KR100648025B1 - 트랜스펙션용 응축 플라스미드-리포좀 복합체 - Google Patents

트랜스펙션용 응축 플라스미드-리포좀 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 트랜스펙션용 플라스미드-리포좀 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 다가양이온 응축제로 응축된 플라스미드 분자 및 양이온성 리포좀을 포함한다. 또한 플라스미드-리포좀 복합체의 제조방법이 기술되어 있다.

Description

트랜스펙션용 응축 플라스미드-리포좀 복합체{CONDENSED PLASMID-LIPOSOME COMPLEX FOR TRANSFECTION}
본 발명은 유전자의 생체내(in vivo) 트랜스펙션용 플라스미드-리포좀 복합체의 제조방법의 개선 및 이 방법으로 제조된 조성물에 관한 것이다.
참고문헌
Felgner,J.,et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7417 (1987).
Felgner,J.,et al., J. Tiss. Cult. Meth. 15:63-68 (1993).
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Li,S.,and Huang, L.,Journal of Liposome Research,6(3):589-608 (1996).
Mulligan, R.S.,Science 260:926-932 (1993).
Morishita,R., et al., J. Clin.Invest. 91:2580-2585 (1993).
Rose, J.K.,U.S. Patent No. 5,279,833 (1994).
Trubetskoy,V.S.,et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1131:311-313 (1992).
Wagner, E., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:4255-4259 (1991).
특정세포로의 유전물질의 전달 (예컨대, 유전자 치료)을 용이하게 하는 다양한 방법이 개발되었다. 이러한 방법들은 생체내 또는 생체외(ex vivo) 유전자 전달에 유용하다. 전자에서, 유전자는 대상체에게 직접적으로 도입된다 (정맥내, 복강내, 에어로졸 등). 생체외 (또는 시험관) 유전자 전달에서 유전자는, 대상체의 특정 조직으로부터 세포를 분리한 후, 세포에 도입하고, 이어서 트랜스펙션된 세포를 다시 대상체에게 도입한다.
생체내 및 생체외 유전자 치료를 위한 전달 시스템에는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터, 마이크로주사, 전기천공, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 및 리포좀이 포함된다 (Felgner, et al., 1987;Mulligan, 1993; Morishita et al., 1993),
예컨대, 리포좀 매개 유전자 치료에는 양이온성 지질 및 중성 지질로 구성된 시약인 LIPOFECTIN 으로부터 형성된 양이온성 리포좀의 사용이 수반된다 (Felgner, et al., 1989, 1993). 양이온성 리포좀 및 DNA 의 정전기적 복합체를 형성시키는, 유전자 치료의 다른 리포좀 매개 방법이 기술되어 있다(Trubetskoy, et al., 1992; Morishita et al., 1993; Rose, 1994). 리포좀 기재 트랜스펙션 조성물에 대한 좀더 최근의 접근법에는, DNA 를 지질입자에 결합시키거나 (Wagner, et al., 1991) 또는 DNA 를 응축시키는 (Gao and Huang, 1996; Li and Huang, 1996) 다가양이온, 예컨대 프로타민 또는 폴리리신이 포함된다.
그러나, 현재까지 기술된 리포좀 매개 유전자 치료법 및 조성물에는, 예컨대 LIPOFECTIN의 독성, DNA-리포좀 복합체의 거대한 크기 및 다소 불량한 생체내 트랜스펙션 효율을 포함한 한계가 있다.
따라서, 비교적 비독성이고, 정맥투여용 크기를 가지며, 높은 트랜스펙션 효율을 갖는 DNA 플라스미드-리포좀 복합체를 제조하는 것이 바람직할 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명에는 플라스미드 내 포함된 유전자로 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 플라스미드-리포좀 복합체의 조성물이 포함된다. 이 조성물은 다가양이온성 응축제로 응축되고 저 이온강도의 수성 매질에 현탁된 플라스미드 분자, 및 양이온성 소포체 형성 지질로 형성된 양이온성 리포좀을 포함한다. 이 복합체는 리포좀 지질 대 플라스미드의 비가 5 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 내지 25 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 미만이고, 약 200 nm 미만의 실질적으로 균일한 크기를 갖는다.
하나의 구현예로서, 응축된 플라스미드 분자는 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 제 8 인자 (Factor VIII), 인터루킨-2 또는 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자를 함유하는 DNA 플라스미드 분자이다.
하나의 구현예로서, 응축제는 히스톤, 폴리-l-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B 로부터 선택된 다가양이온 (polycation)이다. 바람직한 구현예로서, 응축제는 전체 히스톤, 히스톤 1 및 히스톤 4 에서 선택된 히스톤이다.
다른 구현예로서, 리포좀 지질 대 플라스미드의 비율은 8 내지 18 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 이다.
저 이온강도 수성 매질은 비이온성 삼투 용질, 예컨대 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란으로부터 제조된다.
양이온성 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로 필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol)에서 선택된 양이온성 소포체 형성 지질로 이루어진다.
또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 추가로 중성 소포 형성 지질을 포함한다. 또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 추가로 콜레스테롤을 포함한다.
또 하나의 구현예로서, 양이온성 리포좀은 친수성 중합체로 유도된 소포체 형성 지질을 포함함으로써, 친수성 중합체 사슬로 표면 코팅된다. 하나의 구현예로서, 친수성 중합체 사슬의 적어도 일부는 방출성 결합, 예컨대 기존의 또는 유도된 생리학적 조건에 대한 반응으로서 친수성 중합체 사슬을 방출하는 데 효과적인 결합에 의해 소포체 형성 지질에 결합되어 있다. 플라스미드-리포좀 복합체는 표적 세포 표면상의 수용체 분자로의 리간드 특이적 결합을 위해, 친수성 중합체 사슬의 말단에 부착된 리간드를 추가 포함할 수 있다. 예컨대, 바람직한 구현예로서, 친수성 중합체는 폴리에틸렌글리콜이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 플라스미드 분자를 응축시키고, 응축된 플라스미드를 양이온성 리포좀의 현탁액과 혼합하여, 숙주 세포의 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드-지질 복합체를 형성시키는 플라스미드-리포좀 복합체의 제조 방법에서의 개선책이 포함된다. 이 개선책에는 (i) 플라스미드 분자의 응축용 응축제로서, 히스톤, 폴리-l-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B로부터 선택된 다가양이온의 선택, (ii) 응축된 플라스미드 분자의 현탁용 매질로서, 저 이온강도의 수성 매질의 선택 및, (iii) 리포좀 지질 대 플라스미드의 비를 5 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 내지 25 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 미만으로의 선택이 포함된다. 이러한 개선책에 의해 제조된 플라스미드-리포좀 복합체는 200 nm 미만의 실질적으로 균일한 크기를 갖는다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체는, 한 구현예로서, DNA 플라스미드에 함유된 유전자로 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되며, 상기 DNA 플라스미드는 제 8 인자, 인터루킨-2 또는 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자를 포함한다.
바람직한 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체는 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자, 또는, 폐암에 대해서는 인터루킨-2와 같은 사이토킨, 또는 p53과 같은 종양 억제 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 대상체의 폐내 숙주세포를 트랜스펙션시키는 데 사용된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은 본 발명의 하기 상술된 기술내용을 첨부된 도면과 함께 읽게 되면 좀더 명백해질 것이다.
도 1 은 다가양이온성 중합체 전체 히스톤으로 응축된 플라스미드의 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.
도 2 는 본 발명에 따른 양이온성 리포좀과 복합된, 다가양이온으로 응축된 플라스미드의 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.
도 3A-3B 는 본 발명에 따른 양이온성 리포좀과 복합된 다가양이온으로 응축된 플라스미드의 극저온(cryogenic) (도 3A) 및 동결할단(freeze fracture) (도 3B) 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다.
