥ
Ｇ）である（パパハドジョプーロス他、全米科学アカデミー紀要、１５巻；１１
４６０−１１４６４ページ（１９９１年））。同じ目的に使用されるエレメント
は、シアル酸ＧＭ１ポリグリセロール（シャウアー，ＴＩＢＳ，１９８５年９月
号；３５７ページ，山之内他、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース、
１１３巻：１４１ページ（１９９５年）；ポリオキサゾリン−ＤＳＰＥ（ジステ
アロイルホスファチジルエタノールアミン）誘導体（ザリプスキー他、ジャーナ
ル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス、８５巻：１３３−１３７ペー
ジ（１９９６年））；ポリマーベイスト「ステルス」アプローチ（トーチリン他
、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカルス・サイエンス、８４巻：１０４
９ページ（１９９５年））；ホスファチジルポリグリセロール（丸山他、バイオ
シム・バイオフィス・アクタ、１２３４巻：７４−８０ページ（１９９５年））
；フレキシマー・ポリマーズ（（パピソフ、アドバンスド・ドラッグ・デリバリ
・レビュー、３２巻１１９−１３８ページ（１９９８年）；トーチリン、ジャー
ナル・オブ・マイクロエンキャプシュレーション、１５巻、１−１９ページ（１
９９８年））である。代替的免疫防御エレメントは、必ずしもそれに限定されな
いが、ポリグルタミン酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン
、ポリメタクルアミド、ポリエチルオキサゾリン、ポリメチルオキサゾリン、お
よびポリビニルアルコールを含む。ＰＥＧで前に記載したように、これら親水性
ポリマーのそれぞれは、もし必要とあれば反応性化学基を通じてベクターと共有
結合で結合され得る。本発明は更に粒子の表面に望ましい機能を導入しまた免疫
防御機能を持つために使用できるグルタミン酸とロイシンのコポリマーに基づく
新規な組合せリンカーを提供する。本技術分野の経験ある当業者は、グルタミン
酸が含むことを認識するであろう。これら成分は機能的特性を分かち合う他の成
分で置換することができる。これら成分は機能的特性を分かち合う他の成分で置
換することができる。従って、グルタミン酸は、例えばアスパラギン酸と置換す
ることができ、またロイシンには、例えばアラニン、フェニルアラニン、イソロ
イシン、バリンおよび他の疎水性アミノ酸により置換することができる。天然ま
たは非天然アミノ酸が使用される。一つの選択肢として、疎水性機能はエステル
またはグルタミン酸のアミド誘導体として導入することができる。注目すべきは
、ランダムコポリマーおよびまたはブロックコポリマーが類似の目的に使用され
る。
【００３２】 ＰＥＧが免疫防御エレメントとして使用される時には、ＰＥＧは望ましくは約
１０００乃至約５０００ダルトンの分子量を持つ。有利なことに、約２０００ダ
ルトンの分子量を持つＰＥＧは免疫防御を達成するために使用される。膜含有薬
剤送達ベクターの表面に反応性機能基を持つＰＥＧ鎖を配置するために、ＰＥＧ
はデステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのリン脂質に
接合される。他の脂質の使用も本発明の範囲内にあることを当業者は熟知してい
るであろう。更なる修飾可能ＰＥＧを含む適切なＤＳＰＥ−ＰＥＧ分子は従来の
技術で公知であり、例えはシアウォーター・ポリマーズ（ハンツビル、アラバマ
）から購入することができる。
【００３３】 免疫防御エレメントの遺伝子送達ベクター、例えば膜で囲まれたウイルスコア
の表面への取り込みはミセル形成を経由して行うことができる。例えばアスター
他、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．３８６巻：２４３ページ（１９９６年）を参照された
い。ＤＳＰＥ−ＰＥＧの分子は親水性であり、熱力学的に不安定でビリオンのよ
り大きな膜表面と融合するミセルを自発的に形成する。このようなやり方での成
功する挿入は以下に説明される方法を用いて実証することができる。粒子の血液
クリアランス率での免疫防御エレメントの取り込み効果はアイソトープ標識粒子
を用いてモニターすることができる。
【００３４】 標的設定遺伝子送達に対しては、多価および多機能リンカーが多くの利点を提
供する。本発明は以下で説明するように、グルタミン酸とロイシンなどのような
酸性および疎水性アミノ酸の活性化コポリマーに基づく新規な多価および多機能
リンカーを提供する。このようなリンカーの活性化は第三アミンの存在下でポリ
マーをジペンタフルオロフェニルカーボネートと反応させることにより実行する
ことができる。当業者はＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドヒドロキシス
クセネミド、ＢＯＰ試薬などの他の代替的な活性化手段の使用を熟知しており、
またペプチド化学で周知の他の濃縮試薬は本発明の範囲内にある。望ましい機能
グループ、例えばＰＥＧまたは標的設定あるいは融合誘導ペプチドは次いで活性
化リンカーと接合させる。このリンカーはウイルス膜により親和性である疎水性
遺伝子座を所有し、また更に細胞表面により親和性である正の電荷を保持する活
性基のある部分はリンカーの担体への共有結合付着のために保持（または新規に
創出）することができる。このリンカーは壊れやすいウイルスを過剰な化学処理
にさらすことなく多くの方法でウイルス表面を修飾するために使用される。
【００３５】 標的設定エレメント 標的設定エレメントはベクターの標的細胞への高度に特異的な付着を強力にす
る。例えば標的設定エレメントは標的細胞の表面でレセプターまたはリガンドに
結合する結合領域を含む標的設定ポリペプチドである。標的設定エレメントは、
抗体またはその断片、レセプターリガンド、完全タンパク質、ペプチド、レセプ
ター、リガンドとして役立つ非ペプチド有機分子、ビタミン、および細胞表面タ
ンパク質の無機補助因子より成るグループから選択される。有利なことに、標的
設定エレメントは遺伝子治療、例えば癌細胞を標的とする望ましい宿主細胞でよ
り高度に発現されるレセプターに結合する。
【００３６】 適切なリガンドは必ずしもそれに限定されないが、内皮細胞を標的設定する血
管内皮細胞成長因子、血管を標的設定するＦＧＦ２、またインテグリン発現細胞
を標的設定するラミニンおよびＲＧＤペプチドを含む。他の実施例は（ｉ）組成
物が細胞表面葉酸レセプターを持つ種瘍細胞を処置するよう意図された葉酸、（
ｉｉ）組成物がウイルス感染ＣＤ４+リンパ球を処置するよう意図されたピリド
キシル、または（ｉｉｉ）組成物が炎症の領域を処置するよう意図されたシアリ
ル−ルイスoXを含む。望ましい実施例では、標的設定成分はペプチド擬態のもの
である。例えばキーバー−エモンズ他、バイオテクノロジーにおける現在の考え
方、８巻、４３５−４４１ページ；ホーブナー他、Angew. Chim. Int. Ed. Engl
３６巻、１３７４−１３８９ページ（１９９７年）；ポーレッティ他、アドバ
ンスド・ドラッグ・デリバリ・レヴィユー、２７巻、２３５−２５６ページ（１
９９７年）；ボクサス他、バイオオルガニック・アンド・メディシナル・ケミス
トリー、６巻、１５７７−１５９５（１９９８年）：シェップファー、Bioorg.
