EP1187929A2 - Neue liposomale vektorkomplexe und deren verwendung für die gentherapie - Google Patents

Neue liposomale vektorkomplexe und deren verwendung für die gentherapie

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EP1187929A2
EP1187929A2 EP00929548A EP00929548A EP1187929A2 EP 1187929 A2 EP1187929 A2 EP 1187929A2 EP 00929548 A EP00929548 A EP 00929548A EP 00929548 A EP00929548 A EP 00929548A EP 1187929 A2 EP1187929 A2 EP 1187929A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
component
liposomal vector
vector complex
complex according
liposomal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00929548A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sabine BRÜSSELBACH
Kristina MÜLLER
Alfred Fahr
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vectron Therapeutics AG
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
Publication of EP1187929A2 publication Critical patent/EP1187929A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • vectors for gene therapy have so far been nucleic acid sequences which are complexed with a non-viral carrier (e.g. cationic lipids or cationic polymers) or inserted into a virus.
  • a non-viral carrier e.g. cationic lipids or cationic polymers
  • RES reticuloendothelial system
  • the causes of rapid elimination are varied. They can be: too large a negative or positive charge, too large a volume or an opsonization of the vector particles by blood proteins.
  • viral vectors they can furthermore be the binding of the virus envelope proteins to virus-specific receptors in the organs and / or also antibodies or immune cell-specific for the viruses which bind to the vectors and thereby eliminate them.
  • the invention relates to new liposomal vector complexes for gene therapy consisting of the following components:
  • Component a) can be an unmodified or modified DNA sequence or an unmodified or modified RNA sequence.
  • the nucleotide sequence can perform an anti-DNA (triplex) or anti-RNA (antisense; ribozyme) function or code for an RNA sequence acting in this way or for a protein.
  • the nucleotide sequences and their modification can be such that the nucleotide sequence is largely resistant to degradation by DNAsen or RNAsen. Examples of such nucleotide sequences and their modifications are in Breaker, Nature Biotechnol. 15: 427, 1997; Gerwik, Critical Reviews in Oncogenesis 8: 93, 1997; Mukhopadhyay et al., Crit. Rev. Oncogen.
  • the DNA sequence can be linear or circular, for example in the form of a plasmid.
  • Component a) can also be a virus, preferably a virus, into which a nucleic acid sequence foreign to the virus has been inserted using the methods known to those skilled in the art. Examples of such viruses are RTV, AAV and lentiviruses. Such and further examples are from Vile, Nature Biotechnol.
  • Component b) is a cationic carrier which condenses component a) and at the same time has lysosomolytic and / or lysosomotropic and / or lysosomotropic properties.
  • component b) is a cationic polymer, for example described by Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 92: 7297, 1995; Kaneda et al., Science 243: 375, 1989; Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527, 1990; Baker et al., Gene Ther. 4: 773, 1997; Fritz et al., Human Gene Ther. 7: 1395, 1996; Wolfert et al., Human Gene Ther. 7: 2123, 1996 and Solodin et al., Biochem. 34: 13537, 1995.
  • a cationic polymer for example described by Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 92: 7297, 1995; Kaneda et al., Science 243: 375, 1989; Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527, 1990; Baker
  • PEI polyethylene imine
  • component b) is a polyethyleneimine (PEI), in a further particular one
  • the polyethyleneimine has a molecular weight in a range of 500-25,000 Da and in a further embodiment a molecular weight of 5000-10,000 Da in a further embodiment of the invention a molecular weight of approximately 2000 Da on average and was produced as in patent application EP -A 0 905 254.
  • Component c) represents any liposome with any composition known to the person skilled in the art.
  • this liposome has an anionic charge.
  • the lipid and phospholipid composition of the anionic liposome is similar to the composition of a virus envelope.
  • the preparation of liposomes with an anionic charge has already been described many times, for example in US Pat. Nos. 4,946,787, 4,245,737, 5,480,463 and Heywood and Eanes, Calc. Tissue int. 40: 149, 1992; Lee and Huang, J. Biol. Chem. 271: 8481, 1996; Balicki and Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res.
  • the invention furthermore relates to the addition of the liposomal vector complexes according to the invention by adding a component d).
  • This component d) represents a ligand which has a binding site for the target cell and is conjugated to a lipid.
  • the target cell specificity of the ligand can be any.
  • the type of lipid can be of any type, but naturally occurring lipids are preferred, as described, for example, in US Pat. No. 5,252,348; US 5,753,258; US 5,766,625 and EP-A 0 555 333.
  • the lipid is conjugated to the target cell-specific ligand using one of the methods known to the person skilled in the art, for example as described in US Pat. No. 5,662,930.
  • Component d) is inserted into the liposome according to the invention (component c) using the method known to the person skilled in the art, for example described in US Pat. Nos. US 5,252,348 and US 5,753,258).
  • the invention furthermore relates to the supplementation of the liposomal vector complexes according to the invention by adding a component e).
  • This component e) represents the functional sequence of a fusion peptide, preferably from the subunit HA-2 of hemagglutinin from the influenza virus (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (17), 7934-7938), ligands, which facilitates the release of the liposome content from the endosome.
  • the vector complex according to the invention consisting of components a), b) and c) or a), b), c) and d) or a), b), c), d) and e) is prepared using those known to the person skilled in the art Methods, such as that
  • component a) in the 1st step component a) is mixed with component b), the mixing ratio being adjusted so that the net charge of the resulting total complex is preferably either cationic or anionic and subsequent
  • step 2 the complex resulting from step (1) is introduced into component c), which component d) may already contain, the
  • component d) can optionally also be introduced into component c) subsequently step 2;
  • component e) is inserted into the complex resulting from step 2 or 3, or, alternatively, component e) is added to component c) before step 2.
  • the liposomal vector complexes resulting from these production steps have a diameter of 100-600 nm and a cationic or anionic charge, preferably a diameter of 100-300 nm and an anionic charge.
  • the liposomes according to the invention accumulate, for example, in the tumor vascular bed (Unezaki et al, Int. J. Pharmac. 114: 11, 1996; Sadzuka et al., Cancer Lett. 127: 99, 1998; Wunder et al., Int. J. Oncol 11: 497, 1997). Furthermore, the liposomes according to the invention bind via their component d) to the target cell and transfect them, so that the nucleic acid sequence in the vector complex according to the invention is released in the cell.
  • this nucleic acid sequence can develop its effect in the target cell, ie, for example, inhibit the transcription or translation of a specific gene or a specific RNA, or the cell transduce to express the RNA or protein encoded by this nucleic acid sequence.
  • the transduction rate through the liposomal vector complexes according to the invention is considerably improved in comparison to the existing technology known to the person skilled in the art and is, for example in cell culture, in over 80% of the cells which carry a receptor for component d) and with the liposomal vector complexes according to the invention be brought into contact.
  • the vector complexes according to the invention are therefore preferably suitable for in vitro transduction of cells and for in vivo administration with the aim of prophylaxis or therapy of diseases.
  • the invention relates to a liposomal vector complex containing the following components: f) a nucleic acid sequence of any length; g) a cationic carrier which condenses component a) and is lysosomolytic and / or lysosomotropic; h) lipids and phospholipids which form a liposome; i) optionally a ligand which has a binding site for a target cell; j) optionally a fusogenic substance which can replace the lysosomolytic and / or lysosomotropic function of component b); wherein in the presence of a fusogenic substance (e) the cationic carrier (b) need not be lysosomolytic and / or lysosomotropic; and in which component a) is preferably a polynucleic acid, component b) is a cationic protein, a cationic polymer, or a combination of both.
  • component a) is preferably a poly
  • the cationic carrier is protamine sulfate.
  • component b) is a cationic polymer, in particular polyethyleneimine (PEI), particularly preferably PEI with a molecular weight of on average 2,000-10,000 Da, very particularly preferably a highly branched or low-branched PEI.
  • PEI polyethyleneimine
  • component c) is composed of phosphatidylsehn, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, anchor lipid and cholesterol, particularly preferred as anchor lipid is an N-carboxyphosphatidylethanolamine, e.g. an N-glutaryl phosphatidylethanotamine; and preferably component d) is conjugated to one of components a) - c) without an anchor, via an anchor or via an anchor lipid.
  • anchor lipid is an N-carboxyphosphatidylethanolamine, e.g. an N-glutaryl phosphatidylethanotamine
  • Another embodiment of the invention is a liposomal vector complex in which component d) is not covalently embedded in the liposome surface.
  • Another embodiment of the invention is a liposomal vector complex whose target cell is a tissue cell, an epithelial cell, an endothelial cell, a blood cell, a leukemia cell or a tumor cell.