도 4 는 본 발명에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 동적광산란법 (dynamic light scattering)으로 측정시의 크기(nm)를 보여주는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체에 대한, 4℃ 에서 저장시간의 함수로서, 동적광산란법으로 측정시의 입자 직경(nm)의 도면이다.
도 6 은 본 발명의 표식된 플라스미드-리포좀 복합체의 마우스내 정맥주사후 시간의 함수로서의 주사량의 퍼센트의 도면이다.
도 7A-7E 는 전체 히스톤으로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 7A), 간(도 7B), 심장(도 7C), 비장 (도 7D) 및 신장(도 7E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.
도 8A-8E 는 히스톤 H1 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 8A), 간(도 8B), 심장(도 8C), 비장 (도 8D) 및 신장(도 8E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.
도 9A-9E 는 히스톤 H4 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 9A), 간(도 9B), 심장(도 9C), 비장 (도 9D) 및 신장(도 9E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질)을 나타낸다.
도 10A-10E 는 양이온성 응축제로서 폴리-l-글루타민, 멜리틴 또는 폴리믹신 B 로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 폐(도 10A), 간(도 10B), 심장(도 10C), 비장 (도 10D) 및 신장(도 10E) 에서의 루시퍼라아제 발현 (pg 루시퍼라아제/mg 단백질)을 나타낸다.
도 11A-11B 는 4℃ 에서 저장된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 시간(일)의 함수로서 폐(도 11A) 및 간(도 11B)에서의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다.
도 12 는 루시퍼라아제 보유 플라스미드의 마이크로그램의 함수로서, 플라스미드-리포좀 복합체의 마우스내 정맥내 투여 24 시간후에서의 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 (pg/mg 단백질)을 나타낸다.
도 13 은 플라스미드-리포좀 복합체의 정맥내 투여 24 시간후 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 활성 (RLU/mg 단백질) 을 나타낸다.
도 14A-14B 는 플라스미드 pHSVtk (도 14A), pCMVp53(도 14B) 및 pCMVIL2 (도 14C)를 포함한 플라스미드-리포좀 복합체로 처리한 동물에 대한, 루이스 폐 전이부의 접종후 일수의 함수로서 생존 동물의 퍼센트를 나타낸다.
도 15 는 시간(일)의 함수로서 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 투여후 마우스의 체중(g) 을 나타낸다. 마우스는 도면에서 화살표로 나타낸 바와 같이, 염수 (+), 및 50㎍ 플라스미드 (O), 75㎍ 플라스미드 (▲) 및 100㎍ 플라스미드 (▽) 의 투여량으로 플라스미드-리포좀 복합체로 1,8,15, 22 및 28 일째에 처리하였다.
도 16 은 종양을 가진 마우스(루이스 폐 종양의 전이모델)에, 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 투여 24 시간 후 다양한 마우스 조직에서의 루시퍼라아제 발현(ng/mg)을 나타내는 도면이다.
I. 플라스미드-리포좀 복합체
본 발명은 플라스미드-리포좀 복합체, 및 숙주 세포의 생체내 트랜스펙션에 사용하기 위한 상기와 같은 복합체의 제조방법에서의 개선에 관한 것이다. 조성물은 다가양이온성 응축체로 응축시킨 후, 저 이온강도의 매질에 현탁시킨 플라스미드 분자를 포함한다. 응축된 플라스미드 분자를 리포좀과 같은 지질 입자와 혼합하여, 플라스미드-리포좀 복합체를 형성시킨다. 후술되는 바와 같이 제조방법의 개선은 응축제의 선택, 현탁 매질의 선택 및 리포좀 지질 대 플라스미드 비의 선택과 관련된다. 개선된 제조 절차를 상술하기 전, 플라스미드-리포좀 및 이의 구성성분을 기술한다.
A. 양이온성 리포좀 성분 및 제조
전술한 바와 같이, 플라스미드-리포좀 복합체는 응축된 플라스미드 분자 및 리포좀을 포함한다. 본원에서 사용되는 리포좀은 통상적으로 수성 내부를 봉입하는, 하나 이상의 지질 이중층으로 형성되는 외부 지질 쉘(shell)을 갖는 지질 소포체를 의미한다. 바람직한 구현예로서, 리포좀은 약 20 내지 80 몰%의 양이온성 소포체 형성 지질, 및 나머지는 중성 소포체 형성 지질 및/또는 기타 성분으로 이루어진 양이온성 리포좀이다. 본원에서 사용되는 "소포체 형성 지질"은, 인지질에 의해 예시되는 바와 같이 소수성 및 극성 머리 기 (head group) 부분을 가지며, 그 자체로 수중에서 자발적으로 이중층 소포체를 형성할 수 있는 임의의 양친성 지질을 의미한다. 바람직한 소포체 형성 지질은 디아실 사슬 지질, 예컨대 인지질이며, 이의 아실 사슬은 통상적으로 약 14 내지 22 탄소원자의 길이이고 다양한 불포화도를 갖는다.
양이온성 소포체 형성 지질은 극성 머리 기가 조작 pH, 예컨대 pH 4-9 에서 순 양전하를 갖는 지질이다. 통상의 예에는, 예컨대 L-리신으로 유도된 지질 DOPE (LYS-DOPE)(Guo, et al., 1993) 에 대하여 설명된 바와 같이, 극성 머리 기가 양성 부분 (예, 리신)으로 유도된, 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질이 포함된다. 또한 이 부류에는 양이온성 극성 머리그룹을 가지는 세레브로시드 및 갱글리오시드와 같은 당지질이 포함된다.
사용될 수 있는 다른 양이온성 소포체 형성 지질은 콜레스테롤 아민 및 관련 양이온성 스테롤이다. 양이온성 지질의 예로는 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 및 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB) 를 들 수 있다.
리포좀의 나머지는 중성 소포체 형성 지질로 형성되며, 이는 순전하를 갖지 않거나 극성 머리 기에 음전하를 갖는 소량의 지질을 포함할 수 있는 소포체 형성 지질을 의미한다. 이런 부류의 지질에는 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SM) 및 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체 및 기타 비전하 스테롤이 포함된다.
전술한 지질은 시중에서 구입하거나 또는 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 기타 지질은 당지질, 예컨대 세레브로시드 및 강글리오시드이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체에는 플라스미드/리포좀 복합체의 혈중순환시간을 연장시키는 데 효과적인 친수성 중합체 사슬로 표면 코팅된 리포좀이 포함된다. 적합한 친수성 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐-피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 및 유도된 셀룰로오스, 예컨대 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시에틸셀룰로오스가 포함된다. 바람직한 친수성 중합체 사슬은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이며, 바람직하게는 500-10,000 달톤, 좀더 바람직하게는 1,000-5,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 사슬이다. 친수성 중합체는 물 및 클로로포름과 같은 비수성 용매에서 용해될 수 있다.
상기 코팅은 바람직하게는 리포좀을 형성하는 소포체 형성 지질내에 바람직하게는 머리 기에 중합체 사슬을 갖도록 유도된 인지질 또는 기타 디아실-사슬 지질을 소포체 형성 지질의 1 내지 2 몰%로 포함시켜 제조한다. 이러한 지질을 제조하는 방법 및 이로써 중합체 코팅된 리포좀을 형성시키는 예시적 방법이 미국특허 제 5,013,556 호 및 제 5,395,619 호에 기재되어 있다.
친수성 중합체는 지질에 안정하게 결합되거나, 또는 혈류에서의 순환 중에 또는 표적 부위에 정착 후에, 중합체 코팅된 플라스미드 리포좀 복합체가 친수성 중합체 코팅을 떨어뜨리거나 방출시키도록 하는 불안정한 결합을 통해 결합될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 자극에 대한 반응으로 중합체 사슬을 방출시키는 데 효과적인 결합을 통한, 친수성 중합체, 특히 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 소포체 형성 지질에의 부착은, 예컨대 WO 98/16202 및 WO 98/16201, 및 문헌 [Kirpotin, D. et al., FEBS Letters, 388:115-118 (1996)] 에 기재되어 있다.
