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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von lipidischen Mikropartikeln,
wie Liposomen, Lipid:DNA-Komplexen, Lipid:Medikamentkomplexen und
Mikroemulsionströpfchen,
welche an Proteinen befestigt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung
lipidische Mikropartikel mit befestigten Proteinen, welche zuerst an
Linkermoleküle
mit einer hydrophilen Polymerdomäne
und einer hydrophoben Domäne,
die fähig
zur stabilen Assoziation mit dem Mikropartikel ist, konjugiert worden
sind, oder Proteine, welche konstruiert worden sind, um eine hydrophile
Domäne
und eine Lipidhälfte
zu enthalten, welche die stabile Verbindung mit einem lipidischen
Mikropartikel ermöglicht.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Liposomen,
welche aus amphiphilen kationischen Molekülen bestehen, sind nützliche
nichtvirale Vektoren für
die Genzuführung
in vitro und in vivo (übersichtsmäßig zusammengefasst
in Crystal, Science 270: 404–410
(1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate
Chem. 5: 382–389
(1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); und Gao et al.,
Gene Therapy 2: 710–722
(1995)). In der Theorie komplexieren die positiv geladenen Liposomen
an negativ geladenen Nukleinsäuren
mittels elektrostatischer Wechselwirkungen unter Bildung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen.
Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
weisen mehrere Vorteile als Gentransfervektoren auf. Anders als
virale Vektoren können
die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
verwendet werden, um Expressionskassetten von im Wesentlichen unbeschränkter Größe zu übertragen.
Da den Komplexen Proteine fehlen, können sie weniger immunogene und
entzündliche
Antwortreaktionen hervorrufen. Darüber hinaus können sie
nicht replizieren oder unter Bildung eines infektiöses Agens
rekombinieren und sie besitzen eine niedrige Integrationshäufigkeit.
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Es
gibt eine Reihe von Veröffentlichungen,
welche überzeugend
aufzeigen, dass amphiphile kationische Lipide eine Genzuführung in
vivo und in vitro vermitteln können,
indem die nachweisbare Expression eines Reportergens in kultivierten
Zellen in vitro gezeigt wird (Feigner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 7413–17
(1987); Loeffler et al., Methods in Enzymology 217: 599–618 (1993);
Feigner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550–2561 (1994)). Weil Lipid:Nukleinsäurekomplexe
gelegentlich nicht so effizient wie virale Vektoren zum Erzielen
eines erfolg reichen Gentransfers sind, sind große Anstrengungen in die Ermittlung
von kationischen Lipiden mit erhöhter
Transfektionseffizienz gerichtet worden (Gehr, Bioconjugate Chem.
5: 382–389 (1994);
Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene
Therapy 2: 710–722
(1995)). Lipid:Nukleinsäurekomplexe
werden mit Enthusiasmus als ein potenziell nützliches Werkzeug für die Gentherapie
angesehen.
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Mehrere
Gruppen haben die Verwendung von amphiphilen kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen zur
in-vivo-Transfektion sowohl in Tieren als auch in Menschen berichtet
(übersichtsmäßig zusammengefasst in
Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722
(1995); Zhu et al., Science 261: 209–211 (1993); und Thierry et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9742–9746 (1995)). Allerdings wurden
die technischen Probleme bei der Herstellung von Komplexen, welche
stabile Haltbarkeitsdauern besitzen, nicht behandelt. Anders als
virale Vektorpräparationen
sind Lipid:Nukleinsäurekomplexe
zum Beispiel hinsichtlich der Partikelgröße instabil (Gehr, Bioconjugate
Chem. 5: 382–389
(1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); Gao et al., Gene Therapy
2: 710–722
(1995)). Es ist deshalb schwierig, homogene Lipid:Nukleinsäurekomplexe
mit einer für systemische
Injektion geeigneten Größenverteilung
zu erhalten. Die meisten Präparationen
von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
sind metastabil. Folglich müssen
diese Komplexe typischerweise innerhalb einer kurzen Zeitdauer verwendet
werden, welche im Bereich von 30 Minuten bis zu wenigen Stunden
liegt. In jüngeren
klinischen Versuchen unter Verwendung von kationischen Lipiden als
Träger
für DNA-Zuführung wurden
die zwei Komponenten direkt am Bett des Patienten vermischt und
unverzüglich
verwendet (Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)). Die strukturelle
Instabilität,
zusammen mit dem Verlust an Transfektionsaktivität des Lipid:Nukleinsäurekomplexes
mit der Zeit, sind Herausforderungen für die zukünftige Entwicklung einer lipidvermittelten
Gentherapie gewesen.
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Liposomen,
welche aus amphiphilen kationischen Molekülen bestehen, sind selbstverständlich nicht die
einzige Form von lipidischen Mikropartikeln, und Gentherapie ist
nicht die einzige Anwendung für
solche Partikel. Lipidische Mikropartikel sind auch für die Zuführung von
Medikamenten und anderen Mitteln an Zielstellen eingesetzt worden.
Die Ziellenkung bzw. das Targeting der Mikropartikel wird typischerweise
durch die Verwendung eines an der Oberfläche des Mikropartikels befestigten
Proteins erzielt, welches zum Beispiel ein Ligand für einen
Zelloberflächenrezeptor
auf einem Zelltyp von Interesse sein kann. Umgekehrt kann das Protein
ein Antikörper
sein, der ein Antigen auf einem Zelltyp von Interesse, wie erkrankten
Zellen, welche spezifische Marker tragen, spezifisch erkennt. Zusätzlich dazu
können
Proteine für
andere Zwecke als dem Targeting befestigt werden. Zum Beispiel können Liposomen
Proarzneistoffe enthalten, welche langsam aus dem Liposom in den
Kreislauf einsickern. Ein an dem Liposom befestigtes Enzym kann
dann den Proarzneistoff in seine aktive Form umwandeln.
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Derzeitige
Verfahren zur Bewirkung der Befestigung von Proteinen an lipidischen
Mikropartikeln lassen sich in zwei Typen einteilen. Der erste Typ
erfordert das Einbringen eines Linkermo leküls, welches eine "aktive" Gruppe trägt (eine
solche, welche mit einer funktionellen Gruppe des Proteins reagiert),
in die Mikropartikelzusammensetzung vor der Konjugation des "aktivierten" Partikels mit dem
Protein von Interesse. Verfahren dieses Typs weisen die folgenden
Nachteile auf: häufig
unkontrollierbare, unvollständige
Reaktion des Proteins mit dem Linker; Vorhandensein von überschüssigem Linker
auf dem resultierenden Konjugat, potenziell nachteilige Auswirkung
des Linkers auf die Stabilität
des Partikels, sowie das Unvermögen,
mit dem Linker reaktive Komponenten in die Zusammensetzung des Partikels
einzubringen.
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Die
zweite Gruppe von Verfahren verwendet die Schritte des (a) Befestigens
einer hydrophoben Hälfte bzw.
Einheit, wie einer Kohlenwasserstoffkette, an dem Proteinmolekül, (b) Lösens der
Komponenten des lipidischen Mikropartikels, zusammen mit dem Konjugat
von Schritt (a) in Gegenwart eines Detergens, und (c) Entfernens
des Detergens, was die Bildung des lipidischen Partikels unter Einbindung
des Proteinkonjugats bewirkt (Torchilin, Immunomethods 4: 244–258 (1994);
Laukkanen et al., Biochemistry 33: 11664–11670 (1994). Diese Verfahren
weisen eine Reihe von Nachteilen auf, einschließlich der Verhängung schwerer
Einschränkungen
auf den Spielraum an Verfahren, durch welche das Partikel gebildet
werden kann (z. B. ist die Detergens-Entfernungstechnik erforderlich)
und durch welche das Medikament oder ein anderes Mittel in das Mikropartikel
geladen werden kann. Darüber
hinaus erfordert der Schritt (b) das Lösen des Mikropartikels. Diese
Verfahren sind deshalb nicht in der Lage, ein Protein an ein vorgefertigtes
Partikel zu befestigen, ohne es zuerst zu zerstreuen. Das Vorhandensein
von Detergens in diesem Verfahren ist unvermeidbar, weil das hydrophob
modifizierte Protein ohne ein Detergens in wässrigem Medium unlöslich ist.
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Über die "Insertion" von hydrophilem
Polymer-Lipid, das an ein kleines (5 Aminosäuren) Oligopeptid oder kleines
Oligosaccharid gebunden ist, in Liposomen wurde berichtet (Zalipsky
et al., Bioconjugate Chem. 8:111–118 (1997)). Das verwendete
Peptid und Oligosaccharid waren jedoch von einer Größe (Molekulargewicht,
500–3000
Da), welche kleiner oder vergleichbar zum Linker selbst (Molekulargewicht
2750 Da) war. Diese Untersuchung liefert daher keine Richtlinie
für das
Inserieren von Proteinen, wie Antikörpern oder Fragmenten davon,
welche an signifikant kleinere Linker als das Protein konjugiert
sind, in Liposomen oder andere lipidische Mikropartikel. In Hinsicht
auf die hydrophile Natur von Antikörpern und anderen Proteinen,
wurde im Fachgebiet gelehrt, dass der größere, Proteinanteil eines solchen
Konjugats die hydrophobe Verknüpfungs-Einheit
an einer stabilen Verbindung mit einem lipidischen Mikropartikel
hindert.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
Erfindung sieht ein Verfahren zur Bereitung eines lipidischen Mikropartikels
vor, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000 Da mittels
einem Linkermolekül
befestigt ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist:
Inkubieren
des lipidischen Mikropartikels mit einem Polypeptid, welches an
ein Linkermolekül
konjugiert ist, welches aufweist:
- a) eine hydrophobe
Domäne,
- b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben
Domäne
befestigt ist, und
- c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen
Gruppen auf dem Polypeptid reaktiv ist und an der hydrophilen Polymerkette
an einem zu der hydrophoben Domäne
kontralateralen Ende befestigt ist,
für eine Zeit, die ausreichend
ist um zu ermöglichen,
dass sich die hydrophobe Domäne
stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
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Die
Erfindung sieht des Weiteren ein Verfahren zur Bereitung eines lipidischen
Mikropartikels vor, welches an einem Polypeptid von wenigstens 6000
Da befestigt ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist:
Inkubieren
des Polypeptids, welches eine terminal angehängte Aminosäuresequenz aufweist, die hauptsächlich Aminosäuren mit
hydrophilen Seitenketten aufweist, wobei der Sequenz eine Lipid-Modifikationsstelle
mit einer synthetisch angehängten
Lipidhälfte
folgt, mit dem lipidischen Mikropartikel für eine Zeit, die ausreichend ist
um zu ermöglichen,
dass sich die Lipidhälfte
stabil mit dem lipidischen Mikropartikel verbindet.
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Darüber hinaus
stellt die Erfindung ein lipidisches Mikropartikel bereit, welches
mit zwei oder mehr unterschiedlichen Polypeptiden von wenigstens
6000 Da konjugiert ist, wobei die Polypeptide jeweils mit dem lipidischen
Mikropartikel durch ein Linker-Molekül konjugiert sind, wobei jedes
Linker-Molekül
aufweist:
- a) eine hydrophobe Domäne,
- b) eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben
Domäne
befestigt ist, und
- c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder mehreren funktionellen
Gruppen auf dem Polypeptid, das mit dem Linker konjugiert ist, reaktiv
ist, wobei die chemische Gruppe an der hydrophilen Polymerkette
an einem zu der hydrophoben Domäne
kontralateralen Ende befestigt ist, wobei die funktionellen Gruppen
für jedes
Polypeptid gleich sind.
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Darüber hinaus
sieht die Erfindung außerdem
ein Kit zum Bereiten eines an einem Polypeptid von wenigstens 6000
Da befestigten lipidischen Mikropartikel vor, wobei das Kit umfasst:
- (i) einen Behälter mit dem lipidischen Mikorpartikel;
und
- (ii) einen Behälter
mit dem Polypeptid, welches mit einem hydrophilen Polymer verknüpft ist,
das an einer hydrophoben Domäne
befestigt ist;
wobei sich das lipidische Mikropartikel
und das Polypeptid stabil miteinander verbinden, wenn sie zusammen inkubiert
werden.
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Das
lipidische Mikropartikel kann ein Lipid:Nukleinsäurekomplex sein. Die vorliegende
Offenbarung stellt ein neues Verfahren zum Bereiten von kationischen
Lipid:Nukleinsäurekomplexen,
welche eine erhöhte Haltbarkeitsdauer
aufweisen, bereit. In einer Ausführungsform
werden diese Komplexe hergestellt durch In-Kontakt-Bringen einer
Nukleinsäure
mit einem organischen Polykation, um eine kondensierte oder partiell kondensierte
Nukleinsäure
herzustellen. Die kondensierte Nukleinsäure wird dann mit einem amphiphilen
kationischen Lipid sowie einem neutralen Helfer-Lipid, wie Cholesterol,
in einem Molverhältnis
von etwa 2:1 bis etwa 1:2 kombiniert, wodurch der Lipid:Nukleinsäurekomplex
hergestellt wird. Gegebenenfalls wird anschließend ein hydrophiles Polymer
zu dem Lipid:Nukleinsäurekomplex
zugesetzt. Alternativ dazu wird das hydrophile Polymer zu einem
Lipid:Nukleinsäurekomplex
zugesetzt, welcher Nukleinsäure
umfasst, die nicht [nicht] kondensiert worden ist. Diese Lipid:Nukleinsäurekomplexe
besitzen eine erhöhte
Haltbarkeitsdauer, z. B. bei Aufbewahrung bei 22°C oder darunter, im Vergleich
zu einem identischen Lipid:Nukleinsäurekomplex, in welchem die
Nukleinsäurekomponente
nicht mit dem organischen Polykation kontaktiert worden ist, und/oder
in welchem der Lipid:Nukleinsäurekomplex
nicht mit einem hydrophilen Polymer kontaktiert worden ist.
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Vorzugsweise
ist das Polykation ein Polyamin, weiter bevorzugt ein Polyamin wie
Spermidin oder Sperrain.
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Ebenfalls
bevorzugt werden die Lipid:Nukleinsäurekomplexe hergestellt durch
Kombinieren einer Nukleinsäure
mit einem amphiphilen kationischen Lipid und danach Kombinieren
des so gebildeten Komplexes mit einem hydrophilen Polymer. Dieser
Lipid:Nukleinsäurekomplex
besitzt eine erhöhte
Haltbarkeitsdauer, z. B. bei Aufbewahrung bei 22°C oder darunter, im Vergleich
zu einem identischen Komplex, welcher nicht mit dem hydrophilen
Polymer kombiniert worden ist.
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Das
hydrophile Polymer wird zum Beispiel aus der Gruppe gewählt, die
aus Polyethylenglykol (PEG), mit Phosphatidylethanolamin derivatisiertem
Polyethylenglykol (PEG-PE), mit Tween derivatisiertem Polyethylenglykol,
mit Distearoylphosphatidylethanolamin derivatisiertem Polyethylenglykol
(PEG-DSPE), Gangliosid GM1 und synthetischen
Polymeren besteht.
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Der
Lipid:Nukleinsäurekomplex
kann lyophilisiert werden.
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In
jedwedem der Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung kann
die Nukleinsäure
praktisch eine beliebige Nukleinsäure sein, z. B. eine Desoxyribonukleinsäure (DNA)
oder eine Ribonukleinsäure (RNA)
und Peptid-Nukleinsäure
(PNA) etc., und ist am stärksten
bevorzugt eine DNA. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA eine Expressionskassette, die zum Exprimieren eines
Polypeptids in einer Zelle fähig
ist, welche mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex transfiziert wurde.
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Die
Lipid:Nukleinsäurekomplexe
werden zum Beispiel gebildet, indem zuerst ein Liposom gebildet wird
und dann das gebildete Liposom mit kondensierter oder partiell kondensierter
Nukleinsäure
unter Bildung eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes kombiniert wird.
Gegebenenfalls wird der Lipid:Nukleinsäurekomplex anschließend mit
einem hydrophilen Polymer in Kontakt gebracht. Die Liposomen können alternativ
dazu mit einer unkondensierten Nukleinsäure vereinigt werden, um einen
Lipid:Nukleinsäurekomplex
zu bilden, zu welchem später
ein hydrophiles Polymer (z. B. PEG-PE) zugegeben wird. Ein durch
die Kombination von Nukleinsäure
und einem mit einem hydrophilen Polymer kontaktierten Liposom hergestellter
Lipid:Nukleinsäurekomplex
kann anschließend
mit weiterem hydrophilen Polymer kombiniert werden. Vorzugsweise
werden das Lipid und die Nukleinsäure in einem Verhältnis im
Bereich von etwa 1 bis etwa 20, weiter bevorzugt von etwa 4 bis etwa
16 und am stärksten
bevorzugt von etwa 8 bis etwa 12 nmol Lipid:μg Nukleinsäure kombiniert. Das Lipid und
das hydrophile Polymer werden in einem Molverhältnis im Bereich von etwa 0,1
bis etwa 10%, weiter bevorzugt von etwa 0,3 bis etwa 5% und am stärksten bevorzugt
von etwa 0,5 bis etwa 2,0% kombiniert (Molverhältnis von hydrophilem Polymer
zu kationischem Lipid des Komplexes).
