JP2003501373A - 新規なリポソームベクター複合体および遺伝子療法でのそれらの使用 - Google Patents

新規なリポソームベクター複合体および遺伝子療法でのそれらの使用

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クリスティーナ・ミュラー
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アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下の成分：ａ）任意の長さの核酸配列、ｂ）成分ａ）を縮合させ、リソソーム分解性および／またはリソソーム向性であるカチオン性支持体、ｃ）リポソームを形成するリピドおよびリン脂質、ｄ）標的細胞に対する連結点を有する任意のリガンド、ならびにｅ）成分ｃ）のリソソーム分解性および／またはリソソーム向性機能を置換できる任意の融合誘導物質を含有する新規なリポソームベクター複合体に関する。融合誘導物質（ｅ）が存在する場合には、カチオン性支持体（ｂ）はリソソーム分解性および／またはリソソーム向性である必要はない。本発明はまた、上記複合体の製造および使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、新規なリポソームベクター複合体および遺伝子療法のためのそれら
の使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
遺伝子療法のためのベクターの本質的な成分は従来、非ウイルス担体（たとえ
ばカチオン性リピドまたはカチオン性ポリマー）と複合体化されたまたはウイル
スに挿入された核酸配列であった。
【０００３】 すべての種類の疾患の遺伝子療法におけるこのようなベクターでの従来の経験
では、とくに癌を除いて、とくに非ウイルスベクター複合体は細胞培養で比較的
わずかな数の細胞にしか（通常、１％〜３０％）トランスデュースされないこと
、さらに遺伝子療法ベクターの生物体の循環への投与後これらのベクターは短時
間で循環から消失し、標的細胞への結合およびこれらの標的細胞のトランスフェ
クションにはも早利用されないことを示している（Ogrisら, Gene Ther. 6: 595
, 1999; Dashら, Gene Ther. 6: 643, 1999; Liら, Gene Ther. 5:930, 1998; L
iuら, Gene Ther. 4: 517, 1997）。
【０００４】 この消失はＤＮＡの分解または肺臓、肝臓、または脾臓およびリンパ節にとく
に発達する「網様系」（ＲＥＳ）におけるベクターの急速な沈着によって起こり
うる（Zhuら, Science 261: 209, 1993）。
【０００５】 急速な消失の原因は様々である。それらには、著しく大きな陰性または陽性の
電荷、著しく大容量、または血液タンパク質によるベクター粒子のオプソン化が
ある。ウイルスベクターの場合には、それらはさらに生物体内におけるウイルス
特異的受容体に対するウイルスコートタンパク質の結合および／またはベクター
に結合しそれらを消失させるウイルスに特異的な別個の抗体もしくは免疫細胞へ
の結合がある。
【０００６】 以前の経験ではさらに、標的細胞特異的なリガンドのベクター複合体へのカッ
プリングまたは挿入は、血液循環中への投与後のその急速な消失を有意に低下さ
せないことが示されている。
【０００７】 これらの問題に関する知識から、細胞培養液中で可能な限り多くの細胞がトラ
ンスフェクトされ、生存生体に投与されたのちは可能な限り長期に循環中に残留
し、循環から早期に消失しないベクターの新規な調製には緊急な必要性がある。
血液循環からの核酸との複合体としてカチオン性リピドまたはカチオン性ポリマ
ーの消失を低下させるために、ポリエチレングリコール（Seniorら, Biochim.Bi
ophys.Res.Acta 1062:77, 1991; Moriら, FEBS Lett. 284: 263, 1991; Ogrisら
, Gene Ther. 6: 595, 1999）、ビニルポリマー類（Torchilinら, Biochim. Bio
phys.Res.Acta 1195: 181 1994）、または他の両性ポリマー（Woodleら, Biocon
jgat.Chem. 5: 493, 1994）をカチオン性リピドもしくはカチオン性ポリマーに
カップリングさせるか、または陰性に荷電したリピドの助力により核酸配列がカ
チオン性リピドもしくはカチオン性ポリマーとの複合体として包含されるアニオ
ン性リポソームが調製されている（ＵＳ特許第 4,946,787 号；第 4,245,737 号
；第5,480,463号；Heywood & Eanes, Calc.Tissue Int. 40: 149, 2992; Lee &
Huang, J. Biol. Chem. 271: 8481, 1996; Balocki & Beutler, Blood 88: 3884
, 1996; Lucieら, J.Lipi.Res. 8: 57, 1998; Lakkarajuら, J.Lipi.Res. 8: 7
4, 1998; Turnerら, J.Lip.Res. 8: 114, 1998; Schoen ら, J.Lipi.Res. 8: 48
5, 1998）。
【０００８】 この種類の修飾はたとえばベクターの粒子サイズの安定化を招き、ベクターの
それら自体または血液細胞との凝集を防止し、免疫グロブリン、補体因子、フィ
ブリノーゲンまたはフィブリネクチンの結合によるベクターのオプソン化を減少
させ、抗体による消失に対して（アデノ）ウイルスベクターを保護し、ベクター
の血液残留時間の延長、皮下で増殖する腫瘍濃度の著しい上昇、および腫瘍細胞
のトランスダクションを引き起こした（Ogrisら, Gene Ther. 6: 595, 1999）。
【０００９】 しかしながら同時に、肺臓、脾臓および肝臓において、かなりのベクター濃度
およびこれらの臓器における組織細胞のトランスダクションを検出することも可
能であり（Ogrisら, Gene Ther. 6: 595, 1999）、したがって、たとえばＰＥＧ
のカップリングは改善をもたらすが、ベクターの分布のオプソン化は依然として
認められないと結論することができる。
【００１０】
【発明の開示】
本発明は、以下の成分： ａ) 任意所望の長さの核酸配列 ｂ) 成分ａ）を濃縮し、リソソーム分解性および／またはリソソーム向性であ
るカチオン性担体 ｃ) リポソームを形成する脂質およびリン脂質 ｄ) 標的細胞に対する結合部位を有する任意のリガンド ｅ) 成分ｂ）のリポソーム分解性および／またはリポソーム向性機能を置換で
きる任意の融合誘導物質 から構成され、融合誘導物質（ｅ）の存在下にはカチオン性担体はリソソーム分
解性および／またはリソソーム向性であってはならない、遺伝子療法のための新
規なリポソームベクター複合体に関する。
【００１１】 成分ａ）は非修飾もしくは修飾ＤＮＡ配列または非修飾もしくは修飾ＲＮＡ配
列とすることができる。ヌクレオチド配列は抗-ＤＮＡ（トリプレックス）また
は抗−ＲＮＡ（アンチセンス；リボザイム）機能を発揮することができるかまた
はこの種類の活性ＲＮＡ配列もしくはタンパク質をコードすることができる。ヌ
クレオチド配列およびそれらの修飾はＤＡアーゼまたはＲＮアーゼによる分解に
対し著しく抵抗性である。この種類のヌクレオチド配列およびそれらの修飾の例
は Breaker, Nature Biotechnol. 15:427, 1997; Gerwik, Ctitical Reviews in
Oncogenesis 8: 93, 1997; Mukhopadhyayら, Crit.Rev.Oncogen. 7:151, 1996;
Mercolaら, Cancer Gene Ther. 2:47, 1996; Frank-Kamenestski, Annu.Rev.Bi
