JPH09510433A

JPH09510433A - 生物学的に活性な物質を細胞に送達する方法

Info

Publication number: JPH09510433A
Application number: JP7516980A
Authority: JP
Inventors: エフ．エイチ．ウォラック，ドナルド; バラネリー，キャロル
Original assignee: マイクロパックインコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1997-10-21
Also published as: CA2177695C; AU1438395A; WO1995016437A1; EP0734251A1; CA2177695A1; US5665380A; AU680996B2; EP0734251B1; DE69435244D1

Abstract

(57)【要約】生物学的に活性な物質を細胞に伝達する方法を提供する。この方法は、伝達すべき物質を、細胞との融合に際して細胞を溶解させない少ラメラ非リン脂質キャリアー小胞に封入し、そのキャリアー小胞を細胞に最も近い位置に送達し、そのキャリアー小胞の非リン脂質二重層をその細胞の膜と融合させて、封入した物質をその細胞中に拡散させることを含む。この方法を用いて、様々な生物学的に活性な物質を、イン・ビトロ又はイン・ビボで細胞に伝達することができる。この方法は、生物学的に活性な物質を、直接、細胞の細胞質に伝達するための手段を提供する。細胞との融合に際して、非リン脂質小胞の二重層と結合した物質は、細胞の外膜中に取り込まれる。従って、二重層に結合した物質を細胞に伝達する方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的に活性な物質を細胞に送達する方法発明の背景本発明は、生物学的に活性な物質を細胞に送達する方法を特徴とする。特に、本発明は、生物学的に活性な物質を非リン脂質小胞に封入し、その小胞を細胞に送達し、その小胞と細胞とを融合させて生物学的に活性な物質を細胞内に拡散させ、それにより、生物学的に活性な物質を細胞内に送達する方法を特徴とする。この脂質小胞は、封入された物質を、細胞外不活性化から保護し、標的細胞の外膜に融合することにより、封入された物質を直接その細胞の細胞質中に送達する。この細胞との融合において、非リン脂質小胞の二重層と結合した物質は直接標的細胞膜中に取込まれる。従って、本発明は又、二重層に結合した物質を細胞に送達する方法をも特徴とする。生物学的に活性な物質の細胞への送達は、広範囲の治療の必須要素である。かかる治療は、細胞に必要な酵素活性を有する蛋白質を供給すること、新規なＤＮＡ分子を細胞に供給すること（遺伝子治療）、患者を外来蛋白質に対して免疫にすること（ワクチン接種）、蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより患者をその蛋白質に対して免疫にすること（遺伝子ワクチン接種）及び細胞における蛋白質の産生を、その細胞に、その蛋白質をコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスである核酸分子を与えるか或はその蛋白質をコードするｍＲＮＡを邪魔することによって阻止することを含む。生物学的に活性な物質の細胞への導入が、しばしば、望ましいのであるが、これを達成するためには克服すべき幾つかの障害がある。生物学的に活性な物質の細胞への送達は、物質を、その活性を維持しつつ且つ標的細胞にダメージを与えずに、細胞の外側から細胞の内側へ運ぶことを含む。細胞の外膜の多くを構成するリン詣質二重層は、物質の細胞中への無差別の侵入を阻止する。ある種の疎水性分子が、外膜を通って受動的に細胞質中へ拡散し得ても、細胞と出会った殆どの物質は、その細胞内に自由に入ることはできない。細胞膜を通る「チャネル」を形成するトランスポーター蛋白質は、ある種の特定の分子（通常、小分子）の細胞内への通過を与える（例えば、イオンチャネル）。細胞は又、特定のリガンドと結合してそれらの細胞内への侵入を与える表面レセプター（一般に、膜内在性蛋白質の形態である）を発現する。特定の細胞表面レセプターに結合した分子は、一般に、レセプター媒介のエンドサイトーシスにより細胞に入る。他の細胞外物質は、非特異的エンドサイトーシス（例えば、ピノサイトーシス）によって、細胞により取込まれ得る。しかしながら、エンドサイトーシス経路により細胞に入る物質は、一般に、分解酵素を含むリソソーム小胞に合体する。それ故、このルートで細胞に入る物質は、しばしば、破壊され又は修飾される。更に、物質は、細胞に入る前に破壊され得る。体内においては、細胞外物質は、それらが何らかの方法で保護されていないならば、多くの異なる機構による不活性化及び／又は分解にさらされている。生物学的に活性な物質を細胞内に取込むための様々なアプローチが為されたが、それらのアプローチの殆どは、運ぶことのできる型の物質に限る等の制限を受け、これはそれらの有用性を制限している。例えば、核酸例えばＤＮＡを、多くのトランスフェクション技術によって細胞内に導入することができ、その多くは、細胞膜を化学的に（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション）又は電気的に（例えば、エレクトロポレーション）かき乱す。化学媒介のトランスフェクション技術の幾つか（ＤＮＡがカチオン性脂質と複合体を形成するリポフェクション等）は、恐らく、ＤＮＡのエンドサイトーシスによる取込みを含むのであろう。これらの技術は核酸を細胞に導入するのに有用であるが、それらは、多くの他の型の物質に適用できない。細胞に物質を送達するための多くの公知のアプローチの他の制限は、それらがイン・ビボ状況で適用できず、それ故、標的細胞がイン・ビトロで利用可能であることを必要としていることである。例えば、多くの上記のＤＮＡトランスフェクション技術は、イン・ビトロでは有用であるが、イン・ビボ状況に転用することはできない。他の型の技術であるマイクロインジェクションを用いて種々の型の物質を細胞質中に導入することができるが、これは技術的に単調で退屈であり且つ改変し得る幾つかの細胞に限られている。他のアプローチは、ウイルス例えばレトロウイルスを使用して物質を細胞に導入することを含む。ウイルス媒介のトランスファーは、イン・ビボで実施することができるが、それは、主としてＤＮＡを細胞に導入するために有用であり、他の型の物質については有用ではないであろうし、又、ＤＮＡについてさえも、能力が限られている（例えば、トランスファーし得るＤＮＡの長さにおける制限）。イン・ビボにおける物質の細胞への伝達を可能にする技術は限られており且つ通常望まれる特定の細胞を標的として物質を送達することを可能にしないであろうから、物質の大規模な系統的投与の要求へと導く。種々の生物学的に活性な物質の細胞への伝達をイン・ビボ又はイン・ビトロで可能にする送達システムは、送達前の細胞外及び送達後の細胞内の両方において物質を不活性化から保護し、特定の細胞を標的として物質を送達することのできるものが多くの治療応用に非常に望ましい。かかるシステムの開発における一つのアプローチは、生物学的に活性な物質を運び且つ保護し、必要ならば標的を定めて送達することができ、その物質の細胞内への侵入を媒介することのできるキャリアービヒクルをデザインすることである。物質の細胞への送達のための可能なキャリアービヒクルは、脂質小胞である。脂質小胞は、脂質が脂質二重層の形態に組織された高脂質含量を有する物質から作られた実質的に球形の構造である。単ラメラ小胞は、水性容積を封入することのできる不定形の中央空隙を囲む単一の脂質二重層を有する。単ラメラ小胞は、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ；約１ｍより大きい直径）又は小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ；約０．２ｍより小さい直径）の何れかとして製造することができる。多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）は、脂質二重層の多くのタマネギ様の殻を有する。