  • Another embodiment of the invention is a liposomal vector complex whose component e) is the functional sequence from the subunit HA-2 of the hemagglutin of the influenza virus or a synthetic derivative thereof.
  • a further embodiment of the invention is a liposomal vector complex for the transduction and transfection of cells in vitro or in vivo, wherein serum is preferably used in vitro.
  • a further embodiment of the invention is the use of a liposomal vector complex for the production of a diagnostic for use in vitro and in vivo and / or for the production of a remedy for the prophylaxis or therapy of a disease in vivo and ex vivo, the administration preferably being based on the Skin, on a mucous membrane, in the lungs, on the eye, in a body cavity, in the connective tissue, in the muscle, in an organ or in the bloodstream.
  • Another embodiment of the invention is a method for producing a liposomal vector complex, wherein
  • component a) is mixed with component b),
  • step (2) the complex resulting from step (1) is introduced into component c), the mixing ratio of all components being adjusted so that the net charge of the resulting overall complex is preferably either cationic or anionic;
  • component d) is inserted into component c) before or after complex formation
  • component e) is inserted into the complex resulting from step (2) and (3) or to component c) before the complex formation; preferably the resulting product is lyophilized or aerosolized.
  • a cyclic peptide was synthesized to improve the targeting of the integrin receptors. It is a CDCRGDCFC peptide (Arap W., Pasqualini, R. and Ruoslahti, E. (1998) Science, 279: 377-380; Pasqualini, R. Koivunen, E. Ruoslathi E., Nature Biotech. (1997 ) 15: 542-546) with an additional arginine at the N-terminal end (FW 1163.35). The terminal amino acid reduces the extent of coupling of the peptide to the active site, the RGD sequence.
  • the cyclization takes place by oxidation of the thiol groups to disulfide bridges.
  • the successful cyclization is checked by means of HPLC analysis. After HPLC purification, the peptide is lyophilized, stored at 4 ° C. and dissolved in buffer before use (250 ⁇ g / 150 ⁇ l Tris buffer 10 mM pH 7.4 or PBS buffer pH 7.4).
  • the liposomes are produced using the film / hydration method.
  • Chloroform-dissolved lipids and the lipid anchor are pipetted into a 100 ml round-bottomed flask and the chloroform is drawn off for 15 minutes.
  • the flask is immersed in a temperature-controlled water bath at a temperature above the The phase transition temperature of the lipids is 30 ° C. in this special case.
  • the film is dried under high vacuum for 15 min.
  • the film is then hydrated with buffer (Tris 10 mM, pH 7.4 or PBS pH 7.4, other buffers and pH values are also possible).
  • buffer Tris 10 mM, pH 7.4 or PBS pH 7.4, other buffers and pH values are also possible.
  • the buffer is added to the flask together with a few small glass spheres and the batch is rolled for 45 min under gassing with N 2.
  • the flask is also immersed in the 30 ° C water bath.
  • MLV multilamellar liposomes
  • the MLV suspension is transferred to a special Sonicator glass vessel and the batch is sonicated for 15 seconds using a Probe Sonicator (here Soniprep 150 (preferred amplitude in microns 8-12)).
  • the suspension is immersed in an ice bath. After sonication, a pause of 30 seconds is taken to cool the suspension. This procedure (sonication - pause) is repeated 10 times.
  • the size measurement of the SUV obtained results in a size of 120 to 300 nm.
  • the liposomes thus produced are stable for at least 2 months and during this time their size cannot be measured.
  • the liposomes are filled into a sterile Eppendorf cone under the LF for further processing.
  • Liposomes The size exclusion chromatography is carried out with a Sephadex G 50 column, eluent is Tris buffer 10 mM, pH 7.4 (other buffers and pH values are also possible).
  • the coupling yield is carried out by means of a simultaneous approach with RGD labeled with fluorescent dye (5-DTAF) (Product Information Sheet 5-DTAF, Molecular Probes (MP 00143 08/27/95) “Conjugation with Amine-Reactive Probes”) and is at least included 6 ⁇ g RGD / 1 ⁇ mol PL (calculated for the actual amount of lipid with cholesterol)
  • the determination of the coupling efficiency can alternatively be carried out using HPLC (Gyongyossy-Issa et al.
  • the Covalent Coupling of Arg-Gly-Asp-Containing Peptides to Liposomes Purification and Biochemical Function of the Lipopeptide "Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 353, No. 1, May 1, (1998)).
  • the size of the liposomes coupled with RGD is between 100-150 nm.
  • the coupling can be modified according to Bogdanov in order to increase the coupling efficiency.
  • the coupling can also be carried out using an anchor lipid using the method described by Weissig.
  • the resulting lipid anchor-peptide construct like the lipid, can be used in the production of liposomes.
  • Example 2 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the sequence plasmid, liposome, protamine sulfate and PEI
  • the plasmid was mixed with PEI, which was described by Fischer et al. described method (Pharm. Res. 16, 1273-1279, 1999) was produced, or condensed with Lupasol (BASF, Ludwigshafen, Germany).
  • the complex is first formed by combining the negatively charged components plasmid DNA (pGI3, Clontech, Heidelberg, Germany) and liposomes (DLPE, DOPS, cholesterol, N-glutaryl-PE 3: 3: 3: 1). The dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation. The final volume of all components mentioned is 100 ⁇ l. First the buffer (Tris 10 mM, pH 7.4, other buffers and pH values are also possible) is added and 10 ⁇ g plasmid (10 ⁇ g / 60 ⁇ l) and 40 ⁇ g liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are combined by simple pipetting. The mixture is vortexed.
  • the DNA is then condensed by adding the cationic agent; first, 19.96 ⁇ g of protamine sulfate is added (charge ratio +/- 3.3: 1).
  • protamine sulfate is quickly added with an Eppendorf pipette and the mixture is mixed by pipetting up and down 10 times and the complex is coated with the lipids.
  • This is followed by the addition of 29.7 ⁇ g (amounts up to 16.2 ⁇ g are also possible) PEI (N / P ratio 20.7, reduction to 7.5 possible), another cationic agent.
  • 33 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with 250 ⁇ l ultrapure water and added to the batch in partial steps.
  • Example 3 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, liposome, and PEI
  • Example 2 The batch as described in Example 2 can also be prepared without protamine sulfate.
  • the manufacturing steps are identical, except for the addition of 19.96 ⁇ g protamine sulfate. Transfection experiments show almost identical efficiency.
  • Example 4 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, liposome, fusion peptide and PEI.
  • fusion peptide hemagglutinin (HA) derived from the membrane protein of the influenza virus (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 7934- 7938, 1992; Smoes & Slepushkin Gene Therapy 5, 955-964, 1998) were added to the liposomes at the beginning of the complex formation and the mixture was then used like the pure liposomes according to Example 3.
  • the concentration of the HA peptide can be between 0.1 and 1 nmol (1 - 10 ⁇ g) per batch.
  • Example 5 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, liposome, fusion peptide.
  • the complex formation can also take place by condensation of the DNA by PEI.
  • both substances are first combined (one-time addition or in proportions see above) and waited for 15 minutes.
  • the liposomes are then pipetted in and the mixture is pipetted up and down several times (preferably 10 times). This complex is also left to stand for 15 minutes before use.
  • the amount of liposomal formulation of plasmid, cationic agent and liposomes required for the transfection can be reduced to 5 ⁇ g plasmid / 3 cm dish. In addition, the volume of the formulation can be reduced.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and PEI.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is 245.93 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid 15 ⁇ g / 90 ⁇ l
  • the DNA is then condensed by adding the cationic agent, 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger amounts and a reduction to 9.79 ⁇ g are also possible).
  • PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with 106.43 ⁇ l ultrapure water and added to the batch in partial steps.
  • the addition takes place in 1 * 100 ⁇ i and 1 * 55.93 ⁇ l steps, 5 * pipette up and down the batch after the addition and then pipette up and down with 100 ⁇ l volume 5 * , wait 15 min.
  • 60 ⁇ g liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g) and added to the plasmid / PEI complex by simple pipetting.
  • the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 * .
  • the mixture is vortexed.
  • Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned.
  • Such a complex has a size of 180-250 nm after production and is used immediately after production for the cell culture experiments.
  • the Complexes are stable in the cell culture medium M199 + 10% FCS used for the transfection (size 300-400 nm).
  • Example 6 Preparation of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, liposome.
  • the liposomal formulation can be made without the HA fusion peptide.
  • the above-mentioned production instructions are used and only the addition of the HA peptide is omitted.