ochem. 64: 65, 1995 および Fraserら, Exp.Opin.Invest.Drug 4: 637, 1995
に示されている。ＤＮＡ配列は線状でも環状でもよく、たとえばプラスミドの形
態とすることができる。
【００１２】 成分ａ）はさらに、好ましくはウイルスに対して異種の核酸配列が本技術分野
における熟練者に周知の方法を用いて挿入されたウイルスとすることができる。
このタイプのウイルスの例はＲＴＶ，ＡＡＶおよびレンチウイルスである。この
種の例ならびに更なる例は、Vile, Nature Biotechnol. 15: 840, 1997; McKeon
ら, Human Gene Ther. 7: 1615, 1996; Flotteら, Gene Ther. 2: 357, 1995; J
olly, Cancer Gene Ther. 1: 51, 1994; Dubenskyら, J.Viol. 70: 508, 1996
によって記載されている。
【００１３】 成分ｂ）は、成分ａ）を濃縮し、同時にリソソーム分解性および／またはリソ
ソーム向性を有するカチオン性担体である。
【００１４】 本発明の特定の実施態様においては、成分ｂ）はカチオン性ポリマーであり、
たとえば Boussifら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297, 1995; Kanedaら,
Science 243: 375, 1989; Keownら, Methods in Enzymology 185: 527, 1990; B
akerら, Gene Ther. 4:773, 1997; Fritzら, Human Gene Ther. 7:1395, 1996;
Wolfentら, Human Gene Ther. 7: 2123, 1996 および Solodinら, Biochem. 34:
13537, 1995によって記載されている。Boussifらによって記載されたポリエチ
レンイミン（ＰＥＩ）は同じ著者によって記載された方法による遺伝子療法のた
めのベクターとして用いられた場合、最終的にリソソームの膨潤および破裂を導
き、すなわちＰＥＩはリソソーム分解性に作用すえる。
【００１５】 さらに、本発明の特定の実施態様においては、成分ｂ）はポリエチレンイミン
（ＰＥＩ）であり、さらに本発明の特定の実施態様においては、ポリエチレンイ
ミンは分子量範囲 500〜25,000 Ｄa を有し、さらに本発明の実施態様において
はポリエチレンイミンは分子量範囲５０００〜１０,０００Daを有し、さらに本
発明の実施態様においては、ポリエチレンイミンは分子量平均約２０００Daであ
り、特許出願 EP-A 0 905 254 に記載のようにして調製される。高分岐鎖ＰＥＩ
誘導体（Lupasol(R), BASF, Ludwigshafen, Germany）および Fischerら（Pharm
. Res. 16: 1273-1279, 1999）に従って調製された低分岐鎖ＰＥＩ誘導体が本発
明の特定の実施態様において使用される。
【００１６】 成分ｃ）は、本技術分野の熟練者には周知の任意所望の組成を有する任意所望
のリポソームである。特定の実施態様においては、このリポソームはアニオン性
電荷を有する。さらに、特定の実施態様においては、アニオン性リポソームのリ
ピドおよびリン脂質組成はウイルスコートの組成に類似する。アニオン性の電荷
を有するリポソームの製造は既に広範に、たとえば、ＵＳ特許第 4,946,787 号
、第 4,245,737 号、第 5,480,463 号およびまた Heywood & Eanes, Cilc. Tiss
ue Int. 40: 149, 1992; Lee & Huang, J.Biol.Chem. 271: 8481, 1996; Balick
i & Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucieら, J.Lip.Res. 8:57, 1998; Lakka
rajuら, J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turnerら, J.Lip.Res. 8: 114, 1998; Sch
oenら, J. Lip. Res. 8: 485, 1998 に記載されている。
【００１７】 ウイルスコートに類似するリポソームの調製はたとえばＵＳ特許第 5,252,348
号；第 5,753,258；第 5,766,625 号およびＥＰ-Ａ 0 555 333 号に記載されて
いる。
【００１８】 本発明はさらに、成分ｄ）の添加による本発明のリポソームベクター複合体の
完成に関する。この成分ｄ）は標的細胞に対する結合部位を有し、リピドに接合
するリガンドである。リガンドの標的細胞特異性は任意とすることができる。
【００１９】 リガンドの好ましい標的細胞特異性は以下に詳細に記載する群： - ヌクレオチド配列の標的細胞特異的トランスファーのための多機能性リガン
ドシステム（ＥＰ-Ａ 0 846 772） - 単一鎖、二重抗原結合分子（ＤＥ 198161417，未公開） - 特異的細胞膜-透過分子（ＤＥ 19850987.1，未公開） - 標的細胞-特異的多価タンパク質（ＤＥ 19910419.0 未公開） から選択される。
【００２０】 リピドのタイプは任意とすることができるが、たとえばＵＳ特許第 5,252,348
号，第 5,753,258 号，第 5,766,625 号およびＥＰ-Ａ 0 555 333 号に記載され
ているような天然に存在するリピドが好ましい。
【００２１】 標的細胞-特異的リガンドに対するリピドの接合は、本技術分野の熟練者には
周知の方法の一つ、たとえばＵＳ特許第 5,662,930 号に記載された方法を用い
て実施される。
【００２２】 成分ｄ）の本発明によるリポソーム（成分ｃ）への挿入は、本技術分野の熟練
者には周知の方法、たとえばＵＳ特許第 5,252,348 号および第 5,753,258 号に
記載された方法を用いて実施される。
【００２３】 本発明はさらに、成分ｅ）の添加による本発明のリポソームベクター複合体の
完成に関する。この成分ｅ）は、エンドソームからのリポソーム内容物の放出を
促進する、好ましくはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのサブユニット
ＨＡ−２（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(17): 7934-7938）リガン
ドからの融合ペプチドの機能性配列である。
【００２４】 成分ａ）、ｂ）およびｃ）またはａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）またはａ）、ｂ
）、ｃ）、ｄ）およびｅ）から構成される本発明によるベクター複合体の調製は
本技術分野の熟練者には周知の方法、たとえば以下の方法： - 第一工程においては、成分ａ）を成分ｂ）を、混合比が生成した総複合体の
正味電荷が好ましくはアニオン性またはカチオン性のいずれかになるように調整
して混合し、ついで - 第二工程においては、工程（１）から生成した複合体を、すでに成分ｃ）を
含有していてもよい成分ｃ）中に、すべての成分の混合比を得られた全複合体の
正味電荷が好ましくはアニオン性またはカチオン性のいずれかになるように調整
して挿入し、 - 第三工程においては、工程２についで成分ｄ）をまた成分ｃ）に挿入し、 - 第四工程においては、工程２もしくは３で生成した複合体に成分ｅ）を任意
に挿入するか、または工程２の前に成分ｅ）を成分ｃ）に添加する 方法を用いて実施される。
【００２５】 これらの製造工程から得られたリポソームベクター複合体は直径１００〜６０
０nmおよびカチオン性またはアニオン性電荷を有し、好ましくは直径１００〜３
００nmおよびアニオン性電荷を有する。
【００２６】 本発明のリポソームはたとえば、腫瘍血管床に濃縮される（Unezakiら, Int.