それらの高脂質含量の故に、ＭＬＶは、ある種の小さい親油性分子を運ぶための用途を有するが、水性物質に対しては低い運搬容量を有する。少ラメラ小胞（ＰＬＶ）は、脂質二重層を含まない中央空隙を囲む水性層により分離された実質的に球形の殻の形状に配置された約２〜１０の二重層を有する。ＰＬＶは、水性及び疎水性物質の両者を封入することができ、それ故、多種類の物質を運ぶことができる。リン脂質及び／又は糖脂質の単一二重層からなる単ラメラ小胞は、リン脂質が細胞外膜を含む天然の膜の一次構造成分であるので、細胞膜構造のモデリングのために最も普通に用いられる脂質小胞である。リン脂質小胞は、生物学的に活性な物質を細胞に送達するためのキャリアービヒクルとして用いられてきた。しかしながら、かかる小胞は、細胞の外膜と融合せず、むしろ、一般に、エンドサイトーシスにより細胞に取込まれてリソソーム分解経路に入る。次いで、この脂質小胞により運ばれた生物学的に活性な物質は、リソソームの酵素によって破壊される。この運命を回避するリン脂質小胞を構築する試みが為されてきた。リソソーム経路を回避するために用いられた方法は、エンドソームの酸性環境においてエンドソーム膜と融合し、それにより、それらの内容物をリソソームの酵素にさらされる前に放出するｐＨ感受性リポソームの使用、及びウイルス性融合蛋白質をリン脂質小胞に取込ませて小胞と細胞外膜との融合を促進し、それにより、小胞のエンドサイトーシスを回避することを含む。リン脂質小胞の媒介による物質のトランスファーの総説は、Mannino,R.J.及びGould-Fogerite， S.，BioTechniques，6:682(1988); Litzinger，D.C.及びHuang，L.，Biochim．e t Biophys．Acta，1113:201(1992)を参照されたい。生物学的に活性な物質の細胞への送達のためのキャリアービヒクルとしてのリン脂質小胞の使用は、封入した物質のリソソームでの破壊を回避するように小胞を操作する必要性により制限される。更に、リン脂質小胞は、製造するのに高価であり得て、イン・ビトロで不安定であり、且つイン・ビボのホスホリパーゼの活性のためにイン・ビボで長期間安定でいられない。生物学的に活性な物質の送達のための別のキャリアービヒクルは、少ラメラ非リン脂質小胞である。少ラメラ非リン脂質小胞の利点は、それらがリン脂質小胞よりも製造するのが安価であり、イン・ビボでリン脂質小胞よりも一層安定であり、且つ封入する物質に対する大きい運搬容量を有することを含む。今や、ある種の少ラメラ非リン脂質小胞が細胞と接触した場合には、それらが細胞の溶解を引き起こさず且つエンドサイトーシスによっては細胞に取込まれず、むしろ細胞の外膜と融合することが発見されている。従って、エンドサイトーシス経路に導かれ最終的にリソソーム経路に導かれることなく、少ラメラ非リン脂質小胞により運ばれる物質は、細胞の細胞質に直接導入される。更に、融合に際して、この小胞の非リン脂質二重層は、細胞の外膜に取込まれる。従って、この発明の目的は、生物学的に活性な物質を非リン脂質小胞キャリアーを用いて細胞に伝達する方法を提供することである。この発明の他の目的は、生物学的に活性な物質を、非リン脂質小胞キャリアーを用いて、哺乳動物のイン・ビボの細胞に伝達する方法を提供することである。この発明の更なる目的は、生物学的に活性な物質を、その物質を運ぶ非リン脂質小胞と細胞外膜との融合により直接細胞質に送達する方法を提供することである。この発明の更なる目的は、非リン脂質小胞の二重層と結合した物質を、その非リン脂質小胞と細胞外膜との融合によって細胞のリン脂質外膜に送達する方法を提供することである。この発明のこれらの及び他の目的及び特徴は、後述の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。発明の要約本発明は、生物学的に活性な物質を、イン・ビボ又はイン・ビトロで、細胞に伝達する方法を特徴とする。生物学的に活性な物質を非リン脂質小胞中に封入し、その小胞を細胞と接触させ、その小胞を細胞の外膜と融合させて生物学的に活性な物質を細胞中に拡散させ、それにより、小胞中に封入した物質を細胞に送達する。この発明は、少なくとも部分的に、ある種の非リン脂質小胞は、細胞のすぐ近くの位置に置かれたときに、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ又は細胞の溶解を引き起こすよりはむしろ細胞の外膜と融合するという発見に基づいている。細胞との融合に際して、小胞に封入された物質は、細胞中に自由に拡散する。この発明の方法は、小胞に封入された物質を活性な形態で細胞の細胞質に直接送達する手段を提供する。更に、非リン脂質小胞と細胞との融合は、小胞の二重層に結合した物質の細胞外膜へのトランスファーを生じる。生物学的に活性な物質を細胞に伝達する方法は、物質を脂質小胞中に封入する初期工程を有する。この小胞は、１）その物質を細胞への送達の前に細胞外不活性化から保護し、２）その物質を細胞に運び、そして３）その物質を細胞外膜との融合により細胞内に送達するように機能する。この発明で使用する脂質小胞の二重層の一次構造脂質は、非リン脂質である。これらの小胞は、約２〜１０の脂質二重層を有する少ラメラ小胞であり、それらは、水性及び疎水性物質の両者に対する大きい運搬容量を提供し且つ単ラメラ小胞よりも一層安定である。これらの小胞の製造方法及びこれらの小胞それ自体は、米国特許第４，９１１，９２８号、米国特許第５，１４７，７２３号、米国特許第５，０３２，４５７号、米国特許４，８９５，４５２号及び米国特許第５，２６０，０６５号に一層詳細に記載されており、その開示をすべて本明細書中に参考として援用する。この発明の非リン脂質小胞は、非リン脂質物質が細胞との接触に際して細胞を溶解させることなく細胞と融合する小胞を形成するという特性を有する。これらの小胞で用いるのに好ましい非リン脂質物質は、式：R-CO(C₂H₄O)_nH（式中、ｎは２〜４であり、Ｒはセチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレオイルアルコール又はこれらの誘導体よりなる群から選択する炭化水素鎖である）を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルを含む。非リン脂質壁形成物質に加えて、これらの小胞は、ステロール例えばコレステロール、コレステロールに基づく塩又はエステル、フィトコレステロール又はヒドロコーチゾンを含むことができる。電荷生成剤も又、この小胞に加えることができる。好適な電荷生成剤は、ジセチルホスフェート、コレステロールヘミスクシネート及びオレイン酸等の負電荷を生成するものである。正に帯電した小胞は好ましくない。水性溶液に可溶性の生物学的に活性な物質を、非リン脂質小胞の内部水性空間に、その小胞の製造中に封入することができる。この非リン脂質を任意のステロール又は他の親油性添加剤と一緒にブレンドして液体脂質相を形成する。水相は、通常、脂質を水和するために用いられる水和用液体例えば水、塩溶液又は任意の他の水溶液及び小胞に取り込まれるべき水溶性物質を加熱することにより形成する。これらの水相及び脂質相を、次いで、「剪断混合」条件下でブレンドして小胞を形成する。剪断混合は、脂質を水和するのに十分な混合を与え且つ脂質小胞を形成する乱流又は剪断条件下で親油相を水相と混合することとして定義される。剪断混合は、合わせた相についての直径１ｍｍのオリフィスを通る約５〜３０ｍ／ｓの相対的流速に実質的に等しい液体剪断により達成される。小胞は、手作業で作ることができ、又は米国特許第４，８９５，４５２号に記載されたような小胞製造装置を使用して作ることができる。水性溶液に可溶性であり、従って、水相に加えることのできる好適な生物学的に活性な物質には、核酸例えばＲＮＡ及びＤＮＡ並びにそれらの断片（例えば、オリゴヌクレオチド、リボザイム）及び誘導体、蛋白質並びにそれらの断片（例えば、ペプチド）及び誘導体、酵素、酵素の基質及び親水性の薬剤が含まれる。疎水性（即ち、水不混和性）である生物学的に活性な物質も又、非リン脂質小胞に封入することができる。