MXPA03008864A - Composicion de liposoma para el suministro intracelular mejorado en un agente terapeutico. - Google Patents

Abstract

Se describe una composicion liposomal y un metodo para usar la misma para lograr un suministro intracelular de un agente atrapado con liposoma; los liposomas estan compuestos de un Iipido sensible al pH e incluyen un ligando de objetivo para dirigir a los liposomas a una celula objetivo; los liposomas tambien incluyen un componente de estabilizacion, tal como un Iipido derivado de polimero, donde el polimero esta unido al Iipido mediante un enlace el cual se puede liberar; la administracion de liposomas resulta en la internalizacion y desestabilizacion celular del liposoma para el suministro intracelular del agente atrapado.

Description

COMPOSICION LIPOSOMAL PARA EL SUMINISTRO INTRACELULAR MEJORADO DE UN AGENTE TERAPEUTICO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones liposomales diseñadas para el suministro ¡ntracelular mejorado de un agente incluido. De manera más específica, la invención se relaciona con composiciones y métodos para incrementar la citotoxicidad ¡ntracelular de un agente incluido en un liposoma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Durante mucho tiempo, se ha considerado a los liposomas como posibles vehículos para el suministro ¡ntracelular de agentes terapéuticos. Hasta la fecha, sin embargo, el éxito para lograr el suministro ¡ntracelular de un agente incluido en un liposoma se ha limitado por varias razones. Una razón es que los liposomas, después de la administración sistémica a la corriente sanguínea, se remueven rápidamente de la circulación por el sistema reticuloendotelial. Otra razón es la dificultad inherente para el suministro de una molécula, en particular una molécula grande o cargada, en el citoplasma y/o núcleo celular.

Un método para mejorar el suministro intracelular de agentes incluidos en liposomas, es extender la vida de circulación en la sangre del liposoma, incluyendo lípidos derivados con polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés), en la membrana con una bicapa del liposoma (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,013,556). Al extender el lapso de tiempo en que el liposoma permanece en la corriente sanguínea, se mejora la oportunidad de captación por una célula. Otro método para mejorar el suministro intracelular de agentes incluidos en un liposoma, es proporcionar una porción o ligando para la selección de un objetivo en el liposoma (Klibanov et al., J. Liposome Res., 2 (3): 321 (1992)). La unión de la porción para la selección de un objetivo a un receptor en una célula objetivo, mejora la oportunidad de la captación intracelular del liposoma y su agente incluido. En la técnica, también se describen liposomas capaces de una fusión con una célula objetivo (Patente de E.U.A. No. 5,891 ,468). Los liposomas fusogénicos, incluyen típicamente un segmento hidrofóbico que se extiende desde las superficies externas de los liposomas para la- penetración en una membrana celular objetivo. Los liposomas que se desestabilizan bajo condiciones ligeramente acidas, llamados liposomas "sensibles al pH", también se han descrito como un método para el suministro intracelular de un agente incluido (Slepushkin ef al., J. Biol. Chem., 272 (4): 2382 (1997); Wang et al., Proc. Nati. Acad. ScL, 84: 7851 (1987), Liu ef al., Biochlm. Biophys. Acta, 981.: 254 (1989)). Estos liposomas están compuestos principalmente de un lípido, tal como la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, por sus siglas en inglés), que forma una bicapa de lípido en un intervalo de pH definido. Fuera de este intervalo de pH, la bicapa de lípido se desestabiliza. Después de que tales liposomas entran a las células vía la endocitosis, el pH ácido dentro de los endosomas causa que los liposomas sensibles al pH se desestabilicen y liberen al agente incluido. Debido a que los liposomas sensibles al pH, como los "liposomas no sensibles al pH", "convencionales" tienen vidas de circulación cortas, se ha propuesto la adición de lípidos derivados con PEG, para extender la vida de circulación en la sangre (Slepushkin et al.). Sin embargo, la adición de lípidos derivados con PEG, atenúa la sensibilidad al pH de los liposomas, dando como resultado una pérdida de la desestabilización rápida deseada de la bicapa del liposoma y la liberación rápida acompañante del agente incluido en la célula. Un método para proporcionar liposomas sensibles al pH que tengan una vida de circulación en la sangre larga y que retengan la capacidad del liposoma para desestabilizarse rápidamente, es el uso de lípidos derivados con PEG, en donde el PEG está unido al lípido mediante un enlace químicamente escindible, tal como un disulfuro (Kirpotin eí al., FEBS Letters, 388: 1 15 (1996)). Se desea, sin embargo, que la desestabilización ocurra en la célula para lograr una alta concentración intracelular del agente incluido en el liposoma. Los liposomas sensibles al pH, de larga circulación, descritos por Kirpotin et al. (¡d.), se diseñaron para desestabilizarse extracelularmente mediante la liberación de las cadenas de PEG. Este método sufre de la desventaja de liberar extracelularmente el contenido incluido en el liposoma. En consecuencia, permanece una necesidad en la técnica de una composición liposomal capaz de unirse específicamente a una célula objetivo, acompañada por una liberación intracelular rápida de su agente incluido.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar una composición liposomal capaz de suministrar intracelularmente un agente incluido en un liposoma. Un objeto adicional de la invención es proporcionar una composición liposomal y un método para utilizar la misma, para tratar una variedad de trastornos, y en particular para tratar malignidades hematológicas. En consecuencia, en un aspecto, la invención incluye una composición liposomal para el suministro intracelular de un agente terapéutico. La composición está comprendida de liposomas formados de (i) un lípido sensible al pH; (ii) entre 1-20 por ciento en mol de un lípido derivado con un polímero hidrofílico, el polímero está unido al lípido mediante un enlace efectivo para liberar las cadenas del polímero hidrofílico, en respuesta a una condición fisiológica existente o inducida; (iii) un ligando para la selección de un objetivo; y (iv) un agente terapéutico incluido. La composición es efectiva para unirse a una célula objetivo y para liberar el agente incluido, para lograr al menos un incremento de dos veces en la concentración intracelular del fármaco, cuando se compara con la concentración intracelular del fármaco suministrado por liposomas similares que carecen del enlace liberable y/o del ligando para la selección del objetivo. En una modalidad, el lípido sensible al pH es la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). En otra modalidad, los liposomas incluyen además, un componente estabilizante, tal como un semisuccinato de colesterilo (CHEMS, por sus siglas en inglés). El polímero derivado con el lípido, en una modalidad, es fosfatidiletanolamina derivada con polietilenglicol. El ligando para la selección del objetivo puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, y para el tratamiento de ciertos trastornos, se prefieren los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD 9, anti-DC20, anti-CD22. El enlace liberable que une la cadena del polímero hidrofílico al lípido, en una modalidad, contiene un enlace de disulfuro. El enlace de disulfuro, en una modalidad preferida, es parte de un enlace de ditiobencilo. En otro aspecto, la invención incluye un método para incrementar la citotoxicidad intracelular de un agente incluido en un liposoma. El método incluye proporcionar liposomas que tengan la composición descrita anteriormente, y administrar los liposomas para lograr (i) la escisión del enlace liberable, liberando por lo tanto, la cadena del polímero hidrofílico; (ii) unir el ligando a una célula objetivo, en donde la unión ocurre antes de, o posteriormente a la escisión; y (iii) la asimilación del liposoma por la célula objetivo. Tal administración es efectiva para lograr una citotoxicidad intracelular del agente, al menos dos veces más alta, con relación a la concentración intracelular del fármaco suministrado por liposomas similares que carecen del enlace liberable y/o el ligando para la selección del objetivo. En una modalidad, la escisión del enlace liberable después de la administración de la composición, se logra por uno o más agentes endógenos, tales como un componente natural en la sangre o en una célula. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para incrementar la acumulación de un agente terapéutico en los núcleos celulares, proporcionando liposomas tales como los descritos anteriormente y administrando los liposomas para lograr (i) la escisión del enlace liberable, liberando por lo tanto, todas o una porción de las cadenas del polímero hidrofílico; (ii) unir el ligando a una célula objetivo, en donde la unión ocurre antes de, o posteriormente a la escisión; y (iii) la asimilación del liposoma por la célula objetivo. Tal administración es efectiva para lograr una acumulación al menos dos veces más alta del agente en el núcleo de la célula objetivo, cuando se compara con la concentración intracelular del agente suministrado por liposomas similares, que carecen del enlace liberable y/o del ligando para la selección del objetivo.

Estos y otros objetos y características de la invención se apreciarán más completamente, cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención, en conjunto con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1 B ¡lustran la fuga de un pigmento fluorescente encapsulado, como una función del tiempo (hr), determinada como el incremento en el porcentaje en la fluorescencia de la mezcla sobre aquélla de la muestra de preincubación tratada con Tritón X-100 (100% de liberación), de los liposomas de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) estabilizados con varios conjugados de PEG-DSPE (escindibles o no escindibles) en amortiguador a pH 7.4 o pH 5.5, a 37°C, en la presencia o ausencia de ditiotreitoi (DTT, por sus siglas en inglés); los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado ± la S.D. (Desviación Estándar) (en muchos casos, las barras de error son más pequeñas que los marcadores); en (A) , DOPE, sin PEG-DSPE, pH 7.4; , DOPE, sin PEG-DSPE, pH 5.5; , DOPE/mPEG-DSPE, pH 7.4; , DOPE/mPEG-DSPE, pH 5.5, en (B) , DOPE/mPEG-S-S-DSPE, pH 7.4;, DOPE/mPEG-S-S-DSPE, pH 5.5; , DOPE/mPEG-S-S-DSPE+DTT, pH 7.4; , DOPE/mPEG-S-S-DSPE+DTT, pH 5.5. Las Figuras 2A-2B ilustran la fuga del pigmento fluorescente encapsulado como una función del tiempo (hr), determinada como el incremento en el porcentaje en la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de la muestra de preincubación tratada con X-100 (100% de liberación), de liposomas de DOPE/CHEMS, estabilizados con mPEG-DSPE al 5% en mol, o conjugados de mPEG-S-S-DSPE al 5% en mol (escindibles o no escindibles) en amortiguador a pH 7.4 o pH 5.5, a 37°C, en la presencia o ausencia de ditiotreitol (DTT); los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado ± la S.D. (en muchos casos, las barras de error son más pequeñas que los marcadores); en (A) , únicamente DOPE/CHEMS, pH 7.4; , únicamente DOPE/CHEMS, pH 5.5; DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, pH 7.4; , DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, pH 5.5; en (B) , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE, pH 7.4; DOPE/CHEMS/mPEG-S-S DSPE, pH 5.5; , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE+DTT, pH 7.4; , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE+DTT, pH 5.5. Las Figuras 3A-3B ilustran la fuga de un pigmento fluorescente encapsulado como una función del tiempo (hr), de liposomas de DOPE (A) o liposomas de DOPE/CHEMS (B), estabilizados o no estabilizados con diferentes proporciones de mPEG-S-S-DSPE en una mezcla de lípidos, incubada en un extracto libre de células, ajustado a un pH 5.5 a 37°C; la fuga se determina como el incremento del porcentaje en la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de la muestra de preincubación tratada con Tritón X-100 (100% de liberación); los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado ± la S.D.; en (A) , DOPE solo; , DOPE/mPEG-S-S-DSPE (1 :0.03); , DOPE/mPEG-S-S-DSPE (1 :0.05); en (B) , DOPE/CHEMS (6:4); , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE (6:4:0.18); , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE (6:4:0.3). Las Figuras 4A-4B ilustran la fuga como una función del tiempo (hr), después de la incubación en plasma humano (pH 7.4) a 37°C, de la doxorrubicina encapsulada de liposomas de DOPE o DOPE/CHEMS, que contienen anti-CD19 como la porción para la selección del objetivo y mPEG-DSPE o mPEG-S-S-DSPE; la DXR liberada se determinó como el incremento en el porcentaje en la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de las muestras preincubadas con Tritón X-100; los resultados son de un experimento representativo, y son medias de análisis por triplicado ± la S.D.; (A) , DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE cargado con DXR, con el objetivo seleccionado con anti-CD19, (1 :0.04:0.01 ); , DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE cargado con DXR, con el objetivo seleccionado con anti-CD19, (6:4:0.2:0.1 ); (B) , DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE, cargado con DXR, con el objetivo seleccionado con anti-CD19 (1 :0.04:0.01 ); , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S DSPE/Mal-PEG-DSPE cargado con DXR, con el objetivo seleccionado con anti-CD19, (6:4:0.2:0.1 ). Las Figuras 5A-5C ilustran la acumulación nuclear in vitro con el tiempo, de la doxorrubicina en células Namalwa, después del tratamiento con doxorrubicina encapsulada en liposomas; los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado ± la S.D.; en (A) , doxorrubicina libre; , liposomas que contienen doxorrubicina de HSPC/CHOL/mPEG-DSPE, 2:1 :0.1 ; , liposomas que contienen doxorrubicina con el objetivo seleccionado con anti-CD19 de HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE, 2:1 :0.08:0.02; en (B) liposomas que contienen doxorrubicina con el objetivo seleccionado con anti-CD19 de DOPE/mPEGDSPE/Mal-PEG-DSPE, 1 :0.04:0.01 ; , liposomas que contienen doxorrubicina con el objetivo seleccionado con anti-CD19 de DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE, 6:4:0.24:0.06; , liposomas que contienen doxorrubicina de DOPE/mPEG-DSPE, 1 :0.05; O, DXR-DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, 6:4:0.3; en (C) , liposomas que contienen doxorrubicina con el objetivo seleccionado con anti-CD19 de DOPE/CHE S/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE, 6:4:0.12:0.06; liposomas que contienen doxorrubicina con el objetivo seleccionado con ant'n CD19 de DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE, 1 :0.02:0.01 ; , liposomas que contienen doxorrubicina sin el objetivo seleccionado de DOPE/mPEG-S-S-DSPE, 1 :0.03; , liposomas que contienen doxorrubicina sin el objetivo seleccionado de DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE, 6:4:0.18. Las Figuras 6A-6D ¡lustran la farmacocinética de los liposomas de DOPE o DOPE/CHEMS en ratones BALB/c, medida por la captación de [125l] TI encapsulado en varias formulaciones liposomales (0.5 µ?t??? PL/ratón); los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de un análisis por triplicado ± la S.D.; en (A) , DOPE; , DOPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.03; , DOPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.05; DOPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.1 ; en (B) , DOPE/CHEMS; , DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, 6:4:0.18; DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, 6:4:0.3; , DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, 6:4:0.6; en (C) , DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.02:0.01 ; , DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.04:0.01 ; , DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 1.0:0.09:0.01 ; (D) , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 6:4:0.012:0.06; , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 6:4:0.024:0.06; , DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, 6:4:0.054:0.06.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona composiciones liposomales y métodos para utilizar las mismas para el suministro intracelular de un agente incluido en un liposoma. Los liposomas están adaptados para liberar rápidamente el agente incluido, en respuesta a un medio con un pH menor al fisiológico, en un sitio objetivo, tal como la región interna de una célula o un organelo intracelular. A continuación, se describe la composición liposomal y se muestra el suministro intracelular del contenido liposomal.