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Diese
Beschreibung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Transfizieren einer
Nukleinsäure
in eine Säugerzelle
vor, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zelle mit einem beliebigen
der, wie oben beschrieben hergestellten, Lipid:Nukleinsäurekomplexe
umfasst. Das Verfahren kann eine systemische Verabreichung eines
Lipid:Nukleinsäurekomplexes
in ein Säugetier
verwenden. Vorzugsweise verwendet das Verfahren zum Transfizieren
die intravenöse
Verabreichung des Lipid:Nukleinsäurekomplexes
in einen Säuger.
In einem besonders bevorzugten Verfahren umfasst das Verfahren das
Kontaktieren einer spezifischen Zelle, welche einen Ligand exprimiert,
der ein Fab'-Fragment
erkennt, das im Komplex vorhanden ist.
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Diese
Beschreibung sieht auch eine pharmazeutische Zusammensetzung vor,
welche den oben beschriebenen Lipid:kondensierte-Nukleinsäure-Komplex
umfasst. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch
wirksame Dosis des Lipid:Nukleinsäurekomplexes und einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
oder Exzipienten.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A und 1B veranschaulichen
die Rolle von neutralem Lipid in der Genzuführung. Drei Liposomenformulierungen
wurden hinsichtlich Genzuführung
an sowohl Kulturzellen (SKBR-3, humane Brustkrebszelle) als auch
Mäuse (CD1,
weiblich, 20–25
g) getestet. Die Proben waren: (1) DDAB/Chol (1:1); (2) DDAB/Chol/DOPE
(1:0,5:0,5); (3) DDAB/DOPE (1:1); und (4) DDAB allein. 1A veranschaulicht
die Zelltransfektion. SKBR-3-Zellen wurden bei 50000 Zellen je Vertiefung
in Zwölf-Vertiefungs-Platten
ausplattiert und über
Nacht inkubiert. Jede Vertiefung erhielt 1 μg des Plasmids P-CMWIVSLuc+,
welches mit Liposomen bei 5 nmol DDAB komplexiert war. Die Zellen
wurden nach 24 Stunden Inkubation mit den Komplexen bei 37°C geerntet.
Die dargestellten Werte sind der Mittelwert aus 2 Vertiefungen.
Die Werte lagen im Bereich innerhalb von 10–30% vom Mittelwert. Die 1B veranschaulicht
die in-vivo-Transfektion
in Mäusen.
Mäuse erhielten mittels
Schwanzveneninjektion 40 μg
des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit Liposomen bei einem Verhältnis von
8 nmol DDAB pro μg
DNA komplexiert worden war. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert
aus 2 Mäusen.
Die Werte lagen im Bereich innerhalb 20–25% des Mittelwerts.
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Die 2 veranschaulicht
die Reportergenexpression in Mausgewebeextrakten. Mäuse erhielten (durch
Schwanzveneninjektion) 60 μg
des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen
bei einem Verhältnis
von 8 nmol DDAB je μg
DNA (ohne Spermidin) komplexiert war. Die dargestellten Werte sind
der Mittelwert aus 3 Mäusen.
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Die 3 veranschaulicht
die Dauer der Reportergenexpression in Maus-Lunge [Luna]. Jedes
Tier erhielt 40 μg
des Plasmids P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen
bei einem Verhältnis
von 8 nmol DDAB je μg
DNA komplexiert war.
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Die 4 veranschaulicht
die Genzuführung
in Maus-Lunge durch verschiedene stabilisierte Komplexe. Jede Maus
erhielt 60 μg
P-CMVIVS-Luc+, welches mit DDAB/Chol(1:1)-Liposomen bei einem Verhältnis von
8 nmol DDAB/μg
DNA komplexiert war. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert
aus 3 Mäusen.
Punktierte Balken: frisch hergestellte Komplexe; ausgefüllte Balken:
Proben mit einem Alter von einem Monat. Die Proben waren wie folgend:
(1) Keine Zugabe von stabilisierendem Mittel; (2) Zugabe von PEG-PE
bei 1% Gesamtlipid zu den gebildeten Komplexen; und (3) Zugabe von
Spermidin (0,5 nmol pro μg
DNA) zu dem Plasmid vor der Komplexbildung.
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Die 5A und 5B veranschaulichen
die in-vitro-Transfektion von Zelllinien mit Immunlipid:DNA-Komplexen.
Die Proben sind wie folgend: (1) DDAB/DOPE (1:1) unter Erzeugung
von kationischen Liposomen, die lediglich mit DNA komplexiert sind;
(2) DDAB/DOPE (1:1) mit 1% PEG-PE, welches mit Maleimid an der äußersten
Position von PEG derivatisiert ist, unter Erzeugung von Liposomen
mit Hinzufügung
der sterischen Stabilisierungskomponente nach Komplexierung mit
der DNA; und (3) DDAB/DOPE (1:1) mit 1% PEG-PE, welches mit dem
Fab'-Fragment von
einem humanisierten Anti-Her-2-Antikörper derivatisiert ist, der an
der äußersten
Position von PEG über
die freie Thiolgruppe an den Maleimidrest befestigt ist.
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DEFINITIONEN
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Es
werden hierin die folgenden Abkürzungen
verwendet: Chol, Cholesterol; PA, Phosphatidinsäure; PC, Phosphatidylcholin;
PI, Phosphatidylinositol; SM, Sphingomyelin; M-DPE, Maleimid-derivatisiertes
Dipalmitoylethanolamin; PBS, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; LUV,
gro ße
unilamellare Vesikel; MLV, multilamellare Vesikel; PE, Phosphatidylethanolamin;
PEG, Polyethylenglykol; PEG-PE, Polyethylenglykol, welches mit Phosphatidylethanolamin
derivatisiert ist, DC-Chol, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbanoyl]-cholesterol;
DDAB, Dimethyldioctadecylammoniumbromid; DMEPC, Dimyristoylglycero-3-ethylphosphocholin;
DODAP, Dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan;
DOEPC, Dioleoylglycero-3-ethylphosphocholin; DOGS, N,N-Dioctadecylamidoglycylspermin;
DOPE, Dioleoylphosphatidylethanolamin; DOTAP, Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan;
DOTMA, N-[2,3-(Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumbromid;
DSPE, Distearoylphosphatidylethanolamin; PEG-PE, N-[ω-Methoxypoly(oxyethylen)-α-oxycarbonyl]-DSPE;
POEPC, Palmitoyloleoylglycero-3-ethylphosphocholin.
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Der
Begriff "amphiphiles
kationisches Lipid" schließt beabsichtigtermaßen jedwedes
amphiphile Lipid, einschließlich
synthetischer Lipide und Lipidanaloge, ein, aufweisend hydrophobe
und polare Kopfgruppen-Hälften,
eine positive Nettoladung, und welches sich von selbst spontan zu
Doppelschicht-Vesikeln oder Mizellen in Wasser formieren kann, wie
durch Phospholipide beispielhaft veranschaulicht. Der Begriff schließt auch
jedwedes amphiphiles Lipid ein, welches stabil in Lipid-Doppelschichten in
Kombination mit Phospholipiden eingebaut wird, wobei seine hydrophobe
Hälfte
in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran
steht, und seine polare Kopfgruppen-Hälfte zur äußeren, polaren Oberfläche der
Membran hin orientiert ist.
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Der
Ausdruck "spezifische
Bindung" bezieht
sich auf diejenige Bindung, welche zwischen derartigen gepaarten
Spezies wie Enzym/Substrat, Rezeptor/Agonist, Antikörper/Antigen
und Lektin/Kohlenhydrat stattfindet, welche durch kovalente oder
nicht-kovalente Wechselwirkungen oder eine Kombination aus kovalenten und
nicht-kovalenten Wechselwirkungen vermittelt werden kann. Wenn die
Wechselwirkung der zwei Spezies einen nicht-kovalent gebundenen
Komplex erzeugt, ist die Bindung, welche auftritt, typischerweise
elektrostatisch, eine Wasserstoffbrückenbindung oder das Ergebnis
von lipophilen Wechselwirkungen. Folglich tritt eine "spezifische Bindung" zwischen einer gepaarten
Spezies auf, wenn es eine Wechselwirkung zwischen den beiden gibt,
die einen gebundenen Komplex erzeugt, der die Merkmale einer Antikörper/Antigen-
oder Enzym/Substrat-Wechselwirkung
aufweist. Insbesondere ist die spezifische Bindung durch die Bindung
eines Mitglieds eines Paars an eine besondere Spezies und an keine
andere Spezies innerhalb der Familie von Verbindungen, welcher das
entsprechende Mitglied des bindenden Mitglieds angehört, gekennzeichnet.
Somit bindet zum Beispiel ein Antikörper an ein einziges Epitop
und an kein anderes Epitop innerhalb der Familie von Proteinen.
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Die
Ausdrücke "Ligand" oder "Targeting-Einheit", wie hierin verwendet,
beziehen sich im Allgemeinen auf alle Moleküle, welche zum spezifischen
Binden an ein jeweiliges Zielmolekül und zur Bildung eines gebundenen
Komplexes, wie oben beschrieben, in der Lage sind. Somit bilden
der Ligand und sein entsprechendes Zielmolekül ein spezifisches Bindungspaar.
Beispiele schließen,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, Antikörper,
Lymphokine, Cytokine, Rezeptorproteine, wie CD4 und CD8, solubilisierte
Rezeptorproteine, wie lösliches
CD4, Hormone, Wachstumsfakto ren und dergleichen, welche spezifisch
an gewünschte
Zielzellen binden, sowie Nukleinsäuren, welche entsprechende
Nukleinsäuren über Basenpaarkomplementarität binden, ein.
Besonders bevorzugte Targeting-Einheiten schließen Antikörper und Antikörperfragmente
(z. B. das Fab'-Fragment) ein.
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Der
Ausdruck "Lipid:Nukleinsäurekomplex" bezieht sich auf
das Produkt, welches durch Mischen von amphiphilen kationischen
Lipiden oder Liposomen mit einer Nukleinsäure hergestellt wird. Der Ausdruck "CLDC", der, wie hierin
verwendet, für "kationisches-Lipid:DNA-Komplex" steht, ist nicht
auf DNA beschränkt und
ist eine zweckmäßige Abkürzung für Lipid:Nukleinsäurekomplex.
Der Lipid:Nukleinsäurekomplex
kann auch ein Helfer-Lipid einschließen. Das Helfer-Lipid ist häufig ein
neutrales Lipid, wie DOPE oder Cholesterol, wobei Cholesterol am
stärksten
bevorzugt wird. Der Lipid:Nukleinsäurekomplex kann auch andere
Verbindungen, wie ein Polykation, welche in Kontakt mit der Nukleinsäure des
Komplexes sind, kondensierte Nukleinsäure erzeugen, sowie hydrophile
Polymere, wie PEG und derivatisiertes PEG, enthalten.
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Die
Ausdrücke "Immunoliposom" und "Immunolipid:Nukleinsäurekomplex" beziehen sich auf
ein Liposom oder einen Lipid:Nukleinsäurekomplex, der einen Antikörper oder
ein Antikörperfragment
trägt,
welches als eine Targeting-Einheit wirkt, welche ermöglicht,
dass der Lipid-Nukleinsäurekomplex
spezifisch an ein besonderes "Ziel"-Molekül bindet,
welches in Lösung
existieren kann oder an die Oberfläche einer Zelle gebunden sein
kann. Falls das Zielmolekül
ein solches ist, welches typischerweise in verhältnismäßigem Überschuss (z. B. ungefähr 10-fach)
und in Assoziation mit einem jeweiligen Zelltyp oder alternativ
dazu in einer Vielzahl von Zelltypen, welche alle einen jeweiligen
physiologischen Zustand exprimieren, gefunden wird, spricht man von
dem Zielmolekül
als einem "charakteristischen
Marker" dieses Zelltyps
oder dieses physiologischen Zustands. So kann zum Beispiel ein Krebs
durch die Überexpression
eines besonderen Markers gekennzeichnet sein, wie dem HER2 (c-erbB-2/neu)-Protoonkogen
im Fall von Brustkrebs.
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Ein "hydrophiles Polymer", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf hoch-hydratisierte flexible neutrale Polymere,
welche an Lipidmolekülen
befestigt sind. Beispiele schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein,
Polyethylenglykol (PEG), mit Phosphatidylethanolamin derivatisiertes
Polyethylenglykol (PEG-PE), mit Tween derivatisiertes Polyethylenglykol,
mit Distearoylphosphatidylethanolamin derivatisiertes Polyethylenglykol
(PEG-DSPE), Gangliosid GM1 und synthetische
Polymere ein. Solche Polymere weisen typischerweise ein Molekulargewicht
im Bereich von 1000–10000
auf. Vorzugsweise beläuft
sich das Molekulargewicht für
PEG ungefähr
auf 2000.
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"Transfektion" bezieht sich auf
das Kontaktieren einer lebenden Zelle mit einer Nukleinsäure, zum
Beispiel als Teil eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes.
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"Transfektionsaktivität" bezieht sich auf
die Effizienz der Einbringung einer Nukleinsäure in eine lebende Zelle.
Die Transfektionseffizienz kann gemessen werden durch Bestimmen
des Betrags der Expression eines Reportergens, welches als Teil
eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes
in die Zelle transfiziert worden ist, zum Beispiel durch fluoreszente
oder funktionale Assays.
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Die
Begriffe "kondensierte
Nukleinsäure" und "partiell kondensierte
Nukleinsäure" werden verwendet, um
Bezug auf eine Nukleinsäure
zu nehmen, welche mit einem organischen Kation, zum Beispiel Polyaminen, einschließlich Spermin
und Spermidin, Polyammoniummolekülen,
wie Polybrene (Hexadimethrinbromid), basischen Polyaminosäuren und
basischen Proteinen, kontaktiert worden ist. Kondensierte Nukleinsäuren nehmen
typischerweise ein signifikant kleineres Volumen ein als nicht-kondensierte
Nukleinsäuren.
Es wird jedoch erkannt, dass das Ausmaß der Kondensation mit der
lokalen Umgebung (z. B. Lipid im Gegensatz zu wässriger Umgebung) variieren
kann.
-
Der
Begriff "Haltbarkeitsdauer", bei Verwendung
zur Bezugnahme auf die hierin offenbarten Lipid:Nukleinsäuren, bezieht
sich auf die Zeitdauer, über
welche der Lipid:Nukleinsäurekomplex
aufbewahrt werden kann (unter definierten Bedingungen, z. B. bei
4°C), bevor
er seine biologische Aktivität
verliert. Die zur Bestimmung der Haltbarkeitsdauer in der vorliegenden
Erfindung geassayte biologische Aktivität ist die Fähigkeit des Lipid:Nukleinsäurekomplexes,
Säugerzellen
in vivo nach einer intravenösen
Verabreichung zu transfizieren. Die "Haltbarkeitsdauer" eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes
wird zweckmäßigerweise
durch Assay mittels Genexpression von Reporternukleinsäuren in
dem Lipid:Nukleinsäurekomplex
ermittelt, wie es hierin beschrieben wird.
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Eine "Expressionskassette" bezieht sich auf
einen Promotor, der funktionsfähig
an ein DNA-Molekül verknüpft ist,
welches alle Elemente enthält,
die für
die Expression dieses DNA-Moleküls in einer
lebenden Zelle erfordert werden. Die Expressionskassette kann zusätzliche
Elemente, wie Enhancer, Replikationsursprünge und dergleichen enthalten,
wodurch ein Expressionsvektor gebildet wird.
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"Organisches Polykation" oder "Polykation" beziehen sich auf
eine organische polymere Struktur, worin mehr als eine Einheit des
Polymers eine negative Ladung trägt,
und die Nettoladung des Polymers positiv ist. Beispiele für ein solches
organisches Kation sind Polyamine, einschließlich Spermin und Spermidin,
Polyammoniummoleküle,
wie Polybrene (Hexadimethrinbromid), basische Polyaminosäuren oder
basische Proteine.
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Ein "pharmazeutisch annehmbarer
Träger" ist ein Material,
welches nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist, d. h. das Material
kann einem Individuum zusammen mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex
verabreicht werden, ohne unannehmbare biologische Effekte zu verur sachen
oder in einer nachteiligen Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten
der pharmazeutischen Zusammensetzung, in welchem er enthalten ist, wechselzuwirken.