Med.８巻、２８６５−２８７０ページ（１９９８年））を参照されたい。
【００３７】 望ましい実施例において、ペプチド擬態物は癌細胞のレセプターまたは他の標
的に指向される。例えばα−メラノスタチンのペプチド擬態類似体（［Ｎｌｅ４
，Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−ＭＳＨ）は黒色腫の処置に使用することができ、ここで
黒色腫細胞は−α−ＭＳＨレセプターを過剰発現する。他の癌関連ペプチド擬態
物は従来の知識で公知であり、本発明の範囲内にある。例えばキーバー−エモン
ズ他、１９９７年、前掲同書、ホーブナー他、前掲同書を参照されたい。ニュー
ロテンシン、およびプラスミノ−ゲン活性化剤のレセプター結合部位もまた癌関
連リガンドとして記載されている（シュニール、およびグローナー遺伝子治療、
３巻：１０６９−７３ページ（１９９６年））。他の標的設定リガンドは合衆国
特許番号第５，９１６，８０３号に記載されており、その全体を引用例としてこ
こに取り込まれている。
【００３８】 本発明のも一つの実施例において、適切なペプチドリガンドは、従来の技術で
公知のファージディスプレイ法を用いて選択することができる。適当な方法は例
えば合衆国特許番号第５，７８０，２２１号に記載されており、これはここでそ
の全体を引用例として取り込まれている。要約すると、ランダム配列であらかじ
め選択された長さのペプチドをコーディングする短い核酸配列のライブラリーが
線維状ファージの表面タンパク質をコーディングする遺伝子に構造的に融合し、
生成するペプチドはファージの表面で発現（表示）される。ファージは次いであ
る適当な条件下で固定支持体に固定された細胞表面レセプターなどの標的分子と
の結合能力をスクリーンされる。数多くのペプチド配列の結合性能を同時にスク
リーニングできるように、大きなライブラリーのファージを使用することができ
る。望ましい結合性能を持つファージは分離され、対応するペプチドリガンドを
コーディングする核酸の配列が決定される。これらのペプチドは本発明の方法で
直接リガンドとして使用でき、あるいは標的エレメントとして使用されるペプチ
ド擬態物の設計と合成のための鋳型として使用することができる。
【００３９】 ＴＡＧＤベクター表面に存在する標的設定成分の数は、リガンド−レセプター
相互作用の親和力、標的細胞表面のレセプターの相対的発生量、標的細胞の相対
的発生量などの要素に依存して変化するにも拘らず、細胞標的設定で適切な向上
を図るために、少なくとも２０−１００個の標的設定分子が各ベクターの表面に
存在しなければならないであろうことが予想される。標的設定成分は各種の方法
、例えば以下でより詳細に説明されるように熱力学的に不安定なミセル中間体を
経由する方法を用いてＴＡＧＤベクター表面に取り込まれる。選択肢として、標
的設定成分はベクター表面へのＰＥＧの追加で前に記載の同じやり方でポリリン
カーを用いて加えるちことができる。一つの実施例では、標的設定成分は標準リ
ンカー化学で表面に結合することができる。例えば、ハーマンソン、バイオコン
ジュゲート技術（ピアス・ケミカル・カンパニー／アカデミックプレス、サンデ
ィエゴ、７８５ページ（１９９６年））を参照されたい。
【００４０】 例えば脂質接合ポリマーを含む表面に対して、標的設定成分は「供与体−受容
体」型の反応を経由して脂質−ポリマー接合体に化学的に連結することができる
。かくして一つの実施例では、標的設定成分は脂質接合ポリマーに存在するマレ
イミド基（受容体）と反応できる遊離スルフヒドリル基（供与体）を運ぶように
設計することができる。この反応の進捗状態はエルマン試薬の使用で測定される
マレイミド発色団の損失、および遊離スルフヒドリルの損失に起因する３００ｎ
ｍでのＵＶ吸収の減少を観察することによりモニターすることができる。従来の
技術で公知の結合方法も使用することができ、例えば求核アミン基（供与体）と
の結合がそれである。当業者は更に、供与体成分が粒子表面に存在し、受容体が
標的成分に存在し、あるいは必要とあればその逆も真であることを理解するであ
ろう。同様に標的設定成分もまたＴＡＧＤベクターの脂質膜に、ベクターの脂質
−ポリマー接合体成分にあるいはベクターに存在するいずれか他の適切な配設さ
れた表面成分に直接結合することとができる。
【００４１】 このように一度接合されると、標的設定成分がその意図された標的に結合する
能力を保持することを確実にすることが望ましい。コレステロールは従来の技術
で公知である方法を使用することとで行うことができる。例えば非接合標的設定
成分の同系レセプターに結合する能力は結合成分の結合能力と比較するこができ
る。この比較はアセンブルされたＴＡＧＤベクターを用いて行うことができるが
、より便利にはＴＡＧＤベクターへの取り込み前に結合成分と非結合成分を比較
することで達成させる。標的設定成分がアセンブルあるいは部分的にアセンブル
されたベクターの成分に直接結合される場合には、この比較は標的設定成分がベ
クター成分と結合され生成するモデル化合物が次いで非接合標的設定成分と比較
されるようなモデル反応を実施することにより達成され得る。
【００４２】 接合標的設定成分がその標的と結合する能力を保持することを立証する間接接
合検定の一つの例はメラノスタチン（α−ＭＳＨ）化合物を考察することで提供
される。かくしてα−ＭＳＨはスルフヒドリル基（ＳＨ）を含むＰＥＧのＤＳＰ
Ｅ接合体と接合できるマレイミド機能で合成することができる。α−ＭＳＨ，Ｄ
ＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＨ，およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体は黒色腫Ｂ
１６細胞内でメラニン形成を誘導するそれぞれの能力を同じナノモル濃度で比較
することができる。接合ポリペプチド非接合α−ＭＳＨペプチドが非接合α−Ｍ
ＳＨペプチドと類似の活性を持つことが発見される。
【００４３】 前に記載のように、接合体のＴＡＧＤベクターへの取り込みはより大きな膜表
面と融合するミセルの能力を使用して達成することができる。適切な方法はカー
ポチン他（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ−３８８巻；１１５−１１８ページ（１９９６年
