JP2002525270A - トランスフェクションのためのコンデンスされたプラスミド−リポソーム複合体 - Google Patents

トランスフェクションのためのコンデンスされたプラスミド−リポソーム複合体

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Abstract

(57)【要約】 細胞のトランスフェクションのためのプラスミド-リポソーム組成物が記載される。その組成物はポリカチオン性コンデンス試薬でコンデンスされたプラスミド分子およびカチオン性リポソームを含む。プラスミド-リポソーム複合体を調整するための方法も公開される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、インビボの遺伝子のトランスフェクションのためのプラスミド-リ
ポソーム複合体の調製のための方法の改良、およびその方法によって調製される
組成物に関する。
【０００２】 (引用文献) Felgner,J.,et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417(1987). Felgner,J.,et al.,J.Tiss.Cult.Meth.15;63-68(1993). Gao,X.,and Huang,L.,Biochemistry 35:1027-1036(1996). Guo,L.,et al.,Journal of Liposome Research 3(1):51-70(1993). Li,S.,and Huang,L.,Journal of Liposome Research,6(3):589-608(1996). Mulligan,R.S.,Science 260:926-932(1993). Morishita,R.,et al.,J.Clin.Invest.91:2580-2585(1993). Rose,J.K.,U.S.Patent No.5279833(1994) Trubetskoy,V.S.,et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1131:311-313(1992). Wagner,E.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4255-4259(1991).
【０００３】 （背景技術） 例えば遺伝子療法のような、遺伝的物質の特定の細胞への送達を容易化するた
めに、多様な方法が発達してきた。これらの方法はインビボまたはエキソビボの
遺伝子送達のいずれにとっても有用である。前者では、遺伝子は処置対象に直接
的に導入される(静脈内に、腹腔内に、エアゾール、等)。エキソビボ(またはイ
ンビトロ)の遺伝子送達では、個体の特異的な組織から細胞を取り外した後に、
遺伝子は細胞に導入される。そしてトランスフェクトされた細胞は処置対象に戻
される。
【０００４】 インビボおよびエキソビボの遺伝子療法を達成するための送達システムは、レ
トロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクター
、マイクロインジェクション、電気穿孔法、プロトプラスト融合、リン酸カルシ
ウム、およびリポソームを含む(Felgner,et al.,1987;Mulligan,1993;Morishita
,et al.,1993)。
【０００５】 リポソーム仲介遺伝子療法は、例えばカチオン脂質および中性脂質を含む試薬
であるLIPOFECTINから形成されるカチオン性リポソームの使用を含んでいた(Fer
gner,et al.,1989,1993)。他の遺伝子療法のリポソーム仲介方法は記載されてき
ており(Trubetskoy,et al.,1992;Morishita,et al.,1993;Rose,1994)、そこでは
カチオン性リポソームとDNAの静電気的複合体が形成されている。リポソームに
基づくトランスフェクションの組成物に対するより最近のアプローチは、DNAを
脂質粒子に結合させる(Wagner,et al.,1991)またはDNAをコンデンスする(Gao an
d Haug,1996;Li and Haug,1996)プロタミンまたはポリリジンのようなポリカチ
オンを含んでいる。
【０００６】 しかしながら現在までに記載されたリポソーム仲介遺伝子療法の方法および組
成物は、例えばLIPOFECTINの毒性、DNA−リポソーム複合体の大サイズ、および
むしろインビボのトランスフェクションの低い効率を含む限界を認めてきた。
【０００７】 したがって、比較的非毒性であり、静脈内投与用の大きさであり、高トランス
フェクション効率である、DNAプラスミド-リポソーム複合体を生産することが望
ましい。
【０００８】 (発明の要約) ある態様では、本発明は、宿主細胞をプラスミドに含まれる遺伝子でトランス
フェクトすることに使用するためのプラスミド-リポソーム複合体の組成物を含
む。その組成物はポリカチオン性コンデンス試薬でコンデンスされ、低イオン強
度の水性媒体に懸濁されたプラスミド分子、およびカチオン性の小胞形成脂質か
ら形成されるカチオン性のリポソームを含む。その複合体は、5nモルリポソーム
脂質/μgプラスミドより大きく、25nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより小
さいプラスミドに対するリポソーム脂質の率であり、約200nmより小さい実質的
に均一のサイズである。
【０００９】 ある態様では、コンデンスされたプラスミド分子は、膵嚢胞性線維症トランス
メンブランコンダクタンスレギュレーター、第VIII因子、インターロイキン-2ま
たはp53をコードしている遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含むDNAプラス
ミド分子である。
【００１０】 ある態様では、コンデンス試薬はヒストン、ポリ-1-グルタミン、プロタミン
、メリチンおよびポリミキシンBから選択されるポリカチオンである。ある好ま
しい態様では、コンデンス試薬は全ヒストン、ヒストン１およびヒストン４から
選択されるヒストンである。
【００１１】 さらなる態様では、プラスミドに対するリポソーム脂質の割合は8-18nモルリ
ポソーム脂質/μgプラスミドである。
【００１２】 低イオン強度水性媒体はグルコース、スクロースまたはデキストランのような
非イオン性浸透圧性溶質から調製される。
【００１３】 カチオン性リポソームは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)、1,2-
ジオレリルオキシ-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP)、N-[1-(2,3,-ジテト
ラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロ
ミド(DMRIE)、N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロ
キシエチルアンモニウムブロミド(DORIA)、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピ
ル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、および3β[N-(N',N'-ジメ
チルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)から選択される、カ
チオン性の小胞形成脂質から構成される。
【００１４】 さらなる態様において、カチオン性リポソームはさらに中性の小胞形成脂質を
含む。なおさらなる態様においてカチオン性リポソームはさらにコレステロール
を含む。
【００１５】 なおさらなる態様において、そのような親水性ポリマーで誘導体化された小胞
形成脂質を含むことにより、カチオン性リポソームは、親水性ポリマー鎖の表面
被覆を持つ。ある態様において少なくとも親水性ポリマー鎖の部分は、例えば存
在するまたは誘導される生理的な状態に応答して親水性ポリマー鎖を放出するの
に有効な結合のような解放可能な結合により、小胞形成脂質に結合されている。
プラスミド-リポソーム複合体は、標的細胞表面上のレセプター分子へのリガン
ド-特異的結合のための、親水性ポリマー鎖の遠位の末端に結合されたリガンド
をさらに含むことができる。例えば、そして好ましい態様では、親水性ポリマー
はポリエチレングリコールである。
【００１６】 さらなる態様において、本発明はプラスミド分子をコンデンスし、コンデンス
されたプラスミドをカチオン性リポソームの懸濁と混合することにより、宿主細
胞のトランスフェクトに使用するためのプラスミド-脂質複合体を形成させる、
プラスミド-リポソーム複合体を調製する方法における改良を含む。その改良は(
i)プラスミド分子をコンデンスするための試薬として、ヒストン、ポリ-1-グル
タミン、プロタミン、メリチンおよびポリミキシンＢから選択されるポリカチオ
ンを選択すること、(ii)コンデンスされたプラスミド分子を懸濁するための媒体