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Der
Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf
ein Polymer oder Oligomer, welches aus Nukleotideinheiten (Ribonukleotide,
Desoxyribonukleotide oder verwandte strukturelle Varianten oder
synthetische Analoge davon) aufgebaut ist, die durch Phosphodiesterbindungen
(oder verwandte strukturelle Varianten oder synthetische Analoge
davon) verknüpft
sind. Somit bezieht sich der Begriff auf ein Nukleotidpolymer, in
welchem die Nukleotide und die Bindungen zwischen ihnen natürlich vorkommend
sind (DNA oder RNA), sowie auf verschiedene Analoge, zum Beispiel,
und ohne Einschränkung,
Peptidnukleinsäuren
(PNAs), Phosphoramidate, Phosphorthioate, Methylphosphonate, 2-O-Methyl-Ribonnukleinsäuren und
dergleichen.
-
Der
Begriff "Molprozent", bei Bezugnahme
auf den Prozentgehalt an hydrophilem Polymer in einem Liposom, wird
relativ zu dem kationischen Lipid im Liposom ausgedrückt, es
sei denn es ist anders lautend angegeben. So werden beispielsweise
in einem Liposom, welches ein Verhältnis von DDAB zu Cholesterol (Chol)
von 100:100 aufweist, 4 Molprozent hydrophiles Polymer (z. B. PEG)
ein Verhältnis
von DDAB:Chol:PEG von etwa 100:100:4 repräsentieren.
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Der
Ausdruck "identisch" bezieht sich auf
eine Zusammensetzung, welche unter Verwendung derselben Verbindungen
wie in einer anderen Zusammensetzung gebildet wird, wobei sich die
Zusammensetzungen nicht in einer statistisch signifikanten Weise
unterscheiden.
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Der
Begriff "systemische
Verabreichung" bezieht
sich auf ein Verfahren zur Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung
an einen Säuger,
sodass die Verbindung oder Zusammensetzung an viele Stellen im Körper über das
Kreislaufsystem zugeführt
wird.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet "Linkermolekül" ein Molekül, umfassend
(a) eine hydrophobe Domäne, (b)
eine hydrophile Polymerkette, welche terminal an der hydrophoben
Domäne
befestigt ist, und (c) eine chemische Gruppe, die zu einer oder
mehreren funktionellen Gruppen auf einem Proteinmolekül reaktiv
ist und an der Polymerkette an, oder nahe, dem zu der hydrophoben
Domäne
kontralateralen Ende befestigt ist.
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Der
Begriff "hydrophobe
Domäne" von, zum Beispiel,
einem Linkermolekül,
bedeutet eine Fettsäure, einen
Fettalkohol, ein Sterol oder ein anderes hydrophobes Molekül, das aus
einem wässrigen
Medium heraus zur Verteilung in eine Lipidphase fähig ist.
Zum Beispiel kann eine hydrophobe Domäne ein Diacylglycerol, ein Phospholipid,
ein Sterol, wie Cholesterol, oder ein Diacylamidderivat, wie N,N-Distearoylglycinamid
sein.
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Der
Begriff "Lipidhälfte" bzw. "Lipideinheit" in Bezug auf ein
Proteinmolekül
bedeutet eine Anordnung, zusammengesetzt aus einer oder mehreren
hydrophoben Domänen,
welche direkt an das Proteinmolekül kovalent gebunden ist.
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Die
Ausdrücke "Protein" und "Peptid" werden auf dem Fachgebiet
allgemein nach dem Molekulargewicht unterschieden, wobei Polypeptide
unter 6000 Dalton als Peptide angesehen werden, und diejenigen mit oder über 6000
Dalton als Proteine angesehen werden; Siehe z. B. McMurray, Organic
Chemistry (Brooks/Cole Publishing Co., Belmont, CA)(1988), auf S.
971. Die Verwendung dieser Begriffe hierin folgt dieser Unterscheidung.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Diese
Offenbarung liefert Verfahren zur Erhöhung der Haltbarkeitsdauer
von kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen
und der in-vivo- und/oder in-vitro-Transfektionseffizienz dieser
Komplexe. Derartige Komplexe haben ein beträchtliches Interesse als Mittel
zur Zuführung
von Nukleinsäuren,
welche verschiedene therapeutische Polypeptide exprimieren, sowie
als Mittel zur Zuführung
von therapeutischen (z. B. Antisense-)Nukleinsäuren selbst auf sich gezogen.
Unglücklicherweise
ist es schwierig gewesen, homogene Lipid:Nukleinsäurekomplexe,
welche für
eine Verabreichung in vivo geeignet sind, aufrechtzuerhalten und
aufzubewahren. Die Komplexe neigen dazu, rasch zu aggregieren oder
sich innerhalb von relativ kurzer Zeit zu zersetzen. Diese Instabilität hat eine
Anwendung dieser Komplexe innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach
der Zubereitung, häufig
in nicht mehr als 30 Minuten bis einigen Stunden, erforderlich gemacht.
So wurden zum Beispiel in jüngeren
klinischen Versuchen, unter Verwendung von kationischen Lipiden
als Träger
für eine
DNA-Zuführung, die
DNA und Lipidkomponenten direkt am Patientenbett vermischt und unverzüglich verwendet
(Gao et al., Gene Therapy 2: 710–722 (1995)).
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Diese
Lipid:Nukleinsäurekomplex-Instabilität stellt
ein bedeutendes Hindernis für
die allgemein verbreitete Akzeptanz von kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexen
als Therapeutika dar. Die Notwendigkeit der Bereitung des Komplexes
kurz vor der Anwendung erfordert, dass eine pharmazeutische Anlage
in verhältnismäßig enger
Nachbarschaft zur Örtlichkeit
der Anwendung vorhanden ist. Alternativ dazu stellt die Vereinigung
des Lipids und der Nukleinsäure
am Patientenbett eine wesentliche Arbeitslast dar, bringt Probleme bei
der Qualitätskontrolle
zur Gewährleistung
einer angemessenen Komplexierung mit sich und führt eine potenzielle Fehlerquelle
ein.
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Die
vorliegende Offenbarung löst
diese Probleme durch Bereitstellen von Verfahren zur signifikanten Erhöhung der
Haltbarkeits(Lagerungs)dauer von Lipid:Nukleinsäurekomplexen. Die Verfahren
beinhalten im Allgemeinen: (1) Kondensieren der Nukleinsäure vor
Einbringung in den Lipid:Nukleinsäurekomplex; (2) Kombinieren
eines Lipid:Nukleinsäurekomplexes
mit einem hydrophilen Polymer (z. B. PEG); und (3) sowohl Kondensieren
der Nukleinsäure
vor der Komplexbildung als auch Kombinieren des Komplexes mit einem
hydrophilen Polymer.
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Während die
Kondensation von Nukleinsäuren
zu einer Stabilität
der Nukleinsäure
bei der Isolierung führen
kann (z. B. in einem wässrigen
Puffer), war es eine überraschende
Feststellung, dass die Verwendung eines Kondensierungsmittels (z.
B. eines organischen Polykations) einen Lipid:Nukleinsäurekomplex
vorsieht, welcher zum Transfizieren einer Zelle in vivo sogar nach
einer Periode von verlängerter
Aufbewahrung fähig bleibt
(z. B. Kalt-Lagerung bei einer Temperatur von etwa 22°C oder darunter,
weiter bevorzugt im Bereich von etwa 0°C bis etwa 22°C, und am
stärksten
bevorzugt bei etwa 4°C).
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Es
war ebenfalls eine überraschende
Feststellung, dass Lipid:Nukleinsäurekomplexe, kombiniert mit einem
hydrophilen Polymer, das an einem amphipathischen Lipid befestigt
ist (z. B. PEG-PE),
ebenfalls eine erhöhte
Haltbarkeitsdauer zeigen. Ohne durch eine besondere Theorie gebunden
zu sein, nimmt man an, dass wenn der kationisches-Lipid:DNA-Komplex
("CLDC") mit dem hydrophilen
Polymer in Kontrakt gebracht wird, das hydrophile Polymer sich lokalisiert
und über
seine hydrophoben Seitenketten in hydrophobe Taschen im Komplex
eingebunden wird, während
der hydrophile Teil an der Außenoberfläche bleibt,
wodurch der gesamte Komplex stabilisiert wird.
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In
Hinsicht auf diese Feststellungen stellt diese Offenbarung Verfahren
zur Erhöhung
der Haltbarkeitsdauer von kationisches-Lipid:Nukleinsäure-Komplexen
bereit. Die Verfahren beinhalten im Allgemeinen entweder das Kondensieren
der Nukleinsäure
unter Anwendung eines Polykations und/oder das Kontaktieren, z. B.
Beschichten, des Lipid:Nukleinsäurekomplexes
mit einem hydrophilen Polymer.
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Diese
Erfindung sieht Verfahren zur Bildung von lipidischen Mikropartikeln
mit befestigten Proteinen vor, die beispielsweise für das Targeting
der Mikropartikel zu ausgewählten
Zellen oder Geweben geeignet sind. Die Verfahren sehen eine Anzahl
von Vorteilen gegenüber
Verfahren des Stands der Technik vor:
- (1) wegen
der quantitativen Natur der Insertion ist die Anzahl von Proteinen
je Partikel in hohem Maße
reproduzierbar und kann exakt definiert werden;
- (2) mehr als eine Art von Protein kann an die Oberfläche desselben
Partikels, in einem exakten Anteil, befestigt werden;
- (3) wenn das Protein-Linker-Konjugat vor der Insertion in eine
Partikeloberfläche
gereinigt wird, wird das Partikel keine unkonjugierten Linker tragen;
- (4) das Partikel kann, in seiner Zusammensetzung, mit der aktiven
Linker-Gruppe reaktive Moleküle
enthalten. Zum Beispiel kann das Partikel Thiole enthalten, sogar
wenn die aktive Gruppe Maleimid ist;
- (5) wenn das Partikel ein Vesikel ist, werden die Linker/Protein-Moleküle nur auf
der Außenoberfläche vorhanden
sein; und
- (6) das Verfahren erhöht
die Anwendbarkeit von im Voraus hergestellten, bekannten Partikeln,
wie kommerziell hergestellten pharmazeutischen Liposomen, durch
Ermöglichen
der Hinzufügung
von an der Oberfläche
befestigten Konjugaten, die Proteine von Interesse tragen.
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I. Kationisches-Lipid:Nukleinsäure-Komplexe
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Wie
oben erläutert,
liefert diese Offenbarung Verfahren zum Erhöhen der Lagerungsdauer (Haltbarkeitsdauer)
von Lipid:Nukleinsäurekomplexen.
Vorzugsweise werden die Komplexe durch Kombination einer Nukleinsäure mit
einem Liposom gebildet. Es wird jedoch erkannt, dass die Lipide
nicht als ein Liposom bereitgestellt werden müssen. Es wird ebenfalls erkannt,
dass nach der Komplexierung der Lipid:Nukleinsäurekomplex nicht länger als
ein echtes Vesikel vorliegen kann, und deshalb nicht allgemein als
ein Liposom angesehen wird. Die Herstellung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Rezension
in Crystal, Science 270: 404–410
(1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291–297 (1995); Behr et al., Bioconjugate
Chem. 5: 382–389
(1994), Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647–654 (1994); und Gao et al.,
Gene Therapy 2: 710–722
(1995)). Die verschiedenen Komponenten und die Konstruktion der
stabilisierten Lipid:Nukleinsäurekomplexe
der Erfindung werden nachstehend ausführlich beschrieben.
-
A. Amphiphile kationische Lipide
-
Wie
oben angegeben, beinhalten die hierin offenbarten Verfahren das
Komplexieren eines kationischen Lipids mit einer Nukleinsäure. Der
Begriff "kationisches
Lipid" bezieht sich
auf ein beliebiges von einer Reihe von Lipidspezies, welche eine
positive Nettoladung bei physiologischem pH-Wert tragen. Solche
Lipide schließen,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DC-Chol und DMRIE ein. Darüber hinaus
ist eine Reihe von kommerziellen Präparaten kationischer Lipide
verfügbar,
welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese
schließen
zum Beispiel LIPOFECTIN® (kommerziell erhältliche
kationische Liposomen, umfassend DOTMA und DOPE, von GIBCO/BRL,
Grand Island, New York, USA); LIPOFECTAMINE® (kommerziell
erhältliche
kationische Liposomen, umfassend DOSPA und DOPE, von GIBCO/BRL);
und TRANSFECTAM® (kommerziell
verfügbare
kationische Lipide, welche DOGS in Ethanol umfassen, von Promega
Corp., Madison, Wisconsin, USA) ein.
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Das
kationische Lipid kann allein oder in Kombination mit einem "Helfer"-Lipid verwendet
werden. Bevorzugte Helfer-Lipide sind bei physiologischem pH-Wert
nicht-ionisch oder ungela den. Besonders bevorzugte nicht-ionische
Lipide schließen,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, Cholesterol und DOPE ein, wobei Cholesterol am stärksten bevorzugt
ist.
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Das
Molverhältnis
von kationischem Lipid zu Helfer kann im Bereich von 2:1 bis etwa
1:2, weiter bevorzugt von etwa 1,5:1 bis etwa 1:1,5 liegen und beträgt am stärksten bevorzugt
etwa 1:1. Zusätzliche
kationische und nicht-ionische Lipide, die zur Verwendung in den
Lipid:Nukleinsäurekomplexen
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann auf
dem Gebiet allgemein bekannt und werden in einer Vielzahl von allgemein
bekannten Quellen zitiert, z. B. McCutcheon's Detergents and Emulsifiers und McCutcheon's Functional Materials,
Allured Publishing Co., Ridgewood, N. J. Bevorzugte Lipide schließen DDAB:Cholesterol oder
DOTAP:Cholesterol bei einem Molverhältnis von 1:1 ein.
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B. Nukleinsäure
-
Die
Lipid:Nukleinsäurekomplexe
enthalten eine Nukleinsäure,
typischerweise eine Expressionskassette, welche unter Anwendung
rekombinater Techniken konstruiert wird. Eine rekombinante Nukleinsäure wird
hergestellt, indem zuerst die Nukleinsäure von Interesse isoliert
wird. Die isolierte Nukleinsäure
wird dann in eine Kassette oder einen Vektor ligiert, welche(r)
zur Expression des Gens geeignet ist. Verfahren zur Herstellung
einer rekombinanten Nukleinsäure
sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratom Manual (2. Ausgabe 1989)).
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Das
Gen von Interesse, zum Beispiel ein Gen, codierend ein therapeutisches
Polypeptid, oder ein Reportergen, kann in einen "Expressionsvektor", "Klonierungsvektor" oder "Vektor" inseriert werden – Begriffe, welche üblicherweise
Plasmide oder andere Nukleinsäuremoleküle bezeichnen,
die zum Replizieren in einer gewählten
Wirtszelle und zum Exprimieren des Gens von Interesse in der Lage
sind. Expressionsvektoren können
autonom replizieren oder sie können
replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle inseriert werden. Häufig ist
es für
ein Vektor wünschenswert,
in mehr als einer Wirtszelle anwendbar zu sein, z. B. in E. coli
zur Klonierung und Konstruktion, und in einer Sängerzelle zur Expression. Zusätzliche
Elemente des Vektors können
zum Beispiel selektierbare Marker und Enhancer einschließen. Selektierbare
Marker, z. B. Tetracyclinresistenz oder Hygromycinresistenz, gestatten
die Detektion und/oder Selektion derjenigen Zellen, welche mit den
gewünschten
DNA-Sequenzen transformiert wurden (siehe z. B.
U.S.-Patent 4 704 362 ). Der jeweilige Vektor,
der zum Transportieren der genetischen Information in die Zelle
hinein verwendet wird, ist also nicht besonders kritisch. Beliebige
der herkömmlichen
Vektoren, welche für
die Expression von rekombinanten Proteinen in prokaryotischen oder
eukaryotischen Zellen verwendet werden, können eingesetzt werden.
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Die
Expressionsvektoren weisen typischerweise eine Transkriptionseinheit
oder Expressionskassette auf, welche alle die Elemente enthält, die
für die
Expression der Nukleinsäure
in den Wirts zellen erfordert werden. Eine typische Expressionskassette
enthält
einen Promotor in funktionsfähiger
Verknüpfung
an die DNA-Sequenz, welche ein Protein codiert. Der Promotor ist
vorzugsweise etwa im gleichen Abstand von der heterologen Transkriptionsstartstelle
positioniert, wie von der Transkriptionsstartstelle in ihrer natürlichen
Situation. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, kann jedoch eine gewisse
Variation hinsichtlich dieses Abstands ohne Verlust der Promotorfunktion
aufgenommen werden.