하나의 구현예로서, 방출성 결합은 적당한 방출제의 투여로 절단되거나 효소 또는 환원제의 존재와 같은 선택적인 생리학적 조건하에서 절단되는 화학적 방출성 결합이다. 예컨대, 에스테르 및 펩티드 결합은 에스테라아제 또는 펩티다아제 효소에 의해 절단된다. 디술피드 결합은 환원제, 예컨대, 글루타티온 또는 아스코르베이트의 투여 또는 생체내 존재하는 환원제, 예컨대, 혈장 및 세포내 존재하는 시스테인에 의해 절단된다.
기타 방출성 결합에는 pH 민감성 결합, 및 글루코오스, 빛 또는 열에 노출시 절단되는 결합이 포함된다. 예컨대, 친수성 중합체 사슬은 pH 민감성 결합에 의해 리포좀에 부착될 수 있으며, 플라스미드-리포좀 복합체는 결합을 절단하고 친수성 사슬을 방출시키는 데 효과적인 pH 를 갖는 부위, 예컨대 종양 영역을 표적으로 삼게 된다. pH 민감성 결합의 예에는 아실옥시알킬 에테르, 아세탈 및 케탈 결합이 포함된다. 다른 예는, 절단성 결합이 본원에서 포괄적으로 황 함유 결합을 의미하는 디술피드 결합인 경우이다. 황 함유 결합은 선택된 불안정성의 정도를 달성하도록 합성될 수 있고, 디술피드 결합, 혼합된 술피드-술폰 결합 및 술피드-술폭시드 결합을 포함할 수 있다. 이 세 가지 결합 중, 디술피드 결합이 티올첨가분해 (thiolysis)에 가장 덜 민감하고 술피드-술폭시드 결합이 가장 민감하다.
이러한 방출성 결합은 플라스미드-리포좀 복합체로부터 친수성 중합체 단편의 방출 속도를 제어하는 데 유용하다. 예컨대, 매우 불안정한 술피드 결합이 혈액세포 또는 내피 세포에 대한 표적화에 사용될 수 있는데, 이는 이러한 세포가는 접근하기에 용이하고, 리포좀의 짧은 혈중순환 수명으로도 충분하기 때문이다. 정반대로, 장기지속 또는 강력한 디술피드 결합은 표적이 종양 조직, 또는 복합체가 원하는 표적에 도달하는 데 일반적으로 긴 리포좀 혈중순환 수명이 필요한 기타 기관인 경우에 사용될 수 있다.
친수성 중합체 사슬을 리포좀에 부착시키는 방출성 결합은 통상적으로 환경의 변화의 결과로서, 예컨대 약간 낮은 pH 를 갖는 특정 부위, 예컨대 종양 조직의 영역, 또는 환원조건을 갖는 부위, 예컨대 저산소 상태 종양에 리포좀이 도달하는 경우, 생체내에서 절단된다. 또한 생체내 환원조건은 아스코르베이트, 시스테인 또는 글루타티온과 같은 환원제의 투여에 의해 이루어질 수 있다. 또한 절단성 결합은 외부자극, 예컨대 빛 또는 열에 반응하여 절단될 수 있다.
또 하나의 구현예로서, 플라스미드-리포좀 복합체는 치료하고자 하는 표적 세포에 특이적으로 결합하는 데 효과적인 친화성 부분 또는 표적화 리간드를 포함한다. 이러한 부분은 리포좀의 표면에 부착되거나, 친수성 중합체 사슬의 말단에 부착될 수 있다. 이러한 부분의 예에는, 예컨대 PCT출원 제 WO US94/03103, WO98/16202 및 WO98/16201 에 기재되어 있는 바와 같은 항체, 표적세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 또한 상기 부분은 복합체와 표적세포의 융합을 촉진시키는 소수성 단편일 수도 있다.
B. 응축된 플라스미드
본 섹션에서는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체에서 사용하는 응축상 플라스미드의 제조를 기술한다.
플라스미드를 응축시키기 위하여 사용하는 다가양이온성 응축제는 다중 하전된 양이온성 중합체, 통상적으로 생체고분자, 예컨대 스퍼미딘, 스퍼민, 폴리리신, 프로타민, 전체 히스톤, 특정 히스톤 단편, 예컨대, H1, H2, H3, H4 및 기타 다가양이온성 폴리펩티드이지만, 생체호환성(biocompatible) 중합체, 예컨대 폴리믹신 B 를 포함할 수도 있다. 이러한 다가양이온성 응축제는 프로타민 술페이트 및 폴리리신 히드로브로마이드와 같은 유리 염기 또는 염 형태로 사용될 수도 있다. 바람직한 구현예로서, 다가양이온성 응축제는 히스톤이고, 이는 본원에서 언급된 바와 같이 전 히스톤 또는 특정 히스톤 단편을 포함한다.
복합체에서 사용하는데 적합한 플라스미드는 바람직하게는 5-40 Kbp(kilo basepair) 범위 크기를 갖는 환형 또는 폐쇄 이중가닥 분자이다. 이 플라스미드는 공지된 방법에 따라 구축되며, 치료 유전자, 즉, 적당한 프로모터 및 종결자 제어 요소 및 숙주 세포내에서 복제 및/또는 숙주세포 게놈내로 통합에 필요한 기타 요소의 제어하, 유전자 치료시 발현되는 유전자를 포함한다. 유전자 또는 기타 포유류에서 유전자 치료에 유용한 플라스미드의 제조방법은 널리 공지되어 있고 참조되고 있다.
본 발명의 복합체에 의해 유전자 치료를 위해 도입되는 유전자는 통상적으로 다음 3 범주중의 하나에 포함된다:
첫번째는 대상체에서 유전자의 결핍 또는 결함을 극복하기 위한 유전자이다. 즉, 대상체가 전혀 또는 정상 수준 내에서 활성의 내생 단백질을 생성시키지 못하는 경우이며, 플라스미드 내 도입된 유전자는 이러한 결핍을 보충하기 위한 것이다. 이런 부류의 유전자의 예에는 줄기 세포 또는 림프구에서의 유전자 발현를 위한, 아데노신 디아미나아제 (ADA)를 코딩하는 유전자; 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 결핍, 프로스타글란딘 G/H 신타아제의 결핍, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제의 결핍에 의해 유발되는 Lesch-Nyhan 증후군의 치료를 코딩하는 유전자, 혈우병, 겸상빈혈증 및 기타 혈액관련 질병의 치료를 위한, α1-항트립신, 응고 인자(예, 제 8 인자, 제 9 인자)및 글로빈 (예, β-글로빈, 헤모글로빈)과 같은 다양한 순환 단백질을 코딩하는 유전자, 및 호르몬 및 기타 펩티드 조절자를 코딩하는 유전자가 포함된다.
두번째 부류에는, 종양과 같은 기존의 임의 병리, 또는 바이러스 감염과 같은 병원성 상태를 치료하기 위해 고안된 폴리펩티드이다. 이 예에는 종양 치료용 p53 유전자, HIV 감염을 억제하는 CD4 펩티드용 유전자, 슈도모나스(Pseudomonas)의 상피 세포 결합을 억제하는 슈도모나스 펩티드에 대한 유전자, 및 표적화된 병원체를 억제하는 특정 항체 유전자를 공급하는 유전자 치료가 포함된다.
세번째 부류에는, 종양 성장에 특이적인 단백질의 과발현 또는 바이러스 단백질의 발현과 같은 바람직하지 못한 단백질 발현을 억제하는 안티센스 분자로서 작용할 수 있는 mRNA 전사체를 제조하도록 된 유전자가 포함된다.