として、低イオン強度水性媒体を選択すること、および(iii) 5nモルリポソーム
脂質/μgプラスミドより大きく、25nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより小
さい、プラスミドに対するポソーム脂質の割合を選択すること、を含む。その改
良により生産されるプラスミド-リポソーム複合体は、200nmより小さい実質的に
均一のサイズをもっている。
【００１７】 本発明の方法にしたがって調製されたプラスミド-リポソーム複合体は、ある
態様において、DNAプラスミド内に含まれる遺伝子で宿主細胞をトランスフェク
トすることに使用するためのものである。ここでそのDNAプラスミドは、第VIII
因子、インターロイキン-2またはp53をコードしている遺伝子を含む群から選択
される遺伝子を含む。
【００１８】 好ましい態様において、プラスミド-リポソーム複合体は、膵嚢胞性線維症ト
ランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、または肺癌患者のためには、
インターロイキン-2のようなサイトカイン、またはp53のような癌抑制遺伝子を
含むDNAプラスミドで、処置対象の肺の中の宿主細胞をトランスフェクトするこ
とに使用するためのものである。
【００１９】 以下の発明の詳細な説明が、付随される図面とともに読まれるときに、本発明
のこれらのおよび他の目的および特徴は、より十分に明らかとなるだろう。
【００２０】 図面の簡単な説明 図1は、ポリカチオン性ポリマー全ヒストンでコンデンスされたプラスミドの
電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である； 図2は、本発明にしたがって、カチオン性リポソームと複合された、ポリカチ
オンでコンデンスされたプラスミドの電子顕微鏡写真のコンピューター処理され
た画像である； 図3A-3Bは、本発明にしたがって、カチオン性リポソームと複合された、ポリ
カチオンでコンデンスされたプラスミドの低温(図3A)および凍結割断(図3B)透過
型電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である； 図4は、本発明にしたがって、調製されたプラスミド-リポソーム複合体の動的
光散乱により測定されるような、nmにおけるサイズを表すプロットである。
【００２１】 図5は、本発明のプラスミド-リポソーム複合体に関し、4Cにおける貯蔵時間の
関数としての、動的散乱光により測定されるようなnmにおける、粒子直径のプロ
ットである。 図6は、本発明の標識されたプラスミド-リポソーム複合体の、マウスにおける
静脈内注射の後の時間の関数としての、注射された用量のパーセントのプロット
である。 図7A-7Eは、全ヒストンで調製されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、肺
(図7A)、肝臓(図7B)、心臓(図7C)、脾臓(図7D)および腎臓(図7E)における、相対
光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現を示す。
【００２２】 図8A-8Eは、ヒストンH1で調製されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、肺
(図8A)、肝臓(図8B)、心臓(図8C)、脾臓(図8D)および腎臓(図8E)における、相対
光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現を示す。 図9A-9Eは、ヒストンH4で調製されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、肺
(図9A)、肝臓(図9B)、心臓(図9C)、脾臓(図9D)および腎臓(図9E)における、相対
光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現を示す。 図10A-10Eは、カチオン性コンデンス試薬として、ポリ-1-グルタミン、メリチ
ンまたはポリミキシンBで調製されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、肺(
図10A)、肝臓(図10B)、心臓(図10C)、脾臓(図10D)および腎臓(図10E)における、
pgルシフェラーゼ/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現を示す。
【００２３】 図11A-11Bは、4℃で貯蔵されたプラスミド-リポソーム複合体に関し、日にお
ける時間の関数としての、肺(図11A)および肝臓(図11B)における、ルシフェラー
ゼの発現を示す。 図12はルシフェラーゼを運ぶプラスミドのマイクログラムの関数としての、マ
ウスにおけるプラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の２４時間後の、pg/mg
タンパク質における、様々な組織におけるルシフェラーゼを示す。 図13は、プラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の24時間後の、様々な組
織における、(RLU)/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの活性を表す；
【００２４】 図14A-14Bは、pHSVtk(図14A)、pCMVp53(図14B)、およびpCMVIL2(図14C)プラス
ミドを含むプラスミド-リポソーム複合体で処置された動物に関し、ルイス肺転
移腫瘍細胞で接種後の日の関数としての、生存する動物のパーセントを示す。 図15は、ルシフェラーゼをコードするpNSLプラスミドで調製された、プラスミ
ド-リポソーム複合体の投与の後のマウスの、グラムにおける体重を示す、日に
おける時間の関数としてのプロットである。マウスはプロット中に矢印で示され
るように１、８、１５、２２および２８日に、生食水(プラス印)で、および50μ
gのプラスミド(白丸)、75μgのプラスミド(黒三角)、および100μgのプラスミド
(白逆三角)の投与量でプラスミド-リポソーム複合体で処置され；そして 図16は、ルシフェラーゼをコードするpNSLプラスミドで調製されたプラスミド
リポソーム複合体の、腫瘍を有するマウス(ルイス肺腫瘍の転移モデル)への投与
の２４時間後の様々なマウス組織におけるng/mgタンパク質におけるルシフェラ
ーゼの発現を表すプロットである。
【００２５】 （発明の詳細な記載） Ｉ．プラスミド-リポソーム複合体 本発明は、宿主細胞のインビボでのトランスフェクションにおける使用のため
の、プラスミド-リポソーム複合体、およびそのような複合体を調製する方法の
改良に関する。その組成物は、ポリカチオン性コンデンス試薬でコンデンスされ
、そして低イオン強度の媒体に懸濁されるプラスミド分子を含む。そのコンデン
スされたプラスミド分子は、リポソームのような脂質粒子と混合され、プラスミ
ド-リポソーム複合体を形成する。記載されるであろうような、調製の方法にお
ける改良は、コンデンス試薬の選択、懸濁媒体の選択およびプラスミドに対する
リポソーム脂質率の選択に関する。改良された調製手順を詳細に記載する前に、
プラスミド-リポソーム複合体およびその構成要素が記載されるだろう。
【００２６】 A.カチオン性リポソーム構成要素および調製 前述されたように、プラスミド-リポソーム複合体は、コンデンスされたプラ
スミド分子とリポソームを含む。ここに使用されるリポソームは、典型的には1
またはそれ以上の脂質二重層において形成され、水性内容物を包む、外側の脂質
殻をもつ、脂質小胞に関する。好ましい態様において、リポソームは、残りの中
性の小胞形成脂質および/または他の構成要素と一緒に、約20-80モルパーセント
の間のカチオン性の小胞形成脂質から構成される。ここで使用されるように、“
小胞形成脂質”は、親水性および頭部極性基部分を持ち、リン脂質により例示さ
れるように、それ自体自発的に水中で二重層の小胞を形成することができる、任
意の両親媒性の脂質を言う。好ましい小胞形成脂質は、アシル鎖が典型的には14
-22の間の炭素原子の長さであり、不飽和度は様々であるような、ジアシル-鎖脂
質である。
【００２７】 カチオン性の小胞形成脂質は、その頭部極性基が例えばｐH4-9のような操作上
のpHにおいて正味正の電荷を帯びたようなものである。典型的な実施例は、例え
ばL-リジンで誘導体化された脂質DOPE(LYS-DOPE)について例示されたように、そ
の頭部極性基が、例えばリジンのような正の部分で誘導体化されている、フォス
ファチジルエタノールアミンのようなリン脂質を含む(Guo.et al.,1993)。この
クラスにはカチオン性頭部極性基を持つセレブロシドおよびガングリオシドのよ
うな糖脂質をも含まれる。
【００２８】 使用され得るさらなるカチオン性の小胞形成脂質は、コレステロールアミンお
よび関連するカチオン性ステロールである。例示的なカチオン性脂質は、1,2-ジ