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In
der Expressionskassette kann die Nukleinsäuresequenz von Interesse so
an eine Sequenz verknüpft
sein, welche eine spaltbare Signalpeptid-Sequenz codiert, dass die
Sekretion des codierten Proteins durch die transformierte Zelle
gefördert
wird. Die Expressionskassette sollte auch eine Transkriptionsterminationsregion
stromabwärts
des Strukturgens enthalten, um für
eine effiziente Terminierung zu sorgen. Die Terminationsregion kann
aus dem gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden oder
kann aus einem anderen Gen erhalten werden.
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Für eine effizientere
Translation der von dem Strukturgen codierten mRNA in Säugerzellen
werden üblicherweise
auch Polyadenylierungssequenzen an die Expressionskassette angefügt. Terminations-
und Polyadenylierungssignale, welche für die vorliegende Erfindung
geeignet sind, schließen
diejenigen ein, welche aus SV40 abgeleitet sind, oder eine partielle
genomische Kopie eines Gens, welches bereits auf dem Expressionsvektor
vorhanden ist.
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Zusätzlich zu
der Expressionskassette schließen
viele Expressionsvektoren in optimaler Weise Enhancer-Elemente ein,
welche die Transkription von damit verknüpften homologen oder heterologen
Promotoren aus bis zum 1000-fachen stimulieren können. Viele Enhancer-Elemente,
welche aus Viren abgeleitet sind, weisen einen breiten Wirtsbereich
auf und sind in einer Vielzahl von Geweben aktiv. Zum Beispiel ist
der SV40-"Eearly"-Gen-Enhancer für viele
Zelltypen geeignet. Andere Enhancer/Promotor-Kombinationen, welche
für die
vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen diejenigen ein, welche
aus Polyoma-Virus, humanem oder Maus-Cytomegalovirus, dem "Long Terminal Repeat" aus verschiedenen
Retroviren, wie murinem Leukämievirus,
murinem oder Rous-Sarkom-Virus und HIV abgeleitet sind (siehe Enhancers
and Eukaryotic Expression (1983)).
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Zusätzlich zu
den oben erörterten
rekombinanten Nukleinsäuren
können
auch synthetische Nukleinsäuren
oder Oligonukleotide in der Erfindung verwendet werden. Als ein
allgemeiner Punkt im Hinblick auf die in der Erfindung verwendeten
Nukleinsäuren
erkennt der Fachmann auf dem Gebiet, dass die in der Erfindung verwendeten
Nukleinsäuren
sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle einschließen, sowie
synthetische, nicht-natürlich
vorkommende Analoge derselbigen, und Heteropolymere aus Desoxyribonukleotiden,
Ribonukleotiden und/oder Analogen von jedem. Die besondere Zusammensetzung
einer Nukleinsäure
oder eines Nukleinsäureanalogs
wird von dem Zweck, für
den das Material verwendet werden wird, sowie von der Umgebung,
in welcher das Material eingebracht werden wird, abhängen. Modifizierte
oder synthetische, nicht- natürlich vorkommende
Nukleotide sind entworfen worden, um einer Vielzahl von Zwecken
zu dienen und um in einer Vielzahl von Umgebungen stabil zu bleiben,
wie denjenigen, in welchen Nukleasen vorhanden sind, wie es im Fachgebiet
allgemein bekannt ist. Modifizierte oder synthetische, nicht-natürlich vorkommende
Nukleotide können,
im Vergleich zu natürlich
vorkommenden Ribo- oder Desoxyribonukleotiden, in Hinsicht auf das
Kohlenhydrat (Zucker), die Phosphatbindung oder die Basenanteile
der Nukleotide abweichen, oder können
in einigen Fällen sogar
eine Nicht-Nukleotidbase (oder überhaupt
keine Base) enthalten (siehe z. B. Arnold et al., PCT-Patentveröffentlichung
Nr.
WO 89/02439 ). Zum
Beispiel können
die modifizierten oder nicht-natürlich
vorkommenden Nukleinsäuren
der Erfindung biotinylierte Nukleinsäuren, Omethylierte Nukleinsäuren, Methylphosphonat-Grundgerüst-Nukleinsäuren, Phosphorthioat-Grundgerüst-Nukleinsäuren oder
Polyamid-Nukleinsäuren einschließen.
-
Oligonukleotide,
wie nachstehend beschriebene Antisense-RNA, werden vorzugsweise
auf einem Applied BioSystems- oder einem sonstigen kommerziell verfügbaren Oligonukleotidsynthesizer
gemäß den vom Hersteller
bereitgestellten Anweisungen synthetisiert. Oligonukleotide können unter
Anwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie den
Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierten
Ausführungsformen
davon. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite
als Ausgangsmaterialien verwendet und können synthetisiert werden,
wie es von Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22: 1859 (1981),
und
U.S.-Patent Nr. 4 458 066 ,
beschrieben wurde.
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C. Kondensierte Nukleinsäure
-
Es
ist bekannt, dass kleine polykationische Moleküle Nukleinsäuren durch elektrostatische
Ladung-Ladung-Wechselwirkungen kondensieren (Plum et al., Biopolymers
30: 631–643
(1990)). Die Vorbehandlung von Nukleinsäure mit Polyaminen kann daher
die Anzahl von Ladungsstellen zum Komplexieren mit kationischen Liposomen
verringern. Allerdings erzeugte die Kondensierung von Nukleinsäure vor
der Lipidkomplexbildung das überraschende
Ergebnis einer erhöhten
Haltbarkeitsdauer für
Lipid:Nukleinsäurekomplexe,
wie gemessen durch die Transfektionseffizienz. Die mit einer solchen
Vorbehandlung gebildeten Lipid:Nukleinsäurekomplexe waren bei einem
geringeren Verhältnis
von Lipid zu DNA, ohne Aggregation, stabil. Organische Polykationen, wie
Polyamine, Polyamonium-Moleküle
und basische Polyaminosäuren
und ihre Derivate werden verwendet, um die Nukleinsäure vor
der Lipidkomplexbildung zu kondensieren. Eine bevorzugte Ausführungsform
verwendet Polyamine, wie Spermidin und Spermin, um die Nukleinsäure zu kondensieren
(siehe z. B. Beispiel 1).
-
D. Hydrophiles Polymer
-
Es
ist jüngst
belegt worden, dass eine PEG-PE-Einbringung in Liposomen eine sterische
Stabilisierung erzeugt, welche zu längeren Kreislaufzeiten im Blut
führt (Allen
et al., Biochim. Bi ophys. Acta 1066: 29–36 (1991); Papahadjopoulos
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11460–11464 (1991)). In der vorliegenden
Erfindung verhindert das Inserieren von PEG-PE (z. B. 1% des Gesamt-Lipids)
in die frisch gebildeten Lipid:Nukleinsäurekomplexe, dass die Komplexe
während
der Aufbewahrung aggregieren. Es war jedoch eine überraschende
Feststellung, dass die Einbindung von PEG-PE die Transfektionsaktivität in vivo
nicht inhibierte, und auch, dass die in-vitro-Transfektionsaktivität, welche
inhibiert wurde, durch die Einbringung von Fab'-Fragment,
welches am Ende des PEG-PE konjugiert war, zurückgewonnen wurde. Das Vorhandensein
von hydrophilen Polymeren in dem Lipid:Nukleinsäurekomplex sieht eine erhöhte Haltbarkeitsdauer
vor, wie durch Transfektionseffizienz nach einer Aufbewahrung gemessen
wird. Daher ist es wünschenswert,
ein hydrophiles Polymer, wie Polyethylenglykol(PEG)-modifizierte
Lipide oder Gangliosid GM1, an die Liposomen
hinzuzufügen.
PEG kann auch mit anderen amphipathischen Molekülen derivatisiert werden, wie
Fettsäuren,
Sphingolipiden, Glykolipiden und Cholesterol. Die Zugabe solcher
Komponenten verhindert eine Liposomen-Aggregation während der
Kopplung der Targeting-Einheit an das Liposom. Diese Komponenten
stellen auch eine Methode zum Erhöhen der Kreislauf-Lebensdauer
der Lipid:Nukleinsäurekomplexe
bereit.
-
Eine
Anzahl verschiedener Verfahren kann für die Herstellung von PEG zum
Einbringen in Liposomen angewandt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird PEG als PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE)
oder PEG-derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE)
eingebracht. Verfahren zur Herstellung von PEG-PE sind allgemein
bekannt und beinhalten typischerweise die Verwendung von aktiviertem
Methoxy-PEG (mit nur einem reaktiven Ende) und von PE. Somit kann
PEG-Succinimidylsuccinat in einem basischen organischen Lösungsmittel
umgesetzt werden (Klibanov et al., FEBS Lett. 268: 235–237 (1990)).
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur PEG-PE-Herstellung basiert
auf der Reaktion des PEG mit Carbonyldiimidazol, gefolgt von der
Zugabe von PE (siehe Woodle et al., Proc. Intern. Symp. Control. Rel.
Bioact. Mater. 17: 77–78
(1990); Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11460–11464 (1991);
Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29–36 (1991); Woodle et al.,
Biochim. Biophys. Acta 1105: 193–200 (1992); und Woodle et
al., Period. Biol. 93: 349–352
(1991)). In ähnlicher
Weise wird Cyanurchlorid-aktiviertes PEG in einem basischen organischen
Lösungsmittel
von Blume et. al., Biochim. Biophys. Acta 1029: 91–97 (1990),
und
U.S.-Patent Nr. 5 213 804 ,
beschrieben. Ein völlig
anderes Vorgehen basiert auf der Kopplung des PEG mit im Voraus
hergestellten Liposomen unter Verwendung von Tresylchloridaktiviertem PEG,
welches dann Liposomen, die PE enthalten, bei hohem pH-Wert hinzugefügt wird
(Senior et al., Biochim. Biophys. Acta 1062: 77–82 (1991)). Derivatisiertes
PEG ist ebenfalls im Handel erhältlich.
So ist beispielsweise PEG-PE von Avanti Polar Lipids (Alabaster,
Alabama) erhältlich.
Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass viele andere Verknüpfungen
verfügbar
sind, z. B. PEG-verknüpfte
Detergentien, wie Tweens, und die Insertion von PEG-derivatisiertem
Lipid in gebildete Lipid:Nukleinsäurekomplexe.
-
E. Fab'-Antikörperfragment
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
an das Fab'-Fragment eines Antikörpers konjugiert,
welches als eine Targeting-Einheit wirkt, die ermöglicht,
dass der Lipid:Nukleinsäurekomplex
spezifisch an eine Zielzelle bindet, welche das Ziel-Molekül (z. B.
charakteristischer Marker) trägt, gegen
welches das Fab'-Antikörperfragment
gerichtet ist. Kleinere Peptide aus der hypervariablen Region oder aus
einem anderen Peptid, welches mit einem spezifischen Zelloberflächenligand
wechselwirkt, können
ebenfalls an die Komplexe konjugiert werden. Im Allgemeinen repräsentiert
das Fab'-Fragment
eines Antikörpers ein
Monomer, umfassend die variablen Regionen und die CH1-Region
eines Arms eines Antikörpers.
Eine solche bevorzugte Ausführungsform
wird im Beispiel 2 beschrieben.
-
Ein "Antikörper" bezieht sich auf
ein Protein, bestehend aus einem oder mehreren Polypeptiden, welche
im Wesentlichen von Immunglobulingenen oder Fragmenten von Immunglobulingenen
codiert werden. Die erkannten Immunglobulingene schließen die
Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Konstante-Region-Gene
sowie die Myriaden von Genen der variablen Immunglobulin-Region
ein. Leichtketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert.
Schwerketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert,
welche ihrerseits die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw.
IgE definieren.
-
Es
ist bekannt, dass die grundlegende Immunglobulin(Antikörper)-Struktureinheit
ein Tetramer umfasst. Jedes Tetramer ist aus zwei identischen Paaren
von Polypeptidketten aufgebaut, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kD) und
eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kD)
aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region
von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, welche hauptsächlich für die Antigenerkennung
verantwortlich ist. Die Begriffe variable Leichtkette (VL) und variable Schwerkette (VH)
beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
-
Antikörper können als
intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten
Fragmenten existieren, welche durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen
hergestellt werden. Insbesondere verdaut Pepsin einen Antikörper unterhalb
der Disulfidbindungen in der Gelenkregion unter Erzeugung von F(ab)'2,
einem Dimer von Fab',
welches selbst eine leichte Kette ist, verknüpft an VH-CH1 durch eine Disulfidbindung. Das F(ab)'2 kann
unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbindung
in der Gelenkregion zu zerbrechen, wodurch das F(ab)'2-Dimer
in ein Fab'-Monomer
umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer
ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe
Fundamental Immunology, Hrsg.: W. E. Paul, Rauen Press, N. Y. (1993),
für weitere
Antikörperfragment-Terminologie).
Während
das Fab'-Fragment in Hinsicht
auf den Verdau eines intakten Antikörpers definiert ist, wird es
der Fachmann richtig einschätzen,
dass solche Fab'-Fragmente
entweder chemisch oder durch Anwendung rekombinanter DNA-Methodik
de novo synthetisiert werden können.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Fab'-Fragmente können aus Antikörpern von
tierischem (speziell Maus oder Ratte) oder menschlichem Ursprung
abgeleitet werden oder können
chimär
(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984))
oder humanisiert sein (Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986),
sowie veröffentlichte
GB-Patentanmeldung Nr. 8707252 ).
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Das
Fab'-Fragment wird
ausgewählt,
um spezifisch an ein Molekül
oder einen Marker zu binden, das/der für die Oberfläche der
Zellen charakteristisch ist, an welche der Inhalt des kationischen
Lipid:Nukleinsäurekomplexes
gewünschtermaßen zugeführt werden
soll. Ein Molekül
ist charakteristisch für
eine Zelle, ein Gewebe oder einen physiologischen Zustand, wenn
dieses Molekül
typischerweise in Assoziation mit diesem Zelltyp gefunden wird,
oder alternativ dazu in einer Vielzahl von Zelltypen, welche alle
einen besonderen physiologischen Zustand (z. B. Transformation)
exprimieren. Ein spezifischer charakteristischer Marker wird vorzugsweise
auf den Oberflächen
von Zellen eines besonderen Gewebes oder Zelltyps oder auf den Oberflächen von
Geweben oder Zellen, welche einen besonderen physiologischen Zustand
exprimieren, und auf keinem anderen Gewebe oder Zelltyp in dem Organismus
gefunden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird jedoch erkennen, dass
ein solcher Spiegel an Spezifität
des Markers häufig
nicht erforderlich ist. Zum Beispiel wird ein charakteristischer
Zelloberflächenmarker
ausreichende Gewebespezifität
zeigen, wenn die einzigen bzw. nur die Nicht-Ziel-Gewebe für den Lipid:Nukleinsäurekomplex
nicht zugänglich
sind. Alternativ dazu kann eine effektive Spezifität durch Überexpression
des Markers im Zielgewebe, im Vergleich zu anderen Geweben, erzielt
werden. Dies wird zur einer präferenziellen
Aufnahme durch das Zielgewebe führen,
was zu einer effektiven Gewebespezifität führt. Somit sind beispielsweise
viele Krebsarten durch die Überexpression
von Zelloberflächenmarkern,
wie dem HER2(c-erbB-2, neu)-Protoonkogencodierten Rezeptor, im Falle
von Brustkrebs, gekennzeichnet.
-
Der
Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass es zahlreiche Zelloberflächenmarker
gibt, welche gute charakteristische Marker in Abhängigkeit
von dem jeweiligen Gewebe bereitstellen, welches wunschgemäß angezielt
werden soll. Diese Zelloberflächenmarker
schließen,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, Kohlenhydrate, Proteine, Glykoproteine, MHC-Komplexe, Interleukine
und Rezeptorproteine, wie HER-, CD4- und CD8-Rezeptorproteine, sowie
andere Wachstumsfaktor- und Hormon-Rezeptorproteine ein.
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Wachstumsfaktorrezeptoren
sind besonders bevorzugte charakteristische Zelloberflächenmarker. Wachstumsfaktorrezeptoren
sind Zelloberflächenrezeptoren,
welche spezifisch Wachstumsfaktoren binden und dadurch eine zelluläre Antwort
vermitteln, die charakteristisch für den jeweiligen Wachstumsfaktor
ist. Der Begriff "Wachstumsfaktor", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf einen Protein- oder Polypeptidligand, welcher Zellteilung
oder -differenzierung aktiviert oder stimuliert oder eine biologische
Antwort stimuliert, wie Motilität
oder Sekretion von Proteinen. Wachstumsfaktoren sind dem Fachmann
auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein,
(Blut)Plättchen-abgeleiteten
Wachstumsfaktor (PDGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktor (IGF), transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), Fibroblastenwachstumsfaktoren
(FGF), Interleukin 2 (IL2), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Interleukin
3 (IL3), Interleukin 4 (IL4), Interleukin 1 (IL1), Interleukin 6
(IL6), Interleukin 7 (IL7), Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden
Faktor (GM-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF),
Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Erythropoietin,
Interleukin13-Rezeptor (IL13R) und dergleichen ein. Der Fachmann
auf dem Gebiet erkennt, dass der Begriff Wachstumsfaktor, wie hierin
verwendet, im allgemeinen Cytokine und Kolonie-stimulierende Faktoren
einschließt.
