KR20010033518A - 페이로드를 증가시키고, 분리/결합율을 제어하기 위한 고분자 결합체 및 복합응집체의 생장, 시험 및 사용방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 필요하다면 변형된 다양한 양친매성 고분자(폴리펩티드, 단백질 등) 또는 다른 사슬분자(예를 들어, 부분적으로 소수성화한 적당한 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드 등)와 극성 및/또는 하전된 양친매성 물질의 혼합물로 이루어지고 자유롭게 현탁되거나 지지될 수 있는 확장된 표면을 형성하는 응집체와의 조합체의 생장, 시험, 제조 및 용도에 대한 적합한 원리 및 과정을 기재하고 있다. 기재된 방법을 약간의 활성이나 유용한 기능을 나타내는 사슬 분자와 결합시킨 후에 상기 응집체를 사용할 수 있는데, 이는 예를 들어 약물의 전달이나 증상학 또는 생체/가수분해 등의 분야에 비트로나 비보상태로 사용하는 것이 적당하다. 상세한 예로, (결합된) 인슐린, 인터페론, 인터류킨, 신경 생장 인자, 칼시토닌, 및 면역글로불린 등을 함유하고 있는 지질로 이루어지는 포낭형태의 액적 혼합물이 설명되어 있다.

Description

페이로드를 증가시키고, 분리/결합율을 제어하기 위한 고분자 결합체 및 복합체 응집체의 생장, 시험 및 사용방법{METHOD FOR DEVELOPING, TESTING AND USING ASSOCIATES OF MACROMOLECULES AND COMPLEX AGGREGATES FOR IMPROVED PAYLOAD AND CONTROLLABLE DE/ASSOCIATION RATES}
또한, 본 발명의 표면에 전하를 띠는 계면활성제를 첨가하여, 상기 표면과 단백질과의 결합공정을 가속화하고, 고분자-막의 결합비율을 어느 정도 제어하는 수단을 제공한다. 이것은 널리 공지되어 있는, 계면활성제가 단백질의 결합을 억제한다는 상기 언급한 사실에 모순된다. 한편, 상기 표면으로부터 계면활성제를 적어도 부분적으로 제거하는 것은 고분자 탈착 공정을 가속화하고, 약간의 고분자를 탈착시킨다. 이것은 또한 공지된 사실에 위배된다. 본 발명의 연질의 변형가능한 표면, 특히 대응하는 막에 대한 고분자의 흡착은 변형성이 떨어지는 표면에 대한 흡착정도보다 강력하다. 연질의 막은 그렇지 못한 막보다 좀 더 친수성을 지니고, 상호적인 반발력이 우세한데, 이러한 사실은 예상했던 것에 직접적으로 위배된다.
따라서, 본 발명의 목적은 크고, 때로는 단백질과 같은 고분자의 양친매성 분자, 또는 다른 종류의 적당한 사슬 분자 및 복합체 흡착제 표면 사이의 결합력을 최대화하는 조건을 상술하고 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 복합체 표면에 대한 고분자의 흡착 또는 상기 표면으로부터의 대응하는 탈착율을 제어하는 유익한 인자를 정의하는 것이다.
지금까지 본 발명의 또 다른 목적은 (생명)공학 및 의학분야에 적합한 형태로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 결과적인 형태로 실용화하여 사용하기에 특히 적당한 양식을 서술하고 있다; 본 발명은 예를 들어 의학이나 동물의학과 같은 분야에서 증상학, 분리공정 및 (생)공정, 생명공학, 유전자 증식, 제재 안정화처리, 농축 및 운반등의 용도에 사용되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 양친매성을 나타내고, 확장된 표면, 특히 양친매성 액매와 접촉할 경우에 막과 유사한 표면을 형성할 수 있는 물질들의 결합물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 분자수준에서 상기 표면과 다른 양친매성 물질과의 결합물에 관한 것인데, 이러한 상기 기타 양친매성, 표면과 결합되는 물질은 전형적으로 올리고머 및 폴리머와 같은 반복 서브유니트를 갖는 거대한 분자이고, 이것은 종종 생물학적인 활성제로부터 비롯된다.
본 발명은 또한 상기 표면 및 결합물들의 다양한 용도 뿐 만 아니라, 상기 거대분자 및 표면 사이의 결합물과 상기 표면을 제조하는 방법에 관한 것이다.
양친매성 사슬 분자 및 단백질과 같은 이와 관련된 고분자는 같은 양으로 흡수되지는 않고 대부분의 경우에는 다양한 형태로써, 어떤 종류의 표면에도 흡수된다. 본 발명은 본 기술을 설명하고, 부드럽고 복합적인 표면과 결합하는 고분자를 제어하고 활용하기 위한 새로운 원리를 제시하고 있다. 이것은 미래의 생물학, 생물공학, 약학, 치료학 및 증상학 분야에 사용하기 위해서 매우 중요할 것이다.
흡수제 표면(흡착제/흡착질 결합체)에 (거대)분자를 흡착/결합시키는 것은 다단계-공정으로 행해진다:
i) 제1단계는 흡착질의 재분산, 바람직하게는 흡착제/용액 계면에 축적시키는 단계이다. 본 단계는 일반적으로 고속이고, 본 단계에서 확산율이 제어된다.
ii) 제2단계에서는, 흡착질 분자가 소수성을 띠면서 연질 (막) 표면과 결합한다. 본 공정은 부분적인 분자 결합 및 연속적인 재배치와 같은 다단계로 이루어지는데, 본 단계의 적어도 일부는 종종 느리게 진행된다.
"연질"의 지질막에 속하는 계면에 부착된 리간드에 고분자가 특이적으로 결합할 가능성은 계면에 근접할수록 감소되는데, 이것이 Cevc, G., Strohmaier, L., Berkholz, J., Blume, G. Stud. Biophys. 1990, 138: 57ff에 논의되어 있다. 이러한 현상은 인접하는 지질막의 콜로이드 붕괴를 방지하는 동일한 비-쿨롱, 수소결합력으로 인하여 발생한다. 상기 전체적인 힘은 친수성 및 지질액 계면의 견고함으로 인해서 감소한다(Cevc, G., Hauser, M., Kornyshev, A. A. Langmuir 1995, 11: 3103-3110).
이층의 지질(Cevc, et al., op. cit.:1990)에 대한 비-특이적인 단백질의 흡착 정도는 막내에서 단백질에 대한 소수성 결합자리로 활용할 수 있는 가의 여부에 비례한다는 사실이 추정되어 오고있다. 이층의 지질에서 결함부위를 기계적으로 만들거나(예를 들어, 초음파 분해처리에 의해), 지질상 전이를 유도함으로써 막과 결합된 단백질이 증가한다는 것을 발견하였다.
일반적으로, 표면이 좀 더 소수성을 띠면 띨수록 지질성 고분자의 흡착정도가 증가한다고 알려져 있다. 예를 들면, K. Prime and G. M. Whitesides(Science, 1991, 252:1164-1167)는 소수성에 영향을 미치는 말단기가 있는 자가집합한 단층의 긴사슬 형태의 알칸을 사용하였는데, 이들은 이것을 "규칙" 또는 "원리"라고 확신하였다. 따라서, 오늘날까지 "소수성 인력"은 단백질의 흡착에 있어서 주요한 힘으로 간주되고 있다.
한편, 중성의 pH의 수용액에 침지시킨 단백질과 같은 친수성 고분자와 유리나 몽트모릴로나이트 점토와 같은 친수성 표면 사이에 존재하는 순 거시적인 수준의 상호력은 강한 반발력에 의해 조정된다는 사실이 일반적으로 널리 알려져 있다. 따라서, 반데르발스, 루이스 산-염기, 및 전기적 복층 상호력의 거시적인 상태에서 규칙이 적용될 수 있는 상태하에서, 친수성을 띠는 광물질성분의 표면위로 친수성 단백질이 흡착되는 일은 정상적으로 일어나기 힘들다.(H. Quiquampoix et al, Mechanism and Consequences of Protein Adsorption on Soil Mineral Surfaces, Chapter 23 in Proteins at Interfaces(PAI), T. A. Horbett and J. L. Brash, eds., ACS Symposium Series 602, 1995, New York: 321-333). 친수성 단백질이 소수성 표면상으로 흡착되는 것보다는 흡착력이 떨어진다고 하더라도, 용액으로부터 유리위로 친수성 단백질의 일부가 흡착된다; 상기 단백질은 또한 몽트모릴로나이트 점토 표면상으로 흡착된다. 이러한 보기 드문 현상은 설명하기 위하여, 단백질이 (음)전하를 띠는 친수성의 단백질에 결합되는 다가성 짝이온(예를 들어, 칼슘)을 통하여, 수용성 매질에서 침지시킨 (음)전하를 띠는 친수성 광물성 표면에 균일하게 결합할 수 있다는 사실이 제안되고 있으며, 실험적인 데이타로 입증되었다. 기타 미세한 전하 효과는 수소결합의 형성, 단백질내에서의 염, 및 짝이온의 결합에 관련된다. 예를 들면, 단백질분자내에서의 "구조적인 재배열, 흡착제 표면의 탈수, 전하를 띠는 기의 재분산 및 단백질 표면의 극성이 단백질의 흡착에 영향을 줄 수도 있는 사실이 이미 제안되었다.(Haynes, C. A. et al, Colloids Surface B: Biointerface, 2, 1994: 517-566). 이러한 맥락에서, 단백질이 실질적인 순 음전하를 수반하는 조건하에서-LA(알파-락트알부민)이 PS(폴리스티렌)에 강하게 흡착되는 경우에, 쿨롱의 상호인력은 중요하다고 하더라도 일반적으로는 고체표면에 단백질이 흡착하는 작용을 조정하지는 않는다. 최근의 다른 연구보고서에서는 " 단백질의 흡착에 대한 전하효과 정도에 대해서 현재까지 어떠한 확실하게 정립된 사실이 없다" 는 결론을 내렸다(Reversibility and the Mechanism of Protein Adsorption, W. Norde and C. Haynes, Chapter 2 in (PAI), op. cit.: 26-40).
막과 같은 연질의 표면에 있어서, 단백질 흡착에서 제1단계가 적어도 정전기-구동 및/또는 전하의 지배를 받는다는 사실이 현재 확산되고 있다(예를 들어, Deber, C. M.; Hughes, D. W.; Frasez, P. E.; Pawagi, A. B.; Moscarello, M. A. Arch. Biochem. Biophys. 1986, 245: 455-463; Zimmerman, R. M., Schmidt, C. F., Gaub, N. H. E. J. Colloid Int. Sci. 1990, 139: 268-280; Hernandez-Caseidis, T.; Villalaain, J.; Gomez-Fernandez, J. C. Mol. Cell. Biochem. 1993, 120: 119-126.). 일선 전문가들은 또한 다양한 지질응집체에 분비성 포스폴리파제가 결합할 때 정전기력이 중요한 작용을 한다는 결론을 내렸다(Scott, D. L.; Mandel, A. M.; Sigler, P. B.; Honig, B. Biophys. J. 1994, 67:493-504).
지금까지, 본 분야의 전문가들은 흡착시에 단백질의 형태학적인 변화로 인하여 얻어지는 엔트로피와 결합하는 이온력이 또한 약간의 작용을 한다하더라도, 최종적인 단백질의 흡착의 주요한 결정인자가 소수성 인력이라고 믿고 있었다.
일반적으로 단백질은 동등한 전하를 띠는 표면에는 흡착되지 않고, 반대전하를 띠는 표면에 강하게 흡착한다. 단백질 흡착에 있어서의 pH 의존성은 이러한 사실을 반영하고 있다. 상기 전하효과는 때때로 작은 다가성 짝이온과 같은 잠재적인 인자에 의해 방해될 수 있는데, 이는 단백질과 정상적으로 서로 반발하는 유사전하가 존재하는 표면 자리를 가교시킬 수 있다.
흡착된 단백질의 최종적인 형태는 최초의 형태와 좀처럼 일치하지 않는다. 이는 단백질 흡착에 있어서의 대부분의 모델은 결과적으로 분자재배치나 표면상에 단백질의 이완을 야기하는, 가역적으로 흡착된 상태에서 보다 더 진행된 상태로의 전이를 야기하기 때문이다. 흡착시의 고분자 재배치는 종종 치명적이고, 단백질의 변성에 있어서는 더욱더 그러하다. 효소 및 항체가 흡착상태에서 적어도 일부의 생물학적인 활성을 보유한다는 사실과 생물학적인 활성이 본래 구조를 유지시키는데 어느정도 중요하다는 사실로부터, 흡착된 단백질의 형태학적인 변성이 종종 시간과 범위인자내에 한정지어진다는 결론을 얻을 수 있다. 단백질의 폴딩은 소수성 상호력의 영향을 대단히 많이 받는다. 단백질의 결합 및 형태학적인 변화와 같은 두 현상 다는 계면활성제와 인지질과 같은 특정한 양성친화제의 존재여부에 민감하다. 상기 분자를 첨가함으로써 단백질의 흡착이 감소하거나, 역전된다고 추측하였다.
따라서, 비특이적인 단백질의 흡착 및 손실을 최소화하기 위해서, 단백질을 단백질의 격리시에 계면활성제와 자주 혼합시킨다. 일례의 특정한 연구에서, 이식된 플루오닉 계면활성제의 표면농도가 증가함에 따라, 단백질의 흡착은 인지가능할 정도로까지 감소된다. EG 단위(4)를 최소로 갖는 단량체가 혈액성분에 대하여 대단히 비활성인 특징이 있는데, 계면활성제의 단량체 부사슬에서의 에틸렌-글리콜(EG)의 수는 4, 9 및 24였다(Analysis of the Prevention of Protein Adsorption by Steric Repulsion Theory, T. B. McPherson et al., Chapter 28 in PAI, op. cit.: 395-404).
단중합체는 표면에 공유결합하여 부착되는데, 이는 계면 두께 및 친수성을 증가시키고 이로 인해 하면의 소수성 결합자리의 효용성이 저하하는데, 상기 단중합체는 또한 변형된 표면에 단백질이 결합할 가능성을 저하시킬 뿐 아니라, 상기 표면에서의 변성을 보여준다.
또한, 가끔씩 한 말단에 단 중합체 단편을 함유하는 계면활성제가 다양한 표면에 대한 결합력을 방해하거나 심지어는 부분적으로 역전시킬 수도 있다는 사실은 상기 언급한 발견과 일치한다. 상기 현상은 아마도 계면활성제의 표면인력 및 계면활성제-단백질과의 결합력의 상대적인 크기에 의존하는 단백질 용해력이나 교체력에 관계된다;대개 이러한 인자들은 일말의 작용을 한다.
다른 실험에서, 10-4중량%의 농도 범위에서 pH 7.0인 수용성 상에 보리지 비이온성 계면활성제(알칼리-폴리옥시에틸렌 에테르)를 첨가하는 것은 공기/물 계면으로부터 실질적인 단백질의 분리를 야기하였다(T. Arnebrant et al, op. cit.).
계면활성제에 의하여 단백질을 미리 흡착시켜서 제거하는 것에 관한 연구가 집중적으로 연구되어 오고 있다(Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit.: 240-254). 세가지 형태의 인력으로 구분되었다:
i) 정전기 또는 소수성 인력에 의한 알파-락토글로불린이나 알부민 혈청과 같은 단백질내에서 특정자리와의 결합력;
ii) 큰 형태변화없는 단백질과 계면활성제의 상호흡착력;
iii) 형태학적인 변화가 뒤따르는 단백질과 상호흡착한 계면활성제와의 결합력;
예를 들면, 메틸화된 (소수성) 실리카 표면으로부터 단백질을 제거하는 것은 계면활성제의 더 높은 표면활성으로 인하여 대체됨으로써 단백질이 제거되는 식으로, 다른 계면활성제의 경우에도 마찬가지이다. 계면활성제 헤드그룹 효과는 친수성의 표면에서는 가장 잘 발현되지만, 소수성의 표면에서는 덜 중요하다고 결론지을 수도 있다(Protein-Surfactant Interaction at Solid Surfaces, T. Arnebrant et al. Chapter 17 in PAI, op. cit.,: 240-254).
다른 지질에서도 상기 결론이 적용된다. 플라스틸 표면상에 흡착된 플라즈마 단백질의 양은 DPPC 리포솜 현탁액으로 전처리함으로 해서 감소한다; 카테테르 표면상에서 인슐린이 흡착하는 경우도 같은 경향을 나타낸다.
지금까지 예상외로, 양극성의 특히 지질의 혼합물로 구성되는 연질의 표면에 흡착하는 고분자 및 계면활성제가 어떠한 표면활성 분자도 함유하지 않는 지질응집체보다도 훨씬 효과적으로 흡착한다. 보다 쉽게 말하자면, 안정적인 막을 형성하는 분자 혼합물-일반적으로 반드시 지질성 포낭(리포솜)의 형태가 아니어도 되는-및/ 적어도 1종의 강력한 양친매성의, 말하자면 상대적으로 수용성을 띠며, 인지질의 혼합물 및 계면활성제와 같은 이층성-불안정한 성분(종종 계면활성제)은, 순수한 인지질 표면보다 단백질과 같은, 콜레스테롤과 같은 안정화하는 적어도 1종의 이층성 지질성 물질로 이루어지거나 인지질만으로 구성되는 리포솜 또는 특히 포낭 등의 양친매성 물질과 좀 더 결합하기가 쉽다. 또한, 결합되는 양친매성의 고분자(단백질)의 상대적인 수는 흡착본체의 순전하로써 같은 부호를 갖는 순전하를 보유하는 표면에서 더 높다는 것을 예상외로 알게 되었다. 이것은 서로 끌어당기는 물체상에서 정전기적인 결합을 이루어 더 강력해지기 위해서는 반대전하가 필요하다고 알려진 기존의 출간된 자료와는 일치되지 않는다.