J. Pharmac. 114: 11, 1996; Sadzukaら, Cancer Lett. 127: 99, 1998; Wunder
ら, Int. J. Oncol. 11: 497, 1997）。さらに、本発明のリポソームはそれらの
成分ｄ）を介して標的細胞に結合し、これを本発明のベクター複合体中の核酸配
列がその細胞内に放出されるようにトランスフェクトされる。
【００２７】 この核酸配列は、組成に依存して標的細胞内で作用を発揮する。すなわちある
種の遺伝子もしくはある種のＲＮＡの転写もしくは翻訳、またはこの核酸配列に
よってコードされたＲＮＡもしくはタンパク質の発現のための細胞のトランスデ
ュースを阻害する。
【００２８】 本発明のリポソームベクター複合体によるトランスダクション率は本技術分野
の熟練者には周知の現存の技術に比べてかなり改良され、たとえば細胞培養にお
いて成分ｄ）に対する受容体を有する細胞の80％以上が本発明のリポソームベク
ター複合体と接触する。
【００２９】 したがって、本発明のベクター複合体は、好ましくは細胞のインビトロトラン
スダクションおよび疾患の予防または治療の目的でのインビボ投与に適当である
。
【００３０】 本発明は以下の成分： ｆ) 任意所望の長さの核酸配列 ｇ) 成分ａ）を濃縮し、リソソーム分解性および／またはリソソーム向性であ
るカチオン性担体 ｈ) リポソームを形成する脂質およびリン脂質 ｉ) 標的細胞に対する結合部位を有する任意のリガンド ｊ) 成分ｂ）のリポソーム分解性および／またはリポソーム向性機能を置換で
きる任意の融合誘導物質 から構成され、融合誘導物質（単数または複数）の存在下においてはカチオン性
担体（ｂ）はリソソーム分解性および／またはリソソーム向性であってはならず
、成分ａ）は好ましくはポリ核酸であり、成分ｂ）はカチオン性タンパク質、カ
チオン性ポリマーまたは両者の組み合わせであるリポソームベクター複合体に関
する。
【００３１】 更なる本発明の実施態様においては、カチオン性担体は硫酸プロタミンである
。
【００３２】 更なる本発明の実施態様においては、成分ｂ）はカチオン性ポリマー、とくに
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、とくに好ましくは平均２,０００〜１０,０００
Daの分子量を有するＰＥＩ、とくにきわめて好ましくは、高分岐鎖または低分岐
鎖のＰＥＩである。
【００３３】 更なる本発明の実施態様においては、成分ｃ）はホスファチジルセリン、ホス
ファチジルエタノーアミン、ホスファチジルコリン、アンカーリピドおよびコレ
ステロールから構成され、とくに好ましいアンカーリピドはＮ−カルボキシホス
ファチジルエタノールアミンたとえばＮ-グルタリルホスファチジルエタノール
アミンであり、成分ｄ）は好ましくは成分ａ）〜ｃ）の一つに、アンカーなしで
、アンカーリピドを介して接合している。
【００３４】 更なる本発明の実施態様は、成分ｄ）が非共有結合的にリポソーム表面に包埋
されているリポソームベクター複合体である。
【００３５】 更なる本発明の実施態様は、その標的細胞が組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、
血液細胞、白血病細胞または腫瘍細胞であるリポソームベクター複合体である。
【００３６】 更なる本発明の実施態様は、成分ｅ）がインフルエンザウイルスのヘマグルチ
ニンのサブユニットＨＡ−２の機能性配列またはその合成誘導体であるリポソー
ムベクター複合体である。
【００３７】 更なる本発明の実施態様は、インビトロまたはインビボにおける細胞のトラン
スダクションもしくはトランスフェクションのためのリポソームベクター複合体
であり、インビトロにおいては好ましくは血清が使用される。
【００３８】 更なる本発明の実施態様は、インビトロまたはインビボにおいて使用する診断
薬の製造および／またはインビトロおよびエキソインビボにおける疾患の予防も
しくは治療用治療薬の製造のためのリポソームベクター複合体の使用であり、投
与は好ましくは皮膚上、粘膜上、肺内、眼上、生体腔部内、結合組織内、筋肉内
、臓器内または血液循環中に行われる。
【００３９】 本発明の更なる実施態様はリポソームベクター複合体の製造方法において、 (１) 成分ａ）を成分ｂ）と混合し、 (２) 工程（１）から得られた複合体を成分ｃ）に、すべての成分の混合比は
得られた全体的複合体の正味電荷が好ましくはカチオン性またはアニオン性にな
るように調整して挿入し、 (３) 任意成分ｄ）を複合体形成の前または後に成分ｃ）内に挿入し、 (４) 任意成分ｅ）を複合体の形成前に、工程（２）および（３）から生じた
複合体または成分ｃ）に挿入し、 得られた生成物を好ましくは凍結乾燥またはエアゾル化する上記の方法である
。
【００４０】
【実施例】
次に本発明の概念を実施例によって例示する。以下の実施例は本発明を如何に
実施するかを例示する意図である。
【００４１】 実施例１： ＲＧＤ配列を有する修飾ペプチド インテグリン受容体の標的化の改良のために、環状ペプチドを合成した。それ
はＮ−末端に付加的なアルギニンを有する（ＦＷ 1163.35）ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ
ペプチド（Arap W., Pasqualini, R. & Ruoslathi, E., 1988, Science, 279: 3
77-380; Pasqualini, R. Koivunen, E. Ruoslathi E., Nature Biotech. 1977,
15: 542-546）である。末端アミノ酸は活性中心、ＲＧＤ配列へのペプチドのカ
ップリングの程度を低減させる。
【００４２】 環化は、チオール基のジスルフィド橋への酸化によって起こる。環化の成功は
ＨＰＬＣ分析によってチェックされる。
【００４３】 ＨＰＬＣ精製後ペプチドを凍結乾燥し、４℃で保存し、使用前に緩衝液（２５
０μg／１５０μL のトリス緩衝液１０mM pH７.４またはＰＢＳ緩衝液 pH７.４
）に溶解する。
【００４４】 リポソームの調製 材料
【表１】
【００４５】 保存溶液
【表２】
【００４６】 リポソームはフィルム／水和法で調製した。クロロホルムに溶解したリピドお
よびリピドアンカーを１００mLの丸底フラスコにピペットで添加し、クロロホル
ムを１５分間蒸発させた。この間、フラスコはリピドの相遷移温度以上、この特
定の場合には３０℃の温度に制御された水浴に浸漬する。溶媒の完全な除去のた
め、フィルムを高真空中で15分間乾燥する。
【００４７】 ついで緩衝液（トリス１０mM，pH７.４またはＰＢＳ pH７.４，他の緩衝液お
よびpHも同様に使用できる）によりフィルムを水和する。緩衝液を数個の小さい
ガラスビーズとともに加え、バッチをＮ2の通気下に４５分間循環し、この間も
フラスコを３０℃の温水浴に浸漬する。リピドフィルムの膨潤および多重薄層リ
ポソーム（ＭＬＶ）の製造のためにはバッチを室温に２時間放置する［1，p.38