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Besonders
bevorzugte Marker werden in der HER-Familie von Wachstumsfaktorrezeptoren
gefunden. Genauer gesagt werden HER1, HER2, HER3 und HER4 stärker bevorzugt,
wobei HER2 am stärksten
bevorzugt ist. Die HER-Rezeptoren umfassen Protein-Tyrosinkinasen,
welche selbst hochspezifische Antikörperziele bereitstellen. Somit
liefert, in einer Ausführungsform,
die P185-Tyrosinkinase von HER2 ein am stärksten bevorzugtes Ziel für das Fab'-Fragment, das in
den Immunolipid:Nukleinsäurekomplexen
der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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Es
ist davon auszugehen, dass der charakteristische Marker kein natürlich vorkommender
Marker sein muss, sondern vielmehr in die jeweilige Zielzelle eingebracht
werden kann. Dies kann bewerkstelligt werden durch direktes Markieren
bzw. Tagging einer Zelle oder eines Gewebes mit einem jeweiligen
Marker (z. B. durch direktes Injektionsbehandeln des jeweiligen
Zielgewebes mit einem Marker, oder alternativ dazu durch Verabreichen
eines Markers, welcher selektiv von dem Zielgewebe aufgenommen wird,
an den gesamten Organismus. In einer Ausführungsform kann der Marker
ein Genprodukt sein, welches von einer Nukleinsäure in einer Expressionskassette
codiert wird. Das Markergen kann unter der Steuerung eines Promotors
stehen, welcher nur in den besonderen Zielzellen aktiv ist. Daher
wird die Einführung
eines Vektors, der die Expressionskassette enthält, zur Expression des Markers
lediglich in den jeweiligen Zielzellen führen. Der Fachmann auf dem
Gebiet wird erkennen, dass es zahlreiche Vorgehen unter Anwendung
von rekombinanter DNA-Methodik gibt, um charakteristische Marker
in Zielzellen einzubringen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Targeting-Einheit spezifisch Produkte oder Komponenten
eines Wachstumsfaktorrezeptors binden, insbesondere Produkte des
HER2(c-erbB-2, neu)-Protoonkogens.
Es wird besonders bevorzugt, dass die Targeting-Einheit die von
HER2 codierte Wachstumsfaktor-Rezeptortyrosinkinase, Protein p185HER2, bindet, welche üblicherweise in Brustkrebs-Arten überexprimiert
wird (Slamon et al., Science 235: 177–182 (1987)). Andere geeignete
Ziele für
die Targeting-Einheit schließen, ohne
jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, EGFR (HER1), HER3 und HER4, Kombinationen dieser Rezeptoren
und andere mit Krebsarten assoziierte Marker ein. Andere Antikörper von
Interesse schließen,
ohne je doch darauf eingeschränkt
zu sein, BR96 (Friedman et al., Cancer Res. 53: 334–339 (1993),
e23 bis erbB2 (Batra et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89: 5867–5871 (1992)),
PR1 in Prostatakrebs (Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 547–551
(1993)) und K1 in Eierstockkrebs (Chang et al., Int. J. Cancer 50:
373–381
(1992)) ein.
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II. Herstellung von Liposomen
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Eine
Vielzahl von Verfahren ist für
die Herstellung von Liposomen verfügbar, wie z. B. beschrieben
in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980);
U.S.-Patente Nr. 4 186 183 ,
4 217 344 ,
4 235 871 ,
4 261 975 ,
4 485 054 ,
4 501 728 ,
4 774 085 ,
4 837 028 ,
4 946 787 ; PCT-Veröffentlichungen
Nr.
WO 91/17424 ; Szoka & Papahadjopoulos,
Proc. Natl. Acad. Sd. USA 75: 4194–4198 (1978); Deamer & Bangham, Biochim. Biophys.
Acta 443: 629–634
(1976); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348–3352 (1979);
Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812: 55–65 (1985); Mayer et al., Biochim.
Biophys. Acta 858: 161–168
(1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 242–246 (1988),
Liposomes, Kap. 1 (Hrsg.: Ostro, 1983); und Hope et al., Chem. Phys.
Lip. 40: 89 (1986). Geeignete Verfahren schließen z. B. Schallbehandlung,
Extrusion, Hochdruck/Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergens-Dialyse,
Calciuminduzierte Fusion von kleinen Liposomenvesikeln und Ether-Infusionsverfahren
ein, welche alle im Fachgebiet allgemein bekannt sind. Ein Verfahren
erzeugt multilamellare Vesikel von heterogenen Größen. In
diesem Verfahren werden die Vesikel-bildenden Lipide in einem geeigneten
organischen Lösungsmittel
oder Lösungsmittelsystem
gelöst
und unter Vakuum oder einem Inertgas getrocknet, wodurch ein dünner Lipidfilm
gebildet wird. Falls gewünscht,
kann der Film in einem geeigneten Lösemittel, wie tertiärem Butanol,
erneut gelöst
werden und dann lyophilisiert werden, um ein homogeneres Lipidgemisch
zu bilden, welches in einer einfacher hydratisierten, pulverartigen Form
vorliegt. Dieser Film wird mit einer wässrigen gepufferten Lösung bedeckt
und hydratisieren gelassen, und zwar typischerweise über eine
Dauer von 15–60
Minuten unter Bewegung. Die Größenverteilung
der resultierenden multilamellaren Vesikel kann in Richtung zu kleineren
Größen verschoben
werden durch Hydratisieren der Lipide unter heftigeren Bewegungsbedingungen
oder durch Hinzufügen
von solubilisierenden Detergentien, wie Desoxycholat.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden zumeist unilamellare Liposomen durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren
von Szoka & Papahadjopoulos,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198 (1978) hergestellt.
-
Unilamellare
Vesikel werden im Allgemeinen durch Schallbehandlung oder Extrusion
hergestellt. Schallbehandlung wird im Allgemeinen mit einem Sonifikator
vom Bad-Typ, wie einem "Branson
Tip"-Sonifikator,
bei einer regulierten Temperatur durchgeführt, wie bestimmt durch den
Schmelzpunkt des Lipids. Die Extrusion kann durch Biomembran-Extruder
durchgeführt werden,
wie dem "Lipex Biomembrane
Extruder". Die definierte
Porengröße in den
Extrusionsfiltern kann unilamellare liposomale Vesikel von spezifischen
Größen erzeugen.
Die Liposomen können
auch durch Extrusion durch einen asymmetrischen Keramikfilter gebildet werden,
wie einen Ceraflow Microfilter, welcher von der Norton Company,
Worcester MA, im Handel erhältlich ist.
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Im
Anschluss an die Liposomenherstellung, können die Liposomen, welche
während
der Bildung nicht größenklassiert
bzw. gesiebt worden sind, durch Extrusion größenklassiert werden, um einen
gewünschten Größenbereich
und eine relativ schmale Verteilung von Liposomengrößen zu erzielen.
Ein Größenbereich
von etwa 0,2–0,4
Mikrometer ermöglicht,
dass die Liposomensuspension durch Filtration durch einen herkömmlichen
Filter sterilisiert werden kann, typischerweise einen 0,22-Mikrometer-Filter.
Das Filtersterilisations-Verfahren kann auf einer Hochdurchsatz-Basis
ausgeführt
werden, wenn die Liposomen auf etwa 0,2–0,4 Mikrometer herunter klassiert
worden sind.
-
Mehrere
Techniken zum Klassieren von Liposomen zu einer gewünschten
Größe sind
verfügbar.
Ein Klassierungsverfahren ist in den
U.S.-Patenten
Nr. 4 529 561 oder
4
737 323 beschrieben. Die Schallbehandlung einer Liposomensuspension
entweder durch Bad- oder Sonden-Schallbehandlungsvorgehen
erzeugt eine progressive Größenverringerung
hinunter bis zu kleinen unilamellaren Vesikeln mit einer Größe von weniger
als etwa 0,05 Mikrometern. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren,
welches auf Scherenergie beruht, um große Liposomen zu kleineren zu
fragmentieren. In einem typischen Homogenisierungsvorgehen werden
multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsions-Homogenisator
rezirkuliert, bis ausgewählte Liposomengrößen, typischerweise
zwischen etwa 0,1 und 0,5 Mikrometer, beobachtet werden. Die Größe der liposomalen
Vesikel kann durch Quasi-Elektrische-Lichtstreuung (QELS) ermittelt
werden, wie beschrieben in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,
10: 421–450
(17981). Der durchschnittliche Liposomendurchmesser kann durch Schallbehandlung
von gebildeten Liposomen verringert werden. Unterbrochene Schallbehandlungs-Zyklen
können
mit QELS-Überprüfung abgewechselt
werden, um eine effiziente Liposomensynthese zu leiten.
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Die
Extrusion von Liposomen durch eine kleinporige Polycarbonatmembran
oder eine asymmetrische Keramikmembran ist ebenfalls ein effektives
Verfahren zur Verringerung von Liposomengrößen zu einer relativ gut definierten
Größenverteilung.
Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals durch die
Membran zirkuliert, bis die gewünschte
Liposomengrößenverteilung
erreicht ist. Die Liposomen können
durch sukzessiv kleinporigere Membranen extrudiert werden, um eine
allmähliche
Verringerung der Liposomengröße zu erzielen.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weisen Liposomen eine
Größe von etwa
0,05 Mikrometer bis etwa 0,5 Mikrometer auf. Stärker bevorzugt werden Liposomen,
welche eine Größe von etwa
0,05 bis 0,2 Mikrometer aufweisen.
-
III. Bildung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
-
Es
wurde festgestellt, dass stabilisierte Lipid:Nukleinsäurekomplexe
(z. B. aufweisend kondensierte Nukleinsäure und/hydrophiles Polymer)
dazu neigen, keine sichtbaren großen Aggregate zu bilden, und
eine erhöhte
Transfektionseffizienz und Haltbarkeitsdauer aufweisen. Nukleinsäure/Liposom-Verhältnisse
zur Herstellung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen, welche keine
sichtbaren großen
Aggregate bilden, können
vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Typischerweise wird
das Verhältnis
bestimmt durch Mischen festgelegter Mengen einer Nukleinsäure, z.
B. eines Plasmids, mit verschiedenen Mengen an Liposomen (siehe
Beispiel 1). Im Allgemeinen werden Lipid:Nukleinsäurekomplexe
gebildet, indem man die Nukleinsäure
(z. B. Plasmid-DNA) in eine Liposomensuspension mit gleichem Volumen
pipettiert und rasch vermischt. Routinemäßig bilden Liposomen, welche
5–15 nmol
eines Lipids wie DDAB oder DOPE (wie oben beschrieben) enthalten,
einen Komplex mit 1 μg
Plasmid ohne Bildung von sichtbaren großen Aggregaten. Die Untersuchung hinsichtlich
sichtbarer großer
Aggregate wird typischerweise ohne Hilfe eines Mikroskops durchgeführt. Der Endpunkt
der Titration der Mengen an Lipid und Nukleinsäure wird auch durch Assay hinsichtlich
erhöhter Transfektionseffizienz,
entweder in vitro oder in vivo, im Vergleich zu einer nicht-stabilisierten
Kontrolle (wie nachstehend beschrieben), erreicht.
-
Um
die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
von der Bildung großer
Aggregate und vom Verlust an transfizierender Aktivität über die
Zeit abzuhalten, werden zwei Vorgehensweisen eingeschlagen: (1)
Einbinden einer kleinen Menge eines hydrophilen Polymers, wie PEG-PE
(ungefähr
1% Molverhältnis)
in Lipid:Nukleinsäurekomplexe
innerhalb weniger Minuten nach ihrer Herstellung; und/oder (2) Kondensieren
der Nukleinsäure
mit einem Polykation, wie einem Polyamin (z. B. ungefähr 0,05
bis 5,0 nmol Spermidin pro μg
DNA) vor dem Mischen mit den Liposomen. Die optimale Menge der Polyamine
und des hydrophilen Polymers kann vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt
werden durch Titrieren des Polyamins oder hydrophilen Polymers mit
der Nukleinsäure,
sodass die gebildeten Komplexe keine großen, z. B. sichtbaren, Aggregate
bilden. Die Größe dieser
Lipid:Nukleinsäurekomplexe
kann durch dynamische Lichtstreuung als im Bereich von 410 ± 150 nm
eingeschätzt
werden. Der Endpunkt der Titration wird auch erreicht durch Assay
hinsichtlich erhöhter
Transfektionseffizienz entweder in vitro oder in vivo, im Vergleich
zu einer nicht-stabilisierten Kontrolle (wie nachstehend beschrieben).
-
IV. Transfektion und Gentherapie mit Lipid:Nukleinsäurekomplexen
-
Die
vorliegende Offenbarung sieht Lipid:Nukleinsäurekomplexe, welche eine erhöhte Haltbarkeitsdauer
haben, zur Transfektion von Säugerzellen
in vitro, in vivo und ex vivo, sowie Verfahren zur Herstellung und Transfektion
solcher Komplexe vor. Dies beruht zum Teil auf der unerwarteten
Feststellung, dass ein Lipid:Nukleinsäurekomplex, welcher Nukleinsäure umfasst,
die durch Kontakt mit einem organischen Polykation kondensiert worden
ist, eine erhöhte
Haltbar keitsdauer aufzeigt. Darüber
hinaus beruht dies auf der unerwarteten Feststellung, dass ein Lipid:Nukleinsäurekomplex,
welcher nach der Lipid:Nukleinsäurekomplex-Bildung
mit einem hydrophilen Polymer gemischt wird, eine hohe Transfektionsaktivität und erhöhte Haltbarkeitsdauer,
wie gemessen durch die Transfektionsaktivität nach der Aufbewahrung, aufzeigt.
Derartige Lipid:Nukleinsäurekomplexe
mit einer erhöhten
Haltbarkeitsdauer sind z. B. nützlich
für in-vitro- und ex-vivo-Transfektion
von Zellen und für
die Zuführung
von Nukleinsäuren
in Zellen für
Säuger-Gentherapie
in vivo und im Anschluss an intravenöse Verabreichung.
-
Die
Verwendung von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
zum Zuführen
von Nukleinsäuren
in verschiedene Säugerzelltypen
führt zu
einem sicheren Transferverfahren und einer hohen Effizienz des Gentransfers.
Die Transfektion von Zellen in vivo mit Lipid:Nukleinsäurekomplexen
ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und kann unter Anwendung
von Standardtechniken durchgeführt
werden, wie sie im Beispiel 1 erörtert
sind (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2. Ausgabe 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology (1995)).
-
Jedwede
heterologe Nukleinsäure,
welche zur Einführung
in eine Wirtszelle geeignet ist, kann vom Fachmann auf dem Gebiet
verwendet werden. Für
Gentherapie nützliche
Gene können
unter Anwendung der Verfahren und Vektoren dieser Erfindung in Säuger eingeführt werden.
Gene, welche Blutproteine, Enzyme, Hormone, Ribozyme, Antisense-RNA,
virale Inhibitoren und Ionenkanalproteine codieren, sind Beispiele
für heterologe
Nukleinsäuren,
die in der Gentherapie nützlich
sind. Ein funktionales heterologes Gen kann verwendet werden, um
ein mutiertes Gen in einem Säuger
unter Anwendung von Gentherapie zu ersetzen. Zum Beispiel kann das β-Globin codierende
Gen verwendet werden, um β-Thalassämie zu behandeln;
und das CFTR codierende Gen kann verwendet werden, um cystische
Fibrose zu behandeln. Gene, welche selektierbare Marker codieren,
wie diejenigen, welche Antibiotikumresistenz vermitteln, können verwendet
werden, um mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex transfizierte Zellen
nachzuweisen und zu isolieren. Reportergene, wie Luciferase, β-Galactosidase,
Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), humanes Wachstumshormon
(hGH) und das Grün-fluoreszente
Protein (GFP), sind bevorzugte Beispiele von Genen, welche in Assays
zum Bestimmen der Transfektionseffizienz verwendet werden können. Luciferase
kann als ein Reportergen verwendet werden, um die Transfektionseffizienz
zu bestimmen.