油充填した小胞例えば水不混和性の油性物質で満たした中央空隙を有する小胞を、米国特許第４，９１１，９２８号に開示された「ホットローディング」技術又は米国特許第５，１６０，６６９号に開示された「コールドローディング」技術の何れかを用いて形成することができ、該特許の開示も又、本明細書中に参考として援用する。好適な疎水性の生物学的に活性な物質には、ステロイド及び他のホルモン、脂溶性ビタミン並びに疎水性の薬剤が含まれる。小胞形成及び生物学的に活性な物質の封入の後に、その小胞をその物質を送達すべき細胞に最も近い位置に置く。その細胞は、培養培地中の細胞のようにイン・ビトロであってよく、又は哺乳動物中の細胞のようにイン・ビボの細胞であってよい。イン・ビトロでは、この小胞を、この細胞を含む培養培地又は他の溶液に加えることができる。イン・ビボでは、この小胞を、例えば静脈、鼻腔、筋肉、皮下、経皮、気管又は局所投与により導入することができる。これらの小胞を、スプレー、クリーム、ゲル又は他の溶液中に取り込ませて、特定の経路によるそれらの投与を助成することができる。更に、小胞を特定の細胞型に向けるターゲティング分子を脂質小胞に取り込むことができる。例えば、細胞膜レセプターに結合する抗体、ウイルス蛋白質又はリガンドを脂質小胞に結合することができる。結合は、例えば、米国特許第５，０００，９６０号に開示された方法によって達成することができ、その開示を本明細書中に参考として援用する。ターゲッティング分子を含む小胞を細胞に最も近い位置に置いてターゲッティング分子に細胞を捜させ、それにより、その小胞をその細胞に向けさせる。ターゲッティング分子が標的細胞に結合する際に、これらの小胞は、標的細胞の外膜と融合し、それにより、封入された物質を細胞に送達する。物質を伝達するのに用いる脂質小胞の組成及び濃度は、小胞の融合化活性が未だ細胞を溶解させる程には大きくないうちに、小胞が封入した物質を送達すべき細胞の外膜と融合するようなものである。融合に際して、小胞の脂質二重相は、細胞の外膜の脂質二重層中に取り込まれ、封入された物質は、小胞から拡散により細胞に送達されて細胞質に送達される。こうして、この発明の方法は、封入した物質を直接細胞質に送達し、それにより、物質が分解性のリソソーム経路にさらされるのを回避する手段を提供し、更に、小胞の脂質二重層と結合した物質（例えば、非リン脂質自体及び任意の他の取り込んだ物質）を細胞の外膜に送達する手段を提供する。この発明の方法は、広範囲の治療応用に有用である。生物学的に活性な物質を細胞に伝達してその細胞における活性を刺激することができる。例えば、機能性蛋白質又は機能性蛋白質をコードする遺伝子を、その蛋白質が減少し又は不在の細胞に送達し、それにより、その細胞において、その蛋白質により媒介される機能的活性を刺激することができる。或は、生物学的に活性な物質を細胞に伝達してその細胞における活性を阻止することができる。例えば、アンチセンス核酸又はリボザイムを細胞に送達してｍＲＮＡの機能性蛋白質への翻訳を阻止し、それにより、その細胞におけるその蛋白質により媒介される機能的活性を阻止することができる。図面の簡単な説明図１は、非リン脂質小胞との融合後の赤血球の凍結破断電子顕微鏡写真である。禿げた領域は、融合の際に非リン脂質小胞により赤血球膜中に挿入された膜物質を表している。倍率＝×６３，０００発明の詳細な説明本発明は、生物学的に活性な物質を細胞に伝達する方法に関係する。この方法は、伝達すべき物質を封入した少ラメラ非リン脂質小胞のレシピエント細胞の外膜との融合に基づいている。非リン脂質小胞のリン脂質細胞膜への融合は、細胞膜のリン脂質とこれらの小胞で用いた非リン脂質の性質には大きな差異があるので、予想外の発見である。非リン脂質小胞で用いた単一炭素鎖と比べて、リン脂質は、２炭素鎖構造を有する。この発明の方法は、１）伝達すべき物質を少ラメラ非リン脂質小胞に封入し、２）その物質を運ぶ小胞を細胞に最も近い位置に送達し、３）その小胞を細胞と融合させ、そして４）その物質を細胞中に拡散させる工程を含む。生物学的に活性な物質を細胞に送達するのに用いた小胞は、該生物学的に活性な物質を封入する約２〜１０の脂質二重層を有する少ラメラ小胞である。非リン脂質物質が、これらの二重層における一次構造脂質である。この非リン脂質物質は、細胞と接触した際に細胞を溶解させることなく細胞と融合する小胞を形成するという特性を有する。この小胞の二重層中の一次構造脂質としての使用に好適な非リン脂質物質は、式：R-CO(C₂H₄O)_nH（式中、ｎは２〜４に及び、Ｒは、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレオイルアルコール並びにこれらの誘導体よりなる群から選択する炭化水素鎖である）を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルよりなる群から選択する。この小胞の二重層は、更に、ステロール例えばコレステロール、コレステロールに基づく塩又はエステル、フィトコレステロール又はヒドロコーチゾンを含むことができる。この小胞の二重層は、更に、負の電荷生成剤例えばジセチルホスフェート、コレステロールヘミスクシネート及びオレイン酸を含むことができる。この小胞の二重層は、更に、リン脂質を含むことができる。多くの異なる型の生物学的に活性な物質を、細胞に送達することができる。用語「生物学的に活性な物質」は、それら自身が細胞に機能的活性を与える物質及び細胞内の内在性の機能的活性を刺激し又は阻止する物質を含むことを意図するものである。この物質の機能的活性は、その細胞への送達において維持される。非リン脂質小胞キャリアーを用いて、水性物質又は疎水性物質の何れかを送達することができる。送達することのできる親水性物質の例には、ペプチドホルモン例えばインシュリン、カルシトニン及びグルカゴン、視床下部ペプチド、下垂体ホルモン、成長因子例えば血管成長因子、上皮成長因子及び表皮成長因子、リンホカイン例えばインターロイキン及びインターフェロン、並びに血中蛋白質例えばヘモグロビン及び因子VIIIを含む蛋白質並びにその断片（例えば、ペプチド断片）及び誘導体；核酸例えば断片（例えば、オリゴヌクレオチド）及び誘導体を含むＤＮＡ及びＲＮＡ；抗癌剤、免疫抑制剤、駆虫剤及び抗生物質を含む水溶性薬剤；酵素；酵素の基質；並びに細胞を標識する物質例えば蛍光色素、放射性ヌクレオチド及び放射線診断及びＮＭＲ診断用のコントラスト剤が含まれる。封入し得る疎水性物質の例には、ホルモン例えばステロイド；親油性ビタミン；疎水性薬剤例えばシクロスポリンＡ；フェロモン；ポルフィリン並びに有機農薬及び殺菌剤が含まれる。脂質小胞に封入し得る薬剤の型の一層完全な目録は、Gregoriadi s，G.,編Liposome Technology(CRC，Boca Raton，Fla)，Vol.1-3(1984)に含まれている。好適な型の蛋白質は、必要な酵素活性を細胞に供給することのできる酵素である。好適な型の核酸は、細胞に供給すべき蛋白質をコードする遺伝子を、その遺伝子がｍＲＮＡに転写され且つｍＲＮＡが蛋白質に翻訳され、それにより、その蛋白質が細胞に供給されるような形態で含むＤＮＡ分子である。他の好適な型の核酸は、アンチセンス核酸例えば細胞中のｍＲＮＡに相補的であってそのｍＲＮＡに結合することによってそのｍＲＮＡの翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドである。更に他の好適な型の核酸は、細胞内の標的ｍＲＮＡを破壊することのできる触媒ＲＮＡ分子であるリボザイムである。薬剤、ホルモン、酵素基質及びビタミン等の物質を用いて、細胞内の応答を刺激し又は阻止することができる。放射線不透過性又は常磁性の分子を、細胞を、例えばその体内の位置が検出され得るように標識するために使用することができる（例えば、腫瘍細胞の検出）。一度非リン脂質小胞内に封入すれば、その小胞を細胞に最も近い位置に送達することによって、その生物学的に活性な物質を、イン・ビトロ又は好ましくはイン・ビボの何れかで細胞に送達することができる。イン・ビトロでは、これらの小胞を、細胞とインキュベートすることによって細胞に最も近い位置にもたらす。