II 복합체의 제조 및 특성화
본 발명에 따라, 응축상 플라스미드와 양이온성 리포좀을 저 이온강도 매질에서 혼합하여 형성시킨 플라스미드-리포좀 복합체는 통상적으로 약 200 nm 미만, 바람직하게는 50-200 nm, 좀더 바람직하게는 100-200 nm, 가장 바람직하게는 120-180 nm의 실질적으로 균일한 크기를 갖는 복합체를 생성함이 발견되었다. 이 복합체는 추가로 코딩된 유전자의 발현의 활성의 보유를 특징으로 하며, 즉 복합체는 트랜스펙션 안정성을 갖는다. 이는 후술되는 바와 같이, 4℃ 에서 30 일간, 바람직하게는 90 일간 저장된 후, 세포를 트랜스펙션시키고 코딩된 유전자의 발현을 실현시키는 복합체의 능력에 의해 입증된다.
응축상 플라스미드는, 저 이온강도 매질에서 전술한 유형의 다가양이온성 중합체 응축제를 플라스미드에 첨가하여 형성시킨다. 양이온성 중합체는 전하 화학양론이 달성되는 바람직한 농도로 플라스미드 용액에 첨가된다. 즉, 양이온성 중합체내 총 전하수 (중합체의 공지된 전하 밀도/중량으로부터 결정)는 적어도 DNA 의 총 음전하 (플라스미드 중량 및 DNA의 공지된 전하 밀도/중량으로부터 결정)만큼 많다 . 통상적으로, 첨가된 DNA 플라스미드 대 첨가된 중합체의 중량비는 약 0.1 - 5.0, 좀더 바람직하게는 0.3-2.0 이다. 응축제는 바람직하게는 교반하면서 플라스미드 현탁액에 서서히 첨가, 예컨대 10 분에 걸쳐 첨가한다.
이어서, 저 이온강도 매질에 함유된 응축된 플라스미드 및 양이온성 리포좀을, 예컨대 리포좀에 응축된 플라스미드 분자를 서서히 첨가하면서 혼합한다. 리포좀 지질 대 플라스미드의 비는 최대의 트랜스펙션을 달성하는 데 중요한 변수이다. 이 비율 (nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍)은 5 초과 내지 25 미만, 바람직하게는 8 초과 내지 18 미만, 좀더 바람직하게는 10 초과 내지 15 미만, 가장 바람직하게는 12 내지 14 이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 중요한 특징은 저 이온강도의 매질에서 리포좀과 응축상 플라스미드의 혼합이다. 바람직하게는 DNA, 응축제 및 리포좀 지질종내 존재하는 이온을 포함하여, 매질의 최종 농도는 25 mM 일가 이온화가능 염 (예, 염화나트륨)의 이온강도 미만, 바람직하게는 이러한 염의 10mM 미만, 좀더 바람직하게는 약 1 mM 미만이다. 통상적으로, 저 이온강도는, 유리염기 또는 유리산 플라스미드, 다가양이온 및 지질 종을 사용하고, 전해질 성분을 제거하거나, 이와는 달리 저 이온강도를 유지하기에 충분히 희석된 농도의 구성성분을 사용하고/하거나 투석 등에 의해 구성성분으로부터 생성된 전해질을 제거함으로써, 용이하게 수득된다. 동시에, 주사제로서, 삼투균형을 제공하는, 글루코오스와 같은 비전해질 용질의 존재 하에서 조성물을 제조하는 것이 유용하다.
도 1 은 실시예에서 기술된 바와 같이 제조된, 전체 히스톤으로 응축된 루시퍼라아제 코딩 pNSL 플라스미드의 음염색(negative-stain) 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 보는 바와 같이, 플라스미드는 직경 약 100nm 이하의 별개의 단일 입자로 응축된다.
도 2 는 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조된 다가양이온 응축 플라스미드-리포좀 복합체의 음염색 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 도 1 의 순수하게 응축된 플라스미드 분자와 도 2 의 복합체를 비교시, 불투명하게 응축된 플라스미드가 도 2 에서 쉽게 눈에 띤다. 또한 도 2 에서 각 응축된 플라스미드를 둘러싼 투명막이 보인다. 이러한 투명막은 각 응축된 플라스미드를 피복하는 리포좀 지질 이중층이다.
도 3 A-3B 는 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조된 플라스미드-리포좀 복합체의 극저온전자 및 동결할단 음염색 투과형 전자현미경사진의 컴퓨터 영상이다. 도 3A 의 현미경 사진은 플라스미드-리포좀 복합체 현탁액의 박막을 동결시켜 저온저자 현미경하에서 층을 관찰하여 얻는다. 현미경사진에는 별개의 단일 플라스미드-리포좀 복합체가 보이며, 여기에서 응축된 DNA 는 많은 입자들 중에서 더 진한 중앙 영역으로 보인다. 도 3B 의 동결할단 현미경사진에는 명확한 응집체는 없고, 별개의 플라스미드-리포좀 복합체가 보인다.
동적광산란법을 사용하여 평균 복합체 크기 및 크기 분포를 측정하였다. 이 결과는, 실시예 1 에서 제조한 복합체가 약 146 nm (표준편차 45 nm)의 평균 크기를 갖는 균질한 집단을 형성하는 것을 보여주는 도 4 에 나타내었다. 본 발명을 뒷받침하기 위해 수행된 본 연구 및 기타 연구는, 기술된 방법에 따라 제조한 경우 조성물이 상대적으로 협소한 크기 분포를 갖는 복합체의 집단을 나타내는 단일 피크로 입증되는 균일한 집단을 갖는 복합체를 완성함을 나타낸다. 바람직하게는, 복합체는 200 nm 미만, 좀더 바람직하게는 50-200 nm, 가장 바람직하게는 100-200 nm, 좀더 더 바람직하게는 120-180 nm 의 크기를 갖는다.
앞서 간략하게 논의한 바와 같이, 플라스미드-복합체는 안정하다. 즉, 복합체는 초기의 크기를 유지하며, 예컨대 복합체의 집합체가 거의 없으며, 복합체는 4℃ 에서 적어도 30일간 저장후에도 치료활성을 유지한다. 도 5 는 복합체 크기 안정성의 증거를 제공하고, 동적광산란법으로 측정되는 복합체 크기를 시간의 함수로서 나타낸다. 물/글루코오스 중 플라스미드-리포좀 복합체의 현탁액을 4℃ 에서 저장하고, 저장한 지 7, 14, 21, 28, 60 및 90 일 후 분석하였다. 복합체 형성후 평균 복합체 크기는 약 150 nm 이었고, 보는 바와 같이, 90 일간의 저장 후에도, 복합체 크기는 약 150 nm 로 유지되었다. 치료활성의 유지와 관련한 복합체 안정성은 하기 도 11A-11B 에 논의되어 있다.
III. 생체내 트랜스펙션
본 발명에 따라 제조된 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에 투여하여 다양한 플라스미드-리포좀 복합체 제제의 트랜스펙션 효율을 측정하고, 트랜스펙션의 안정성, 복합체의 생체내분포, 약물동력학 및 투여량 반응을 측정하였다. 예시적인 생체내 트랜스펙션 절차를 실시예 2에 기재하였다.