상기 분자(예를 들어, 약물-캐리어)체에 대하여 상기 기재한 개선에 있어서 필요한 것 중의 하나는 흡착제 표면의 일반적인 흡착가능성이다. 이러한 흡착 촉진력은 고분자의 흡착을 가능하게 한다:
i) 먼저, 부분적으로 반대전하-전하 및 다른 상호력으로 인하여 흡착제 표면 근방을 고농도로 한다.
ii) 그 다음으로, 흡착제 표면과의 결합력/비-정전기적인 상호력을 활용한다.(후자는 일반적으로 소수성이면서 수소결합 결합자리가 필요한 공정인데, 이는 발생되거나 표면-유연성 및/또는 적응성에 의해서 이루어질 수 있다.)
이러한 요구사항을 충족시키고, 제어가 가능한 (고분자)약물-캐리어 결합물은 실용적으로 사용하는 데에 가장 적합하다.
또한, 연질의 표면에 대한 단백질의 흡착에 관한 각 공정단계는 가변적이기는 하지만, 막-용해성 계면상 또는 내면에서의 소수성의 근접성 및 다수성에 의존한다. 따라서, 접근가능한 결합자리의 수에 영향을 받는 고분자 및 결합 표면사이 소수성 결합의 운동성은 표면활성 성분 및 막의 연성이 존재하면 증가한다.
흡착하는 (고)분자가 다수의 결합자리에 구조적으로 맞춰질 수 있는 비율 또한 중요하다. 예를 들면, 비전하의 유연성이 있는(Transfersomeⓡ) 막의 소수성 상호력이 인슐린-표면 결합의 중요한 요인이 된다. 상기 기본적인 다단계 결합은 대개 실질적인 시스템 재배치가 필요하지만, 완결되는데 있어서 장시간의 흡착이 요구된다. Transfersomeⓡ-인슐린 복합체형에 있어서 최적의 항온배양 시간은 결과적으로 다소 길어질 수도 있다.
전 단락에서 설명된 흡착개요는 구체적인 자료에 기재되어 있는 기본적인 흡착 시나리오와 일치한다. 이러한 사실에도 불구하고, 공지된 사실과 확실하게 구분되는 여러가지 차이점 및 심지어는 논의사항들이 지금까지 개시되었다.
본 발명의 이러한 문제에 대한 해결책으로 첨부된 독립된 항에서 정의한다.
정의
본원에 사용된 정의에 의해 " 결합물" 이라는 것은 둘 이상의 다른 분자사이의 복합체이고, 복합체 구조가 공유결합을 배제하지 않는 이유와는 상관없이 적어도 그것들 중의 하나는 다른 하나 또는 다수의 잘 규정지어진 표면(들)과 응집체를 형성한다. 다른 종류 분자사이의 결합은 인캡슐레이션(예를 들어, 표면-형성 분자로 구성되는 포낭에 포함됨), 삽입(예를 들어, 표면과 표면아래의 응집체층에 포함됨) 또는 흡착(응집체 표면위로)을 근간으로 이루어진다고 할 수 있다; 이러한 원리로 둘 이상의 결합물이 또한 가능하다.
본원에 사용되는 상기 언급했던 맥락에서 " 흡착질 ", " 흡착하는 (고)분자 ", " 접합하는 (고)분자 ", " 결합하는 (고)분자 " 및 " 흡착제 " 또는 " 접합하는 표면 " 등은 교대로 사용되는데 이것은 선택된 조건하에서 확장된 표면을 형성하지 않는 분자사이의 결합을 설명한다.
"캐리어"라는 것은 자연적이거나 그것의 발생원과는 상관없이 본 출원에서와 같은 실용적인 목적으로 사용되는 하나 이상의 고분자와 결합할 수 있는 응집체, 또는 인체나 동물체로의 전달체를 의미한다.
본 발명에서의 의미로 "지질"이라는 것은 지방의 특성과 유사한 특징을 보유하는 어떠한 물질을 의미한다. 대개, 이러한 유형의 분자는 확장된 무극성 영역(사슬, X)을 보유하고 있고, 대부분의 경우에는 또한 소위 헤드그룹(Y)이라고 불리는 수용성이고, 극성이며, 친수성을 띠는 기를 보유하고 있다. 상기 물질의 기본적인 구조식1은 하기와 같다.
X-Yn(1)
여기서, n은 0이상이다. n=0인 경우에 그 지질을 무극성 지질이라고 한다; n1이면 지질은 극성을 띠게 된다. 이러한 맥락에서, 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 글리세로포스피노리피드, 글리세로포스포노리피드, 설포리피드, 스핑고리피드, 이소프레노이드리피드, 스테로이드, 스테린 또는 스테롤 등과 같은 모든 양친매성 물질들 및 탄수화물 잔기를 함유하고 있는 모든 지질은 단순히 지질이라고 명명한다. 보다 정확한 정의를 위해서 PCT/EP91/01596을 참조한다.
본원에서 " 가장자리-활성" 물질 또는 "계면활성제"라는 것은 가장자리, 돌출부 또는 기타 심하게 굴곡진 구조 및 결함이 많은 영역을 형성하는 시스템의 성향을 증가시키는 어떤 물질을 의미한다. 일반적으로 사용하는 계면활성제에 부가적으로 보다 더 통상적으로 사용하는 계면활성제의 존재하에 지질의 용해화를 촉진하는 다른 분자 및 상호-계면활성제는 이러한 범주에서 제외한다; 또한 흡착체(헤테로)군에서 결점(적어도 부분적으로는 소수성)의 형성을 야기하거나 촉진하는 분자도 마찬가지로 제외한다. 직접적인 계면활성제 작용이나 (부분적인)분자분리의 (부분적인) 촉매작용, 또는 그 밖에 적당한 분자에 계면활성제로 야기된 형태의 변화가 종종 상기 효과에 원인을 제공한다. 결과적으로, 다수의 올리고 및 폴리카보하이드레이트, 올리고 및 폴리펩티드, 올리고 및 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것들의 유도체와 같은 비대칭이고 양친매성의 분자 및 중합체 뿐만 아니라 다수의 용매들은 종래부터 사용되는 계면활성제에 부가적으로 상기 언급한 범주내에 포함된다. 매우 폭넓게 사용되는 계면활성제, 적당한 용매(소위, 상호-계면활성제라고도 함), 및 다수의 다른 적당한 가장자리 활성 물질이 비교적 대단히 많이 언급되어 있는 리스트가 PCT/EP91/01596에 기재되어 있는데, 본 발명에서 이것을 예시적으로 참조한다. 보다 더 완벽한 리스트는 Industrial surfactants 핸드북(Michael Ash, Irene Ash, eds., Gower Publishing, 1993)에 기재되어 있다.
"사슬 분자" 또는 "고분자"는 적어도 2종 이상 또는 "흡착하는 표면"에 대하여 동등하지 못한 친화도를 나타내는 기의 상태를 보유하는 직쇄나 측쇄의 분자이다. 본 발명의 대응하는 대안을 제시하거나 종합하는 관점에 있어서 특별히 요구되는 것은 상기 기의 적어도 1종이 도너 용액 및/또는 흡착하는 표면에서 (부분적으로) 확실히 충전된다는 것이다. 각 기에 대한 상기 표면-친화도는 종종 그것들의 다른 양친매성에 기인하고 있는데, 말하자면 다른 친수성/소수성에서 비롯된다. 다른 기들은 사슬을 따라서 제멋대로 분배될 수 있지만, 대부분의 경우에 다수의 물리적으로 연관된(예를 들어, 다수의 친수성 또는 하나 이상의 소수성)기가 하나의 사슬단편에 위치하게 된다.
본 원에 사용된 의미로 "고분자"에는 하기의 것들이 있다.
기본식 CX(H2O)y로 표시되는 설탕, 전분, 셀룰로오스 등(탄수화물의 보다 확실한 정의는 PCT/EP91/01596을 참조한다.)과 같은 것이 있는데, 본 발명에서 접합하는 표면에 대한 부가적인 친화력을 얻기위해서 매우 자주 활용되어야만 한다. 예를 들어, 소수성 잔기를 (부분적으로) 소수성을 띠는 표면과 결합하게 되는 탄수화물을 부착시킴으로써, 또는 보다 다 친수성을 띠는 접합하는 표면과 비-쿨롱 상호력(예를 들어, 수소결합)을 내는데 필요한 기를 도입함으로써 이것은 가능해진다.
데옥시리보뉴클레익 에씨드(DNA) 또는 리보뉴클레익 에씨드(RNA)의 호모나 헤테로 사슬과 같은 올리고 또는 폴리뉴클레오티드와 그것들의 화학적, 생물학적 또는 분자 생물학적 (유전자) 변형체(보다 상세한 정의는 PCT/EP91/01596에 기재되어 있는 리스트를 참조한다)가 있다.
3-250, 종종 4-100, 흔하게는 10-50개의 같거나 다른 아미노산으로 구성되어 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 아미드결합으로 자연적으로 겹쳐지지만, 프로테오미네틱의 경우에 이것은 다른 중합반응 개요에 따라 변화할 수도 있고, 심지어 부분적으로나 전체적으로 고리형이다; 선택적으로 순수한 화합물 또는 라세믹 혼합물을 사용하는 것도 가능하다(보다 상세하고 완벽한 정의를 위해서 PCT/EP91/01596를 참조한다.).
긴 폴리펩티드 사슬을 그것들의 상세한 형태나 중합반응의 정확도와는 상관없이 일반적으로 단백질이라 한다. 대부분, 단백질은 표면과 비교적 효율적으로 결합한다. 따라서, 여기에서는 연관되는 물질을 인용하지는 않고 부분적인 리스트로 PCT/EP91/01596 및 최근까지 게재된 전문분야의 논문을 참조로 한다.
단지 설명을 목적으로, 약간의 연관되는 군들을 하기 간단하게 요약한다.
효소에는 옥시도리덕타제(여기에는 다양한 디하디드로게나아제, (퍼)옥시다아제, (수퍼옥시드)디스뮤타아제 등이 있다.), 트랜스퍼라아제(아실-트랜스퍼라아제, 포스포릴라아제 및 기타 키나아제), 트랜스펩티다아제(에스터라아제, 리파아제 등), 리아제(디카르복실라아제, 이소머라아제 등), 다양한 프로티아제, 보조효소 등이 있다.
특수형이 있는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM로 분류되는 면역글로불린, Fab- Fab2-단편과 같은 그것들의 단편, 본래의 형태 또는 화학적, 생화학적, 또는 유전학적으로 증폭된 형태로 가변하거나 고도로 가변하는 영역인, 단일 사슬 항체 또는 그 일부가 본 발명으로부터 얻어질 수 있다. 여기에는 IgG-감마 사슬, IgG-F(ab')2 단편, IgG-F(ab), IgG-Fc 단편, Ig-카파 사슬, Ig-s의 경사슬(예를 들어, 카파 및 람다 사슬) 및 또한 가변하거나 고도로 가변하는 영역인 더 작은 면역 글로불린 단편 또는 이러한 물질이나 단편중의 어느 것으로 된 변형체가 있다.
상기 항체 이외에 면역학적으로 활성이 있는 분자(엔도톡신, 키토킨, 림포킨 및 다른 거대한 면역조절물질이나 생물학적 전달체) 또한 이종의 사슬분자군에 속한다. 피토해마글루틴, 렉틴, 폴리이노신, 폴리시티딜산(폴리 I:C), 에리트로포이에틴, "과립백혈구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 1~18의 인터루킨, 인터페론(알파, 베타 또는 감마 및 그것들의 (생)합성된 변형체), 종양 괴사 인자, (TNF-s)인 경우에도 그러하다; 충분히 크고 양친매성 조직 및 식물체 추출물, 그것들의 화학적, 생화학적 또는 생물학적 유도체 및 대체물, 그것들의 일부 등도 같은 군에 속한다. 결과적으로, 상기 모든 분자는 본 명세서에서 기재한 대로 복합체 표면과 알맞게 그리고 효율적으로 결합할 될 수 있다.
생물학적으로 연관되는 또 다른 예에는 기본적인 파이브로블라스트 생장인자(BFGF), 내피세포 생장인자(ECGF), 표피 생장인자(EGF), 파이브로블라스트 생장인자(FGF), 인슐린, 인슐린과 유사한 생장인자(LGF I 및 LGF II 등), 신경-생장인자(NGF, NGF 2.5s, NGF 7s 등), 전구로부터 유도된 생장인자(PDGF) 등과 같은 국소적이거나 전체적인 생장에 영향을 주는 물질이 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서 특히 유용한 유도체는 변형체인데, 이 변형체는 탄소수 1~24인 아릴, 알킬, 알케닐, 알케노일, 히드록시알킬, 알케닐히드록시 또는 히드록시아실 사슬과 같은 다수, 종종은 3이상의, 무극성(소수성) 잔기로 치환되어 있는 흡착체 또는 적절하게는, 흡착체와 흡착질 사이의 다른 비쿨롱 상호력이 다수 형성되려고 하는 특성을 이용하는 반응에 의해서 (생)화학적으로, 생물학적으로, 또는 유전학적으로 변형된다. 고분자가 소수성화하는 경우에, 측쇄당 비교적 소수(1-8이거나 바람직하게는 1-4)의 탄소수가 바람직하다. 이와 연관되는 과학자료는 사슬 분자가 각기 다른 목적으로 어떻게 소수성화 하는지에 대한 충분한 정보를 제공해주고 있다. 이렇게 상세한 설명을 하는 목적은, 상기 흡착질의 강한 고정력은 이미 다른 공고물에 기재되어 있고(예를 들어, Torchilin, V. P.;Goldma cher, V. S.; Smirnov, V. N. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1978, 85: 983-990), 이는 종래기술의 특성 때문일 뿐만 아니라 비교적 미약한 가역적인 결합을 일으키기가 쉽기 때문에 배제된다.
본 기술에서, 양친매성 물질로 만들어진 막에 계면활성제를 첨가하는 것은 상기 막의 성질을 변형시킨다는 사실이 이미 공지되어 있다. 또한, 상기 성분을 대응하는 막으로 둘러싸인 축소된 액적내로 주입시킴으로써, 배리어내에 한정된 구멍을 통과하여 성분이 잘 전달되어 적당한 액매내에서 현탁되도록 하는데 사용될 수도 있다는 것이 이미 제안되어 있다. 이것은 이전의 출원 PCT/EP 91/01596, PCT/EP 96/04526에 매우 상세하게 기재되어 있다.
배리어 구멍을 관통하기 위한 목적으로, 매우 순응성이 있는 막이 있는 상기 포낭을 최적화하기 위해서 선택적으로 행해지는 방편은 사슬분자와 상기 막 사이의 결합율을 어느정도 제어하기 위해서 또는 제어가능하게 하기위해서 도입되는 공정과 일반적으로 일치시키지는 않는 것이다. 또한, 상기 포낭(및 포낭자체의 변형체)으로 둘러싸여 있는 상기 막 표면의 3차원적인 순응성은, 예를 들어 결합하는 고분자체가 있는 상기 표면이 고상-지지체일 경우의 결합 공정과 반드시 연관되는 것은 아니며, 따라서 이는 지지되지 않는 막의 3차원적인 순응성을 보유하지 않는다.
표면과 결합하는 고분자체의 결합공정을 제어하기 위해서 및/또는 가능케하기 위한 목적으로, 본 발명은 상기 기재한 두가지의 주요한 효과에 주목하고 있다.
첫번째 중요한 현상은 양친매성 분자, 말하자면 이미 언급한 고분자나 사슬분자와 같은 분자는 확장된 표면을 형성하려고 하는 특성이 있는 적어도 1종의 양친매성 물질 및 부유성 액매내에서 더 잘녹고 상기 양친매성 물질보다 확장된 표면을 형성하려고 하는 특성이 덜한 적어도 1종 이상의 물질로 이루어져 있는 확장된 표면과 더 잘 결합한다. 즉, 표면을 불안정하게 하는 특성이 있는 물질의 존재하에서는 표면용액 계면이, 상기 언급한 물질보다 더 용해성이 있는 표면을 불안정화하는 특성이 있는 제2물질의 존재하에서 덜 용해성이 있는 표면-형성물질로부터 형성되는 대응하는 물질과 비교해서 볼때, 흡착하는 고분자를 좀 더 끌어당긴다. 본 발명의 견지에서, 2차원내에서 상호 표면 자극이 일어나게 하거나, 그것이 확장시키는 경우에 표면이 늘어나게 된다고 추정하고 있다. 예를 들면, 포낭의 표면은 막 유연성, 20㎚에서 수백㎚사이에 평균 포낭 직경이 포함되는 경우에, 표면을 파동치게 하거나 동요시키면 상기와 같은 현상이 일어나게 된다. 적어도 어느 한방향으로도 상기 직경을 보유하지 않는 (혼합시킨) 지질 미셀은 상기 필요조건을 충족시키지 않는다; 그렇다면, 이러한 표면은 본 발명에서 사용된 의미로 확장된다고 간주되지는 않는다.
제2의, 보다 가용성이고, 표면을 불안정하게 하는 물질은 일반적으로 가장자리-활성 물질이나 계면활성제이다.
지금부터 설명하는 제2의 효과는, 전기적으로 하전된 고분자 또는 동등하게 하전된(예를 들면, 둘다 음극이거나 둘다 양극인 경우) 표면과 더 용이하게 그리고 보다 잘 결합하는 사슬 분자인데, 이런 경우 후자는 복합체이고, 그중 하나가 다른 하나보다 더 가용성이고, 덜 가용성인 물질로 형성되는 표면을 불안정화하는 특성이 있는 적어도 2종의 양친매성 물질로 이루어진다. 말하자면, 유사한 전하는 서로 반발하는 것이 일반적으로 알려진 사실이라 하더라도, 하전된 고분자나 사슬 분자는 표면의 유연성으로 인하여 필요한 분자내와 분자사이의 재배치가 가능하다면, 결합하는 물질 및 기질 표면이 음극이거나 결합공정에 관여하는 두가지 물질이 순 양극 전하를 보유하는 경우중의 어느 하나의 경우에 동등하게 하전된 표면과 더 잘 결합할 수 있다. 이러한 명백한 사실을 바탕으로, 음극으로 하전된 고분자가 양극으로 하전된 표면과 결합하는 경우에, 및 그 반대의 경우에 말하자면 정전기적인 인력의 도움을 받는 경우, 그 결합이 더 용이하고 더 강력해지리라고 추정해 오고 있다.