オレリルオキシ-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP);N-[1-(2,3,-ジテトラデ
シルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド
(DMRIE);N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシ
エチルアンモニウムブロミド(DORIE);N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N
,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA);3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエ
タン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol);およびジメチルジオクタデシルア
ンモニウム(DDAB)を含む。
【００２９】 リポソームの残りは、正味電荷をもたないか、または頭部極性基に負の電荷を
持つ、割合の小さい脂質を含み得る小胞形成脂質を意味する、中性の小胞形成脂
質から形成される。この脂質のクラスには、フォスファチジルコリン(PC)、フォ
スファチジルエタノールアミン(PE)、フォスファチジルイノシトール(PI)および
スフィンゴミエリン(SM) のようなリン脂質およびコレステロール、コレステロ
ール誘導体およびその他の荷電していないステロールが含まれる。
【００３０】 前記で記載した脂質は商業的に得られ、または公開された方法にしたがって製
造することができる。本発明に含まれることのできる他の脂質は、セレブロシド
およびガングリシドのような糖脂質である。
【００３１】 本発明のある態様において、プラスミド-リポソーム複合体は、プラスミド/リ
ポソーム複合体の血液循環時間を延長するのに有効な、親水性ポリマー鎖の表面
被覆を持つリポソームを含む。適当な親水性ポリマーは、ポリエチレングリコー
ル(PEG)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニル-ピロリドン、ポリメチルオ
キサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドキシプロピルメタクリルアミド
、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、およびヒドロキシメチ
ルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースのような誘導セルロースを含む
。好ましい親水性ポリマー鎖は、PEG鎖として好ましくは500-10000ダルトンの間
の、より好ましくは1000-5000ダルトンの間の分子量を持つポリエチレングリコ
ール(PEG)である。その親水性ポリマーは水およびクロロホルムのような非水性
溶媒における可溶性を持ち得る。
【００３２】 被覆は、その頭部基においてそのポリマー鎖で誘導体化されている、好ましく
はリン脂質または他のジアシル-鎖脂質を、小胞形成脂質の1-20モルパーセント
の間で、リポソームを形成する小胞形成脂質の中に含むことにより好ましくは調
製される。そのような脂質を調製し、ポリマー被覆リポソームを形成する例示的
な方法は、米国特許番号5013556および5395619において記載された。
【００３３】 親水性ポリマーは、安定的に脂質に結合され、または血液流における循環中に
または標的部位に局在化した後に、親水性ポリマー被覆を脱落または“放出”す
るポリマー-被覆プラスミド-リポソーム複合体を可能とする非安定的な結合を通
じて、結合されることができることが認識される。親水性ポリマー特にポリエチ
レングリコール(ＰＥＧ)の、刺激に応答してポリマー鎖を放出するのに有効な結
合を通した、小胞形成脂質への結合は、例えばWO98/16202およびWO98/16201にお
いて、およびKirpotin,D.et al.(FEBS Letters,388:115-118(1996)によって記載
された。
【００３４】 ある態様において、解放可能な結合は、酵素および還元剤の存在のような、適
当な放出試薬の投与によって切断される、または選択的生理状態の下で切断され
る、化学的に遊離可能な結合である。例えばエステルおよびペプチド結合はエス
テラーゼまたはペプチダーゼ酵素によって切断される。ジスルフィド結合は、グ
ルタチオンまたはアスコルビン酸塩のような還元剤の投与によって、または血漿
および細胞内に存在するシステインのようなインビボに存在する還元剤によって
、切断される。
【００３５】 他の解放可能な結合は、ｐH感受性の結合、およびグルコース、光および熱に
さらすことにより切断される結合を含む。例として、親水性ポリマー鎖はpH感受
性結合によりリポソームに結合されることができ、プラスミド-リポソーム複合
体は、腫瘍領域のような、結合を切断し親水性鎖を放出するのに有効なpHを持つ
部位に標的される。例示的なpH感受性結合は、アシルオキシアルキルエーテル、
アセタールおよびケタール結合を含む。さらなる実施例は、切断可能な結合がジ
スルフィド結合であるところ、ここで広く硫黄を含む結合に言及することが意図
されている。硫黄を含む結合は、選択される不安定さの程度を達成されるよう合
成されることができ、ジスルフィド結合、混合されたスルフィド-スルフォン結
合およびスルフィド-スルフォキシド結合を含む。3種の結合のうち、ジスルフィ
ド結合はチオリシスにもっとも感受性が低く、スルフィド-スルフォキシド結合
は最も感受性である。
【００３６】 そのような解放可能な結合は、プラスミド-リポソーム複合体から親水性ポリ
マーセグメントの解放の割合を調節するのに有用である。例えば、非常に不安定
なジスルフィド結合は血液細胞または内皮細胞を標的するのに使用されることが
できる。というのはこれらの細胞は容易に接近可能であり、より短いリポソーム
血液循環寿命で十分であるからである。他の極端な場合、標的が、より長いリポ
ソーム血液循環寿命を複合体が計画される標的に届くのに一般に必要とされる、
腫瘍組織または他の組織であるときに、長く続くまたは達者なジスルフィド結合
が使用されることができる。
【００３７】 親水性ポリマー鎖をリポソームへ結合する解放可能な結合は、インビボで典型
的には、腫瘍組織の領域のような、わずかに低いpHの特異的な部位へ、または低
酸素症の腫瘍のような還元状態の部位へ、リポソームが到達するときのような、
環境の変化の結果として切断される。インビボの還元的条件はアスコルビン酸塩
、システインまたはグルタチオンのような還元剤の投与によってもたらされるこ
ともできる。その切断可能な結合は光または熱のような外的な刺激に応答しても
破壊され得る。
【００３８】 さらなる態様において、プラスミド-リポソーム複合体は、治療の目的とされ
る標的細胞へ特異的に結合するのに有効な、親和性部分または標的化リガンドを
含む。そのような部分はリポソームの表面に、または親水性ポリマー鎖の遠位の
端に結合されることができる。例示的な部分は、例えばPCT出願WO US94/03103、
WO 98/16202およびWO 98/16201において記載されたような、抗体、標的細胞表面
レセプターへの特異的な結合のためのリガンド等を含む。その部分は複合体の標
的細胞との結合を容易化するような疎水性セグメントを含むこともできる。
【００３９】 B.コンデンスされたプラスミド このセクションは、本発明のプラスミド-リポソーム複合体に使用されるコン
デンス相プラスミドの調製について記載する。
【００４０】 プラスミドをコンデンスするために使用されるポリカチオン性のコンデンス試
薬は、スペルミジン、スペルミン、ポリリジン、プロタミン、全ヒストン、H1、
H2、H3、H4のような特異的ヒストン分画、および他のポリカチオン性ポリペプチ
ドのような典型的にはバイオポリマーである、多極的に荷電したカチオン性ポリ
マーであるが、ポリミキシンBのような生物学的適合性のポリマーをも含み得る
。これらのポリカチオン性コンデンス試薬は、遊離塩基、または例えば硫酸プロ
タミンおよび臭化水素酸ポリリジンのような塩の形態で使用されることができる
ことが認識される。このましい態様において、ポリカチオン性コンデンス試薬は
、ここで言及されるように全ヒストンまたは特異的ヒストン分画を含むヒストン
である。
【００４１】 複合体における使用に適するプラスミドは、好ましくは5-40Kbp(キロベースペ
アー)の範囲の大きさを持つ、好ましくは環状のまたは閉じた二本鎖分子である
。プラスミドはよく知られた方法にしたがって構築され、治療の遺伝子すなわち
遺伝子療法において、適当なプロモーターおよびターミネーターコントロールエ
レメントの制御のもとで、発現されるべき遺伝子、および宿主細胞内での複製お
よび/または宿主細胞ゲノムへの組み込みに必要な他の要素を含む。遺伝子また
は他の哺乳類における遺伝子療法に有用なプラスミドを調製するための方法は広
く知られ、言及されている。