플라스미드-리포좀 복합체의 약물동력학은 S35-표식 DNA 플라스미드를 포함하는 복합체를 마우스에 주사하여 측정하였다. 도 6 은 정맥내 주사후 시간의 함수로서 주사량의 퍼센트를 나타낸다. 플라스미드-리포좀 복합체의 주사 직후, 약 7% 의 주사량은 혈류내 존재한다. 기타 연구로, 복합체의 나머지 퍼센티지는 주사 직후 폐에 집중되는 것이 측정되었다. 일정기간 경과후 복합체는, 5 시간째에서 약 22% 로 주사량의 퍼센티지가 증가하는 것에 의해 입증되는 바와 같이, 폐내 혈청 단백질에 의해 중화되어 혈류로 유입된다 (도 6). 이어서, 복합체는 혈류로부터 사라지고, 24 시간후 약 12% 의 주사량이 존재한다.
플라스미드-복합체는 리포좀 지질 대 플라스미드의 비를 변화시키면서 생체내 투여를 위해 제조하였다. 이 복합체는 다가양이온 응축제의 양 및 리포좀 지질의 총량을 변화시키면서, 실시예 1 에 기재된 일반절차에 따라 제조하였다. 통상적으로, 다가양이온 응축제의 양은 100-500 ㎍ 이고, 리포좀 지질/플라스미드의 비는 8-18 nmole의 지질/플라스미드의 ㎍ 였다.
도 7-9 는 다가양이온성 응축제로서 전체 히스톤 (도 7A-7E), 히스톤 H1 (도 8A-8B) 및 히스톤 H4 (도 9A-9E)로 제조한 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 결과를 나타낸다. 하기의 표에 나타낸 제형으로부터 제조된 복합체의 투여후, 루시퍼라아제 발현을 폐, 간, 심장, 비장 및 신장에서 측정하였다.
표 1 에는 다가양이온성 응축제로서 전체 히스톤을 사용하여 제조된 플라스미드-리포좀 복합체에 대한 조성을 나타내었다. 전 히스톤의 양은 플라스미드/전체 히스톤의 비를 0.2-1.0 으로 변화시키기 위하여 100-500 ㎍ 사이에서 변화시켰다. 또한 리포좀 지질/플라스미드의 비를 변화시켰고, 8, 14 및 18 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 의 비를 시험하였다.
성분 제제번호1
1 2 3 4 5 6
pNSL플라스미드(㎍) 100 100 100 100 100 100
전체 히스톤(㎍) 200 100 200 350 500 200
리포좀지질2(μmole) 0.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.8
플라스미드(㎍)/전체히스톤(㎍) 0.5 1.0 0.5 0.3 0.2 0.5
nmole지질(nmole)/플라스미드 (㎍) 8 14 14 14 14 18
1: 도7A-7E 에 예시된 각각의 제제번호에 대한 생체내 결과 2: DDAB:콜레스테롤의 1:1 몰비로부터 제조된 리포좀
표 1 에 요약한 제제의 마우스내 생체내 투여의 결과는 도 7A-7E 에 나타내었고, 여기에서 폐(도 7A), 간(도 7B), 심장(도 7C), 비장(도 7D), 및 신장(도 7E)에서의 루시퍼라아제 발현량을 상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질 로 나타내었다. 도면은 트랜스펙션이 가장 높은 범위가 존재함을 보여준다. 특히, 응축제로서의 전체 히스톤에 있어서, 트랜스펙션은 리포좀 지질/플라스미드 비가 8 nmole의 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 및 18 nmole의 지질/플라스미드의 ㎍ 미만일 때 가장 높다.
표 2 에는 다가양이온성 응축제로서 히스톤 H1 을 이용하여 생체내에서 제조 및 시험된 플라스미드-리포좀 복합체 조성을 요약하였다. 플라스미드/히스톤 H1의 비는 0.3 또는 0.5 이고, 리포좀 지질/플라스미드 비는 8, 14 및 18 nmole의 지질/플라스미드의 ㎍ 에서 변한다.
성분 제제 번호1
7 8 9 10 11
pNSL 플라스미드(μg) 100 100 100 100 100
히스톤 H1(μg) 350 200 350 200 350
리포좀 지질2(μmoles) 0.8 1.4 1.4 1.4 1.4
플라스미드(μg)/ 히스톤 H1(μg) 0.3 0.5 0.3 0.5 0.3
지질(nmoles)/ 플라스미드(μg) 8 14 14 18 18
1: 도 8A - 8E에 예시된 각각의 제제 번호에 대한 생체내 결과
2: 1:1의 몰 비의 DDAB:콜레스테롤 로부터 제조된 리포좀
표 2 에 요약된 제제를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 8A - 8E에 예시하였는데, 여기서, 폐 (도 8A), 간 (도 8B), 심장 (도 8C), 비장 (도 8D) 및 신장 (도 8E)에서의 루시퍼라아제 발현량을 상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질 로 나타내었다. 도면은 최상의 트랜스펙션이 리포좀 지질/플라스미드의 비가 14 및 18인 경우 성취됨을 나타낸다.
표 3A 및 3B에는 다가 양이온성 응축제로서 히스톤 H4를 사용하여 형성시킨 플라스미드-리포좀 복합체 제제가 요약되어 있다. 플라스미드/히스톤 H4 의 비는 0.2, 0.3 또는 0.5로 변화시켰고, 리포좀 지질/플라스미드 비는 8, 14 또는 18 nmole의 지질/ 플라스미드의 ㎍ 로 변화시켰다.
성분 제제 번호1
12 13 14 15
pNSL 플라스미드(μg) 100 100 100 100
히스톤 H4(μg) 200 350 500 200
리포좀 지질2(μmoles) 0.8 0.8 0.8 1.4
플라스미드(μg)/ 히스톤 H4(μg) 0.2 0.3 0.2 0.5
지질(nmoles)/ 플라스미드(μg) 8 8 8 14
1: 도 9A - 9E에 예시된 각각의 제제 번호에 대한 생체내 결과
2: 1:1의 몰 비의 DDAB:콜레스테롤 로부터 제조된 리포좀
성분 조성물 번호1
16 17 18 19 20
pNSL 플라스미드(μg) 100 100 100 100 100
히스톤 H4(μg) 350 500 200 350 500
리포좀 지질2(μmoles) 1.4 1.4 1.8 1.8 1.8
플라스미드(μg)/ 히스톤 H4(μg) 0.3 0.2 0.5 0.3 0.2
지질(nmoles)/ 플라스미드(μg) 14 14 18 18 18
1: 도 9A - 9E에 예시된 각각의 제제 번호에 대한 생체내 결과
2: 1:1의 몰 비의 DDAB:콜레스테롤 로부터 제조된 리포좀
표 3A 및 3B에 요약된 제제를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 9A - 9E에 예시하였는데, 여기서 폐 (도 9A), 간 (도 9B), 심장 (도 9C), 비장 (도 9D) 및 신장 (도 9E)에서의 루시퍼라아제 발현량을 상대 광 단위 (RLU)/10초/mg 단백질 로 나타내었다. 트랜스펙션이 가장 큰 범위가 8 nmoles의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 내지 18 nmoles의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 미만에서 존재한다.
본 발명을 뒷받침하기 위해 수행한 다른 실험에 있어서, 폴리-l-글루타민, 멜리틴 (26개의 아미노산을 함유하는 저분자량 펩티드) 또는 폴리믹신 B 술페이트를 다가양이온성 응축제로 사용하여, 플라스미드-리포좀 복합체를 제조하였다. 이들은 각각 Sigma Chemical Co.사로부터 구매가능한 것이다. 상기 복합체를 실시예 2에 기술한 바와 같이 마우스에 주입하고, 루시퍼라아제 발현량을 측정함으로써 생체내 트랜스펙션을 측정하였다.
표 4 에는 다가양이온성 응축제로서 폴리-l-글루타민, 멜리틴 또는 폴리믹신 B를 사용하여 제조한 플라스미드-리포좀 복합체의 조성이 요약되어 있다. 응축제의 양은 50 내지 200 ㎍으로 변화시켰다.
