KR101004709B1

KR101004709B1 - 글루코스 산화효소가 고정화된 베시클의 제조방법

Info

Publication number: KR101004709B1
Application number: KR1020070140200A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 조성민
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2011-01-04
Also published as: KR20090072170A

Abstract

본 발명은 글루코스 산화효소(Glucose Oxidase, 이하 GOD)가 고정화된 베시클 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 베시클은 외부 표면에 글루코스 산화효소가 고정화되어 있기 때문에 베시클이 혈액 또는 그 외 글루코스를 함유하는 용액 중에 주입되었을 때, 혈액 또는 용액 중의 글루코스를 산화시켜 글루콘산(gluconic acid)을 생성시키는데, 글루콘산이 생성되면 베시클 주변의 pH는 낮아져 산성이 되고, 이로 말미암아 베시클은 파괴되며, 그 내부에 봉입되어 있는 목적물질은 외부로 방출되는 특징이 발휘된다.

고정화, 글루코스 산화효소, 베시클, 선택적, 식품, 의약,

Description

글루코스 산화효소가 고정화된 베시클의 제조방법{Method for production of vesicle immobilizing glucose oxidase}

본 발명은 양 친매성 분자에 의해 구형으로 형성되고, 내부에 목적물질이 포집될 수 있는 베시클 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글루코스 산화효소(Glucose Oxidase, 이하 GOD)가 외부 표면에 고정화된 베시클 및 그 제조방법에 관한 것이다.

팩킹 파라미터(Packing parameter)가 1에 가까운 양 친매성 분자 (amphiphilic molecule)는 수상에서 이중층 소포체(bilayer vesicles), 즉 베시클을 형성한다.

베시클은 친수성 그룹이 수상을 향하고 소수성 그룹이 마주하는 이중층 막(bilayer membrane)이 형성하는 폐쇄된 구형 소포체이다.

베시클은 내부 수상 코아와 소수성 이중층 막으로 구성되어 있기 때문에 소수성 약물과 친수성 약물을 동시에 모두 봉입(entrapment)할 수 있다. 그리고, 약물을 서서히 방출하는 서방성 거동을 보이며, 베시클의 조성을 조절함으로써 방출 속도를 제어할 수 있고, 특히 인지질로 구성되어 있는 베시클(리포솜; liposome)은 생체 적합성을 나타내기 때문에 인체 내 약물전달 운반체(drug carrier)로 개발하고자 하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다(Kim J-C, Song M-E, Kim M-J, Lee E-J, Park S-K, Rang M-J, Ahn H-J (2002) Preparation and characterization of Triclosan-containing vesicles　. Colloid Surf. B: Biointerfaces,　26:235-241).

이와 같이 베시클은 약물을 비롯한 여러 활성 성분(이하, 통칭해서 '목적물질'이라 함)을 포집하여 인체 내에 전달하기 위한 매개 수단으로 활용되고 있는데, 인체 내에서 적절한 위치 또는 적절한 환경에서 선택적으로 터질 수 있다면 내부에 포집된 목적물질의 효용을 극대화시킬 수 있는 장점이 있다.

이에 본 발명의 목적은 선택적으로 파쇄가 가능한 베시클을 제조하는데 있고, 특히 혈중 혈당 농도에 의해 선택적 파쇄가 가능한 베시클을 제조하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 양 친매성 분자에 의해 구형으로 형성되고, 내부에 목적물질이 포집될 수 있는 베시클에 있어서, 글루코스 산화효소가 베시클의 외부 표면에 고정화된 것을 특징으로 하는 베시클을 제공한다.

또한, 본 발명은 소수화된 글루코스 산화효소, 베시클 내부에 포집되는 목적물질 및 분산제가 녹아 있는 수용액에 양 친매성 분자를 첨가한 후 수화시켜 현탁액을 제조하는 단계(a); 현탁액을 균질화하는 단계(b); 및 균질화 후, 분산제를 제거하는 단계(c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 양 친매성 분자에 의해 구형으로 형성되고, 내부에 목적물질이 포집될 수 있는 베시클에 있어서, 글루코스 산화효소가 베시클의 외부 표면에 고정화된 것을 특징으로 하는 베시클을 제공한다.