］。ＭＬＶ懸濁液を特殊な超音波処理用ガラス容器に移し、バッチをプローブソ
ニケーター（好ましくは振幅８−１２ミクロンに調整）によって１５分間超音波
処理する。この経過中、懸濁液は氷浴に浸漬する。超音波処理後、懸濁液を冷却
するために３０秒間の休止時間を置く。この操作（超音波処理および休止）は１
０回反復する。得られたＳＵＶのサイズ測定では１２０〜３００nmのサイズを与
える。次に孔径５０nmのポリカルボネートフィルターを通して LiposoFast によ
り押し出したのち［1, pp.52-56］［2］、この実施例におけるサイズは１０７.
５〜１２８nmに低下する。このようにして得られたリポソームは少なくとも２カ
月安定であり、この時点でそのサイズに見るべき変化はない。その後処理するた
めのリポソームの保存は滅菌エッペンドルフキャップを施したエアフード下に行
う。 参考文献 (１) Roger R.C. New,“Preparation of liposomes", chapter 2, Liposomes
a practical approach (1989) (２) Olsonら (1980) Biochim. Biophys. Acta, 394: 483
【００４８】 ペプチドのリピドアンカーへのカップリング（Weissig, V., Lasch, J., Klib
anov, A.L. Torchilin, V.P., A new hydrophobic anchor for the attachment
of proteins to liposomal membranes. FEBS Lett. 202:1986, 86-90; Bogdanov
ら,“Protein immobilization on the surface of liposomes via carbodiimide
activation in the presence of N-hydroxysulfosuccimide", FEBS Lett. 231:
1988, 381-384; Weissig, Qualifying thesis for University lectures“Meth
oden zur Darstellung funktionalisierter Liposomen mit Adjuvanseffekt"（
アジュバント作用を有する機能性リポソームの製造方法） MLU Halle-Wittenber
g (1992); Thesis Ragna Schmidt, Halle University (1997). [3] Martinら,“
Covalent attachment of protein to liposomes", chapter 4, Roger R.C. New,
Liposomesa practical approach (1989)）。
【００４９】 材料
【表３】
【００５０】 最初に、リピドアンカーのグルタール酸ラジカルのカルボキシル基を１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド［3, p.170］の添加に
よって活性化する。このためには４００μＬのリポソーム懸濁液（総リピド４μ
moL, Ｎ−glut−ＰＥ ４μmoL, メジウム：トリス緩衝液pH８, １０mM，他の緩
衝液およびpHも同様に使用できる）を旋回させ、３.５mgのＥＤＣを秤量して添
加する。バッチを再び、遮光下に５時間旋回、振盪する（IKA Vibrax VXR）。活
性化された中間体、Ｏ−アシル中間体を形成させ、これに遊離アミノ機能を有す
るペプチドがアミドを形成して結合する。ＰＢＣ緩衝液pH７.４またはトリス緩
衝液１０mM pH７.４（２５０μg／１５０μL, 他の緩衝液およびpHも同様に使用
できる）中に溶解した２５０μgのＲＧＤを加え、バッチを一夜旋回、振盪する
。カップリングが起こったのち、結合していないペプチドをゲルクロマトグラフ
ィーによりリポソームから分離する。サイズ排除クロマトグラフィーは Sephade
x G50 カラムを用いて実施し、溶出液はトリス緩衝液１０mM pH７.４（ほかの緩
衝液およびpHも同様に使用できる）とする。
【００５１】 カップリングの収率は、同時に実施した蛍光染料（５−ＤＴＡＦ）−標識ＲＧ
Ｄ含有バッチ（生成物情報シート５−ＤＴＡＦ，分子プローブ（MP 00143 08/27
/95)「アミン反応性プローブと接合」）により測定し、ＰＬ 1μmoLあたり少な
くとも６μgのＲＧＤである（コレステロールを用いリピドの現実の量から計算
）。カップリング効率の定量はまた、別法として、ＨＰＬＣによっても実施する
ことができる（Gyongyossy-Issaら“The Covalent Coupling of Arg-Gly-Asp-Co
ntaining Peptide to Liposomes: Purification and Biochemical Function oh
the Lipopeptide" Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.353, No.1,
May1, 1998）。ＲＧＤを用いてカップリングさせたリポソームのサイズは１０
０〜１５０nmである。カップリングはカップリング効率を上昇させるために Bog
danov によって修飾することができる。カップリングはまた、Weissig によって
記載された方法に従いアンカーリピドを用いそれだけで実施することができる。
得られたリピドアンカーペプチド構築体は、リピドと同様にリポソームの製造に
使用することができる。
【００５２】 実施例２： 配列プラスミド、リポソーム、硫酸プロタミンおよびＰＥＩからなる本発明のリ
ポソームベクター複合体の製造 プラスミドは、Fischerら（Pharm.Res. 16: 1273-1279, 1999）に記載された
方法に従って製造されたＰＥＩと、または Lupasol（BASF, Ludwigshaften, Ger
many）を用いて縮合させた。
【００５３】 複合体の形成には最初に陰性に荷電した構成成分プラスミドＤＮＡ（ｐＧＩ3,
Clontech, Heidelberg, Germany）およびリポソーム（ＤＬＰＥ，ＤＯＰＳ，コ
レステロール，Ｎ−グルタリル-ＰＥ 3:3:3:1）を一緒に混合することによって
行われる。この方法では、溶液の希釈を、不可逆的沈殿の形成の防止のために考
慮すべきである。上述の全成分の最終容量は１００μLである。始めに緩衝液（
トリス１０mM，pH７.４，他の緩衝液およびpHも同様に使用できる）を導入し、
１０μgのプラスミド（１０μg／６０μL）および４０μgのリポソーム（１〜６
μg／μLで変動可能）も単純なピペッティングにより一緒に混合する。混合物を
旋回させる。ＤＮＡの縮合はついでカチオン性試薬の添加により実施し、最初に
硫酸プロタミン１９.９６μgを加える（電荷比±３.３）。このためには、硫酸
プロタミンをエッペンドルフピペットを用いてそれに急速に加え、全体を10回ピ
ペッティングしてバッチを混合し、複合体のリピドによるコーティングは２９.