응축제 응축제1
폴리-l-글루타민 멜리틴 폴리믹신 B
제제 번호 21 22 23 24 25 26 27 28 29
pNSL 플라스미드(μg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100
응축제(μg) 50 100 200 50 100 200 50 100 200
리포좀 지질2(μmoles) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
플라스미드(μg)/ 응축제(μg) 2 1 0.5 2 1 0.5 2 1 0.5
지질(nmoles)/ 플라스미드(μg) 14 14 14 14 14 14 14 14 14
1: 도 10A - 10E에 예시된 각각의 제제 번호에 대한 생체내 결과
2: 1:1의 몰 비의 DDAB:콜레스테롤 로부터 제조된 리포좀
표 4의 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에 생체내 투여한 결과를 도 10A - 10E에 예시하였는데, 여기서 폐 (도 10A), 간 (도 10B), 심장 (도 10C), 비장 (도 10D) 및 신장 (도 10E)에서의 루시퍼라아제 발현량을 pg의 루시퍼라아제/mg 단백질 로 나타내었다. 제제 각각에 있어서의 지질/플라스미드 비는 14 nmoles의 지질/플라스미드의 ㎍ 으로 일정하였으며, 상기 비는 5 - 25 nmoles의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 의 바람직한 범위의 약 중간치였다.
다양한 다가양이온성 응축제, 예를 들어 전체 히스톤, 히스톤 H1, 히스톤 H4, 폴리-l-글루타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B를 사용한 상기 연구에 의하면, 트랜스펙션은 리포좀 지질/플라스미드 비 (단위: nmoles의 지질/플라스미드의 ㎍)가 5 초과 내지 약 25 미만인 경우 성취됨이 나타났다. 더 바람직하게는, 상기 비는 8 내지 18, 훨씬 더 바람직하게는 10 내지 15, 가장 바람직하게는 12 내지 14 nmoles의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 이다.
상기에 논의한 바와 같이, 본 발명의 플라스미드/리포좀 복합체는 4℃에서 90일 동안만큼, 입자 크기가 거의 변화하지 않는 것에 의해 입증되듯이, 안정하다 (도 5 참조). 본 복합체의 발현 안정성은 4℃에서 저장한 플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에게 투여함으로써 측정하였다. 구체적으로는, 복합체의 제조 후 즉시 (0 일), 그리고 4℃에서 보관한 지 7일, 14일, 21일, 28일, 30일 및 90일 후에 플라스미드-리포좀 복합체 현탁액을 마우스에게 정맥내 투여하였다. 실시예 2에 상세하게 설명한 방법에 따라, 폐 및 간에서의 루시퍼라아제 발현량을 측정하여, 결과를 도 11A - 11B 에 나타내었다.
도 11A - 11B에서 알 수 있는 바와 같이, 폐 (도 11A) 및 간 (도 11B)에서의 복합체의 저장 시간의 함수로서의 루시퍼라아제 발현량은 일정하게 유지되었다.
복합체는 90일 동안의 시험 기간 동안 코딩 유전자를 발현하는 능력을 유지함이 명백하였다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에 있어서, 복합체는 30일 이상, 더 바람직하게는 90일 동안 0 일에서 측정되는 발현 활성의 50% 이상을 유지하는 능력에 의해 특징지워진다.
실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한 플라스미드-리포좀 복합체를 사용하여 투여량-반응 연구를 수행하였다. 플라스미드-리포좀 복합체를 25, 50, 200, 250 및 200 ㎍의 5가지 플라스미드 투여량 수준으로 마우스에게 정맥내 투여하였다. 투여한 지 24시간 후에, 폐, 심장, 간, 신장 및 비장에서의 루시퍼라아제 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 측정된 루시퍼라아제 발현량은 투여량과 비례하였으며, 폐에서의 발현량이 가장 컸다.
마우스에서의 플라스미드-리포좀 복합체를 투여한지 24시간 후의 전신 루시퍼라아제 발현량을 도 13에 나타내었다. 플라스미드-리포좀 복합체는, 골수, 림프절 및 뇌에서의 루시퍼라아제 발현에 의해 입증되는 바와 같이, 광범위하게 분포한다.
실시예 3에 상술한 바와 같이, 본 발명을 뒷받침하기 위해 수행한 다른 연구에 있어서, 전이성 루이스 (Lewis) 폐 종양을 보유하는 마우스를 플라스미드-리포좀 복합체로 처리하였다. 종양 접종 후, 마우스를 실시예 3의 표 5에 나타낸 8가지의 처리법 중 하나로 처리하였다. 처리는, p53 (pCMVp53) 및 인터루킨 2 (pCMVIL2)를 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 사용하여 제조한 플라스미드-리포좀 복합체의 투여, 및 pHSVtk (헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제) 플라스미드로 제조한 플라스미드-리포좀 복합체와 간시클로비르(ganciclovir)의 병용 처리를 포함하였다. 대조 동물군에는 염수를 투여하였으며, 비교 동물군에는 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드 (실시예 1) 또는 간시클로비르 만으로 제조한 복합체를 투여하였다.
도 14A - 14C는 종양-세포 접종 후의 일수의 함수로서의 생존 동물의 퍼센트를 나타낸다. 도 14A - 14C 모두에 있어서, 염수로 처리한 동물을 ■으로 표시하였다. 예시된 바와 같이, 염수-처리 동물 모두는 종양 접종 후 24 일째에 죽었다. 도 14A에는, 50 μg (▼) 및 75 μg (□)의 pHSVtk 플라스미드를 포함하는 복합체, 및 간시클로비르로 처리한 동물이 예시되어 있다. 간시클로비르 (O)만으로 처리한 동물은 모두 37 일째에 죽었다. 대조로, 리포좀-플라스미드 복합체 및 간시클로비르의 병용 요법으로 처리한 동물은 양호하게 지냈으며, 고 플라스미드 투여량으로 처리한 동물의 70%는 연구기간 동안 생존하였다.
도 14B는 pCMVp53 (▼) 및 pNSL (루시퍼라아제 코딩) (O)을 포함하는 플라스미드-리포좀 복합체로 처리한 동물의 생존율을 나타낸다. 예시된 바와 같이, p53 유전자를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물의 20%는 연구기간 동안 생존하였으며, 반면, 염수 처리 동물 (■) 및 루시퍼라아제-리포터 유전자를 코딩하는 pNSL 플라스미드로 처리한 동물은 죽었다.
도 14C는 50 μg의 플라스미드 DNA (▼) 및 75 μg의 플라스미드 DNA (□)를 투여한, pCMVIL2 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물에서의 결과를 나타낸다. 예시된 바와 같이, 약 15 내지 20 % 사이의 동물이 처리 기간 마지막까지 생존하였으며, 반면, 나머지 미처리 (염수 대조, ■) 동물 모두는 24일에 죽었다. 이와 유사하게, 루시퍼라아제 코딩 pNSL 플라스미드를 포함하는 복합체로 처리한 동물 (O)은 31일에 죽었다.
실시예 3의 표 5의 제제 번호 34, 즉, pNSL 루시퍼라아제-코딩 유전자를 포함하는 플라스미드-리포좀 복합체를, 50 μg의 플라스미드/ 0.7μmol의 지질, 75 μg의 플라스미드/1.05 μmol의 지질 및 100 μg의 플라스미드/1.4 μmol의 지질 의 투여량으로 마우스에게 투여하여, 제제의 독성 지표로서 마우스의 체중을 모니터링하였다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 복합체로 1일, 8일, 15일, 22일 및 28 일째에 처리한 마우스는 도면에서 화살표로 나타낸 바와 같이 첫번째 투여 후 체중이 약간 손실되었지만, 수일 내에 체중 손실을 회복하였다. 도면의 기호는 다음과 같다: 염수로 처리한 마우스 (+ 기호), 및 50 μg의 플라스미드 (O), 75 μg의 플라스미드 (▼), 및 100 μg의 플라스미드 (▽)의 투여량으로 플라스미드-리포좀 복합체로 처리한 마우스.