상기 기재한 두가지 효과는 제3 독립항에서 상세하게 정의한 대로 효과적으로 종합된다.
양친매성이고, 표면-형성물질을 선택하여 관여하는 물질의 시차 용해도의 측면에서 정의할 수 있는데, 이것은 고분자나 사슬분자가 결합하고, 대부분 액매에서 현탁된 포낭의 형태를 취하는 막이나 표면을 함께 형성한다. 일반적으로, 관여하는 물질사이의 용해도 차가 더욱더 커질 경우에 예를 들어, 결합하는 고분자의 표면인력이 상승할 경우에 본 발명의 효과가 더 현저해진다. 더 가용성이 있는 막성분은 가용성이 덜한 표면 형성성분보다 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상 가용성이 있어야 한다. 따라서. 인지질과 같은 양친매성의 표면-형성물질이 물과 같은 적당한 액매에서 계면활성제와 같은 제2물질과 결합하는 경우에는, 제2성분으로 인지질(양질의)보다 물에 더 잘 녹는 계면활성제를 사용하는 것이 훨씬 더 좋다.
한편, 표면곡률 측면에서 선택성을 정의할 수 있다. 수(액매로 사용됨)중에서 계면활성제(표면을 불안정하게하고, 더 가용성이 있는 제2 성분)와 혼합시킨 인지질(기본적인 표면-형성물질로 사용함)의 상기 언급한 예를 적용하여, 특징적인 표면곡률을 어느 정도 이루게 한다. 일반적으로 말해서, 상기 (평균)곡률은 의도한 표면으로 봉쇄된 영역의 역 평균반지름으로 정의된다. 일반적으로, 계면활성제를 첨가하는 것은 어떠한 계면활성제도 함유하고 있지않은 인지질 포낭의 곡률과 비교해서 혼합시킨 지질 포낭 표면의 곡률이 증가할 것으로 추정된다. 상기 계면활성제의 포화농도는 곡면 표면의 안정도를 나타내지는 않더라도, 최적의 계면활성제 농도는 일반적으로 상기 포화농도를 기준으로 해서 99% 이하에서 선택되고; 대부분 포화농도를 기준으로 해서 1~80몰%에서 선택되고, 보다 바람직하게는 포화농도를 기준으로 해서 10~60몰%에서 선택되고, 가장 바람직하게는 포화농도를 기준으로 해서 20~50몰%에서 선태된다.
한편, 각 시스템에서 포화농도까지 도달하는 것이 불가능한 경우에는, 포화농도가 계면활성제를 첨가한 후에는 포화에 도달하기 이전에 표면이 변형되기 때문에, 사용되는 계면활성제의 양은 용해되는 농도의 99% 미만이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 훨씬 더 작은 평균 표면으로 대체되는 확장된 표면에서 용해된 혼합시킨 지질응집체의 상기 농도와 같은 시스템내에서의 계면활성제의 최적농도는, 종종 흡착제 표면의 형태를 제한하는 농도를 기준으로 해서 1%~80%에 있고, 대부분은 10%~60%에 있고, 바람직하게는 20%~50%에 있다.
또한, 상기 표면의 평균곡률의 측면에서 간편하고, 실용적으로 유용하게 사용되는 물질의 혼합물을 정의할 수 있다. 7항에서 언급한대로, 상기 표면은 15㎚~5000㎚ 사이, 바람직하게는 30㎚~1000㎚ 사이, 더욱 바람직하게는 40㎚~300㎚ 사이, 그리고, 가장 바람직하게는 50㎚~150㎚ 사이값을 갖는 평균반지름에 대응하는 평균곡률(상기 표면으로 봉쇄된 영역의 역평균반지름으로 정의함)을 갖는다. 하지만, 반드시 흡착제 표면의 곡률이 항상 흡착제 막의 특성에 의해 결정되는 것이 아니라는 것을 강조해 둘 필요가 있다. 양친매성 물질의 선택적인 혼합물로부터 만들어진 본 발명의 고상으로 지지되는 표면을 사용할 경우에, 상기 표면의 평균곡률은 통상적으로는 고상 표면곡률에 의해 결정된다.
더욱이, 적어도 유사한 전하 사이의 결합력이 사용될 경우에, 표면과 밀접하게 연관된 하전된 성분의 상대적인 농도의 측면에서 본 발명을 정의하는 것이 가능하다. 상기 표면과 밀접하게 연관된 하전된 성분의 상대농도는 동시에 얻어지는 전 표면-형성 양친매성 물질의 농도를 기준으로 해서, 5몰%~100몰%에 있지만, 보다 바람직하게는 10몰%~80몰%에 있고, 가장 바람직하게는 20몰%~60몰%에 있다. 순 표면전하 밀도의 측면에서 표시하자면, 상기 표면은 0.05Cb/m2~0.5Cb/m2의 값, 보다 바람직하게는 0.075Cb/m2~0.4Cb/m2의 값, 및 가장 바람직하게는 0.01Cb/m2~ 0.35Cb/m2의 값으로 특징지어진다.
다가의 이온으로 이루어져 있는 종래의 전해물의 농도 및 성분를 선택하는 것이 바람직한데, 이는 바람직한 결합물상에서의 전하-전하 상호력의 긍적적인 효과를 최대화하기 위한 것이다. 일반적으로, I=0.001~I=1에 있는 벌크이온강도를 유지시켜 주고, 바람직하게는 I=0.02~I=0.5의 값, 훨씬 더 바람직하게는 I=0.1~ I=0.3의 벌크 이온강도를 유지시켜 준다.
본 발명의 또 다르게 효과적으로 사용되는 정의는 유체로 된 엷은 액적으로 둘러싸여 있는 막형태의 흡착제 표면이다. 상기 막은 종종 이분자 층이고, 액적을 현탁시키기 위해서 사용되는 (바람직하게는 수용성)액매내에서의 용해도 차가 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상의 용해도 차를 갖는 적어도 2종 또는 (자가) 응집하는 양친매성 물질의 형태로 이루어진다. 그러한 경우에, 막을 형성하는 물질의 선택성은 보다 가용성이 있는 물질의 동종-응집체의 평균 직경 또는 두가지 물질로 구성되는 이종-응집체의 직경이 단지 가용성이 덜한 물질을 함유하는 동종-응집체의 평균직경보다 작게함으로써 상세화 될 수 있다.
특히 상기 조성물은 주로 의학적인 목적으로 인체나 동물체에 적용되는 형태로 제조하기 위해서 사용되는데, 이러한 경우에 시스템내에서 표면을 형성할 수 있는 모든 양친매성 물질의 전함량은, 전체 건조중량을 기준으로 해서 0.01중량%~30중량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1중량%~15중량%가 좋고, 가장 바람직하게는 1중량%~ 10중량% 함량인 경우이다.
예를 들어, 확장된 표면을 형성할 수 있는 물질과 같은 표면-형성 또는 표면-지지 물질은 특히 상기 흡착체 표면이 이분자 층과 유사한 구조를 보유하는 경우에 생물학적으로 호환성이 있는 극성이나 비극성의 지질중에서 선택하여도 좋다. 상세하게 말하자면, 주요 표면-형성물질은 지질이나, 어떤 적당한 생물학적인 소스나 대응하는 합성된 지질이나 그밖에는 상기 지질의 변형체로부터 비롯된 복합지질인데, 이 중에서 바람직한 것은 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 이소프레노이드리피드, 스핑고리피드, 스테로이드, 또는 스테롤, 황이나 탄수화물-함유 지질, 또는 반-양자화한 유체 지방산과 같은 이분자 층을 형성할 수 있는 기타 지질, 포스파티딜콜린군이 바람직한데, 이러한 것에는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜산, 포스파티딜세린이 있고, 이외에도 스핑고미엘린이나 스핑고-포스포리피드, 글리코스핑고리피드(예를 들어, 세레브로사이드, 세라마이드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핑고플라스마로겐), 간글리오사이드 또는 다른 글리코리피드나, 디올레오일, 디리노레일, 디리노레노일, 디아라키도일, 디라우로일, 디미리스토일, 디팔미토일, 디스테아로일과 같은 합성된 지질이 바람직하고, 또는 대응하는 스핑코신 유도체 타입, 글리코리피드나 디아실, 디알케노일이나 디알킬지질이 있다.
이외에도, 표면을 불안정하게 하고, 더 가용성이 있는 물질로는 계면활성제가 효과적으로 사용되고 있고, 비이온성, 쯔비터이온, 음이온이나 양이온성 세제군이 유용하게 사용될 수도 있다; 특히, 긴사슬형태의 지방산이나 알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄염, 알킬설포네이트염, 콜레이트의 단일가염, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 또는 타우로콜레이트, 도데실-디메틸-아미노옥사이드와 같은 아실이나 알카노일-디메틸-아미노옥사이드, 알킬이나 알카노일-N-메틸글루카미드, N-알킬-N,N-디메틸글리신, 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트, N-아실-설포베타인, 노나에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르와 같은 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 노나에틸렌-도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르, 옥타에틸렌글리콜-이소트리데실 에테르와 같은 폴리에틸렌글리콜-이소아실 에테르, 옥타에틸렌도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르, 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(트윈 20) 또는 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(트윈 80)과 같은 폴리에틸렌글리콜-소르비탄-아실 에테르, 폴리히드록시에틸렌-라우릴, -미리스토일, -세틸스테아릴이나 -올레일 에테르와 폴리히드록시에티렌-4-나 6 또는 8이나 10 또는 12(브리즈 시리즈로) 등과 같은 폴리히드록시에틸렌-아실에테르 또는 대응하는 에스테르로는 폴리히드록시에틸렌-8-스테아레이트(미르지 45), -라우레이트나 -올레이트 타입이 있고, 폴리에톡시화한 캐스톨 오일 40(크레모퍼 EL)로는 소르비탄-모노라우레이트와 같은 소르비탄-모노알킬레이트(예를 들어, 아르라셀이나 스판), 데카노일-이나 도데카노일-N-메틸글루카미드와 같은 아실이나 알카노일-N-메틸글루카미드가 있고, 라우릴-이나 올레일-설페이트와 같은 알킬-설페이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 글로코데옥시콜레이트, 소듐 올레이트, 소듐 타우레이트, 소듐 엘라데이트, 소듐 리놀레이트, 소듐 라우레이트와 같은 지방산염, n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티딜산, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린과 같은 리소포스포리피드, 라우릴이나 올레일-글리세로-포스파티딜산과 같은 n-아실-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린, n-테트라데실-글리세로-포스파티딜산, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린, 대응하는 팔리티오에로일-, 엘라도일-, 바세닐-리소포스포리피드나 대응하는 단사슬의 포스포리피드나 그 밖에 표면-활성 폴리펩티드가 있다.
하전된 막성분의 농도는, 전체 막-형성성분의 양을 기준으로 해서 1-80몰%의 상대적인 범위에 있고, 바람직하게는 10-60몰%의 범위, 가장 바람직하게는 30-50몰%의 범위에 있을 것이다.
표면-지지 물질로 포스파티딜콜린 및/또는 포스파티딜글리세롤과, 리소포스파티딜산이나 메틸포스파티딜산, 리소포스파티딜글리세롤이나 리소포스파티딜콜린과 같은 리소포스포리피드를 선택하는 것이 바람직하고, 또는 부분적으로 N-메틸화한 리소포스파티딜에탄올아민, 콜레이트의 단가염, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트나 충분히 극성을 띠는 스테롤 유도체, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레이트, 팔미트올레이트, 엘라데이트나 일부의 다른 지방산염 및/또는 트윈, 미리즈나 브리즈형, 이외에도 트리톤, 지방질의 설포네이트나 지방질의 설포베타인, -N-글루카미드나 -소르비탄(아르라셀이나 스판) 계면활성제가 확장된 표면을 형성하는 능력이 떨어지는 물질로 선택된다.
상기 확장된 표면으로 둘러싸여 있는 영역의 평균 반지름으로는 15~5000㎚의 범위에 있지만, 바람직하게는 30~1000㎚의 범위에 있으며, 더욱 바람직하게는 40~300㎚의 범위에 있고, 가장 바람직하게는 50~150㎚의 범위에 있는 것이다.
일반적으로, 다른 두가지 물질(때에 따라, 3종, 4종, 5종 등과 결합하여 형성되는 확장된 표면과 결합하는 세번째 물질은 반복서브유닛를 갖는 분자로 구성되는데, 이것은 특히 사슬분자의 형태이다. 따라서, 상기 세번째 물질은 올리고머나 폴리머가 될 수 있다. 특히, 800 달톤이상, 바람직하게는 1000 달톤이상이고, 대부분의 경우에는 1500 달톤이상의 평균 분자량을 갖는 양친매성 고분자 물질이 될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질은 생물에서 채취한 물질이거나 그와 유사한 물질이고, 말하자면, 생체-성분과 같은 생물학적 활성을 갖는 것이 좋다.
상기 제3물질을, 특히 막과 액매 사이에 막의 통합부가 되는 계면(들)과 같은 막내로 삽입시킴으로써, 본 발명의 막과 유사한 확장된 표면과 결합하도록 하는 것이 바람직하다.
상기 언급한 물질(분자)나 대응하는 사슬분자의 함량은, 흡착제 표면의 질량을 기준으로 해서 일반적으로 0.001~50중량% 사이에 있다. 종종, 함량은 유사한 상대적인 단위를 사용하여 나타내는데 이것에 의해서, 흡착하는 (사슬)분자의 몰질량의 증가에 따라 특이적인 비가 감소하기도 하는데, 상기 함량은 0.1~35중량%의 범위에 있기도 하지만, 보다 바람직하게는 0.5~25중량%에 있고, 가장 바람직하게는 1~20중량%의 범위에 있다.
흡착하는 표면과 결합하려고 하는 특성이 있는 적어도 3개의 단편이나 관능기로 이루어져 있다면, 흡착하는 고분자 또는 사슬분자가 단백질이거나 단백질의 일부이기만 하면, 본 발명의 맥락에서 상기 물질들은 흡착하는 표면과 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 고분자나 사슬분자는 본연의 형태로 또는 약간의 적당한 화학적, 생화학적 또는 유전학적으로 변형된 후에, 적어도 표면을 끌어당기는 성질이 있는 DNA나 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드군에 속하는 양친매성물질로부터 만들어지는 확장된 표면과 결합하려는 경향이 있다.
확장된 표면과 결합하는 사슬분자는 예를 들어, 아드레노코르티코스타티쿰,-아드레노리티쿰, 안드로겐이나 안티안드로겐, 안티파라시티쿰, 아나보리쿰, 아나에스테티쿰이나 아날게시쿰, 아날에피쿰, 안티알레지쿰, 안티아르하이쓰미쿰, 안티알트로스크레로티쿰, 안티아스토마티쿰 및/또는 브론코스파스모리티쿰, 안티바이오티쿰, 안티드레프레씨붐 및/또는 안티사이코티쿰, 안티디아베티쿰, 안티에메티쿰, 안티에피레피쿰, 안티피브리노리티쿰, 안티코불시붐, 안티콜린에르지쿰, 효소, 보조효소 또는 대응하는 억제제, 안티히스타미니쿰, 안티하이퍼토니쿰, 약물 활성의 생물학적인 억제제, 안티히포토니쿰, 안티콜란트, 안티미코티쿰, 안티미아스테니쿰, 항 모르버스 파킨슨 또는 모르버스 알츠하이머 제제, 안티플로지스티쿰, 안티피레티쿰, 안티르레마티쿰, 안티셉티쿰, 호흡에 관여하는 아날레피쿰이나 호흡에 관여하는 자극제, 브론콜리티쿰, 카르디오토니쿰, 케모테라페티쿰, 관 확장제, 키토스타티쿰, 디우레티쿰, 강글리움 차단제, 글루코코르티코이드, 안티-플루 제제, 해모스타티쿰, 히프노티쿰, 면역 글로불린이나 그 단편 또는 기타 다른 면역학적으로 활성인 물질, 생체활성 탄수화물(유도체), 피임제, 안티-마이그레인 제제, 미네랄로코르티코이드, 몰핀-길항제, 근육이완제, 나르코티쿰, 뉴로테라푸티쿰, 뉴로렙티쿰, 신경전달제나 그 길항제의 일부, 펩티드(유도체), 옵탈미쿰, (파라)-심파티모미메티쿰 또는 (파라)심파티코리티쿰, 단백질(유도체), 건선/뉴로데르미티스 약물제, 미드리아티쿰, 정신자극제, 리놀로지쿰, 수면제나 그 길항제, 진정제, 스파스모리티쿰, 튜버쿨로스타티쿰, 유로로지쿰, 혈관수축제나 혈관확장제, 바이러스타티쿰이나 상처-치유 물질 또는 그러한 물질의 결합물과 같이, 다양한 생리학적인 기능 및 작용을 가지고 있을 수도 있다.
제3물질이 생장 촉진제일 경우에 본 발명은 또한 유용하게 활용될 수 있다.
보다 유용하게 사용되는 하기 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 제3물질에는, 예를 들어 항체, 키토킨, 림포킨, 케모킨 및 식물의 대응하는 활성부위, 박테리아, 바이러스, 파토겐이나 그 밖에는 면역항원이나 이것의 변형체, 효소나 보조효소 또는 다른 종류의 생체촉매와 같은 면역-변조물질; 인터 알리아 어드헤린, 항체, 카테닌, 셀렉틴, 카퍼론이나 그 일부와 같은 인지분자; 호르몬 및 특히 인슐린이 있다. 특히, 활성물질로 인슐린을 사용하는 경우에는, 본 발명의 조성물에 함유되는 인슐린의 양이 1~500 I.U.(인슐린/밀리리터), 보다 바람직하게는 20~400 I.U.인 것이, 가장 바람직하게는 50~250 I.U.이다. 약제의 형태로는 인간 재조합 인슐린 또는 휴머나이즈드 인슐린이 바람직하다.
본 발명의 기타 유용한 용도로는 인터류킨이나 인터페론 등과 같은 다양한 키토킨으로 사용하는 것과, 인체나 동물에 적합하게 사용될 수 있는 상기 인터류킨에는 IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12가 있고, 마찬가지 용도로 사용가능한 상기 인터페론에는 IF 알파, 베타 및 감마가 있는데, 여기에만 한정되는 것은 아니다.