７μg（１６.２μgまでの量が同様に使用できる）のＰＥＩ（Ｎ／Ｐ比 ２０.７
，７.５までの低下が可能）により達成し、ついでさらにカチオン性試薬を添加
する。このためには、３３μLのＥＰＩ溶液０.９mg／mLを２５０μLの高純度の
水で希釈し、サブ工程でバッチに加える。添加は２×１００μLおよび１×８５
μLの工程で実施し、各添加後１５分間待ってバッチ全体を１０回ピペッティン
グする。このタイプの複合体は製造１時間後１８０〜３００nmのサイズを有し、
製造後直ちに細胞培養実験に使用する。複合体は細胞培養メジウムＭ199＋１０
％ＦＣＳ中で安定であり、トランスフェクションに使用される（サイズ３６０〜
５００nm）。
【００５４】 実施例３： 配列プラスミド、リポソーム、およびＰＥＩからなる本発明のリポソームベクタ
ー複合体の製造 実施例２に記載のバッチは硫酸プロタミンなしでも製造することができる。製
造工程は硫酸プロタミン１９.９６μgを加えないほかは同じである。トランスフ
ェクション実験はほぼ同じ効率を示す。
【００５５】 実施例４： 配列プラスミド、リポソーム、融合ペプチドおよびＰＥＩからなる本発明のリポ
ソームベクター複合体の製造 複合体の形成は実施例３に記載の方法および順序に従って実施する。さらに、
「融合ペプチド」、インフルエンザウイルスの膜タンパク質に由来するヘマグル
チニン（ＨＡ，Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7934-7938, 1992;
Somes & Slepushkin, Gene Therapy 5: 955-964, 1998）を複合体形成の最初に
加え、ついで混合物を実施例３の純粋なリポソームと同様に使用する。ＨＡペプ
チドの濃度は各バッチにつき０.１〜１nmol（１〜１０μg）とすることができる
。
【００５６】 実施例５： 配列プラスミド、ＰＥＩ、リポソーム、融合ペプチドからなる本発明のリポソー
ムベクター複合体の製造 複合体の形成は、ＤＮＡのＰＥＩによる縮合によって実施する。このためには
、まず両物質をともに混合し（１回または分割、上記参照）、１５分間待つ。つ
いでリポソームをピペットで加え、混合物全体を数回（好ましくは１０回）ピペ
ッティングする。この複合体は使用前同様に１５分間放置する。トランスダクシ
ョンに必要なプラスミド、カチオン性試薬およびリポソームのリポソーム形成量
は３cmのディシュあたり５μgまで減少させることができる。さらに、処方の容
量も低下させることができる。
【００５７】 複合体の形成は最初構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合すること
によって行われる。この方法では、溶液の希釈を、不可逆的沈殿の形成の防止の
ために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量は２４５.９３μLである。始
めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.４，ほかの緩衝液およびpHも同様に使用でき
る）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μL）をそれに加える。Ｄ
ＮＡの縮合はついでカチオン性試薬、４４.５４μgのＰＥＩ（Ｎ／Ｐ比 ２０.７
，さらに大きな量および９.７９μgまでの低下は同様に使用できる）。このため
には、４９.５μLのＰＥＩ溶液０.９mg／mLを１０６.４３μLの高純度の水で希
釈し、サブ工程でバッチに加える。添加は１×１００μLおよび１×５５.９３μ
Lの工程で実施し、各添加後バッチ全体を５回ピペッティングし、最後に１００
μLの容量でバッチ全体を５回ピペッティングし、１５分間待つ。６０μgのリポ
ソーム（１〜６０μg／μLで変動させることができる）を１５μgのＨＡ融合ペ
プチド（量を０.１μgまで低下させることができる）と混合し、プラスミド／Ｐ
ＥＩ複合体に１回のピペッティングで加える。これには、添加後バッチを全体を
１００μLの容量でピペッティングする。混合物を旋回させる。類似の活性を有
する複合体が指示した全成分を単純に混合しても得られる。製造後、このタイプ
の複合体は１８０〜２５０nmのサイズを有し、製造後直ちに細胞培養実験に使用
する。複合体は、トランスフェクションに使用される細胞培養メジウムＭ199＋
１０％ＦＣＳ中で安定である（サイズ３６０〜４００nm）。
【００５８】 実施例６： 配列プラスミド、ＰＥＩ，リポソームからなる本発明のリポソームベクター複合
体の製造 リポソーム製剤はＨＡ融合ペプチドなしでも製造することができる。このため
には、上述の製造操作を使用し、ＨＡペプチドの添加のみを省略する。
【００５９】 実施例７： 配列プラスミド、ＰＥＩ、リポソーム、ＨＡペプチドは使用および使用しない容
量可変性の本発明のリポソームベクター複合体の製造 複合体の形成は最初構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合すること
によって行われる。この方法では、溶液の希釈を、不可逆的沈殿の形成の防止の
ために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量はバッチタイプに依存して、
ａ）４６５μL、ｂ）２４５.９３μL、ｃ）１９６.４μL、ｄ）１５０μL であ
る。始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの緩衝液およびpHも同様に使
用できる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μLまたは７５μL）
をそれに加える。ついでＤＮＡの縮合はカチオン性試薬、４４.５４μgのＰＥＩ
（Ｎ／Ｐ比 ２０.７，さらに大きな量および９.７９μgまでの低下が可能である
）。このためには４９.５μLのＰＥＩ溶液０.９mg／mLを高純度の水（３２５.５
，１０６.４３，５６.９，２５.５μL）で希釈して、サブ工程でバッチに添加す
る。添加は、１００μLおよび／または変動可能（５５.９，７５，１０６μL）
な工程で実施し、各添加後バッチ全体を５回ピペッティングし、最後に１００μ
Lの容量でバッチ全体を５回ピペッティングし、１５分間待つ。６０μgのリポソ
ーム（１〜６０μg／μLで変動可能）を１５μgのＨＡ融合ペプチド（量を０.１
μgまで低下させることができる）と混合する。このＨＡ融合ペプチドの添加は
任意であり、トランスフェクションに比較的大きな低下はなく省略することがで
きる。リポソームはプラスミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで加える
。これには、添加後バッチを全体を１００μLの容量でピペッティングする。混
合物を旋回させる。類似の活性を有する複合体が指示した全成分を単純に混合し
ても得られる。製造後、このタイプの複合体は１８０〜２５０nmのサイズを有し
、製造後直ちに細胞培養実験に使用する。複合体はトランスフェクションに使用
される細胞培養メジウムＭ199＋１０％ＦＣＳ中で安定である（サイズ３００〜
４００nm）。
【００６０】 実施例８： 配列プラスミド、硫酸プロタミン、ＰＥＩおよびリポソームの本発明のリポソー
ムベクター複合体の製造 複合体の形成は最初構成成分プラスミドＤＮＡと硫酸プロタミンを一緒に混合