））に記載される。アスター前掲同書も参照されたい。例えば脂質ＰＥＧ−125
Ｉα−ＭＳＨ接合体はＭｏＭｕＬＶウイルス粒子と一緒に保温される。生成ビリ
オンはスクロース勾配でまず精製され、ついで不連続勾配遠心分離が行われる。
高いアイソトープ計数がビリオンを含む分画と関連して発見される。も一つの実
施例では、レッド蛍光ＤＳＰＥ−ＰＥＴ−ローダミン成分が同じ型のミセルを使
用してビリオンに取り込まれる。ＭｏＭｕＬＶはＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミン
と共に保温され、次いでマウスはヒト細胞との結合を許される。細胞は次いで抗
ＭｏＭｕＬＶ ｅｎｖ抗体と共に保温され、次いでＦＩＴＣ標識二次抗体（グリ
ーン蛍光）の追加が行われる。生成細胞はＦＡＣＳで分析される。ここでただト
レーサーとして使用されローダミン信号標識がウイルスレセプターを含むマウス
細胞で特異的に検出され、またマウスウイルスと結合するレセプターを欠いてい
るヒト細胞では非特異的信号標識が検出されなかったことが発見される。
【００４４】 標的設定成分のＴＡＧＤベクターへの取り込みがベクターの細胞結合特異性を
再び指向できることを示すために、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体は前に
記載の通りＭｏＭｕＬＶウイルス粒子で保温され、Ｄ１０ヒト黒色腫細胞と結合
する能力を検定することができる。修飾および非修飾ＭｏＭｕＬＶ粒子はＤ１０
細胞と結合され、それは次いで前に記載の方法を用いてモロニーｅｎｖ特異的Ｆ
ＩＴＣ信号標識の存在を検証される。ＭｏＭｕＬＶはそれ自身ヒト細胞とは結合
できないマウスウイルスであるが、一度脂質−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体で前処
理されると、ヒトＤ１０細胞と結合することが発見される。しかしその表面にＤ
ＳＰＥ−ＰＥＧ−α−ＭＳＨを含まないＭｏＭｕＬＶを用いた場合には結合は一
切検出されなかった。これらの結果は、適切な結合成分を用いることでＴＡＧＤ
粒子の結合特性を再指向することが可能であることを示している。当業者はこの
実施例が単に例証するものであり、この結果を一般に適用できるものとして更に
十分に理解するであろう。
【００４５】 細胞侵入エレメント 細胞侵入エレメントはＴＡＧＤベクターと標的細胞の間の融合のために膜活性
成分を提供することによりＴＡＧＤベクターの宿主または標的細胞への侵入を助
ける。標的薬剤送達での効率での主要は制約は標的細胞の膜を通過することであ
るため、機能的細胞侵入エレメントを持つＴＡＧＤベクターは標的細胞に侵入す
ることが可能であり改良された効率で治療化合物を送達することができる。
【００４６】 有利な点は、細胞侵入エレメントペプチドなどの融合誘導成分、すなわち膜不
安定化能力を持つペプチドである。融合誘導ペプチドは膜リン脂質の秩序だった
パッキングを破壊することにより細胞膜に孔の形成を誘導する。ある融合誘導ペ
プチドは脂質の無秩序を促進し、このように各種性質の２個の膜エンベロープ粒
子（例えば細胞、被包ウイルス、リポソーム）の近位に配置された膜の合体また
は融合の機会を高めるように作用する。他の融合誘導ペプチドは同時に２個の膜
に付着し、膜の合体の原因となりその１個になる融合を促進する。融合誘導ペプ
チドの例はウイルスエンベロープタンパク質エクトドメインからの融合ペプチド
、細胞質尾部からのウイルスエンベロープタンパク質膜近位ドメインの膜不安定
化ペプチドを含む。
【００４７】 他の融合誘導ペプチドはしばしば更に両親媒体性領域を含む。両親媒体領域含
有ペプチドの例は、メリチン、マゲイニン、ＨＩＶ１ ｇｐ４１細胞質尾部、微
生物およびレプチリアン細胞毒ペプチド、例えばボモリチン１、パルダキシン、
マストパラン、クラブロリン、セクロピン、エントアメーバ属およびブドウ球菌
の毒素；（１）ウイルスエンベロープタンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインのＮ
末端領域、例えばＨＩＶ−１，ＳＩＶ，インフルエンザ、ポリオ、ライノウイル
ス、およびコクサッキーウイルス；（２）ＴＭエクトドメインに対する内部の領
域、例えばセムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、
風疹ウイルス、および精子タンパク質ＰＨ−３０からの融合ペプチド、（３）ウ
イルスエンベロープタンパク質の細胞質側に膜近位の領域、例えば鳥類白血症ウ
イルス（ＡＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、および脾臓壊死ウイ
ルス（ＳＮＶ）などからのウイルス融合ペプチドを含む。
【００４８】 一般にこのような融合誘導ペプチドは膜などのような疎水性表面の存在下では
両親媒性αらせん構造を形成する傾向を持つ。両親媒性ペプチドは一方の側が疎
水性であり他方の側が親水性であることを当業者は理解するであろう。一つの見
地において、融合誘導ペプチド配列はエンベロープタンパク質の膜貫通部分の膜
広がりセグメントが５′であるウイルスエンベロープタンパク質の部分から取ら
れる。
【００４９】 天然ウイルスにおいては、対象となる主題の両親媒性断片は、長さがしばしば
約２０アミノ酸であるエンベロープタンパク質の膜貫通部分の膜広がりセグメン
トの疎水性領域の位置を占める。一般に本発明の融合誘導ペプチドは、各種の長
さのものであることができる。一つの実施例において、ペプチドは約１２乃至約
３５アミノ酸残基を持つ両親媒性アミノ酸配列を含む。疎水性膜広がりセグメン
トはしばしばその細胞質末端近くに一般に屈曲構造と関連するグリシンまたはプ
ロリンを含む。このような膜近似セグメントの両親媒性はその疎水性モーメント
を計算することにより同定される。このような膜近位両親媒性セグメントの例が
示される。
【００５０】 も一つの実施例において、融合誘導ペプチドは前に記載のアミノ酸配列の誘導
体または類似体であるアミノ酸配列を含む。誘導体または類似体は前に記載のア
ミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１個が置換されている。一つの実施例で
は、融合誘導ペプチドは前に記載の円エンベロープタンパク質の細胞質部分から
誘導されたアミノ酸配列より成り、更に膜貫通タンパク質の少なくとも部分を含
んでいる。
【００５１】 ウイルスから誘導される融合誘導ペプチドの代表的な例は下記の表１で与えら
れる。表１では、負の数字はウイルスエンベロープタンパク質の予想される膜貫
通領域のＣ末端領域にあるアミノ酸残基を引用し、また正の数字はペプチドにあ
るウイルスエンベロープのＮ末端で始まる細胞質尾部からの残基数を引用する。
貫通膜と細胞質ドメインの間の境界は、約２０疎水性アミノ酸Ｎ末端からウイル
スエンベロープタンパク質のエクトドメインまでの広がりの後の最初の疎水性ア
ミノ酸にある。かくして例えば、「−２／１４」で示されたペプチドは、分離ペ
プチドが（Ｎ末端からＣ末端方向で）Ｎ末端の最初の２個のアミノ酸残基として
、予想される膜貫通部分の２個のＣ末端アミノ酸を含み、また最後の１４アミノ
酸残基が予想される細胞質尾部の１４Ｎ末端アミノ酸である、ということを意味
している。表１は数多くのウイルスエンベロープタンパク質のもっとも親水性で
ある膜近似セグメントの位置をリストする。
【００５２】
【表１】
【００５３】 更に表１では、下記の略語が使用されている：ＡＬＶ−鳥類白血症ウイルス；
ＢＬＶ−ウシ白血病ウイルス；ＥＩＡウマ伝染性貧血；ＦＩＶ−ネコ免疫不全ウ
イルス；ＨＥＰ Ｃ−Ｃ型肝炎；ＨＩＶ−ヒト免疫不全ウイルス；ＨＴＬＶ−ヒ
トＴ細胞白血病ウイルス；ｈＲＳＶ−ヒトＲＳウイルス（ヒト呼吸器合胞体ウイ
ルス）；ｉｎｆＭ２−インフルエンザＭ２ウイルス；ＩＮＦ−インフルエンザ；
ＭＭＴＶ−マウス乳腺癌ウイルス；ＭＰＭＶ−マソン−ファイザーサルウイルス
；ＲＳＶ−ラウス肉腫ウイルス；ＰＩＮＦ−パラインフルエンザ；ＳＮＶ−脾臓
壊死ウイルス；ＶＳＶ−水泡性口内ウイルス；ＳｉｍＳｒｃＶ−ＨＬＢ−シミア
ン肉腫ウイルス；ＭｏＭｕＬＶ−モロニーマウス白血病ウイルス。
【００５４】 望ましい実施例において、融合誘導体ペプチドは、ＭｏＭｕＬＶエンベロープ
タンパク質（ｅｎｖ）の膜近位細胞質ドメインである。このドメインは各種のウ
イルスの間で保存された構造的特性を持ち、また膜誘導αらせんを含む。このペ
プチドは出願中の合衆国特許出願連続番号第０９／１１２，５４４号に記載され
ており、その全体を引用例としてここに取り込まれている。
【００５５】 も一つの実施例では、グルタミン酸とロイシンのコポリマーが融合誘導エレメ
ントとして利用できる。これらのコポリマーは各種の物質を細胞に送達できる協
力な配座ｐＨ依存親水性／疎水性担体である。その全体を引用例としてここに取
り込まれているＷＯ ６７／４０８５４を参照されたい。しかしここで示された
これらのコポリマーの膜浸透および膜混乱性質は、本発明の前後関係で異なる目
的のために使用される。物質を細胞に送達するよりも、このコポリマーは遺伝子
送達粒子表面の表面に付着されて、ｐＨ依存性融合誘導因子として、およびまた
は他の望ましい機能（融合誘導、免疫防御、標的設定などの機能等）のための多
価および多機能担体として作用する。グルタミン酸とロイシンまたは他の疎水性
（天然または非天然のもの）アミノ酸とのコポリマーに基づいて、ｐＨ依存性リ
ンカーの融合誘導性質は更に前に記載の融合誘導ペプチドの使用により増大する
ことができる。
【００５６】 ベクターの試験管内アセンブリ ＴＡＧＤのベクターをアセンブルするための一つの方法はベクターに加えるべ
きエレメントを含むミセル調製物の使用を通じて行われる。かくして例えば、標
的設定リガンドと融合誘導エレメントは前記のとおり結合ポリマー−脂質化合物
に共有結合することができ、生成接合分子は次いでミセルを調製するために使用
される。これらのミセルはコア成分の調製物に加えられ、これにより接合体はコ
ア成分の表面に挿入される。「拡散交換」という類似の方法が、例えば合衆国特
許番号第５，６３１，０１８号に記載されており、その全体を引用例としてここ
に組み込まれている。
【００５７】 ＴＡＧＤをアセンブリする工程で使用される他の方法は従来の技術で公知であ
る。例えば、天然発生ウイルスエンベロープを修飾する一つの方法は、二重洗剤
透析によるものであり、これは合衆国特許番号第５，７６６，６２５号に記載さ
れ、その内容はその全体を引用例としてここに組み込まれている。ウイルスエン
ベロープの脂質は、脂質およびまたは免疫防御ポリマーならびに洗剤、例えば部
分的にエンベロープを可溶化するコール酸塩などの調製物を使用することにより
修飾される。洗剤は次いで食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して包括的透析に
より除去され、次いでデオキシコール酸ナトリウムまたは他の適切な洗剤での部
分ミセル化による融合誘導成分およびまたは標的設定成分の挿入が行なわれる。
洗剤は次いで再び包括的透析で除去される。
【００５８】 「ミセル化」という用語は、追加の免疫防御脂質またはポリマー成分の取り見
を可能にするよう「軟化」されるが、二層構造が喪失する点まで可溶化（ミセル
化）されないウイルス膜を引用する。部分ミセル化のプロセスはレーザー光線拡
散装置を用いて小胞の光の拡散をモニターして制御することができる。光線拡散
信号を維持するために、十分な洗剤が小胞分散に導入される。光線拡散信号の損
失は真の可溶化と二重構造の損失を示している。部分ミセル化の後、一つの実施
例でのＴＡＧＤ粒子の全体性がウイルス力価を測定することにより立証すること
ができる。
【００５９】 有用な洗剤は従来の技術に習熟した人にとって公知であり、必ずしもそれに限
定されないが、胆汁酸塩（コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、タウロコー
ル酸など）、チャプス、オクチルグルコシド、トリトン−Ｘ誘導体（トリトン系
界面活性剤）などを含む。これらの洗剤はチャプスなどのような両性イオン系か
、またはオクチルグルコシドあるいはトリトン−Ｘなどのような非イオン系にす
ることができる。非イオン系洗剤は、それらがＴＡＧＤ粒子での完全性の損傷を
来たすことが少ないので望ましい。洗剤の選択は特定の洗剤と挿入される表面タ