상기 결합물내에 함유되는 인터류킨의 양은 주로 0.01㎎~20㎎(인터류킨/㎖)이지만, 특히 0.1~15㎎이며, 가장 바람직하게는 1~10㎎인데, 만약 필요하다면 최종적으로 희석시켜서 실용적으로 사용가능한 약제의 농도범위에 있게한다.
상기 결합물내에 함유되는 인터페론의 상대량은 주로 20중량%까지이고, 특히 0.1~15㎎(인터페론/㎖)이지만, 가장 바람직하게는 1~10㎎인데, 만약 필요하다면 최종적으로 희석시켜서 실용적으로 사용가능한 약제의 농도범위에 있게한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 제3활성 물질로 본 발명의 표면과 결합하는 신경생장 인자(NGF)에 대해서 설명한다. 상기 물질의 형태로는 인간 재조합 NGF가 바람직하고, 사용되는 최적 농도 범위는 현탁액상태로는 25㎎ 신경생장 인자(NGF)/㎖ 까지 또는 물질로는 25 상대중량%, 특히 0.1~15 상대중량% 단백질 및 가장 바람직하게는 1~10 상대중량%인데, 이것을 필요에 따라 사용전에 희석시켜서 사용해도 좋다.
면역 글로불린(Ig) 조절을 목적으로, 손상되지 않은 항체, 항체의 일부나 다른 일부의 생물학적으로 수용가능하고 활성인 그 변형체의 형태로 본 명세서상에 기재한 본 발명의 기술을 사용할 수 있다. 전체 지질에 대한 상대적인 양으로, 25㎎(면역 글로불린(Ig)/㎖ 현탁액)까지이나 25중량%까지의 면역 글로불린을 사용하고, 바람직하게는 0.1~15 상대중량% 단백질이고, 가장 바람직하게는 1~10 상대중량% 면역글로불린 양으로 사용하는 것이 좋다.
본 발명은 상기 생물학적, 화장품용으로 및/또는 약학적으로 활성인 물질과 같은 특히, 활성물질의 형태로 상기 정의한 결합물을 제조하는 방법을 기재하고 있는데, 그 방법은 적당한 액매에서 용해도 차가 있는 적어도 2종의 양친매성 물질을 선택하는 것으로 이루어지는데, 상기 양친매성 물질은 적어도 이것들이 특히 막형태로 상기 매질과 접촉하여 서로 결합될 경우에 확장된 표면을 형성할 수 있다. 상기 표면과의 결합체를 지지하고, 활성성분을 끌어당길 수 있는 물질과 결합하여 형성되는 확장된 표면을 사용하는 이러한 방법이 바람직한 선택기준이 되는데, 이때 전제조건은 다른 물질보다 그 자체상에 보다 확장된 표면을 형성하는 두가지 물질 및/또는 적당한 액매에서 용해도 차가 있는, 선택한 적어도 2개의 물질의 표면만으로부터 형성되는 표면보다 상기 성분에 대하여 상기 표면이 더 유인력이 있어야 한다는 것과, 적어도 결합될 경우에 상기 표면이 상기 액매와 접촉하는 특히 막형태의 표면인 확장된 표면을 형성할 수 있어야 한다는 것과, 두가지 물질의 결합물로 이루어지는 상기 표면이 좀 더 유인력이 있고, 다른 표면보다 보다 더 확장된 표면을 형성하는 두가지 물질로부터 형성되는 표면보다 활성성분과 더 잘 결합할 수 있어야한다는 것과, 마지막으로 상기 성분 뿐만아니라 표면이 순 전하를 띠고 있고, 그 성분과 표면이 평균적으로, 둘 다 음전하로 하전되거나 둘 다 양전하로 하전되어 있어야 하는 경우이다.
본 발명의 확장된 표면을 형성하는 바람직한 방법에는, 공정중에 형성되는 표면과 결합하게 되는 상기 물질분자의 존재하에서 여과, 압력변화나 기계적인 균질화, 흔들기, 교반하기, 혼합 또는 다른 통제되는 기계적인 파쇄와 같은 대응하는 물질의 혼합시키기 위한 기계적인 조작이 있다.
표면형성 물질의 선택적인 결합물이 적당한 지지하는 고체표면상에 흡착하거나, 다른 방식으로 상기 고체표면과 영구적으로 접촉할 경우, 동시에 서로 다르거나 다수의 물질을 첨가시킴으로써 액매와 접촉하게 되는데, 이것으로 적어도 하나의 후 표면-형성 공정이 상기 성분의 존재하에서 이루어지고, 연속적으로 고상-지지되는 표면과 결합하는 것이 바람직하다.
액매내에서 현탁시키거나 고상으로 지지되는 것에 상관없이, 흡착하는 표면이나 그것들의 전구체가 표면형성 분자를 실질적으로 혼합하는 공정으로 먼저 제조되고, 단, 하기 처리들이 만들어지는 표면을 손상시키지 않는다면, 필요에 따라 교반, 혼합이나 항온배양을 부수적으로 행하여 상기 결합하는 분자를 첨가하고 상기 표면에 결합되도록 하는 것이 좋다.
본 발명에서 특히 인체나 동식물의 손상되지 않은 피부조직을 통하여 다양한 성분을 비-침입형으로 하여, 적어도 1종의 양친매성 물질, 적어도 1종의 친수성 유체, 적어도 1종의 가장자리-활성물질이나 계면활성제 물질, 및 적어도 1종의 물질로 이루어지는 복합체내에서 물질분자와 결합할 수 있는 표면을 형성하도록 하는 제조방법이 바람직하다. 또한, 이러한 성분들은 비-침입형 성분에 적합한 형태로 되어, 이것으로 다른 종래에 사용되던 성분들이 바람직한 특성과 최종적인 제조시의 안정성을 도모하기 위하여 필요하고 적당한 양으로 첨가할 수도 있다.
상기 방법을 실행함에 있어서, 상기 선택된 성분들을 각각 혼합하고, 필요에 따라 용액내에 성분을 함께/용해한 다음, 결과적인 혼합물(들) 또는 용액(들)을 결합시켜, 최종적으로 바람직하게는 상기 기재한 기계적인 조작을 통하여 성분과 결합된 물질이나 표면의 형태가 되도록 한다.
본 발명에서 기재한 목적에 적당한 양친매성 물질은 그대로 사용하거나, 물과 같은 생리학적으로 호환성이 있는 극성 유체에 용해시켜 사용하기도 하고, 상기 용매와 혼합시키거나 적어도 1종의 가장자리-활성 물질이나 계면활성제로 바람직하게 이루어지는 극성 용액과 함께 용매화-조절 성분내에서 용해될 수도 있다.
성분-유도 표면을 형성하는 다른 바람직한 방법으로는 유체상으로 물질을 첨가하는 것이다. 또 다른 방법으로는 역상(亦相)으로부터 증발시키는 것, 주입이나 투석 또는 흔들기, 교반, 동요시킴, 균일화하기, 초음파처리(예를 들어, 초음파에 노출시키는 것), 전단, 냉동 및 해동 또는 간편하고 적당한 구동압하에서 여과하는 것과 같은 기계적인 스트레스를 가해주는 것이 있다. 여과시에, 여재로는 그 여재의 크기가 0.01~0.8㎛, 바람직하게는 0.02~0.3㎛, 가장 바람직하게는 0.05~0.15㎛인 것을 선택하는 것이 좋다. 다양한 필터를 연속적으로 사용하거나, 바람직한 표면 형성 효과를 얻고, 제조시의 속도나 용이함을 최대화하기 위한 목적으로 적절하게 병렬하여 사용하기도 한다.
흡착하는 표면을 형성시킨 후에, 상기 물질이나 캐리어를 적어도 부분적으로 결합시키는 것이 바람직하다.
실용적인 목적으로 그 형태로 사용하기 전에, 물질분자와 결합하는 표면사이에 즉시 결합체를 형성시킬 수가 있다. 그리고 나서, 적당한 농축액이나 동결건조체로 시작할 수도 있다.
본 발명은 특히 약물의 전달이나 다른 종류의 의학이나 생물학적인 응용을 목적을 위한 성분-캐리어의 제조방법을 기재하고 있다. 따라서, 베리어 공극 투과 측면에서 또한 사용할 수 있다; 이러한 경우, 베리어내에서 상기 공극을 통하여 매우 잘 변형될 수 있는 액적에 의해서 운반되는데, 이때 상기 베리어 공극의 평균 직경은 액적이나 포낭의 평균직경보다 작은, 훨씬 더 작게 되도록 하는, 이미 공지된 기술로 축소된 액적으로 둘러싸인 양친매성 분자에 의해서 형성되는 막형태로 결합하는 표면을 제공하는 것이 좋다. 하지만, 상기 설명한 대로 하기 두가지의 특성과 같이, 그리고 종종 실제적으로 공극 통과에 대한 포낭 막 순응성으로 정의되는 최적의 조성물 특성과는 다르다고 하더라도, 이것이 최적의 결합특성과 최적의 막 순응성 사이에서 이루어지도록 하는 것이 필요하다.
또한, 본 발명의 결합물은 생명공학 분야, 유전자 증식 뿐만 아니라 공정이나 진단학적인 목적으로 하는 분리 기술에 사용된다. 여기서, 효소 공정 및 촉매반응을 포함한 기타의 용도에 있어서도 결합하는 표면이 막과 같은 포낭의 형태를 취하는 것보다 오히려 고체를 지지할 수도 있다는 측면에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 고상 지지체 상에 이러한 종류의 표면과 결합하는 활성 분자를 의도적으로 최대한 고정시키기 위해서 본 발명의 표면은 고상 지지체에 고정되는데, 그런 후에는 간단하게 처리하여 고정, 분리, 농축시키는 등의 과정을 행한다. 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드나 폴리사카라이드 및/또는 표면이 결합된 상태에서 상기 분자와 관계되는 촉매반응 공정에서 사슬분자와 같은 적어도 부분적으로 양친매성인 표면-형성분자를 안정화할 수 있다. 따라서, 촉매로 활성화되고, 대단히 잘 결합하거나 선택적인 반응성 있는 고분자로 채워진 컬럼을 제조하기 위해서 본 발명의 기술을 사용할 수도 있다고 사료된다. 이것의 한 예로, 용액내에서, 비-공유결합으로 결합되어, 고상 지지체로 둘러싸인 활성분자가 있는 고체로 지지되는 표면으로 구성되고, 상기 용액이 부동의 고분자를 통과하면서 상기 활성 고분자와의 반응이 일어나는 컬럼을 통하여 적당한 쌍-반응체(들)을 통과함으로써 행해지는 화학적 반응이다. 또 다른 예에서는, 용액으로부터 분리되는 적어도 일부의 분자용액은 컬럼에 충전되거나, 목적분자가 기질 표면과 결합하여 유체를 분리시키기 위해서 고체로 지지된 흡착제 표면의 현탁액 및 원심분리, 침전, 부유(교반과 침전으로나, 침전으로만), 전자기적인 흡착제 입자분리 등 이외의 적당한 방법으로 고체 입자와 접촉하도록 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 용도는 적당한 양친매성 물질과 결합시킴으로써 상기 표면과 결합하는 분자와 본 발명에 따라 형성된 복합체의 순응성있는 표면 사이에 결합이나 분리의 가역성 및/또는 운동성을 제어에 관한 것인데, 이것으로 더 큰 표면전하 밀도 및/또는 더 커진 표면연성 및/또는 더 큰 표면결점 밀도로 하여금 결합이 가속화할 수 있다. 따라서, 대응하는 환원력이 결합율을 저하하는데, 또한 부분적이거나 완전한 분리를 유도하는데 사용될 수도 있다.
형성온도 및 저장온도는 좀처럼 0~95℃의 범위밖으로 벗어나지 않는다. 다양한 흥미로운 성분, 특히 다양한 종류의 고분자가 온도에 대하여 민감하기 때문에, 70℃ 미만의 온도, 특히 45℃ 미만의 온도가 바람직하다. 비-수용성 용매, 크리오나 열-안정제를 사용함으로써 상기 해당온도 이외의 온도 범위에서도 사용이 가능해진다. 일반적으로, 대부분은 실온이나 생리학적인 온도에서 행해지지만, 그 이외의 다른 온도 범위에서 사용하는 것도 가능하고 이것은 특정한 형태에 적합할 수도 있다. 또 다른 실시예에서는 보다 더 높은 온도에서 상기 흡착하는 표면 순응성의 유지력이 이것에 대한 가능성있는 이유가 된다; 저온에서 상기 물질을 활성형태로 유지해 준다.
특징적인 형태라도 대부분의 민감한 시스템 성분에 상당히 순응적이다. 저온(약, 4℃)에서 저장하는 것은 비활성기체(예를 들어, 질소)를 사용하는 것만큼 효율적이다.
흡착제나 흡착질에 대한 특정한 과정을 사용하는 경우에 상기 기재한 형태화가 행해질 수 있으나, 어느 것이든지 다 중요하다(포스포리피드를 사용하여 만들어진 흡착제는 "Liposome"(Gregoriadis, G., ed., CRC Press, Boca Raton, FI., Vols 1-3, 1987); 'Liposomes as drug carriers' Gregoriadis, G,. ed., John Wiley ＆ Sons, New York, 1988; 'Liposomes, A Practical Approach', New, R., Oxford-Press, 1989)에 기재되어 있다. 상기 물질은 또한 희석되거나 농축될 수도 있다(예를 들어, 초 원심분리나 한외여과에 의함).
상기 물질을 사용할 때나 그 전에, 상기 조합체의 화학적 또는 생물학적인 안정성, 고분자 결합력이나 그것의 역전, 분리/결합시의 운동성을 증가시키기 위해, 그리고 조절과 혼합을 용이하게 하기 위해서 첨가제를 도입할 수 있다.
흥미로운 첨가제에는 다양한 시스템을 최적화하는 용매(시스템의 성질을 바람직하게하거나 이를 유지시킴으로써 한계를 초과시키지 않는 농도인, 화학안정제(예를 들어, 항산화제 및 기타 스캐빈저(scavenger), 완충액등이 있음), 흡착 촉진제, 생물학적으로 활성인 보조분자(예를 들어, 살균제, 바이러스 증식 억제제) 등이 있다.
상기 언급한 목적으로 사용되기에 적당한 용매에는 치환되거나 치환되지 않은, 예를 들어 수소화한, 지방족, 고리형지방족, 방향족, 또는 벤졸, 톨루올, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄이나 클로로포름과 같은 방향족-지방족 탄수화물, 메탄올이나 에탄올, 프로판올, 에틸렌글리콜, 프로판디올, 글리세롤, 에리쓰리톨과 같은 알콜, 아세트산과 같은 알칸탄소 산에스테르, 디에틸에테르와 같은 산알킬에스테르, 디옥산 또는 테트라하이드로퓨란 등과 이들의 혼합물이 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.
그것을 제조한 후나 그것을 사용하기 전에 흡착제/흡착질 혼합물의 pH 값을 조절하는 것이 또한 편리할 수도 있다. 이렇게 하는 것은 각 시스템 성분 및/또는 결합체의 감퇴를 저지한다. 결과적인 혼합물의 생물학적인 활성이나 생리학적인 호환성을 증가시킬 수도 있다. 비보나 비트로 상태에서 생물학 분야에 응용시킬 목적으로 혼합물을 중화시키기 위해서, 응용분야의 종류나 목적에 따라서 다르지만, 3-12의 pH값, 더욱 바람직하게는 5~9의 pH값, 가장 바람직하게는 6~8의 pH값의 범위에 있는 생물학적으로 적합한 산이나 염기가 사용된다. 예를 들어, 생리학적으로 수용가능한 산, 염산, 황산이나 인산과 같은 미네랄산의 희석시킨 수용액 및 예를 들어 아세트산 등의 카르복실알칸산과 같은 유기성산이 있다. 생리학적으로 수용가능한 염기로는 예를 들어 희석시킨 수산화나트륨, 적당하게 이온화된 인산 등이 있다.
간략하게 언급하거나, 자세하게 언급했던 지질 및 계면활성제가 공지되어 있다. 고분자와 결합하여 적당한 응집체를 형성하는 지질 및 인지질은 예를 들어 'Phospholipids Handbook'(Cevc, G., ed., Marcel Dekker, New York, 1993), 'An Introduction to the Chemistry and Biochemistry of Fatty acids and Their Glycerids'(Gunstone, F. D., ed.) 및 참고문헌에 기재되어 있다. 화학적인 계면활성제에 관한 보고서가 'Mc Cutcheon's, Emulsifiers ＆ Detergents'(Manufacturing Confectioner Publishing Co.) 및 다른 관련된 참고문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Hadbook of Industrial Surfactants, M. Ash ＆ I. Ash, eds., Gower, 1993). 이와 연관된 활성제의 조합체가 'Deutsches Arzneibuch', The British Pharmaceutical Guide, European Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia, The United States Pharmacopoeia 등에 기재되어 있다. 관련되는 고분자는 제조업체의 카탈로그, 적당한 과학 정기 간행물 및 산업이나 연구를 목적으로 하는 특정한 참고문헌에 기재되어 있다.
본 발명을 몇몇의 선택된 폴리펩티드/단백질 및 인지질/계면활성제 혼합물을 예로 들어, 결합체의 일부 관련되어 있는 특성을 기재한다.
복합체 포낭상에 있는 인슐린의 결합력을 측정하기 위한 목적으로 하기 실험들을 행하였다. 다른 조성물의 포낭조성물을 사용하였다. 변형체에는 포낭상으로/내로 순전하를 도입시킨 다양한 계면활성제와 지질, 다양한 지질/세제 비, 다른 전체 지질 함량 및 다양한 종류와 농도의 인슐린이 있다.
제1실시예로써, 인지질/생체 계면활성제로 이루어지는 복합체 지질 포낭을 결합이 최대로 되게 하는 다양한 단백질/지질 비에서 인슐린에 결합시켰다. 종래부터 사용되어 오던, 단일성분의 포낭(리포솜)을 참고로 사용하였다.