  • Example 7 Preparation of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, liposome, with and without HA peptide, with variable volumes.
  • the complex formation takes place first by combining the components plasmid DNA and PEI.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is: * a) 465 ⁇ l, b) 245.93 ⁇ l, c) 196.4 ⁇ l, d) 150 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid (15 ⁇ g / 90 ⁇ l or 75 ⁇ l) are added.
  • the DNA is then condensed by adding the cationic agent, 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger amounts and a reduction to 9.79 ⁇ g are also possible).
  • the cationic agent 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger amounts and a reduction to 9.79 ⁇ g are also possible).
  • 49.5 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with ultrapure water (325.5, 106.43, 56.9, 25.5 ⁇ i) and added to the mixture in partial steps.
  • the addition is carried out in 100 ⁇ l and / or variable (55.9, 75, 106 ⁇ l) steps, 5 * pipette up and down the batch after the addition and then pipette up and down with 100 ⁇ l volume 5 *, wait 15 min.
  • liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g).
  • This addition of the HA fusion peptide is optional, it can be omitted without major reduction in transfection.
  • the liposomes are added to the plasmid / PEI complex by simple pipetting. To do this, add 100 after the addition Pipette ⁇ l volume 10 * up and down. The mixture is vortexed. Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned. Such a complex has a size of 180-250 nm after production and is used immediately after production for the cell culture experiments. The complexes are stable in the cell culture medium M199 + 10% FCS used for the transfection (size 300-400 nm).
  • Example 8 Preparation of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, protamine sulfate, PEI, and liposome.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and protamine sulfate.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is: «a) 369 ⁇ l, b) 320 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid (15 ⁇ g / 90 ⁇ l) added.
  • the DNA is then condensed by adding the protamine sulfate (+/- ratio 3.3, larger or smaller amounts are also possible).
  • Protamine sulfate is diluted with ultrapure water (29.94 ⁇ g / 105 ⁇ l) and added to the DNA, pipette 10 * being pipetted up and down. The complex is left to mature for 15 minutes. Then 49.5 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with ultrapure water (106.43, 56.9 ⁇ l) and added to the batch in partial steps. The addition takes place in 100 ⁇ l and / or 55.9 ⁇ l steps, pipette 5 * up and down the batch after the addition and then pipette up and down with 100 ⁇ l volume 5 * , wait 15 min.
  • liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ i) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g).
  • This addition of the HA fusion peptide is optional, it can be omitted without major reduction in transfection.
  • the liposomes are added to the plasmid / PS / PEI complex by simple pipetting. For this purpose, the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 *. The mixture is vortexed. Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned. Such a complex has a size of after production 180-300 nm and is used for cell culture experiments immediately after production.
  • the complexes are stable in the cell culture medium M199 + 10% FCS used for the transfection (size 300-500 nm). These complexes can be prepared with different charge ratios, whereby both the PS and the PEI content can be varied. The volumes can also be selected to be larger or smaller.
  • Example 9 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, protamine sulfate, PEI, and liposome with a reduced PEI content.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and protamine sulfate.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is: «319 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid (15 ⁇ g / 90 ⁇ l) added.
  • the DNA is then condensed by adding the protamine sulfate (+/- ratio 3.3, larger or smaller amounts are also possible).
  • Protamine sulfate is diluted with ultrapure water (29.94 ⁇ g / 105 ⁇ l) and added to the DNA, pipette 10 * being pipetted up and down. The complex is left to mature for 15 minutes. Then 30 ⁇ l (N / P ratio 12.5) or 18 ⁇ l (N / P ratio 7.5) PEI solution 0.9 mg / ml are diluted with ultrapure water to 106 ⁇ l (76 or 88 ⁇ l) and added to the batch in partial steps. The addition is carried out in 106 ⁇ l steps, 10 * the batch after the addition and pipette off, wait 15 min.
  • liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g).
  • This addition of the HA fusion peptide is optional, it can be omitted without major reduction in transfection.
  • the liposomes are added to the plasmid / PS / PEI complex by simple pipetting. For this purpose, the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 * . The mixture is vortexed. Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned.
  • Example 10 Preparation of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, protamine sulfate, and liposome.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and PEI.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is: «246 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid 15 ⁇ g / 90 ⁇ l
  • the DNA is then condensed by adding 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger quantities and a reduction is also possible).
  • PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with ultrapure water (to 155.93 ⁇ l) and added to the batch in partial steps.
  • the addition is carried out in 100 ul and 55.9 .mu.l steps with 5 * the batch after addition of pipetting up and down and * and on-pipetting finally with 100 ul volumes of 5, 15 min wait.
  • the protamine sulfate is added (+/- ratio 3.3, larger or smaller amounts are also possible).
  • Protamine sulfate is diluted with ultrapure water (29.94 ⁇ g / 105 ⁇ l) and added to the DNA, pipette 10 * being pipetted up and down. The complex is left to mature for 15 minutes.
  • liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g).
  • This addition of the HA fusion peptide is optional, it can be omitted without major reduction in transfection.
  • the liposomes are added to the plasmid / PEI / PS complex by simple pipetting. For this purpose, the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 * . The mixture is vortexed. Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned.
  • Example 11 Preparation of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, protamine sulfate, and liposome with a reduced PEI content.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and PEI. The dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation. Depending on the batch type, the final volume of the two components mentioned is: «196 ⁇ l. First, the buffer (Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible) is introduced and 15 ⁇ g plasmid (15 ⁇ g / 90 ⁇ l) added.
  • the DNA is then condensed by adding 9.75 ⁇ g, 16.2 ⁇ g or 27 ⁇ g PEI (N / P ratio 4.5, 7.5, 12.5, larger amounts and a reduction are also possible, for example N / P ratio 1.8).
  • 10.86 ⁇ l, 18 ⁇ l or 30 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with ultrapure water (to 106 ⁇ l) and added to the mixture with pipetting up and down 10 times.
  • protamine sulfate is added (+/- ratio 3.3, larger or smaller amounts are also possible).
  • Protamine sulfate is diluted with ultrapure water (29.94 ⁇ g / 105 ⁇ l) and added to the DNA / PEI complex, pipetting 10 * up and down. The complex is left to mature for 15 minutes.
  • 60 ⁇ g liposomes (variable, between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are mixed with 15 ⁇ g HA fusion peptide (the amount can be reduced to 0.1 ⁇ g).
  • This addition of the HA fusion peptide is optional, it can be omitted without major reduction in transfection.
  • the liposomes are added to the plasmid / PEI / PS complex by simple pipetting.
  • the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 *.
  • the mixture is vortexed.
  • Complexes of similar effectiveness are also obtained by simply mixing all of the components mentioned.
  • Example 12 Production of a liposomal vector complex according to the invention in the order plasmid, PEI, and liposome with an increased and reduced lipid content.
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and PEI.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is 245.93 ⁇ l.
  • First the buffer (Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible) is placed in front and 15 ⁇ g plasmid (15 ⁇ g / 90 ⁇ l) added.
  • the DNA is then condensed by adding the cationic agent, 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger amounts and a reduction is also possible).
  • 49.5 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with 106.43 ⁇ l ultrapure water and added to the batch in partial steps.
  • the addition takes place in 1 * 100 ⁇ l and 1 * 55.93 ⁇ l steps, 5 * pipette up and down the batch after the addition and then pipette up and down with 100 ⁇ l volume 5 *, wait 15 min. 75, 45 and 30 ⁇ g liposomes (between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) are added to the plasmid / PEI complex by simple pipetting.
  • the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 * .
  • the proportion of liposomes used can also be increased significantly to 10 times the amount.
  • Example 13 Biological testing of the liposomal vector complexes according to the invention in different cell cultures
  • the complex is first formed by combining the components plasmid DNA and PEI.
  • the dilution of the solutions must be taken into account to prevent irreversible precipitate formation.
  • the final volume of the two components mentioned is 245.93 ⁇ l.
  • the buffer Tris 10 mM, pH 7.8, other buffers and pH values also possible
  • 15 ⁇ g plasmid 15 ⁇ g / 90 ⁇ l
  • the DNA is then condensed by adding the cationic agent, 44.55 ⁇ g PEI (N / P ratio 20.7, larger amounts and a reduction is also possible).
  • 49.5 ⁇ l PEI solution 0.9 mg / ml is diluted with 106.43 ⁇ l ultrapure water and added to the batch in partial steps.