I. Definiciones y Abreviaturas "Una condición fisiológica inducida", se refiere a un agente o condición exógeno, tal como calor, luz, un agente químico o un agente biológico, administrado a un sujeto tratado con los liposomas descritos aquí, en donde el agente o condición es efectivo para causar la escisión de un enlace lábil.

"Una condición fisiológica existente", se refiere a un agente o condición endógeno, tal como un agente químico, un agente biológico, un nivel de pH o una temperatura, efectivo para causar la escisión de un enlace lábil. La frase "efectivo para liberar las cadenas del polímero hidrofílico", pretende la liberación de todas o al menos una porción de las cadenas de polímero. Un lipido "sensible al pH", se refiere a un lipido cuya capacidad para formar y/o mantener la formación de una bicapa de lipido, depende al menos en parte del pH del medio circundante. DOPE se refiere a la dioleoilfosfatidiletanolamina. DSPE se refiere a la diestearoilfosfatidiletanolamina. mPEG-DSPE se refiere al metoxipoli(etilenglicol) acoplado covalentemente a la DSPE. mPEG-S-S-DSPE se refiere al N-[2-ro-metoxipoli(etilenglicol)-a-aminocarboniletil-ditiopropionil]-DSPE. Mal-PEG-DSPE se refiere al polietilenglicol terminado en maleimida acoplado covalentemente a la DSPE. CHEMS se refiere al semisuccinato de colesterilo. CFE se refiere a extracto libre de células. mAb se refiere a anticuerpo monoclonal. DXR se refiere a doxorrubicina. HPTS se refiere al 8-hidroxipirentrisulfonato trisódico.

HSCP se refiere a la fosfatidilcolina de soya hidrogenada. TI se refiere a la tiraminilinulina. DPX se refiere al bromuro de p-xilen-bis-piridinio.

II. Composición Liposomal Los liposomas para utilizarse en el método de la invención están comprendidos de un lípido sensible al pH y de un lípido derivado con un polímero hidrofílico, en donde el polímero y el lípido se unen mediante un enlace escindible. Los liposomas también incluyen un ligando o una porción efectiva para dirigir los liposomas a una célula específica. Un agente terapéutico está incluido en los liposomas para el suministro intracelular. Cada uno de estos componentes se describirá ahora.

Componente de Lípido sensible al pH Los liposomas incluyen un lípido sensible al pH, esto es, un lípido que forma vesículas con una bicapa en ausencia de un componente estabilizante, únicamente a intervalos de pH específicos. Estos lípidos son, de manera típica, lípidos anfifátícos que tienen porciones con grupos principales hidrofóbicos y polares, y cuando se arreglan en una bicapa, están orientados de manera que la porción hidrofóbica está en contacto con la región hidrofóbica interior de la membrana con una bicapa, y la porción con el grupo principal polar está orientada hacia la superficie polar exterior de la membrana. Los lípidos anfifátícos sensibles al pH, de manera preferida, tienen dos cadenas de hidrocarburo, típicamente cadenas de acilo de entre aproximadamente 8-22 átomos de carbono de longitud, y que tienen grados variables de insaturación. Un lípido sensible al pH preferido es la dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), un fosfolípido que tiene cadenas de diacilo. Al pH y fuerzas iónicas fisiológicos, la DOPE existe en una fase hexagonal invertida (H||), incapaz de formar bicapas. Los liposomas con una bicapa de DOPE, pueden hacerse a un pH por encima de la pKa del grupo amina, es decir, a un pH de aproximadamente 8.5 (Alien T. . et al., Biochemistry, 23: 2976 (1990)). Sin embargo, a pH en donde el ácido está cargado negativamente, la DOPE puede estabilizarse en el estado de bicapa en la presencia de un anfífilo con porciones hidrofílicas que rechacen las cargas (Litzinger, L. H. Biochim. Biophys. Acta, 1 131 : 201 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters, 388: 15 (1996)). La protonación del anfífilo a la pKa del anfífilo, acelera la desestabilización de las vesículas de DOPE, promoviendo la inversión a la fase hexagonal (H,,) (La¡, M. Z. et al. Biochemistry, 24: 1654 (1985); Ellens, H. et al., Biochemistry, 23: 1532 (1984)). Así, el pH al cual los liposomas liberarán su contenido, puede controlarse mediante la selección de los anfífilos estabilizantes. En una modalidad de la presente invención, la DOPE se estabiliza en el estado de bicapa por el semisuccinato de colesterilo (CHEMS) voluminoso. El CHEMS está cargado negativamente de manera neta a pH 7.4, y estabiliza la DOPE en el estado de bicapa a pH neutro. A niveles de pH de aproximadamente 6.0 y menores, el CHEMS se protona, lo cual resulta en una desestabilización de las vesículas de DOPE. La DOPE también puede estabilizarse en el estado de bicapa a un intervalo de pH de entre 5.5-7.4, mediante la inclusión de un pequeño porcentaje en mol de un lípido anfifático, que tenga una porción hidrofílica voluminosa, por ejemplo, un derivado de lípido con PEG, como se describirá posteriormente.

Componente de Lípido Derivado con Polímero Los liposomas también incluyen un lípido derivado por un polímero hidrofílico. Los lípidos derivados con polímeros sirven para estabilizar el lípido sensible al pH para facilitar la formación de la bicapa y del liposoma, y para formar un recubrimiento de las cadenas del polímero sobre la superficie del liposoma para extender la vida de circulación en la sangre de los liposomas. Esto es, el recubrimiento del polímero hidrofílico proporciona estabilidad coloidal y sirve para proteger los liposomas de la captación por el sistema fagocítico mononuclear, proporcionando una vida más larga de circulación en la sangre para que los liposomas se distribuyan en el organismo. Como se describirá, las cadenas de polímero se unen al lípido mediante un enlace liberable para la escisión y liberación de las cadenas de polímero, con el fin de restablecer la sensibilidad al pH de los liposomas. De manera preferida, el lípido derivable es un lípido anfifático que forma vesículas, no sensible al pH, el cual puede formar espontáneamente una vesícula con una bicapa en agua. Los lípidos que formas vesículas de este tipo, son de manera preferida, unos que tengan dos cadenas de hidrocarburo, típicamente cadenas de acilo y un grupo principal, ya sea polar o no polar. Existe una variedad de lípidos anfifáticos que forman vesículas, sintéticos o naturales, que incluyen y no se limitan a los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, y esfingomielina, en donde las dos cadenas de hidrocarburo son típicamente, de entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono de longitud, y que tienen grados variables de insaturación. Los lípidos y fosfolípidos descritos anteriormente, cuyas cadenas de acilo tienen grados variables de saturación, pueden obtenerse comercialmente o prepararse de acuerdo con métodos publicados. Los lípidos alifáticos con cadenas de diacilo preferidos para utilizarse en la presente invención, incluyen al diacil glicerol, fosfatidil etanolamina (PE, por sus siglas en inglés) y fosfatidllgllcerol (PG, por sus siglas en inglés), y la fosfatidil etanolamina (PE) es la más preferida. En una modalidad preferida de la invención, se utiliza la diestearolil fosfatidil etanolamina (DSPE). Los polímeros hidrofílicos adecuados para derivar los lípidos anfifáticos incluyen la polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hldroxietiiceluíosa, polietilenglicol, y poliaspartamida.

En una modalidad preferida, el polímero hidrofílico es polietilenglicol (PEG), de manera preferida, como una cadena de PEG que tiene un peso molecular de entre 500-10,000 Daltons, de manera más preferida, de entre 2,000-10,000 Daltons, y de manera aún más preferida, de entre 1 ,000-5,000 Daltons.

Enlace Liberable Como se describió anteriormente, el polímero hidrofílico está unido al lípido que forma vesículas a través de un enlace liberable, esto es, un enlace que se escinde tras la exposición a un estímulo particular, tal como calor, un cambio en el pH, o un agente químico o biológico administrado exógenamente. En una modalidad preferida, el enlace es uno que responde a un estímulo que es un estímulo endógeno, in vivo, incluyendo, pero sin limitarse a un agente químico o biológico en una célula, sangre, (plasma), o en la proximidad de una superficie celular objetivo. Los enlaces liberables adecuados incluyen, por ejemplo, enlaces de péptido, éster o disulfuro. Los enlaces de éster y péptido pueden escindirse mediante las enzimas esterasa o peptidasa endógenas o exógenas. Los enlaces de disulfuro pueden escindirse mediante la administración de un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT), glutation o ascorbato, o in vivo mediante un agente reductor tal como la cisteína, o enzimas reductoras, las cuales están presentes en el plasma e intracelularmente.

En una modalidad preferida, el enlace liberable es un enlace de disulfuro, aquí se pretende hacer amplia referencia a enlaces que contienen azufre. Los enlaces que contienen azufre pueden sintetizarse para lograr un grado seleccionado de labilidad, como se sabe en la técnica, y se describe, por ejemplo.^ en la Patente de E.U.A. No. 6,043,094. Un grado variable de labilidad permite ajustar a la medida la velocidad de liberación del recubrimiento del polímero hidrofílico de la superficie del liposoma. Generalmente, cuando se necesita una vida de circulación más larga, se utiliza un enlace menos lábil. Un enlace de disulfuro ejemplar es el ditiopropionilo (DTP), como se describe en la técnica (Kirpotin et al., FEBS Letters, 388: 115 (1996)). La síntesis del polietilenglicol (PEG) enlazado a la diestearolfosfatidiletanolamina (DSPE) lipídica por el DTP, se logra mediante la reacción del éster de succinimidilo del ditiobis(propionato de succinimidilo) con un exceso de mPEG-NH2, para formar el ditiopropionato de N-succinimidil-[2-(metoxipoli(oxietilen)- -am¡nocarbonil)et¡lo, mPEG-DTP-OSu. Este se hace reaccionar con DSPE para formar el conjugado deseado, mPEG-DTP-DSPE (Id.). Otro enlace liberable preferido es el enlace de ditiobencilo (DTB) (Zallpsky eí al., Bioconjugate Chemistry, 10 (5): 703 (1999); WO 00/64483 y WO 00/64484), como se ha descrito en las solicitudes de EUA copendientes, números de serie 09/556,056 y 09/556,610, ambas de las cuales se incorporan aquí como referencia. El enlace está representado por la estructura general: en donde R1 es un polímero hidrofílico que comprende un enlace para la unión a la porción de ditiobencilo; R2 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo y arilo; R3 se selecciona del grupo que consiste de 0(C=0)R4, S(C=0)R4, y 0(C=S)R4; R4 comprende un lípido que contiene una amina, tal como los lípidos que forman vesículas descritos anteriormente; y R5 se selecciona del grupo que consiste de H, alquilo y arilo; y en donde la orientación de CH2-R3 se selecciona de la posición orto y la posición para. El esquema A muestra una modalidad de la invención, en donde el ditiobencilo (DTB, por sus siglas en inglés), se enlaza a la porción de metoxi-polietilenglicol (mPEG, por sus siglas en inglés), y el ligando que contiene la amina; es decir, muestra la estructura de un compuesto ejemplar de acuerdo con la invención, en donde R1 es el polímero hidrofílico de metoxi-polietilenglicol, mPEG = CH30(CH2CH20)n, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300, lo cual corresponde a pesos moleculares de aproximadamente 440 Daltons a aproximadamente 100,000 Daltons. El peso molecular del polímero depende en algún grado de la selección de R3. En las modalidades en donde R3 es un lípido que contiene una amina para utilizarse en un liposoma, un intervalo preferido del peso molecular del PEG es de aproximadamente 750 a aproximadamente 10,000 Daltons, de manera más preferida de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 Daltons. El mPEG es esta modalidad, incluye una porción enlazante de uretano. Se apreciará que R1 puede seleccionarse de una variedad de polímeros hidrofílicos, y los polímeros ejemplares se exponen anteriormente. Se apreciará también que el peso molecular del polímero puede depender de la cantidad del conjugado de polímero-DTB-lípido incluido en la composición liposomal, en donde un polímero de peso molecular mayor, con frecuencia se selecciona cuando la cantidad del polímero-DTB-lípido en la composición es pequeña, proporcionando así un número pequeño de cadenas de polímero unidas al liposoma.