【００４２】 本発明の複合体により遺伝子療法のために導入されるべき遺伝子は、一般的に
は3のカテゴリーの1に入る:
【００４３】 第一には、対象における遺伝子の欠損または欠陥を克服することが意図される
遺伝子であり、すなわち対象が全くまたは通常の水準の範囲に、活性のある、内
生的なタンパク質を生産できない場合、そのプラスミドに導入された遺伝子はこ
の欠損を埋め合わせることが意図されている。遺伝子のこのクラスの実施例は、
幹細胞またはリンパ球における遺伝子発現のための、アデノシンデアミナーゼ(A
DA)をコードする遺伝子；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損をコードする
遺伝子、プロスタググランジンG/Hシンターゼの欠損をコードする遺伝子、ヒポ
キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの欠損により引き起こ
されるレッシュ-ナイハン症候群の治療のための遺伝子、α1-アンチトリプシン
、血友病、鎌状赤血球貧血および他の血液関連疾患の処置のための、凝血因子(
例えば第VIII因子、第IX因子)およびグロビン(例えばβ-グロブリン、ヘモグロ
ビン)のような、様々な循環しているタンパク質をコードしている遺伝子、およ
びホルモンおよび他のペプチドレギュレーターをコードしている遺伝子を含む。
【００４４】 第二のクラスは、癌のような任意の存在している病状、またはウイルス感染の
ような病原性の状態を処置するために設計されたポリペプチドである。実施例は
、癌治療のためのp53遺伝子を供給する遺伝子療法、HIV感染を阻害するためのCD
4ペプチドのための遺伝子、上皮細胞へのシュードモナスの結合を阻害するため
のシュードモナスペプチド、および標的とされる病原体を阻害するための特異的
抗体遺伝子を含む。
【００４５】 第三のクラスは、腫瘍の成長に特異的なタンパク質の過剰発現、またはウイル
ス性タンパク質の発現のような、望ましくないタンパク質の発現を阻害するため
のアンチセンス分子として振舞うことのできるmRNA転写物を生産することが意図
された遺伝子を含む。
【００４６】 ＩＩ．複合体の調製および特徴 本発明にしたがって、低イオン強度媒体中で、濃縮相プラスミドとカチオン性
リポソームの混合によって形成されるプラスミド-リポソーム複合体は、典型的
には約200nmより小さい、好ましくは50-200nm、より好ましくは100-200、もっと
も好ましくは120-180nmの範囲である実質的に均一なサイズを持つ複合体を生産
することが発見された。さらにその複合体はコードされた遺伝子の発現の活性の
保持力により特徴付けられ、すなわち、その複合体はトランスフェクションの安
定性を持つ。以下に記載されるであろうように、このことは、4℃で30日間、好
ましくは90日間の貯蔵の後の、細胞をトランスフェクトし、コードされた遺伝子
発現を達成する複合体の能力により証拠付られる。
【００４７】 コンデンス相プラスミドは、そのプラスミドに、低イオン強度媒体において、
前記で特定されたタイプのポリカチオン性ポリマーコンデンス試薬を、加えるこ
とにより形成される。カチオン性ポリマーは、プラスミド溶液に、電荷ストイキ
オメトリーが達成される好ましい濃度、すなわちカチオン性ポリマーの全電荷数
(ポリマーの知られた電荷密度/重量から決定されるような)が少なくともDNAの全
負電荷(プラスミドの重量および知られたDNAの電荷密度/重量から決定されるよ
うな)と同じ大きさであるような濃度、となるまで、加えられる。典型的には、
加えられるDNAプラスミドの加えられるポリマーに対する重量割合は、約0.1-5.0
の間、より好ましくは0.3-2.0の間である。コンデンス試薬は好ましくはプラス
ミド懸濁中にゆっくりと例えば10分間に渡り撹拌しながら加えられる。
【００４８】 低イオン強度媒体中にともに含まれる、コンデンスされたプラスミドおよびカ
チオン性リポソームは、例えばコンデンスされたプラスミド分子のリポソームへ
のゆっくりとした添加によって混合される。リポソーム脂質のプラスミドに対す
る割合は、最大のトランスフェクションを達成するためには重要なパラメーター
である。nモルリポソーム脂質/μgプラスミドにおけるその率は、5より大きいが
25より小さく、好ましくは8より大きいが18より小さく、より好ましくは10より
大きいが15より小さく、もっとも好ましくは12から14の間である。
【００４９】 前記で指摘されたように、本発明の決定的な特徴は、リポソームとコンデンス
相プラスミドを低イオン強度媒体中で混合することである。好ましくは、DNA、
コンデンス試薬およびリポソーム脂質の種類において存在するイオンを含む媒体
の最終的な濃度は、25mMのNaClのような一価イオン化塩のイオン強度より小さく
、好ましくはそのような塩の10mMより小さく、より好ましくは約1mMより小さい
。一般的には低イオン強度は、遊離塩基または遊離酸プラスミド、ポリカチオン
、および脂質の種類に、電解質構成要素を除去することを実施すること、または
それに替えて低イオン強度を保持するために構成要素を十分に希薄な濃度とする
こと、および/または透析等によって構成要素から発生される電解質を除去する
ことによって容易に得られる。同時に、注射できる処方としての浸透圧的バラン
スを提供するために、グルコースのような非電解質の溶質の存在下に、組成物を
調製することは有用である。
【００５０】 図1は、実施例1に記載されたように調製された、全ヒストンでコンデンスされ
たルシフェラーゼをコードしているpNSLプラスミドのネガティブ染色した透過型
電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である。ごらんのように、プラ
スミドは別々にコンデンスされており、直径約100nmおよびそれより小さい単一
粒子である。
【００５１】 図2は、実施例1に記載されたように調製された、ポリカチオンでコンデンスさ
れたプラスミド-リポソーム複合体のネガティブ染色した透過型電子顕微鏡写真
のコンピューター処理された画像である。図1の巧妙にコンデンスされたプラス
ミド分子と、図2の複合体を比較すると、不透明なコンデンスされたプラスミド
は容易に図2において明らかである。各コンデンスされたプラスミドを包む透明
な膜は図２においても見える。この透明な膜が、各コンデンスされたプラスミド
を被覆するリポソーム脂質二重層である。
【００５２】 図3A-3Bは、実施例1に記載されたように調製された、プラスミド-リポソーム
複合体の低温電子顕微鏡法および凍結割断透過型電子顕微鏡写真のコンピュータ
ー処理された画像である。図3Aの顕微鏡写真はプラスミド-リポソーム複合体の
懸濁の薄層を凍結し、その層を低温電子顕微鏡下で見ることにより得られる。そ
の顕微鏡写真は単一の、別々のプラスミド-リポソーム複合体を示す。ここで、
コンデンスされたDNAは、多くの粒子におけるより暗い中心領域として見える。
図3Bの凍結割断顕微鏡写真は、明らかに集合のない別々のプラスミド-リポソー
ム複合体をも示す。
【００５３】 動的光散乱は平均複合体サイズおよびサイズの分布を定量するために使用され
た。実施例1において調製されるような複合体は、約146nmの平均サイズ(標準偏
差45nm)を持つ均一な集団を形成することを示す図4において、結果は示される。
本研究および本発明の補助として実施されたその他の研究は、記載された方法に
したがって調製されたとき、複合体の集団が比較的狭いサイズ分布を持つことを
指摘するシングルピークにより証拠付られるように、その組成物は均一な集団を
持つ複合体を達成することを指摘している。好ましくは複合体は200nmより小さ
い、より好ましくは50-200nmの間の、もっとも好ましくは100-200nmの間の、そ
してなお好ましくは120-180nmのサイズを持つ。
【００５４】 前記で簡単に記載されたように、プラスミド-リポソーム複合体は安定的であ
り、すなわち、例えば4℃での貯蔵の少なくとも30日後まで、複合体の集合はほ
とんどなく、複合体は治療上の活性を保持するように、複合体は当初のサイズを
保持する。図5は、時間の関数として、動的光散乱によって測定されるような、
複合体サイズの安定性の証拠を提供し、複合体のサイズを示す。水/グルコース
におけるプラスミド/リポソーム複合体の懸濁は、4℃で貯蔵され、７、１４、２
１、２８、６０および９０日の貯蔵の後分析される。複合体の形成の後、最初は
平均複合体サイズは150nmであり、ごらんの通り、90日の貯蔵の後には、複合体
は約150nmのままであった。治療上の活性の保持に関して、複合体の安定性は以
下に図11A-11Bにおいて記載される。
【００５５】 III.インビボのトランスフェクション 本発明にしたがって調製されたプラスミド-リポソーム複合体は、様々なプラ
スミド-リポソーム複合体処方のトランスフェクション効率を測定し、トランス
フェクションの安定性、複合体の生体分布、薬物動態学および服用反応を測定す
るためにマウスに投与された。インビボのトランスフェクション手順の例は、実
施例2において記載される。
【００５６】 プラスミドリポソーム複合体の薬物動態は、S35-標識されたDNAプラスミドを