例えば、患者から細胞を単離することができ、物質をイン・ビトロでその細胞に伝達することができ、次いで、その細胞を患者に再導入することができる。イン・ビボでは、これらの小胞を、標的細胞に最も近い位置にもたらす経路で患者（例えば、哺乳動物）に投与することができる。細胞外で、標的細胞との融合の前に、この小胞は、その内部に封入された物質を不活性化又は分解から、並びに免疫学的認識から保護する。これは、蛋白質が細胞外分解を非常に受け易く且つその蛋白質に対する免疫応答を誘発し易いので、蛋白質を細胞に伝達するときに、特に有用な面である。イン・ビボでこれらの小胞を投与する可能な経路には、静脈、鼻腔、筋肉、皮下、経皮、気管又は局所投与が含まれる。例えば、これらの小胞の注射によって、小胞を静脈、筋肉内及び皮下に投与することができる。或は、小胞をカテーテル法によって経皮的に投与することができ、例えば、カテーテルを動脈若しくは静脈に挿入することができ又はカテーテルを特定の器官若しくは腫瘍に挿入してこれらの小胞をその位置に送達することができる。これらの小胞は、組成物例えばスプレー、クリーム、ゲル又は製薬上許容し得るキャリアー（例えば、注射可能な塩類水溶液）に取り込ませて適当なイン・ビボ投与を可能にする。この小胞の組成及び濃度は、これらの小胞と細胞との融合を引き起こすが細胞溶解を引き起こさないように選択する。小胞調製物の融合化活性対毒性を、後述の実施例に記載のアッセイにおいて、イン・ビトロで、試験することができる。例えば、赤血球膜に対するこれらの小胞の効果を評価することができる（実施例６を参照されたい）。こうして、細胞融合及び物質のトランスファーの条件を、イン・ビトロで細胞を用いて最適化することができる。小胞の融合化活性を、高度に融合化活性な非リン脂質よりなる非リン脂質と融合化活性でないリン脂質とのブレンドで小胞を形成することによって調節することができる。例えば、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルを含む小胞の融合化活性を、バチルアルコールをそれらの小胞中に取り込むことにより下方調節することができる（実施例６、表４を参照されたい）。ブレンドした脂質小胞の形成は、米国特許第５，２６０，０６５号に記載されており、その開示を本明細書中に参考として援用する。更に、一次壁形成物質が非リン脂質物質である小胞は、更に、リン脂質を含むことができる。物質を特定の型の細胞に特異的に送達すべきであるが小胞が１種より多くの型の細胞の最も近い位置に送達される場合（例えば、多くのイン・ビボの状況）には、ターゲティング分子を小胞中に取り込ませることによりその小胞を直接関心ある標的細胞に向けることができる。このターゲッティング分子は、関心ある標的細胞を捜してその標的細胞に結合するように機能し、それにより、この小胞を標的細胞に向ける。好適なターゲッティング分子には、関心ある標的細胞の表面構造に結合する抗体例えばモノクローナル抗体、関心ある標的細胞の表面上のレセプターに対するリガンド及び、特定の細胞型に対するウイルスの結合を媒介するウイルス蛋白質例えばエンベロープを有するウイルスからの膜蛋白質が含まれる。このターゲッティング分子を、それがこの小胞の脂質二重層中に取り込まれ得るように修飾することができる。例えば、可溶性蛋白質を、その蛋白質を脂質小胞につなぎ留めることを可能にする疎水性のアンカー分子と共に与えることができる。或は、ターゲッティング分子を、米国特許第５，０００，９６０号（前に、参考として援用）に開示された手順等によって二特異性のカップリング剤を用いて取り込むことができる。この手順においては、チオコレステロールを、先ず、非リン脂質小胞に取り込ませ、次いで、スルフヒドリル基及びアミノ基と反応性のカップリング剤を用いて、蛋白質を、それらのアミノ基を介して、小胞に、チオコレステロールのスルフヒドリル基を介して架橋する。生物学的に活性な物質を封入する非リン脂質小胞が標的分子を含む場合には、その小胞を細胞に最も近い位置に送達してターゲティング分子にその細胞を捜させることによりその小胞を細胞に送達することができる。生物学的に活性な物質を送達すべき細胞がイン・ビボ例えば哺乳動物中にある場合には、この小胞をその哺乳動物の血流中に送達してターゲティング分子に細胞を捜させることにより細胞に送達することができる。この発明の方法を用いて、生物学的に活性な物質を実質的に任意の型の細胞に送達することができる。この細胞は、哺乳動物細胞であってよい。例えば、物質を伝達することのできる細胞には、赤血球、リンパ球、繊維芽細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、内分泌細胞、神経細胞、真皮細胞、生殖細胞、卵母細胞、精子細胞、幹細胞、造血幹細胞、胚細胞、Ｍ細胞、ランゲルハンス細胞及びマクロファージが含まれる。更に、この細胞は、植物細胞であってよい。例えば、植物細胞に対する破壊因子に対する耐性を与える等の生物農業的目的で物質を植物細胞に伝達することができる。更に、この細胞は、寄生虫の細胞であってよい。例えば、寄生虫に対して破壊的である薬剤を寄生虫に伝達することができる。この発明の方法は、多くの治療応用に使用することができる。この発明の一具体例において、生物学的に活性な物質を赤血球に送達する。赤血球への物質の伝達のための治療用途には、細胞内環境の調節による鎌状赤血球の発症の治療、及び赤血球内寄生虫例えば赤血球ステージのマラリアの抗寄生虫剤の赤血球への送達による治療が含まれる。小胞を、静脈投与により、イン・ビボで、赤血球に最も近い位置に送達することができる。この発明の他の具体例において、生物学的に活性な物質をリンパ球に送達する。リンパ球への物質の伝達の治療用途には、アデノシンデアミナーゼのリンパ球への送達によるアデノシンデアミナーゼ欠乏症の治療、免疫抑制剤例えばシクロスポリンをリンパ球に送達することによる組織移植片の拒絶の予防、及びＢリンパ球（又は、他の抗原提示細胞）に抗原のペプチド断片を送達することによる外来抗原に対する免疫化が含まれる。この発明の方法によるペプチド断片の細胞への送達は、それらのペプチドの細胞質への送達を生じ、その結果、それらのペプチドはＭＨＣクラスＩプロセッシング経路を通って運ばれる。この様式でプロセスを受けて提示されたペプチドは、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導する。従って、この発明の方法を用いて、外来抗原に対するＣＴＬ応答を誘導することができる。小胞を、リンパ球に特異的なターゲティング分子をその小胞に取り込ませることによってリンパ球を標的として送達することができる。例えば、抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いて、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を小胞の標的とすることができるであろう。これは、抗ウイルス剤をＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔリンパ球に送達するのに有用であり得るであろう。この発明の方法を用いて、脳内の細胞に物質を送達することもできる。例えば鼻内噴霧による物質を封入した小胞の鼻腔内投与は、嗅覚器経路を介して物質の脳細胞への伝達を可能にする。これは、血液−脳関門を超えられない薬剤についての送達機構として特に有用であり得よう。他の治療応用には、筋ジストロフィーを患っている患者の筋肉細胞中に、病気を軽減するために、ジストロフィンを封入した小胞の筋肉内注射によってジストロフィン蛋白質を導入することが含まれる。腫瘍も又、抗腫瘍剤例えば化学療法剤を、抗腫瘍剤を腫瘍中に運ぶ注射用小胞によって腫瘍細胞に送達することによって治療することができる。この発明の方法の更なる治療応用は、遺伝子治療のためのものである。近年、多くの遺伝病の分子的基礎が解明され、これらの病気に関連する遺伝子が単離された。これは、機能的遺伝子をその遺伝子に欠陥を有する患者に供給することに基づく治療の潜在的可能性を与えた。