CN1628638A - 含有奥沙利铂的脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种被亲水性聚合物和配基衍生化的含有抗肿瘤金属络合物的脂质体制剂。在一个实施方案中，抗肿瘤金属络合物是奥沙利铂，亲水性聚合物是聚乙二醇，配基是运铁蛋白。根据本发明，在肿瘤细胞表面表达的运铁蛋白受体能促进肿瘤细胞对脂质体中所含药剂的吸收。本发明还提供了含有脂质体的药物组合物及其使用方法。

Description

含有奥沙利铂的脂质体制剂

                         发明领域

本发明涉及一种用作抗肿瘤药的脂质体制剂。

                         背景技术

下述的本发明的背景仅提供给读者理解本发明，而不详细描述或组合本发明的现有技术。

顺铂是一种抗肿瘤药物，已被广泛用作治疗多种癌症，包括睾丸瘤、膀胱瘤、肾盂瘤、输尿管瘤、前列腺癌、卵巢癌、头部和颈部的癌、非小细胞型肺癌、食道癌、宫颈癌、神经母细胞瘤和胃癌。然而，因为顺铂毒性大且常常伴随着诸如包括急性肾衰竭的肾功能紊乱、骨髓功能的抑制、恶心、呕吐和食欲减退这些不利的副作用，所以它有很大的缺点。为了克服这些缺点，研制出了顺铂的衍生物例如卡铂和奥沙利铂。奥沙利铂的治疗作用与顺铂相同而肾毒性和致吐性相对较低。

脂质体常被用来降低某些药物的毒性。然而，许多化合物不能被有效地包裹在脂质体中，而且还伴随着脂质体制剂的稳定性问题。脂质体制剂还必须能使其被有效地传送到靶细胞。

因此，能提高含有抗肿瘤药的脂质体制剂的储存稳定性和它们被传送到靶肿瘤细胞的有效度的组合和方法有着极大的价值。

                         发明概述

本发明提供了一种在脂质体内含有抗肿瘤金属络合物的脂质体制剂。该脂质体用亲水性聚合物和配基衍生化。在各种实施方案中，抗肿瘤金属络合物选自：金、铜、铂、镍、钯、铁、钌和锇的络合物。在优选实施方案中，抗肿瘤金属络合物是奥沙利铂。在各种实施方案中，配基选自：运铁蛋白、叶酸、透明质酸、糖链-例如半乳糖或甘露糖、单克隆抗体、吡哆醛磷酸、维生素B12、唾液酸路易斯X(sialyl Lewis X)、肽-例如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血管细胞粘合分子(VCAM-1)、细胞间粘合分子(ICAM-1)、血小板内皮粘合分子(PECAM-1)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、或天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸(NGR)肽，和单克隆抗体的Fab’片断。在各种实施方案中，亲水性聚合物选自：聚乙二醇(PEG)、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙二醇和聚羟基环氧丙烷。在一个实施方案中，亲水性聚合物是聚乙二醇且配基是运铁蛋白。

“聚合物”是由两个或多个较小的分子(单体)共价连接在一起组成的。“亲水性聚合物”是在水溶液中易溶解的聚合物。在各种实施方案中，脂质体制剂所含奥沙利铂的浓度为1-20mg/ml、1-10mg/ml、5-10mg/ml、10-15mg/ml、15-20mg/ml，或大约8mg/ml、7.5-8.5mg/ml、7-9mg/ml、6-10mg/ml或7-10mg/ml。本文上下文中的“大约”指上下浮动10％。在其它实施方案中，可使用任意浓度的奥沙利铂，例如，大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％(w/v)。在一个实施方案中，提供了在蔗糖溶液中的脂质体制剂。在各种实施方案中，溶液中蔗糖的浓度大约为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％(w/v)。在各种实施方案中，溶液中有大约9％(w/v)、8.5-9.5％(w/v)、8-10％(w/v)或7-11％(w/v)的蔗糖。“衍生化”意味着脂质体与亲水性聚合物和配基之间共价结合。可通过将配基连接在与稳定地处在脂质体的脂质双层结构中的分子相连的亲水性聚合物或其他分子上进行衍生化。例如，配基可以连接在亲水性聚合物的远端，而亲水性聚合物的近端连接在稳定地处在脂质体的脂质双层结构中的磷脂分子的极性端基团上。也可通过将配基连接在自身稳定地处在脂质体的脂质双层结构中的分子上进行衍生化。例如，配基可以直接连接在脂质体的双层结构的磷脂成员上。在另一实施方案中，可通过将配基与连接在亲水性聚合物上的连接体共价相连进行衍生化，而这个亲水性聚合物共价连接在包埋于脂质体的脂质双层结构中的分子上。