실시예 1~27
매우 잘 변형될 수 있고, 유연성이 있는 포낭(트랜스퍼좀TM):
출발 현탁액:
대두콩으로부터 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린,
125.6㎎ 나트륨 콜레이트, 및
pH 7.1의 9㎖ 인산염 완충액으로 이루어진
10중량% 함량의 전체 지질(TL).
최종 현탁액 A
상기 지질 및
0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4㎎ 인슐린/100㎎ TL로 이루어진
5중량% 함량의 TL
필요한 농도로 희석하기 위해서, 인슐린 원액(4㎎/㎖ 아크트라피드TM노보-노르디스크사 제품)를 하기 완충액과 혼합하였다.
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 완충액 인슐린액 (4㎎/㎖;아크트라피드)
4 -- 3㎖
3 0.75㎖ 2.25㎖
2 1.5㎖ 1.5㎖
1 2.25㎖ 0.75㎖
0.5 2.265㎖ 0.375㎖
0.1 2.925㎖ 0.075㎖
최종 현탁액 A를 2.5㎖의 출발 지질현탁액(10% TL) 및 2.5㎖의 적당한 인슐린 희석액을 혼합시켜서 제조하였다.
최종 현탁액B:
상기 지질 및
4, 5, 6.67, 10, 20, 40, 및 80(㎎인슐린/100㎎ TL)로 이루어지는 5중량%~0.25중량%의 TL 함량.
다양한 인슐린/지질 비율을 얻기위해서, 하기 피펫팅 표를 참고로 하였다:
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 얻어진 최종 TL (중량%) 출발 현탁액 (10% 지질) 완충액
4 5 3㎖ --
5 4 2.4㎖ 0.6㎖
6.67 3 1.8㎖ 1.2㎖
10 2 1.2㎖ 1.8㎖
20 1 0.6㎖ 2.4㎖
40 0.5 0.3㎖ 2.7㎖
80 0.25 0.15㎖ 2.85㎖
2.5㎖ 아크트라피드 HM(4㎎/㎖ 인슐린)과 2.5㎖의 적당하게 희석시킨 지질 현탁액을 혼합하여 최종 현탁액B를 제조하였다.
최종 현탁액C
상기 기질 및
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 및 60㎎ 인슐린/100㎎ TL로 이루어지는 2.5중량%~0.125중량%의 TL 함량.
인용된 인슐린/지질 비율을 얻기 위해서, 하기 피펫팅 표를 참고로 하였다:
단위:(㎎인슐린/100㎎지질) 최종 TL 농도 (중량%) 출발지질 현탁액, 희석한 5중량% 지질 인슐린액(4㎎/㎖;아크트라피드) 완충액
4 2.5 2.5㎖ 1.25㎖ 1.25㎖
5 2.5 2.5㎖ 1.563㎖ 0.938㎖
6 2.5 2.5㎖ 1.875㎖ 0.625㎖
7 2.5 2.5㎖ 2.188㎖ 0.313㎖
8 2.5 2.5㎖ 2.5㎖ --
9 2.2 2.222㎖ 2.5㎖ 0.278㎖
10 2 2㎖ 2.5㎖ 0.5㎖
15 1.3 1.333㎖ 2.5㎖ 1.167㎖
20 1 1㎖ 2.5㎖ 1.5㎖
30 0.67 0.667㎖ 2.5㎖ 1.833㎖
40 0.5 0.5㎖ 2.5㎖ 2㎖
50 0.4 0.4㎖ 2.5㎖ 2.1㎖
80 0.25 0.25㎖ 2.5㎖ 2.25㎖
160 0.125 0.125㎖ 2.5㎖ 2.375㎖
테스트 시리즈 C에서, 완충액으로 현탁액을 1:1의 부피비로 희석하고, 여과하여 동결건조 과정을 하기대로 행하여, 5% 포낭 현탁액을 10%의 원현탁액으로부터 조제하였다.
흡착제/흡착질 혼합물의 조제
통상적인 방법으로 완충액을 조제하고, 0.2㎛의 살균필터를 통과시켜 여과하였다(이후에도 사용하기 위해서, 상기 액을 유리용기에 저장하였다.). 살균된 유리용기내에 있는 완충액에서 지질 혼합물을 현탁하고, 실온에서 2일동안 자기 교반기로 교반하였다. 그리고 나서, 상기 현탁액을 400㎚, 100㎚, 및 50㎚의 미세한 공극 사이즈의 에칭된 트랙 폴리카보네이트 막(뉴클레오공극형)을 통과시켜 연속적으로 압출성형하였다. 0.6MPa~0.8MPa의 구동압으로, 각 회마다 3회씩 통과시켰다. 이렇게 하여 만들어진 포낭현탁액을 -70℃~+50℃의 각 온도에서 5회 동결건조하였다. 바람직한 포낭 크기를 얻기위해서, 상기 현탁액을 재-압출성형하여, 0.7MPa에서 100㎚의 필터를 4회 통과시켰다. 마지막 단계로, 변형성이 매우 큰 포낭을 200㎚의 공극의 살균된 주사형필터를 통과시켜 여과시킴으로써 멸균하였다. 이후에도 사용하기 위해서 포낭을 4℃의 살균시킨 폴리에틸렌 용기에 저장하였다.
pI=5.4 이상의 양으로 하전된 아미노산에 대하여 음으로 하전된 아미노산이 과도하게 많기 때문에, 각 인슐린 분자는 중성의 pH 영역에서 순전하를 수반한다.
시판되는 인슐린액(노보-노르디스크사 제품인 아크트라피드TM)을 이것을 포함한 결합체의 연구에 다수 사용하였다. 결과적으로, 출발 단백질액은 4㎎ 인슐린/㎖ 및 3㎎ m-크레졸/㎖을 함유하였다. 상기 용액의 적당량을 흡착제 포낭의 현탁액에 첨가시켰더니, 다양한 인슐린/지질 비가 얻어졌다. 실험에 따라, 실온에서 결과적인 캐리어/인슐린 혼합물을 완전히 혼합시키고, 적어도 2시간 동안 항온배양하였다.
테스트 시리즈 A에서, 아크트로피드로 상기 포낭현탁원액을 희석하여 50㎎ TL/㎖ 농도 및 다양한 단백질/지질 비율을 갖는 최종적인 지질을 얻었다. 테스트 시리즈 B에서, 인슐린/TL 비율에 따라서 2.5~40㎎/㎖의 범위에서 최종지질 농도가 변화하였다. 테스트 시리즈 C에서, 1.25~25㎎/㎖ 범위에서 최종지질 농도가 변화하였다. 비교예로, 지질 현탁액 대신에 완충액으로 사용하여 유사한 현탁액 시리즈를 조제하였다.
4㎖의 인슐린/포낭 혼합물에 대하여 각각 시험 측정을 행하였다. 2시간 후에, 얼마나 많은 양의 인슐린이 지질 포낭과 결합하는지, 그리고 수용성 서브-상내에는 얼마나 많은 양의 인슐린이 결합되지 않고 남아있는 지를 측정하기 위해서 수용성 서브-상으로부터 지질 포낭을 분리하였다. 이러한 목적으로, 차단력(cut-off)이 100.000 Da인 CENTRISART I-원심분리관을 사용하였다. 현탁액을 함유하고 있는 인슐린 1㎖를 각각 희석시키는데 3가지 관을 사용하고, 3시간(T=10℃)동안 2000g에서 원심분리하였다. 결과적으로 인슐린 농도, 및 용해시킨 세제와 함께 임의의 깨끗한 계면활성제(단지, 완충액, 인슐린 및 일부의 혼합된 지질(포스파티딜콜린/콜레이트를 함유하고 있다고 추정됨) 마이셀을 측정하였다. 오염된 계면활성제는 이것이 CENTRISART I-필터내의 결함부를 통과할때 지질 포낭을 오염시킨다는 것이 증명되었기 때문에 제거해주었다. 여기서 언급된 모든 인슐린표준 측정법은 HPLC 공정을 사용하여 행하였다. 측정은 2회로 행하였다.
포지티브 콘트롤로 원희석액을 사용하였고, 네거티브 콘트롤에서는 시험기에 흡착하는 비-특이적인 인슐린을 정량하였다. 상기 비-특이적인 결합을 수정한 후에, 계면활성제의 출발 및 최종 인슐린 농도차를 측정하였다. 상기 "유실된" 인슐린은 아마도 포낭과 결합했을 거라고 추정하고, 이것을 절대적이거나 상대적인 단위로 표시하였다.
상기 실험의 결과를 도1에 표시하였다. 이것으로, 6㎎/100㎎ TL의 인슐린/지질 비율, 첨가된 단백질의 80~90% 미만의 양으로 상기 포낭과 결합한다는 것을 나타낸다. 좀 더 높은 인슐린/지질 비율일때, 단백질-표면결합의 상대적인 효율이 감소하여, 2/5(40㎎/100㎎)로 희석시킨 것에 대해서 단지 5%의 결합률에 이르게 된다. 말하자면, 매우 희석이 많이 되고 단백질/지질의 비율이 큰 40㎎의 인슐린의 각각 2㎎은 변형성이 큰 포낭의 형태로 100㎎의 지질과 결합하게 된다.
항온배양 시간을 약간 연장하는 것이나 첨가된 현탁액의 농도를 증가시키는 것은 상기 현상을 개선시킨다(도2 및 3).
실시예 28~45
통상적으로 사용되는 포낭(리포솜), 출발 현탁액:
대두에서 추출한 1g 포스파티딜콜린
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액 A
상기 지질 및
0.1, 0.5, 1. 2. 3. 4㎎인슐린/100㎎TL
(0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 상대중량%)로 이루어지는 5중량%의 TL 함량..
최종 현탁액B
상기 지질 및
4, 5, 6.67, 1., 20, 40, 및 80㎎인슐린/100㎎ TL로 이루어지는 5~0.25중량%의 TL 함량.
실시예 1~27에 기재한 대로 출발 지질 현탁액을 제조하였다. 하지만, 충분히 작은 리포솜을 조제하여 충분하게 단분산시켜 얻기 위해서, 100㎚의 필터를 통과하여 6회 압출성형을 더 행한다.
시험하는 리포솜과 결합하는 인슐린은 매우 적은 것으로 나타났다. 첨가된 약물의 단 2~5%만이 표준 지질 포낭과 4㎎/㎖~100㎎/㎖-희석범위내에서 결합한다(이에 관한 자료는 도시되지 않음).
변형성이 큰 복합체 포낭 조성물에 대한 희석된 현탁액의 효과를 검사하고, 실험적으로 배제하기 위해서, 하기 실험을 행하였다.
실시예 46~59:
출발 현탁액:
대두로부터 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트(10부피% TL 함량으로 주어짐)
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
최종 현탁액 조성물은 최종 지질 농도가 감소하는 실시예1~27의 시리즈 B 및 C와 같다.
측정된 인슐린/지질 비율은 하기와 같다: 4, 8, 10, 20, 40, 80, 160㎎ 인슐린/100㎎ TL
희석액이 10mM의 콜레이트를 함유하는 아크트라피드 및/또는 5~20mM 콜레이트를 함유하는 콜레이트(제어와 시험용 샘플용)중의 어느 하나로 조제하는 것을 제외하고는 상기 기재한 인슐린/지질 비율에 대하여 실시예 1~27에서 주어진 설명에 부합하도록 포낭 현탁액을 조제하였다. 이렇게 하여, 모든 샘플내에 있는 최종 콜레이트 농도는 본 세제의 CMC에 근접한 값인 5mM가 되었는데, 이렇게 함으로써 희석시킨 후에 포낭막으로부터 콜레이트가 유리되는 것을 방지된다.
포낭으로부터 콜레이트가 유실되는 것을 방지함으로 해서, 본래의 활성 포낭 조성물 뿐만 아니라, 포낭 표면의 평균전하 밀도가 유지된다. 이러한 개선된 효과는 결합시에도 반영된다.
이러한 연속된 시험의 실시예에 있어서, 피펫팅 공정 전체에 걸쳐서 콜레이트의 농도가 5mM, 특히 전체 지질농도가 더 낮게 되도록 유지시키면 부주의한 포낭의 용해화가 방지된다는 사실에 주목하였다.
첨가되는 인슐린의 단백질/지질 중량비가 첨가되는 인슐린의 80~90% 사이의 10%까지가 지질 포낭 표면과 결합하는 것에 대한 결과가 나타나 있다(도4). 이것은 흡착제-흡착질 결합은 거의 완벽하고, 단백질이 결합하는 효율이 대단히 크다는 것을 의미한다. 단백질과 결합하는 지질 퍼센트 양은 단백질/지질 비율이 증가함에 따라 서서히 감소하여, 1.6㎎인슐린/1㎎지질에서 7%에 달한다.
캐리어와 결합하는 인슐린의 절대량은 약 0.4㎎인슐린/1㎎ 지질에서 최대치에 이르는데, 여기서 첨가된 40㎎의 인슐린중의 15.6㎎은 변형성이 큰 포낭의 형태로 100㎎의 전체지질과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 최대 생산량은 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질의 상대비에서 얻어지지만, 여기서 첨가된 20㎎중 14㎎은 혼합된 지질 포낭과 결합하는 것으로 측정된다. 이러한 결과가 도4에 도시되어 있다.
콜레이트 분자가 완충액이나 인슐린액이 있는 혼합된 지질 포낭 현탁액에 도입될 경우에 유사한 결과가 얻어진다.
실시예 60~71:
출발 현탁액(20% TL):
대두에서 추출한 1099.7㎎의 포스파티딜콜린
900.3㎎의 트윈 80
pH7.4의 8㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
상기 지질 혼합물 및
2, 4, 8, 10, 20 및 40㎎인슐린/100㎎ TL로 이루어짐.
교반시간이 7일로 연장되는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예1~27에 기재한 것과 동일하게 하여 포낭 현탁액을 조제하였다. 아크트라피드TM(노보-노르디스크)는 모든 경우에 있어서 인슐린을 흡착원로 사용되었다.
인슐린 농도를 4㎎/㎖로 고정시키는데 사용할 수 있게 하기 위해서, 8㎎/㎖~100㎎/㎖로 최종 전체 지질농도가 변화하는 인슐린/지질 비율로 조제하였다. 비교예로써(희석효과가 존재할 수 있다고 간주함), 유사한 조성의 포낭을 10㎎/㎖(1중량%)로 최종 전체 지질 농도가 고정되도록하는 것을 제외하고 다양한 인슐린/지질 비율로 조제하였다. 단백질-포낭 결합시간을 3시간으로 정하였다.
포낭과 결합한 단백질로부터 비-결합하는 인슐린을 분리하는데 소요되는 원심분리시간은 6시간이었다(1000g에서). 기타의 다른 실험에 관계된 세부사항은 제1 시험 시리즈에서와 동일하다(실시예1~27).
비이온성 계면활성제(트윈-80)을 함유하는 막과 결합하는 인슐린양이 일반적으로 하전된(콜레이트를 함유하는) 막과 결합하는 인슐린양보다 적다는 사실과는 상관없이, 양 흡착제 시스템의 정량적인 특성은 유사하다(실시예1~27을 참고).
0.04㎎인슐린/1㎎지질의 상대적인 인슐린/지질비일때, 막과 결합하는 인슐린의 양은 약 50%이다. 최대로 결합할 경우에 상대적인 농도 0.2㎎인슐린/1㎎지질은 전체적으로 첨가되는 20㎎의 인슐린의 결합하는 단 5.2㎎의 단백질에 대응한다. 말하자면, 이러한 시험 시리즈에서 최대 생산량을 제공하는 절대적인 최적화는 0.04㎎인슐린/1㎎지질에서 얻어진다.
실시예72~76:
출발 현탁액(10% TL):
대두로부터 추출한 74.4㎎ 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액(-7.4; 이러한 완충액으로, 상기 출발 현탁액의 pH는 7.3~7.6의 범위에 있다. 바람직한 pH 범위는 7.3~7.4이기 때문에, 계면활성제로 콜레이트가 있는 하기 테스트 시리즈에서는 pH가 7.1인 완충액을 사용하였다.)
인슐린 A:
pH 7.4인 인산염 완충액 4㎎/㎖, 8㎎/㎖, 10㎎/㎖, 20㎎/㎖
30㎕ HCL(1M)/㎖ 용해된 건조 인슐린, 및
30㎕ 1M NaOH/1㎖ 용액
인슐린B:
pH 7.4인 4㎎ 아크트라피드/㎖ 인산염 완충액
인슐린-포낭 혼합물
5중량%의 전체지질 농도
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 건조 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 상대중량%)
유사한 막 조성물을 사용하여 실시예1~27에서 기재한 대로 포낭현탁액을 조제하였다. 하지만, 최종지질의 농도가 상당히 높은 건조 인슐린을 사용하여 인슐린/지질의 비율을 높이기 위해서는, 시판되는 용액에 사용되는 것보다 더 높은 농도에서 용해시킨다.
동결건조된 인간 재조합 인슐린을 pH 7.4인 인산염 완충액에서 쉽게 용해되지 않는다. 인슐린 용액을 조제하기 위해서, 아크트라피드TM과 유사한 건조, 동결건조한 인간 재조합 인슐린 "분말"을 먼저 2㎖의 완충액을 첨가하고, 완전히 와동시켰다. 일시적으로 산성화한(60㎕의 HCL을 첨가함) 후에, 인슐린의 용해성이 충분하게 증가하여 맑은 용액을 만들고, 60㎕의 NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 다시 돌아가도록 하는데, 여기서 인슐린은 안정해지고(헥사머로), 해체/결합이 방지된다. pH 7.4인 완충액을 2㎖에 8㎎의 인슐린을 바로 용해시켜서 첨가할 용액을 조제하였다.
포낭 현탁액(2㎖)와 인슐린액-A(2㎖)를 완전히 혼합하고, 상기 주어진 인슐린/지질 비로 12시간동안 항온배양하였다. 모든 경우에 있어서, 최종 전체 지질 농도는 50㎎/㎖였다. 참고로, 용액B를 사용하였다. 나머지 실험은 실시예1~27에 기재된 대로 행하였다.