-
Die
Transfektionseffizienz eines Reportergens kann mit einem Assay bestimmt
werden, welcher für das
verwendete Reportergen geeignet ist. Solche Assays sind dem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt. Zum Beispiel ist der HGH-Reporter-Assay
immunologisch basiert und verwendet im Handel erhältliche
Radioimmunassay-Kits. Vorzugsweise wird der Luciferase-Assay angewandt,
um die Transfektion und Expression des Luciferase-Reportergens nachzuweisen.
Der Luciferase-Assay
wird bevorzugt, weil er hochempfindlich ist und keine Radioaktivität anwendet.
Ein Lu minometer kann verwendet werden, um die Luciferase-Enzymaktivität zu messen,
wie es im Beispiel 1 beschrieben wird.
-
Gentherapie
stellt Verfahren zur Bekämpfung
von chronischen Infektionskrankheiten, wie HIV-Infektion, sowie nicht-infektiösen Krankheiten,
wie Krebs und Geburtsfehlern bereit (siehe im allgemeinen, Anderson, Science
256: 808–-813
(1992); Yu et al., Gene Ther. 1: 13–26 (1994)). Gentherapie kann
angewandt werden, um Zellen entweder mit einem Ex-vivo- oder einem
In-vivo-Vorgehen
zu transduzieren. Ex-vivo-Verfahren für die Gentherapie beinhalten
das Transduzieren der Zellen außerhalb
des Säugers
mit einem Lipid:Nukleinsäurekomplex
dieser Erfindung und das Wiedereinbringen der Zellen in den Organismus.
Die Zellen können
hämatopoietische
Stammzellen sein, welche aus dem Knochenmark isoliert wurden, oder
andere Zellen, welche mittels Lipid:Nukleinsäurekomplexen transfiziert werden
können.
-
Im
Menschen können
hämatopoietische
Stammzellen aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, einschließlich Nabelschnurblut,
Knochenmark und mobilisierten peripherem Blut. Die Reinigung von CD34+-Zellen kann durch Antikörper-Affinitätsverfahrensweisen
bewerkstelligt werden (siehe Ho et al., Stem Cells 13 (Suppl. 3):
100–105
(1995); siehe auch Brenner, J., Hematotherapy 2: 7–17 (1993)).
Zellen können auch
aus Patienten isoliert und kultiviert werden. Alternativ dazu können die
für ex-vivo-Verfabrensweisen
verwendeten Zellen diejenigen sein, welche in einer Zellbank gelagert
sind (z. B. einer Blutbank). Der Vorteil bei der Verwendung von
Stammzellen besteht darin, dass sie in vitro zu anderen Zelltypen
differenziert werden können
oder in einen Säuger
(wie den Spender der Zellen) eingebracht werden können, wo
sie sich im Knochenmark einnisten werden. Verfahren zur Differenzierung
von Knochenmarkzellen in vitro zu klinisch bedeutsamen Immunzelltypen
unter Verwendung von Cytokinen, wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-28, sind bekannt (siehe
z. B. Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693–1702 (1992)).
-
Die
Zuführung
einer Nukleinsäure
kann ebenfalls unter Verwendung von In-vivo-Gentherapie bewirkt werden.
Die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
der Erfindung können
direkt an einen Patienten, vorzugsweise an einen Menschen, verabreicht
werden. In-vivo- und Ex-vivo-Verabreichung erfolgt durch eine Beliebige
der Routen, welche normalerweise zur Einführung eines Moleküls oder
einer Zelle in den letztendlichen Kontakt mit Blut oder Gewebezellen
angewandt werden. Lipid:Nukleinsäurekomplexe
der Erfindung werden auf eine beliebige geeignete Weise verabreicht,
vorzugsweise mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern.
-
Geeignete
Verfahren zur Verabreichung solcher nicht-viralen Partikel im Kontext
der vorliegenden Erfindung an einen Patienten sind dem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen
Zusammensetzungen unter Anwendung von Aerosol-Verabreichung (z. B. unter Verwendung
eines Zerstäubers
oder einer anderen Aerosolierungs-Vorrichtung) und parenteral, d. h. intra-arteriell,
intravenös,
intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Weiter bevorzugt
werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Aerosol-Verabreichung
oder intravenös
oder intraperitoneal durch eine Bolus-Injektion verabreicht. Besondere
Formulierungen, welche für
diese Verwendung geeignet sind, findet man in Remington's Pharmaceutical
Sciences (17. Auflage, 1985). Typischerweise werden die Formulierungen
eine Lösung
der Lipid:Nukleinsäurekomplexe
umfassen, welche in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise in einem
wässrigen
Träger,
suspendiert ist.
-
V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, welche die Lipid:Nukleinsäurekomplexe umfassen, werden gemäß Standardtechniken
hergestellt und umfassen ferner einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger.
Im Allgemeinen wird normale Kochsalzlösung als der pharmazeutisch
annehmbare Träger
verwendet. Andere geeignete Träger
schließen
z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, isotonische Lösung (z. B. Dextrose), 0,4%
Kochsalzlösung,
0,3% Glycin und dergleichen ein, einschließlich Glykoproteinen für eine gesteigerte
Stabilität,
wie Albumin, Lipoprotein, Globulin etc. Diese Zusammensetzungen
können
durch herkömmliche,
allgemein bekannte Sterilisierungstechniken sterilisiert werden.
Die resultierenden wässrigen
Lösungen
können
zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert
und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat, vor
der Verabreichung, mit einer sterilen wässrigen Lösung vereinigt wird. Die Zusammensetzungen
können
pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen nach Bedarf enthalten,
um physiologische Bedingungen anzunähern, wie pH-einstellende und
puffernde Mittel, Tonizitäts-einstellende
Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat,
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid etc. Darüber hinaus kann
die Lipid:Nukleinsäurekomplex-Suspension
lipidschützende
Mittel einschließen,
welche Lipide gegen Freiradikal- und Lipid-peroxidative Schäden bei
der Aufbewahrung schützen.
Lipophile Freiradikal-Abfangmittel, wie Alphatocopherol und wasserlösliche,
eisenspezifische Chelatbildner, wie Ferrioxamin, sind geeignet.
-
Die
Konzentration von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
in den pharmazeutischen Formulierungen kann in breitem Maße, d. h.
von weniger als etwa 0,05%, üblicherweise
bei oder bei mindestens etwa 2–5%,
bis so viel wie 10 bis 30 Gew.-%, variieren und wird hauptsächlich nach
den Fluidvolumina, Viskositäten
etc. gemäß der gewählten besonderen
Art der Verabreichung ausgewählt.
Zum Beispiel kann die Konzentration erhöht werden, um die mit der Behandlung
assoziierte Fluidbelastung zu verringern. Dies kann besonders wünschenswert
bei Patienten sein, welche ein mit Atherosklerose assoziiertes kongestives
Herzversagen oder schwerere Hypertension aufweisen. Alternativ dazu
können
aus irritierenden Lipiden zusammengesetzte Immunlipid:Nukleinsäurekomplexe
zu geringen Konzentrationen verdünnt
werden, um eine Entzündung
an der Stelle der Verabreichung zu verringern. Die Menge an verabreichtem
Lipid:Nukleinsäurekomplex
wird von dem verwendeten jeweiligen Fab', dem behandelten Krankheitszustand
und der Beurteilung des Arztes abhängen. Im Allgemeinen wird die
Menge an verabreichten Lipid:Nukleinsäurekomplexen ausreichend sein,
um eine therapeutisch wirksame Dosis der Nuk leinsäure zuzuführen. Die
zur Zuführung
einer therapeutisch wirksamen Dosis notwendige Menge an Lipid:Nukleinsäurekomplex
kann vom Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Typische Lipid:Nukleinsäurekomplex-Dosierungen
werden allgemein zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg Nukleinsäure pro
Kilogramm Körpergewicht,
vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg Nukleinsäure/kg Körpergewicht
und am stärksten
bevorzugt zwischen etwa 2,0 und etwa 5,0 mg Nukleinsäure/kg Körpergewicht
liegen. Für
eine Verabreichung an Mäuse
beträgt
die Dosis typischerweise 50–100 μg je 20 g
Maus.
-
VI. Assay der Blut-Halbwertszeit
-
Eine
Hilfe für
die Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lokalisierung
in einem Zielgewebe ist eine verlängerte Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lebensdauer
im Blutstrom im Anschluss an eine Verabreichung. Ein Maß der Lipid:Nukleinsäurekomplex-Lebensdauer
im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, welches
an einem ausgewählten
Zeitpunkt nach der Komplex-Verabreichung bestimmt wird. Typischerweise
werden Lipid:Nukleinsäurekomplexe,
welche eine Markierung (z. B. fluoreszenter Marker, elektronendichtes
Reagenz oder radioaktiver Marker) entweder intern im Komplex oder
gebunden an ein im Komplex beinhaltetes Lipid enthalten, in den Testorganismus
injiziiert. Eine festgelegte Zeitspanne später, wird der Organismus getötet, und
die Menge an im Blut nachgewiesener Markierung (z. B. durch Messen
der Lumineszenz oder durch Szintillationszählung) wird mit derjenigen
verglichen, welche in jeweiligen Geweben (z. B. Leber oder Milz)
lokalisiert ist.
-
Der
Zeitverlauf der Retention von Lipid:Nukleinsäurekomplexen im Blut kann auch
einfach bestimmt werden durch Probenentnahme von Blut bei festgelegten
Intervallen nach der Verabreichung von Markierung enthaltenden Lipid:Nukleinsäurekomplexen
und Ermitteln der Menge an Markierung, welche im Kreislauf bleibt.
Das Ergebnis kann als der Bruchteil der ursprünglichen Dosis ausgedrückt werden.
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VII. Assay der Gewebetransfektion durch
die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
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Die
Transfektion von Zielzellen durch die Lipid:Nukleinsäurekomplexe
dieser Erfindung kann in ähnlicher
Weise durch Verabreichen von Lipid:Nukleinsäurekomplexen bestimmt werden,
welche eine Nukleinsäure
enthalten, die an sich nachweisbar ist oder die ein nachweisbares
Produkt codiert. Biologische Proben (z. B. Gewebebiopsien oder Fluidproben)
werden dann abgenommen und hinsichtlich Transfektion durch Nachweisen
der Gegenwart der transfizierten Nukleinsäure selbst oder durch Nachweisen
der Gegenwart des exprimierten Produkts der Nukleinsäure geassayt.
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Die
Nukleinsäure
selbst kann gewählt
werden, um eine Sequenz aufzuweisen, welche leicht, z. B. durch
Nukleinsäure-Amplifikation,
nachweisbar ist. In diesem Fall wird die Nukleinsäure selektiert,
welche Primerstellen aufweist, die so ausgewählt sind, dass sie eine einzigartige
Amplifikation der vorliegenden Nukleinsäure und keiner anderen in der
Probe des biologischen Gewebes ermöglichen, welches hinsichtlich
der Transfektion zu testen ist.
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Methoden
zum Nachweisen von spezifischen DNA-Sequenzen sind dem Fachmann
auf dem Gebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel können Oligonukleotidsonden verwendet
werden, welche gewählt
sind, um komplementär
zu einer ausgewählten
Teilsequenz innerhalb[mit] der Region zu sein. Alternativ dazu können Sequenzen
oder Teilsequenzen durch eine Vielzahl von DNA-Amplifikationstechniken
amplifiziert werden, einschließlich,
ohne jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR) (Inns et al., PCR Protocols:
A guide to Methods and Application (1990)), Ligase-Kettenreaktion
(LCR) (siehe Wu & Wallace,
Genomics 4: 560 (1989); Landegren et al., Science 241: 1077 (1988);
Barringer et al., Gene 89: 117 (1990), Transkriptionsamplifikation
(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989)) und selbst-ablaufender
Sequenzreplikation (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87: 1874 (1990)).
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird Transfektion durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit
oder Quantifizieren eines Genprodukts in einem oder mehreren Geweben
ausgewertet. Ein beliebiges Gen, welches ein leicht zu testendes
Produkt exprimiert, wird einen geeigneten Indikator für den vorliegenden
Assay bereitstellen. Geeignete Reportergene sind dem Fachmann auf
dem Gebiet allgemein bekannt. Sie schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein,
bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), beta-Galactosidase
oder Luciferase (siehe z. B. Alam et al., Analytical Biochemistry
188: 245–254 (1990))
ein. Ein besonders bevorzugtes Reportergen ist das Fflux-Gen, wie
es in den Beispielen veranschaulicht wird.
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VIII. Assay der Haltbarkeitsdauer
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Wie
oben angegeben, wird der Begriff "Haltbarkeitsdauer" hierin verwendet, um Bezug auf die
Zeitdauer zu nehmen, während
der der Lipid:Nukleinsäurekomplex
aufbewahrt werden kann (unter definierten Bedingungen, z. B. in
Puffer bei 4°C),
bevor er seine biologische Aktivität verliert. Die biologische
Aktivität,
welche zur Ermittlung der Haltbarkeitsdauer in der vorliegenden
Erfindung getestet wird, ist das Vermögen des Lipid:Nukleinsäurekomplexes,
Säugerzellen
in vivo nach einer intravenösen
Verabreichung zu transfizieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Haltbarkeitsdauer bestimmt durch Aufbewahren der Lipid:Nukleinsäurekomplexe
während
variierenden Zeitdauern, Injizieren des Komplexes in ein oder mehrere Versuchstiere
und Assay ausgewählter
Gewebe in dem Tier hinsichtlich Transfektion (z. B. Expression eines Reportergens),
wie oben beschrieben und in den Beispielen veranschaulicht.
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Es
wird davon ausgegangen, dass die Haltbarkeitsdauer als Absolutangabe
ausgedrückt
werden kann, d. h. die Länge
der Zeit, während
der die Zusammensetzung vor Verlust von Aktivität aufbewahrt werden kann. Alternativ
dazu kann die Haltbarkeitsdauer als Relativangabe unter Bezugnahme
auf eine andere Zusammensetzung ausgedrückt werden. Wenn der vorliegende
Komplex nach einer festgelegten Aufbewahrungsdauer eine Transfektionsaktivität zeigt
und diese Aktivität
größer ist
als die Aktivität
eines unterschiedlichen Komplexes, der während der gleichen Zeitspanne
in ähnlicher
Weise aufbewahrt wurde, sagt man zum Beispiel, dass der vorliegende
Komplex somit eine erhöhte
Haltbarkeitsdauer im Vergleich zu dem unterschiedlichen Komplex
aufweist.
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IX. Ziellenken von Lipid:Nukleinsäurekomplexen
zu spezifischen Geweben
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Es
können
spezifische Targeting-Einheiten mit den Lipid:Nukleinsäurekomplexen
der Erfindung verwendet werden, um spezifische Zellen oder Gewebe
anzuzielen. So stellt die Verwendung einer Targeting-Einheit in
Kombination mit einem generischen bzw. allgemeinen Effektor-Lipid:Nukleinsäurekomplex
die Fähigkeit bereit,
den Komplex für
die Zuführung
zu spezifischen Zellen und Geweben zweckmäßig zu gestalten.
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Beispiele
von Effektoren in Lipid:Nukleinsäurekomplexen
schließen
Nukleinsäuren,
welche Cytotoxine (z. B. Diphtherietoxin (DT), Pseudomonas-Exotoxin
A (PE), Pertussistoxin (PT) und die Pertussis-Adenylcyclase (CYA))
codieren, Antisense-Nukleinsäure,
Ribozyme, markierte Nukleinsauren und Nukleinsäuren, welche Tumorsuppressorgene
wie p53, p110RB und p72 codieren, ein. Diese Effektoren können mit
einer Targeting-Einheit spezifisch zu Zellen, wie Krebszellen, Immunzellen
(z. B. B- und T-Zellen) und anderen gewünschten zellulären Zielen,
gelenkt werden. Wie oben beschrieben, sind zum Beispiel viele Krebsarten
durch die Überexpression
von Zelloberflächenmarkern,
wie HER2, welches in Brustkrebszellen exprimiert wird, oder IL17R,
welches in Gliomen exprimiert wird, gekennzeichnet. Targeting-Einheiten,
wie Anti-HER2- und
Anti-IL17R-Antikörper
oder -Antikörperfragmente
werden verwendet, um den Lipid:Nukleinsäurekomplex an die Zelle der
Wahl zuzuführen.
Das Effektormolekül
wird somit zu dem spezifischen Zelltyp zugeführt, wodurch eine nützliche
und spezifische therapeutische Behandlung bereitgestellt wird.
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X. Lipid:Nukleinsäurekomplex-Kits
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Die
vorliegende Offenbarung sieht auch Kits zur Herstellung der oben
beschriebenen Lipid:Nukleinsäurekomplexe
vor. Derartige Kits können
aus leicht verfügbaren
Materialien und Reagenzien, wie oben beschrieben, hergestellt werden.