본 발명의 베시클 외부 표면에 고정화되어 있는 글루코스 산화효소(GOD)는 베시클이 혈액 중에 주입되었을 때, 혈액 중의 글루코스를 산화시켜 글루콘산 (gluconic acid)을 생성시킨다. 글루콘산의 생성에 의해 베시클 주변의 pH는 낮아져 산성이 되는데, 그 결과 베시클이 파괴되고, 내부에 봉입되어 있는 목적물질은 방출된다(도 1).

따라서, 본 발명의 베시클은 혈액 중에서 글루코스의 농도에 의해 선택적으로 파쇄됨으로 말미암아 목적물질을 유의 적절하게 전달할 수 있는 장점이 발휘되는 것이다.

글루코스 산화효소의 베시클로의 고정화는 공유결합 및 비공유결합을 매개로 하는 다양한 고정화 방법을 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 글루코스 산화효소에 소수성 앵커를 부착하여, 베시클 막의 내부 소수성 부분에 소수성 결합을 통해 고정화하는 것을 사용할 수 있다.

소수성 앵커는 글루코스 산화효소에 결합하여, 글루코스 산화효소에 소수성 특성을 부여할 수 있는 것이라면, 소수성 잔기를 갖는 아미노산을 포함하는 여러 화합물이 특정의 것에 국한되지 않고 사용될 수 있는데, 일 예로, 팔미틱 에시드 히드록시숙신이미드 에스테르(palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester)가 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 베시클을 형성할 수 있는 양 친매성 분자는 분자 내에 친수성 그룹과 소수성 그룹을 모두 갖고 있는 것으로, 용액 중에 현탁되면 이중층의 막(bilayer membrane)을 형성하여 폐쇄된 구형의 베시클을 형성할 수 있는 것이라면 특정 물질에 국한되는 것은 아니나, 친수성 머리의 단면적과 소수성 꼬리의 단면적이 거의 동일한 팩킹 파라미터(Packing parameter)가 1에 가까운 양 친매성 분 자는 구형의 베시클을 형성하기 용이하기 때문에 바람직하다.

한편, 양 친매성 분자인 인지질 중에서 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)는 팩킹 파라미터가 1보다 크기 때문에 즉, 친수성 머리의 단면적이 소수성 꼬리의 단면적보다 작기 때문에 분자 모양이 쐐기 모양(conical shape)이다. 따라서, DOPE는 수상에서 이중층 베시클을 형성하지 못하고 역상 헥사고날 상(inverted hexagonal phase)를 형성한다. 그러나, 적절한 보조분자(complementary molecule)가 존재하면, 보조분자가 DOPE의 친수성 헤드 그룹과 헤드 사이에 생기는 공간을 메우기 때문에, 이중 층 막을 형성할 수 있다. 이중층 막을 형성할 수 있는 보조분자들로는, (디니트로-페닐) 카프로일-포스파티딜-에탄올아민( (dinitro-phenyl) caproyl-phosphatidyl-ethanolamine), N-숙시닐디오레오일-포스파티딜-에탄올아민(N-succinyldioleoyl-phosphatidyl- ethanolamine), 강리오시드(ganglioside), 올레익 에시드(oleic acid), 콜레스테릴 헤미숙시네이트(cholesteryl hemisuccinate), 팔미토일 호모시스테인(palmitoyl homocystein), 글리코포린 A(glycophorin A), 팔미토일 이뮤노글로불린(palmitoyl immunoglobulin), 및 팔미토일 라이소자임(palmitoyl lysozyme) 등이 밝혀 졌다(김진철, 김종득, 리포솜 이용의 최근동향, Recent advances in Bioprocess Engineering, 4, 65-83, 1996).