Con referencia continua al Esquema A, R2 y R5 en este compuesto ejemplar, son hidrógeno (H), sin embargo, cualquiera o ambas de R2 y R5 también puede ser un grupo alquilo o arito de cadena lineal o ramificada. En una modalidad preferida, R5 es H y R2 es un alquilo, y varios ejemplos se dan posteriormente. En el compuesto mostrado en el Esquema A, R3 toma la forma de general de 0(C=0)-(NH2-ligando), en donde NH2- ligando puede ser cualquier lípido que contenga una amina. R3 también puede estar en la forma de 0(C=S)-(NH2-ligando) o S(C=0)-(NH2-ligando). El Esquema de Reacción B y muestra el mecanismo de la escisión tiolítica del compuesto mPEGDTB-(NH2-lípido) del Esquema A. La porción de orto o para-carbamato de ditiobencilo es escindible bajo condiciones ligeramente tiolíticas, tales como en la presencia de cisteína u otros agentes reductores naturales. Tras la escisión, el lípido que contiene la amina es regenerado en su forma natural, no modificada. Los estudios que apoyan esta invención, descritos posteriormente, muestran que las condiciones fisiológicas naturales in vivo, son suficientes para iniciar y lograr la escisión del enlace de DTB. Se apreciará que también puede administrarse un agente reductor para inducir artificialmente las condiciones tiolíticas suficientes para la escisión y descomposición del compuesto.

Los lípidos adecuados para utilizarse en el conjugado de polímero-DTB-lípido son, de manera preferida, moléculas insolubles en agua, que tienen al menos una cadena de acilo que contiene al menos aproximadamente ocho átomos de carbono, de manera más preferida, una cadena de acilo que contiene entre aproximadamente 8-24 átomos de carbono. Un lípido preferido es un lípido que tiene un grupo principal polar que contiene una amina y una cadena de acilo. Los lípidos ejemplares son fosfolípidos que tienen una sola cadena de acilo, tales como la estearoilamina, o dos cadenas de acilos. Los fosfolípidos preferidos con un grupo principal que contiene una amina incluyen la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina. La cola del lípido puede tener entre aproximadamente 12 a aproximadamente 24 átomos de carbono, y puede estar completamente saturada o insaturada. Un lípido preferido es la diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), sin embargo, aquéllos con experiencia en la técnica apreciarán que una amplia variedad de lípidos caen dentro de esta descripción. También se apreciará que el lípido puede incluir naturalmente un grupo amina, o puede derivarse para incluir un grupo amina. Otras porciones de lípidos que no tienen una cola de acilo, tal como la colesterolamina, también son adecuados. La síntesis de un compuesto de polímero-DTB-lípido se ha descrito en otro lugar ((Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, 10 (5): 703 (1999); WO 00/64483 y WO 00/64484), y una ruta sintética ejemplar se describe esquemáticamente en el Esquema de Reacción C, en donde aparece la síntesis del mPEG-DTB-amina-lípido, en donde la amina-lípido es el lípido de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE, por sus siglas en inglés). Los derivados de mPEG (P de 2000 y 5000 Daltons), que tienen un grupo final de metoxicarbonilditioalquilo, se prepararon haciendo reaccionar la 2-(metoxicarbonilditio)etanamina con mPEG-cloroformiato, el cual se prepara fácilmente por fosgenación de una solución de mPEG-OH seca (Zalipsky, S., et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 15: 00-114 (1992)). El compuesto anterior se obtuvo a través de la reacción del clorhidrato de 2-aminoetantiol con una cantidad equivalente de cloruro de metoxicarbonilsulfenilo, de acuerdo con los procedimientos publicados (Brois, S. J., et al., J. Amer. Chem. Soc. 92: 7629-7631 (1970); Koneko, T., et al., Bioconjugate Chem. 2: 133-141 (1991 )). Ambos isómeros para y orto del alcohol mercaptobencílico (Grice, R., et al., J. Chem. Soc. 1947-1954 (1963)), se acoplan limpiamente con el acildisulfuro enlazado al PEG resultante, proporcionando un mPEG que porta un grupo de extremo de alcohol ditiobencílico. La introducción del carbonato activo procede como con el mPEG-OH no derivado, para dar el carbonato de para-nitrofenilo. La adición de DSPE en etanolamina forma el producto de mPEG-DTB-DSPE deseado. Ambos compuestos orto- y para-DTB-lípido, se preparan mediante este método, y pueden purificarse a continuación mediante cromatografía en gel de sílice y se caracterizan por RMN y MALDI-TOFMS.

ESQUEMA DE REACCION C R — H, CHg, C2H EkN alcohol para- u orto-mercaptobencílico cloroformiato de para-n¡trofen¡lo/Et3N DSPE/EI3N El Esquema de Reacción D muestra el mecanismo de la escisión tiolítica del conjugado mPEG-DTB-DSPE enlazado a un (DTB) de para- ditiobencil uretano. Tras la escisión, el lípido de fosfatidiletanolamina (DSPE) se regenera en su forma natural, no modificada.

ESQUEMA DE REACCION D Conjugados de Polímero-Lípido Funcionalizados en un Extremo La composición liposomal de la invención incluye además, una porción para la selección del objetivo. En una modalidad preferida, el ligando para la selección del objetivo está unido covalentemente al extremo dista! de una cadena de polímero hidrofílico anclada al liposoma. Por ejemplo, el extremo distal libre del polímero en el lípido-DTB-polímero descrito anteriormente, puede modificarse para incluir un grupo reactivo terminal (funcionalizado en el extremo), adaptado para acoplarse con grupos funcionales dentro de las moléculas de la porción para la selección del objetivo. Tales grupos reactivos terminales del polímero se conocen en la técnica, y se seleccionan de acuerdo con el ligando para la selección del objetivo a unirse. Por ejemplo, cuando la porción para la selección del objetivo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, las cadenas de polímero se funcionalizan para contener grupos reactivos adecuados para acoplarse con, por ejemplo, sulfhidrilos, grupos amino y aldehidos o cetonas (derivados típicamente de la oxidación ligera de porciones de carbohidrato de un anticuerpo), presentes en el anticuerpo. Los ejemplos de tales grupos reactivos termínales de PEG, incluyen la maleimida (para la reacción con grupos sulfhidrilo), N-hidroxisuccinimida (NHS, por sus siglas en inglés) o éster de carbonato de NHS (para la reacción con aminas primarias), hidracida o hidracina (para la reacción con aldehidos o cetonas), yodoacetilo (reactivo de manera preferencial con grupos sulfhidrilo) y ditiopiridina (reactiva con tiol). Otros grupos de extremo reactivos adecuados, incluyen las maleimidas y las hidracinas. Las maleimidas son reactivos que modifican las proteínas utilizados ampliamente y son especialmente útiles cuando la maleimida es uno de los dos grupos funcionales en un reactivo reticulante heterobifuncional. La reacción de las maleimidas con los grupos sulfhidrilo involucra la adición de Michael del grupo mercaptano al doble enlace activado. La reacción con los grupos amino ocurre por el mismo mecanismo, pero a una velocidad mucho más lenta. Puesto que el mercaptano es la especie más reactiva, particularmente a un pH neutro, el grupo maleimida puede utilizarse para seleccionar los grupos sulfhidrilo en la porción para la selección del objetivo, y usualmente se logra una buena selectividad.

Los grupos hidracida o hidracina son reactivos hacia los grupos aldehido. Las hidracidas también pueden adiarse mediante ésteres activos o por grupos carboxilo activados por carbodiimida. Los grupos de acil azida reactivos como especies acilantes, pueden obtenerse fácilmente a partir de las hidracidas y permiten la unión de las moléculas que contienen amino. Los métodos para preparar los conjugados de polímero-lípido funcionalizados en el extremo, se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,620,689, coposeída, describe los métodos para preparar y utilizar grupos de extremo de maleimida, hidracida, y 2-piridilditio propionamida, para acoplar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a las cadenas de polímero; la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. Se apreciará que el ligando para la selección del objetivo también puede incluirse en los liposomas por medio de un conjugado de lípido-polímero sin enlace liberable que una al lípido y al polímero. También se apreciará que cualesquier lípidos adecuados para formar un recubrimiento del polímero hidrofílico del liposoma discutido anteriormente, pueden utilizarse para formar el conjugado de polímero-lípido modificado, y que cualesquiera de los polímeros hidrofílicos descritos anteriormente son adecuados. De manera preferida, al unir una porción para la selección del objetivo a un lípido funcionalizado con PEG, la porción para la selección del objetivo no sufre ninguna pérdida de actividad.

La porción para la selección del objetivo puede unirse a la superficie del liposoma, incluyendo el conjugado de polímero-lípido funcionalizado en el extremo en el liposoma, y a continuación después de la formación del liposoma, hacer reaccionar el ligado para la selección del objetivo deseado con los extremos del polímero reactivo en el liposoma preformado. De manera alterna, el ligando-polímero-lípido puede incluirse en la composición de lípido al momento de la formación liposomal. También es posible incorporar el conjugado de ligando-polímero-lípido en liposomas preformados mediante inserción, en donde el conjugado de ligando-polímero-lípido se incuba con los liposomas preformados bajo condiciones adecuadas para permitir que el conjugado se incorpore en la bicapa de lípido liposomal. Se han descrito en la técnica, las técnicas de inserción, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,056,973.

Porción para la Selección del Objetivo Se contempla para uso una amplia variedad de porciones para la selección del objetivo, y las porciones ejemplares incluyen aquéllas expuestas, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No 5,891 ,468, y las porciones de esta patente que describen los ligandos se incorporan aquí como referencia. En general, la porción para la selección del objetivo es un ligando efectivo para unirse específicamente con un receptor de la superficie celular sobre las células objetivo.

En una modalidad preferida, el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, antígenos para la selección del objetivo, específicos a un receptor en una célula objetivo. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, o fragmentos de anticuerpos, los cuales son específicos para el objetivo. En una modalidad preferida, los anticuerpos unidos a los liposomas son anti-CD19, anti-CD20, o anti-CD22, para la unión específica a un epitopo de la célula B. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se derivan típicamente de hibridomas que muestran una reactividad positiva hacia las células B afectadas. Se contempla que otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para la selección de cualquier otra célula en el cuerpo, pueda utilizarse de manera similar. En los estudios realizados que apoyan la presente invención, se utilizaron anticuerpos anti-CD19 para seleccionar como objetivo un liposoma que contiene un agente incluido para las células B malignas. El anticuerpo reconoce un epitopo único, el antígeno de la superficie CD19 en las células B. Como se describirá posteriormente, los liposomas sensibles al pH con la porción para la selección del objetivo, son efectivos para suministrar intracelularmente el agente incluido.

Agente Terapéutico Incluido en el Liposoma Un agente terapéutico está incluido en los liposomas, para el suministro intracelular a las células objetivo. Una variedad de agentes terapéuticos puede incluirse en las vesículas de lípido, incluyendo agentes solubles en agua, que pueden encapsularse de manera estable en el compartimiento acuoso de las vesículas, compuestos lipofílicos que se dividen de manera estable en la fase líquida de las vesículas, o agentes que pueden unirse de manera estable, por ejemplo, mediante unión electrostática a la superficie externa de la vesícula. Los compuestos solubles en agua ejemplares incluyen compuestos orgánicos pequeños, solubles en agua, péptidos, proteínas, plásmidos de ADN, oligonucleótidos y fragmentos de genes. El fragmento incluido en el liposoma también puede ser un agente para la formación de imágenes para rastrear la progresión de una enfermedad. Los agentes para la formación de imágenes incluyen los quelatos de radionúclidos, tales como tecnecio-99, indio-1 11 y yodo-125. El agente incluido también puede ser una molécula reportera, tal como una enzima o un fluoroforo, para utilizarse en ensayos de diagnóstico in vitro. Tales liposomas que tienen una molécula reportera incluida, pueden suministrarse por fusión a las células objetivo o a los liposomas que contienen al receptor. En una modalidad, el compuesto es útil para el tratamiento de un trastorno del plasma celular, tal como mieloma múltiple, el cual está caracterizado por neoplasmas de las células de linaje del linfocito B. Los agentes terapéuticos preferidos para el tratamiento del mieloma múltiple incluyen al melfalan, ciclofosfamida, prednisona, clorambucil, carmustina, dexametasona, doxorrubicina, cisplatina, paclitaxel, vincristina, lomustina, e ¡nterferón. Las dosis típicas para el tratamiento con quimioterapia estándar para algunos de estos fármacos son como sigue: melfalan, 8 mg/m2 de área de superficie corporal por día; ciclofosfamida, 200 mg/m2 por día; clorambucil, 8 mg/m2 por día; prednisona 25-60 mg/m2 por día, vincristina (1.4 mg/m2) y doxorrubicina (60-75 mg/m2). También está contemplado el suministro intracitoplásmico de los plásmidos, oligonucleótidos antisentido y ribozimas para el tratamiento de cáncer e infecciones virales. En la presente invención, el agente terapéutico está incluido en el liposoma, mediante métodos discutidos posteriormente, para la administración parenteral a un sujeto. La dosis utilizada para la administración del liposoma puede basarse inicialmente en la dosis quimioterapéutica estándar y ajustarse en consecuencia, durante el curso del tratamiento, verificando la progresión de la enfermedad.