することによって行われる。この方法では、溶液の希釈を、不可逆的沈殿の形成
の防止のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量はバッチタイプに依
存して、ａ）４６９μL、ｂ）３２０μLである。始めに緩衝液（トリス１０mM，
pH７.８，ほかの緩衝液およびpHも同様に使用できる）を導入し、１５μgのプラ
スミド（１５μg／９０μL）をそれに加える。ついで、ＤＮＡの縮合は硫酸プロ
タミン（比±３.３，さらに大きなまたは小さな量も同様に使用できる）。硫酸
プロタミンを高純度の水（２９.９４μg／１０５μL）で希釈してＤＮＡに加え
、バッチ全体を１０回ピペッティングする。複合体を１５分間放置して成熟させ
る。４９.５μLのＰＥＩ溶液０.９mg／mLを高純度の水（１０６.４３，５６.９
μL）で希釈して、サブ工程でバッチに添加する。添加は、１００μLおよび／ま
たは５５.９μL工程で実施し、各添加後バッチ全体を５回ピペッティングし、最
後に１００μLの容量でバッチ全体を５回ピペッティングし、１５分間待つ。６
０μgのリポソーム（１〜６０μg／μLで変動可能）を１５μgのＨＡ融合ペプチ
ド（量を０.１μgまで低下させることができる）と混合する。このＨＡ融合ペプ
チドの添加は任意であり、トランスフェクションに比較的大きな低下はなく省略
できる。リポソームはプラスミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで添加
する。これには、添加後バッチを全体を１００μLの容量でピペッティングする
。混合物を旋回させる。製造後、このタイプの複合体は１８０〜３００nmのサイ
ズを有し、製造後直ちに細胞培養実験に使用される。複合体はトランスフェクシ
ョンに使用される細胞培養メジウムＭ199＋１０％ＦＣＳ中で安定である（サイ
ズ３００〜４００nm）。これらの複合体は他の電荷比でも製造することが可能で
あり、ＰＳおよびＰＥＩの両比率を変えることができる。この場合、より大きい
または小さい容量も同様に選択できる。
【００６１】 実施例９： 配列プラスミド、硫酸プロタミン、ＰＥＩおよびリポソームからなりＰＥＩ含量
を低下させた本発明のリポソームベクター複合体の製造 複合体の形成は、最初に構成成分プラスミドＤＮＡと硫酸プロタミンを一緒に
混合することによって行われる。この方法では、溶液の希釈を、不可逆的沈殿の
形成の防止のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量はバッチタイプ
に依存して約３１９μLである。始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの
緩衝液およびpHも同様に使用できる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg
／９０μL）を加える。ついで、ＤＮＡの縮合は硫酸プロタミン（比±３.３，さ
らに大きなまたは小さな量も同様に使用できる）の添加によって行われる。硫酸
プロタミンを高純度の水（２９.９４μg／１０５μL）で希釈してＤＮＡに加え
、バッチを全体的に１０回ピペッティングする。複合体を１５分間放置し成熟さ
せる。３０μL（Ｎ／Ｐ比 １２.５）または１８μL（Ｎ／Ｐ比 ７.５）のＰＥＩ
溶液０.９mg／mLを高純度の水（７６または８８μL）１０６μLで希釈して、サ
ブ工程でバッチに添加する。添加は、１０６μL工程で実施し、添加後バッチ全
体を１０回ピペッティングし、１５分間待つ。６０μgのリポソーム（１〜６０
μg／μLで変動可能）を１５μgのＨＡ融合ペプチド（量を０.１μgまで低下さ
せることができる）と混合する。このＨＡ融合ペプチドの添加は任意であり、ト
ランスフェクションに比較的大きな低下はなく省略できる。リポソームはプラス
ミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで添加する。これには、添加後バッ
チを全体を１００μLの容量でピペッティングする。混合物を旋回させる。類似
の活性を有する複合体が指示した全成分を単純に混合しても得られる。
【００６２】 実施例１０： 配列プラスミド、ＰＥＩ、硫酸プロタミンおよびリポソームの本発明のリポソー
ムベクター複合体の製造 複合体の形成は、最初に構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合する
ことによって行われる。この方法では、溶液の希釈を不可逆的沈殿の形成の防止
のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量はバッチタイプに依存して
約２４６μLである。始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの緩衝液およ
びpHも同様に使用できる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μL
）をそれに加える。ついで、ＤＮＡの縮合はＮＩＰ（Ｎ／Ｐ比 ２０.７，さらに
大きな量も原料も可能である）。これには、４９.５μLのＰＥＩ溶液０.９mg／m
Lを高純度の水（１５５.９３μL）で希釈して、サブ工程でバッチに添加する。
添加は、１０６μLおよび５５.９μL工程で実施し、添加後バッチ全体をそれぞ
れ５回ピペッティングし、最後に１００μLの容量において５回ピペッティング
し５分間待つ。硫酸プロタミン（比±３.３，さらに大きなまたは小さな量も同
様に使用できる）をついで添加する。硫酸プロタミンを高純度の水（２９.９４
μg／１０５μL）で希釈してＤＮＡに加え、バッチを全体的に１０回ピペッティ
ングする。複合体を１５分間放置し成熟させる。６０μgのリポソーム（１〜６
０μg／μLで変動可能）を１５μgのＨＡ融合ペプチド（量を０.１μgまで低下
させることができる）と混合する。このＨＡ融合ペプチドの添加は任意であり、
トランスフェクションに比較的大きな低下はなく省略できる。リポソームはプラ
スミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで添加する。これには、添加後バ
ッチを全体を１００μLの容量でピペッティングする。混合物を旋回させる。類
似の活性を有する複合体が指示した全成分を単純に混合しても得られる。
【００６３】 実施例１１： 配列プラスミド、ＰＥＩ、硫酸プロタミンおよびリポソームからなり、ＰＥＩ含
量を低下させた本発明のリポソームベクター複合体の製造 複合体の形成は、最初に構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合する
ことによって行われる。この方法では、溶液の希釈を不可逆的沈殿の形成の防止
のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量はバッチタイプに依存して
約１９６μLである。始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの緩衝液およ
びpHも同様に使用できる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μL
）を加える。ついで、ＤＮＡの縮合はＲＥＩ（Ｎ／Ｐ比 ４.５，７.５，１２.５