결과:
결합하는 인슐린(이것은 일시적으로 단량체 용액이 되기도함)은 실시예 1~27의 아크트라피드의 인슐린으로 측정한 것과 비교할 수 있는 건조 단백질 분말(이것은 적어도 일시적으로 단량체 용액이 되기도함)로부터 만들어졌다. 50㎎/㎖ 농도에서 지질 포낭 현탁액과 다량의 인슐린이 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 최대치로 결합하는 인슐린은 첨가되는 약 16㎎의 인슐린이 혼합된 지질막과 결합하는, 단백질/지질의 중량비가 1/5가 되는 값 근방에서 발견된다.
이와 유사한 단백질 농도에서, 용해된 ad hoc와 시판되는 인슐린용액을 가지고 측정하면 동일한 결과가 얻어진다.
하기 연계된 실험에서, 다양하게 하전되거나 하전되지 않은, 유체, 혼합된 지질막에 흡착한 인슐린을 조제하였다.
실시예 77-92:
종래의 포낭, SPC 리포솜, 중성상태(TL=10중량%):
순전하가 없고, 이것은 쯔비터이온성 인지질로만 이루어짐
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액.
종래의 포낭, 하전된 SPC/SPG 리포솜(TL=10중량%):
25몰%의 음이온성 포스파티딜글리세롤의 순 음전하
대두에서 추출한 750㎎의 포스파티딜콜린
대두에서 추출한 250㎎의 포스파티딜글리세롤
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
대단히 잘 변형될 수 있는 중성상태의 포낭(TL=10중량%):
순전하가 없고, 쯔비터이온성 인지질과 비이온성 계면활성제
대두에서 추출한 550㎎ 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭A(TL=10중량%):
25몰%의 음이온성 콜레이트로 인해서 순전하가 없음.
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액.
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭B(TL=10중량%):
25몰%(PC의 상대량)의 음이온성 포스파티딜글리세롤로 인해서 순 음전하로 하전됨.
대두에서 추출한 포스파티딜콜린 284.3㎎
대두에서 추출한 포스파티딜글리세롤 94.8㎎
620.9㎎ 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
인슐린-포낭 혼합물은 각각
50, 25, 10, 5㎎전체 지질/㎖ 최종현탁액
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 단백질의 상대중량%)
모든 포낭을 상기 기재한 대로 조제하였다. 트윈-함유 포낭을 7일동안 교반하였다. 상기 콜레이트-함유 포낭 및 리포솜은 2일 동안 교반하였다. 아크트라피드 100 HMTM(노보-노르디스크사 제품)을 인슐린원으로 하였다. 이는 최종단백질에서부터 비롯되고, 결과적으로 최종지질의 농도가 변화한다(50, 25, 10 및 5㎎ TL/㎖). 하지만, SPC-리포솜으로 인해, 4상대중량%의 샘플을 조사하였다.
실험적인 프로토콜은 실시예 1~27에 기재한 것과 같다. 항온배양 시간은 3시간으로 하고, 비교예의 경우에도 좀 더 용이하게 조제하기 위해서 전 조제공정에 있어서 원심분리시간은 6시간(500g에서)으로 하였다. 측정결과가 도6에 도시되어 있다.
순음전하로 하전되어 있다고 하더라도, 인슐린이 음전하로 하전된 표면과 가장 잘 결합한다는 사실을 결과로부터 확실히 알 수 있다. 포낭이 매우 잘 변형되도록 하는 매우 유연한 막을 사용하는 것이 또한 좋다.
대단히 유연성이 있고, 하전된 막을 만들기 위한 상대적인 결합 효율은 80~90%이다. 두가지 타입의 검사한 인지질-계면활성제 혼합물에서 인슐린/지질의 중량비가 1/25인 경우에 대단히 큰 단백질 막 결합도가 얻어진다. 인지질과 비이온성 계면활성제로 이루어지는 하전되지 않은 막은 비교가능한 인슐린/지질비에서 50%의 상대결합을 나타낸다. 하지만, 2.5%(실시예 28-45)사이에서만 첨가된 인슐린이 하전되지 않은 포스파티딜콜린 리포솜과 결합하는 것으로 계산된다. 이러한 경우, 무엇보다도 좋지 못한 것은 하전된 리포솜과 결합하는 단백질에 의해서 결과가치가 넘게 되는 것인데, 이때 상기 리포솜은 단백질/지질의 중량비가 1/25일때 첨가된 인슐린의 10~20%와 결합한다. 그러므로, 하전된 종래부터 사용되고 있는 지질 이중층은 하전되지 않은 리포솜 막과 더 유연하지만 중성인(트랜스퍼좀TM) 막 사이에 있는 중간체이다.
이러한 사실로부터, 순 표면전하(하전된 지질이나 다른 하전된 막과 결합한 성분으로부터 비롯됨)는 표면- 또는 캐리어-단백질 결합을 최대화하는 막의 연성(세제 및 흡착제내에 관련된 다른 분자가 있음으로 해서 촉진됨)과 관련이 있다는 것을 알 수 있다. 왜 "부드러워진 표면"에서는 단백질이 계면영역으로 삽입이 용이해지게 될 경우에, 상기 전하는 흡착제에 대하여 흡착하는 표면(부)을 밀어내는 가에 대한 의문은 남아있다.
실시예 93~95:
종래의 포낭, SPC 리포솜, 중성상태(TL=10중량%):
순전하가 없고, 쯔비터이온성 인지질로만 이루어져 있음
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭A(TL=10중량%)
25몰%의 음이온성 콜레이트로 인해 순 음전하를 띰
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖ 인산염 완충액
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭B(TL=10중량%):
음이온성 포스파티딜글리세롤의 25몰%(PC에 대하여 상대적임)로 인해 순전하를 띰.
대두에서 추출한 284.3㎎의 포스파티딜콜린
대두에서 추출한 94.8㎎의 포스파티딜글리세롤
620.9㎎의 트윈 80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
인슐린-포낭 혼합물은 각각
50, 25, 10, 5㎎전체 지질/㎖최종현탁액
0.04, 0.08, 0.1 및 0.2㎎ 인슐린/1㎎ 전체지질
(4, 8, 10, 20 단백질의 상대중량%)
조제 흡착하는 인슐린의 운동성에 대한 연구:막과 혼합된 포스파티딜콜린 트윈 80에 대하여 시간에 따라 측정을 행하였다. 시험용 포낭을 대응하는 상기 실시예에서 기재한 대로 조제하였다. 단백질 용액과 지질 현탁액을 혼합한 후에 제1 데이타 포인트를 얻는데 2시간이 소요되었다. 중성의 고변형성 막에 있어서, 다음번 포인트까지는 3시간이 소요되었다. 다른 실시예의 모든 현탁액에 있어서도, 4~5일 및 5~6주 동안 항온배양을 행하였다.
결과
전하를 띠지 않는 SPC/트윈 혼합된 막에 인슐린이 흡착되는 것은 시간에 따라 달라진다는 것을 확실히 발견하였다.(일부 대표적인 데이타를 취한 도9에 표시함) 결합공정시에 초기에 관찰되는 결합효율은 2시간이 경과한 후에 30%에서 증가하였고, 3시간이 경과했을때는 50%까지 증가하였는데, 이때 인슐린/지질 중량비는 1/25였다. 4일이 경과했을 때는, 결합효율이 64%까지 증가하였지만, 5주가 경과한 후에도 결합효율은 58%에 그치기 때문에, 이러한 변화량은 그다지 중요하지 않다.
단순한 포스파티딜콜린 리포솜에 대한 인슐린의 결합은 3시간이 경과한 후에는 2.5%이고, 6주가 경과한 후에는 5%로 증가한 것으로 측정되었다.
상기 막과 결합하는 단백질의 양이 2시간후에 64%에서 6주후에는 76%로 증가하는 것으로부터 알 수 있듯이, 하전된 SPC/SPG/트윈에 대해서 인슐린이 흡착하는 것은 매우 빠르고 중성상태의 막인 경우보다 더 강하다. 처음 1시간동안 결합하는 양과 비교해서 볼때, 2시간째의 증가량이 작다는 것은, 보다 빠른 결합운동성을 나타낸다.
인슐린의 결합비는 하전된 SPC/콜레이트 혼합된 막보다 훨씬 더 크다. 상기와 같은 하전된 포낭을 가지고 행한 시험에서 혼합된 지질막에 대한 단백질의 흡착은 전혀 시간에 대한 의존성을 가지지 않는다는 것을 알았다. 2시간이 경과한 후에 상기 결합은 실험적인 오차가 없다면, 이미 5주동안의 항온배양시킨 것만큼이나 결합율이 높아진다. 이것으로 하전되고, 유연한 막과 흡착하는 인슐린이 하전되지 않은 막에 비해서 훨씬더 결합이 빠를 것이라고 사료된다. 참고로, 무시할 수 없는 정전기적 인력이 또한 단백질분자의 탈착에 영향을 미칠 지도 모른다고 생각하게 되었다. 포스파티딜콜린 막과 매우 약하고/또는 더디게 결합하는 것은 소수성 결합만이 높은 페이로드를 이루는데 충분하지 못하다는 것을 나타낸다. 이것은 지질 이중층의 표면에서 적당한 결합위치를 찾는 인슐린 분자의 능력의 한계 때문이다. 흔하지 않고, 좋지 못하게 흡착된 단백질 분자와 이웃하는 불안정한 흡착질 사이의 반발력이 또한 중요해질 수 있다.
실시예 96~100
각기 다른 전하 밀도(TL=10중량%)를 갖는 아주 월등한 변형성을 갖는 포낭현탁액:
25, 33, 50, 67, 75몰% 포스파티딜글리세롤로 인해서 순음전하로 하전됨
대두에서 추출한 137㎎, 205㎎, 274㎎, 343㎎, 411㎎ 포스파티딜글리세롤
대두에서 추출한 411㎎, 343㎎, 274㎎, 205㎎, 137㎎ 포스파티딜콜린
452㎎의 트윈80
pH 7.4인 9㎖의 인산염 완충액
2㎎ 인슐린/㎖ 최종현탁액
상기 실시예 93~95에 기재한 대로 지질 포낭을 조제하였다. 도4에 도시되어 있는 것과 같이, 막내에서 하전된 지질의 상대농도의 증가는 포낭-인슐린과의 결합을 촉진시키고, 최종현탁액의 점도를 증가시켰다.
더 높은 SPG/SPC 몰비에서, 실시예 93~95에서 조제한 지질 현탁액은 더 점성이 있고, 다루기가 어렵다. 하전된 지질 조성물의 상대농도가 더 커지면 인슐린과 결합하는 포낭의 상대량을 증가하였다. 이것이 도7에 도시되어 있다.
하전된 지질 함량의 변화하면 복잡한 방식으로 단백질의 결합효율에 영향을 미친다. 먼저, 포낭과 결합하는 인슐린의 상대량이 증가한다. 50근방의 SPC/SPG일때, 상대적인 결합량이 최대가 된다는 것을 알 수 있다. 계면 밀집효과 및/또는 단백질 흡착운동성에 관한 표면전하의 영향때문에, SPG 함량이 매우 커지면 효과적인 인슐린의 결합에 장애가 된다는 것을 나타낸다.(후자의 경우, 표면에서 고분자 재배치가 매우 빠르게 행해지지 않기때문에, 패킹 밀도가 최대화하지 않는다.)
실시예 101~104:
인슐린과 1/1로 혼합된 대단히 유연성이 있는 하전된 막(TL=10중량%)
대두에서 추출한 874.4㎎ 포스파티딜콜린
125.6㎎ 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
4㎎ 인슐린/㎖ 출발용액
포낭을 제조하기 위하여 다른 방법도 사용된다: 상기 실시예1~27에서 기재한 압출성형과 동결-건조 사이클에 부가하여, 훨씬 더 간단한 프로토콜(상기 현탁액을 단지 연속적으로 압출성형시킴)이 또한 시험된다. 혼합된 지질막에 대한 단백질 흡착효율의 현저한 차이는 발견되지 않았다(도8). 하지만, 상기 "공극 관통 평가"로 정의한 지질 포낭의 모양 적응성은 다른 배취의 경우와 달랐다: 상기 실시예1~27에서 조제된 포낭의 변형은 매우 큰 것으로 발견되었다.
실시예 105~106:
다양한 첨가제를 첨가시킨 대단히 유연성있게 하전된 막
(최종 현탁액)
대두에서 추출한 437㎎ 포스파티딜콜린
63㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 1㎖의 인산염 완충액
2㎎ 인슐린/㎖(최종현탁액으로)
첨가제 A
m-크레졸 1.5㎎/㎖(최종)
첨가제 B
벤질 알콜 2.5㎎/㎖(최종)
나트륨 콜레이트를 함유하는 트렌스퍼좀ⓡ에 첨가되는 상호-용매는 최종적인 막과 결합하는 인슐린의 양에 영향을 준다. m-크레졸의 존재하에서 상대적인 결합효율은 60%이고, 시험 현탁액으로 벤질 알콜을 도입시킨 후의 효율은 90%이다.
실시예103~104에 사용된 첨가제를 또한 보존제로 사용할 수 있다.
실시예107~110:
다양한 소스로부터 취한 다양한 인슐린이 있는 유사막:
대두로부터 추출한 437㎎의 포스파티딜콜린
63㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 1㎖의 인산염 완충액
아크트라피드 100HMTM(노보-노르디스크사 제품),
본래 건성인, 인간 재조합체(노보-노르디스크사 제품),
본래 건성인, 포르신(시그마 케미컬 인더스트리사 제품)에서 취한
2㎎ 인슐린/㎖, 및
리스프로TM에서 취한 인슐린 아날로그(플리저사 제품)
유사막에 대한 다양한 단백질 흡착효율에서의 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 하지만, 이것은 다양한 탈착/흡착율의 가능성을 배제하지는 않는다.
특히, 산성 완충액에 용해되고, 중성 pH 범위로 복귀시킨 건성의 인슐린은 아크트라피드TM(노보-노르디스트사 제품) 용액을 사용하기로 되어 있는 인슐린만큼이나 효율적으로 혼합된 지질막과 흡착한다.
실시예111~118:
연질의, 하전되지 않은 막
출발 현탁액(10% TL):
대두에서 추출한 1099.7㎎의 포스파티딜콜린
900.3㎎의 트윈 80
pH7인 19㎖의 인산염 완충액
최종 현탁액:
상기대로 지질 혼합물과 혼합한 8.4㎍의 IF,
도10에 주어진대로, 1.84㎎ TL/㎖~18.4㎍ TL/㎖를 사용해서 인터페론의 상대량을 증가시킴.
증가한 몰비로 혼합된 단백질/지질 혼합물을 함유도록 하고, 실시예 60~71에서 기재한 대로 물질을 조제하였다. 첫단계는, 센트리스아트 분리관(컷-오프 100kDa)으로 행하는데, 이것은 이러한 테스트 시리즈에서 항상 알부민(40㎎ BSA/㎖ 완충액을 함유하는 용액으로부터 취함)으로 전-코팅되어 비-특이적인 단백질 흡착율을 15% 이하의 수준으로 감소시킨다. BSA로 항온배양시킨 후에, 상기 완충액으로 2회 세척을 행하고, 적당한 농도의 인터페론 용액으로 충전시켰다(동일한 완충액에서 원액으로 희석시켜서 조제함). 최종적인 단백질의 농도를 평가하기 위해서, IF용 시판되는 ELISA 면역정량법을 사용하였다. 동일한 과정으로 포낭과 결합하는 인터페론의 양을 측정하기 위해서 실시예 1~18에서 기재한 대로의 방법을 사용하였다. 따라서, 단백질의 결합도는 상청액으로부터 2회 또는 3회 반복하여 취한 "단백질의 손실량"과 일치하였다.
얻어진 결과를 도10에 표시하였다. 이것으로 인슐린의 결합에 대하여 기재된 것과 정량적으로 유사한 도면이 얻어진다는 것을 알게 된다.
실시예 119~134:
매우 유연하고, 하전된 막
출발 현탁액
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1의 9㎖ 인산염 완충액으로 이루어지는 10중량%의 전체 지질(TL)함량
최종 현탁액
도10에 기재한 지질/단백질 혼합물
(실시예111~118에서 주어진 것에 대응하는 다른 데이타)
도10에 도시되어 있는(다이아몬드와 사각형을 채워져 있음)두개의 다른 실험적인 시리즈의 결과로부터, 단백질 분자에 대하여 전체적으로 음전하를 띠고 있다고 하더라도 고도로 변형가능한 이중층에 대하여 결합하는 인터페론의 효율에 대하여 음전하를 띠고 있는 막이 바람직한 작용을 하고 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 135~145:
출발 현탁액(10% TL):
연질의, 하전되지 않은 막
SPC/Tw80
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎ 트윈80
pH6.5인 9㎖의 인산염 완충액
연질의, 하전된 막
SPC/NaChol
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
최종현탁액:
상기 기재한 것과 같은 비를 갖는 지질, 및
10000IU의 인터류킨-2(IL-2)로 이루어짐.
주어진 지질 혼합물과 단백질 둘다를 가지고 공정을 행하였다. 그리고 나서, 결합도를 측정하였다. IL-2의 양이 표준곡선과 비교해서 비트로상태에서 렌카(Renca) 세포의 자극에 의존하는 단백질을 사용하여 결정되는 반면에. 실시예 119~134에서 주어진 대로 분리를 실질적으로 행하였다. 이것으로 하기 표에 주어지는 데이타를 얻었다(IL-2의 절대농도는 IU 단위로 주어지고, 상대적인 단백질량은 %로 주어진다).
출발치와 최종치(전체 회수된 단백질) 사이의 차이는 포낭/IL-2 분리동안에 단백질의 손실 및 지질의 존재하에서 단백질의 활성을 변형시킨 것에 부분적으로 기인한다.
다양한 표면전하 밀도를 갖는 인터류킨과 이전에 조제된 고도로 변형가능한 지질포낭과의 단기간의 결합은 상기 표에 기재한 것(데이타는 표시되지 않음)보다 전하효과에 덜 민감한 것으로 판명되었다.