在一个实施方案中，可通过将亲水性聚合物共价连接在脂溶性分子(例如，磷脂分子或脂肪酸分子)上进行衍生化，该脂溶性分子是脂质体双层结构的一部分，而配基共价连接在亲水性聚合物上(直接连接或通过连接体连接)进行衍生化。在一个实施方案中，亲水性聚合物的一端共价连接在脂质体中脂类的头部基团上(例如，PEG分子共价连接在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-DSPE上)，而另一端连接在配基上。“配基”指的是与哺乳动物细胞表面的受体或表面抗原相连的物质。“糖链”指的是单糖、双糖、寡糖和多糖。在各种实施方案中，糖链指的是半乳糖或甘露糖，或它们的聚合物。但在其它实施方案中，糖链指的是鼠李糖、海藻糖、木糖、阿拉伯糖，或葡萄糖分子，或两个或多个这些或其它单糖分子构成的链。在另外的实施方案中，糖链指的是双糖，例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖、纤维二糖，或任意这些二糖的聚合物，或寡糖或多糖链。

另一方面，本发明提供了一种含有包含在脂质体内的抗肿瘤金属络合物的脂质体制剂。亲水性聚合物稳定地存在于脂质体内且配基与亲水性聚合物相连。亲水性聚合物通过与作为脂质体双层结构成员的一部分的磷脂相连而稳定存在。“稳定存在”是指与聚合物相连的脂质体在4℃的温度下保存90天后仍有至少75％的聚合物与脂质体相连。在各种实施方案中，在4℃的温度下保存30天、60天、90天、120天、150天或180天后仍有至少75％、80％、85％、90％或98％的聚合物与脂质体相连。在一个实施方案中，聚合物通过共价连接(直接连接或通过连接体间接连接)在作为脂质体的双层结构成员的一部分的磷脂上而稳定存在。

另一方面，本发明提供了治疗肿瘤的药物组合物。该药物组合物包括本发明的制剂和药学上可接受的载体。

本发明也提供了治疗肿瘤的方法。这些方法包括给需要这种治疗的患者服用本发明的制剂或药物组合物。需要这种治疗的人包括患肿瘤或患癌症的人，但也包括设法预防或阻止肿瘤发展的人。该组合物可被用于缩小或杀死已存在的肿瘤，也可用于防止已存在的肿瘤变大或进一步扩散。在各种实施方案中，肿瘤指的是结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食道癌，或其它类型的癌症。

上面对发明内容的概述是非限定的，本发明的其它特征和优点将在下面对优选实施方式的具体描述和权利要求中体现。

                         附图说明

图1是显示本发明的结合了运铁蛋白的脂质体的制备过程的流程图。

图2是显示奥沙利铂的细胞毒性的图表。y轴表示在用1μg/ml、5μg/ml、100μg/ml的奥沙利铂治疗后存活的细胞数。该值表示未经治疗的对照细胞数目(即奥沙利铂的浓度为0时)的百分数。数据显示LD₅₀(即50％细胞死亡时奥沙利铂的浓度)为8μg/ml。

图3是显示未经修饰的脂质体、PEG脂质体和运铁蛋白-PEG脂质体的物理特性的表。

图4是显示正常白细胞和各种类型肿瘤衍生的细胞系的细胞表面的运铁蛋白受体数目的图。

图5是显示服用未经修饰的脂质体、PEG脂质体和运铁蛋白-PEG脂质体的大鼠的血性腹水和肿瘤结节的发生率的表。

图6是显示本发明的奥沙利铂脂质体对Colon 26细胞的细胞毒性的图示说明。该图示显示了奥沙利铂溶液、Bare-脂质体制剂、PEG脂质体和运铁蛋白-PEG脂质体对Colon 26细胞的LD₅₀值分别为2μg/ml、60μg/ml、18μg/ml和8μg/ml。