生物学的に活性な物質を細胞に伝達する伝達する現在の方法を用いて、機能的遺伝子産物をコードする遺伝子を患者の細胞中に送達してその患者におけるその遺伝子の活性を回復することができる。この発明の方法を用いて遺伝子治療により治療することのできる公知の遺伝子中の突然変異と関連した幾つかの病気は、次の通りである（それぞれの病気は、それぞれの遺伝子に従う）：鎌状細胞貧血症（ｂ−グロビン）、サラセミア（ｂ−グロビン）、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ）、デュシェーヌ筋ジストロフィー（ジストロフィン）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、血友病Ａ（因子VIII）、血友病Ｂ（因子IX）及びテイ−サックス病（ａ１−ヘキソサミニダーゼ）。遺伝子治療により治療し得るであろう遺伝病の広範囲のリストは、 Antonarakis，New England J．of Medicine，320:153-163(1981)に含まれている。更に、遺伝子治療のアプローチを後天性の病気にも、例えば、患者の免疫系の応答性を増大させる遺伝子産物をコードする遺伝子を患者の細胞中に導入することによって、同様に適用することができる。従って、癌及びＡＩＤＳ等の病気の治療又は予防を、遺伝子治療のためのこの発明の方法を用いて行なうことができるであろう。例えば、ＨＩＶｇｐ１６０蛋白質をコードするＤＮＡの細胞中への導入は、ｇｐ１６０蛋白質の発現へと導いてＨＩＶに対する免疫を誘出することができる（遺伝子ワクチン接種）。この発明の他の面は、非リン脂質小胞の二重層と結合した物質の細胞への伝達方法に関係する。細胞の外膜との融合に際して、この発明で使用する非リン脂質小胞の脂質二重層は、その細胞の外膜中に取り込まれる。こうして、非リン脂質小胞の細胞との融合は、二重層に結合した物質の細胞への伝達のための方法を提供する。二重層に結合した物質には、非リン脂質小胞の二重層の一次成分であるリン脂質でない脂質自身が含まれ、他の物質例えばステロール（例えば、コレステロール、コレステロールに基づく塩又はエステル、フィトコレステロール、又はヒドロコーチゾン）、負電荷生成剤（例えば、ジセチルホスフェート、コレステロールヘミスクシネート及びオレイン酸）及び／又はリン脂質も含まれ得る。更に、二重層に結合した物質には、非リン脂質小胞の非リン脂質二重層中に取り込まれた分子が含まれ得る。例えば、蛋白質又はその断片（例えば、ペプチド）若しくは誘導体を、小胞の二重層中に取り込み、その小胞と細胞との融合によって細胞の膜に伝達することができる。ミクソウイルスウイルスの膜スパニングエンベロープ蛋白質が、小胞とウイルスエンベロープとの融合の後に、非リン脂質小胞の非リン脂質二重層中に取り込まれた（米国特許出願第０８／００５，００８号を参照されたい。該出願を本明細書中に参考として援用する）。非リン脂質小胞と細胞との融合における非リン脂質二重層に結合した物質の細胞の外膜への伝達を用いて、標的細胞の特性及び機能を改変することができる。これは、細胞の外膜に取り込まれる小胞の非リン脂質二重層が正常の細胞膜と異なる特性を有し、細胞透過性の変化及び変化した能動輸送機構へと導くという事実に基づいている。例えば、非リン脂質小胞の細胞との過剰の融合は、これらの細胞のイン・ビトロでの複製を減じる（実施例８参照）。こうして、細胞の複製を、この発明の非リン脂質小胞をその細胞を標的として送達してそれらの小胞をその細胞と融合させ、それにより、二重層に結合した物質をその細胞の外膜に、それらの細胞の複製を阻止する程度に伝達することによって阻止することができる。例えば、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞を、かかる細胞に対する特異的モノクローナル抗体をターゲティング分子として用いて（例えば、腫瘍に結合した抗原又はウイルスにコードされた細胞表面蛋白質と反応性のモノクローナル抗体を用いて）非リン脂質小胞との融合の標的とし、それらの細胞の複製を減少させることができる。更に、二重層に結合した物質の細胞への伝達を用いて、外来の刺激（例えば、ホルモン、成長因子等）に応答する細胞内のシグナル変換を、その細胞の外膜の組成を変えることにより変えることができる。下記の実施例は、制限するものと解釈してはならないが、この発明及びその効力を一層明確に説明するであろう。実施例１この実施例においては、少ラメラ非リン脂質小胞キャリアーを用いて、酵素の基質をトリ赤血球中に導入した。この基質のこれらの細胞への伝達を、これらの小胞を赤血球と接触させた後に、赤血球中に内生的に存在する酵素のその基質に対する反応性を測定することにより測定した。化学剤２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ；ＳｉｇｍａＡ１８８８）を、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５２；ICI Americas Inc．）／コレステロール／ジセチルホスフェート（３／１／０．０１；Ｍ／Ｍ／Ｍ）からなる少ラメラ非リン脂質小胞中に封入した。ＡＢＴＳは、赤血球中に内生的に存在するペルオキシダーゼ酵素活性に対する基質である。これらの非リン脂質小胞を、米国特許第４，９１１，９２８号に示された一般的手順を用いて作成した。簡単に言えば、この小胞の壁の脂質成分を流動状態まで加熱し（７５℃）、第１の注射器に入れた（１０ｍｌの注射器中の１ｍｌの脂質）。水性成分も又、加熱して（５５℃）、第２の注射器中に入れた（１０ｍｌの注射器中の４ｍｌのＡＢＴＳ溶液）。これらの２つの注射器を活栓により繋ぎ、これらの物質を、小胞が形成されるまで１分又は２分間にわたって、活栓を通して往復させた（約６０往復。各２０往復毎に、冷却した）。この調製物は、液体であり且つ顕微鏡検査において全く均一な小胞を示した。これらの小胞の１：１０稀釈物を作成した。最終的ＡＢＴＳ濃度は、２ｍｇ／ｍｌであった。ＡＢＴＳを封入してない「ブランク」の非リン脂質小胞も調製した。ニワトリ赤血球（Vineland Laboratories）を、リン酸緩衝塩溶液で２回洗った。２０ｍｌの細胞を、２ｍｌの(a)ＡＢＴＳをロードした小胞の１：１０稀釈物、(b)ブランク小胞の１：１０稀釈物、又は(c)未封入のＡＢＴＳ（２ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。細胞を、これらの溶液と３７℃で１時間インキュベートし、次いで、室温で２時間インキュベートした。顕微鏡検査で、細胞の溶解は見られなかった。これらの非リン脂質小胞にさらした赤血球は、これらの小胞にさらさなかった細胞より膨潤して見え且つ一層明るい細胞質を有した。インキュベーションに続いて、各混合物の２００ｍｌのアリコートを洗って１００ｍｌの０．３％過酸化水素（これは、赤血球膜を透過して、ＡＢＴＳの存在下で、細胞内でペルオキシダーゼ反応を開始する）にさらした。１／２〜１時間以内に、ＡＢＴＳをロードした小胞にさらした細胞は、ペルオキシダーセ活性を示す薄紫色を示した。対照的に、ブランク小胞又は未封入ＡＢＴＳの何れかにさらした細胞は、これらの細胞中に存在するメトヘモグロビンに特徴的な茶色がかった赤色のままであった。ＡＢＴＳをロードした小胞で処理した細胞の紫色は、過酸化水素の第２の１００ｍｌのアリコートの添加に際して暗くなった。これらの細胞中の検出可能なペルオキシダーゼ活性は、紫色により示されたように、ペルオキシダーセの基質のＡＢＴＳが、ＡＢＴＳをロードした小胞と細胞との融合に際して細胞にトランスファーされたことを示している。実施例２この実施例においては、少ラメラ非リン脂質小胞キャリアーを用いて、酵素をトリ赤血球中に導入した。この酵素のこれらの細胞への伝達を、これらの小胞をこれらの細胞に接触させた後に存在する細胞に結合した酵素活性の量を測定することにより測定した。この酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Sigma P-6782）を、実施例１に記載のように、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５２）／コレステロール／オレイン酸からなる少ラメラ非リン脂質小胞に封入した。