실시예 146~148:
종래부터 사용된 중성상태의 포낭(출발 현탁액):
대두에서 추출한 1g의 포스파티딜콜린
pH6.5인 9mM의 인산염 완충액
매우 잘 변형될 수 있는 중성상태의 포낭(출발물질)
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈 80
pH6.5인 9㎖ 인산염 완충액
매우 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭(출발물):
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
1%의 5.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH 7.1인 9㎖의 인산염 완충액
포낭(최종 현탁액)과 혼합한 칼시토닌(예를 들어, 연어)
100㎎ 전체지질/㎖ 최종현탁액
1㎎ 단백질/100㎎ 전체지질
상기 기재한 대로 전체 지질 현탁액을 조제하였다. 처리한 포낭에 단백질(소량의125I-표지 단백질로 극파(棘波)시키고, 사용하기 전에 단기간에 정제한 것)을 첨가하고, 적어도 24시간 동안 항온배양하였다;또는, 상기 지질에 단백질액을 첨가하고, 현탁액의 제조동안에 초미세한 구멍이 있는 필터를 통과시켜 공동-압축성형하였다.
막과 결합하는 폴리펩티드의 상대적인 효율을 측정하기 위해서, 단백질/포낭 혼합물을 연속적으로 방사성을 검출하는 크기별-배제 겔 크로마토그래피를 사용하여 크로마토그래피 하였다. 이것으로 두개의 피크는 포낭과 결합하는 방사선-표지된 단백질을 용액내에 각각 함유하도록 할 수 있다. 곡선이하의 영역은 약 30%이고, 종래의 포낭의 경우에는 70%이고, 중성상태의 연질막에 있어서는 60~70% 및 40~30%이고, 하전되고, 매우 유연성이 있는 막에 있어서는80%이고20%이다.
실시예 149~152:
대단히 잘 변형될 수 있는 중성상태의 포낭(출발물질)
대두에서 추출한 550㎎의 포스파티딜콜린
450㎎의 트윈80
pH6.5인 9㎖의 인산염 완충액
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭(출발물질)
대두에서 추출한 874.4㎎의 포스파티딜콜린
125.6㎎의 나트륨 콜레이트
pH7.1인 9㎖의 인산염 완충액
포낭과 혼합시킨 면역글로불린 G(최종현탁액)
100㎎ 전체지질/㎖ 최종현탁액
0.5㎎ 및 1㎎ 단백질/100㎎ 전체지질
상기 기재한 대로 전체지질 현탁액을 조제하였다.
이미 처리된 포낭 현탁액에 첨가시킴으로써 상기 면역글로불린(플루오레세인에 대하여 직접적으로 작용하는 모노클로날 IgG)을 물질내에 함유시켰다. 결합한 포낭 및 소실된 면역글로불린의 양을 분리시킨 후에, 전자로부터의 상대적인 기여량을 분리된, 원래의 제어 용액에 형광 담금질(quenching)하여 측정하였다. 이것으로 각각에서 최종적인 IgG 농도가 유지될 수 있다.
IgG 캐리어 막 결합효율을 측정하였더니, 하전되고 대단히 잘 변형될 수 있는 포낭의 경우에는 적어도 85% 정도가 되었고, 중성상태의 연질의 막의 경우에는 10% 정도 저하하였다. 관찰된 미량의 차는 IgG가 다량의 소수성 Fc 영역을 함유하기 때문이라고 추정되는데, 이것은 심지어 막이 연질화한 경우에도 지질막내로 쉽게 주입되고, 발생하는 성분에도 악영향을 미친다.
실시예 153~154:
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭, C형:
대두에서 추출한 130.5㎎의 포스파티딜콜린
19.5㎎의 콜레이트, 나트륨염
0.1㎖ 에탄올
대단히 잘 변형될 수 있는 하전되지 않은 포낭, T 타입:
대두에서 추출한 75㎎ 포스파티딜콜린
75㎎의 트윈 80
0.1㎖의 에탄올
인슐린, 인간 재조합체:
1.35㎖ 아크트라피드TM100(노보-노르디스크사 제품)
제제화 시험
균일한 인지질 용액을 얻을 때까지, 어떤 지질 혼합물을 알콜에 녹였다(케이브: 나트륨 콜레이트는 완전히 녹지않음). 상기 혼합물을 인슐린용액에 주입하여 완전하게 혼합하였다. 약 12시간동안의 시효처리를 행해준 후에, 양질의 샘플의 균일성을 용이하게 이루기위해서, " 입자가 큰 포낭 "으로 되어있는 결과적인 현탁액을 0.2㎛의 필터(고팅젠의 사르토리우스사 제품)에 수차례 통과시켜 여과하였다.
시험
아무것도 먹지 않은 남자 볼론티어(75㎏, 42세)를 첫번째 글루코스 농도를 측정하기 전에 17시간동안 아무것도 먹이지 않았다. 그 사람의 혈액내의 글루코스 농도를 일시적으로 변화시키도록 하는데, 2~4㎖의 샘플을 볼론티어의 팔에 있는 연질의 정맥 카테테르를 통하여 10분~20분마다 주사하였다. 70분이라는 초기 시험기간이 경과한 후에, 평균 혈액 글루코스 농도가 78.4였을때, C 타입의 트랜스퍼설린ⓡ을 사용하는데(45IU), 다른 팔의 앞쪽의 내부의 손상되지 않은 피부표면을 균일하게 발라서 그 칠한 면적이 56㎠이 되게 하였다. 시험 현탁액을 사용한 다음 30분후는, 육안으로 보았을때 피부 표면이 건조해보이고, 또 30분 후에는 상기 현탁액이 단지 희미한 흔적으로 보였다.
표준 글루코스-탈수소화효소 분석평가(머르크, 글루크-DH)를 사용하여 혈액중의 당도를 측정하였다. 3가지의 각 샘플이 함유된 각각의 견본으로 적어도 3회씩 측정하였다. 이렇게 하여 측정된 평균 표준 편차는 5㎎/㎖를 넘지 않았다.
결과
트랜스퍼좀ⓡ(트랜스퍼설린ⓡ)과 결합하는 인슐린을 투약한 후에, 혈당이 정상치인 볼론티어에서의 혈당 농도변화는 인슐린용액을 파하로 주사하여 얻은 것보다 언제나 더뎠다.
트랜스퍼설린ⓡ을 투약한 후에 혈액내에서의 당농도의 최대 감소량은 일반적으로 대응하는 피하에 주입하여 얻은 것의 10%, 참고자료를 사용하여 적어도 20%가 되는 곡선이하의 영역을 능가하였다. t＞3인 현탁액 C인 경우의 혈액내의 혈당농도의 평균 억압량은 약 18㎎/㎖였다.
현탁액 T인 경우에는 현탁액C로 측정한 데이타에 비해서 불량한 약 35%정도였다. 포스파티딜글리세롤(포스파티딜콜린에 대하여 상대적으로 15중량%)을 주입하였더니 C타입과 T타입의 물질의 차이가 25%(데이타는 표시되지 않음)로 감소하였다.
하지만, 이온토포레시스(Meyer, B. R., Katzeff, H. L., Eschbach, J., Trimmer, J., Zacharis, S. R. Rosen, S., Sibalis, D. Amer. J. Med. Sci. 1989, 297:321~325)나 트랜스나살 스프레이를 사용하는 것과 같은 지금까지 가장 잘 사용되고 있는 다른 비침투형 인슐린 전달방법으로는 인슐린 분자의 5% 및 10% 미만이 각각 혈액으로 순환되기 시작한다.
실시예 155:
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭:
실시예 72~76에서 사용된 조성
인슐린, 인간 재조합체:
실시예 72~76에서 사용된 아크트라피드TM(동결건조시킴)(노보-노르디스크사 제품)
실시예 61~65에 기재한 대로 시험 물질을 조제하였다. 이전 실시예에서 기재한 대로 일말의 투약을 필수적으로 행하지만, 패스팅(fasting) 시간을 더 연장하고 혈액 샘플링을 더 빨리 시작하였다(따라서, 실험은 모니터되지 않는 12시간의 패스팅으로 시작되고, 어떠한 처리도 하지 않고 혈당량을 모니터하면서, 또 다시 12시간의 패스팅시간을 가지고 시험대상자를 아무것도 주지 않고 패스팅시키면서 트랜스퍼설린ⓡ으로 처리하는 동안 16시간가량 모니터하였다.).응용면적이 단지 10㎠이 되었을때 약간의 차이가 있었다.
인슐린을 투약하기 전에, 불규칙적으로 샘플을 취하였다. 트랜스퍼설린ⓡ을 투약한 후에, 최초 4시간에 걸쳐서 20분마다 혈액샘플을 취하고 그 이후에는 30분 마다 취하였다. 자가-진단 장치인 애쿠트렌드(독일, 보에린거-맨하임사 제품)로 모든 샘플을 분석하였다. 매 시간 포인트에 3~5개의 기록값을 얻었다. 도12에 표시되어 있는 결과는 혈당농도 변화의 평균값에 대응한다. 충돌된 라인들은 95%의 신뢰한계를 제공한다.
두번째의 " 무처리" 기간에서의 평균 혈당농도는 83.2㎎/㎗였다. 대단한 순응성이 있는 혼합된 지질 포낭으로 약물을 투약한 다음의 1시간 이내에 혈당농도가 저하하는 것이 현저하게 관찰된다. 글루코다이나믹 프로파일은 상기 테스트 시리즈에서 측정된 것과 유사하고, 아마도 후자의 시험물질 테스트에서의 훨씬 더 높은 약물의 농도로 인하여 전반적인 효과는 다소 강해지게 된다.
실시예 156~158:
대단히 잘 변형될 수 있는 하전된 포낭:
실시예 153의 조성
인슐린, 인간 재조합체:
도2에 주어진 배치대로, 아크트라피드TM(노보-노르디스크사 제품).
테스트 시리즈에서, 동일한 트랜스퍼좀ⓡ 배치를 사용하여, 인슐린에 대한 내부-배치가 변화함에 따른 효과를 연구하였다. 상기 실시예대로 투약하였다. 면적당 용량을 상기 실시예에서 사용한 것과 같이 하였다.
모든 3개의 실험에서 평균 혈당농도가 거의 같았다. 이러한 현저한 실험의 결과는 인슐린 배치사이에서 매우 다양하였다. 하나의 배치는 매우 효과적이었지만, 두번째는 그렇지 않았다; 세번째의 것은 즉각적인 많은 결과를 나타내었다.
인슐린에 대한 작은 배치에서 배치로의 변화(이것은 알려져 있긴 하지만, 대부분은 알려져 있지 않고, 이는 특히 대단위로 흡착하는(캐리어) 표면의 존재하에서 특히 영구적임)는 인슐린-캐리어 상호력의 운동성 및/또는 효율에 영향을 미치는 것 같다. 약물의 유리도의 변화율은 특히 현상에 민감하다고 일반적으로 알려져있다. 따라서, 진지한 생물학적 테스트 이전에 지질과 결합하는 캐리어의 양 뿐만 아니라, 약물 유리율을 측정하는 것도 중요하다. 마우스나 래트와 같은 시험동물에서, 주입후의 물질의 특징으로 글루코다이나믹을 측정하는 것도 이러한 목적을 위해서는 유용하다. 3개의 다른 트랜스퍼설린ⓡ을 투약한 후에 혈당치가 정상인 볼론티어의 글루코다이나믹은 트랜스퍼좀ⓡ과 동일한 배치를 갖지만, 다른 인슐린은 다른 물질의 생물학적인 활성에 관한 본래 약물의 특성의 작은 변화에도 상대적으로 강력한 효과를 확실히 나타낸다.
본 발명은 복합체 표면에 대한 고분자의 흡착 또는 상기 표면으로부터의 대응하는 탈착율을 제어하는 유익한 인자를 정의함으로써, (생명)공학 및 의학분야에 적합한 형태로 제조하는 방법이 제공할 수 있으며, 또한 결과적인 형태로 실용화하여 사용하기에 특히 적당한 물질에 대한 특성을 기재하고 있는데, 본 발명은 예를 들어 의학이나 동물의학과 같은 분야에서 증상학, 분리공정 및 (생)공정, 생명공학, 유전자 증식, 제재 안정화처리, 농축 및 운반등의 용도에 사용되지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

Claims (57)

  1. 적당한 액매와 접촉시 양친매성을 나타내고 상기 액매내에서 용해도가 서로 다른 2가지 이상의 물질로 이루어지고, 상기 액매와 접촉시 확장된 표면, 특히 막표면을 증가시켜 양친매성의 제3물질 분자들이 상기 표면과 결합되는 조합체로서:
    상기 2가지 이상의 물질은,
    다른 물질보다 상기 액매에 더 잘 용해되는 물질은 상기 조합체의 상기 다른 물질보다 덜 확장된 표면을 형성하도록, 그리고
    상기 제3의 물질의 분자들은 상기 다른 덜 용해되는 물질만으로 형성된 확장된 표면보다는 상기 다른 2가지 이상의 물질에 의해 형성된 확장된 표면과 더 잘 결합되도록 선택되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  2. 적당한 액매와 접촉시 양친매성을 나타내고 결합상태에서 상기 액매와 접촉시 확장된 표면 특히 막표면을 형성할 수 있는 2가지 이상의 물질로 이루어지고, 순전하를 갖는 다른 양친매성 물질의 분자가 상기 표면과 결합되도록 그리고, 상기 표면의 순전하 밀도와 상기 표면과 결합되는 양친매성 분자들의 순전하가 동일한 극성(둘다 음극 또는 양극)을 갖도록 상기 표면이 순전하를 띠는 것을 특징으로 하는 상기 2가지 이상의 물질의 조합체.
  3. 적당한 액매와 접촉시에 양친매성을 나타내며, 이러한 용매내에서 용해도가 다르고 적어도 결합될 경우에 확장된 표면, 특히 막표면을 형성할 수 있는 2종 이상의 물질이 상기 액매내에서 양친매성 제3물질과 결합할 수 있도록 하고,
    다른 물질보다도 상기 액매내에서 보다 더 잘 녹는 물질이 조합체의 다른 물질보다도 덜 확장된 표면을 형성하도록,
    상기 제3물질분자가 다른 가용성이 덜 한 물질에 의해서만 형성되는 확장된 표면보다도, 2종 물질의 조합체로 형성되는 확장된 표면과 더 잘 결합하도록 하고,
    상기 표면과 결합하기 쉬운 제3의 물질분자 뿐 만 아니라 결합된 물질에 의해서 형성되는 표면이 둘다 음극으로 하전되거나 양극으로 하전되도록 하는 것을 특징으로 하는 2가지 이상 물질의 조합체.
  4. 제1항 또는 3항중 어느 한 항에 있어서, 확장된 표면을 형성하도록 자가응집가능한 적어도 하나의 물질로서, 다른 성분 특히 상기 자가응집물질보다 액매에서 용해도가 큰 양친매성 물질, 상세하게는 용해도 차가 상기 액매내에서 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상인 다른 물질과 혼합될 때 더 유연해지는 것을 특징으로 하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 2가지 이상 물질의 조합체.
  5. 제1항 또는 3항중 어느 한 항에 있어서, 자가응집하여 확장된 표면을 형성할 수 있고, 상기 표면과 결합될 경우에 그 표면의 곡률을 증가시키는 1종 이상의 양친매성 물질을 포함하고, 상기 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 아무리 높아도 포화농도나 표면을 형성할 수 없는 농도의 99%이하인 것을 특징으로 하는 2가지 이상 물질의 조합체.
  6. 제4항 또는 5항에 있어서, 상기 좀 더 가용성이 있거나 곡률을 증가시키는 물질의 농도는 제5항에서 정의한 상대농도의 0.1% 이상, 바람직하게는 1~80% 이상, 더욱 바람직하게는 10~60% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 20~50%인 것을 특징으로 하는 2가지 이상 물질의 조합체.
  7. 제5항 또는 6항에 있어서, 상기 표면의 평균곡률(평균반지름의 역수인)은 15㎚~5000㎚, 바람직하게는 30㎚~1000㎚, 더욱 바람직하게는 40㎚~300㎚, 가장 바람직하게는 50㎚~150㎚의 평균 반지름에 상응하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  8. 제5항 또는 7항중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 고체로, 특히 적당한 곡률이나 크기를 갖는 표면을 지지함으로써 지지되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  9. 제2항 또는 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 표면과 연관된 하전된 성분의 상대적인 농도가 함께 얻어지는 전표면 형성 양친매성 물질의 농도를 기준으로 해서, 5~100 상대몰%, 보다 바람직하게는 10~80 상대몰%, 가장 바람직하게는 20~60 상대몰%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  10. 제2항 또는 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표면의 평균 전하 밀도가 0.05 Cb/m2~0.5 Cb/m2, 바람직하게는 0.075 Cb/m2~0.4 Cb/m2이고, 더욱 바람직하게는 0.10 Cb/m2~0.35 Cb/m2에 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  11. 제2항 또는 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 단가나 다가의 이온을 포함하는 배경 전해질 조성 및 농도를 필요한 결합시 전하간의 상호작용의 효과를 최대화하기 위해서 선택되고, 0.0001~1, 바람직하게는 0.02~0.5, 더욱 바람직하게는 0.1~0.3의 이온강도(I)에 대응하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  12. 제1항 또는 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 액매내에서 잘 용해되지 않고 바람직하게는 표면-형성 및/또는 전하 수반 양친매성 물질이 지질 또는 지질과 유사한 물질이며, 액매내에서 잘 용해되고 바람직하게는 표면곡률, 유연성이나 순응성을 증가시키거나 및/또는 전하 수반 물질이 계면활성제 또는 제3결합물질과 동일한 것을 특징으로 하는 조합체.
  13. 제1항 또는 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 액매내에서 현탁되거나 분산되고, 2종류 또는 2가지 형태 이상의 자가응집성 양친매성 물질로 1층 이상으로 코팅되어있는 미세한 액적 형태의 분자배열을 포함하고, 상기 2종 이상의 물질은 수성 액매에서 그 용해도가 서로 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상이어서, 상기 잘 용해되는 물질의 동종 응집체 또는 2가지 물질의 이종응집체의 평균직경이 상기 잘 용해되지 않는 물질의 동종 응집체의 직경보다 작은 것을 특징으로 하는 2종 이상 물질의 조합체.