图7是显示本发明的奥沙利铂的脂质体对AsPC-1细胞的细胞毒性的图示说明。该图示显示了奥沙利铂溶液、Bare-脂质体制剂、PEG脂质体和运铁蛋白-PEG脂质体对AsPC-1细胞的LD₅₀值分别为5μg/ml、45μg/ml、75μg/ml和8μg/ml。

                       对发明的详细描述

脂质体或脂质囊是有水性内核的球状脂质双层结构。其包括一系列双分子脂质层的洋葱样结构被水溶液彼此分隔开，最外层是脂质。脂质体在包裹用于各种用途的生物活性物质上有很大的优越性。脂质体可以是单层的或多层的。多层脂质体由许多插有水性介质的双分子层构成。它们有包括一系列被水溶液彼此分隔开的双分子脂质层的洋葱样结构，其最外层是脂质。单层的囊有单一的包裹水溶液的球状脂质双层。根据它们的大小，将其分为小的单层囊(SUV)，其直径为250nm或更小，和大的单层囊(LUV)，其直径大于250nm。不论是单层囊(小的或大的)或多层脂质体均能应用于本发明。在本发明的一个实施方案中，脂质体是小的单层囊，其直径小于200nm。

在形成脂质体时，水溶液中的分子被包裹入脂质体的水性核心中，因此将其保护起来免受外界环境的影响。由于脂质体能与细胞膜融合，体内注射的脂质体能被有效地输送至细胞质。

奥沙利铂，反式-1-1，2-二氨基环己烷的铂(II)顺-草酸基络合物(platinum(II)cis-oxalato complex)，是一种铂的络合物，用下式表示：

奥沙利铂是一种有效的抗肿瘤或抗癌药物，它的治疗活性与顺铂相同而肾毒性和致吐性较低。它特别用于治疗结肠癌，但也有效地用于治疗胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、食道癌和其它的癌症。奥沙利铂的制备工艺在本领域是已知的(例如，参见日本专利公开JP-9-40685)。在本发明的组合物中，奥沙利铂可以存在于水溶液中，将溶液包裹于脂质体中，使得奥沙利铂在脂质体中的浓度为1-20mg奥沙利铂/ml溶液。在一个实施方案中，本发明脂质体制剂含有1-20μg奥沙利铂/mg脂质，和100-300μg配基/mg脂质。

在一个实施方案中，脂质体在9％蔗糖(w/v)、8-10％蔗糖(w/v)、8.5-9.5％蔗糖(w/v)或大约9％蔗糖(w/v)溶液中含有奥沙利铂。发现此蔗糖浓度能使脂质体包裹更多量的奥沙利铂。因为9％的蔗糖溶液是等渗的，含有奥沙利铂的脂质体能被生理盐水稀释，并在循环的血液中稳定。意外地发现这种脂质体能被输送到肿瘤部位(损伤)而不发生显著的奥沙利铂从脂质体中泄漏。此外，糖溶液的一般功能可保护脂质体膜，这样一种脂质体制剂可以冷冻干燥并能长期保存而无不良影响。

脂质体制剂

在一个实施方案中，本发明的脂质体是通过将磷脂溶解在合适的有机溶剂中，然后将生成的溶液分散在含有治疗成分的水溶液中，然后将形成的分散体进行超声或反相蒸发。许多磷脂可用于本发明。例如，卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、双硬脂酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂、磷脂酰甘油、鞘磷脂或磷脂酸都可用于本发明。为了改善脂质膜的稳定性和渗透性，可以加入另外的亲脂性成分，例如，胆固醇或其它类固醇、硬脂醇胺、磷脂酸、三十二烷磷酸酯、生育酚或羊毛脂提取物。

在其它实施方案中，可以用磷脂、中性脂质、表面活性剂或其它有关的有类似两亲性的化合物制备本发明的脂质囊。可以按式A-B将这些材料分类，A是亲水性的，通常是极性基团，例如，羧基基团；B是疏水性的，即亲脂性的、非极性基团，例如长链脂肪烃基团。如前所述，值得注意的是脂质成分的组合物可以变化很大而不会明显降低包裹性能，也可以使用上述所列出的之外的其它脂质。