  • the addition takes place in 1 * 100 ⁇ l and 1 * 55.93 ⁇ l steps, 5 * pipette up and down the batch after the addition and then pipette up and down with 100 ⁇ l volume 5 *, wait 15 min. 60 ⁇ g liposomes (between 1 and 6 ⁇ g / ⁇ l) with and without a coupled RGD targetor (RGD binds to the ⁇ v ß 3 receptor) are added to the plasmid / PEI complex by simple pipetting. For this purpose, the batch is pipetted up and down with 100 ⁇ l volume 10 *. The mixture is divided into 3 aliquots and an aliquot is placed on a 3 cm dish. The triplicate was placed on a 10 cm dish for FACS analysis.
  • the liposomal Vector complexes prepared as in Examples 1-11, were added to the cells (in 10 cm dishes for FACS analysis; 3 cm dishes for luciferase and GFP microscopy) and incubated at 37 ° C. for 1-6 hours. The cells were subsequently washed and incubated in the fresh cell culture medium for a further 24-48 hours. The successful uptake of the complexes into the cell, the transcription, and the expression of the reporter gene in the plasmid were then measured by detecting the GFP autofluorescence, luciferase assay, and FACS analysis. Results of the FACS analysis are summarized in the following table.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen liposomalen Vektorkomplex enthaltend folgende Komponenten: a) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge; b) einen kationischen Träger, welcher die Komponente a) kondensiert und lysosomolytisch und/oder lysosomotrop ist; c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; d) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat; und e) optional eine fusogene Substanz, welche die lysosomolytische und/oder lysosomotrope Funktion der Komponente b) ersetzen kann; wobei bei Vorhandensein einer fusogenen Substanz (e), der kationische Träger (b) nicht lysosomolytisch und/oder lysosomotrop sein muß, seine Herstellung und Verwendung.

Description

Neue liposomale Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie
Die wesentlichen Komponenten von Vektoren für die Gentherapie sind bislang Nukleinsäuresequenzen, welche mit einem nichtviralen Träger (z.B. kationische Lipide oder kationische Polymere) komplexiert oder in ein Virus eingefügt werden.
Die bisherige Erfahrung mit solchen Vektoren bei der Gentherapie unterschiedlichster Erkrankungen, insbesondere jedoch von Tumorerkrankungen, zeigt, daß in der Zellkultur besonders nichtvirale Vektorkomplexe nur eine relativ geringe Anzahl von Zellen (meist zwischen 1 % und 30%) transduziereir können; des weiteren, daß nach Verabreichung eines gentherapeutischen Vektors in den Kreislauf eines Organismusses diese Vektoren in kurzer Zeit aus dem Kreislauf eliminiert werden und für die Bindung an die Zielzellen und zur Transfektion dieser Zielzellen nicht mehr zur Verfügung stehen (Ogris et al. Gene Ther. 6: 595, 1999; Dash et al., Gene Ther. 6: 643, 1999; Li et al., Gene Ther. 5: 930, 1998; Liu et al. Gene Ther. 4: 517, 1997).
Diese Elimination kann erfolgen durch Degradation der DNA oder durch schnelle Ablagerung der Vektoren in der Lunge, der Leber oder dem sogenannten retikuloendothelialen System (RES), welches besonders ausgebildet ist in der Milz und den Lymphknoten (Zhu et al., Science 261 : 209, 1993).
Die Ursachen der schnellen Elimination sind vielgestaltig. Sie können sein: eine zu große negative oder positive Ladung, ein zu großes Volumen oder eine Opsonierung der Vektorpartikel durch Blutproteine. Bei viralen Vektoren können sie des weiteren sein die Bindung der Virushüllproteine an virusspezifische Rezeptoren in den Organen und/oder auch Antikörper oder Immunzellen-spezifisch für die Viren, welche an die Vektoren binden und diese hierdurch eliminieren.
Die bisherige Erfahrung zeigt des weiteren, daß die Kopplung oder Einfügung eines zielzellspezifischen Liganden in den Vektorkomplex dessen schnelle Elimination nach Verabreichung in den Blutkreislauf nicht wesentlich vermindert. In Kenntnis dieser Probleme besteht die dringliche Notwendigkeit nach neuen Zubereitungen von Vektoren, die möglichst viele Zellen in der Zellkultur transfizieren und die nach Verabreichung in einen lebenden Organismus möglichst lang im Kreislauf verbleiben und nicht vorzeitig aus dem Kreislauf eliminiert werden. Um die Elimination von kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren im Komplex mit Nukleinsäuresequenzen aus dem Blutkreislauf zu vermindern, wurde Polyethylen- glykol (Senior et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1062: 77, 1991 ; Mori et al., FEBS Lett 284: 263, 1991 ; Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), Vinylpolymere (Torchilin et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1195: 181 , 1994) oder andere amphipatische Polymere (Woodle et al., Bioconjugat. Chem. 5: 493, 1994) an die kationischen Lipide oder kationischen Polymere gekoppelt oder mit Hilfe negativ geladener Lipide anionische Liposomen hergestellt, in welche die Nukleinsäure-sequenzen im Komplex mit kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren eingeschlossen waren (US Patent Nr. 4,946,787; US Patent Nr. 4,245,737; US Patent Nr. 5,480,463; Heywood und Eanes, Calc. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee und Huang, J. Biol. Chem. 271 : 8481 , 1996; Balicki und Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8: 57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8: 1 14, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8: 485, 1998).
Derartige Modifikationen führten beispielsweise zu einer Stabilisierung der Vektorpartikelgröße, inhibierten die Aggregation der Vektoren mit sich selbst oder mit Blutzellen, reduzierten die Opsonierung von Vektoren durch Bindung von Immungtobulinen, Complementfaktoren, Fibrinogen oder Fibronektin, schützten (adeno-)virale Vektoren vor der Elimination durch Antikörper (Chillon et al., Gene Ther. 5: 995, 1998) und bewirkten eine Verlängerung der Blutverweilzeit von Vektoren, eine deutlich stärkere Anreicherung in subkutan wachsende Tumoren und eine Transduktion der Tumorzellen (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999).
Zugleich konnte jedoch auch in der Lunge, der Milz und der Leber eine beträchtliche Anreicherung der Vektoren und Transduktion der Gewebezellen in diesen Organen festgestellt werden (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), so daß gefolgert werden kann, daß beispielsweise die Kopplung von PEG zwar eine Verbesserung, aber noch keine Optimierung der Verteilung von Vektoren bewirkt.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind neue liposomale Vektorkomplexe für die Gentherapie bestehend aus folgenden Komponenten:
a) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge; b) einen kationischen Träger welcher die Komponente a) kondensiert und lysosomolytisch und/oder lysosomotrop ist; c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; d) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat; e) optional eine fusogene Substanz, welche die lysosomolytische und/oder lysosomotrope Funktion der Kompenente b) ersetzen kann; wobei bei Vorhandensein einer fusogenen Substanz (e) der kationische Träger (b) nicht lysosomolytisch und/oder lysosomotrop sein muß.
Komponente a) kann eine nicht-modifizierte oder modifizierte DNA-Sequenz oder eine nicht-modifizierte oder modifizierte RNA-Sequenz sein. Die Nukleotidsequenz kann eine anti-DNA (Triplex) oder anti-RNA (antisense; Ribozym) Funktion ausüben oder für eine derartig wirkende RNA-Sequenz oder für ein Protein kodieren. Die Nukleotidsequenzen und ihre Modifikation kann dergestalt sein, daß die Nukleotidsequenz weitgehend resistent ist gegen den Abbau durch DNAsen oder RNAsen. Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen und ihre Modifikationen sind in Breaker, Nature Biotechnol. 15: 427, 1997; Gerwik, Critical Reviews in Oncogenesis 8: 93, 1997; Mukhopadhyay et al., Crit. Rev. Oncogen. 7: 151 , 1996; Mercola et al., Cancer Gene Ther. 2: 47, 1995; Frank-Kamenetski, Annu. Rev. Biochem. 64: 65, 1995 und Fräser et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 4: 637, 1995 dargestellt. Die DNA- Sequenz kann linear oder zirkulär, beispielsweise in Form eines Plasmids vorliegen. Komponente a) kann des weiteren ein Virus darstellen, bevorzugt ein Virus, in welches mit den dem Fachmann bekannten Methoden eine für das Virus fremde Nukleinsäuresequenz eingefügt wurde. Beispiele für derartige Viren sind RTV, AAV und Lentiviren. Derartige und weitere Beispiele sind von Vile, Nature Biotechnol. 15: 840, 1997; McKeon et al., Human Gene Ther. 7: 1615, 1996; Flotte et al., Gene Ther. 2: 357, 1995; Jolly, Cancer Gene Ther. 1 : 51 , 1994; Dubensky et al., J. Virol. 70: 508, 1996 beschrieben worden.