ンパク質との適合性を考慮して決定される。
【００６０】 一つの実施例でのＴＡＧＤベクターをアセンブルするも一つの方法は、１個ま
たはそれ以上の免疫防御、標的設定および細胞侵入エレメントをウイルス粒子の
表面に存在するウイルスタンパク質に共有結合させることである。かくして例え
ば、追加されるエレメントは活性化カルボキシル基を運ぶように準備でき、それ
が次いでウイルスタンパク質にある表面リシン分子の側鎖の遊離アミノ基と反応
する。分子をタンパク質と結合する他の方法は従来の技術で公知である。例えば
表面リシン分子の側鎖は、遊離スルフヒドリル基を提供するために２−イミノチ
オレイン（トラウト試薬）と反応できる。これらの基は次いでマレイミド基を運
ぶ免疫防御、標的設定および細胞侵入エレメントと反応できる。
【００６１】 新規な機能エレメントを含有する表面でＴＡＧＤベクターを調製する方法は、
追加脂質の存在下でエンベロープウイルスを超音波処理または渦巻き運動させる
ことを含み、これによりこれらの追加の脂質は現存する脂質膜に導入される（例
えばファン他、バイオケミストリー、８巻：３４４−３５２ページ（１９６９年
）を参照されない）。望ましい新規な機能成分を含有するＴＡＧＤベクターはコ
ア含有粒子の存在下でリポソームを形成することで調製される。これらの方法は
、洗剤透析によるリポソーム形成：例えば香川他、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２４６巻：５４７７−５４８８ページ（１９７１年）を
参照されたい；凍結融解法（メーヤー他、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・
アクタ、８１７巻：１９３−１９６ページ（１９８５年）およびバリー他：薬剤
担体としてのリポソーム、グリゴリアディス編，Ｇ．チチェスター・ニューヨー
ク−ブリスベン−トロント−シンガポール：ジョン・ワイリー・アンド・サンズ
、８４１−８５４ページ（１９８８年）所収参照）；逆相蒸発法（スゾカ他、バ
イオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ、６０１巻：５５９−５７１ページ（
１９８０年）参照を含む。最後に、ロイシンとグルタミン酸のブロックコポリマ
ーが脂質のように行動して膜を形成することが示された。箕浦、ラングミュア、
１４巻：２１４５−２１４７ページ（１９９８年）を参照されたい。従って、こ
のようなブロックコポリマーは前に記載の方法を用いてＴＡＧＤベクターで膜エ
レメントとして使用することができる。
【００６２】 ＴＡＧＤコアがレトロウイルスベクターである時には、ここでその全体を引用
例として取り込まれている合衆国特許第５，６６１，０２２号に記載された方法
により大量に産出され精製される。
【００６３】 ベクター投与の方法 ＴＡＧＤベクターは従来公知の方法で投与される。望ましくはベクターは、非
経口で、より望ましくは静脈内または動脈内で投与される。
【００６４】 ベクターの試験管内検定 本発明のベクターの試験管内検査方法は従来の技術で公知である。例えばベク
ターは、標的細胞でのベクターの成功裡の挿入と発現を追跡するのに使用できる
レポーター遺伝子または選択マーカーを含む。例えばベクターはβガラクトシダ
ーゼ（β−ｇａｌ）、クロムフェニルコールアシルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など
のレポーター遺伝子を含むように遺伝子産物発現の水準が測定される。制御目的
のために この発現は、標的測定リガンドおよび細胞侵入エレメントの一方または両方、免
疫防御エレメントを欠いているベクターで得られた発現と比較される。選択肢と
して、ベクターはネオマイシン耐性遺伝子などの耐性マーカーを含むことができ
る。ベクターの標的細胞への適用に続き、細胞は薬剤耐性を検出される。
【００６５】 ベクターの試験管内効率検定 本発明のベクターの試験管内効率を測定する方法は、従来の技術で公知である
。たとえばベクターが哺乳類の免疫の処置に使用される時には、ベクターの効率
は疾病の１個またはそれ以上の症状の回復によって決定することができる。有利
なことに、生体内効率は疾病の経過または範囲の特徴である定められた臨床終点
の測定を使用できる。遺伝子治療への候補疾病は従来の技術で公知である。例え
ば、バーマ他、ネイチャー、３８９巻、２３９ページ（１９９７年）およびそこ
で引用された文献を参照されたい。
【００６６】 このようにして記載された本発明は下記の実施例を参照することにより容易に
理解されるであろうし、それは概略で提供されており、また本発明を限定するこ
とを意図したものではない。
【００６７】 実施例 下記の実験は、合成成分をコア含有粒子の表面に挿入できることを示す。特異的
には、レトロウイルスベクターはその表面にα−ＭＳＨペプチド擬態リガンドを
含ませるために非遺伝子手段により機能的に修飾された。このリガンドで標的か
されるＴＡＧＤベクターは異色腫の遺伝子治療に有用である。加えて実験はレト
ロウイルス粒子の被包を記載する。
【００６８】 これらのステップを実行するために３件のアプローチ、すなわち（１）直接粒
子表面の修飾、（２）表面挿入のためのミセル中間体の使用、および（３）多機
能で多価のリンカーの使用が行われる。これらの方法はリポソームリガンドと生
体の表面への小さいペプチドの直接の化学的付着を準備するためにこれまでに使
用された方法を利用する（カシュキン他、イムノロジージャ、Ｎ６、３７−４０
ページ（１９８７年）と同著者の証明文言、ＵＳＳＲ Ｎ １４５０８５，Ａ−
６１ Ｋ３９／３９（１９８８年）を参照のこと）。
【００６９】 担体分子の標的設定リガンドへの接合 担体分子の接合時、マレイミドイル誘導体を標的設定リガンドに存在するチオ
ール基に反応させて達成された。ＰＥＧは従来の技術で公知の方法を用いてホス
ファチジルエタノールアミンと接合され、標準方法を用いてマレイミド誘導体（
マレイミド−ＰＥＧ−ＰＥ）に転換された。生成化合物は標的リガンドペプチド
としてのＣｙｓ５９８−６１６ペプチド（ＩＬＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱ
ＡＬ）に接合された。この接合は３００ｎｍで吸収するマレイミドイル基の性質
を利用してモニターされた（ハーマンソン、前掲同書）。類似の結果は脂質（す
なわちＤＳＰＥ）−ＰＥＧ−ＳＨと、α−ＭＳＨのマレイミド化類似体および他
のペプチドとの接合で得られ、ここで他のペプチドは、ＭＳＨのペプチド擬態類
似体（［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−ＭＳＨ，サンディエゴ、カリフォルニ
ア、ノババイオケムから得られたもの）であるα−ＭＳＨNLDを含む。
【００７０】 接合体でのペプチドの転換の水準はマレイミドイル基のモル吸光度を基礎にし
て計算された（６３０Ｍ／ｃｍ-1）。反応の完成はエルマン試薬を用いて未結合
チオールを測定して決定された。接合体は更にそれ以上の実験の結果を妨げかね
ない未結合のペプチドを接合体が持たないことを確認するために、質量分析法（
ＥＳ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により特徴付けられた。準備された接合
体はアプロティック接地でのゲル精製で、またミセル形態では透析により精製さ
れた。カーヌープ他、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９巻：２３２−２３９ペ
ージ（１９９７年）を参照されたい。
【００７１】 生成された脂質−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体は、黒色腫Ｂ１６細胞でのメラニ
ン形成の検定により生物活性を保持することが示された。かくしてα−ＭＳＨ，
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＨ，およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体は同じナ
ノモル濃度で検定された。α−ＭＳＨ接合体は非接合α−ＭＳＨペプチドと比較
できる効率でメラニン形成を誘導した。
【００７２】 ウイルス粒子への接合体の取り込みと細胞標的設定 より大きな膜表面と融合する熱力学的に不安定なミセルの性能がＴＡＧＤベク
ターの構築での次のステップに利用された。この方法は脂質−ポリマー−標的設
定リガンド接合体のリポソーム（カーポティン、前掲参照）またはビリオン（下
記参照）のいずれかの膜表面に取り込むために利用できる。
【００７３】 脂質−ＰＥＧ−125Ｉａ−ＭＳＨ接合体はＭｏＭｕＬＶウイルス粒子と共に保
温された。修飾されたビリオンはスクロース勾配のステップでまず精製され、次
いで不連続勾配遠心分離が行われた。ビリオンがペレットにされた同じ分画と会
合するために高いアイソトープ計数が示された。
【００７４】 この方法の有用性を更に検証するためにＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミン（レッ
ド蛍光）がミセルを利用してビリオンと会合された。かくしてＭｏＭｕＬＶは、
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミンで保温され、マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞またはヒ
トＤ１０黒色腫細胞と結合できるようにされた。細胞は次いで抗ＭｏＭｕＬＶ
ｅｎｖ抗体と共に保温され、次いでＦＩＴＣ標識二次抗体（グリーン蛍光）と共
に保温された。その結果（図３参照）は、ローダミン信号（図３の右上四分円部
のレッド蛍光）がウイルス粒子がミセルとの保温で接合体を取り込められた時に
のみウイルスレセプターを含むマウス細胞で特異的に検出されたことを示してい
る。かくしてＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミンは予期されたようにＭｏＭｕＬＶ粒
子に侵入し、マウス宿主細胞上で検出できる。
【００７５】 次にＤＳＰＥ−ＰＥＧ−α−ＭＳＨNLD接合体はＭｏＭｕＬＶウイルス粒子と
共に保温され、マウスレトロウイルス粒子がＤ１０ヒト黒色腫細胞と結合するよ
うに再指向する接合体の性能を示すために検定された。修飾および非修飾ＭｏＭ
ｕＬＶ粒子はＤ１０細胞との結合を許され、これらの細胞は抗ｅｎｖ一次ｎｄＦ
ＩＴＣ標識二次抗体（前記のもの）で検出されるモロニーｅｎｖ特異的信号の存
在を検出された。ＦＡＣＳプロファイルは脂質−ＰＥＧ−α−ＭＳＨ接合体で前
処理されたＭｏＭｕＬＶの結合に続くヒトＤ１０細胞上の正の移動を示した。負
の調節では、脂質−ＰＥＧで修飾されるがα−ＭＳＨを欠いているビリオンはヒ
ト細胞への類似の結合を示さなかった。これらの実験は、マウスレトロウイルス
粒子がα−ＭＳＨペプチド擬態接合体の表面取り込みによりヒト黒色腫細胞と結
合するように修飾することを示している。従って表面修飾粒子を新しく特異的な
宿主細胞に再指向できることが示された。
【００７６】 同じ粒子はヒト細胞を形質導入する性能を試験された。ＤＳＰＥ−ＰＥＧを通
じて（ｅｃｏ産生細胞系ＧＰＥ８６／ＬＮＣＸからの）組換えウイルス粒子の表
面に結合されるα−ＭＳＨの接合体はウイルス力価＞１０2を提供し、それはマ
ーカー遺伝子（ｎｅｏおよびβ−ｇａｌ）の送達の成功を意味していた。グルタ
ミン酸とロイシンのコポリマーがＭｏＭｕＬＶの表面でα−ＭＳＨの表示として
使用された時に＞１０4の力価のものが得られた。マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞で
の非修飾および非遺伝子操作粒子の野生型ＭｏＭｕＬＶ力価はほぼ１０6位であ
る。コポリマー−ＭＳＨ接合体の調製の詳細は以下で述べられる。
【００７７】 ＴＡＧＤベクターを創り出すための代替的アプローチは、機能ペプチド、ペプ
チド擬態物およびポリマーを直接または新規な多機能および多価リンカーを通じ
てビリオンの表面に化学的に接合する方法を使用する。これらの化学的接合法は
有機副次溶媒の使用と他の反応性有機化合物での処置を必要とし、かくしてまず
ウイルス生存能力を支持する化学的修飾試薬の作用濃度を確立する必要があった
。ウイルスは各種の有機溶媒と接合体での処置を受けた。ＭｏＭｕＬＶが有機溶
媒での処置に驚くばかり安定しており、５％（量／量）までのアセトニトリルま