此外，可以用亲水性聚合物修饰脂质体以防止脂质体被细胞内皮系统吸收，并增强肿瘤组织对脂质体的吸收。用亲水性聚合物对脂质体的修饰延长了脂质体在血液中的半衰期。许多亲水性聚合物可用于本发明，包括例如，聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙二醇、聚羟基环氧丙烷、聚氧化烯(polyoxyalkylenes)、聚醚胺。另外的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇和聚天冬酰胺。聚合物可以作为均聚物或嵌段共聚物或无规共聚物。

配基衍生化

本发明的脂质体制剂的进一步特征是用配基对脂质体衍生化。在一个实施方案中，配基是运铁蛋白。运铁蛋白是一种铁结合蛋白，它经定位在细胞表面的运铁蛋白受体，通过与运铁蛋白连接的Fe³⁺的细胞吞噬现象促使铁吸收到哺乳动物的细胞中去。运铁蛋白因此起着向细胞供铁的作用。运铁蛋白受体通常在肿瘤细胞中比在正常细胞中有更大数量的表达。这在许多不同种类的肿瘤中都存在。因此，通过将运铁蛋白与治疗药物连接，通过运铁蛋白受体增加肿瘤细胞对治疗药物的吸收。

另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，即本发明的脂质体制剂和药物可接受的载体。载体包括，例如无菌水、缓冲溶液和盐水。该药物组合物可以按需要进一步任意包含各种盐、糖、蛋白质、淀粉、明胶、植物油、聚乙二醇。在各种实施方案中，本发明的脂质体制剂可经静脉注射或肝动脉注射系统给药。但也可使用其它给药方式，例如，肿瘤部位的局部注射、静脉或动脉内注射、向肿瘤外部的滴注，或经过药丸注射或连续注射的胃肠外给药。多层脂质囊也能通过局部注射给药，甚至以油膏的形式给药。可根据给药途径、病情的严重程度、被治疗的病人的年龄和病情以及副作用的程度改变剂量，但通常在大约10至100mg/m²/天的范围内。本发明的药物组合物治疗肿瘤和癌症有效。

本文引用的所有专利和文献的公开全部结合于此作为参考，包括全部表格、图和权利要求书。

下述的实施例进一步说明本发明。下面的实施例是非限制性的，仅代表本发明的一些方面和特征。

                        具体实施方式

实施例1  脂质体的制备

该实施例提供了制备本发明的脂质体组合物的一个通用的策略。当然也可以采用本领域的技术人员通过参考这个公开的策略能得到的其它策略。该实施例描述了使用反相蒸发(REV)制备本发明脂质体制剂的实施方案(例如，参见美国专利US-4,235,871的更详细的描述)。

为了将亲水性聚合物稳定地保存在脂质双层中，可以先制备亲水性聚合物的磷脂衍生物，然后再用磷脂衍生物和磷脂以及脂质一起制备脂质体。将亲水性聚合物合成为衍生物，其中磷脂部分化学连接在聚合物上。衍生物的磷脂部分因此起到了在脂质双层中稳定地保存衍生物的作用。亲水性聚合物的磷脂衍生物可以用这样一种方式制备，例如，美国专利US-5013556中描述的那样。如聚乙二醇这样的亲水性聚合物，用氰尿酸在碱性有机溶剂中处理以活化亲水性聚合物的一个末端，其产物与磷脂-如磷脂酰乙醇反应，由此得到了亲水性聚合物的磷脂衍生物。亲水性聚合物的其它末端也可有功能基团，例如羧基或顺丁烯二酰亚胺，配基连接在其上。

因此，磷脂(例如二硬脂酰卵磷脂(DSPC))或(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE))、脂质(胆固醇)和亲水性聚合物的磷脂衍生物(聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺)混合并溶解在适当的有机溶剂中。磷脂和脂质以2∶1至1∶1之间的比例混合，而3∶1至1∶3之间的比例也适合。在一个实施方案中，使用了分子量大约是2750的DSPE-PEG，其中PEG大约占了2000。用大约占所有总脂质5mol％的亲水性聚合物的磷脂衍生物混合，而亲水性聚合物的磷脂衍生物重量比约占全部脂质的至少约为1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％都是合适的。在另一个实施方案中，使用了至少约为全部脂质15mol％的磷脂。这些用量使脂质体能在血液中存留最大的时间。制得的溶液与奥沙利铂的水缓冲溶液混合。在其它实施方案中，DSPC∶CH∶DSPE-PEG＝1∶1∶0.1(摩尔比)，DSPE/PEG大约占总脂质的5mol％。含水溶液中奥沙利铂的浓度大约从5至10mg/ml(然而从1至20mg/ml的浓度也都适合)。溶剂的混合物超声后再蒸发以除去溶剂。所制得的脂质体是体积分级的，以提供直径大约0.2μm的含奥沙利铂的脂质体。