Zum Beispiel können
solche Kits ein beliebiges oder mehrere der folgenden Materialien
umfassen: Liposomen, Nukleinsäure
(kondensiert oder unkondensiert), hydrophile Polymere, hydrophile
Polymere, die mit Targeting- Einheiten,
wie Fab'-Fragmenten,
derivatisiert sind, und Anweisungen. Eine weite Vielzahl von Kits
und Komponenten kann gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt werden, abhängig von dem beabsichtigten
Anwender des Kits und den jeweiligen Anforderungen des Anwenders.
Zum Beispiel kann das Kit eine Beliebige von einer Reihe von Targeting-Einheiten
zum Ziellenken des Komplexes zu einem spezifischen Zelltyp enthalten,
wie oben beschrieben.
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Das
Kit kann gegebenenfalls Anweisungsmaterialien einschließen, welche
Anleitungen (d. h. Protokolle) enthalten, welche die Anwendung des
kationischen Lipid:Nukleinsäurekomplexes
zum Transfizieren von Zellen in vivo, ex vivo oder in vitro ermöglichen.
Typischerweise beschreiben die Anweisungsmaterialen die Verfahrensweise
zum Bereiten des Lipid:Nukleinsäurekomplexes
aus Liposomen und Nukleinsäure,
wie oben beschrieben. Die Anweisungsmaterialien beschreiben ebenfalls,
wie das hydrophile Polymer mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex
zu vermischen ist. Darüber
hinaus können
die Anweisungsmaterialien Verfahrensweisen zum Transfizieren von
Zellen mit dem Lipid:Nukleinsäurekomplex
beschreiben.
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Obgleich
die Anweisungsmaterialien typischerweise geschriebene oder gedruckte
Materialien umfassen, sind sie nicht derartig eingeschränkt. Jedwedes
Medium, das zum Speichern solcher Anweisungen und zum Mitteilen
dieser an einen Endverbraucher in der Lage ist, wird von dieser
Erfindung in Betracht gezogen. Solche Medien schließen, ohne
jedoch darauf eingeschränkt
zu sein, elektronische Speichermedien (z. B. Magnetscheiben, Bänder, Kassetten,
Chips), optische Medien (z. B. CD-ROM) und dergleichen ein. Derartige
Medien können
Adressen von Internetseiten einschließen, welche solche Anweisungsmaterialien
bereitstellen.
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XI. Herstellung von lipidischen Mikropartikeln
mit Oberflächen-befestigten
Proteinen
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A. Allgemeines
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Die
vorliegende Erfindung sieht die Bereitung von lipidischen Mikropartikeln
mit an der Oberfläche
befestigten Proteinen vor. Wie im oben aufgeführten "Hintergrund"-Abschnitt angemerkt, lehrt das Fachgebiet, dass
lösliche
Proteine, wie Antikörper,
so groß sind,
dass ihre Tendenz zur Solubilisierung der Tendenz einer hydrophoben
Domäne
eines an dem Protein befestigten Linkermoleküls, stabil mit einem lipidischen
Mikropartikel verbunden zu werden, überlegen ist. Daher war die
Lehrmeinung, dass, während,
an ein Linkermolekül von
ungefähr
gleicher oder höherer
Größe konjugierte,
kleine Peptide ermöglichen
könnten,
dass die hydrophobe Domäne
eines Linkermoleküls
stabil mit einem lipidischen Mikropartikel verbunden wird, Proteine,
welche an ein Linkermolekül,
das viel kleiner als das Protein ist, konjugiert sind, nicht in
der Lage sind, dies zu vollbringen.
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Wir
haben nun festgestellt, dass im Gegensatz zu den Lehren des Stands
der Techniks, Proteine, die um ein Vielfaches größer als ein Linkermolekül sind,
an ein Linkermolekül
konjugiert wer den können
und immer noch erfolgreich und stabil an ein lipidisches Mikropartikel
befestigt werden können.
Die nachstehenden Beispiele zeigen, dass Proteine, die um ein Vielfaches
größer als
die Linkermoleküle
sind, an welchen sie konjugiert sind, erfolgreich an lipidische
Mikropartikel befestigt werden können.
Diese Feststellung erweitert die Typen von Mitteln, mit denen solche
Mikropartikel beladen werden können.
Ferner erweitert sie den Bereich an Verfahren, durch welche solche
Mikropartikel hergestellt und noch an Proteine befestigt werden
können,
da die Befestigung nun unter Bedingungen stattfinden kann, bei welchen
die Stabilität
des Mikropartikels, wie eines Liposoms, nicht gefährdet sein
wird.
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Vorzugsweise
besitzen die in diesem Verfahren verwendeten Proteine ein Molekulargewicht
zwischen etwa 6000 und etwa 1000000 Dalton. Weiter bevorzugt besitzen
die Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 10000 und etwa 600000
Dalton. Noch weiter bevorzugt weisen die Proteine ein Molekulargewicht
zwischen etwa 15000 und etwa 250000 Dalton auf. Am stärksten bevorzugt
weisen die Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 20000 und
etwa 75000 Dalton auf.
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B. Befestigung von Proteinen durch Inkubieren
von lipidischen Mikropartikeln mit an Linkermoleküle konjugierten
Proteinen
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Zur
Verwendung in dieser Erfindung kann ein Protein zuerst an ein Linkermolekül konjugiert
werden, umfassend (a) eine hydrophobe Domäne, (b) eine hydrophile Polymerkette,
welche terminal an der hydrophoben Domäne befestigt ist und (c) eine
chemische Gruppe, welche zu einer oder mehreren funktionalen Gruppen
auf einem Proteinmolekül
reaktiv ist und an der hydrophilen Polymerkette am oder nahe dem
zur hydrophoben Domäne
kontralateralen Ende befestigt ist. Derartige Linkermoleküle sind
im Fachgebiet bekannt (Allen & Martin,
US 5 527 528 ; Shahinian & Sylvius, Biochim.
Biophys. Acta, 1239: 157–167
(1995); Zalipsky et al., J. Controlled Release 39: 153–161, 1996;
Kirpotin et al., Biochemistry, 36: 66–75 (1997)).
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Die
hydrophobe Domäne
des Linkermoleküls
kann zum Beispiel ein Diacylglycerol, ein Phospholipid, ein Sterol,
wie Cholesterol, oder ein Diacylamid-Derivat, wie N,N-Distearoyl-Glycinamid, sein.
Die hydrophile Polymerkette kann zum Beispiel Poly(ethylenglykol),
Polyglycidol, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Polyoxazolidinon,
Polysaccharid oder ein Copolymer, welches die Blöcke der oben genannten Polymere
einschließt,
sein. Die chemische reaktive Gruppe kann beispielsweise eine Aminogruppe,
Carboxygruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Iodacetamidgruppe, Vinylsulfongruppe,
Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Ketongruppe, Cyanurchloridgruppe
oder jedwede andere im Fachgebiet bekannte funktionale Gruppe zur
Bildung von Bindungen mit Proteinen sein. Ein Protein kann ein Antikörper, ein
Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Nukleinsäure-bindendes
Protein oder ein beliebiges anderes Protein von Nützlichkeit
für eine
jeweilige beabsichtigte Anwendung sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Protein ein Fab''-Fragment
eines Antikörpers
oder ein Single-Chain-Antikörper.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist der Single-Chain-Antikörper
ein Fv-Antikörper,
der über
Selektion aus einer Phagendisplay-Bibliothek produziert wird. Maleimidgruppen,
welche mit Cysteinresten im Protein reagieren, werden als die reaktive
Gruppe zur Verwendung mit einem Fab'-Antikörperfragment oder Single-Chain-Antikörper bevorzugt.
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Die
Konjugation des Proteins an den Linker kann durch ein Beliebiges
von einer Anzahl von Verfahren, welche auf dem Fachgebiet für Proteinkonjugation
bekannt sind, bewirkt werden. In einem bevorzugten Verfahren kann
der Linker einfach in wässrigem
Puffer gelöst
werden (was auf Grund der Gegenwart der hydrophilen Polymerdomäne möglich ist)
und mit dem Protein der Wahl inkubiert werden, um die Bildung einer
stabilen Bindung zwischen der chemischen reaktiven Gruppe des Linkers
und der passenden funktionellen Gruppe des Proteins zu gewähren. Das
Konjugat kann ferner von dem überschüssigen Linker
und jedwedem nicht-konjugierten Protein durch Aussalzen, Dialyse,
Chromatographie und andere Verfahren, welche auf dem Fachgebiet
der Proteinreinigung bekannt sind, gereinigt werden. Alternativ
dazu kann das Konjugat ohne weitere Reinigung verwendet werden.
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Konjugiertes
Protein wird dann mit den lipidischen Mikropartikeln in einem wässrigen
Medium während einer
ausreichenden Zeit inkubiert, damit die hydrophobe Domäne des Konjugats
in die Oberflächen-Lipidschicht
des Partikels hinein verschmilzt. Die erforderliche Zeit wird von
der Lipidzusammensetzung des Mikropartikels, der Natur der hydrophoben
Domäne
und der Temperatur der Inkubation abhängen. Typischerweise wird die
Inkubationszeit im Bereich von etwa 1 Minute bis etwa 50 Stunden
liegen. Die zur Inkubation notwendige Zeit wird sinken, wenn die
Temperatur, bei der die Inkubation durchgeführt wird, erhöht wird.
Somit wird die Inkubation bei 37°C
im Allgemeinen über
Nacht stattfinden, während
die Inkubation bei 55–60°C im Allgemeinen
5–60 Minuten
dauern wird, wobei 15–30
Minuten bevorzugt sind. Für
jedwede besondere Kombination von Mikropartikel, hydrophober Domäne und Temperatur
angemessene Inkubationszeiten können
unter Anwendung der nachstehend in den Beispielen aufgeführten Assays
bestimmt werden.
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C. Herstellung von Proteinen, welche hydrophobe
Domänen
enthalten, welche sich selbst in ein lipidisches Mikropartikel inserieren
-
In
einer alternativen Ausführungsform
werden ein hydrophober Anker und eine hydrophile Polymerkette durch
rekombinante DNA- und Proteintechnik-Verfahren in ein Proteinmolekül eingeführt. In
diesem Fall wird eine hydrophile polymere Domäne, wie oben beschrieben, in
das Protein von Interesse eingeführt
durch eine terminal angehängte
Polyaminosäuresequenz,
welche hauptsächlich
Aminosäuren
mit hydrophilen Seitenketten enthält. Ein hydrophober Anker wird
in das Konstrukt während
seiner Biosynthese vermittels einer Lipidmodifikationsstelle eingeführt, die
am distalen Ende der terminal angehängten Polyaminosäuresequenz
positioniert ist.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese
Beispiele werden zur Veranschaulichung, aber nicht nur Einschränkung der
vorliegenden Erfindung angeboten.
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Beispiel 1: Herstellung von stabilen Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen
für in-vivo-Genzuführung
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A. Materialien und Methoden
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1. Lipide & andere Reagenzien
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DOPE
wurde von Avanti (Alabaster, AL) erworben. Hochgereinigtes Cholesterol
wurde von Calbiochem (San Diego, CA) erhalten. DDAB und Dextran
(M. G. 40000) wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. DDAB wurde
einmal aus Aceton-Methanol-Lösung
umkristallisiert. D-Luciferin wurde von Boehringer Mannheim erhalten.
PEG-PE war ein Geschenk von Sequus Pharmaceuticals (Menlo Park,
CA). DC-Chol, MMCE und DOGS wurden vom "UCSF Gene Transfer Vehicle Core of Gene
Therapy Center" erhalten.
ESPM, DOTAP, POEPC, DOEPC, DMEPC und DODAP waren Geschenke von Avanti
(Alabaster, AL). Die Chloroformlösung
von jedem Lipid wurde unter Argon in versiegelten Ampullen bei –40°C aufbewahrt.
Andere Reagenzien von höchstmöglicher
Güteklasse
wurden erworben und ohne weitere Reinigung verwendet.
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2. Herstellung von Liposomen
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Kleine
kationische Liposomen wurden in 5% (w/v) Dextroselösung auf
die folgende Weise hergestellt. DDAB oder andere kationische Lipide
in Chloroform wurden mit DOPE und/oder Cholesterol in einem gewünschten
Molverhältnis
vermischt, und das Lösungsmittel
wurde langsam unter verringertem Druck bei 50°C auf einem Rotationsverdampfer
entfernt. Der trockene Lipidfilm wurde mit 5% Dextroselösung, welche
auf 50°C
vorgewärmt
war, hydratisiert, und der Behälter
wurde unter Argon verschlossen. Die hydratisierte Lipidsuspension
wurde in einem Bad-Sonifikator
(Lab Supplies, Hicksville, N. Y.) während 5–10 Minuten bei 50°C schallbehandelt.
Die Endkonzentration an Liposomen war 5 mM kationisches Lipid, und
die Größe von Liposomen
wurde durch dynamische Lichtstreuung als 195 ± 65 nm gemessen. Schallbehandelte
Liposomen wurden unter Argon bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
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3. Luciferase-Reportersystem
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Das
Plasmid pCMV/IVS-luc+ wurde wie folgend
konstruiert. Ein Fragment, welches den CMV-Promotor und ein synthetisches IgE-Intron
enthielt, wurde aus pBGt2.CAT unter Verwendung von SpeI und HindIII herausgeschnitten
und in pBSIIKS+ kloniert. Die cDNA, welche
die modifizierte Glühwürmchen-Luciferase (luc+)
einschließlich
SV40-Late-Poly(A)-Signal codiert, wurde aus dem pGL3-Basic-Vector
(Promega) mit HindIII und SalI herausgeschnitten und in den pBS-CMV-IVS-Klon
stromabwärts
der Splice-Stelle eingebracht. Plasmide wurden unter Anwendung von
Alkalische-Lyse-Verfahrensweisen gereinigt, welche von Qiagen Corp.
(Chatsworth, CA) angenommen und ersonnen wurden. Die Plasmidreinheit
wurde durch das Verhältnis der
Extinktion bei 260 nm gegenüber
280 nm gemessen, und eine Aufbewahrung erfolgte im Puffer, der 10
mM Tris-Cl und 1 mM EDTA bei pH 8,0 enthielt, bei Konzentrationen
von 1–2
mg/ml.
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4. Herstellung von Transfektionskomplexen
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Vor
den Transfektionsexperimenten wurde das optimale DNA/Liposomen-Verhältnis zur
Bildung von Komplexen, welche keine großen Aggregate waren, durch
Mischen von festgelegten Mengen an Plasmid mit veränderlichen
Mengen an Liposomen bestimmt. Im Allgemeinen wurden die Transfektionskomplexe
durch Pipettieren von Plasmid in eine Liposomensuspension von gleichem
Volumen und rasches Vermischen gebildet. Routinemäßig konnten
Liposomen, welche 8–12
nmol DDAB enthielten, mit 1 μg
Plasmid ohne Bildung von sichtbaren großen Aggregaten komplexieren.
Solche Komplexe besitzen eine überschüssige positive
Ladung, aber neigen noch dazu, mit der Zeit während der Aufbewahrung bei
4°C zu aggregieren
und Transfektionsaktivität
in 4 Tagen zu verlieren. Für
in-vitro-Experimente, welche nach viel verdünnteren Komplexen verlangen, wurden
kationische Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe ("CLDC")
bei 5 nmol DDAB pro μ [μg] DNA verwendet.
Um die Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe davon abzuhalten, große Aggregate
zu bilden und mit der Zeit die transfizierende Aktivität zu verlieren,
wurden zwei Vorgehensweisen angewandt: (1) Einbinden einer kleinen
Menge von PEG-PE (ungefähr
1% Molverhältnis)
in Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe innerhalb einiger weniger Minuten
nach ihrer Herstellung; und/oder (2) Kondensieren von Plasmid mit
Polyaminen (z. B. 0,05–5,0
nmol Spermidin pro μg
DNA) vor dem Vermischen mit Liposomen. Die optimale Menge der Polyamine
wurde bestimmt durch Titrieren von Polyaminen zu DNA vor der Bildung
großer
Aggregate. Die Größe dieser
Komplexe wurde durch dynamische Lichtstreuung als im Bereich von
410 ± 150
nm eingeschätzt.
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5. Assay der Reportergen-Expression
-
Gereinigte
Luciferase wurde von Boehringer Mannheim als Standard zum Kalibrieren
des Luminometers und zum Konstruieren eines Kontrollstandards für die relative
spezifische Aktivität
von Luciferase erworben. Die Reportergen-Expression in einem Gewebeextrakt
wurde durch Umwandeln der von einem Luminometer gemessenen relativen
Lichteinheiten in Gewichtseinheiten gemäß einer Eichkurve in Nanogramm-Mengen
dargestellt. In Zellen oder Geweben exprimierte Luciferase wurde
mit chemischer Zelllyse extrahiert. Ein effektiver Lysepuffer bestand
aus 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7,8, 1% Triton X-100, 1 mM
DTT und 2 mM EDTA.