III. Preparación de los Liposomas para la Selección del Objetivo, Sensibles al pH Los liposomas que contienen un agente incluido pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos, tales como la hidratación de una película de un lípido, evaporación en fase inversa e infusión del solvente. El compuesto a ser suministrado es incluido en la película de lípido, en el caso de un compuesto lipofílico o es incluido en el medio de hidratación, en el caso de un agente terapéutico soluble en agua. De manera alterna, el agente terapéutico puede cargarse en las vesículas preformadas, por ejemplo, cargando un compuesto ionizable contra un gradiente iónico. Un procedimiento bien conocido para la formación de vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés), es una técnica simple de hidratación de la película de lípido. En este procedimiento, una mezcla de lípidos que forman liposomas se disuelve en un solvente orgánico adecuado, el cual es evaporado a continuación para formar una película delgada de lípido. La película de lípido es hidratada a continuación con un medio acuoso para formar las MLV, típicamente con tamaños de entre aproximadamente 0.1 a 10 mieras. El compuesto terapéutico a suministrarse puede incorporarse en los liposomas agregando el fármaco a los lípidos que forman vesículas, antes de la formación del liposoma, para incluir el fármaco en el liposoma formado. Si el fármaco es hidrofóbico, puede agregarse directamente a la mezcla hidrofóbica, mientras que un fármaco hidrofílico puede agregarse al medio acuoso, el cual cubre la película delgada de los lípidos secos. De manera alterna, el fármaco puede incorporarse en los liposomas preformados mediante mecanismos de transporte activo, tales como carga remota mediante la cual el compuesto se capta en los liposomas en respuesta a un gradiente, tal como un gradiente de sulfato de amonio (Patente de E.U.A. No. 5,192,549; Bolotin eí ai., J. Liposome Res., 4: 455 (1994)), o una concentración de ion potasio o hidrógeno.

Después de la formación, los liposomas son clasificados según el tamaño. Un método de clasificación por tamaño efectivo para las MLV, involucra extruir una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado en el intervalo de 0.03 a 0.2 mieras, típicamente de 0.05, 0.08, 0.1 ó 0.2 mieras. El tamaño de poro de la membrana corresponde aproximadamente a los tamaños más grandes de los liposomas producidos por extrusión a través de esa membrana, particularmente en donde la preparación se extruye dos veces a través de la misma membrana. Los métodos de homogeneización también son útiles para clasificar por tamaños los liposomas a tamaños de 100 nm o menos. En una modalidad preferida de la presente invención, los liposomas se extruyen a través de una serie de filtros de policarbonato con tamaños de poro que varían de 0.2 a 0.08 µ??, dando como resultado liposomas que tienen diámetros en el intervalo aproximado de 120 + 10 nm. Los liposomas de la invención se preparan típicamente con componente lipidíeos presentes en una relación molar de aproximadamente 70-90 por ciento de lípidos que forman vesículas, 1-20 por ciento de un conjugado de polímero-lípido para formar el recubrimiento de la superficie de las cadenas de polímero liberables, y 0.1-5 por ciento del conjugado de polímero-lípido funcionalizado en el extremo, para el acoplamiento de las porciones para la selección del objetivo. Se apreciará que el conjugado de polímero-lípido con el enlace liberable, puede funcionalizarse en el extremo para acoplar un ligando para la selección del objetivo, o los liposomas pueden incluir dos diferentes especies de polímero-lípido - un conjugado de polímero-lípido con un enlace liberable y "otro conjugado de polímero-lípido sin enlace liberable, pero con una porción para la selección del objetivo unida. En los estudios realizados para apoyar la invención, se prepararon liposomas sensibles al pH y no sensibles al pH, como se describe en el Ejemplo 1. Los liposomas sensibles al pH, estabilizados esténicamente, para la selección del objetivo o sin la selección del objetivo, y que tienen un recubrimiento liberable o no liberable, se prepararon de una mezcla de DOPE o DOPE/CHEM (relación molar de 6:4), y que incluye mPEG-DSPE (no liberable) o mPEG-S-S-DSPE (recubrimiento liberable) y, en algunos casos, un polietielenglicol terminado en maleimida acoplado a la DSPE, Mal-PEG-DSPE, capaz de unirse de un ligando para la selección del objetivo. Las relaciones molares del lípido de las diferentes formulaciones se indican en las leyendas de las Figuras y en la descripción de cada uno de los experimentos. Se prepararon liposomas no sensibles al pH a partir de fosfatidilcolina de soya hidrogenada (HSPC), colesterol (CHOL), mPEG-DSPE y maleimida-PEG-DSPE (con objetivo seleccionado) o no (sin objetivo seleccionado), que tienen las relaciones molares de 2:1 :0.08:0.02 de HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/maleimida-PEG-DSPE o 2:1 :0.08 de HSPC/CHOL/mPEG-DSPE, respectivamente. Los liposomas se formaron por la técnica de hidratación disolviendo los componentes lipidíeos en cloroformo. Después de mezclar los componentes, se removió el cloroformo y las películas de lípido secas se hidrataron con un amortiguador apropiado y se extruyeron posteriormente a través de una serie de filtros de policarbonato con tamaños de poro que varían de 0.2 a 0.08 µ??. El fármaco terapéutico doxorrubicina (DXR), se encapsuló en los liposomas preformados mediante carga remota, siguiendo un método de gradiente de sulfato de amonio, como se describe en el Ejemplo 1. En algunos estudios, los liposomas sensibles al pH también se cargaron con 8-hidroxipirentrisulfonato trisódico p-xilen-bis-piridimio (HPTS-DPX), un pigmento fluorescente, o se radiomarcaron con tiraminilinulina ([125I]TI), para evaluar la estabilidad de la bicapa del liposoma. La encapsulación de HPTS-DPX o [125I]TI se logró hidratando la película delgada de lípido con una solución (pH 9.0) del compuesto deseado, como se describe en el Ejemplo 1. En algunos estudios, descritos posteriormente, los liposomas seleccionados que tienen un anticuerpo anti-CD19 acoplado al término de maleimida de Mal-PEG-DSPE, se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.

IV. Estabilidad In vitro de la Composición Liposomal Los liposomas sensibles al pH descritos aquí, se estabilizan mediante un recubrimiento polimérico liberable, permitiendo así que los liposomas retengan un compuesto encapsulado incluso a pH ácidos. La sensibilidad al pH de los liposomas, y por lo tanto la desestabilización a pH ácidos, se restablece escindiendo todo o una porción del recubrimiento del polímero para causar la desestabilización de los liposomas y la liberación concomitante del contenido liposomal. Esta característica de la composición liposomal se demostró por experimentos de fuga in vitro, descritos en los Ejemplos 3-5. La estabilidad de los liposomas sensibles al pH se comparó con aquélla de los liposomas no sensibles al pH en amortiguadores a pH 7.4 o pH 5.5, con o sin ditiotreitol (DTT), en extracto libre de células (CFE), en plasma humano, y en un medio de cultivo celular que contiene suero de ternero fetal al 10% (FBS). La liberación o fuga del soluto incluido, bromuro de 8-hidroxipirentrisulfonato trisódico-p-xilen-bis-piridinio (HPTS-DPX, un pigmento fluorescente), o doxorrubicina (DXR), de los liposomas, se midió utilizando un ensayo de extinción de la fluorescencia.

Estabilidad de los liposomas sensibles al pH en amortiguadores La fuga de los liposomas de HPTS de DOPE (Figuras 1A-1 B), y de DOPE/CHEMS (Figuras 2A-2B), estabilizados con mPEG-DSPE (Figuras A y 2A) o mPEG-S-S-DSPE (Figuras 1 B y 2B), e incubados en amortiguadores a pH 7.5 y pH 5.5 a 37°C, se evaluó mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Adicionalmente, se evaluó la fuga de HPTS de liposomas que contienen mPEG-S-S-DSPE, incubados en amortiguadores a pH 7.4 y pH 5.5, en la presencia de ditiotreitol (DTT) (100nM) (Figura 2B). El DTT induce la adición tiolítica del enlace de disulfuro y causa la liberación del recubrimiento estabilizante del polímero.

Como se muestra en las Figuras 1A y 1 B, los liposomas sensibles al pH pueden estabilizarse en un estado de bicapa mediante la inclusión de un pequeño porcentaje molar de una molécula que tenga un grupo principal voluminoso. Esto es, un derivado de lípido con PEG, puede estabilizar a la DOPE o DOPE/CHEMS en el estado de bicapa en el intervalo de pH de 5.5-7.4, y la sensibilidad al pH del liposoma se restablece cuando el recubrimiento se libera. Los liposomas formados a partir de DOPE liberan únicamente su contenido cuando se incuban en un amortiguador a pH 7.4 ( ), o en un amortiguador a pH 5.5 ( ) (Figura 1A). La incorporación de 5% en mol de mPEG-DSPE (Figura 1A) o mPEG-S-S-DSPE (Figura 1 B), en la formulación de DOPE, da como resultado la formación de liposomas que no se fugan cuando se incuban en un amortiguador a pH 7.4 ( , 5% en mol de mPEG-DSPE (Figura 1A), y , 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE (Figura 1 B)) o en un amortiguador a pH 5.5 ( , 5% en mol de mPEG-DSPE (Figura 1A), y , 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE (Figura 1 B) durante 24 horas. El tratamiento de los liposomas con ditiotreitol (DTT) induce la escisión tiolítica del mPEG-S-S-DSPE del ancla de la membrana del lípido (DSPE). Los liposomas de DOPE que contienen 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE, tienen poca liberación del contenido en 24 horas en la presencia de DTT a un pH de 7.4 ( , Figura 1 B); sin embargo, a pH 5.5, el tratamiento con DTT conduce a una liberación gradual de HPTS de aproximadamente 50% en aproximadamente 10 h (V, Figura 1 B). A pH 5.5, una formulación de DOPE que contiene 3% en mol de mPEG-S-S-DSPE, tiene una liberación mucho más rápida del contenido (100% de liberación en 2 h, datos no mostrados). Como se ilustra en las Figuras 2A y 2B, los liposomas de DOPE también puede estabilizarse en el estado de bicapa mediante porciones voluminosas y/o hidrofílicas que rechacen las cargas. Las formulaciones de DOPE/CHEMS sin mPEG-DSPE, tienen poca fuga a pH 7.4 ( , Figura 2A), pero liberaron rápidamente el pigmento encapsulado a pH 5.5 ( , Figura 2A). A pH 5.5 ó 7.4, ocurrió menos del 10% de la fuga en 24 horas cuando estos liposomas se estabilizaron con 5% en mol de mPEG-DSPE (Figura 2A: , a pH 5.5 y , a pH 7.4), o 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE (Figura 2B:, t a pH 5.5 y , a pH 7.4). En la presencia de DTT, los liposomas de DOPE/CHEMS que contienen 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE, tuvieron una vida media de liberación de aproximadamente 8 horas a un pH de 5.5 (V, Figura 2B), mientras que ocurrió poca liberación a pH 7.4 ( , Figura 2B). El tratamiento con DTT de los liposomas de DOPE/CHEMS estabilizados con 3% en mol de mPEG-S-S-DSPE, resultó en velocidades de fuga intermedias (datos no mostrados). Como se observa en las Figuras 1 B y 2B, los liposomas sensibles al pH que contienen mPEG-S-S-DSPE ( , en ambas Figuras 1B y 2B), tiene una velocidad incrementada de liberación del contenido a pH 5.5, aunque la liberación del contenido es menos rápida que aquélla observada para liposomas similares que carecen de PEG ( , Figuras 1A y 2A). Esta liberación menos rápida puede deberse en parte, a una escisión incompleta del mPEG-S-S-DSPE, una característica que puede utilizarse ventajosamente para variar y ajustar a la medida la velocidad de liberación de un agente incluido. Por ejemplo, la selección de un enlace liberable que falle en sufrir una liberación completa, puede utilizarse para disminuir la velocidad de liberación del contenido, mientras que la selección de un enlace que se escinda fácilmente en respuesta a estímulos seleccionados, puede utilizarse para lograr una liberación total, rápida, del agente incluido.