接着，将配基连接在脂质体上。在该实施例中，配基是运铁蛋白。运铁蛋白是商业可得的纯化蛋白质(Biocompare，Burlington，CA)。为了将运铁蛋白连接在脂质体上，可先将一个另外的功能基团引入到连接在存在于脂质体膜中的磷脂衍生物的亲水性聚合物上。因此，一个在一个末端导入了羧基或顺丁烯二酰亚胺基团的亲水性聚合物被加到磷脂上以形成外表面有羧基或顺丁烯二酰亚胺基团的脂质体。

在末端是羧基基团的情况下，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺的氢氯化物(EDC-HCL)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺连在脂质体上。所得的有连接体的脂质体与运铁蛋白反应以获得运铁蛋白结合的脂质体的脱-形式(anapo-form)，其中运铁蛋白结合在外表面。用柠檬酸铁/柠檬酸钠处理所得的脂质体以获得运铁蛋白结合的脂质体的完整形式(图1)。

在末端有顺丁烯二酰亚胺基团的情况下，有连接的连接体的脂质体与先引入了SH基团的运铁蛋白反应，接着以与前述同样的方式加入铁，以制备运铁蛋白结合的脂质体的完整形式。

除了这些实施例外，其他的氨基、巯基、乙醛和碳二亚胺基团也能用作适合的连接体。

实施例2  脂质体制备

在此制备脂质体的可选择的方式中，脂质膜的形成步骤是在一个部分填充有惰性固体接触物质的容器中进行的。重要的变化可以是大小、体积分布、形状和接触物质的成分。接触物质的首要特征是：(1)接触物质对配方中所用的材料是惰性的，换句话说，在接触物质与所用的脂质、亲脂性物质、有机溶剂或水性液体之间没有不需要的反应，且(2)接触物质在反应步骤中一直是固体，换句话，接触物质不应溶解或碎裂，而应能提供一个适当的固体表面支持液相薄膜。前面的试验性测试用玻璃珠或玻璃球作为惰性固体接触物质，已证明这些材料特别适合。也期望金属球-例如不锈钢球，和合成物质-如塑料，在合适的环境下也适用。球形接触物质在给定的体积下提供了最大的表面积且在搅拌步骤中易于流动，也可使用其他规则或不规则的形状。

在任何应用中所用的接触物质的大小取决于操作规膜、搅拌强度和其他因素。作为一个实施例，通常希望使用的接触物质具有的体积使容器体积对单个的接触物质的体积之比在50到50,000之间。一般来说，球形接触物质的直径在1.0mm到100mm之间。还要补充的是接触物质的大小应分布在一定的范围内。但同样体积的接触物质会充分满足本发明的需要。所用接触物质的数目由它们的形状、大小、容器的大小、所用有机溶剂的体积及脂质或所溶解的亲脂性物质的量来确定。用合适的数量以增加在蒸发步骤中的表面积，且增加形成的脂质薄膜的总面积，但为了在搅拌步骤中运动接触物质，在容器中要保留充分的体积。

能通过将脂质成分(用亲水性聚合物衍生的)与其他任何亲脂性物质和奥沙利铂溶解在合适的、通常是非极性的有机溶剂中一起来制备脂质体。选择有机溶剂使其能通过蒸发从脂质中基本除去而不影响其他在配方中包括的亲脂性物质。适宜溶剂的例子包括醚、酯、醇、酮和各种芳香族的和脂肪族的烃类化合物，包括碳氟化合物。可使用单独或联合溶剂，如氯仿和甲醇的2∶1混合物。可通过蒸发除去有机溶剂，通常在20℃到60℃温度下，在低于大气压的压力下通过旋转蒸发来完成。蒸发条件取决于有机溶剂和配方中所使用的亲脂性物质的物理性质。