그런데, 본 발명에서는 글루코스 산화효소(GOD)를 바람직하게 소수화(hydrophobicization)시켜 베시클에 고정화하는데, 이는 베시클 형성에 보조분자로 작용하여, DOPE로부터 리포좀(베시클)을 제조하는데 큰 역할을 한다. 즉, 소수 화된 글루코스 산화효소(HMGOD)가 글루코스를 산화시키는 역할 및 베시클의 형성을 도와주는 보조분자의 역할을 동시에 하는 것이다.

한편, 본 발명은 소수화된 글루코스 산화효소, 베시클 내부에 포집되는 목적물질 및 분산제가 녹아 있는 수용액에 양 친매성 분자를 첨가한 후 수화시켜 현탁액을 제조하는 단계(a); 현탁액을 균질화하는 단계(b); 및 균질화 후, 분산제를 제거하는 단계(c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법을 제공한다.

이때, 바람직하게 양 친매성 분자는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine; PE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol; PG), 포스파티딜에시드(phosphatidylacid; PA), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol; PI), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)와 같은 인지질; 모노 글리세라이드(mono glyceride), 디 글리세라이드(di glyceride), 트리 글리세라이드(tri glyceride)와 같은 에스테르 화합물; 팔미틱 에시드(palmitic acid), 스테아릭 에시드(stearic acid), 베헤닉 에시드(behenic acid)를 포함하는 지방산; 디메틸아미노프로필옥타데칸아미드(dimethylaminopropyloctadecanamide), 도데실 아민(dodecyl amine), 미리스틸 아민(myristyl amine), 팔미틸 아민(palmityl amine), 스테아릴 아민(stearyl amine)을 포함하는 알킬 아민(alkyl amine); 및, 도데실 알콜(dodecyl alcohol), 미리스틸 알콜(myristyl alcohol), 팔미틸 알 콜(palmityl alcohol), 스테아릴 알콜(stearyl alcohol)을 포함하는 알킬 알콜(alkyl alcohol); 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서, 목적물질로는 베시클 내부에 포집될 수 있다면 특정의 것에 반드시 한정되는 것은 아니며, 바람직하게 인슐린(insulin), 글리피자이드(glipizide), 레파글리지나이드(repaglizinide), 메트포르민(metformin), 피오글리타존(pioglitazone)와 같은 혈당 강하제, 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 트랜스투주맙(transtuzumab), 시스플라틴(cisplatin), 제머라실(gemeracil), 류코보르빈(leucovorin)과 같은 항암제, 그리고 엠피실린(ampicillin), 아목시실린(amoxicillin), 목사락탐(moxalactam), 록시트로마이신(roxithromycin), 독시사이클린(doxycycline), 레보플록사신(levofloxacin)과 같은 항생제 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서, 분산제의 농도는 0.01~0.1%(w/w), 바람직하게는 0.05~0.5%(w/w), 가장 바람직하게는 0.07%~0.12%(w/w)인 것이 좋다. 0.01~0.1%(w/w)의 범위보다 높으면 소수화된 글루코스 산화효소가 변성되고 이 범위보다 낮으면 건조 인지질 막을 효과적으로 분산시킬 수 없기 때문이다.