Estabilidad de los liposomas sensibles al pH en extracto libre de células (CFE) El extracto libre de células (CFE), contiene enzimas citoplásmicas y liposomales capaces de imitar la acción del ditiotreitol (DTT) en la escisión del mPEG-S-S-DSPE. La fuga del pigmento 8-hidroxipirentrisulfonato trisódico (HPTS) hidrofílico, impermeable a la membrana, de las formulaciones expuestas a CFE, es indicativa, por lo tanto, del proceso de desestabilización en un medio ¡ntracelular de los liposomas sensibles al pH estabilizados con mPEG-DSPE o mPEG-S-S-DSPE. Las Figuras 3A-3B muestran la fuga del pigmento HPTS encapsulado como una función del tiempo de los liposomas de DOPE o DOPE/CHEMS estabilizados con diferentes proporciones de mPEG-S-S-DSPE en una mezcla de lípidos, incubada en extracto libre de células ajustado a pH 5.5 (aproximadamente el pH lisosomal de entre 5 y 6.5) a 37°C. El estudio se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4.

La fuga se determinó como el incremento en el porcentaje en la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de la muestra de preincubación tratada con Tritón X-100 (100% de liberación); los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado + la S.D. La Figura 3A muestra el porcentaje de liberación del pigmento HPTS como una función del tiempo para los liposomas que consisten de DOPE ( ), de DOPE estabilizado con 3% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ) y con 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ). Los liposomas hechos de DOPE solo o DOPE estabilizado con 3% en mol de mPEG-S-S-DSPE, sufrieron una rápida liberación de su contenido, con vidas medias de 1.7 horas. La velocidad de liberación en CFE de la formulación de DOPE con 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ), fue más lenta, con 40% del pigmento encapsulado liberado en 24 horas. La Figura 3B muestra el porcentaje de liberación del HPTS incluido en liposomas hechos de DOPE/CHEMS ( ), DOPE/CHEMS/1.8% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ); y DOPE/CHEMS/3% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ). Las tres formulaciones tuvieron una rápida liberación de su contenido en el CFE a pH 5.5, con una liberación casi completa a las 8 horas. Las formulaciones de DOPE/CHEMS y DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE incubadas en CFE, ajustado a un pH de 7.4, liberaron el HPTS a velocidades mucho más lentas (datos no mostrados).

Estabilidad del Liposoma Sensible al pH en Plasma Humano En otro estudio, detallado en el Ejemplo 5, las velocidades de fuga del pigmento hidrofílico de varias formulaciones liposomales se evaluaron en plasma humano al 90% (pH 7.4) a 37°C, y en un medio de cultivo celular que contiene FBS al 10% a 37°C. El HPTS se cargó pasivamente en los liposomas como un complejo soluble en agua (pero con extinción de la fluorescencia), HPTS-DPX. Cuando el HPTS-DPX se fuga de los liposomas, se disocia en HPTS y DPX libres, incrementando la fluorescencia del HPTS cuando se excita a 413 nm. Se encontró que menos del 20% del HPTS encapsulado se fugó de formulaciones de DOPE/mPEG-DSPE, DOPE/CHE S/mPEG-DSPE, DOPE/mPEG-S-S-DSPE o DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE, en 24 horas, en plasma humano (no mostrado). La doxorrubicina (DXR), es normalmente cargada de manera activa en los liposomas a un pH de aproximadamente 5.5, utilizando un gradiente de sulfato de amonio para formar un precipitado ((DXR-NH3) 2SO4) dentro de los liposomas (Bolotin et al., J. Liposome Res., 4: 455 (1994)). Esta formulación de doxorrubicina liposomal es muy estable con una velocidad lenta de liberación de fármaco. Sin embargo, al pH mayor requerido para montar los lípidos de DOPE o DOPE/CHEMS en los liposomas, no se sabe hasta ahora, si la DXR forma un precipitado dentro de los liposomas durante la carga activa, y cual sería la velocidad de liberación de la DXR de los liposomas sensibles al pH. Como se observa en las Figuras 4A-4B, la fuga de DXR en el plasma humano se examinó para los liposomas sensibles al pH con el objetivo seleccionado con anti-CD19, que comprende DOPE/4% en mol de mPEG-DSPE, ( ); DOPE/CHEMS/2% en mol de mPEG-DSPE ( ), DOPE/4% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ) y DOPE/CHEMS/2% en mol de mPEG-S-S-DSPE ( ). La DXR se liberó rápidamente de todas las formulaciones, con excepción de DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE ( , Figura 4A), la cual tuvo una velocidad de liberación algo más lenta, pero todavía rápida. No hubo una diferencia significativa en la velocidad de liberación de la DXR entre las formulaciones con el objetivo seleccionado con anti-CD19 y formulaciones sin el objetivo seleccionado similares (que contienen 5% en mol de mPEG) en la presencia de plasma humano (datos no mostrados). También se evaluó la estabilidad de varias composiciones liposomales sensibles al pH en medios de cultivo celular que contienen FBS al 10%. Todos los liposomas probados incluyen un ligando anti-CD19 para la selección del objetivo y contienen DXR incluida en los compartimientos interiores. Las composiciones de lípido liposomales comprenden DOPE/4% en mol de mPEG-DSPE, DOPE/CHEMS/2% en mol de mPEG-DSPE, DOPE/4% en mol de mPEG-S-S-DSPE y DOPE/CHEMS/2% en mol de mPEG-S-S-DSPE. Todas las composiciones liposomales fueron estables en que hubo menos de un 10% de fuga de DXR en 24 horas de incubación a 37°C (datos no mostrados).

V. Eficiencia del Suministro del Fármaco de la Composición Liposomal De acuerdo con el método de la invención, los liposomas descritos anteriormente son capaces de liberar su contenido rápidamente, en respuesta a condiciones de pH menores en, o justo fuera de la célula objetivo, para lograr una concentración intracelular incrementada del fármaco, cuando se compara con liposomas no sensibles al pH, con el objetivo seleccionado, o con liposomas no sensibles al pH, sin el objetivo seleccionado. Esta concentración intracelular incrementada se demostró en los estudios realizados' para apoyar la invención, descritos en la Parte A siguiente. En estos estudios, se determinó la velocidad de acumulación de la doxorrubicina en los núcleos celulares, puesto que la velocidad de liberación de la doxorrubicina encapsulada en el liposoma del aparato lisosomal al núcleo de la célula, seguido por la asimilación de los liposomas seleccionados, es un factor determinante para la citotoxicidad de la doxorrubicina encapsulada en el liposoma. Los resultados del ensayo de acumulación nuclear de doxorrubicina se discuten en la Parte B. La Parte C describe los estudios de la eliminación en sangre de los liposomas en un modelo murino, y la Parte D ¡lustra, con estudios in vivo, el efecto terapéutico mejorado que se logra mediante el método de tratamiento de la invención.

Citotoxicidad ¡n vitro de los liposomas con el objetivo seleccionado, estabilizados, sensibles al pH La citotoxicidad in vitro de la DXR libre y de varias formulaciones liposomales se evaluó utilizando células Namalwa con un ensayo de proliferación in vitro, como se describe en el Ejemplo 6. Las formulaciones liposomales evaluadas se listan en el Cuadro 1. Además de los liposomas sensibles al pH, con el objetivo seleccionado, también se probaron liposomas estabilizados estéricamente, no sensibles al pH, (DXR-SL) y doxorrubicina en forma libre. Cada una de las formulaciones de prueba se incubó con células Namalwa bajo condiciones controladas durante 48 horas. Al final del tiempo de incubación, la citotoxicidad se expresó como la concentración inhibidora, esto es, la concentración' requerida para un 50% de inhibición del crecimiento celular (CI50). Los resultados se muestran en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Citotoxicidad de la doxorrubicina libre (DXR) y las formulaciones liposomales de DXR (con o sin anti-CD19) a las células Namalwa CD19+ Formulación de los liposomas cargados con DXR Cl50 (µ? DXR)1 DOPE/mPEG-DSPE (1 :0.05) 7.0 ± 2.2 DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE [anti-CD19] 0.2 ± 0.1 (1 :0.04:0.01 ) DOPE/mPEG-S-S-DSPE (1 :0.03) 8.9 ± 4.7 DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mai-PEG-DSPE [anti-CD19] 1.5 ± 0.7 (1 :0.02:0.01 ) DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE (6:4:0.3) 4.2 ± 1 .1 DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE [anti-CD19] 0.4 ± 0.1 (6:4:0.24:0.06) DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE (6:4:0.18) 6.0 ± 0.8 DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE [anti- 3.3 + 1.0 CD19] (6:4:0.12:0.06) HSPC/CHOL/mPEG-DSPE ("DXR-SL") >200 HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE [anti-CD19] 35.4 ± 12.7 (2:1 :0.08:0.02) ("DXR-SIL") DXR Libre 0.8 ± 0.7 Las citotoxicidades se determinaron por el ensayo MTT, y se expresaron como la concentración media del fármaco a la cual el crecimiento- celular se inhibe en un 50% (Cl50 ± la S. D).

Como se muestra en el Cuadro 1 , todas las formulaciones de DOPE o DOPE/CHEMS, ya sea con el objetivo seleccionado o sin el objetivo seleccionado, tuvieron una CI50 significativamente menor que las formulaciones de DXR-SL (HSPC/CHOL/mPEG-DSPE) o DXR-SIL[anti-CD19] (HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE[anti-CD19]) (P < 0.001 ). Las CI50 significativamente menores se deben probablemente a la rápida velocidad de liberación de la doxorrubicina de las formulaciones de DOPE o DOPE/CHE S, en comparación con la liberación de la doxorrubicina de la DXR-SL o DXR-SIL[anti-CD19], la cual tiene una velocidad de liberación considerablemente más lenta del fármaco (Lopes de Menezes eí al., Cáncer Res., 58: 3320 (1998)). Las formulaciones de DOPE y DOPE/CHEMS con el objetivo seleccionado, tienen CI5o que son comparables en la mayoría de los casos, con aquéllas de la doxorrubicina libre (Cuadro 1 ). Las Cl50 de las formulaciones con el objetivo seleccionado, cargadas con doxorrubicina de DOPE o DOPE/CHEMS (estabilizadas con mPEG-DSPE o mPEG-S-S-DSPE), fueron significativamente menores que las Cl50 de las formulaciones sin el objetivo seleccionado (P < 0.05 a P < 0.001 ). De manera notable, hubo una tendencia de las formulaciones que contienen mPEG-DSPE, para ser ligeramente más citotóxicas que aquéllas que contienen mPEG-SS-DSPE, ya sea con o sin el objetivo seleccionado. Las formulaciones con el objetivo seleccionado sin doxorrubicina encapsulada, no fueron tóxicas a concentraciones por debajo de DOPE 0.06 µ?, lo cual correspondería a una concentración de doxorrubicina de 34.5 µ?, si las formulaciones contienen doxorrubicina (no mostrado). Esta claro de los datos en el Cuadro 1 , que los liposomas sensibles al pH, con el objetivo seleccionado o sin el objetivo seleccionado, tienen una Cl50 significativamente menor que los liposomas no sensibles al pH (por ejemplo, los liposomas preparados de HSPC/CHOL/mPEG-DSPE). La Cl50 de los liposomas no sensibles al pH, fue de doxorrubicina 20 µ? y doxorrubicina 35 µ? para las formulaciones sin el objetivo seleccionado y con el objetivo seleccionado, respectivamente. El uso de lípidos sensibles al pH de DOPE o DOPE/CHEMS más que HPSC/CHOL, resultó en una disminución de entre 22-48 veces la CI50. El incremento sustancial en la citotoxicidad fue inesperado, y de acuerdo con la invención, contempla un método para incrementar la citotoxicidad de un fármaco incluido en un liposoma al menos aproximadamente 10 veces, de manera preferida aproximadamente 20 veces, y de manera aún más preferida aproximadamente 40 veces, incluyendo el fármaco en un liposoma sensible al pH. También se observa de los datos en el Cuadro 1 , la citotoxicidad incrementada lograda incluyendo un ligando para la selección del objetivo a los liposomas sensibles al pH. La invención contempla así, incrementar la citotoxicidad de un fármaco incluido en un liposoma sensible al pH, incluyendo un ligando para la selección del objetivo en el liposoma. El ligando para la selección del objetivo es efectivo para lograr un incremento en la citotoxicidad de al menos 2 veces, de manera preferida de 4 veces, de manera más preferida de 6 veces, y de manera aún más preferida de 10 veces, como se mide por una disminución en la Cl50 con relación a los liposomas sensibles al pH que carecen del ligando para la selección de un objetivo.