，さらに大きな量も減量も可能である。たとえばＮＰ比 １.８）。これには、１
０.８６μL、１８μLまたは３０μLのＰＥＩ溶液０.９mg／mLを高純度の水（１
０６μLに）で希釈して、バッチに添加し、全体を１０回ピペッティングする。
硫酸プロタミン（比±３.３，さらに大きなまたは小さな量も同様に使用できる
）をついで添加する。硫酸プロタミンを高純度の水（２９.９４μg／１０５μL
）で希釈してＤＮＡ／ＰＥＩ複合体に加え、バッチを全体的に１０回ピペッティ
ングする。複合体を１５分間放置し成熟させる。６０μgのリポソーム（１〜６
０μg／μLで変動可能）を １５μgのＨＡ融合ペプチド（量を０.１μgまで低
下させることができる）と混合する。このＨＡ融合ペプチドの添加は任意であり
、トランスフェクションに比較的大きな低下はなく省略できる。リポソームはプ
ラスミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで添加する。これには、添加後
バッチを全体を１００μLの容量でピペッティングする。混合物を旋回させる。
類似の活性を有する複合体が指示した全成分を単純に混合しても得られる。
【００６４】 実施例１２： 配列プラスミド、ＰＥＩおよびリポソームからなり、リピド含量を増加または低
下させた本発明のリポソームベクター複合体の製造 複合体の形成は、最初に構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合する
ことによって行われる。この方法では、溶液の希釈を不可逆的沈殿の形成の防止
のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量は２４５.９３μLである。
始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの緩衝液およびpHも同様に使用で
きる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μL）をそれに加える。
ついで、ＤＮＡの縮合はカチオン性試薬４４.５５μg ＰＥＩ（Ｎ／Ｐ比 ２０.
７，さらに大きな量も減量も可能である）。これには、４９.５μLのＰＥＩ溶液
０.９mg／mLを高純度の水１０６.４３μLで希釈して、バッチにサブ工程で添
加する。添加は１×１００μLおよび１×５５.９３μL工程で実施し、各添加後
バッチ全体を５回ピペッティングし、最後に１００μLの容量でバッチ全体を５
回ピペッティングし、１５分間待つ。７５、４５および３０μgのリポソーム（
１〜６０μg／μLで変動可能）をプラスミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティ
ングで添加する。これには、添加後バッチを全体を１００μLの容量でピペッテ
ィングする。使用したリポソームの含量はさらに１０倍量に著しく増大させるこ
とができる。
【００６５】 実施例１３： 様々な細胞培養中における本発明のリポソームベクター複合体の生物学的試験 複合体の形成は、最初に構成成分プラスミドＤＮＡとＰＥＩを一緒に混合する
ことによって行われる。この方法では、溶液の希釈を不可逆的沈殿の形成の防止
のために考慮すべきである。上述の２成分の最終容量は２４５.９３μLである。
始めに緩衝液（トリス１０mM，pH７.８，ほかの緩衝液およびpHも同様に使用で
きる）を導入し、１５μgのプラスミド（１５μg／９０μL）をそれに加える。
ついで、ＤＮＡの縮合はカチオン性試薬、４４.５５μgのＰＥＩ（Ｎ／Ｐ比 ２
０.７，さらに大量または減量も可能）の添加により行う。これには、４９.５μ
LのＰＥＩ溶液０.９mg／mLを高純度の水１０６.４３μLで希釈し、バッチにサブ
工程で添加する。添加は１×１００μLおよび１×５５.９３μL工程で実施し、
添加後バッチ全体を５回ピペッティングし、最後に１００μLの容量でバッチ全
体を５回ピペッティングし、１５分間待つ。６０μgのリポソーム（１〜６０μg
／μLで変動可能）をカップリングしたＲＧＤ（ＲＧＤはαVβ3に結合する）を
加えまたは加えないで、プラスミド／ＰＥＩ複合体に１回のピペッティングで添
加する。これには、添加後バッチ全体を１００μLの容量でピペッティングする
。バッチを３つのアリコートに分割し、１つのアリコートにそれぞれ３cmのディ
ッシュに加える。ＦＡＣＳ分析のためには、三重のバッチを１０cmのディッシュ
に加えた。実施例１〜１１に調製したリポソームベクター複合体は細胞（ＦＡＣ
Ｓ分析のためには１０cmのディッシュ中、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ顕微鏡の
ためには３cmのディッシュ中）に加え、３７℃で１〜６時間インキュベートした
。ついで細胞を洗浄し、新鮮な細胞培養メジウム中でさらに２４〜４８時間イン
キュベートした。連続的な細胞への複合体の吸収、転写およびＧＦＰ自動蛍光、
ルシフェラーゼ分析およびＦＡＣＳ分析の検出によるプラスミド中レポーター遺
伝子の発現をついで測定した。ＦＡＣＳ分析の結果は以下の表に示す通りである
。
【００６６】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ６１Ｋ 47/34 47/42 47/42 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アールフレト・ファー ドイツ連邦共和国デー−35091ケルベ／マ ールブルク．ハインリッヒ−ハイネ−シュ トラーセ27ベー Ｆターム(参考） 4C076 AA19 AA24 CC26 CC27 CC35 DD63 EE13 EE41 FF68 4C084 AA13 MA05 MA13 MA24 NA10 NA13 ZB26 ZB33 4C086 EA16 MA05 MA13 MA24 NA10 ZB26 ZB33

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の成分： ａ) 任意所望の長さの核酸配列 ｂ) 成分ａ）を濃縮し、リソソーム分解性および／またはリソソーム向性であ
    るカチオン性担体 ｃ) リポソームを形成するリピドおよびリン脂質 ｄ) 標的細胞に対する結合部位を有する任意のリガンド ｅ) 成分ｂ）のリソソーム分解性および／またはリソソーム向性機能を置換で
    きる任意の融合誘導物質 からなり、融合誘導物質（ｅ）の存在下にはカチオン性担体（ｂ）はリソソーム
    分解性および／またはリソソーム向性であってはならない、リポソームベクター
    複合体。
  2. 【請求項２】 成分ａ）はポリ核酸である請求項１記載のリポソームベクタ
    ー複合体。
  3. 【請求項３】 成分ｂ）はカチオン性タンパク質である請求項１または２記
    載のリポソームベクター複合体。
  4. 【請求項４】 カチオン性タンパク質はリソソーム分解性ではなく、硫酸プ
    ロタミンからなる群より選択される請求項３記載のリポソームベクター複合体。
  5. 【請求項５】 成分ｂ）はカチオン性ポリマーである請求項１記載のリポソ
    ームベクター複合体。
  6. 【請求項６】 カチオン性ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である
    請求項５記載のリポソームベクター複合体。