未封入酵素を、デキストラン密度勾配上の複数遠心洗浄により除去した。最後の洗液は保存した。封入酵素を有しない「ブランク」の非リン脂質小胞も調製した。ＨＲＰをロードした小胞の１：１０稀釈物を２．３×１０⁶のニワトリ赤血球（Vineland Laboratoriesより入手）と３７℃で１時間インキュベートした。対照用赤血球も又、(a)最終洗浄溶液の１：１０稀釈物、(b)同じ稀釈のブランク小胞及び、(c)最終洗液の１：１０稀釈物にて作成したブランク小胞の１：１０稀釈物とインキュベートした。このインキュベーションの最後に、赤血球を小胞から遠心分離した。細胞溶解は起きなかった。これらの細胞を、１００ｍｌのオクチルグルコシド（１００ｍｇ／ｍｌ）にて破砕し、次いで、１００ｍｌの基質（ＡＢＴＳ；１０ｍｇ／ｍｌ）及び１００ｍｌのＨ₂Ｏ₂（０．３％）を加えた。色を、４０５ｎｍで、標準曲線に対して読んだ。これらの結果を表１に示す。実施例３この実施例においては、少ラメラ非リン脂質小胞キャリアーを用いて、酵素をマウスリンパ球に導入した。この酵素のこれらの細胞への伝達を、これらの小胞をこれらの細胞と接触させた後に存在する細胞に結合した酵素活性の量を測定することにより測定した。実施例２に記載したように、ＨＲＰを、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５２）／コレステロール／オレイン酸からなる少ラメラ非リン脂質小胞に封入し、未封入酵素を、デキストラン密度勾配上の複数遠心洗浄により除去した。最終洗液を保存した。封入酵素を有しない「ブランク」の非リン脂質小胞も調製した。ＨＲＰをロードした非リン脂質小胞の１：２０稀釈物を、１．３×１０⁶のＳＰ２ミエローマ細胞（分化したＢリンパ球）と３７℃で１時間インキュベートした。対照として、ＳＰ２細胞も、(a)ＨＲＰをロードした非リン脂質小胞の最終洗液の１：２０稀釈物、(b)ブランクの非リン脂質小胞の１：２０稀釈物、及び( c)最終洗液の１：２０稀釈物にて作成したブランクの非リン脂質小胞の１：２０稀釈物とインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、ＳＰ２細胞を、非リン脂質小胞から、洗浄及び遠心分離により分離した。これらの条件下で、細胞溶解は認められなかった。これらの細胞ペレットを、２００ｍｌのオクチルグルコシド（１００ｍｇ／ｍｌ）中で再懸濁してＳＰ２細胞膜を崩壊させた。これらの崩壊させた細胞に、２００ｍｌのＨＲＰ酵素の基質（ＡＢＴＳ；Sigma;１０ｍｇ／ｍｌ）及び２００ｍｌの過酸化水素（０．３％）を加えた。生じた色を、３０分後に、４０５ｎｍにて読んだ。これらの結果を表２に示す。発色は、細胞を非リン脂質小胞に封入したＨＲＰとインキュベートした後に、対照の二倍強であった。これは、非リン脂質小胞／細胞融合及び細胞当り５×１０⁶分子のＨＲＰを超える酵素の標的細胞中へのトランスファーを示唆する。非リン脂質小胞の細胞への接着は、このアッセイによっては十分に妨げることはできないが、実施例４に記載したＤＮＡトランスファー実験によって排除される。実施例４この実施例においては、非リン脂質小胞キャリアーを用いて、ＤＮＡ分子をマウス繊維芽細胞に導入した。ＤＮＡ分子のこれらの細胞への伝達を、これらの細胞をこれらの小胞と接触させた後にこれらの細胞中に存在するＤＮＡ分子によりコードされる蛋白質の活性を測定することにより測定した。脂質小胞の内容物の標的細胞の細胞質への送達を測定するアッセイは、真の小胞−細胞融合と、小胞の細胞表面への単なる接着または封入した内容物の放出を伴わない小胞のエンドサイトーシスとを区別しなければならない。小胞内容物の細胞質への送達を定量する１つの方法は、細胞質へ活性型で送達されたときに蛋白質合成を開始する分子を利用することである。かかる分子の一つは、測定可能な酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含み且つその遺伝子の転写及びその結果生成したｍＲＮＡの翻訳を可能にする適当な制御配列を含むＤＮＡプラスミッドである。細胞中に存在する蛋白質の酵素活性の測定は、その細胞の細胞質中へのそのＤＮＡのトランスファーの評価を与える。この実施例で用いた系は、Ｔ７プロモーターのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａ）との相互作用から生じる哺乳動物細胞における高効率の蛋白質合成に基づいている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現しているＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を使用した。これらの細胞に導入したＤＮＡプラスミッドは、Ｔ７プロモーターの制御下でｌａｃＺ遺伝子を発現させるｐＥＭＣ−ＬａｃＺｂｇＡｎであった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼからの転写物が５’キャップを有しないので、ＥＭＣウィルスからの５’ＵＴＲをこのプラスミッド中に組み込んで高効率の翻訳を与えた。更に、ポリ（Ａ）配列を３’末端に加えてｍＲＮＡの安定性を増大させた。このプラスミッドを、実施例１に記載したように、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５２）／コレステロールからなる非リン脂質小胞に封入した。２０ｍｇプラスミッドＤＮＡ／ｍｌを封入に用いた（全非リン脂質＝５ｍｌ；封入効率は測定しなかったが、典型的には３５％を超える）。中性の、正に帯電した及び負に帯電した非リン脂質小胞を試験した。ＤＮＡをロードした非リン脂質小胞の様々な希釈物を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを内生的に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞に加えて一晩インキュベートし、それから、培養培地を交換した。非リン脂質小胞の１：１０００希釈物（ウェル当たり０．３７５ｎｇのプラスミッドＤＮＡに等しい）を、記載した実験に用いて、一晩のインキュベーションの際に過剰の融合による毒性を回避した。正の対照として、これらの細胞を、同じプラスミッドを用いて、リン酸カルシウム技術によって、トランスフェクトもした（ウェル当たり１２３．３３ｎｇのプラスミッドＤＮＡ濃度）。負の対照として、遊離のプラスミッドＤＮＡ（ウェル当たり１２３．３３ｎｇのプラスミッドＤＮＡ濃度）をこれらの細胞の加えた。４８時間後、これらの細胞をｂ−ガラクトシダーセ活性についてアッセイした。下記に与えたこれらの結果は、３つの別々のウェルの平均であり且つ３つの異なる実験を表わす。ｂ−ガラクトシダーゼ活性を、ＯＤ₅₇₀／ウェルで表現してある。これらの結果を、表３に示す。ウェル当たり添加した非リン脂質ＤＮＡの全量が、封入された及びされなてないＤＮＡの両者を含み、３００回より多く（ＣａＰＯ₄正の対照より少ない）且つ６００回より多い（封入したＤＮＡに関しては少ない）ことは注意すべきである。たとえ正の対照ＤＮＡより遥かに低い濃度で存在するにしても、非リン脂質に封入されたＤＮＡ（ＮＰＬＤＮＡ）は、細胞をＮＰＬＤＮＡとインキュベートした後に存在するｂ−ガラクトシダーゼ活性が遊離ＤＮＡの負の対照と比較して２〜２％倍に増大していることにより示されるように、インキュベーション中に細胞に伝達されている。実施例５この実施例においては、オリゴヌクレオチドを非リン脂質小胞中に封入し、封入効率を測定した。 ³²Ｐ−グアニン標識した抗−ｃ−ｍｙｃ−５Ｇ、未標識の抗−ｃ−ｍｙｃ、標識した抗−ＶＳＶ−５Ｇ及び未標識の抗−ＶＳＶの混合物を封入に用いた。０．４ｍｌのポリオキシエチレン（２）セチルエーテル／コレステロール／ジセチルホスフェート（３．０／１．０／０．１；Ｍ／Ｍ／Ｍ）を、実施例１に記載した注射器技術を用いて、２０ｍｇ（１００，０００ｄｐｍ）のアンチセンス混合物を含む０．５ｍｌの１０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）と合わせた。