이때, 분산제로는 히드로필릭 리포필릭 발란스 넘버(hydorphilic liphophilic balance number; HLB no.)가 바람직하게 4~15, 더욱 바람직하게는 6~14, 가장 바람직하게는 7-13인 계면활성제를 사용하는 것이 좋다. 4~15의 범위보 다 높으면 글루코스 산화효소가 변성되고, 이 범위보다 낮으면 건조 인지질 막을 효과적으로 분산시킬 수 없기 때문이다. 이 값의 범위를 가지는 계면활성제로는 소르비탄 라우레이트(sorbitan laurate), 소르비탄 팔미테이트(sorbitan palmitate)와 같은 다가 알코올 에스테르, PEO(20) 소르비탄 트리올레이트(PEO(20) sorbitan trioleate)와 같은 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 부가물, 다가 알코올 에스테르, 데옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 담즙산 염(bile salt)이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서 소수화된 글루코스 산화효소의 농도는, 바람직하게 양 친매성 분자에 대한 몰 비로서 바람직하게 1000:1~1,000,000, 더욱 바람직하게는 5000:1~500,000:1, 가장 바람직하게는 10000:1~100,000:1인 것이 좋다. 1000:1~1,000,000 범위를 벗어나는 비율에서는 베시클이 형성되지 않거나 약물전달자로서 베시클 역할을 수행하지 못하기 때문이다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서, 현탁액을 균질화시킬 때는 특정의 균질화 방법에 반드시 국한되는 것은 아니나, 바람직하게 초음파 분쇄법(sonication), 초고압 분쇄법(microfluidizer), 막 압출법(membrane extrusion) 중 선택되는 어느 하나를 이용하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서, 분산제의 제거는 특정의 방법에 반드시 국한되는 것은 아니나, 겔 크로마토그래피 또는 투석을 이용하는 것이 좋다. 겔 크로마토그래피를 실시할 때는 충진 겔로서 세파덱스(Sephadex), 바이오겔(Bio gel) 등을 사용하는 것이 좋고, 투석법을 이용할 때는 현탁액에 대한 투석 액의 부피비율을 최소한 1:100으로 하고 투석시간은 24시간으로 하고, 분산제와 봉입되지 않은 목적물질이 완전 제거될 때까지 투석액을 갈아주는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 베시클 제조방법에 있어서, 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD)는 특정의 방법에 의해 제조된 것으로 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 소수성 앵커를 유기 용매에 녹이는 단계(가); 소수성 앵커가 녹아 있는 유기 용액을 분산제 및 글루코스 산화효소가 녹아 있는 수용액에 서서히 첨가하여 반응시키는 단계(나); 반응이 완결된 후 여과하여 여과액을 회수하는 단계(다); 및 회수한 여과액으로부터 분산제를 제거하는 단계(라);를 포함하는 과정을 통해 제조된 것이 좋다.

이때, 소수성 앵커는 특정의 것으로 반드시 한정되는 아니며, 팔미틱 에시드 히드록시숙신이미드 에스테르(palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester: PAHE)을 일 예로서 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD) 제조방법에 있어서, 수용액에 대한 분산제의 농도는 바람직하게 0.1~5.0%(w/w), 더욱 바람직하게는 0.5~4.0%(w/w), 가장 바람직하게는 1.0~3.0%(w/w)인 것이 좋다. 0.1~5.0%(w/w) 범위를 벗어나면 글루코스 산화효소가 변성되거나 소수성 앵커를 효과적으로 분산시킬 수 없기 때문이다.

이때, 분산제는 히드로필릭 리포필릭 발란스 넘버(hydorphilic liphophilic balance number; HLB no.)가 바람직하게 4~15, 더욱 바람직하게는 6~14, 가장 바람직하게는 7~13인 계면활성제를 사용하는 것이 좋다. 4~15의 범위보다 높으면 GOD가 변성되고 이 범위보다 낮으면 소수성 앵커를 효과적으로 분산시킬 수 없기 때문이다. 이 값의 범위를 가지는 계면활성제로는 소르비탄 라우레이트(sorbitan laurate), 소르비탄 팔미테이트(sorbitan palmitate)와 같은 다가 알코올 에스테르, PEO(20) 소르비탄 트리올레이트(PEO(20) sorbitan trioleate)와 같은 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 부가물, 다가 알코올 에스테르, 데옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 담즙산 염(bile salt)이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD) 제조방법에 있어서 수용액에 대한 글루코스 산화효소(GOD)의 농도는 바람직하게 0.1~1.0%(w/w), 더욱 바람직하게는 0.2~0.8%(w/w), 가장 바람직하게는 0.3~0.6%(w/w)인 것이 좋다. 0.1~1.0%(w/w) 범위를 벗어나면 반응이 진행되지 않기 때문이다.