  14. 제1항~13항 중의 어느 한 항에 있어서, 표면을 형성할 수 있는 모든 양친매성 물질의 전체 함량이, 특히 상기 조합체가 인체나 동물에 사용될 경우에 응집체의 전체 건조중량을 기준으로, 0.01~30중량%, 바람직하게는 0.1~15중량%, 가장 바람직하게는 1~10중량%인 것을 특징으로 하는 조합체.
  15. 제1항~14항 중의 어느 한 항에 있어서, 보다 확장된 표면을 형성하는 물질로서, (생체)적합한 극성 또는 비극성 표면-지지 지질을 1종 이상을 함유하고, 상기 표면이 바람직하게는 이중 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 조합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 확장된 표면형성 물질이 생물에서 생긴 지질이나 리포이드 또는 이에 상응하는 합성지질이거나, 바람직하게는 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 이소프레노이드리피드, 스핑고리피드, 스테로이드, 스테린이나 스테롤, 황이나 탄수화물-함유 지질 또는 이중층을 형성할 수 있는 어느 다른 지질, 특히 반-양자화한 유체 지방산, 바람직하게는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린이나 스핑고포스포리피드, 글리코스핑코리피드(예를 들어, 세레브로사이드, 세라미드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핑고플라즈마로겐), 강글리오사이드나 다른 글리코리피드 또는 특히 디올레오일-, 디리노레일-, 디리노레닐-, 디리노레노일-, 디아라키도일-, 디라우로일-, 디미리스토일-, 디팔미토일-, 디스테아로일의 합성지질이나 대응하는 스핑고신 유도체, 또는 다른 글리코리피드나 디아실-, 디알케노일-이나 디알킬-지질의 변형체인 것을 특징으로 하는 조합체.
  17. 제12항~16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성, 쯔비터이온, 음이온성이거나 양이온성의 계면활성제, 특히 긴사슬형의 지방산이나 알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄 염, 알킬설포네이트염, 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트나 타우로콜레이트의 단가염, 특히 도데실-, 디메틸-아미노옥사이드와 같은 아실- 또는 알카노일-디메틸-아미노옥사이드, 알킬-이나 알카노일-N-메틸글루카미드, N-알킬-N,N-디메틸글리신, 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트, N-아실-설포베타민, 특히 노나에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르와 같은 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 노나에틸렌-도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르 특히, 옥타에틸렌글리콜-이소트리데실 에테르와 같은 폴리에틸렌글리콜-이소아실 에테르, 특히 옥타에틸렌도데실 에테르와 같은 폴리에틸렌-아실 에테르, 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(트윈20)이나 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(트윈 80)과 같은 폴리에틸렌글리콜-소르비탄-아실 에테르, 폴리히드록시에틸렌-4 또는 6 또는 8이나 10이나 12 등-라우릴 에테르(브리지 시리즈중에서)나 예를 들어 폴리히드록시에틸렌-8-스테아레이트(미리지 45), -라우레이트, 또는 -올레이트형과 같은 대응하는 에스테르 또는 폴리에톡시화한 캐스터 오일 40(크레모퍼 EL)내에서 특히 폴리히드록시에틸렌-라우릴, -미리스토일-, -세틸스테아릴이나 -올레오일 에테르와 같은 폴리히드록시에틸렌-아실 에테르, 특히 소르비탄-모노라우레이트(알라셀 20, 스판 20)과 같은 소르비탄-모노알킬레이트(예를 들어, 알라셀이나 스판중에서), 데카노일-이나 도데카노일-N-메틸글루카미드와 같은 아실-이나 알카노일-N-메틸 글루카미드, 라우릴-이나 올레오일-설페이트와 같은 알킬-설페이트(염), 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 글리코데옥시콜레이트, 나트륨 올레이트, 나트륨 타우레이트, 나트륨 엘라이데이트, 나트륨 리놀리에이트, 나트륨 라우레이트와 같은 지방산염, n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티딜산과 같은 리소포스포리피드, -포스포릴글리세롤이나 -포스포릴세린, 대응하는 팔미토엘오일-, 엘라이도일-, 바세닐-리소포스포리피드 또는 대응하는 단-사슬의 포스포리피드나 그 밖의 표면-활성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조합체.
  18. 제12항~17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 1~80몰%, 바람직하게는 10~60몰%, 더욱 바람직하게는 30~50몰%의 상대농도로 하전된 막 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  19. 제11항~18항 중의 어느 한 항에 있어서, 포스파티딜콜린 및/또는 포스파티딜글리세롤은 표면-지지 물질이고, 리소포스파티딜산이나 메틸포스파티딜산, 리소포스파티딜글리세롤이나 리소포스파티딜콜린과 같은 리소포스파티딜 또는 부분적으로 N-메틸화한 리소포스파티딜에탄올아민, 콜레이트, 데옥시콜레이트-, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트의 단가 염, 어떤 다른 충분한 극성을 띠는 스테롤 유도체, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올레이트, 팔리톨레이트, 엘라이데이트 또는 일부의 다른 지방산 염 및/또는 -설포베타인, -N-글루카미드나 -소르비탄(아르락셀이나 스판) 계면활성제는 확장된 표면을 형성하기가 힘든 물질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  20. 제1항~19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 표면으로 둘러싸이는 영역의 평균 반지름이 15~5000㎚, 바람직하게는 30~1000㎚, 대부분은 40~300㎚이고, 가장 바람직하게는 50~150㎚인 것을 특징으로 하는 조합체.
  21. 제1항~20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 확장된 표면과 결합할 수 있는 제3의 물질은, 올리고머나 폴리머와 같은 사슬분자의 형태의 반복서브유닛으로서, 800달톤이상, 바람직하게는 1000달톤이상, 가장 바람직하게는 1500달톤이상의 평균 분자량을 갖는 반복 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제3물질은 생물체로부터 취하는데, 바람직하게는 생체활성인 것을 특징으로 하는 조합체.
  23. 제1항~22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질은 상기 막과 이에 접촉하는 액매 사이의 계면에 삽입되어 막처럼 확장된 표면과 결합하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  24. 제1항~23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질과 대응하는 사슬분자의 상대함량이 흡착제 표면의 질량과 비교해서 0.001~50%이고, 바람직하게는 0.5~25%, 더 바람직하게는 1~20%이므로, 특정한 비값이 상기 사슬분자의 몰질량 증가에 따라 감소되는 것을 특징으로 하는 조합체.
  25. 제21항~24항 중의 어느 한 항에 있어서, 사슬분자의 일부가 상기 표면과 결합하려고 하는 특성이 있는 관능기나 단편을 3개 이상 보유하고 있다면, 상기 사슬분자는 단백질이고, 상기 사슬분자의 상기 일부가 상기 표면과 결합하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  26. 제21항~24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 사슬분자가 화학적, 생화학적 또는 유전학적인 변형를 거친후에 또는 자연적인 형태로 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드군에 속하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  27. 제21항~24항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 사슬분자는 화학적, 생화학적 또는 유전적인 변형을 거친 후 또는 자연적인 형태로 상기 표면과 적어도 부분적으로 상호작용하려고 하는 폴리사카라이드군에 속하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  28. 제21항~27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 사슬분자가 아드레노코르티코스타디쿰,-아드레노릴티쿰, 안드로겐이나 안티안드로겐, 안티파라시티쿰, 아나보리쿰, 아나에스테티쿰이나 아날게시쿰, 아날레피쿰, 안티알레르지쿰, 안티아르히스미쿰, 안티아르테로크레로티쿰, 안티아스마티쿰 및/또는 브론코스파스모리티쿰, 안티바이오티쿰, 안티드레프레시붐, 및/또는 안티사이코티쿰, 안티디아베티쿰, 안티도트, 안티에메티쿰, 안티에피레피쿰, 안티피브리노리티쿰, 안티컨불시붐, 안티콜리네르지쿰, 효소, 보조효소 또는 대응하는 억제제, 안티히스타민쿰, 안티하이퍼톤니쿰, 약물 활성의 생물학적인 억제제, 안티하이포토니쿰, 안티코아굴란트, 안티미코티쿰, 안티미아스테니쿰, 모르버스 파킨슨이나 모르버스 알츠하이머에 대항하는 성분, 안티폴로지스티쿰, 안티리레티쿰, 안티우매티쿰, 안티셉티쿰, 호흡에 관여하는 아날레티쿰이나 호흡 자극제, 브론콜리티쿰, 카르디오토니쿰, 케모테라푸티쿰, 혈관 확장제, 키노스타티쿰, 디우레티쿰, 강글리움-차단제, 글루코코르티코이드, 안티플류 성분, 헤모스타티쿰, 히프노티쿰, 면역글로불린이나 그것의 단편 또는 다른 면역학적으로 활성인 물질, 생활성인 탄수화물(유도체), 피임약, 안티-마이그란 성분, 미네랄로-코르티코이드, 몰핀-길항제, 근육이완제, 나르코티쿰, 뉴로테라피티쿰, 뉴로렙티쿰, 뉴로트랜스미터나 그 길항제, 펩티드(유도체), 옵타미쿰, (파라)-심퍼티코미메티쿰이나 (파라)심퍼티코리티쿰, 단백질(유도체), 프소리아시스/뉴로데르미티스 약, 미드리아티쿰, 사이코스티뮬란트, 리놀로지쿰, 수면-유도제나 그 길항제, 안정제, 스파스모린티쿰, 튜머쿠모스타티쿰, 우롤로지쿰, 혈관수축제나 혈관이완제, 바이러스타티쿰 또는 어느 상처-치유 물질이나 상기 성분의 조합체로 작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  29. 제1항 또는 28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질의 사슬분자 또는 성분이 생장 조절 물질인 것을 특징으로 하는 조합체.
  30. 제1항 또는 29항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질 성분이 항체, 키토킨, 림포킨, 케모킨 및 식물, 박테리아, 바이러스, 파토겐이나 그 밖의 이뮤노겐의 대응하는 활성부위 또는 이러한 것들 중의 일부 및 변형체를 포함한 면역조절력을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  31. 제1항 또는 30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질 성분이 효소, 보조효소, 또는 일부 다른 종류의 생체촉매인 것을 특징으로 하는 조합체.
  32. 제1항 또는 31항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3물질 성분이 인터 알리아 어드헤린, 항체, 카테닌, 세렉틴, 캐페론 또는 그것의 일부분을 포함하는 인식 분자인 것을 특징으로 하는 조합체.
  33. 1항 또는 32항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 성분이 호르몬 특히 인슐린인 것을 특징으로 하는 조합체.
  34. 제1항 또는 33항 중의 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 인체생산형의 1~500 I.U.인슐린/mL, 특히 20~400 I.U.인슐린/mL, 가장 바람직하게는 50~250 I.U.인슐린/mL을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  35. 제1항 또는 34항 중의 어느 한 항에 있어서, 인터류킨을 0.01mg~20mg인터류킨/mL, 바람직하게는 0.1mg~15mg인터류킨/mL, 가장 바람직하게는 1mg~ 10mg인터류킨/mL로 함유하고, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12를 포함한 상기 인터류킨은 필요하다면 실제 필요한 약물농도범위로 희석한 뒤에 인간 또는 동물에 사용하기에 적당한 것을 특징으로 하는 조합체.
  36. IF 알파, 베타, 감마(반드시 이것에 제한되지는 않음)를 포함한 IF를 바람직하게는 0.1~15㎎인터페론/㎖ 및 가장 바람직하게는 1~10㎎인터페론/㎖로 함유하며, 20상대중량% 이하의 인터페론을 필요에 따라 상기 약물농도를 실제 필요한 농도범위가 되도록 최종적으로 희석시킨 후에, 인간이나 동물에 적당하게 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  37. 제1항 또는 36항 중의 어느 한 항에 있어서, 필요에 따라 사용 전에 희석시킨 후, 바람직하게는 인간 재조합형의 NGF을 25mg 신경 생장인자 (NGF)/mL 현탁액까지 또는 성분으로 25 상대중량%까지의 NGF, 특히 0.1-15 상대중량%의 단백질 및 가장 바람직하게는 1~10 상대중량%의 NGF을 함유하는 것을 특징으로 하는 조합체.
  38. 제1항 또는 37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액이 25면역글로불린 (Ig)mg/mL 이하 또는 전체 지질에 대하여 25 상대중량%의, 더 바람직하게는 0.1~10상대중량%의 단백질 및 가장 바람직하게는 1~10상대중량%의 면역글로불린을 함유하여, 상기 성분이 항체 그대로의 형태, 항체의 일부분 또는 생물에 적용할 수 있는 활성 변형체의 형태로 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 조합체.
  39. 생물학적, 화장품적 및/또는 약리적인 활성제의 제조방법에 있어서:
    적당한 액매와 접촉하여 결합될 경우에, 확장된 표면, 특히 막표면을 형성할 수 있고, 그 액매내에서 용해도가 서로 다른 2종 이상 양친매성 물질을 선택하는 단계; 및
    상기 물질들의 조합체에 의해서 형성되는 상기 표면이 상기 액매내에서 용해도가 작은 물질만으로 형성된 표면보다 더 크게 활성제와 결합할 수 있고 한가지 물질만으로 형성된 표면보다 확장된 표면을 형성하도록 하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표면 형성 물질의 조합체가 물질 분자의 존재하에 여과, 압력 변화, 기계적 균질화, 흔들기, 교반, 혼합, 기타 다른 제어된 기계적 분쇄에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 선택된 표면형성 물질의 조합체가 적당한 지지용 고체표면에 흡착되도록 하거나, 또는 그 고체표면에 영구접촉된 뒤, 여러물질을 차례로 첨가하거나 한꺼번에 첨가하여 액매와 영구접촉되어, 뒤의 표면-형성단계 중 한 단계이상이 고체-지지된 표면과 차례로 결합하는 성분의 존재하에 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  42. 제38항에 있어서, 액매중에 현탁되어 있거나 고체로 지지되어 있는 상기 흡착표면 또는 그 전단계 물질은, 표면-형성 분자를 혼합한 뒤, 결합분자를 첨가하고, 필요하다면 상기 표면을 손상시키지 않는 조건하에서 교반, 혼합, 또는 항온배양으로 상기 표면에 결합시키는 단계들에 의해 먼저 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  43. 제39항 또는 42항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 물질분자와 결합하는 표면이 제1항 또는 37항 중의 어느 한 항에 대응하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  44. 제39항 또는 43항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 액매 현탁액의 특성이 제1항 또는 37항 중의 어느 한 항에 대응하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  45. 당뇨병 치료제, 생장 인자, 면역조절제, 효소, 인지분자나 아드레노코르티코스타티카, 아드레노리티카 등과 같은 다양한 물질을 비-침투형으로 제조하는 방법에 있어서:
    상기 물질분자와 결합할 수 있는 표면이 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체, 1종 이상의 가장자리 활성 물질 또는 계면활성제, 1종 이상의 성분 및 경우에 따라서는 다른 종래의 성분으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  46. 제45항에 있어서, 1종 이상의 가장자리-활성 물질이나 계면활성제, 1종 이상의 양친매성 물질, 1종 이상의 친수성 유체 및 제제가 별도로 혼합되고, 필요에 따라 용해되어 용액을 형성한 뒤, 그 결과 생긴 혼합물이나 용액을 바람직하게는 기계적인 에너지를 이용해 상기 물질분자와 결합하는 물질로 만드는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  47. 제45항 또는 46항에 있어서, 상기 양친매성 물질은 그 자체로 사용되거나, 물 또는 물과 혼합될 수 있는 생리학적으로 호환성이 있는 극성용매에 용해되거나, 또는 극성용액과 함께 용매화조절제에 용해될 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 극성용액이 1종 이상의 가장자리-활성 물질 또는 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  49. 제45항 또는 48항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 유체상으로의 물질 첨가, 역상으로부터의 증발에 의해, 필요에 따라 흔들기, 교반, 진동, 균질화, 초음파처리, 전단, 동결건조 또는 편리한 구동압을 이용한 여과와 같은 기계적인 응력을 가한 주입 또는 투석에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 표면이 여과에 의해서 형성되고, 상기 여과물질의 공극의 크기는 0.01㎛~0.8㎛이고, 바람직하게는 0.02㎛~0.3㎛이며, 가장 바람직하게는 0.05㎛~0.15㎛이어서, 여러개의 필터를 순차적으로 또는 병렬로 사용할 수도 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  51. 제45항 또는 50항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 물질 및 캐리어는 적어도 부분적으로 흡착표면이 형성된 이후에 결합하도록 하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  52. 제45항 또는 51항 중의 어느 한 항에 있어서, 물질분자와 결합하는 상기 표면은 필요에 따라 적당한 농축제나 동결건조제로부터 사용하기 직전에 조제되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  53. 약물 캐리어, 약물 저장소의 조제용으로, 또는 다른 종류의 의학분야나 생물학분야에 응용하는 것을 목적으로 하는 제1항 또는 제52항 중의 어느 한 항에 따른 조합체의 용도.
  54. 생명공학이나 유전자 증식분야에 사용되는 제1항 또는 53항에 따른 조합체의 용도.
  55. 분리공정분야에서, (생물)처리 또는 진단을 목적으로 사용되는 제1항 또는 54항에 따른 조합체의 용도.
  56. (유도)단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리사카라이드와 같은 적어도 부분적으로 양친매성인 사슬분자 형태인 표면-결합분자를 안정화하고, 표면결합 상태로 상기 분자와 관련된 가수분해 공정에 사용하는 것을 목적으로 하는 제1항 또는 55항 중의 어느 한 항에 따른 조합체의 용도
  57. 상기 표면 결합분자와 복합적이고 순응적인 표면 사이의 결합이나 분리에 기구학적으로 및/또는 가역적으로 영향을 주어, 표면전하 밀도가 높을수록 및/또는 표면연성이 클수록 및/또는 표면결합밀도가 클수록 결합속도가 빨라지고, 또는 그 반대일수록 결합속도가 늦어지거나 부분적인 분자분리를 일으키는 제1항 또는 56항 중의 어느 한 항에 따른 조합체의 용도.
KR10-2000-7007020A 1998-10-23 1998-10-23 페이로드를 증가시키고, 분리/결합율을 제어하기 위한 거대 분자 결합체 및 복합응집체의 생장, 시험 및 사용방법 KR100464601B1 (ko)

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