  7. 【請求項７】 ＰＥＩは平均２,０００〜１０,０００Daの分子量を有する請
    求項６記載のリポソームベクター複合体。
  8. 【請求項８】 ＰＥＩは高分岐鎖である請求項６記載のリポソームベクター
    複合体。
  9. 【請求項９】 ＰＥＩは低分岐鎖である請求項６記載のリポソームベクター
    複合体。
  10. 【請求項１０】 ＰＥＩが追加的に存在する請求項４記載のリポソームベク
    ター複合体。
  11. 【請求項１１】 成分ｃ）はホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノ
    ールアミン、ホスファチジルコリン、アンカーリピドおよびコレステロールから
    構成される請求項１記載のリポソームベクター複合体。
  12. 【請求項１２】 アンカーリピドはＮ−カルボキシホスファチジルエタノー
    ルアミンである請求項１１記載のリポソームベクター複合体。
  13. 【請求項１３】 アンカーリピドはＮ-グルタリルホスファチジルエタノー
    ルアミンである請求項１２記載のリポソームベクター複合体。
  14. 【請求項１４】 成分ｄ）は成分ａ）〜ｃ）の一つにアンカーなしでアンカ
    ーまたは請求項１２または１３に記載のアンカーリピドを介して接合している請
    求項１記載のリポソームベクター複合体。
  15. 【請求項１５】 成分ｄ）は非共有結合的にリポソーム表面に包埋されてい
    る請求項１記載のリポソームベクター複合体。
  16. 【請求項１６】 標的細胞は、組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、血液細胞、
    白血病細胞または腫瘍細胞である請求項１〜１５のいずれかに記載のリポソーム
    ベクター複合体。
  17. 【請求項１７】 成分ｅ）はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのサ
    ブユニットＨＡ−２の機能性配列またはその合成誘導体である請求項１記載のリ
    ポソームベクター複合体。
  18. 【請求項１８】 インビトロにおける細胞のトランスダクションもしくはト
    ランスフェクションのための請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベク
    ター複合体の使用。
  19. 【請求項１９】 血清の存在下における請求項１８記載の使用。
  20. 【請求項２０】 インビボにおける細胞のトランスダクションまたはトラン
    スフェクションのための請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター
    複合体の使用。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター複
    合体からなる細胞。
  22. 【請求項２２】 インビトロまたはインビボにおいて使用する診断薬の製造
    のための請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター複合体または請
    求項２１記載の細胞の使用。
  23. 【請求項２３】 インビボおよびエキソビボにおける疾患の予防または治療
    用の治療薬の製造のための請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクタ
    ー複合体または請求項２１記載の細胞の使用。
  24. 【請求項２４】 皮膚、粘膜、肺内、眼上、生体腔部内、結合組織内、筋肉
    内、臓器内または血液循環内に投与するための請求項２３記載のリポソームベク
    ター複合体の使用。
  25. 【請求項２５】 (１) 請求項１記載の成分ａ）を請求項１記載の成分ｂ）
    と混合し、 (２) 工程（１）から得られた複合体を請求項１記載の成分ｃ）に、すべての
    成分の混合比は得られた全体的複合体の正味電荷が好ましくはカチオン性または
    アニオン性になるように調整して挿入し、 (３) 請求項１記載の任意成分ｄ）を複合体形成の前または後に成分ｃ）内に
    挿入し、 (４) 請求項１記載の任意成分ｅ）を複合体の形成前に、工程（２）および（
    ３）から生じた複合体または成分ｃ）中に挿入する、 請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター複合体の製造方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター複
    合体の製造方法において、得られた生成物を凍結乾燥する方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームベクター複
    合体の製造方法において、得られた生成物をエアゾル化する方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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PT103865A (pt) * 2007-10-25 2009-05-15 Univ De Coimbra Nano-transportadores de base lipídica para entrega direccionada de vectores virais e processo para a sua produção
CN101270168B (zh) * 2008-05-13 2011-06-22 中国药科大学 透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、制备方法及其作为基因载体的应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
FR2739292B1 (fr) * 1995-09-28 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations
EP0784984B1 (en) * 1996-01-17 2003-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Transfection competent molecules
EP0979311A1 (en) * 1997-04-30 2000-02-16 Of The University Of Minnesota Regents $i(IN VIVO) USE OF RECOMBINAGENIC OLIGONUCLEOBASES TO CORRECT GENETIC LESIONS IN HEPATOCYTES
CA2327367A1 (en) * 1998-04-07 1999-10-14 Roche Diagnostics Gmbh New compounds for dna-transfection
WO2000003683A2 (en) * 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes

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