含む複合体をマウスに注射することにより測定される。図6は、静脈内注射の後
、時間の関数としての、注射された用量についてのパーセントを示す。プラスミ
ド-リポソーム複合体の注射の直後は、注射された用量の約7％が、血流中にある
。他の試験は、注射の直後、複合体の残っている割合が、肺に局在化することを
決定した。5時間の時点において注射された用量の割合において約22％に増加す
ることにより証明されるように、ある期間の後、複合体は血清タンパク質によっ
て肺において中性化され、血流に入る(図6)。そして、24時間の時点で注射され
た用量の約12％が存在しているように、複合体は血流から取り除かれる。
【００５７】 プラスミド-リポソーム複合体が、リポソーム脂質のプラスミドに対する様々
な率でのインビボでの投与のために調製された。複合体は、実施例1に示された
一般的な手順にしたがって、ポリカチオンコンデンス試薬の量およびリポソーム
脂質の総量を変化させることにより調製された。典型的には、ポリカチオンコン
デンス試薬の量は100-500μgの間で変化し、リポソーム脂質/プラスミド率は8-1
8nモル脂質/μgプラスミドの間で変化させた。
【００５８】 図7-9は、ポリカチオン性のコンデンス試薬として、全ヒストン(図7A-7E)、ヒ
ストンH1(図8A-8E)、およびH4(図9A-9E)で調製されたプラスミド-リポソーム複
合体に関する結果を示す。以下の表に示された処方から調製された複合体の投与
の後、肺、肝臓、心臓、脾臓および腎臓におけるルシフェラーゼの発現が測定さ
れた。
【００５９】 表1は、ポリカチオン性コンデンス試薬として全ヒストンを使用して調製され
たプラスミド-リポソーム複合体の組成物について概要を述べる。全ヒストンの
量は、100-500μgの間で変化させ、プラスミド/全ヒストンの割合を0.2-1.0に変
化させた。リポソーム脂質/プラスミドの割合も変化させ、８、１４および１８n
モルリポソーム脂質/μgプラスミドの割合がテストされた。
【表１】
【００６０】 マウスにおけるインビボでの表１に概要を述べられた処方の投与の結果は図7A
-7Eにおいて示される。ここで相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質によるルシフ
ェラーゼの発現は、肺(図7A)、肝臓(図7B)、心臓(図7C)、脾臓(図7D)および腎臓
(図7E)において見られる。その図はトランスフェクションが最高となる一定の領
域があることを指摘している。特にコンデンス試薬としての全ヒストンに関して
は、リポソーム脂質/プラスミド率が8nモル脂質/μgプラスミドより大きく18nモ
ル脂質/μgより小さい場合、トランスフェクションが最高となる。
【００６１】 表2は、ポリカチオン性コンデンス試薬としてヒストンH1を使用して調製され
、インビボで試験されたプラスミド-リポソーム複合体の組成物について概要を
述べる。プラスミド/ヒストンH1の割合は、0.3または0.5であり、リポソーム脂
質/プラスミド率は8から、14および18nモル脂質/μgプラスミドに変化させられ
た。
【表２】
【００６２】 マウスにおけるインビボでの表2に概要を述べられた処方の投与の結果は図8A-
8Eにおいて示される。ここで相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質によるルシフ
ェラーゼの発現は、肺(図8A)、肝臓(図8B)、心臓(図8C)、脾臓(図8D)および腎臓
(図8E)において見られる。その図は最良のトランスフェクションは、14および18
のリポソーム脂質/プラスミド率において達成されることを指摘している。
【００６３】 表3Aおよび3Bは、ポリカチオン性コンデンス試薬としてヒストンH4を使用して
形成されたプラスミド-リポソーム複合体の処方について概要を述べる。プラス
ミド/ヒストンH4率は、0.2から、0.3または0.5であり、リポソーム脂質/プラス
ミド率は8から、14または18nモル脂質/μgプラスミドに変化させられた。
【表３】
【表４】
【００６４】 マウスにおけるインビボでの表3Aおよび3Bに概要を述べられた処方の投与の結
果は図9A-9Eにおいて示される。ここで相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質によ
るルシフェラーゼの発現は、肺(図9A)、肝臓(図9B)、心臓(図9C)、脾臓(図9D)お
よび腎臓(図9E)において見られる。8nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより大
きく18 nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより小さいような、トランスフェク
ションが最高となる一定の領域がある。
【００６５】 本発明を支持するために実施された他の試験において、プラスミド-リポソー
ム複合体は、ポリカチオン性コンデンス試薬として、ポリ-1-グルタミン、メリ
チン(26アミノ酸を含む低分子量ペプチド)または硫酸ポリミキシンBを使用して
調製された。これらのそれぞれはSigma Chemical Co.から商業的に入手可能であ
る。複合体はマウスに実施例2で説明されるように注射され、ルシフェラーゼの
発現を定量することによりインビボのトランスフェクションが測定された。
【００６６】 表4はポリカチオン性コンデンス試薬として、ポリ-1-グルタミン、メリチンま
たはポリミキシンBを使用して調製されたプラスミド-リポソーム複合組成物の概
要を述べる。コンデンス試薬の量は50から200μgに変化された。
【表５】
【００６７】 マウスにおけるインビボの表4中のプラスミドリポソーム
複合体の投与の結果は、図10A-10Eにおいて示される。ここでpgルシフェラーゼ/
mgタンパク質によるルシフェラーゼの発現は、肺(図10A)、肝臓(図10B)、心臓(
図10C)、脾臓(図10D)および腎臓(図10E)において見られる。各処方に関し、脂質
/プラスミド率は14nモル脂質/μgプラスミドで一定であり、5-25nモルリポソー
ム脂質/μgプラスミドである好ましい範囲のおおむね半ばである。
【００６８】 例えば全ヒストン、ヒストンH1、ヒストンH4、ポリ-1-グルタミン、メリチン
およびポリミキシンBのような様々なポリカチオン性コンデンス試薬を使用する
これらの試験は、リポソーム脂質/プラスミド率(nモル脂質/μgプラスミドにお
ける)が5より大きく約25より小さいときにトランスフェクションが達成されるこ
とを指摘する。より好ましくはその割合は、8-18の間、なおより好ましくは10-1
5の間、もっとも好ましくは12-14nモルリポソーム脂質/μgプラスミドの間であ
る
【００６９】 前記で報告されたように、本発明のプラスミド-リポソーム複合体は、粒のサ
イズにおける変化がほとんどないことにより証拠付けられたように(図5参照)、4
℃で90日間も安定的である。複合体の安定性の発現は、4℃で貯蔵されたプラス
ミド-リポソーム複合体のマウスへの投与によって測定された。特に、プラスミ
ド-リポソーム複合体の懸濁は、複合体の調製の直後(0日)および4℃での貯蔵の7
,14,21,28,30および90日後マウスに静脈内に投与された。実施例2に詳しい処置
の後、肺および肝臓におけるルシフェラーゼの発現は定量され、結果は図11A-11
Bにおいて示される。
【００７０】 図11A-11Bにおいて見られるように、肺(図11A)および肝臓(図11B)におけるル
シフェラーゼの発現は、複合体の貯蔵時間の関数として、一定のままである。90
日のテスト期間に関し、複合体がコードされた遺伝子の発現の能力を保持してい
たことは明らかである。それゆえに、本発明のある態様において、複合体は、少
なくとも30日、より好ましくは90日に渡り、０日に測定された発現活性の50％よ
り大きく保持する能力によって特徴付けられる。
【００７１】 実施例1に記載されるように調製されたプラスミド-リポソーム複合体を使用す
る用量-応答の試験が実施された。プラスミド-リポソーム複合体は、5のプラス
ミドの用量水準:25、50、200、250および200μgで、マウスに静脈内に投与され
た。投与24時間後、肺、心臓、肝臓、腎臓および脾臓におけるルシフェラーゼの
発現が測定され、結果は図12において示される。測定されたルシフェラーゼ発現
は投与された用量に比例的であり、肺において最高の発現であった。
【００７２】 マウスにおけるプラスミド-リポソーム複合体の投与の24時間後の全身のルシ
フェラーゼ発現は図13において示される。プラスミド-リポソーム複合体は、骨
髄、リンパ節および脳におけるルシフェラーゼの発現において証拠づけられるよ
うに、広範囲に分布している。
【００７３】 実施例3において詳細に説明されるような、本発明を支持するために実施され
たさらなる試験において、転移性ルイス肺腫瘍を有するマウスが、プラスミド-
リポソーム複合体で処置された。腫瘍の接種の後、実施例3において表5において
示された8処置群のうちの1で処置された。その処置は、p53をコード(pCMVp53)お