Ensayo de acumulación nuclear La acumulación nuclear de la doxorrubicina se determinó como se describe en el Ejemplo 7. Brevemente, las células Namalwa, mantenidas bajo condiciones de crecimiento logarítmico, se trataron con formulaciones liposomales con doxorrubicina incluida, a una concentración de doxorrubicina de 8 µ?. A varios tiempos (0, 2, 4, 8, 12 horas), una alícuota de las células tratadas se rompió para recuperar los núcleos. El ADN en los núcleos se digirió enzimáticamente y se midió la fluorescencia de la doxorrubicina. Los resultados se muestran en las Figuras 5A-5C. La Figura 5A compara la acumulación nuclear de la doxorrubicina, medida por la fluorescencia de la doxorrubicina, en células " Namalwa tratadas con doxorrubicina libre ( ); liposomas no sensibles al pH, sin el objetivo seleccionado, encapsulados con doxorrubicina ( ) (HSPC/CHOL/mPEG-DSPE, relación molar de 2:1 :0.1 ); y liposomas no sensibles al pH, con el objetivo seleccionado, encapsulados con doxorrubicina, ( ) (HSPC/CHOL/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE, relación molar de 2:1 :0.08:0.02). Como se observa, se encontró poca doxorrubicina mensurable en los núcleos después de la administración de los liposomas no sensibles al pH. La Figura 5B compara la acumulación nuclear de la doxorrubicina en las células Namalwa tratadas con liposomas con la selección del objetivo con anti-CD19, encapsulados con doxorrubicina, compuestos de DOPE/mPEGDSPE/Mal-PEG-DSPE, relación molar de 1 :0.04:0.01 ( ); liposomas con la selección del objetivo con anti-CD19, encapsulados con doxorrubicina compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.24:0.06 ( ); liposomas encapsulados con doxorrubicina compuestos de DOPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1 :0.05 ( ); liposomas encapsulados con doxorrubicina compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.3 ( ). Como se observa, los liposomas sensibles al pH dan como resultado la acumulación del fármaco en el núcleo (comparado con los liposomas no sensibles al pH mostrados en la Figura 5A), con la adición de un ligando para la selección del objetivo, efectivo para alcanzar un nivel más alto de acumulación. La Figura 5C muestra la acumulación nuclear de la doxorrubicina en células Namalwa tratadas con liposomas con la selección del objetivo con anti-CD19, encapsulados con doxorrubicina, compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.2:0.06 ( ); liposomas con la selección del objetivo con anti-CD19, compuestos de DOPE/mPEG-S-SDSEP/Mal-PEG-DSPE, relación molar de 1 :0.02:0.01 ( ); liposomas sin el objetivo seleccionado, compuestos de DOPE/mPEG-S-S-DSPE, relación molar de 1 :0.03 ( ); liposomas sin el objetivo seleccionado, compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE, relación molar de 6:4:0.18 (V). Como se observa, los liposomas sensibles al pH con cadenas de PEG liberables y un ligando para la selección del objetivo, logran una acumulación del liposoma incluido en el fármaco en el núcleo celular. Los datos presentados en las Figuras 5A-5C, muestran que la doxorrubicina libre se acumuló dentro de los núcleos a la velocidad más rápida (Figura 5A). Las velocidades de liberación de la doxorrubicina para formulaciones de DOPE o DOPE/CHEMS estabilizadas con mPEG-DSPE (Figura 5B), o estabilizadas con mPEG-S-S-DSPE con el objetivo seleccionado (Figura 5C), fueron mucho más rápidas que aquéllas de los liposomas no sensibles al pH, sin el objetivo seleccionado (Figura 5A). El orden de la acumulación nuclear de la doxorrubicina de las formulaciones liposomales fue: fármaco libre > mPEG-S-S-DSPE sensible al pH, con el objetivo seleccionado > mPEG-DSPE sensible al pH, con el objetivo seleccionado > mPEG-S-S-DSPE sensible al pH, sin el objetivo seleccionado > mPEG-DSPE sensible al pH, sin el objetivo seleccionado > no sensible al pH, con el objetivo seleccionado > no sensible al pH. De manera interesante, aunque no más citotóxicas que las formulaciones que contienen mPEG (Cuadro 1 ), las formulaciones que contienen mPEG-S-S-DSPE, parecen resultar en acumulaciones nucleares más rápidas de la doxorrubicina con el curso del tiempo de estos experimentos. Los valores de la citotoxicidad (Cl50) reportados en el Cuadro 1 , paralelos a los datos de acumulación nuclear, indican que la cantidad total de captación del fármaco liposomal, así como la velocidad de liberación del fármaco encapsulado, gobiernan las citotoxicidades de los fármacos liposomales, La captación celular total del fármaco liposomal puede incrementarse vía el mecanismo de la asimilación mediada por el receptor, y la liberación ¡ntracelular del fármaco puede incrementarse a través de mecanismos, tales como un mecanismo de liberación accionado por la sensibilidad al pH, descrito aquí. Así, los datos apoyan un método para incrementar la acumulación de un agente terapéutico en los núcleos celulares, proporcionando los liposomas descritos aquí, que están comprendidos de un lípido sensible al pH, un recubrimiento liberable de una cadena de polímero, y una porción para la selección del objetivo y la administración de los liposomas. La administración es reactiva para lograr (i) la escisión del enlace liberable, para liberar todas o una porción de las cadenas del polímero hidrofílico; (i¡), la unión entre el ligando unido al liposoma y la célula objetivo, en donde la unión puede ocurrir antes o posteriormente a la escisión de las cadenas de polímero; y (iii) asimilación del liposoma en la célula objetivo. La asimilación de los liposomas causará la exposición del lípido sensible al pH a condiciones efectivas para causar la desestabilización del liposoma, liberando intracelularmente el contenido incluido. La administración logra efectivamente una acumulación al menos 2 veces más alta del agente incluido en el liposoma en el núcleo celular, que aquélla lograda por los liposomas que carecen de lípido sensible al pH, el enlace liberable y/o el ligando para la selección del objetivo.

Farmacocinética Sanguínea La farmacocinética de las preparaciones liposomales en ratones se evaluó con un liposoma preparado de acuerdo con la invención, y que contiene [125I]TI radiomarcado. Como se describe en el Ejemplo 8, se inyectaron ratones i. v., vía la vena de la cola con una sola dosis de 0.2 mi de [125I]TI, encapsulado en varias formulaciones liposomales (0.5 µ?t??? PL/ratón). A momentos seleccionados postinyección, se tomaron muestras de sangre y se analizaron para la marca de I. La supresión/eliminación de los liposomas de la sangre se midió por la disminución de la radioactividad. Los resultados se muestran en las Figuras 6A-6D. La Figura 6A muestra la eliminación de los liposomas de DOPE, expresada como el porcentaje de conteos por minuto (cpm, por sus siglas en inglés) ¡n vivo, como una función del tiempo, en horas, para cuatro composiciones liposomales que tienen un contenido variable de mPEG-DSPE. Las composiciones liposomales fueron: únicamente DOPE ( ); DOPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1 .0:0.03 ( ); DOPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1 .0:0.05 ( ); DOPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1 .0:0.1 ( ). El perfil de eliminación de la sangre varía conforme varía la cantidad de mPEG-DSPE en el liposoma, con un contenido de mPEG-DSPE más alto, dando como resultado una disminución de la eliminación del liposoma de la corriente sanguínea. La Figura 6B es una gráfica similar para los liposomas preparados de DOPE/CHEMS, y que tienen un contenido variable de mPEG-DSPE. Las formulaciones liposomales fueron: DOPE/CHEMS, relación molar de 6:4 ( ); DOPE/CHEMS/mPEG/DSPE, relación molar de 6:4:0.18 ( ); DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.3 ( ); DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.6 ( ). El perfil de eliminación en la sangre varía conforme varía la cantidad de mPEG-DSPE en el liposoma, con un contenido de mPEG-DSPE más alto, dando como resultado una disminución de la eliminación del liposoma de la corriente sanguínea. La Figura 6C muestra el perfil de eliminación para los liposomas de DOPE que tienen un contenido variable de mPEG-S-S-DSPE como una función del tiempo. Los liposomas compuestos de DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1.0:0.02:0.01 ( ); DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1.0:0.04:0.01 ( ); DOPE/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, relación molar de 1.0:0.09:0.01 ( ), se administraron a ratones como se describe en el Ejemplo 8. Aquí, hay una menor dependencia de la vida de circulación con la cantidad que se incrementa de mPEG-S-S-DSPE, con las formulaciones que tienen esencialmente el mismo perfil de eliminación. Una observación similar también se observa en la Figura 6D, la cual muestra la eliminación de los liposomas de DOPE/CHEMS que tienen un contenido variable de mPEG-S-S-DSPE como una función del tiempo. Aquí, las formulaciones comprendieron DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG/DSPE, relación molar de 6:4:0.012:0.06 ( ); DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.024:0.06 (?); DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/mPEG-DSPE, relación molar de 6:4:0.054:0.06 ( ). Nuevamente, todas las formulaciones tienen esencialmente el mismo perfil de eliminación, con la cantidad que se incrementa de PEG escindible (mPEG-S-S-DSPE), que no tiene un efecto mensurable en el tiempo de circulación.

En resumen, los tiempos de circulación se incrementaron con la concentración que se incrementa de mPEG-DSPE en formulaciones liposomales de DOPE o DOPE/CHEMS (Figuras 6A-6B). Aproximadamente 5-10% de los Iiposomas inyectados permanecen todavía en la sangre 24 h después de la inyección de los Iiposomas que contienen 10% en mol de mPEG-DSPE. La inyección de Iiposomas de DOPE o DOPE/CHEMS que no se estabilizaron con mPEG-DSPE, da como resultado una supresión rápida de los Iiposomas. La inclusión de 2 a 9% en mol de mPEG-S-S-DSPE, no incrementa los tiempos de circulación para las formulaciones de DOPE (Figura 6C) o DOPE/CHEMS (Figura 6D). Todas las formulaciones mPEG-S-S-DSPE, contenían 1 % en mol de mPEG/DSPE, para imitar el efecto de agregar 1% en mol de un lípido acoplante a las formulaciones en los experimentos para la selección del objetivo. Las cantidades que se incrementan de mPEG-S-S-DSPE en las formulaciones, no incrementan las vidas medias de la circulación de las formulaciones en ningún grado significativo (Figuras 6A-6B). Los Iiposomas que contienen mPEG-S-S-DSPE, tienen una vida de circulación en la sangre acortada, con relación a los Iiposomas que comprenden un mPEG-DSPE no escindióle, debido a la rápida escisión del enlace de disulfuro por los componentes sanguíneos, por ejemplo, cisteína, in vivo. La pérdida del impedimento esférico debido a la pérdida del PEG de los Iiposomas, disminuiría su estabilidad en la sangre e incrementaría la captación de los Iiposomas por el MPS. Los Iiposomas seleccionados con un anticuerpo, se unen a, y se asimilan rápidamente por las células objetivo (Lopes de Menezes et al., J. Liposome Res., 9: 199 (1999); Lopes de Menezes eí al., Cáncer Res., 58: 3320 ( 998)). Así, la invención contempla administrar liposomas con el objetivo seleccionado, sensibles al pH, que contienen cadenas de polímero escindibles para lograr la unión entre el ligando para la selección del objetivo y la célula objetivo, la asimilación de los liposomas, la escisión de las cadenas de polímero, y la ruptura posterior de la bicapa de lípido para la liberación intracelular del contenido liposomal.

Tratamiento terapéutico in vivo En otro estudio realizado para apoyar la invención, se trataron ratones con liposomas con el objetivo seleccionado, sensibles al pH, que tienen cadenas de PEG liberables. El agente terapéutico de doxorrubicina (DXR) está incluido en los liposomas. Como se describe en el Ejemplo 9, los ratones se trataron con una sola dosis de 3 mg de DXR/kg en forma libre o incluida en los liposomas. Las formulaciones liposomales se resumen en el Cuadro 2, y se detallan en el Ejemplo 8.

CUADRO 2 Tiempo de Supervivencia de Ratones que Portan CD19 ± células de linfoma B humano (Namalwa) 1Los Grupos de Tratamiento Nos. (3)-(8) son formulaciones liposomales que contienen doxorrubicina incluida. 2Lapso de Vida Incrementada con relación al tiempo de supervivencia medio de los ratones control. El Cuadro 2 muestra el tiempo de supervivencia medio para cada uno de los grupos de tratamiento y el lapso de vida incrementada, calculado basándose en el tiempo de supervivencia media (MST) de los animales control. Ninguna evidencia de toxicidad del fármaco fue evidente en ninguno de los animales de prueba. Los animales tratados con formulaciones liposomales sin el objetivo seleccionado (Grupos (3)-(5)), mostraron poca eficiencia terapéutica mejorada sobre el grupo control (P > 0.05). Sin embargo, los grupos de prueba tratados con formulaciones liposomales con el objetivo seleccionado (Grupos (6)- (8)), tuvieron lapsos de vida incrementada significativos (> 100% de ILS), que el grupo control o los grupos tratados con formulaciones sin el objetivo seleccionado (P > 0.001 ). El Grupo (7), tratado con DXR-DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE [anti-CD19], tuvo un % de ILS incrementado de manera significativa, comparado con otros grupos de tratamiento con el objetivo seleccionado, Grupo 6 y Grupo 8. Los datos presentados en la Cuadro 2 y en las Figuras, muestran que los liposomas sensibles al pH, con el objetivo seleccionado, que tienen PEG escindible, tienen una eficiencia terapéutica más alta que los liposomas no sensibles al pH o sin selección del objetivo. Esto es, las formulaciones sensibles al pH, con el objetivo seleccionado, estabilizadas con mPEG-S-S-DSPE, suministraron la doxorrubicina encapsulada eficientemente en el citoplasma de las células objetivo y mejoró la citotoxicidad de la doxorrubicina encapsulada in vitro,' con relación a una formulación con el objetivo seleccionado, que carece de propiedades de liberación accionada, es decir, DXR-HSPC/CHOL/mPEG-DSPE [anti-CD19]. Las formulaciones con cadenas de polímero escindibles, sensibles al pH, con un objetivo seleccionado, logran un suministro intracelular incrementado del agente incluido en el liposoma.