在脂膜形成步骤之后，用含水液体水合脂类以形成脂类的水分散体。所需的搅拌可以通过在容器中旋转或移转-即振荡来实现。容器中惰性固体接触物质的存在使机械搅拌强度增强并得以持续，这促进了均一体积的脂质囊的形成。这个水合步骤在高于脂质成分的转化温度的条件下进行。

水性液体可以是纯水，但也可以是任何电解质或生物活性物质的水溶液。例如，可以使用NaCl或CaCl₂的水溶液。

在搅拌脂质水溶液混合物后，使所得分散体在充足的时间内保持安静，以使脂质囊形成并熟化。在一个实施方案中，容器在室温静置大约1到2小时。然后可以从含有惰性固体接触物质的容器中回收多层脂质体囊的水分散体系。如果需要，可以用已知技术如重复离心、透析或柱色谱从分散体系中回收任何非结合的活性物质。可以将脂质体囊重新悬浮在任何合适的电解质缓冲液中以在随后使用。

至此，如上所述，通过连接所选择的连接键和配基完成了脂质体的制备。

实施例3  奥沙利铂的细胞毒性

通过将奥沙利铂以8mg奥沙利铂/ml溶液的浓度溶解在9％的蔗糖溶液中，制备奥沙利铂溶液。

在有各种浓度的奥沙利铂溶液的补充了10％胎牛血清的RPMI 11640培养基中，将AsPC-1细胞在37℃用5％CO₂培养4小时。更换培养基，细胞再培养48小时。用商业可得的细胞毒性测试盒测定细胞生存能力，例如，APO-ALERT^TM测试盒(Clontech，BD，Biosciences，Clontech，Palo.Alto，CA)。在细胞中加入培养基且在5％CO₂中培养2小时，在450nm处测定显色(参考波长：620nm)。结果如图2所示。奥沙利铂的LD₅₀＞8ug/ml。

实施例4  制备含奥沙利铂的脂质体

该实施例提供了本发明脂质体组合物的另一个实施方案。根据本实施方案制备的脂质体含有下列物质

1、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)

2、胆固醇(CH)

3、N-(氨基甲酰基甲氧基-聚乙二醇2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-OMe)

4、(羧基聚乙二醇3000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-COOH)

这些组分以下述比例存在：

DSPC∶CH∶DSPE-PEG-OMe∶DSPE-PEG-COOH＝2∶1∶0.19∶0.01(m/m)。对于水相，使用奥沙利铂溶液(8mg/ml，在9％蔗糖溶液中)。

将DSPC、胆固醇、PEG2K-OMe和PEG3K-COOH以2∶1∶0.19∶0.01(m/m)的比例的混合物，溶解在氯仿和异丙醚中。在所得到的溶液中加入奥沙利铂溶液(在9％蔗糖溶液中)并进行超声。该溶液在60℃蒸发以除去溶剂，重复冻干5次。在60℃用挤压机(Avestin，Ottawa，Canada)的滤膜筛分所得产品(用400nm滤膜过滤2次，再用100nm滤膜过滤5次)，再离心2次，转速200,000g，每次30分钟。在挤出过程中，脂质囊一般地在压力下被物理挤压通过预先确定孔径的聚碳酸酯滤膜。所得沉淀在9％蔗糖溶液或2-(N-吗啉代)-乙基磺酸(MES)的缓冲液(PH5.5)中重新悬浮以获得奥沙利铂-PEG(-COOH/-OMe)脂质体。

含PEG的脂质体用运铁蛋白(TF)衍生化。然后将按前述方法制备的奥沙利铂-PEG(-COOH/-OMe)脂质体与1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)(以相对于脂质成分重量的2.7％的量)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(S-NHS)(以相对于脂质成分重量的7.3％的量)混合，然后将混合物在室温中静置10分钟。所得溶液与运铁蛋白(TF)(以相对于脂质成分重量的20％的量)反应，并于室温下搅拌3小时。溶液在200,000g离心30分钟，所得沉淀重新悬浮在9％蔗糖溶液中。

在如上制备的TF(-PEG)脂质体的脱-形式中加入柠檬酸铁-柠檬酸钠，然后在室温搅拌15分钟。所得溶液在200,000g离心30分钟。得到的沉淀重新悬浮在9％蔗糖溶液中，以得到完整形式的TF(-PEG)脂质体。