Komponente b) stellt einen kationischen Träger dar, welcher die Komponente a) kondensiert und zugleich lysosomolytisch und/oder lysosomotrop und/oder lysosomotrope Eigenschaften aufweist.
Entsprechend dieser Erfindung stellt in einer besonderen Ausführungsform die Komponente b) ein kationisches Polymer dar, beispielsweise beschrieben von Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 7297, 1995; Kaneda et al., Science 243: 375, 1989; Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527, 1990; Baker et al., Gene Ther. 4: 773, 1997; Fritz et al., Human Gene Ther. 7: 1395, 1996; Wolfert et al., Human Gene Ther. 7: 2123, 1996 und Solodin et al., Biochem. 34: 13537, 1995. Das von Boussif beschriebene Polyethylenimin (PEI) führt bei der Verwendung als Vektor für die Gentherapie nach der von demselben Autor beschriebenen Methode letztlich zu einem Anschwellen und Zerplatzen der Lysosomen, d.h. PEI wirkt lysosomolytisch.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung stellt die Komponente b) ein Polyethylenimin (PEI) dar, in einer weiteren besonderen
Ausführungsform dieser Erfindung besitzt das Polyethylenimin ein Molekulargewicht in einem Bereich von 500-25.000 Da und in einer weiteren Ausführungsform ein Molekulargewicht von 5000-10.000 Da in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ein Molekulargewicht von durchschnittlich etwa 2000 Da und wurde hergestellt, wie in der Patentanmeldung EP-A 0 905 254 beschrieben.
Hochverzweigtkettiges PEI (Lupasol ®, BASF, Ludwigshafen, Germany) und ein niedrigverzweigtkettiges PEI-Derivat, das nach Fischer et al. (Pharm. Res. 16, 1273- 1279, 1999) hergestellt wurde, werden in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung verwendet.
Komponente c) stellt ein beliebiges Liposom mit einer beliebigen, dem Fachmann bekannten Zusammensetzung dar. In einer besonderen Ausführungsform hat dieses Liposom eine anionische Ladung. In einer weiteren besonderen Ausführungsform ähnelt die Lipid- und Phospholipidzusammensetzung des anioπischen Liposoms der Zusammensetzung einer Virushülle. Die Herstellung von Liposomen mit anionischer Ladung ist bereits vielfach beschrieben worden, so beispielsweise von in den US Patenten Nr. US 4,946,787, US 4,245,737, US 5,480,463, sowie bei Heywood und Eanes, Calc. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee und Huang, J. Biol. Chem. 271 : 8481 , 1996; Balicki und Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8: 57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8: 114, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8: 485, 1998.
Die Herstellung von Liposomen, die Virushüllen ähnlich sind, wurde beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. US 5,252,348; US 5,753,258; US 5,766,625 und EP-A 0 555 333.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Ergänzung der erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe durch Hinzufügung einer Komponente d).
Diese Komponente d) stellt einen Liganden dar, welcher eine Bindungsstelle für die Zielzelle hat und mit einem Lipid konjugiert ist. Die Zielzellspezifität des Liganden kann beliebig sein.
Bevorzugt werden Zielzellspezifitäten von Liganden, ausgewählt aus einer Gruppe, im Detail beschrieben bei
- mehrfach funktionelle Ligandensysteme zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen EP-A 0 846 772 - einzelkettige, zweifach-antigenbindende Moleküle (DE 198161417, noch unveröffentlicht)
- spezifisch Zelimembran-penetrierende Moleküle (DE 19850987.1 , noch unveröffentlicht) oder - zielzellspezifischen, multivalenten Proteinen (DE 19910419.0, noch unveröffentlicht).
Die Art des Lipids kann beliebig sein, bevorzugt werden jedoch natürlich vorkommende Lipide, wie beispielsweise in den US-Patenten Nr. US 5,252,348; US 5,753,258; US 5,766,625 und EP-A 0 555 333 beschrieben.
Die Konjugation des Lipids an den zielzellspezifischen Liganden erfolgt mit einer der dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise wie in US-Patent Nr. US 5,662,930 beschrieben.
Die Einfügung von Komponente d) in das erfindungsgemäße Liposom (Komponente c) erfolgt mit der dem Fachmann bekannten Methode, beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. US 5,252,348 und US 5,753,258).
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Ergänzung der erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe durch Hinzufügung einer Komponente e). Diese Komponente e) stellt die funktionale Sequenz eines Fusionspeptides, bevorzugt aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutinin vom Influenza Virus (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89(17), 7934-7938) Liganden dar, welches die Freisetzung des Liposomeninhaltes aus dem Endosom erleichtert.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Vektorkomplexes bestehend aus den Komponenten a), b) und c) oder a), b), c) und d) oder a), b), c), d) und e) erfolgt mit den dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise derartig, daß
im 1. Schritt Komponente a) mit Komponente b) vermischt wird, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt werden soll, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist und nachfolgend
- im 2. Schritt der aus Schritt (1 ) resultierende Komplex in die Komponente c) eingeführt wird, die die Komponente d) bereits enthalten kann, wobei das
Mischungsverhältnis aller Komponenten so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder anionisch oder kationisch ist;
- in einem 3. Schritt kann auch optional die Komponente d) in die Komponente c) nachfolgend Schritt 2 eingeführt werden; und
- in einem 4. Schritt optional Komponente e) in den aus Schritt 2 oder 3 resultierenden Komplex eingefügt wird, oder, alternativ, Komponente e) zu Komponente c) vor Schritt 2 gegeben wird.
Die aus diesen Herstellungsschritten resultierenden liposomalen Vektorkomplexe haben einen Durchmesser von 100 - 600 nm und eine kationische oder anionische Ladung, vorzugsweise einen Durchmesser von 100 - 300 nm und eine anionische Ladung.
Die erfindungsgemässen Liposomen reichern sich beispielsweise im Tumorgefässbett an (Unezaki et al, Int. J. Pharmac. 114:11 , 1996; Sadzuka et al., Cancer Lett. 127:99, 1998; Wunder et al., Int. J. Oncol. 11 :497, 1997). Des Weiteren binden die erfindungsgemässen Liposomen über ihre Komponente d) an die Zielzelle und transfizieren diese, so daß die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemässen Vektorkomplex in der Zelle freigesetzt wird.
Diese Nukleinsäuresequenz kann, je nach Zusammensetzung, in der Zielzelle ihre Wirkung entfalten, d.h. beispielsweise die Transkription oder Translation eines bestimmten Genes oder einer bestimmten RNA hemmen, oder die Zelle transduzieren zur Expression der RNA oder des Proteins kodiert von dieser Nukleinsäuresequenz.
Die Transduktionsrate durch die erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe ist im Vergleich zur bestehenden, dem Fachmann bekannten Technik, erheblich verbessert und liegt, beispielsweise in der Zellkultur, bei über 80% der Zellen, welche einen Rezeptor für die Komponente d) tragen und mit den erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexen in Kontakt gebracht werden.
Die erfindungsgemäßen Vektorkomplexe sind somit bevorzugt geeignet für die in vitro Transduktion von Zellen und für die in vivo Verabreichung mit dem Ziel der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen.