たはＤＭＦで３０分処置した後でも殆ど完全な感染性を保持していたことが判明
した。これらの結果は、ウイルスがビリオンの化学的修飾を実施するのに必要な
条件に耐えることができるということを示している。
【００７８】 ＭｏＭｕＬＶ感染性がトラウト試薬での修飾後も保持されることが示された。
これは接合体をトラウト試薬でウイルス表面の修飾を通じてビリオンに共有結合
で付着し、次いでマレイミドイル化化合物で修飾ウイルスを反応させ得るという
ことも示している。修飾の最適条件は１−８ｍＭのトラウト試薬であることが発
見された。
【００７９】 ９０％のグルタミン酸塩（重量／重量）と１０％のロイシンを含む多機能で多
価のリンカーを用いてα−ＭＳＨペプチド擬態リガンドをＭｏＭｕＬＶ表面に取
り込むことが可能であることを更なる実験が示した。例えばバイクコバ他、分子
生物学（モスクワ）１４巻、２７８−２８６ページ（１９８０年）を参照された
い。要約すると、ポリマー（１００ｍｇ）が３００ｍｇのジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＰＥＡ）が１ｍｌのＤＭＦに溶解され、ゆっくりと０．１ｍｌの部
分に加えられた。４０分後、反応産物はエーテルで沈殿され、エーテルとペンタ
ンで洗浄され、その後乾燥された。生成活性リンカー（１０ｍｇ）は２ｍｌのＤ
ＭＦに溶解された。ペプチド（α−ＭＳＨNLD、１ｍｇ）が加えられ、次いで３
５ｍｌのＤＩＰＥＡが加えられた。反応物は室温で一晩振動され、次いで−２０
℃で貯蔵された。このようなやり方でリンカーの追加は、活性ペンタフルオロフ
ゥニルエステルが遺伝子送達ベクターの表面に更に接合を行うためにまだ残存し
ていることを保証した。
【００８０】 このリンカー−ＭＳＨ接合体は次いでＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＳＨについて前に
記載したものと同じ条件下でウイルスベクターと共に保温された。修飾後に、Ｍ
ｏＭｕＬＶ粒子はウエスタンブロット分析を用いてウイルス粒子へのα−ＭＳＨ
の取り込みを検定された。α−ＭＳＨ正の信号は修飾ウイルスのｅｎｖタンパク
質と含有していることが発見されたが、非接合α−ＭＳＨが負の調節に加えられ
た非修飾ウイルスには存在しなかった。このようなやり方でのＭＳＨリガンドの
追加は更に修飾ＭｏＭｕＬＶ粒子の結合特性をうまく再指向させた。かくしてα
−ＭＳＨペプチド擬態リガンドを含む多機能多価リンカーを含む化学的修飾Ｍｏ
ＭｕＬＶはヒト黒色腫Ｄ１０細胞に結合できたが、一方、非修飾ウイルスは結合
しなかった。前掲文献に記載された化学的修飾に比べると、多機能リンカーを用
いた結合が優れていることが発見された。これらの結果は図４で示される。
【００８１】 ＭｏＭｕＬＶ粒子の新規な機能表面への再被包 本実験はビリオンなどの遺伝子送達粒子が新しい機能表面で再被包され得るこ
とを実証する。ＵＶ不活性化センダイウイルスがＭｏＭｕＬＶ粒子の遺伝子容量
を新規な宿主に送達するこのような機能再標的設定融合誘導エンベロープ表面を
提供するために使用された。センダイウイルスはこれまでに裸の膜表面と融合す
ることが実証され、遺伝子送達では融合誘導リポソームの成分として適用されて
きた（中西他、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース、５４巻；６１−
６８ページ（１９９８年）で検出された）。ＵＶ不活性化センダイウイルスはグ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子をコード化するＭｏＭｕＬＶと
融合するために使用された。ＭｏＭｕＬＶがヒーラ細胞の培養物に加えられた時
、ＧＦＰ発現は検出されなかった。しかしＭｏＭｕＬＶのセンダイウイルスとの
融合はヒトヒーラ細胞でのＧＦＰ発現を可能にし（＞５０ｃｆｕ／ｍｌ）、マウ
スウイルスＭｏＭｕＬＶによるヒト細胞系の形質導入を実証した。従ってこれら
の結果は、融合および再標的設定分子を含む人工表面でコアが再エンベロープ化
を達成できることを実証する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 免疫防御エレメント（ＰＥＧ）、融合誘導エレメント（膜不安定
化ペプチド）および細胞結合エレメント（標的設定ペプチド）を含むＴＡＧＤ粒
子表面を示す概略図
【図２】 リガンドを表面に取り込んでＴＡＧＤ粒子を生成できる二つの異
なる方法を示す図
【図３】 ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミンを含むミセルと共にビリオンを保
温した後ウイルス粒子と会合するＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ローダミン（レッド蛍光）
を示す図
【図４】 α−ＭＳＨペプチド擬態リガンドを含む多機能多価リンカーを含
む化学的修飾ＭｏＭｕＬＶがヒト黒色腫Ｄ１０細胞と結合でき、一方非修飾ウイ
ルスは結合できなかったことを示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/46 Ａ６１Ｋ 47/46 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 メドベードキン，ビアチェスラブ アメリカ合衆国，90004 カリフォルニア， ロスアンジェルス，アパートメント 110， バージル 160 (72)発明者 アンダースン，ダブリュ．，フレンチ アメリカ合衆国，91108 カリフォルニア， サンマリノ，オクスフォード ロード 960 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 CA04 CA05 EA02 FA20 GA11 GA18 HA01 HA08 HA11 HA17 4C076 AA95 EE23 EE41 EE56 4C084 AA13 NA13 4C087 BC83 NA13

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的細胞への核酸の細胞特異的送達のための一つの非天然発