如上制备的未修饰脂质体、PEG-脂质体和TF-PEG脂质体的物理特性概括于图3。

实施例5  测定细胞表面运铁蛋白受体的数目

该实施例描述了测定细胞表面运铁蛋白受体数目的一种方法。在该实施例中采用正常人的白细胞和来源于不同的恶性肿瘤细胞系(K562、MKN45P和HL60)的人类细胞，由Scatchard分析法测定细胞表面的运铁蛋白(TF)受体的数目。向细胞培养物加入不同浓度的¹²⁵I标记的TF溶液并在4℃保温1小时。用蛋白质测定分析法测定TF的浓度，用伽马计数器测定放射活性。将溶液离心以使细胞沉淀，用冰冷却的缓冲液洗涤细胞碎片，并用伽马计数器测定以确定与细胞表面结合的TF的浓度。用蛋白质定量测定法测定细胞的数目。从最初加入的TF的已知浓度中扣除结合TF的浓度，计算出未结合的TF的浓度。通过在纵轴标出结合TF的浓度，以水平轴表示结合TF的浓度与未结合TF的浓度的比例，从斯卡查德(Scatchard)测绘曲线测定结合TF的数目(即，受体的数目)。从图中X轴的截距求出已结合的TF数目(即，受体的数目)。

在不同细胞类型中，结合在细胞表面的¹²⁵I-TF的数量如图4所示。发现来自人恶性肿瘤细胞系的细胞表面的运铁蛋白受体数目显著高于正常白细胞上的数目。

实施例6  含奥沙利铂的脂质体对腹膜接种模型的治疗效果

这个实施例说明了本发明的脂质体组合物相与简单的奥沙利铂溶液相比的治疗效果。以6到7周大的雄性BALB/c nu-nu裸鼠作为动物模型，以ASPC-1细胞(来自人胰腺癌)和MKN45P细胞(来自人胃癌)作为肿瘤细胞。

在试验第0天时，将AsPC-1细胞(2×10⁶细胞)或MKN45P细胞(1×10⁷细胞)腹膜内注射入裸鼠体内。在第1天和第4天时，将按实施例1制备的脂质体或奥沙利铂溶液(8mg/ml，在9％蔗糖溶液中)分别腹膜内注射入裸鼠体内。在2种情况下，奥沙利铂的浓度调整到5mg奥沙利铂溶液/kg体重。使用Tf-PEG脂质体、PEG脂质体、没有修饰的脂质体。PBS给药作为阴性对照。

注射AsPC-1细胞的裸鼠在第21天时被打开腹腔，注射MKN45P细胞的裸鼠在第16天和26天时被打开腹腔。观察体内有无血性腹水和肿瘤结节。结果示于图5。

研究发现给予本发明的Tf-PEG脂质体的裸鼠与给予未经修饰的脂质体及PEG脂质体的裸鼠相比，体内血性腹水和肿瘤结节的发生率显著降低。

实施例7  奥沙利铂(奥沙利铂)脂质体对肿瘤细胞的细胞毒性

Colon 26细胞和AsPC-1细胞在96孔的平板上，以每孔5×10³细胞的比例培养，并用5％CO₂预培养过夜。

奥沙利铂(奥沙利铂)溶液或各种类型的脂质体以表1所示的浓度被加入到细胞中。细胞在5％CO₂中于37℃培养4小时。除去测试溶液，培养物继续培养两天，然后统计活细胞数。用WST-1测定法测定细胞生存力。

根据WST-1测定法，测试溶液含有5mmol/L WST-1试剂(10μL)；20mmol/LHEPES；0.2mmol/L 1-甲氧基-PMS；pH值为7.4。在每个孔中加入测试液，充分混匀，在CO₂培养箱中培养两个小时使显色。在平板读数计上在400-450nm处测吸收度，参考波长大于600nm。

奥沙利铂(奥沙利铂)溶液与各种类型的脂质体制剂相比对Colon 26细胞和AsPC-1细胞的细胞毒性分别如图6和7所示。图6显示了奥沙利铂(奥沙利铂)溶液、Bare-脂质体、PEG-脂质体和TF-PEG-脂质体对Colon 26细胞的LD₅₀值分别为2μg/ml、60μg/mL、18μg/mL、8μg/mL。它们对AsPC-1细胞的LD₅₀值分别为5μg/mL、45μg/mL、75μg/mL和8μg/mL。