Gegenstand der Erfindung ist ein liposomaler Vektorkomplex enhaltend folgende Komponenten: f) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge; g) einen kationischen Träger welcher die Komponente a) kondensiert und lysosomolytisch und/oder lysosomotrop ist; h) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; i) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat; j) optional eine fusogene Substanz, welche die lysosomolytische und/oder lysosomotrope Funktion der Kompenente b) ersetzen kann; wobei bei Vorhandensein einer fusogenen Substanz (e) der kationische Träger (b) nicht lysosomolytisch und/oder lysosomotrop sein muß; und bei welchem vorzugsweise die Komponente a) eine Polynukleinsäure ist, die Komponente b) ein kationisches Protein, ein kationisches Polymer, oder eine Kombination von beiden ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der kationische Träger Protaminsulfat. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente b) ein kationisches Polymer, insbesondere Polyethylenimin (PEI), besonders bevorzugt PEI mit einem Molekulargewicht von durchschnittlich 2,000 - 10,000 Da, ganz besonders bevorzugt ein hochverzweigtkettiges oder niedrigverzweigtkettiges PEI.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente c) aufgebaut aus Phosphatidylsehn, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Ankerlipid, und Cholesterol, besonders bevorzugt als Ankerlipid ist ein N-Carboxy- Phosphatidylethanolamin, z.B. ein N-Glutaryl-Phosphatidylethanotamin; und vorzugsweise die Komponente d) an eine der Komponenten a) - c) ohne Anker, über einen Anker oder über ein Ankerlipid konjugiert ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein liposomaler Vektorkomplex, bei dem die Komponente d) nicht kovalent in die Liposomenoberfläche eingebettet ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein liposomaler Vektorkomplex dessen Zielzelle eine Gewebezelle, eine Epithelzelle, eine Endothelzelle, eine Blutzelle, eine Leukämiezelle oder eine Tumorzelle ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein liposomaler Vektorkomplex dessen Komponente e) die funktionelle Sequenz aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutin des Influenzavirus oder ein synthetisches Derivat davon ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein liposomaler Vektorkomplex für die Transduktion und Transfektion von Zellen in vitro oder in vivo, wobei in vitro vorzugsweise Serum verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines liposomalen Vektorkomplexes zur Herstellung eines Diagnosticums zur Anwendung in vitro und in vivo und / oder zur Herstellung eines Heilmittels für die Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung in vivo und ex vivo, wobei die Verabreichung vorzugsweise auf die Haut, auf eine Schleimhaut, in die Lunge, am Auge, in einer Körperhöhle, in das Bindegewebe, in den Muskel, in ein Organ oder in den Blutkreislauf erfolgt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Vektorkomplexes, wobei
(1 ) Komponente a) mit Komponente b) vermischt wird,
(2) der aus Schritt (1 ) resultierende Komplex in die Komponente c) eingeführt wird, wobei das Mischungsverhältnis aller Komponenten so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist;
(3) optional Komponente d) in die Komponente c) vor oder nach der Komplexbildung eingefügt wird;
(4) optional Komponente e) in den aus Schritt (2) und (3) resultierenden Komplex oder zu Komponente c) vor der Komplexbildung eingefügt wird; wobei vorzugsweise das resultierende Produkt lyophilisiert oder aerosolisiert wird.
Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens
Die folgenden Beispiele sollen verdeutlichen, wie man die vorliegende Erfindung ausführen könnte.
Beispiel 1 : Modifiziertes Peptid mit RGD-Sequenz
Zur Verbesserung des Targetings der Integrin Rezeptoren wurde eine cyclisches Peptid synthetisiert. Es handelt sich um ein CDCRGDCFC-Peptid (Arap W., Pasqualini, R. und Ruoslahti, E. (1998) Science, 279: 377-380; Pasqualini, R. Koivunen, E. Ruoslathi E., Nature Biotech. (1997) 15:542-546) mit einem zusätzlichen Arginin am N-terminalen Ende (FW 1163.35). Die terminale Aminosäure verringert das Ausmaß der Kopplung des Peptids am aktiven Zentrum, der RGD- Sequenz.
Die Cyclisierung findet durch Oxidation der Thiolgruppen zu Disulfid-Brücken statt. Die erfolgreiche Cyclisierung wird mittels HPLC-Analytik überprüft. Nach der HPLC-Aufreinigung wird das Peptid lyophilisiert, bei 4°C aufbewahrt und vor Gebrauch in Puffer gelöst (250 μg/150 μl Tris Puffer 10 mM pH 7.4 oder PBS- Puffer pH 7.4).
Herstellung der Liposomen Material
Stammlösungen
Die Herstellung der Liposomen erfolgt nach der Film/Hydration-Methode. Die in
Chloroform gelösten Lipide und der Lipidanker werden in einen 100 ml Rundkolben pipettiert und das Chloroform 15 min abgezogen. Der Kolben taucht dabei in ein temperaturkoπtrolliertes Wasserbad mit einer Temperatur, die über der Phasenübergaπgstemperatur der Lipide liegt, in diesem speziellen Fall 30 °C. Zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels wird der Film 15 min im Hochvakuum getrocknet.
Es folgt die Hydratisierung des Films mit Puffer (Tris 10 mM, pH 7.4 oder PBS pH 7.4, andere Puffer und pH-Werte sind ebenfalls möglich). Der Puffer wird zusammen mit wenigen kleinen Glaskügelchen in den Kolben gegeben und der Ansatz unter N2- Begasung 45 min rolliert, auch hierbei taucht der Kolben in das 30°C warme Wasserbad. Zum Quellen des Lipidfilms und zur Erzeugung von multilamellaren Liposomen (MLV) wird der Ansatz für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen [1 , S.38]. Die MLV-Suspension wird in ein spezielles Sonicator-Glasgefäß überführt und der Ansatz 15 sec mittels eines Probe Sonicators (hier Soniprep 150 (bevorzugt eingestellte Amplitude in Mikron 8-12)) beschallt. Die Suspension taucht dabei in ein Eisbad ein. Nach der Beschallung wird zum Abkühlen der Suspension eine Pause von 30 sec eingelegt. Diese Prozedur (Beschallung - Pause) wird 10mal wiederholt. Die Größenmessung der erhaltenen SUV ergibt eine Größe von 120 bis 300 nm. Nach anschließender Extrusion [1 , S.52-56][2] mittels LiposoFast durch einen Polycarbonatfilter, Porengröße 50 nm, reduziert sich die Größe in diesem Beispiel auf einen Wert zwischen 107.5-128 nm. Die so hergestellten Liposomen sind mindestens 2 Monate stabil und verändern in dieser Zeit ihre Größe nicht meßbar. Die Abfüllung der Liposomen zur weiteren Verarbeitung erfolgt unter dem LF in ein steriles Eppendorf-Hütchen.
Literatur [1] Roger R.C. New, „Preparation of Iiposomes0 chapter 2, Liposomes a practical approach (1989) [2] Olson et al. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 394, 483
Kopplung des Peptides an Lipidanker (WeissigN., Lasch.J., Klibanov,A.L.Torchilin,V.P., A new hydrophobic anchor for the attachment of proteins to liposomal membranes. FEBS Lett. 202, 1986, 86-90; Bogdanov et al., „Protein immobilization on the surface of liposomes via carbodiimide activation in the presence of N-hydroxysulfosuccinimide", FEBS Lett. 231 , 1988, 381-384; Weissig, Habilitationsschrift „Methoden zur Darstellung funktionalisierter Liposomen mit Adjuvanseffekt" MLU Halle-Wittenberg (1992); Diplomarbeit Ragna Schmidt, Universität Halle (1997). [3] Martin et al. „Covalent attachment of protein to Iiposomes0 chapter 4, Roger R.C. New, Liposomes a practical approach (1989))
Material
Zunächst wird die Carboxylgruppe des Glutarsäurerestes des Lipidankers durch die Zugabe von 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid aktiviert [3, S. 170].
Dazu werden 400 μl der Liposomensuspension (4 μmol Gesamtiipid, 0,4 μmol N-glut- PE, Medium Tris-Puffer pH 8, 10 mM, andere Puffer und pH-Werte sind ebenfalls möglich) gevortext und 3.5 mg EDC hinzugewogen. Der Ansatz wird erneut gevortext und 5 h vor Licht geschützt, geschüttelt (IKA-Vibrax-VXR). Es bildet sich die aktivierte Zwischenstufe, das O-Acyl-Intermediat, an welches das Peptid mit einer freien Aminofunktion unter Ausbildung eines Amids bindet. 250 μg RGD gelöst in PBS-Puffer pH 7.4 oder Tris-Puffer 10 mM pH 7.4 (250 μg / 150 μl, andere Puffer und pH-Werte sind ebenfalls möglich) werden hinzugeben, der Ansatz gevortext und über Nacht schütteln gelassen. Nach erfolgter Kopplung erfolgt die Gelchromatographische Abtrennung des ungebundenen Peptids von den
Liposomen. Die Größenausschlußchromatographie wird mit einer Sephadex G 50 Säule durchgeführt, Eluent ist Tris Puffer 10 mM, pH 7.4 (andere Puffer und pH- Werte sind ebenfalls möglich). Die Kopplungsausbeute wird über einen gleichzeitig durchgeführten Ansatz mit Fluoreszenzfarbstoff (5-DTAF) gelabeltem RGD durchgeführt (Product Information Sheet 5-DTAF, Molecular Probes (MP 00143 08/27/95) „Conjugation with Amine- Reactive Probes") und liegt mindestens bei 6 μg RGD/ 1 μmol PL (berechnet für tatsächliche Lipidmenge mit Cholesterol). Die Bestimmung der Kopplungseffizienz kann auch alternativ mittels HPLC erfolgen (Gyongyossy-Issa et al. „The Covalent Coupling of Arg-Gly-Asp-Containing Peptides to Liposomes: Purification and Biochemical Function of the Lipopeptide" Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 353, No. 1 , May 1 , (1998)). Die Größe der mit RGD gekoppelten Liposomen liegt zwischen 100-150 nm. Die Kopplung kann nach Bogdanov modifiziert werden um die Kopplungseffizienz zu erhöhen. Die Kopplung kann nach dem von Weissig beschriebenen Verfahren auch allein mit einem Ankerlipid durchgeführt werden. Das resultierende Lipidanker-Peptid Konstrukt kann wie das Lipid bei der Herstellung von Liposomem eingesetzt werden.