VI. EJEMPLOS Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención descrita aquí, y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Materiales La fosfatidilcolina de soya hidrogenada (HSPC), se obtuvo de Lipoid KG (Ludwigshafen, Alemania), la mPEG2000-diestearoilfosfatidil-etanolamina (mPEG2000-DSPE, también abreviada mPEG-DSPE), puede sintetizarse a partir de métodos estándar (Zalipsky, S., et al., en Poly (Ethylene Glvcól) Chemistrv: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris, Ed.) Plenum Press, p. 347-370 (1992)). La doxorrubicina (DXR), se compró de Sigma Chamial Company, St. Louis, Mo. El PEG2000-DSPE (Mal-PEG-DSPE), derivado con maleimida (Kirpotin, D. et al., Biochemistry, 36: 66 (1997)), se sintetizó específicamente por Shearwater Polymers (Huntsville, AL). El colesterol (CHOL) y la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), se compraron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). La N-[2-w-metoxipoli(etilengl¡col)- aminocarbonil-etil-ditiopropionil]-DSPE (mPEG-S-S-DSPE, enlazante de disulfuro), se sintetizó como se describe. El Sephadex G-50 y la Sepharose CL-4B se compraron de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). El Na125l y el éter de colesteril-[1 ,2-[3H](N)]-hexadecilo ([3H]CHE), se compraron de Mandel Scientific (Guelph, ON). El semisuccinato de colesteriio (CHEMS), el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y el iminotiolano, se compraron de Sigma Chemicals (Oakville, ON). El bromuro de p-xilen-bis-piridinio (DPX) y el 8-hidroxipirentrisulfonato trisódico (HPTS), se compraron de Molecular Probes (Eugene, OR). La yodación de IgG se realizó de acuerdo con el método descrito en otro lugar (Lopes de Menezes ef ai., Cáncer Res., 58: 3320 (1998)). La síntesis de la tiraminilinulina (TI) y la preparación del [125I]TI, se han descrito previamente (Sommerman, E. F. eí a/., Biochem. Biophys. Res. Commun., 122: 319 (1984)). El anticuerpo monocional murino (mAb) anti-CD19, se preparó de la línea celular del hibridoma anti-CD19 murino FMC-63, obtenido del Dr. H. Zola (Instituto de Investigación de Salud Infantil, Australia). La línea celular del linfoma B humano, Namalwa (ATCC CRL 1432), se obtuvo de la American Type Culture Collection (MD, EUA). El plasma humano se obtuvo de voluntarios sanos en la Universidad de Alberta, Departamento de Farmacología. Las membranas de policarbonato Nuclepore (tamaño de poro de 0.08, 0.1 y 0.2 µ??), se compraron de Northern Lipids (Vancouver, BC). Todos los otros reactivos químicos fueron grado analítico.

EJEMPLO 1 Preparación de liposomas sensibles al pH y no sensibles al pH Los liposomas sensibles al pH estabilizados estéricamente, se prepararon a partir de una mezcla de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o DOPE/CHEMS (semisuccinato de colesterilo), y mPEG-DSPE o mPEG-S-S-DSPE (preparado como se describe en Kirpotin et al.), y DSPE-PEG-maleimida (Mal-PEG-DSPE; preparada como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,326,353), de acuerdo con las relaciones molares del lípido de las formulaciones deseadas. La mezcla deseada de lípidos se disolvió en cloroformo y se secó como una película delgada mediante rotación, bajo presión reducida, utilizando un evaporador giratorio. La película de lípido seca, se hidrató por la adición de un amortiguador acuoso para formar los liposomas. Los liposomas se clasificaron por tamaño mediante exclusión secuencial a través de una serie de filtros de policarbonato Nucleopore con un tamaño de poro que varia de 0.2 a 0.08 µ?t?, utilizando un Extrusor Lipex (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC). El diámetro medio de los liposomas se determinó por la dispersión de luz dinámica utilizando un clasificador de Tamaños de Partícula Brookhaven BI-90 (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY). Los diámetros de los liposomas extruidos estuvieron en el intervalo de 120 + 10 nm. Para los liposomas cargados con HPTS-DPX o [ 25I]TI, las películas de lípido se hidrataron con una solución de HPTS-DPX (PST 30 mM, DPX 30 mM, pH 9.0, ajustado a 290 mosmol con NaCI) o una solución de [125I]TI (pH 9.0). Después de la extrusión, el pigmento atrapado o [ 25I]TI, se removió mediante cromatografía en columnas Sephadex G-50 o Sepharose CL-4B, respectivamente, eluidas con amortiguador HEPES, pH 7.4 (HEPES 25 mM, NaCI 140 mM).

El agente terapéutico, la doxorrubicina (DXR), se cargó mediante carga remota utilizando un gradiente de sulfato de amonio como se describe en Bolotin et al. (J. Liposome Res., 4: 455 (1994)), con una modificación menor. Brevemente, las películas de lípido se hidrataron en sulfato de amonio 250 mM a pH 8.5 para las formulaciones que contienen DOPE/CHEMS o a pH 9.0 para las formulaciones que contienen DOPE. Se agregaron cantidades minúsculas de NaOH para obtener la hidratacion completa de la película de lípido en algunos casos. Después de la extrusión, el amortiguador extemo se intercambió eluyendo a través de una columna Sephadex G-50 equilibrada con sucrosa al 10%, base Trizma 25 mM a pH 8.5 o pH 9.0, conforme sea apropiado, para lograr la formación de la bicapa. Se agregó DXR a los liposomas preformados a una relación de DXR/lípido de 0.2:1 (peso/peso), y los liposomas se incubaron durante 15 minutos a 22°C. La DXR encapsulada en el liposoma se separó de la DXR libre mediante cromatografía en una columna Sephadex G-50 eluida con amortiguador HEPES desgasificado. La concentración de la DXR incluida en el liposoma se determinó mediante espectrofotometría (? = 490 nm), seguido por extracción con metanol. La concentración del fosfolípido se determinó utilizando el ensayo colorimétrico de Fiske-Subbarow (Bartlett, G. R., J. Biol. Chem, 234: 466 (1959)).

EJEMPLO 2 Acoplamiento del anticuerpo a los líposomas preformados El acoplamiento del mAb anti-CD19 a la maleimida (Mal)-PEG-DSPE en los liposomas, se llevó a cabo de acuerdo con un método descrito previamente (Lopes de Menezes et al., J. Liposome Res., 9: 199 (1999)), utilizando el mAb anti-CD19 marcado con 25l, como un indicador radioactivo. Los anticuerpos se marcaron primero con un reactivo de Traut (2-iminotiolano) a una relación molar de 20:1 (Trau lgG), a una concentración de 10 mg de IgG/ml de amortiguador durante 1 h a 25°C en amortiguador HEPES, pH 8.0 (HEPES 25 mM, NaCI 140 mM). El reactivo de Traut sin reaccionar se removió utilizando una columna G-50. La reacción de acoplamiento se corrió a una relación molar de IgG a fosfolípido de 1 :2000, bajo una atmósfera de argón durante 18 h a 25°C. El Ab no acoplado se removió de los liposomas pasando la mezcla de acoplamiento a través de una columna de Sepharose CL-4B en amortiguador HEPES, pH 7.4. La eficiencia del acoplamiento fue en promedio, del 80%. Todas las densidades del mAb estuvieron de manera rutinaria en el intervalo de 30-60 µg de anti-CD19^mol de fosfolípido para los experimentos in vivo, y de 65-80 µ9 de anti-CD19^mol de PL para los experimentos in vitro.

EJEMPLO 3 Fuga del pigmento fluorescente incluido en el liposoma o la doxorrubicina incluida en el liposoma en amortiguador La fuga de HPTS-DPX incluido de varias formulaciones de Iiposomas de DOPE o DOPE/CHEMS, se evaluó verificando la liberación del soluto incluido utilizando un ensayo de extinción de la fluorescencia. El HPTS se cargó pasivamente en los Iiposomas como el complejo soluble en agua (pero con extinción de la fluorescencia), HPTS-DPX. Cuando el HPTS-DPX se fuga de los Iiposomas; se disocia en HPTS y DPX libres, incrementando la fluorescencia de HPTS cuando se excita a 413 nM. Las formulaciones de DOPE y DOPE/CHEMS probadas fueron como se muestra en ei cuadro A, a continuación: CUADRO A Componentes Lipidíeos Relación Molar DOPE 1 DOPE/mPEG-DSPE 1 :0.05 DOPE/mPEG-S-S-DSPE 1 :0.05 DOPE/CHEMS 6:4 DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE 6:4:0.3 DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE 6:4:03 Los Iiposomas que contienen HPTS-DPX incluidos, se pasaron en una columna Sephadex G-50 inmediatamente antes del uso para remover cualquier pigmento o fármaco residual libre. Cincuenta (50) µ? de Iiposomas que contienen el pigmento incluido (HPTS-DPX), o doxorrubicina se incubaron a una concentración PL final de 0.5 mM a 37°C en 450 µ? de amortiguadores a pH 5.5 o amortiguador a pH 7.4. Los liposomas sensibles al pH que contienen mPEG-S-S-DSPE, también se incubaron con ditiotreitol (DTT) (100 nM) en amortiguadores a pH 5.5 o a pH 7.4. En varios momentos, se determinó el porcentaje de HPTS liberado en una alícuota de la mezcla de incubación, midiendo el incremento en la fluorescencia de la mezcla a una longitud de onda de emisión de 512 nm y a una longitud de onda de excitación de 413 nm (Daleke, K. eí al., Biochim. Biophys. Acta, 1024: 352 (1990)), con relación a aquélla de una muestra de preincubación (cero liberación), utilizando un fluorímetro SLM-Aminco Modelo 8100 (Spectronic Instruments, Rochester, NY); los valores se normalizaron al incremento en la fluorescencia obtenida después de la tisis de una muestra de preincubación con Tritón X-100 al 10% (100% de liberación) (Kirpotin et a/., FEBS Letters, 388: 115 (1996)). La fuga del HPTS encapsulado de los liposomas de DOPE y DOPE/CHEMS estabilizados con mPEG-S-S-DSPE o mPEG-DSPE, en amortiguador a pH 5.5 o pH 7.4, se graficaron como una función del tiempo en las Figuras 1 A-1 B y las Figuras 2A-2B. Los resultados son de un experimento representativo, y son las medias de análisis por triplicado ± la S.D.

EJEMPLO 4 Liberación del pigmento fluorescente incluido en el liposoma en extracto libre de células A. Preparación del Extracto Libre de Células Las células Namalwa se mantuvieron en condiciones de crecimiento logarítmico en RP I 1640 suplementado con FBS al 10% a 37°C, en una atmósfera humidificada que contiene C02 al 5%. Las células (1.0 x 108), se recolectaron mediante centrifugación (1000 rpm durante 10 minutos), y se lavaron con 20 mi de amortiguador TEA (trietanoiamina 10 mM, sucrosa 0.25 M, ácido acético 10 mM, y EDTA 1 mM, pH 7.4). Las células lavadas se resuspendieron en 4 mi amortiguador TEA, y un cóctel inhibidor de proteasa formulado para extractos celulares de mamíferos, fluoruro de (4-(2-amino-etil)-bencensulfonilo, pepstatina A, frans-epoxisuccinil-L-leucilamino (4-guanidino)butano, bestatina, leupeptina y aprotinina; Sigma, MO, EUA), se agregó a 100 µ? por gramo de células. Las células se rompieron a 4°C utilizando 40 golpes firmes con un homogeneizador Dounce ajustado. Las células sin romper se granularon mediante centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos a 4°C. El CFE se removió cuidadosamente del gránulo celular, y a continuación se diluyó a 6 mi con la adición de amortiguador TEA. El CFE se ajustó a pH 5.5, aproximándose al pH lisosomal de entre 5 y 6.5 (Tycko, B. et ai, Cell, 28: 643 (1982); Tycko, B. ef a/., J. Cell Biol., 97: 762 ( 983)).

Los liposomas que contienen HPTS-DPX, se pasaron sobre una columna Sephadex G50 inmediatamente antes del uso, para remover cualquier pigmento libre residual. La liberación del soluto incluido se estudió utilizando un ensayo de extinción de la fluorescencia. Cincuenta (50) mi de liposomas que contienen el pigmento incluido (HPTS-DPX), se incubaron a una concentración final de fosfolípido de 0.5 mM a 37°C, en 450 mi de extracto libre de células. La formulación liposomal consiste de liposomas de DOPE no estabilizado o estabilizados con 3% o 5% de mPEG-S-S-DSPE, y de liposomas de DOPE/CHEMS no estabilizados o estabilizados con 1.8% en mol o 3% en mol de mPEG-S-S-DSPE en la mezcla de lípido. La fuga se determinó como el incremento en el porcentaje de la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de la muestra de preincubación tratada con Tritón X-100 (100% de liberación). El resultado de un experimento representativo, dividido como una función del tiempo, se muestra en las Figuras 3A-3B. Cada punto de datos es la media de análisis por triplicado ± S.D.