因此，奥沙利铂溶液显示最高毒性。TF-PEG-脂质体对Colon 26细胞的ED₅₀大约比PEG-脂质体高2.3倍，比Bare-脂质体高7.5倍。对于AsPC-1细胞，TF-PEG-脂质体的毒性大约比PEG-脂质体高9.4倍，比Bare-脂质体高5.6倍。此外，TF-PEG-脂质体显示细胞毒性的浓度要低于其它脂质体制剂。

表1

	LD50(Colon 26细胞)	LD50(AsPC-1细胞)
			奥沙利铂溶液	2μg/mL	5μg/mL
包裹了奥沙利铂的TF-PEG-脂质体	8μg/mL	8μg/mL
			包裹了奥沙利铂的-PEG-脂质体	18μg/mL	75μg/mL
包裹了奥沙利铂的Bare-脂质体	60μg/mL	45μg/mL

本发明在此说明性地描述的内容可以在缺少任何本文中未特别公开的一个或几个元素、一个或几个限定的情况下进行。所用的术语和表达只作为描述性而非限定性的术语，在使用这些术语和表达时并不排除任何显示和描述的特征或相关部分的等同物，但值得注意的是在本发明权利要求范围内的各种变型是可能的。因此，应理解虽然通过优选实施方案和选择性的特征已经详细公开本发明，本领域的技术人员可以采用在此公开的设想，这些改进和变化也在附带的本发明的权利要求书限定的范围内。

本文所提到或引用的文章、专利、专利申请和所有其它文件和可应用的电子信息的内容，将它们完全结合于此作为参考，正如将每个出版物作为参考被特别和单独地结合在一起一样。申请人保留将此申请实际地与这些文章、专利、专利申请或其他文献中的任何一篇或所有材料结合的权利。

在此详细地描述的本发明在缺少任何本文中未详细公开的一个或几个元素、一个或几个限定的情况下可能适当地实施。因此例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应理解为开放式而非封闭式的概念。另外本文所用的术语和表达只作为叙述性而非限定性的术语，在使用这些术语和表达时不排除任何所示和描述的特征或相关部分的等同物，但应认识到不同变型也可能在本发明权利要求的范围内。因此，应理解虽然通过优选的实施方案和选择性的特征已经特别公开了本发明，本领域的技术人员可以采用本文内容所体现的本发明的改进和变型，这些改进和变型被认为在本发明的范围内。

在此已大致地和一般性地描述了本发明。落在一般性公开范围内的每个更窄的种和下位的分组也构成了本发明的一部分。这包括了本发明的一般性描述，并具有从一般性范围内排除任何主题的前提或否定性限定，无论去除的物质在此是否被特别详述过。

此外，当以马库什基团的方式描述本发明的特征或各方面时，本领域的技术人员将认识到也能以马库什基团的任何单独成员或多成员亚组的方式描述本发明。

其他实施方案在下述权利要求书中列出。

Claims (12)

1.一种被亲水性聚合物和配基衍生化并在其中包含抗肿瘤金属络合物的脂质体制剂。

2.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于抗肿瘤金属络合物选自：金、铜、铂、镍、钯、铁、钌和锇的络合物。

3.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于抗肿瘤金属络合物是奥沙利铂。

4.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于配基选自：运铁蛋白、叶酸、透明质酸、糖链、单克隆抗体、单克隆抗体的Fab’片断和肽。

5.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于配基是运铁蛋白。

6.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于亲水性聚合物选自以下组分：聚乙二醇、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙二醇和聚羟基环氧丙烷。

7.根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于亲水性聚合物是聚乙二醇。

8.根据权利要求3所述的脂质体制剂，其特征在于奥沙利铂以6-10mg/ml的浓度存在。

9.根据权利要求3所述的脂质体制剂，其特征在于奥沙利铂以7-9mg/ml的浓度存在。

10.根据权利要求3所述的脂质体制剂，其特征在于奥沙利铂存在于8-10％的蔗糖溶液中。

11.根据权利要求3所述的脂质体制剂，其特征在于奥沙利铂以7-9mg/ml的浓度存在于8-10％的蔗糖溶液中。

12.一种治疗肿瘤的药物组合物，含有根据权利要求8所述的脂质体制剂和药学上可接受的载体。

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