よびインターロイキン2(pCMVIL2)をコードする遺伝子を有するプラスミドを使用
して調製されたプラスミド-リポソーム複合体の投与、およびガンシクロビルお
よびpHSVtk(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プラスミドで調製されたプ
ラスミド-リポソーム複合体の組み合わせ処置を含む。コントロール群の動物は
生食水を受け、比較群の動物は、ルシフェラーゼ(実施例1)をコードしているpNS
Lプラスミドで調製された複合体をまたはガンシクロビルを単独で受けた。
【００７４】 図14A-14Cは、腫瘍細胞接種の後の日の関数として生存している動物のパーセ
ントを示している。図14A-14Cすべてにおいて、生食水で処置された動物は黒四
角で表される。図示のようにすべての生食水で処置された動物は腫瘍の接種の後
24日までに死亡した。図14Aにおいて、50μg(黒逆三角)および75μg(白四角）の
pHSVtkプラスミドを含む複合体で、およびガンシクロビルで処置された動物が示
される。ガンシクロビルのみで(白丸)処置された動物のすべては、37日までに死
亡した。これに対して、リポソーム-プラスミド複合体とガンシクロビルの組み
合わせ治療で処置された動物はよくなり、より高度のプラスミド用量で処置され
たこれらの内の70％に関しては、試験を生存した。
【００７５】 図14Bは、pCMVp53(黒逆三角)およびpNSL(ルシフェラーゼをコードする)(白丸)
を含むプラスミドリポソーム複合体で処置された生存している動物のパーセント
を示している。図示のように、p53遺伝子をコードしているプラスミドを含む複
合体で処置された動物の20％が試験期間中生存したが、一方、生食水で処置され
た動物(黒四角)およびルシフェラーゼ-レポーター遺伝子をコードするpNSLプラ
スミドで処置された動物は死亡した。
【００７６】 図14Cは、pCMVIL2プラスミドを含む複合体で、50μgプラスミドDNA(逆黒三角
）および75μgプラスミドDNA(白四角)によって投与され、処置された動物に関す
る結果を示している。図示のように処置期間の終わりに、約15-20％の間の動物
が生存したが、一方、処置されないままの(生食水コントロール、黒四角)のすべ
ての動物は24日までに死亡した。同様にルシフェラーゼをコードするpNSLプラス
ミド(白丸)を含む複合体で処置された動物(開いた円)は31日までに死亡した。
【００７７】 実施例3における表5の処方番号34、すなわちpNSLルシフェラーゼコード遺伝子
のプラスミドリポソーム複合体は、50μgプラスミド/0.7μモル脂質、75μgプラ
スミド/1.05μモル脂質および100μgプラスミド/1.4μモル脂質の用量でマウス
に投与され、その処方の毒性の兆候として、マウスの体重が監視された。図15に
見られるように、プロット中に矢で示されるように1、8、15、22および28日に複
合体で処置されたマウスは、最初の投与の後少し体重は減ったが、数日の内に減
少した体重は回復した。図中の印は以下の通りである:生食水で処置されたマウ
ス(プラス印)、および50μgプラスミド(白丸)、75μgプラスミド(黒三角)および
100μgプラスミド(白逆三角)の用量でプラスミド-リポソーム複合体で処置され
たマウス。
【００７８】 ルイス肺腫瘍モデルを使用するさらなる試験で、pNSL-ルシフェラーゼ-プラスミ
ド-リポソーム複合体がマウスに投与され、プラスミド-リポソーム複合体の投与
の24時間後、様々な組織のルシフェラーゼ発現が調査された。図16に見られるよ
うに、最高のルシフェラーゼの発現は肺中におよび腫瘍中に観察された。
【００７９】 前述より、いかに多様な本発明の特徴および目的があるか評価されることがで
きる。本発明の方法にしたがって調製されたプラスミド-リポソーム複合体は、
動的光散乱によって明らかにされたように、約200nmより小さいサイズを持つ実
質的に均一な集団を形成する。その複合体は、動的光散乱によって証拠付られた
ように、90日間複合体の凝集がなく、安定的である。その複合体は、4℃で少な
くとも30日の貯蔵の後、50％より大きいトランスフェクション効率を保持すると
ころ、複合体のトランスフェクション活性が安定でもあることが重要である。
【００８０】 IV．実施例 以下の実施例は、本発明のプラスミド-リポソーム複合体の調製方法、特徴、
および使用を例示する。その実施例は、決して発明の範囲を限定することを意図
するものではない。
【００８１】 材料および方法 A.脂質 ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)をAvanti Polar Lipids,Inc.(Bir
mingham,AL)より購入した。99％より高純度のコレステロールをNu-Chek(Elysian
,MN)より得た。
【００８２】 B.ポリカチオン性コンデンス試薬 H1、H2、H3およびH4を含むヒストンの混合物からなる全ヒストン、ヒストンH1
およびヒストンH4をBoehringer Mannheim(Indianapolis,IN)より得た。ポリ-1-
グルタミン、メリチンおよび硫酸ポリミキシンBをSigma Chemical Co.(St.Louis
,MO)より得た。
【００８３】 C.方法:動的光散乱 サイズ分布の測定は、Coulter N4MD instrumentを使用して、製造者の指示に
したがって操作し、動的光散乱(DLS)によって実施した。結果をnmによる平均直
径および相対体積による粒子のガウス分布の標準偏差として表現した。
【００８４】 実施例1 プラスミド-リポソーム複合体の調製 A.pNSLプラスミドの調製 ルシフェラーゼをコードしているpNSLプラスミドを、商業的に入手可能な2の
プラスミド、pGFP-N1プラスミド(Clontech,Palo Alto,CA)およびpGL3-C(Promega
Corporation,Madison,WI)から構成した。
【００８５】 pGL3-CをXbaIで切断し、E.coliDNAポリメラーゼのクレノー断片を使用し平滑
末端にライゲイトした。そしてそれをHindIIIで切断し、ルシフェラーゼ遺伝子
を有する1689-bpの断片をゲル-精製した。pGFP-N1プラスミドをSmaIおよびHindI
IIで切断し、アガロースゲルから単離した4.7kbの断片を、ルシフェラーゼ断片
とライゲートした。JM109 E. coli細胞を形質転換し、20コロニーを選抜した;約
半数が挿入の存在を示した; さらにルシフェラーゼ遺伝子の存在を確認するため
に、挿入を有する8クローンをNamHIおよびXhoIで切断し;そのうちの7が陽性であ
った。
【００８６】 B.カチオン性リポソームの調製 カチオン性リポソームを、10μモルのDDABおよび10μモルのコレステロールを
まずCHCl3を含む有機溶媒に溶解することにより、標準的な手順にしたがって調
製した。脂質を減圧下でローテーションにより乾燥し薄膜とした。その脂質の薄
膜に蒸留水を加えることにより水和し、20μモル/mlの濃度のリポソームの懸濁
を形成した。リポソームを超音波処理により、または0.4μm、0.2μm、0.1μmお
よび0.05μmのポアーサイズのNucleoporeポリカーボネート膜を通した逐次押出
により大きさを整え、約200nmのサイズより小さいリポソームを得た(Nucleopore
,Pleasanton,CA)。
【００８７】 C.コンデンスされたプラスミドの調製 前記で記載したように調製したルシフェラーゼをコードしているDNAプラスミ
ドpNSLを、以下の手順にしたがってコンデンスした。400μlのプラスミド(蒸留
水中1mg/ml)を310μlの蒸留水で希釈し、90μlの50％グルコースと混合した。蒸
留水中1mg/mlのストック溶液からの100μlのポリカチオン性コンデンス試薬(全
ヒストン、ヒストンH1、ヒストンH4、ポリ-1-グルタミン、メリチンまたはポリ
ミキシンB)をプラスミド溶液に撹拌しながらゆっくりと加えた。混合物を10分間
撹拌した。
【００８８】 D.複合体の調製 14nモル脂質/μgプラスミドのリポソーム脂質/プラスミド率を持つプラスミド
-リポソーム複合体を、350μlの蒸留水で280μlのリポソーム懸濁を希釈し、70
μlの50％グルコースを加えることにより調製した。そのコンデンスされたプラ
スミドの懸濁を希釈されたカチオン性リポソーム懸濁にゆっくりと加え、10分間
継続して撹拌した。
【００８９】 実施例２ インビボのトランスフェクション手順 プラスミド−リポソーム複合体でのインビボのトランスフェクションを、Simo
nsen(Gilroy,CA)から得たBALB/cマウスで実施した。各プラスミド−リポソーム
複合体処方を尾部静脈経由で３のマウスに注射した。マウスを、注射の２４時間
後屠殺し、麻酔下ヘパリン化処置されたPBS(４C)で灌流の後、組織(肺、肝臓、
脾臓、腎臓、心臓)を収集した。
【００９０】 0-4℃の間の温度で、0.75mlの細胞溶解試薬(Promega,Medison,WI)を各組織に
加え、組織を1分間20000rpmでホモジナイズした。上清をミクロ遠心管に移動し