    生ウイルス遺伝子治療ベクターであって、組換えウイルスコア、非天然発生機能
    表面部分、および前記コアを前記機能表面部分と会合させるリンカーより成り、 ここで前記コアは核酸分子より成り、 ここで前記ベクターは少なくとも１個の治療核酸、ペプチド、またはタンパク
    質の産生を促進し、 ここで前記機能表面部分は免疫防御エレメント、標的設定エレメントおよび細
    胞侵入エレメントより成るグループから選択される少なくとも１個の機能エレメ
    ントより成り、また ここで前記リンカーは多価ポリマーおよびポリマー修飾脂質より成るグループ
    から選択される少なくとも１個のエレメントより成り、また これにより前記ベクターは、前記コアに結合しそれを標的細胞に送達する、 ことを特徴とするベクター。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のベクターであって、ここで前記コアが更に少
    なくとも１個のウイルスカプシドタンパク質より成ることを特徴とするベクター
    。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のベクターであって、ここで前記機能表面部分
    が免疫防御エレメントより成ることを特徴とするベクター。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のベクターであって、ここで前記機能表面部分
    が標的設定エレメントより成ることを特徴とするベクター。
  5. 【請求項５】 請求項１記載のベクターであって、ここで前記機能表面部分
    が細胞侵入エレメントであることを特徴とするベクター。
  6. 【請求項６】 請求項１記載のベクターであって、ここで前記機能表面部分
    が免疫防御エレメント、標的設定エレメント、および細胞侵入エレメントより成
    ることを特徴とするベクター。
  7. 【請求項７】 請求項３記載のベクターであって、ここで前記免疫防御エレ
    メントが合成ポリマー部分であることを特徴とするベクター。
  8. 【請求項８】 請求項４記載のベクターであって、ここで標的設定部分が正
    常細胞よりも罹患細胞でより高度に発現される受容体と結合することを特徴とす
    るベクター。
  9. 【請求項９】 請求項８記載のベクターであって、ここで前記標的設定部分
    が細胞表面受容体のためのペプチドまたはペプチド擬態リガンドであることを特
    徴とするベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項５記載のベクターであって、ここで前記細胞侵入エ
    レメントが膜不安定化部分であることを特徴とするベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載のベクターであって、ここで前記膜不安定
    化部分が両親媒体αらせんより成ることを特徴とするベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１０記載のベクターであって、ここで前記膜不安定
    化部分がグルタミン酸とロイシンのコポリマーより成ることを特徴とするベクタ
    ー。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載のベクターであって、ここで前記両親媒性
    αらせんがウイルスｅｎｖタンパク質のＣ末端ドメインから誘導されることを特
    徴とするベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１１記載のベクターであって、ここでＣ末端ドメイ
    ンがモロニー白血病ウイルスｅｎｖタンパク質のＣ末端ドメインであることを特
    徴とするベクター。
  15. 【請求項1５】 請求項１４記載のベクターであって、ここで前記Ｃ末端ド
    メインがモロニー白血病ウイルスｅｎｖタンパク質のアミノ酸５９８−６１６よ
    り成ることを特徴とするベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項７記載のベクターであって、ここで前記合成ポリマ
    ー成分がポリ（エチレングリコール）より成ることを特徴とするベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項７記載のベクターであって、ここで前記合成ポリマ
    ーがグルタミン酸とロイシンより成ることを特徴とするベクター。
  18. 【請求項１８】 患者にある疾病を処置する一つの方法であって、前記患者
    に請求項１記載の治療有効量を投与することより成ることを特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１記載の遺伝子治療ベクターであって、ここで前記
    リンカーが多価ポリマーより成ることを特徴とする遺伝子治療ベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１９記載の遺伝子治療ベクターであって、ここで前
    記多価ポリマーがグルタミン酸とロイシンアミノ酸を不可欠に構成されることを
    特徴とする遺伝子治療ベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１記載の遺伝子治療ベクターであって、ここで前記
    リンカーがポリマー修飾脂質を含むことを特徴とする遺伝子治療ベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項２１記載の遺伝子治療ベクターであって、ここで前
    記ポリマー修飾脂質の近位端部が疎水性または両親媒性部分で修飾されることを
    特徴とする遺伝子治療ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２１記載の遺伝子治療ベクターであって、ここで前
    記ポリマー修飾脂質の遠位端部がリガンドまたは標的設定部分で修飾されること
    を特徴とする遺伝子治療ベクター。
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