その結果生成した小胞を、４ｍｌに希釈し、これらの小胞をデキストラン勾配上で遠心分離した（２０％；１０％；４０分間、４０，０００ｒｐｍ）。遠心管の底に穴を開けて内容物を溶出させた。すべての実験において、未封入のオリゴヌクレオチドが１〜１０滴中に出現し、封入された物質は、画分１２に現われた。封入効率は、７２．４〜７６．０％であった。実施例６この実施例においては、種々の組成の非リン脂質小胞を、それらの相対的な融合化活性についてアッセイした。融合化活性を、これらの小胞をヒト赤血球とインキュベートし、光学顕微鏡検査により赤血球膜に対するこれらの小胞の影響を調べることによってアッセイした。様々な非リン脂質小胞配合物を調製して、１％クエン酸塩添加したヒト赤血球と室温及び３７℃でインキュベートした。赤血球膜を時間を追って（直ちに、１時間、２時間、一晩など）顕微鏡で監視した。ヒト赤血球を種々の小胞とインキュベートすることは顕微鏡で検出可能な種々の質的効果を生じることが見出された。認められた赤血球膜に対する効果のスペクトルは、最も僅かの影響を受けた膜から最も影響を受けた膜まで、次の通りであった：１）丸い、本質的に変形してない膜；２）丸い、僅かに変形した「毛」様の突起を有する膜；３）丸い、僅かに一層変形した「針」様及び「棒」様の突起を有する膜；４）中位に円鋸歯状の、凝集した膜粒子を有するが「棒」様の突起を有しない膜；５）ひどく円鋸歯状となった、凝集した膜粒子並びに「棒」様及び管状の突起を有する膜；６）部分的に溶解した膜及び赤血球「ゴースト」；並びに７）破裂膜を伴う急速な溶解。これらの結果を表４にまとめる。表４に記載したものと同様の結果が、種々の非リン脂質小胞組成物をトリ赤血球とインキュベートしたときに得られた。種々の脂質組成の小胞の融合化活性は、赤血球膜に対する影響を、良好な融合化活性を有することが知られているＰＯＥ（２）ＣＥ（Ｂｒｉｊ５２）含有小胞（実施例１〜４参照）のそれと比較することにより予想することができる。表４に示したように、ＰＯＥ（２）ＣＥ−含有小胞は、赤血球を溶解させ又はゴースト形成することなく赤血球膜の円鋸歯形成を引き起こした。赤血球膜を変形させないが又は最小の変形を生じた小胞例えばＰＯＥ（３）ＧＭＳ及びＰＯＥ（９）ＧＭＳを一次壁形成物質として含むものは、融合化活性を有しないか又は低い融合化活性を有すると予想されるが、他方、赤血球のゴーストの形成又は完全な溶解を引き起こした小胞例えばＧＭＯ、ＰＯＥ（９）ＧＭＳ／ＧＭＯ、ＰＯＥ（４）ＬＥ／ＧＤＬ、ＰＯＥ（１０）ＣＥ、ＤＭＡＴＯ及びリノール酸アミドを含むものは、細胞への物質のトランスファーに有用であるには反応性過ぎるであろう。物質を細胞に伝達するのに好適な小胞は、赤血球膜の中位の変形乃至膜から形成される棒様及び管状突起を有するひどい円鋸歯形成を引き起こす。これらは、ＰＯＥ（２）ＳＥ及びＰＯＥ（２）ＣＥからなる小胞を含む。これらの脂質から形成した小胞（即ち、ブレンドした脂質小胞）への他の成分の添加を用いて、小胞の融合化活性を調節することができる。例えば、バチルアルコールのＰＯＥ（２）ＳＥ（Ｂｒｉｊ７２）及びＰＯＥ（２）ＣＥ（Ｂｒｉｊ５２）小胞への添加は、それらの小胞の赤血球への影響を減少させた。この実施例に記載した赤血球アッセイを用いて種々の組成の非リン脂質小胞をそれらの融合化能力についてスクリーニングすることができる。次いで、小胞を、細胞と融合して物質を送達するそれらの能力について、実施例１〜４に記載したようなアッセイによって直接試験することができる。実施例７この実施例においては、非リン脂質小胞との融合の際の赤血球の変形過程の性質を、凍結破断電子顕微鏡検査により研究した。新鮮な、リン酸緩衝塩溶液中で洗ったヒト赤血球を、実施例１に記載したように調製したポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５２）／コレステロール／オレイン酸小胞と混合した。これらの赤血球を、これらの小胞（約１０⁵小胞／細胞）と室温で１８時間インキュベートし、次いで、凍結破断電子顕微鏡検査により調べた。代表的電子顕微鏡写真を図１に示す。電子顕微鏡検査は、棒及び管は、赤血球の細胞質で満たされており、即ち、それらは赤血球膜の突起であって、単に脂質小胞によって形成されたものではないことを示した。更に、膜内粒子の分布は、赤血球の膜貫通蛋白質を代表するが、これらの小胞との相互作用によりひどく変化した。顕著な粒子を有しないドメインのない粒子の統計的分布の代わりに、処理した赤血球の破断面は、殆ど又は全く膜内粒子を有しない大きい「禿げた」領域を示している（それらの粒子の殆どは、堅いクラスターに凝集していた）。これらの禿げた領域は、１〜３ｍ²に及び、用いた非リン脂質小胞の表面積の２〜６倍に等しい。これらの電子顕微鏡写真は、非リン脂質小胞の赤血球膜との融合に際して、これらの小胞の二重層に結合した物質が赤血球の外膜にトランスファー（即ち、挿入）されたことを示した。上記の凍結破断電子顕微鏡実験を、同じ非リン脂質小胞組成を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞について繰り返した。同様の結果がＮＩＨ３Ｔ３細胞について得られた（即ち、大きい禿げた区画及び凝集した粒子が認められた）が、これは、これらの小胞の細胞膜との融合及び二重層結合物質の細胞膜への伝達を示唆している。実施例８この実施例においては、過剰の融合の細胞複製に対する影響を、種々の濃度の非リン脂質小胞を、培養繊維芽細胞と、時間を変えてインキュベートし、次いで、細胞増殖を測定することにより試験した。実施例７に記載した凍結破断電子顕微鏡実験は、非リン脂質小胞の標的細胞との融合は、正常の外側細胞膜中に挿入された小胞二重層の大きい部分を有する細胞を生成することを示した。小胞の二重層が正常の細胞膜と異なる特性を有し且つ細胞透過性及び能動輸送機構を変え得るので、イン・ビトロで過剰の融合が細胞複製を変え得るか否かを調べた。非リン脂質小胞の量を増して、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞と時間を増してインキュベートした。細胞膜に対する細胞融合の影響を、光学顕微鏡検査によって視覚的に調べ、細胞複製に対する影響を、細胞増殖アッセイを用いて測定した。それらの結果を表５に示す。このデータは、３×１０¹⁰／ｍｌを超える小胞濃度の少しの増加及び細胞を小胞に曝露する増大した時間が、細胞複製を阻止する過剰の融合へと導き得ることを示している。これは、細胞膜と非リン脂質二重層の相対的表面積に基づく計算から予想されよう。例えば、半径３〜７ミクロンを有する１０⁶の球形細胞は、７−＞２０×１０⁷ｍ²の表面積を有するであろう。非リン脂質小胞は、通常、１０¹⁴粒子／ｍｌの濃度で調製する。２二重層及びほぼ０．２５ミクロンの半径を有する小胞については、これは、約２×１０¹³ｍ²（１０⁶倍までの膜表面積過剰）に相当する。同等物当業者は、ここに記載した発明の特定の具体例に対する多くの同等物を、常例的実験を用いて認識し、又は確認することができよう。かかる同等物は、後述の請求のの範囲により包含されることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/48 ＡＢＤ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の工程を含む、生物学的に活性な物質を細胞に伝達する方法： (a) 該生物学的に活性な物質を封入する約２〜１０の脂質二重層を有するキャリアー小胞を形成し、該キャリアー小胞は、非リン脂質物質を該二重層における一次構造脂質として有する少ラメラ脂質小胞であり、該非リン脂質物質は、下記式を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルからなる郡より選択し：Ｒ−ＣＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ（式中、ｎは２〜４に及び、Ｒは、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレオイルアルコール又はこれらの誘導体からなる郡より選択する炭化水素鎖である）、 (b) 該生物学的に活性な物質を含む該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達し、 (c) 該キャリアー小胞の該脂質二重層と該細胞の膜とを融合させ、そして (d) 該生物学的に活性な物質を該細胞中に拡散させる。