、10000gで5分間遠心分離した。上清をルシフェラーゼおよびタンパク質のアッ
セイのために収集した。20μlの各サンプルをすぐにルミノメーターによって測
定した(100μlのルシフェリンおよびATPを含むアッセイバッファー、10秒測定)
。相対光単位を抽出物中のタンパク質の量によって標準化した。
【００９１】 実施例3 腫瘍を有するマウスのインビボのトランスフェクション A.プラスミド-リポソーム複合体の調製 以下のプラスミド:実施例1に記載されたようなルシフェラーゼをコードしてい
るpNSL、およびpCMVp53、pCMVIL2およびpHSVtk(すべて商業的に入手可能)を使用
し、プラスミド-リポソーム複合体を、実施例1の手順にしたがって調製した。
【００９２】 B.腫瘍接種 80匹のB6C3-F1オスのマウスを、Taconic Farms(German Town,NY)より得、実験
の開始に先立ち3日間馴化させておいた。適当な隔離されたケージングに、無菌
げっ歯類飼料および酸性化された水および12:12の光:暗黒サイクルで、動物を自
由に収容した。動物を腫瘍の接種に先立ち、体重に基づき処置群に無作為化した
。動物を腫瘍の接種に先立ち、処置群に無作為化した。
【００９３】 すべての動物を一般的な満足の行く状態で毎日観察した。動物を腫瘍細胞の接
種に先立ち、およびその後は週に2回体重を測定した。開始時の体重から15％ま
たはそれ以上体重が減少したと観察された動物、またはディストレスにある任意
の動物を安楽死し、肺、肝臓および脾臓における転移病巣の存在およびサイズに
ついて調査した。
【００９４】 他のB6C3-F1マウスから、安楽死の後無菌的な外科的な収集により、成長して
いるルイス肺腫瘍をとることにより、腫瘍を接種した。腫瘍を機械的にできるだ
け微細にミンスし、短時間に37℃でコラゲナーゼ、プロテアーゼおよびDNA分解
酵素の酵素混合において消化した。消化し、媒体(RPMI+15%FCS)で洗浄した後、
細胞を血球計数器でカウントした。細胞を遠心分離し、媒体に106細胞/ml(105細
胞/0.1ml注射)で再懸濁した。再懸濁された細胞を、各動物の尾部静脈への静脈
内注射のために、各シリンジにとった(0.1ml、継続的な混合下)。
【００９５】 C.処置 表5に示された8の群のうちの1について、腫瘍細胞の接種の3日後に始め、動物
を処置した。指摘されたように、ガンシクロビル処置群no.30、および組み合わ
せ治療の一部としてのガンシクロビルを受ける動物(群nos.32,33)以外は、各群
の10の動物を1週間間隔で5回処置した。
【表６】 表５ 1データは図14Aに記載。2 データは図14Bに記載。3 データは図14Cに記載。4 データは図15に記載。5 データは図16に記載。
【００９６】 最後の処置の24時間後、組織および腫瘍の収集および調査のために、生存して
いる動物を安楽死させた。各処置群について生存している動物のパーセントを、
図14A-14Cに示す。処方no.34の毒性を図15に示し、処方no.34のルシフェラーゼ
発現を図16に示す。
【００９７】 本発明は特定の具体例に関して記載されたけれども、多様な変化および修飾が
本発明から離れることなくなされることができることは、当技術分野における技
術者にとっては明白だろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、ポリカチオン性ポリマー全ヒストンでコンデンスされた
プラスミドの電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である。
【図２】 図2は、本発明にしたがって、カチオン性リポソームと複合され
た、ポリカチオンでコンデンスされたプラスミドの電子顕微鏡写真のコンピュー
ター処理された画像である。
【図３】 図3A-3Bは、本発明にしたがって、カチオン性リポソームと複合
された、ポリカチオンでコンデンスされたプラスミドの低温(図3A)および凍結割
断(図3B)透過型電子顕微鏡写真のコンピューター処理された画像である。
【図４】 図4は、本発明にしたがって、調製されたプラスミド-リポソーム
複合体の動的光散乱により測定されるような、nmにおけるサイズを表すプロット
である。
【図５】 図5は、本発明のプラスミド-リポソーム複合体に関し、4Cにおけ
る貯蔵時間の関数としての、動的散乱光により測定されるようなnmにおける、粒
子直径のプロットである。
【図６】 図6は、本発明の標識されたプラスミド-リポソーム複合体の、マ
ウスにおける静脈内注射の後の時間の関数としての、注射された用量のパーセン
トのプロットである。
【図７】 図7A-7Eは、全ヒストンで調製されたプラスミド-リポソーム複合
体に関し、肺(図7A)、肝臓(図7B)、心臓(図7C)、脾臓(図7D)および腎臓(図7E)に
おける、相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現
を示す。
【図８】 図8A-8Eは、ヒストンH1で調製されたプラスミド-リポソーム複合
体に関し、肺(図8A)、肝臓(図8B)、心臓(図8C)、脾臓(図8D)および腎臓(図8E)に
おける、相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現
を示す。
【図９】 図9A-9Eは、ヒストンH4で調製されたプラスミド-リポソーム複合
体に関し、肺(図9A)、肝臓(図9B)、心臓(図9C)、脾臓(図9D)および腎臓(図9E)に
おける、相対光単位(RLU)/10秒/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現
を示す。
【図１０】 図10A-10Eは、カチオン性コンデンス試薬として、ポリ-1-グル
タミン、メリチンまたはポリミキシンBで調製されたプラスミド-リポソーム複合
体に関し、肺(図10A)、肝臓(図10B)、心臓(図10C)、脾臓(図10D)および腎臓(図1
0E)における、pgルシフェラーゼ/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの発現
を示す。
【図１１】 図11A-11Bは、4℃で貯蔵されたプラスミド-リポソーム複合体
に関し、日における時間の関数としての、肺(図11A)および肝臓(図11B)における
、ルシフェラーゼの発現を示す。
【図１２】 図12はルシフェラーゼを運ぶプラスミドのマイクログラムの関
数としての、マウスにおけるプラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の２４
時間後の、pg/mgタンパク質における、様々な組織におけるルシフェラーゼを示
す。
【図１３】 図13は、プラスミド-リポソーム複合体の静脈内投与の24時間
後の、様々な組織における、(RLU)/mgタンパク質における、ルシフェラーゼの活
性を表す。
【図１４】 図14A-14Bは、pHSVtk(図14A)、pCMVp53(図14B)、およびpCMVIL
2(図14C)プラスミドを含むプラスミド-リポソーム複合体で処置された動物に関
し、ルイス肺転移腫瘍細胞で接種後の日の関数としての、生存する動物のパーセ
ントを示す。
【図１５】 図15は、ルシフェラーゼをコードするpNSLプラスミドで調製さ
れた、プラスミド-リポソーム複合体の投与の後のマウスの、グラムにおける体
重を示す、日における時間の関数としてのプロットである。マウスはプロット中
に矢印で示されるように１、８、１５、２２および２８日に、生食水(プラス印)
で、および50μgのプラスミド(白丸)、75μgのプラスミド(黒三角)、および100
μgのプラスミド(白逆三角)の投与量でプラスミド-リポソーム複合体で処置され
る。
【図１６】 図16は、ルシフェラーゼをコードするpNSLプラスミドで調製さ
れたプラスミドリポソーム複合体の、腫瘍を有するマウス(ルイス肺腫瘍の転移
モデル)への投与の２４時間後の様々なマウス組織におけるng/mgタンパク質にお
けるルシフェラーゼの発現を表すプロットである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１０月１８日（２０００．１０．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 モハマッド・ハッサニプア アメリカ合衆国94591カリフォルニア州バ レホ、トップセイル・ドライブ1023番 (72)発明者 ベイ・ジン アメリカ合衆国94587カリフォルニア州ユ ニオン・シティ、ケイプ・ビュー・ドライ ブ4546番 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA01 BA27 CA04 DA02 DA06 EA04 GA13 4C076 AA19 CC03 CC26 CC27 DD31 DD67 EE23 EE30 EE41 EE51 FF16 FF63 4C084 AA02 AA03 AA13 BA50 CA70 DA14 DA27 MA05 MA17 MA66 NA14 ZA512 ZA552 ZB262 ZB332 ZB352 ZC552