루이스 폐 종양 모델을 사용한 다른 연구에 있어서, pNSL-루시퍼라아제-플라스미드-리포좀 복합체를 마우스에게 투여하여, 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 발현량을 플라스미드-리포좀 복합체 투여 24시간 후에 조사하였다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 폐 및 종양에서 가장 큰 루시퍼라아제 발현이 관찰되었다.
상기로부터, 어떻게 본 발명의 다양한 특징 및 목적이 충족되는지를 알 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조한 플라스미드-리포좀 복합체는 동적광산란법에 의해 입증되는 바와 같이 약 200 nm 미만의 크기를 가지는 실질적으로 균일한 집단을 형성한다. 본 복합체는 동적광산란법에 의해 입증되는 바와 같이 복합체의 응집 없이 90일 동안 안정하다. 본 복합체의 트랜스펙션 활성이 안정하다는 것도 또한 중요한데, 본 복합체는 4℃에서 30일 이상 동안 저장한 후에 50% 이상의 트랜스펙션 효율을 유지한다.
IV 실시예
하기 실시예에는 본 발명의 플라스미드-리포좀 복합체의 제조, 특징화 및 사용방법이 설명되어 있다. 이 실시예들은 결코 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
재료 및 방법
A. 지질
디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)은 Avanti Polar Lipids Inc (Birmingham, AL) 사로부터 구입하였다. 순도 99% 이상의 콜레스테롤은 Nu-Chek (Elysian, MN) 사로부터 구입하였다.
B. 다가양이온성 응축제
H1,H2, H3 및 H4 를 포함한 히스톤의 혼합물로 구성된 전 히스톤, 히스톤 H1 및 히스톤 H4 는 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) 사로부터 입수하였다. 폴리-l-글루타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B 술페이트는 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO) 사로부터 입수하였다.
C. 방법 : 동적광산란법
크기분포 측정은 제조사의 지시에 따라 작동시킨 Coulter N4MD 장비를 이용하여 동적광산란법(DLS)으로 얻었다. 이 결과는 평균직경(nm), 및 상대부피에 의한 입자의 가우스 분포의 표준 편차로 나타내었다.
실시예 1
플라스미드-리포좀 복합체의 제조
A. pNSL 플라스미드의 제조
루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL 플라스미드는 두개의 시판 플라스미드, pGFP-N1 플라스미드 (Clontech, Palo Alto, CA) 및 pGL3-C (Promega Corporation, Madison,WI)로 구축하였다.
pGL3-C 는 Xbal 로 절단한후 대장균 DNA 폴리머라아제의 클레나우(Klenow) 단편을 이용하여 평활말단 결찰시켰다. 이어서 이것을 HindIII 로 절단시킨후, 루시퍼라아제 유전자를 보유하는 1689-bp 단편을 겔-정제시켰다. pGFP-N1 플라스미드를 SmaI 및 HindIII 로 절단시킨후 아가로오스 겔로부터 단리시킨 4.7kb 단편을 루시퍼라아제 단편과 결찰시켰다. JM109 대장균 세포를 형질전환시켜, 20 개의 콜로니를 선택하였고; 이들중 약 절반은 삽입체의 존재를 보였으며; 삽입체를 가진 8 개의 클론을 NamHI 및 XhoI 로 절단하여 추가로 루시퍼라아제 유전자의 존재를 확인하였고; 이들중 7 개는 양성이었다.
B. 양이온성 리포좀의 제조
양이온성 리포좀은 주로 CHCl3 을 함유하는 유기 용매에 10 μmol DDAB 및 10 μmol 콜레스테롤를 용해시켜 표준 방법에 따라 제조하였다. 이 지질은 감압하 회전시켜 박막으로 건조시켰다. 이 지질막은 증류수를 첨가하여 수화시켜 20 μmole/ml 의 농도의 리포좀 현탁액을 형성시켰다. 리포좀은 초음파에 의해, 또는 공극크기 0.4 ㎛, 0.2㎛, 0.1㎛ 및 0.05㎛ 의 Nucleopore 폴리카르보네이트 막을 통해 순차적으로 압출시켜 크기 조절하여, 약 200 nm 미만 크기의 리포좀을 수득하였다 (Nucleopore Pleasanton, CA).
C. 응축된 플라스미드의 제조
전술한 바와 같이 제조된 루시퍼라아제를 코딩하는 DNA 플라스미드 pNSL 은 하기의 절차에 따라 응축시켰다. 400㎕ 의 플라스미드 (증류수 중 1 mg/ml)를 310㎕ 의 증류수로 희석시킨후 50% 글루코오스 90 ㎕와 혼합하였다. 원액 (증류수중 1mg/ml)에서 취한 100 ㎕의 다가양이온성 응축제 (전체 히스톤, 히스톤 H1, 히스톤 H4, 폴리-l-글루타민, 멜리틴 또는 폴리믹신 B)를 교반하면서 서서히 플라스미드 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 10 분간 교반하였다.
D. 복합체의 제조
14 nmole의 지질/플라스미드의 ㎍ 의 리포좀 지질/플라스미드 비를 갖는 플라스미드-리포좀 복합체를, 280 ㎕의 현탁 리포좀을 350 ㎕의 증류수로 희석시킨 후 70 ㎕ 의 50% 글루코오스를 첨가함으로써 제조하였다. 응축된 플라스미드의 현탁액을 10 분간 연속적으로 교반하면서 묽은 양이온성 리포좀 현탁액에 서서히 첨가하였다.
실시예 2
생체내 트랜스펙션 절차
플라스미드-리포좀 복합체에 의한 생체내 트랜스펙션은 Simonsen(Gilroy, CA)사로 부터 입수한 BALB/c 마우스로 실시하였다. 각 플라스미드-리포좀 복합 체 제제를 꼬리 정맥을 통해 3 마리의 마우스에 주사하였다. 이 마우스를 주사 24 시간후 죽여 조직 (폐, 간, 비장, 신장, 심장)를 채취한후 마취하 헤파린화 PBS(4C) 로 관류시켰다.
0-4℃ 의 온도에서, 0.75ml의 세포 용해 시약 (Promega, Madison, WI)를 각각의 조직에 첨가하고, 이 조직을 20,000rpm 에서 1 분간 균질화시켰다. 상층액은 미세원심분리관에 넣어 10,000g 에서 5 분간 회전시켰다. 상층액을 수거하여 루시퍼라아제 및 단백질에 대해 분석하였다. 각 시료의 20 ㎕ 를 발광계로 즉시 측정하였다(100㎕의 루시페린 및 ATP 함유 분석 버퍼, 10초 측정). 상대광단위는 추출물내 단백질의 양으로 표준화하였다.
실시예 3
생체내 트랜스펙션 종양보유 마우스
A. 플라스미드-리포좀 복합체의 제조
플라스미드-리포좀 복합체는 하기의 플라스미드를 이용하여 실시예 1 의 절차에 따라 제조하였다: 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조된 루시퍼라아제를 코딩하는 pNSL, 및 pCMVp53, pCMVIL2 및 pHSVtK (모두 시판품임).
B. 종양 접종
80 마리의 B6C3-F1 수컷 마우스를 Taconic Farms (German Town, NY)사로 부터 입수하여 실험 개시전 3 일동안 순치시켰다. 이 동물들은 즉석 살균된 설치류 사료 및 산성화수가 공급된(12:12 명암주기) 적절히 분리된 우리에 수용시켰다. 이 동물들은 체중에 따라 종양 접종전 치료군으로 무작위로 추출하였다 이 동물들은 종양의 접종전 치료군으로 무작위로 추출하였다.