한편, 본 발명의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD) 제조방법에 있어서 소수성 앵커의 농도는, 유기 용액 중 바람직하게 0.3~3.0%(w/w), 더욱 바람직하게 0.5~2.0%(w/w), 가장 바람직하게 0.7~1.5%(w/w)인 것이 좋다. 0.3~3.0%(w/w) 범위보다 낮은 농도를 사용할 경우에는 필요한 양의 소수성 앵커(일 예로서, PAHE)를 수상에 첨가하기 위해서 많은 양의 유기 용매가 수상에 첨가되기 때문에 글루코스 산화효소가 변성될 수 있기 때문이고, 3~3.0%(w/w) 범위보다 높은 농도를 사용하면 소수성 앵커가 잘 용해되지 않거나 응집되어서 반응이 진행되지 않기 때문이다.

한편, 본 발명의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD) 제조방법에 있어서 유기 용액과 수용액의 첨가 비율은 글루코스 산화효소에 대한 소수성 앵커(일 예로서, PAHE)의 몰 비가 바람직하게 1:200~1:10, 더욱 바람직하게 1:100~1:20, 가장 바람직하게 1:50~1:30이 되도록 첨가하는 것이 좋다. 1:200~1:10 비율보다 낮을 경우는 소수성 알킬기가 GOD에 적게 공유결합되기 때문에 베시클(리포솜) 표면에 고정화될 수 없고, 1:200~1:10 비율보다 높을 경우는 소수성 알킬기가 GOD에 과도하게 공유결합되어 GOD의 효소 활성을 낮추기 때문이다.

한편, 본 발명의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD) 제조방법에 있어서 분산제를 완전히 제거하기 위해서는, 바람직하게 투석의 방법을 사용하는 것이 좋은데, 여과액에 대한 투석액의 부피비율을 최소한 1:100으로 하고, 투석시간은 12시간으로 하고, 투석액을 갈아주면서 3번 반복하는 것이 좋다.

본 발명의 베시클은 외부 표면에 글루코스 산화효소가 고정화되어 있기 때문에 베시클이 혈액 또는 글루코스를 함유하는 용액 중에 주입되었을 때, 혈액 또는 용액 중의 글루코스를 산화시켜 글루콘산(gluconic acid)을 생성시킨다. 글루콘산이 생성됨으로 말미암아 베시클 주변의 pH는 낮아져 산성이 되고, 베시클은 파괴되는데, 이때 내부에 봉입되어 있는 목적물질은 외부로 방출된다.

따라서, 본 발명의 베시클은 혈액 또는 글루코스 함유 용액 중에서 선택적으로 파쇄됨으로 말미암아 목적물질을 혈액 또는 용액에 손실 없이 예정된 농도로 전달할 수 있는 장점이 발휘되므로, 의약산업 및 식품산업에 있어 매우 유용하다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시에에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1 : 소수화된 글루코스 산화효소( HMGOD) 제조

먼저, 계면활성제인 디옥시콜레이트(deoxycholate; DOC) 0.24 g을 12 ml의 인산염 완충액(pH 8.8, 0.16M)에 용해시켰다. 그 다음 글루코스 산화효소(GOD) 0.048g을 앞서 제조한 수용액에 용해시켰다.

한편, 팔미틱 에시드 히드록시숙신이미드 에스테르(palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester) 0.0228g을 유기용매인 디옥산(dioxane) 2ml에 용해시켰다. 이 후, 에스테르가 용해되어 있는 유기용액 0.4ml을 GOD가 녹아 있는 수용액에 서서히 첨가하였다. 이때, 팔미틱 에시드 에스테르에 대한 GOD의 몰 비율은 1:40이었다. 반응은 30℃에서 교반하면서 10시간 동안 진행시켰다.