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリカチオン性コンデンス試薬でコンデンスされ低イオン強
    度水性媒体に懸濁されたコンデンスされたプラスミド分子、および 小胞形成脂質を含むカチオン性リポソームを含み、 該複合体は5nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより大きく25nモルリポソーム
    脂質/μgプラスミドより小さい、プラスミドに対するリポソーム脂質の割合を持
    ち、約200nmより小さい実質的に均一な大きさを持つ、 プラスミドに含まれる遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトすることに使用する
    ための、プラスミド−リポソーム複合体の組成物。
  2. 【請求項２】 コンデンスされたプラスミド分子が、膵嚢胞性繊維症膜貫通
    コンダクタンスレギュレーター、第VIII因子、インターロイキン-2またはp53を
    コードしている遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含む、DNAプラスミド分
    子である、請求項1記載の組成物。
  3. 【請求項３】 コンデンス試薬が、ヒストン、ポリ-1-グルタミン、プロタ
    ミン、メリチンおよびポリミキシンBを含む群から選択されるポリカチオンであ
    る、請求項1記載の組成物。
  4. 【請求項４】 コンデンス試薬が、全ヒストン、ヒストン1およびヒストン4
    から選択されるヒストンである、請求項3記載の組成物。
  5. 【請求項５】 プラスミドに対するリポソーム脂質の率が8-18nモルリポソ
    ーム脂質/μgプラスミドの間である、請求項1記載の組成物。
  6. 【請求項６】 低イオン強度水性媒体が非イオン性の浸透圧性溶質から調製
    される、請求項1記載の組成物。
  7. 【請求項７】 該溶質がグルコース、スクロースおよびデキストランを含む
    群から選択される、請求項6記載の組成物。
  8. 【請求項８】 カチオン性リポソームが、ジメチルジオクタデシルアンモニ
    ウム(DDAB)、1,2-ジオレリルオキシ-3-(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP)、N-
    [1-(2,3,-ジテトラデシルオキシ)プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル
    アンモニウムブロミド(DMRIE)、N-[1-(2,3,-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-
    ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N-[1-(2,3-ジオレ
    イルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、および
    3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)か
    ら選択される、カチオン性の小胞形成脂質から構成される、請求項1記載の組成
    物。
  9. 【請求項９】 カチオン性リポソームが中性の小胞形成脂質をさらに含む、
    請求項1記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 カチオン性リポソームがコレステロールをさらに含む、請
    求項1記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 カチオン性リポソームが、そのような親水性ポリマーで誘
    導体化された小胞形成脂質を含むことにより親水性ポリマー鎖の表面被覆を持つ
    、請求項1記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 少なくとも親水性ポリマーの一部が、存在するまたは誘導
    される生理的状態に応答して親水性ポリマー鎖を放出するために有効な結合によ
    って、小胞形成脂質に結合されている、請求項11記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 プラスミド-リポソーム複合体が、標的細胞表面上のレセ
    プター分子へのリガンド-特異的結合のための、親水性ポリマー鎖の遠位の端に
    結合されているリガンドをさらに含む、請求項11または請求項12記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求
    項11または請求項12記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 膵嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュ
    レーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選択
    されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすることに
    使用するための、請求項1から14のいずれかに記載のプラスミド-リポソーム複合
    体。
  16. 【請求項１６】 インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の
    群から選択されるDNAプラスミドで対象中の腫瘍中の宿主細胞をトランスフェク
    トすることに使用するための、請求項1から15のいずれかに記載のプラスミド-リ
    ポソーム複合体。
  17. 【請求項１７】 プラスミド分子をコンデンスするためのコンデンス試薬と
    して、ヒストン、ポリ-1-グルタミン、プロタミン、メリチンまたはポリミキシ
    ンBを含む群から選択されるポリカチオンを選択すること、 該コンデンスされたプラスミド分子を懸濁するための媒体として、低イオン強度
    水性媒体を選択すること、および 5nモルリポソーム脂質/μgプラスミドより大きく25nモルリポソーム脂質/μgプ
    ラスミドより小さい、プラスミドに対するリポソーム脂質の割合を選択すること
    、の段階を含み、 その改良によって生産されるプラスミド-リポソーム複合体が、約200nmより小さ
    い大きさの点で実質的に均一である、 プラスミド分子をコンデンスし、コンデンスされたプラスミドとカチオン性リポ
    ソームの懸濁を混合することによって、宿主細胞をトランスフェクトすることに
    使用するためのプラスミド-リポソーム複合体を形成させる、プラスミド-リポソ
    ーム複合体を調製する改良製法。
  18. 【請求項１８】 該コンデンス試薬が、全ヒストン、ヒストン1およびヒス
    トン4を含む群から選択される、請求項17記載の方法。
  19. 【請求項１９】 プラスミドに対する該リポソーム脂質の割合が、8-18nモ
    ルリポソーム脂質/μgプラスミドの間である、請求項17記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該低イオン強度水性媒体が、非イオン性の浸透圧性溶質か
    ら調製される、請求項17記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該溶質がグルコース、スクロースおよびデキストランを含
    む群から選択される、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 そのカチオン性リポソームが、コレステロールおよびDDAB
    から調製される、請求項17記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該カチオン性リポソームが、親水性ポリマーで誘導体化さ
    れた小胞形成脂質を含むことにより、親水性ポリマー鎖の表面被覆を持つ、請求
    項17記載の方法。
  24. 【請求項２４】 第VIII因子、インターロイキン-2またはp53をコードして
    いる遺伝子を含む群から選択される遺伝子を含むDNAプラスミドで、宿主細胞を
    トランスフェクトすることに使用するための、請求項17にしたがって調製される
    、プラスミド-リポソーム複合体。
  25. 【請求項２５】 膵臓嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギ
    ュレーター、インターロイキン-2およびp53をコードしている遺伝子の群から選
    択されるDNAプラスミドで、対象の肺中の宿主細胞をトランスフェクトすること
    に使用するための、請求項17にしたがって調製される、プラスミド-リポソーム
    複合体。
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