２．前記の脂質二重層が、更に、ステロールを含む、請求項１に記載の方法３．前記の脂質二重層が、更に、負の電荷生成剤を含む、請求項１に記載の方法。４．前記の生物学的に活性な物質が、蛋白質又はその断片若しくは誘導体を含む、請求項１に記載の方法。５．蛋白質が酵素である、請求項４に記載の方法。６．前記の生物学的に活性な物質が核酸を含む、請求項１に記載の方法。７．前記の核酸がＤＮＡ又はその断片若しくは誘導体である、請求項６に記載の方法。８．前記の核酸がＲＮＡ又はその断片若しくは誘導体である、請求項６に記載の方法。９．前記の生物学的に活性な物質が、前記の細胞中のｍＲＮＡ又はその断片に相補的である、請求項１に記載の方法。１０．前記の生物学的に活性な物質がリボザイムを含む、請求項１に記載の方法。１１．前記の生物学的に活性な物質が薬剤を含む、請求項１に記載の方法。１２．前記の細胞が、イン・ビトロである、請求項１に記載の方法。１３．前記の細胞が、哺乳動物中でイン・ビボである、請求項１に記載の方法。１４．前記の細胞が、赤血球である、請求項１に記載の方法。１５．前記の細胞が、リンパ球である、請求項１に記載の方法。１６．前記の細胞が、繊維芽細胞である、請求項１に記載の方法。１７．前記の細胞を、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、内分泌細胞、神経細胞、表皮細胞、生殖細胞、卵母細胞、精子細胞、幹細胞、造血幹細胞、胚細胞、Ｍ細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、植物細胞及び寄生虫細胞よりなる郡から選択する、請求項１に記載の方法。１８．前記のキャリアー小胞が、更に、ターゲティング分子を含み且つ、該キャリアー小胞を細胞に最も近い位置に送達する工程が、該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達して該ターゲティング分子に該細胞を捜させることを含む、請求項１に記載の方法。１９．前記のターゲティング分子が抗体である、請求項１８に記載の方法。２０．前記のターゲティング分子がウイルス蛋白質である、請求項１８に記載の方法。２１．前記のターゲティング分子が前記の細胞上のレセプターに対するリガンドである、請求項１８に記載の方法。２２．前記のキャリアー小胞を前記の細胞に最も近い位置に送達する工程が、該キャリアー小胞を、静脈投与、筋肉内投与、鼻腔投与、皮下投与、経皮投与、気管投与及び局所投与より選択する経路によって前記の哺乳動物に投与することを含む、請求項１３に記載の方法。２３．前記のキャリアー小胞が、更に、ターゲティング分子を含み、キャリアー小胞を前記の細胞に最も近い位置に送達する工程が、該キャリアー小胞を前記の哺乳動物の血流に送達して該ターゲティング分子に該細胞を捜させることを含む、請求項１３に記載の方法。２４．前記の生物学的に活性な物質が、前記の細胞の細胞質中に拡散する、請求項１に記載の方法。２５．前記の生物学的に活性な物質が、前記の細胞における活性を刺激する、請求項１に記載の方法。２６．前記の生物学的に活性な物質が、前記の細胞における活性を阻止する、請求項１に記載の方法。２７．下記の工程を含む、二重層に結合した物質を細胞に伝達する方法： (a) 該二重層に結合した物質を取り込んだ約２〜１０の脂質二重層を有するキャリアー小胞を形成し、該キャリアー小胞は、該二重層における一次構造脂質として非リン脂質物質を有する少ラメラ脂質小胞の形態であり、該非リン脂質物質は、下記式を有するポリオキシエチレン脂肪エーテルからなる郡より選択し：Ｒ−ＣＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ（式中、ｎは２〜４に及び、Ｒは、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレオイルアルコール又はこれらの誘導体からなる郡より選択する炭化水素鎖である）、 (b) 該二重層に結合した物質を取り込んだ該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達し、 (c) 該キャリアー小胞の該脂質二重層と該細胞の膜とを融合させ、そして (d) 該二重層に結合した物質を該細胞の膜に伝達させる。２８．前記の脂質二重層が、更に、ステロールを含む、請求項２７に記載の方法。２９．前記の脂質二重層が、更に、負の電荷生成剤を含む、請求項２７に記載の方法。３０．前記の二重層に結合した物質が、前記のキャリアー小胞の前記の非リン脂質物質を含む、請求項２７に記載の方法。３１．前記の二重層に結合した物質が、該二重層に挿入された蛋白質又はその断片若しくは誘導体を含む、請求項２７に記載の方法。３２．前記の細胞が、イン・ビトロである、請求項２７に記載の方法。３３．前記の細胞が、哺乳動物中で、イン・ビボである、請求項２７に記載の方法。３４．前記のキャリアー小胞が、更に、ターゲティング分子を含み、該キャリアー小胞を細胞に最も近い位置に送達する工程が、該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達して該ターゲティング分子に該細胞を捜させることを含む、請求項２７に記載の方法。３５．前記のターゲティング分子が抗体である、請求項３４に記載の方法。３６．前記のターゲティング分子がウイルス蛋白質である、請求項３４に記載の方法。３７．前記のターゲティング分子が前記の細胞上のレセプターに対するリガンドである、請求項３４に記載の方法。３８．前記のキャリアー小胞を前記の細胞に最も近い位置に送達する前記の工程が該キャリアー小胞を前記の哺乳動物に、静脈、筋肉、鼻腔、皮下、経皮、気管及び局所投与よりなる郡から選択する経路によって投与することを含む、請求項３３に記載の方法。３９．前記のキャリアー小胞が、更に、ターゲティング分子を含み、そのキャリアー小胞を前記の細胞に最も近い位置に位置に送達する前記の工程が、該キャリアー小胞を前記の哺乳動物の血流に送達して該ターゲティング分子に該細胞を捜させることを含む、請求項３３に記載の方法。４０．下記の工程を含む、生物学的に活性な物質を細胞に伝達する方法： (a) 該生物学的に活性な物質を封入する約２〜１０の脂質二重層を有するキャリアー小胞を形成し、該キャリアー小胞は、該脂質二重層における一次構造脂質として非リン脂質物質を有する少ラメラ脂質小胞の形態であり、該非リン脂質物質は、細胞との接触に際して細胞を溶解させることなく細胞と融合する小胞を形成するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルであり、 (b) 該生物学的に活性な物質を含む該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達し、 (c) 該キャリアー小胞の該脂質二重層と該細胞の膜とを融合させ、そして (d) 該生物学的に活性な物質を該細胞中に拡散させる。４１．前記の脂質二重層が、更に、リン脂質を含む、請求項４０に記載の方法。４２．下記の工程を含む、二重層に結合した物質を細胞に伝達する方法： (a) 該二重層に結合した物質を含んだ約２〜１０の脂質二重層を有するキャリアー小胞を形成し、該キャリアー小胞は、該脂質二重層における一次構造脂質として非リン脂質物質を有する少ラメラ脂質小胞の形態であり、該非リン脂質物質は、細胞との接触に際して細胞を溶解させることなく細胞と融合する小胞を形成するポリオキシエチレン脂肪酸エーテルであり、 (b) 該二重層に結合した物質を取り込んだ該キャリアー小胞を該細胞に最も近い位置に送達し、 (c) 該キャリアー小胞の該脂質二重層と該細胞の膜とを融合させ、そして (d) 該二重層に結合した物質を該細胞の膜に伝達させる。４３．前記の脂質二重層が、更に、リン脂質を含む、請求項４２に記載の方法。