Beispiel 2: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, Liposom, Protaminsulfat und PEI
Das Plasmid wurde mit PEI, das nach der von Fischer et al. beschriebenen Methode (Pharm. Res. 16, 1273-1279, 1999) hergestellt wurde, oder mit Lupasol (BASF, Ludwigshafen, Germany) kondensiert.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der negativ geladenen Bestandteile Plasmid DNA (pGI3, Clontech, Heidelberg, Germany) und Liposomen (DLPE, DOPS, Cholesterol, N-Glutaryl-PE 3:3:3:1 ). Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen aller genannten Bestandteile beträgt 100 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.4, andere Puffer und pH-Werte sind ebenfalls möglich) vorgelegt und 10 μg Plasmid (10 μg/60 μl) sowie 40 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) zusammengegeben durch einfaches Pipettieren. Die Mischung wird gevortext. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agens, zunächst wird 19.96 μg Protaminsulfat zugeben (charge ratio +/- 3.3:1 ). Dazu wird das Protaminsulfat mit einer Eppendorfpipette schnell dazu gegeben und der Ansatz durch 10maliges Auf- und Abpipettieren vermischt und ein Coaten des Komplexes mit den Lipiden erzielt. Danach erfolgt die Zugabe von 29.7 μg ( Mengen bis 16.2 μg sind ebenfalls möglich) PEI (N/P ratio 20.7, Reduzierung bis 7.5 möglich), ein weiteres kationisches Agens. Dazu werden 33 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 250 μl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 2*100 μl und 1 * 85 μl Schritten, je 10* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren, 15 min warten. Ein derartiger Komplex hat 1 h nach der Herstellung ein Größe von 180-300 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 360-500 nm).
Beispiel 3: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, Liposom, und PEI
Der Ansatz wie in Beispiel 2 beschrieben kann auch ohne Protaminsulfat hergestellt werden. Die Herstellungsschritte sind identisch, mit Ausnahme der Zugabe von 19.96 μg Protaminsulfat. Transfektionsexperimente zeigen nahezu identische Effizienz.
Beispiel 4: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, Liposom, Fusionspeptid, und PEI.
Die Herstellung erfolgt gemäss der Methode und Reihenfolge wie beschrieben in Beispiel 3. Zusätzlich wird ein "Fusionspeptid", vom Membranprotein des Influenza Virus abstammendes Hemagglutinin (HA) (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 7934-7938, 1992; Smoes & Slepushkin Gene Therapy 5, 955-964, 1998) zu Beginn der Komplexbildung zu den Liposomen gegeben und die Mischung dann wie die reinen Liposomen laut Beispiel 3 verwendet. Die Konzentration des HA-Peptides kann zwischen 0.1 und 1 nmol (1 - 10 μg) pro Ansatz betragen. Beispiel 5: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, Liposom, Fusionspeptid.
Die Komplexbildung kann ebenfalls durch Kondensation der DNA durch PEI erfolgen. Dazu werden zunächst beide Substanzen zusammengegeben (einmalige Zugabe oder in Anteilen s.o.) und 15 min gewartet. Danach werden die Liposomen hinzupipettiert und die Mischung mehrfach (vorzugsweise 10 x) auf- und abpipettiert. Dieser Komplex wird vor Anwendung ebenfalls 15 min stehen gelassen. Die für die Transfektion benötigte Menge an liposomaler Formulierung aus Plasmid, kationischem Agenz und Liposomen, kann reduziert werden auf 5 μg Plasmid / 3 cm Schale. Zudem läßt sich das Volumen der Formulierung vermindern.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt 245.93 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg/90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, von 44.55 μg PEI (N/P Verhältnis 20.7, größere Mengen und eine Reduzierung bis 9.79 μg sind ebenfalls möglich). Dazu werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 106.43 μl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 1*100 μi und 1* 55.93 μl Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich) und zu dem Plasmid/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt. Ein derartiger Komplex hat nach der Herstellung eine Größe von 180-250 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 300-400 nm).
Beispiel 6: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, Liposom.
Die liposomale Formulierung kann ohne das HA-Fusionspeptid hergestellt werden. Dazu wird oben genannte Herstellungsvorschrift verwendet und nur die Zugabe des HA-Peptides weggelassen.
Beispiel 7: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, Liposom, mit und ohne HA-Peptid, mit variablen Volumina.
Die Komplexbilduπg erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt je nach Ansatztyp: * a) 465 μl, b) 245.93 μl, c) 196.4 μl, d) 150 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg/90 μl oder 75 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, von 44.55 μg PEI (N/P ratio 20.7, größere Mengen und eine Reduzierung bis 9.79 μg sind ebenfalls möglich). Dazu werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit Reinstwasser verdünnt (325.5, 106.43, 56.9, 25.5 μi) und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 100 μl und / oder variablen (55.9, 75, 106 μl) Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich). Diese Zugabe des HA- Fusionspeptide ist optional, es kann ohne größere Verminderung der Transfektion weggelassen werden. Die Liposomen werden zu dem Plasmid/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt. Ein derartiger Komplex hat nach der Herstellung eine Größe von 180-250 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 300-400 nm).
Beispiel 8: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, Protaminsulfat, PEI, und Liposom.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und Protaminsulfat. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt je nach Ansatztyp: « a) 369 μl, b) 320 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg / 90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des Protaminsulfates (+/- ratio 3.3, größere oder kleinere Mengen sind ebenfalls möglich). Protaminsulfat wird mit Reinstwasser verdünnt (29.94 μg / 105 μl) und zu der DNA gegeben, wobei der Ansatz 10 * auf und abpipettiert wird. Der Komplex wird 15 min zum Reifen stehen gelassen. Danach werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit Reinstwasser verdünnt (106.43, 56.9 μl) und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 100 μl und / oder 55.9 μl Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μi) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich). Diese Zugabe des HA- Fusionspeptide ist optional, es kann ohne größere Verminderung der Transfektion weggelassen werden. Die Liposomen werden zu dem Plasmid/PS/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt. Ein derartiger Komplex hat nach der Herstellung eine Größe von 180-300 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 300-500 nm). Diese Komplexe können mit anderen Ladungsverhältnissen hergestellt werden, wobei sowohl der Anteil des PS, als auch des PEI variiert werden kann. Die Volumina können dabei ebenfalls größer oder geringer gewählt werden.
Beispiel 9: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, Protaminsulfat, PEI, und Liposom mit reduziertem PEI Anteil.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und Protaminsulfat. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt je nach Ansatztyp: « 319 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg / 90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des Protaminsulfates (+/- ratio 3.3, größere oder kleinere Mengen sind ebenfalls möglich). Protaminsulfat wird mit Reinstwasser verdünnt (29.94 μg / 105 μl) und zu der DNA gegeben, wobei der Ansatz 10 * auf und abpipettiert wird. Der Komplex wird 15 min zum Reifen stehen gelassen. Danach werden 30 μl (N/P ratio 12.5) oder 18 μl (N/P ratio 7.5) PEI Lösung 0.9 mg/ml mit Reinstwasser zu 106 μl verdünnt (76 oder 88μl) und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 106 μl Schritten, je 10* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren, 15 min warten. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich). Diese Zugabe des HA-Fusionspeptide ist optional, es kann ohne größere Verminderung der Transfektion weggelassen werden. Die Liposomen werden zu dem Plasmid/PS/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt. Beispiel 10: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, Protaminsulfat, und Liposom.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt je nach Ansatztyp: « 246 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg / 90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation-der DNA durch Zugabe von 44.55 μg PEI (N/P ratio 20.7, größere Mengen und eine Reduzierung sind ebenfalls möglich). Dazu werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit Reinstwasser verdünnt (zu 155.93 μl) und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 100 μl und 55.9 μl Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. Danach erfolgt die Zugabe des Protaminsulftates (+/- ratio 3.3, größere oder kleinere Mengen sind ebenfalls möglich). Protaminsulfat wird mit Reinstwasser verdünnt (29.94 μg / 105 μl) und zu der DNA gegeben, wobei der Ansatz 10 * auf und abpipettiert wird. Der Komplex wird 15 min zum Reifen stehen gelassen. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich). Diese Zugabe des HA- Fusionspeptide ist optional, es kann ohne größere Verminderung der Transfektion weggelassen werden. Die Liposomen werden zu dem Plasmid/PEI/PS-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt.