EJEMPLO 5 Fuga de la doxorrubicina de los liposomas sensibles al pH incubados en plasma humano La fuga de la doxorrubicina (DXR) en el plasma humano, se examinó para los liposomas con la selección del objetivo con anti-CD19 de DOPE/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE (1 :0.04:0.01 ), DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:0.2:01 ), DOPE/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE (1 :0.04:0.01 ) son DOPE/CHEMS/mPEG-S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:02:0.1 ). Cincuenta (50) mi de liposomas que contienen la DXR incluida, se incubaron a una concentración final de fosfolípido de 0.05 mM a 37°C, en 450 µ? de plasma humano. En varios momentos, se tomaron alícuotas de una mezcla de incubación, y se diluyeron el amortiguador HEPES (pH 7.4). La fluorescencia de la doxorrubicina contenida en los liposomas se extinguió debido a su autoasociación cuando se carga con el método del sulfato de amonio. La fuga de doxorrubicina se determinó mediante la extinción de la fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 480 y 590 nm, respectivamente. La DXR liberada, se determinó como el incremento en el porcentaje de la fluorescencia de la muestra sobre aquélla de una muestra de preincubación tratada con Tritón X-100 al 10% (100% de liberación). Los resultados de un experimento representativo, que se graficaron como una función del tiempo, se muestran en las Figuras 4A-4B. Cada punto de datos es la media de análisis por triplicado + la S.D.

EJEMPLO 6 Citotoxicidad in vitro, de los liposomas con objetivos seleccionados, estabilizados con PEG-DSPE, sensibles al pH Se realizó una comparación de la citotoxicidad in vitro de la doxorrubicina libre y varias formulaciones liposomales (Cuadro 1 ), sobre células Namalwa con un ensayo de proliferación in vitro utilizando un pigmento de tetrazolio ( TT-bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-¡l)-2,5-difeniltetrazolio; Mosmann, J. J. Immunol Methods, 65: 55 (1983)), como se describe en Lopes de Menezes eí al., Cáncer Res., 58: 3320 (1998). Brevemente, 5 x 105 células Namalwa se cultivaron en placas de 9.6 pozos, y se incubaron con DXR libre o varias formulaciones de doxorrubicina encapsulada en el liposoma con o sin el mAb ant¡-CD 9. Los anticuerpos monoclonales se acoplaron al PEG-DSPE terminado el maleimida para formar los liposomas que tienen 65-80 µ9 de mAb/µ?t??? de fosfolípido. Los liposomas se cargaron de manera remota con doxorrubicina a niveles de carga de entre 140-160 µg de doxorrubicina^mol de fosfolípido (0.24-0.28 µ???? de doxorrubicina/µ???? de fosfolípido). Las células se incubaron durante 1 , 24, 48 horas a 37°C en una atmósfera de humedad al 95% y C02 al 5%. A los periodos de tiempo de 1 hora y 24 horas de incubación, las células se lavaron dos veces antes de reemplazar con medio fresco y se incubaron durante 47 horas y 24 horas adicionales, respectivamente. Todas las placas se incubaron durante un total de 48 horas. Al final de periodo de incubación, se agregó el pigmento de tetrazolio, y las placas se leyeron en un Titertek Multiskan Plus (Flow Laboratories, Inc. Mississauga, Ontario, Canadá), a longitudes de onda duales de 570 y 650 nm. Las citotoxicidades de vahas formulaciones liposomales se expresaron como la concentración media efectiva para inhibir el crecimiento celular en un 50% (Ci50, DXR µ?) + la S.D. (n = 3-6), y se listan en el Cuadro 1 .

EJEMPLO 7 Ensayo de acumulación nuclear La acumulación nuclear de la doxorrubicina se determinó de acuerdo con el método de Kirchmeier et al. (J. Liposome Res., JM : 15 (2001 )). Brevemente, 4.5 x 108/500 mi de células Namalwa, mantenidas bajo condiciones de crecimiento logarítmico en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, se trataron con DXR libre o con varias formulaciones de DXR liposomal a una concentración de DXR de 8 µ?. A varios momentos (0, 2, 4, 8, 12 horas), 100 mi de las células se granularon mediante centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos y se lavaron con 20 mi de amortiguador TEA. Las células lavadas se suspendieron en 3 mi amortiguador TEA y se rompieron a 4°C utilizando 40 golpes firmes como un homogeneizador Dounce ajustado. Las células sin romper se centrifugaron y el CFE, el cual contiene los núcleos, se removió cuidadosamente del granulado celular. Para obtener una homogeneización más completa, el gránulo de células sin romper, se suspendió en amortiguador TEA (3 mi) y se rompió una segunda vez, seguido nuevamente por la remoción de las células sin romper. Los sobrenadantes combinados se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos para remover cualesquier células sin romper restantes. El sobrenadante de este paso de centrifugación se centrifugó a 2000 rpm durante 2.5 minutos a 4°C para granular los núcleos. Después de la remoción del sobrenadante, el gránulo se diluyó a 1 mi con amortiguador TEA, se sometió a un vórtice y a sonicación hasta que los núcleos se dispersaron de manera uniforme, como se determina mediante inspección visual. Para cada momento, tres alícuotas de las fracciones nucleares (cada una de 0.2 mi), se colocaron en 1.3 mi de TEA. El ADN se digirió enzimáticamente mediante la adición de 10 µ? de una solución de digitonina (25 mg/ml en PBS estéril, Sigma, St. Louis, MO), una solución de 10 µ? de MgCI2 (57 mg/ml en PBS estéril) y una solución de 50 µ? de DNasa 1 (3 mg/ml en PBS estéril, Sigma). Después de la digestión a 22°C durante 2 horas, la fluorescencia de la doxorrubicina se registró (excitación a 480 nm y emisión a 595 nm). La pureza de la fracción nuclear se verificó determinando los niveles de los marcadores de la enzima para varios organelos celulares (Lopes de Menezes et al., J. Liposome Res., 9: 199 (1999)). Los resultados se muestran en las Figuras 5A-5C.

EJEMPLO 8 Eliminación de la sangre de los liposomas en ratones BALB/c (endógamos) Ratones hembra BALB/c Cr Alt B/ , en el intervalo en peso de 17-22 g, se obtuvieron de la Universidad de Alberta, de los Servicios Animales de Laboratorio de Ciencias de la Salud, y se inyectaron vía la vena de la cola con una dosis de un bolo único de 0.2 mi de liposomas de varias formulaciones que contienen [ 25I]TI encapsulado (0.5 µ???? de PL/ratón). Las formulaciones liposomales consistieron de DOPE únicamente, DOPE con 3% en mol, 5% en mol o 10 mol% de mPEG-DSPE, DOPE/CHEMS únicamente y DOPE/CHEMS con 1.8% en mol, 3% en mol o 6% en mol de mPEG-DSPE; DOPE/1 % en mol de PEG-DSPE con 2% en mol, 4% en mol o 9% en mol de mPEG-S-S-DSPE, y DOPE/CHEMS/mPEG-DSPE (6:4:0.06) con 1 % en mol, 2% en mol o 5% en mol de mPEG-S-S-DSPE. A tiempos seleccionados postinyección, los ratones se anestesiaron con halotano y se sacrificaron mediante dislocación cervical. Se recolectó una muestra de sangre (100 µ?) mediante punción cardiaca. Las muestras de sangre, varios órganos y los cuerpos del animal sacrificado se contaron para la marca de 125l en un contador gamma Beckman 8000. Los datos se analizaron utilizando PKAnalyst (MicroMath Scientific Software).

Los resultados de un experimento representativo se muestran en las Figuras 6A-6D. Los puntos de datos son medias de los análisis por triplicado ± la S.D.

EJEMPLO 9 Administración in vivo Las células Namalwa se introdujeron con una sonda i. p. en ratones CB-17/ICR Tac SCID (Charles River Laboratories, Quebec, Canadá), para desarrollar una cepa más virulenta con recepción del tumor reproducible (Lopes de enezes et a/., Cáncer Res., 58: 3320 (1998)). Las células Namalwa se recolectaron en PBS estéril y se implantaron en ratones SCID. La viabilidad de las células se evaluó mediante exclusión con pigmento utilizando un pigmento de Azul de Tripan antes y después del proceso de implantación. Los ratones SCID (5 ratones/grupo) (Charles River Laboratories), de 6-8 semanas, se implantaron con células Namalwa i. v. (5 x 106) y se trataron i. v. a 24 h después de la implantación con una única dosis de 3 mg de doxorrubicina/kg como formulaciones de doxorrubicina libre, doxorrubicina-SIL[anti-CD19] o DOPE/CHEMS cargados con DXR con el objetivo seleccionado, estabilizadas con mPEG-DSPE o mPEG-S-S-DSPE. Los regímenes de tratamiento fueron como se muestra en el cuadro B, a continuación: CUADRO B Gru o de Formulación1 Tratamiento (1 ) Solución salina (2) Doxorrubicina libre (3) Liposomas compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG- DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:0.24:0.06) (4) Liposomas compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG- S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:0.24:0.06) (5) Liposomas compuestos de HSPC/CHOL/mPEG- DSPE/Mal-PEG-DSPE (2:1 :0.08:0.02) ("DXR-SL") (6) Liposomas compuestos de HSPC/CHOL/mPEG- DSPE/ al-PEG-DSPE (2:1 :0.08:0.02) y 58.4 µ3 de anti-CD19 imol de fosfolípido ("DXR-SIL") (7) Liposomas compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG- DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:0.24:0.06) y 33.3 µg de anti-CD19^mol de fosfolípido (8) Liposomas compuestos de DOPE/CHEMS/mPEG- S-S-DSPE/Mal-PEG-DSPE (6:4:0.24:0.06) y 31.2 µ9 de ant¡-CD19 imol de fosfolípido Todas las formulaciones liposomales contienen doxorrubicina. Todos los grupos de tratamiento recibieron 3 mg de doxorrubicina/kg. Los ratones se verificaron de manera rutinaria para la pérdida de peso, y se sometieron a eutanasia conforme se volvieron moribundos; los tiempos de supervivencia se registraron. No se observó evidencia de la toxicidad del fármaco en ningún grupo experimental. Todos los experimentos con animales se aprobaron por la Política Animal de Ciencias de la Salud y el Comité de Asistencia Social de la Universidad de Alberta (Edmonton, Alberta, Canadá). Se determinaron el tiempo de supervivencia medio (MST) y el porcentaje de lapso de vida incrementada (ILS) sobre ei MST de los ratones control, y se muestran en el Cuadro 2.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a las modalidades particulares, será evidente para aquéllos con experiencia en la técnica, que varios cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse de la invención.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una composición liposomal para el suministro ¡ntracelular de un agente terapéutico, que comprende los liposomas formados de (i) un lípido sensible al pH; (¡i) entre 1-20 por ciento en mol de un lípido derivado con un polímero hidrofílico, el polímero está unido al lípido mediante un enlace efectivo para liberar las cadenas del polímero hidrofílico en respuesta a una condición fisiológica existente o inducida; (iii) un ligando para la selección del objetivo; y (iv) un agente terapéutico incluido; en donde la composición está adaptada para unirse a una célula objetivo y para liberar el agente incluido para lograr un incremento de al menos dos veces en la concentración intracelular del agente, cuando se compara con la concentración ¡ntracelular del agente suministrado mediante liposomas similares, que carecen del enlace liberable y/o del ligando para la selección del objetivo. 2 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el lípido sensible al pH es la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). 3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los liposomas incluyen además un componente estabilizante. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el componente estabilizante es el semisuccinato de colesterilo (CHEMS). 5 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polímero derivado del lípido es la fosfatidiletanolamina derivada con polietilenglicol. 6 - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ligando para la selección del objetivo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. 7 - La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22. 8. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el enlace liberable contiene un enlace de disulfuro. 9. - La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el enlace de disulfuro es un enlace de ditiobencilo. 10. - Una composición para incrementar la citotoxicidad intracelular de un agente incluido en un liposoma, que comprende los liposomas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, los liposomas cuando se administran, son efectivos para lograr (i) la escisión del enlace liberable, liberando por lo tanto, la cadena del polímero hidrofílico; (ii) la unión del ligando a la célula objetivo, en donde la unión ocurre antes de, o posteriormente a la escisión; y (iii) la asimilación del liposoma por la célula objetivo, logrando por lo tanto una citotoxicidad intracelular al menos dos veces más alta del agente, con relación a la concentración intracelular del agente suministrado mediante liposomas similares que carecen del enlace liberable y/o del ligado para la selección del objetivo. 11.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la escisión del enlace liberable se logra mediante los componentes sanguíneos naturales. 12.- Una composición para incrementar la acumulación de un agente terapéutico en los núcleos celulares, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, los liposomas cuando se administran, son efectivos para lograr (i) la escisión del enlace liberable, liberando por lo tanto, la cadena del polímero hidrofílico; (ii) la unión del ligando a una célula objetivo, en donde la unión ocurre antes de o posteriormente a la escisión; y (¡ii) la asimilación del liposoma por la célula objetivo, para lograr una acumulación al menos dos veces más alta del agente en el núcleo de la célula objetivo, cuando se compara con la concentración intracelular del agente suministrado mediante liposomas similares que carecen del enlace liberable y/o del ligando para la selección del objetivo. 13 - La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la escisión del enlace liberable se logra mediante los componentes sanguíneos naturales.