반응 후, 반응의 부산물을 제거하기 위해서 0.45μm 기공을 가진 여과기를 통해 여과시켰다. 그 다음 디옥시콜레이트와 저분자 불순물을 제거하기 위해서 여과액을 투석막에 넣고 1000ml 인산염 완충액(pH 7.4, 0.15 M)에서 12시간 투석시켜 주었다. 이때, 저분자 불순물들을 완전히 제거하기 위해서 투석을 3회 반복하였다. 그 다음 투석된 액을 동결건조시켜 건조상태의 소수화된 글루코스 산화효소(HMGOD)를 얻었다.

평가예 1: 글루코스 산화효소( GOD )에 공유 결합된 팔미틱 에시드( palmitic acid)의 수 결정

GOD에 공유 결합된 팔미틱 에시드(palmitic acid)의 수를 TNBS 방법을 이용하여 결정하였다.

먼저, 소디움 라우릴 설페이트 0.025g을 50ml 인산염 완충액(pH 8.9, 0.01 M)에 용해시켰다.

한편, 트리니트로벤젠 설포닉 에시드(trinitrobenzene sulphonic acid; TNBS) 용액(0.03 %)은 0.5 ml 트리니트로벤젠 설포닉 에시드를 상기에서 제조한 83 ml 소디움 라우릴 설페이트 수용액에 첨가하여 제조하였다. 그 다음, 1ml 소디움 라우릴 설페이트 수용액, 1ml TNBS용액, 그리고 0.5ml HMGOD 수용액 (3.55mg/ml)을 10ml 유리용기에 넣고 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 그 다음 1.9ml HCl 수용액(0.21 M)을 반응 혼합물에 첨가하고 상온에서 30분 동안 방치하였다.

이 후, 335nm에서 반응물의 흡광도를 측정함으로써 아미노기의 수를 결정하였다. GOD의 아미노기 수와 HMGOD의 아미노기 수의 차이가 팔미틱 에시드가 공유결합된 수인데, 실험 결과에 의하면 GOD 분자 하나에 있는 아미노기 수는 24±1개이었고, HMGOD의 아미노기 수는 18±1개이었다.

따라서 GOD 분자 하나당 5±1개의 아미노기가 공유결합되었다고 할 수 있었다.

실시예 2 및 비교예 1~3: 글루코스 산화효소( GOD )가 고정화된 베시클 제조

(몰 %)

	DPPC	DOPE	HMGOD	DOC
비교예 1	86%	-	-	14%
비교예 2	85.997%	-	0.003%	14%
비교예 3	-	86%	-	14%
실시예 2	-	85.997%	0.003%	14%

상기 표에서와 같은 조성과 발명의 상세한 설명 부분에서 기술한 방법대로 베시클을 제조하였다. 비교예 1, 2와 같이 양 친매성 분자로서 DPPC(Dipalmitoylphosphatidylcholine)를 사용하면 HMGOD의 존재 여부와 관계없이 베시클이 형성되었다. 이것은 DPPC의 분자모양이 친수성 머리 부분의 단면적과 소수성 꼬리 부분의 단면적이 유사한 직사각형이기 때문이다. 따라서, HMGOD의 존재여부와 무관하게 이중층 지질막을 형성할 수 있었다.

한편, 실시예 2 및 비교예 3과 같이 지질로서 DOPE를 사용하는 경우에는 HMGOD가 존재하면 베시클이 형성되고, 존재하지 않으면 베시클이 형성되지 않았다. DOPE의 경우, 머리 부분이 너무 작아 삼각형 모양이다. 따라서 HMGOD와 같은 보조 분자가 존재하여야 베시클이 형성되고, 존재하지 않으면 베시클이 형성되지 않은 것이다.