Beispiel 11 : Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, Protaminsulfat, und Liposom mit reduziertem PEI Anteil. Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt je nach Ansatztyp: « 196 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg / 90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe von 9.75 μg, 16.2 μg oder 27 μg PEI (N/P ratio 4.5, 7.5, 12.5, größere Mengen und eine Reduzierung sind ebenfalls möglich, z.B N/P ratio 1.8). Dazu werden 10.86 μl, 18 μl oder 30 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit Reinstwasser verdünnt (zu 106 μl) und unter 10 maligem Auf- und Abpipettieren zum Ansatz zugeben.
Danach erfolgt die Zugabe des Protaminsulfates (+/- ratio 3.3, größere oder kleinere Mengen sind ebenfalls möglich). Protaminsulfat wird mit Reinstwasser verdünnt (29.94 μg / 105 μl) und zum DNA/PEI Komplex gegeben, wobei der Ansatz 10 * auf und abpipettiert wird. Der Komplex wird 15 min zum Reifen stehen gelassen. 60 μg Liposomen (variabel, zwischen 1 und 6 μg/μl) werden mit 15 μg HA-Fusionspeptid vermischt (Reduzierung der Menge bis 0.1 μg möglich). Diese Zugabe des HA- Fusionspeptide ist optional, es kann ohne größere Verminderung der Transfektion weggelassen werden. Die Liposomen werden zu dem Plasmid/PEI/PS-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Die Mischung wird gevortext. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt.
Beispiel 12: Herstellung eines erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexes in der Reihenfolge Plasmid, PEI, und Liposom mit erhöhtem und reduziertem Lipid Anteil.
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt 245.93 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg/90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, von 44.55 μg PEI (N/P ratio 20.7, größere Mengen und eine Reduzierung sind ebenfalls möglich). Dazu werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 106.43 μl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 1*100 μl und 1* 55.93 μl Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. 75, 45, und 30 μg Liposomen (zwischen 1 und 6 μg/μl) werden zu dem Plasmid/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Der Anteil der verwendeten Liposomen kann darüber hinaus deutlich erhöht werden auf die 10-fache Menge.
Beispiel 13: Biologische Prüfung der erfindungsgemässen liposomalen Vektorkomplexe in verschiedenen Zellkulturen
Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der Bestandteile Plasmid DNA und PEI. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen der beiden genannten Bestandteile beträgt 245.93 μl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.8, andere Puffer und pH-Werte ebenfalls möglich) vorgelegt und 15 μg Plasmid (15 μg/90 μl) dazugegeben. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, von 44.55 μg PEI (N/P ratio 20.7, größere Mengen und eine Reduzierung sind ebenfalls möglich). Dazu werden 49.5 μl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 106.43 μl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 1*100 μl und 1* 55.93 μl Schritten, je 5* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren und abschließend mit 100 μl Volumen 5* auf-und abpipettieren, 15 min warten. 60 μg Liposomen (zwischen 1 und 6 μg/μl) mit und ohne gekoppelten RGD Targetor (RGD bindet an den αvß3-Rezeptor) werden zu dem Plasmid/PEI-Komplex gegeben durch einfaches Pipettieren. Dazu wird der Ansatz nach der Zugabe mit 100 μl Volumen 10* auf und abpipettieren. Der Ansatz wird in 3 Aliquots geteilt und je ein Aliquot auf eine 3-cm Schale gegeben. Der dreifache Ansatz wurde auf eine 10-cm Schale zur FACS Analyse gegeben. Die liposomalen Vektorkomplexe, hergestellt wie in den Beispielen 1-11 , wurden zu den Zellen (in 10- cm Schalen für FACS Analyse; 3-cm Schalen für Luciferase und GFP Mikroskopie) gegeben und für 1 - 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen gewaschen und für weitere 24 - 48 Stunden im frischen Zellkulturmedium inkubiert. Anschliessend wurde die erfolgreiche Aufnahme der Komplexe in die Zelle, die Transkription, und die Expression des Reportergens im Plasmid durch den Nachweis der GFP Autofluoreszenz, Luciferase-Assay, und FACS Analyse gemessen. Ergebnisse der FACS Analyse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Liposomaler Vektorkomplex enhaltend folgende Komponenten a) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge; b) einen kationischen Träger welcher die Komponente a) kondensiert und lysosomolytisch und/oder lysosomotrop ist; c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; d) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat; e) optional eine fusogene Substanz, welche die lysosomolytische und/oder lysosomotrope Funktion der Kompenente b) ersetzen kann; wobei bei Vorhandensein einer fusogenen Substanz (e) der kationische Träger (b) nicht lysosomolytisch und/oder lysosomotrop sein muß.
2. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , bei welchem die Komponente a) eine Polynukleinsäure ist.
3. Liposomaler Vektorkomplex nach Ansprüchen 1 oder 2, bei welchem die
Komponente b) ein kationisches Protein ist.
4. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 3, bei welchem das kationische
Protein nicht lylosomolytisch ist und ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend Protaminsulfat.
5. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , bei welchem die Komponente b) ein kationisches Polymer ist.
6. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 5, bei welchem das kationische Polymer Polyethylenimin (PEI) ist.
7. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 6, bei welchem das PEI ein Molekulargewicht von durchschnittlich 2,000 - 10,000 Da aufweist.
8. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 6, bei welchem das PEI hochverzweigtkettig ist.
9. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 6, bei welchem das PEI niedrigverzweigtkettig ist.
10. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 4, bei dem zusätzlich ein PEI vorhanden ist.
1 1. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , bei welchem die Komponente c) aus Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Ankerlipid, und Cholesterol besteht.
12. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 1 , wobei das Ankerlipid ein N- Carboxyl-Phosphatidylethanolamin ist.
13. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 12, wobei das Ankerlipid ein N- Glutaryl-Phosphatidylethanolamin ist.
14. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , wobei die Komponente d) an eine der Komponente a) - c) ohne Anker, über einen Anker oder über ein Ankerlipid nach den Ansprüchen 12 oder 13 konjugiert ist.
15. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , wobei die Komponente d) nicht kovalent in die Liposomenoberfläche eingebettet ist.
16. Liposomaler Vektorkomplex nach Ansprüchen 1 - 15, wobei die Zielzelle eine Gewebezelle, eine Epithelzelle, eine Endothelzelle, eine Blutzelle, eine Leukämiezelle oder eine Tumorzelle ist.
17. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1 , wobei die Komponente e) die funktionelle Sequenz aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutin des Influenzavirus oder ein synthetisches Derivat davon ist.
18. Verwendung eines liposomalen Vektorkompiexes nach einem der Ansprüche 1 - 17 für die Transduktion und Transfektion von Zellen in vitro.
19. Verwendung nach Anspruch 18 in Gegenwart von Serum.
20. Verwendung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1
- 17, für die Transduktion und Transfektion von Zellen in vivo.
21. Zelle enthaltend einen liposomalen Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1 - 17.
22. Verwendung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1
- 17 oder einer Zelle nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Diagnosticums zur Anwendung in vitro und in vivo.
23. Verwendung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1 - 17 oder einer Zelle nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Heilmittels für die
Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung in vivo und ex vivo.
24. Verwendung des liposomalen Vektorkomplexes nach Anspruch 23 zur
Verabreichung auf die Haut, auf eine Schleimhaut, in die Lunge, am Auge, in eine Körperhöhle, in das Bindegewebe, in den Muskel, in ein Organ oder in den Blutkreislauf.
25. Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1 - 17, wobei
(1 ) Komponente a) gemäss Anspruch 1 mit Komponente b) gemäss Anspruch 1 vermischt wird,
(2) der aus Schritt (1 ) resultierende Komplex in die Komponente c) gemäss Anspruch 1 eingeführt wird, wobei das Mischungsverhältnis aller
Komponenten so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist;
(3) Optional Komponente d) gemäss Anspruch 1 in die Komponente c) vor oder nach der Komplexbildung eingefügt wird; (4) Optional Komponente e) gemäss Anspruch 1 in den aus Schritt (2) und (3) resultierenden Komplex oder zu Komponente c) vor der Komplexbildung eingefügt wird.
26. Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1 - 17, wobei das resultierende Produkt lyophilisiert wird.
27. Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1 - 17, wobei das resultierende Produkt aerosolisiert wird.
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