모든 동물에서 일반적 상태에 대하여 매일 관찰하였다. 이 동물들은 종양세포의 접종전 체중을 재고 이후 주마다 2 회 체중을 쟀다. 초기 체중보다 15% 이상 체중이 감소한 것으로 관찰되거나 또는 피로해 보이는 임의의 동물을 안락사시켜 폐, 간 및 비장에서 전이부위의 존재 및 크기에 대하여 조사하였다.
종양은, 안락사후 멸균상태에서 수술로써 다른 B6C3-F1 마우스로부터 성장중인 루이스 폐 종양을 취하여 접종하였다. 이 종양은 가능한한 기계적으로 미세하게 잘게 썰어 콜라게나아제, 프로테아제 및 DNAse의 효소 혼합물에서 간략하게 분해시켰다(37℃). 배지(RPMI+15%FCS)에서 분해 및 세정시킨후, 혈구기로 세포를 계수하였다. 세포는 스핀다운시켜 배지에 106 세포/ml (105 세포/0.1 ml 주사액)로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포는 개별의 주사기 (0.1 ml, 연속적으로 혼합하면서)로 빨아 올려 각 동물의 꼬리 정맥에 정맥주사하였다.
C. 처리
동물들은 종양 세포로 접종후 3 일째부터 하기 표5 에 기재된 8 개의 양생법중 하나로 처리하였다. 간시클로비르 처리군 번호 30 및 병행치료의 일부로 간시클로비르가 투여된 동물 (군번호 32,33)에 대하여 나타낸 경우만 제외하고, 각각의 군에서 10 마리를 1 주일 간격으로 5 회 처리하였다.
제제번호 조성
301,2,3,4 염수, 0.1ml IV
311 간시클로비르, 100㎍/kgIP (5주간 6일동안 1일 2 회)
321 리포좀/pHSVtk복합체,50㎍DNA/마우스+간시클로비르100㎍/kg (플라스미드/리포좀 복합체의 각 투여후 6 일간 1일 2회)
331 리포좀/pHSVtk복합체,75㎍DNA/마우스+간시클로비르100㎍/kg (플라스미드/리포좀 복합체의 각 투여후 6 일간 1일 2회)
342,3,4,5 리포좀/pNSL(루시퍼라아제코딩)복합체;50,75,100㎍의 플라스미드의 다양한 투여량
352 리포좀/pCMVp53복합체, 75㎍DNA/마우스
363 리포좀/pCMVIL2복합체, 50㎍DNA/마우스
373 리포좀/pCMVIL2복합체, 75㎍DNA/마우스
1 도14A 에 나타낸 데이타 2 도14B 에 나타낸 데이타 3 도14C 에 나타낸 데이타 4 도15 에 나타낸 데이타 5 도16 에 나타낸 데이타
마지막 처리 24 시간후, 생존한 동물을 안락사시켜 조직 및 종양을 수거하여 조사하였다. 각 처리군에 대한 생존 동물의 퍼센트는 도 14A-14C 에 나타내었다. 제제 번호 34 의 독성은 도 15 에 나타내었고 제제 번호 34의 루시퍼라아제 발현량은 도 16 에 나타내었다.
비록 본 발명은 특정 구현예와 관련하여 기술되었지만, 당업자에게는 다양한 변경 및 변형이 본 발명에서 벗어나지 않으면서 행해질 수 있음이 명백하다.

Claims (29)

  1. 다가양이온성 응축제로 응축되고, 일가 이온화가능 염을 함유하는 10 mM 용액의 이온강도 미만의 이온강도를 가지며 비전해질 용질을 함유하는 수성 매질에 현탁된 응축된 플라스미드 분자, 및
    디아실 사슬을 갖는 양이온성 소포체 형성 지질, 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)를 함유하고, 일가 이온화가능 염을 함유하는 10 mM 용액의 이온강도 미만의 이온강도를 가지며 비전해질 용질을 함유하는 수성 매질에 현탁된 양이온성 리포좀을 함유하는,
    플라스미드 내 함유된 유전자로 숙주 세포를 트랜스펙션시키는데 사용되는 플라스미드-리포좀 복합체의 조성물로서,
    상기 복합체는 리포좀 지질 대 플라스미드의 비가 5 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 내지 25 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 미만이고, 200 nm 미만의 균일한 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 응축된 플라스미드 분자는 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 제 8 인자 (Factor VIII), 인터루킨-2 또는 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 응축제는 히스톤, 폴리-l-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B 로 구성된 군에서 선택된 다가양이온인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 응축제는 전체 히스톤, 히스톤 1 및 히스톤 4 에서 선택된 히스톤인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 리포좀 지질 대 플라스미드의 비가 8 내지 18 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 용질은 글루코오스, 수크로오스 및 덱스트란으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 디아실 사슬을 갖는 양이온성 소포체 형성 지질이 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 추가로 중성 소포체 형성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 추가로 콜레스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은, 친수성 중합체로 유도된 소포체 형성 지질을 포함함으로써, 친수성 중합체 사슬로 표면 코팅되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 친수성 중합체의 일부는 기존의 또는 유도된 생리학적 조건에 대한 반응으로서 친수성 중합체 사슬을 방출시키는 데 효과적인 결합에 의해 상기 소포체 형성 지질에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 플라스미드 리포좀 복합체는, 표적 세포 표면상의 수용체 분자로의 리간드 특이적 결합을 위해 친수성 중합체 사슬의 말단에 결합된 리간드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자, 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 폐내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 5 항, 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
  16. 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 종양내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 5 항, 및 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
  17. 플라스미드 분자를 응축시키고, 응축된 플라스미드를 디아실 사슬을 갖는 양이온성 소포체 형성 지질, 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시 에틸암모늄 브로마이드 (DORIE), 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)를 함유하는 양이온성 리포좀의 현탁액과 혼합하여, 숙주 세포의 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드-리포좀 복합체를 형성시키는, 하기 단계를 포함하는 크기가 200 nm 미만으로 균일한 플라스미드-리포좀 복합체의 제조방법:
    플라스미드 분자 응축용 응축제로서, 히스톤, 폴리-l-글루타민, 프로타민, 멜리틴 및 폴리믹신 B 로 구성된 군에서 선택된 다가양이온을 선택하는 단계;
    상기 응축된 플라스미드 분자 및 상기 양이온성 리포좀의 현탁용 매질로서, 일가 이온화가능 염을 함유하는 10 mM 용액의 이온강도 미만의 이온강도를 가지며 비전해질 용질을 함유하는 수성 매질을 선택하는 단계; 및
    리포좀 지질 대 플라스미드의 비를 5 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 초과 내지 25 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 미만으로 선택하는 단계.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 응축제는 전체 히스톤, 히스톤 1 및 히스톤 4 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 리포좀 지질 대 플라스미드의 비는 8 내지 18 nmole의 리포좀 지질/플라스미드의 ㎍ 인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 용질은 글루코오스, 수크로오스 및 덱스트란으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀이 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판 (DOTAP)으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은, 친수성 중합체로 유도된 소포체 형성 지질을 포함함으로써, 친수성 중합체 사슬로 표면 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 8 인자, 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드로 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는, 제 17 항에 따른 방법으로 제조되는 플라스미드-리포좀 복합체.
  25. 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자, 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 폐내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는, 제 17 항에 따른 방법으로 제조되는 플라스미드-리포좀 복합체.
  26. 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자, 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 폐내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 13 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
  27. 낭포성 섬유증 막투과 전도성 조절자, 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 폐내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 14 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
  28. 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 종양내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 13 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
  29. 인터루킨-2 및 p53 을 코딩하는 유전자의 군으로부터 선택된 DNA 플라스미드로 대상체의 종양내 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 제 14 항에 따른 플라스미드-리포좀 복합체.
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