평가예 2: 본 발명 베시클의 포도당 용액 내에서 유효 성분 방출 거동 평가

본 발명의 방법에 의해 모델물질로 형광물질인 칼세인(calcein)을 사용하고, 하기 표 2에 기재된바 조성에 의해 글루코스산화효소가 삽입된 베시클을 제조하여 여러 글루코스 농도의 조건하에서 방출실험을 실시하였다. 증류수를 NaOH 또는 HCl 용액을 이용하여 pH 7.5로 맞추고 각각의 글루코스 농도가 0, 50, 200, 400 mg/dL가 되도록 글루코스를 넣어주었다. 여기에 베시클 현탁액을 넣어주고 마그네틱 바를 이용하여 교반 해주면서 3시간 동안 칼세인의 형광성을 측정하였다(Hitachi F-2500, Japan).

구분	방출 용액의 양(mL)	리포솜 현탁액의 양(mL)	글루코스 농도(mg/dL)
실시예 3	50	1.724	0
실시예 4	50	1.724	50
실시예 5	50	1.724	200
실시예 6	50	1.724	400

그 결과, 글루코스의 농도가 높은 실시예에서의 베시클 방출이 글루코스 농도가 낮은 실시예 에서의 방출보다 높게 나타났다(도 2). 실시예 4(○)에서는 1시간 동안의 리포솜 방출이 20%가량 되었고, 실시예5 (▼)에서는 40%, 그리고 실시예 6(▽)에서는 60%가 방출되었다.

또한, 3시간 후의 방출에서는 실시예 4의 경우 80%가량 방출되었으나, 실시예 5,6 에서는 95%가량의 방출에 도달하였다. 하지만 글루코스가 들어있지 않은 조건인 실시예 3(대조군, ●)에서의 리포솜 방출은 3시간 동안 거의 이루어지지 않았다.

이상의 실험으로부터, 본 발명의 베시클이 글루코스 함유 용액 중에서 선택적으로 파쇄되어, 내부에 포집된 목적물질을 용액 중으로 발산하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 글루코스 산화효소가 고정화되어 있는 베시클의 모식도이다.

도 2는 본 발명 베시클의 포도당 용액 내에서 유효 성분 방출 거동을 평가한 그래프이다.

Claims

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디옥시콜레이트(deoxycholate; DOC) 0.1~5.0%(ww), 글루코스 산화효소 0.1~1.0%(w/w)를 함유하는 수용액과, 팔미틱 에시드 히드록시숙신이미드 에스테르(palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester) 0.3~3.0%(w/w)를 함유하는 유기용액을 제조한 후, 상기 팔미틱 에시드 히드록시숙신이미드 에스테르에 대한 상기 글루코스 산화효소의 몰 비율이 1:40이 되도록 상기 유기용액을 상기 수용액에 서서히 첨가하여 30℃에서 10시간 동안 교반하며 반응시키고, 반응이 완결된 후 여과하여 여과액을 회수한 후, 상기 회수한 여과액을 투석시켜 상기 디옥시콜레이트를 제거하는 과정을 통해 소수화된 글루코스 산화효소를 제조하는 단계;

디옥시콜레이트 0.01~0.1%(w/w), 상기 소수화된 글루코스 산화효소, 및 베시클 내부에 포집되는 목적물질을 함유하는 수용액에, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)에 대한 상기 소수화된 글루코스 산화효소의 몰 비가 1000:1~1,000,000가 되도록 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)를 첨가한 후, 수화시켜 현탁액을 제조하는 단계;

상기 현탁액을 초음파 분쇄법 (sonication), 초고압 분쇄법 (microfluidizer) 및 막 압출법 (membrane extrusion) 중 어느 하나를 사용하여 균질화하는 단계; 및

균질화 후, 겔 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 분산제를 제거하는 단계;를 포함하는 과정을 통해,

상기 소수화된 글루코스 산화효소를 베시클의 이중층 막의 외부 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
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