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Weibliche
CD1-Mäuse
(4–6 Wochen
alt, Gewicht ungefähr
25 g) wurden vom Charles River Laborstory erhalten. Mäuse erhielten
Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe durch Schwanzveneninjektion und wurden
24 Stunden später
geopfert. Die betäubten
Tiere erhielten eine Perfusion mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
durch Herzpunktur. Jedes Gewebe wurde präpariert und in PBS gewaschen
und dann in 6 ml großen
Rundboden-Kulturröhrchen,
enthaltend 500 μl
Lysepuffer, homogenisiert. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei
gelegentlichem Mischen bei Raumtemperatur gehalten. Die homogenisierten
Proben wurden 10 Minuten lang bei 3000 U/min in einer Eppendorf-Zentrifuge
zentrifugiert. Die Luciferase-Aktivität jedes Gewebes wurde durch
Mischen von 100 μl
des rekonstituierten Luciferase-Substrats (Promega, Madison, WI)
mit 20 μl des Überstands
des Gewebehomogenats im Injektionssystem eines Luminometers gemessen.
Die Spitzen-Lichtemmission wurde 10 Sekunden lang bei 20°C gemessen.
Die relativen Lichteinheiten jeder Probe wurden in die Menge an
Luciferase im Gewebeextrakt durch Vergleichen mit einer Eichkurve
umgewandelt, welche für
jeden Satz an Experimenten aufgestellt worden war. Der Proteingehalt
des Extrakts wurde unter Anwendung von Protein-Assay-Kits (BioRad, Richmond, CA) bestimmt.
Der Hintergrund war die Zählung
von Lysepuffer allein.
-
SK-BR-3-Zellen
(Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327–1331 (1995))
wurden in McCoy's 5A-Medium,
das mit 10% hitzeinaktiviertem bovinem Kälberserum ergänzt war,
und in 5% CO2 kultiviert. SK-BR-3-Zellen
in Monoschichtkultur wurden bei 50000 Zellen je Vertiefung in 12-Vertiefungs-Platten
ausplattiert und über
Nacht inkubiert. Jede Vertiefung erhielt 0,5~1 μg pCMV/IVS-luc+ innerhalb
von 20 Minuten der Komplexbildung. Die Zellen wurden nach 24 Stunden
Inkubation mit Komplexen bei 37°C
geerntet. Die Luciferase-Aktivität
in den Zellen wurde wie oben beschrieben bestimmt.
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B. Ergebnisse
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1. Optimieren des "Helfer"-Lipids
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Die
Verwendung von kationischen Liposomen für in-vitro-Gentransfer gelangte
zu weiter Verbreitung, seit Feigner et al. ihre Untersuchung veröffentlichten
(Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–17 (1987)).
Es wurde später
belegt (Feigner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550–2561 (1994)), dass DOPE bei
Weitem das effizienteste "Helfer"-Lipid für in-vitro-Gentransfektion ist,
und dieses Ergebnis ist durch mehrere Laboratorien bestätigt worden
(Farhood et al., in Gene Therapy for Neoplastic Diseases, S. 23–55 (Hrsg.:
Huber & Lazo,
1994); Zhou et al., Biochim. Biophys. Acta 1189: 195–203 1994)).
Auf der Grundlage von in-vitro-Untersuchungen
ist es vorgeschlagen worden, dass DOPE die cytoplasmatische Zuführung mittels
Membranfusion erleichtern kann, sobald positiv geladene Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
an die Zellmembran gebunden sind (Zhou et al., Biochim. Biophys.
Acta 1189: 195–203
(1994)). Selbst obwohl Friend et al. keinerlei morphologischen
Beweis erhielten, dass die DOTMA/DOPE-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
direkt mit der Plasmamembran fusionieren, schließen sie nicht die Möglichkeit
von Fusionsereignissen aus (Friend et al., Biochim. Biophys. Acta
1278: 41–50
(1996)). Sie schlugen vor, dass die Komplexe endozytiert werden,
und die kationischen Lipide die endosomal/lysosomalen Membranen
zerbrechen und danach ein Austreten der DNA-Komplexe in das Cytoplasma
und letztendlich in den Zellkern hinein erleichtern.
-
Im
Gegensatz zu den meisten Erwartungen ist die "Helfer"-Rolle von DOPE, welche aus in-vitro-Untersuchungen
belegt wurde, für
eine in-vivo-Genzuführung
im Anschluss an eine i.v.-Injektion
der Komplexe nicht offensichtlich. Als DOPE in DDAB-kationische
Liposomen eingeschlossen wurde, wurde die in-vivo-Gentransfektion
inhibiert. Diese DOPE-abhängige
Inhibition ist in der 1 gezeigt. Es
wurde festgestellt, dass Cholesterol, nicht DOPE, als "Helfer"-Lipid für in-vivo-Genzuführung effektiv
ist. Es bestand eine zehnfache Verringerung der Luciferase-Expression in Mauslungen,
als die Hälfte
des Cholesterols mit DOPE ersetzt wurde. Die in-vivo-Ergebnisse von DDAB-
und anderen kationischen Liposomen sind nicht konsistent mit der
allgemeinen Annahme, dass DOPE ein geeignetes "Helfer"-Lipid ist. Im Widerspruch hierzu schwächt DOPE
in kationisches-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen die in-vivo-Transfektion
zu einem so großen
Ausmaß ab,
dass DOPE als ein inhibitorisches Mittel in Formulierungen für in-vivo-Genzuführung betrachtet
wird. Cholesterol ist für
in-vivo-Untersuchungen in kürzlich
veröffentlichten
Berichten gewählt
worden (Liu et al., J. Biol. Chem. 270: 24864–70 (1995); Solodin et al.,
Biochemistry 34: 13537–44
(1995)), in welchen die Autoren nicht darauf eingehen, wie und warum
sie verschiedene "Helfer"-Lipide für ihre Experimententwürfe wählten, d.
h. DOPE für in
vitro erfolgende und Cholesterol für in vivo erfolgende Untersuchungen.
Die Stabilisierung von anionischen und neutralen Liposomen im Blut
durch Cholesterol ist über
lange Zeit hinweg bekannt gewesen (Mayhew et al., Cancer Treat.
Rep. 63: 1923–1928
(1979)). Es ist deshalb offensichtlich, dass man für systemische
Genzuführung
die Stabilität
von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen
in Blut berücksichtigen
muss, von welchem verschiedene Komponenten bekanntermaßen mit
makromolekularen Komplexen reagieren. In der Tat hat die vorläufige Untersuchung
verschiedener Formulierungen von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen unter
Anwendung von Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie gezeigt, dass in
Gegenwart von Serum die Cholesterol enthaltenden Komplexe strukturell
stabiler sind als die DOPE enthaltenden Komplexe.
-
Unter
Verwendung von DDAB/Chol-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen (8 nmol DDAB/μg DNA) für in-vivo-Transfektionsexperimente
erforderte eine nachweisbare Luciferase-Expression in der Lunge
von 25 g Maus eine DNA-Dosis im Bereich von 30 μg bis 60 μg. Routinemäßig ergaben 40 Ç an 60 μg Plasmid-DNA
pro Maus eine konsistente Genexpression. Die Menge an DDAB, welche üblicherweise
mit 80 μg
DNA (oder mehr) pro Maus assoziiert war, wurde als zu toxisch für das Tier
befunden. Die Expression von Luciferase in verschiedenen Geweben
ist in der 2 gezeigt. Wie zuvor beobachtet
(Zhu et al., Science 261: 209–211
(1993); Liu et al., J. Biol. Chem. 270: 24864–70 (1995); Solodin et al.,
Biochemistry 34: 13537–44
(1995)), wurde eine maximale Expression im Lungengewebe gefunden.
Für 60 μg injiziertes
Plasmid wurden routinemäßig 1–2 ng Luciferase
pro mg Gewebeprotein erhalten. Die 3 zeigt
die Dauer der Reportergen-Expression in Lungengewebe. Die Expression
von Luciferase sank rasch und erreichte in 2 Wochen nicht-nachweisbare
Spiegel. Zhu et al. berichteten, dass im Anschluss an eine i.v.-Injektion von DOTMA/DOPE(1:1)-Plasmidkomplexen
in erwachsene Mäuse
die Expression des Reportergens (CAT) unter verschiedenen Geweben
weitverbreitet ist, und die Maximum-Expression aus Komplexen mit einem Verhältnis von
1 I μg Plasmid
zu 8 nmol Gesamtlipiden erfolgt (Zhu et al., Science 261: 209–211 (1993)).
Allerdings neigten, bei diesem Verhältnis (entsprechend 1 μg Plasmid
zu 4 nmol kationischem Lipid), die DDAB/Chol-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe dazu, zu
aggregieren, und riefen keine messbare Genexpression in dieser Untersuchung
hervor.
-
Da
unter verschiedenen Laboratorien unterschiedliche Reportergene verwendet
wurden, ist es schwierig, die Variationen in der Effizienz der in-vivo-Genzuführung Änderungen
in der Formulierung von Liposomen zuzuschreiben. Für einen
direkten Vergleich der Ergebnisse in der Literatur wurden die relativen
Lichteinheiten von Luciferase-Aktivität, welche aus einem Luminometer
gemessen wurden, in einen Standard von gereinigter Luciferase umgewandelt.
Bei derartigem Vorgehen war die Spitzen-Transfektionsaktivität von DDAB/Chol-Formulierungen
um 3 Größenordnungen
höher als
die Werte, welche kürzlich
in vergleichbaren Experimenten berichtet wurden (Thierry et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9742–9746 (1995)). Unter Vorgabe
desselben Reportergens zusammen mit demselben Promotor in den experimentellen
Auslegungen, kann der Unterschied in der Expression die Selektion
der Liposomen-Formulierung widerspiegeln. Tatsächlich war DDAB/Chol eines
der effizientesten Genzuführungsvehikel
unter vielen Formulierungen aus 18 verschiedenen kationischen Lipiden,
welche kürzlich
gescreent wurden. Vorläufige
Ergebnisse der Expression in Mauslunge im Anschluss an i.v.-Injektion
zeigten, das DOTMA/Chol, DOTAP/Chol, MMCE/Chol und ESPM/Chol ergaben 10–100% der
Transfektionsaktivität
von DDAB/Chol, [und] DOGS/Chol, POEPC/Chol, LYSPE/DOPE und DC-Chol/DOPE ergaben
1–10%
von DDAB/Chol. DOEPC/Chol, DMEPC/Chol, DODAP/Chol und DDAB/DOPE
ergaben keinerlei messbare Aktivität.
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Parallel
zu den Transfektionsuntersuchungen wurde die Morphologie dieser
Komplexe in Serum und in Zellmedium durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie
untersucht. Bei Untersuchungen in 50% Mausserum (10 Minuten Inkubationszeit),
sind nicht-stabilisierte, einen Tag alte CLDC so klein, wie sie
im Puffer bei geringer Innenstärke
(100–250
nm) sind, aber sie zeigen sehr wenige Protrusionen. Sechs Tage alte,
nicht-stabilisierte CLDC, die in 50% Mausserum inkubiert wurden,
erschienen als dicht gepackte Aggregate von sphärischen Partikeln mit einer
hohen Anzahl von befestigten Partikeln. Solche Formulierungen haben
alle ihre in-vivo-Transfektionsaktivität innerhalb von 4 Tagen verloren.
Restliche fibrilläre
Protrusionen werden nicht beobachtet.
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PEG-PE-stabilisierte
CLDC, welche in 50% Mausserum inkubiert wurden, waren sogar nach
sechs Tagen klein (100–200
nm). In ähnlicher
Weise waren mit kondensierter DNA zubereitete CLDC ebenfalls ziemlich klein,
sogar nach sechs Tagen Aufbewahrung. Genauer gesagt, waren die CLDC
wie "Stecknadeln" geformt, welche
in Gegenwart von Serum strukturell stabil waren.
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Nach
Inkubation in Zellmedium (RPMI-1640 mit 10% FCS) waren nicht-stabilisierte,
sechs Tage alte CLDC morphologisch ähnlich zu denjenigen, welche
wie oben beschrieben, in Mausserum inkubiert wurden. Diese Komplexe
waren jedoch loser gepackt und zeigte keine fibrillären Protrusionen.
Eine ähnliche
Morphologie wurde mit PEG-PE-stabilisierten CLDC und Kondensierte-DNA-CLDC,
welche in Zellmedium inkubiert wurden, beobachtet.
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2. Erhöhung der Haltbarkeitsdauer
für Transfektionsaktivität
-
Die
Beziehung zwischen struktureller Stabilität und Transfektionsaktivität von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen ist
bislang in veröffentlichten
Berichten nicht ausführlich
geschildert worden. Es sind Screening-Vorgehen eingerichtet worden,
um große
Aggregate von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
durch Ändern
des Verhältnisses
von DNA zu Lipid von einer negativen Netto-Ladung zu einer positiven
Ladung zu vermeiden. Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe von jedem besonderen
kationischen Lipid bei verschiedenen Verhältnissen von DNA/Lipid wurden
hergestellt, und die resultierenden stabilen und metastabilen Formulierungen wurden
für in-vivo-Transfektion
verwendet. Komplexe, welche 8 bis 12 nmol kationisches Lipid pro μg DNA enthielten,
wiesen festgestelltermaßen
die höchste
in-vivo-Transfektionsaktivität
auf. Allerdings sank die Transfektionsaktivität dieser Komplexe mit der Zeit.
Ohne Modifizieren der Vorgehensweisen zur Herstellung der Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
gab es eine sichtbare Aggregation innerhalb weniger Tage, und die
Transfektionsaktivität
sank um mehr als das Tausendfache beinahe auf Hintergrundspiegel
nach einem Monat Aufbewahrung bei 4°C (4). Deshalb
wurde eine Formulierung von stabilisierten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen
ausgeführt,
welche eine hohe in-vivo-Transfektionsaktivität während der
Aufbewahrung beibehalten konnte.
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i. Erhöhen
der Transfektionsstabilität:
PEG-PE
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Das
Inserieren von PEG-PE (1% des Gesamtlipids) in die frisch gebildeten
Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
konnte nicht nur die Komplexe am Aggregieren während der Aufbewahrung hindern,
sondern die PEG-PE-enthaltenden Komplexe zeigten auch eine ziemlich
hohe Transfektionsaktivität
in vivo, und zwar eine lediglich geringfügig niedrigere Aktivität im Vergleich
zu den Komplexen ohne PEG-PE (4). Der
Einbau von PEG-PE in die Komplexe ist im Hinblick auf die mit der
Dosis zusammenhängende
Inhibition der Transfektionsaktivität bei steigendem Prozentgehalt
an PEG-PE offensichtlich (Ergebnisse nicht gezeigt). Unerwarteterweise
stellte die Aufbewahrung der PEG-PE enthaltenden Komplexe bei 4°C langsam
die ursprüngliche
Aktivität
wieder her, wie es in der 4 gezeigt
ist. Die mechanistischen Aspekte des Inhibitionseffekts auf die Transfektion
durch PEG-PE sowie die Wiederherstellung der Aktivität im Anschluss
an eine Aufbewahrung bei niedriger Temperatur sind zum derzeitigen
Zeitpunkt nicht bekannt.
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ii. Erhöhen der Transfektionsstabilität: Polyamine
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Zusätzlich zu
der Rolle von PEG-PE bei der Erhöhung
der Haltbarkeitsdauer von Lipid:Nukleinsäurekomplexen ergab auch das
Kondensieren von Nukleinsäure
mit Polyaminen eine ähnliche
unerwartete Erhöhung
der Haltbarkeitsdauer der Komplexe. Die mit kondensierter DNA gebildeten
Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe waren bei einem niedrigeren Verhältnis von
Lipid zu DNA, ohne Aggregation, stabil. Die 4 zeigt
die Spiegel der in-vivo-Transfektionsaktivität einer solchen Präparation
und ihr Schicksal während
der Aufbewahrung. Erneut wurde eine unerwartete Erhöhung der
Transfektionsaktivität
in gealterten, Polyamin-behandelten Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen
im Vergleich zu derjenigen der Proben gefunden, welche nicht mit
Polyaminen vorbehandelt und unmittelbar verwendet wurden, nachdem
die Komplexe gebildet worden waren. Ein anderes Vorgehen zum Erhalten
stabiler kationisches-Lipid/DNA-Komplexe
durch Komplexieren von Plasmid mit Lipid in Lipid-Detergens-Mizellen
wurde kürzlich
veröffentlicht
(Hofland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7305–7309 (1996)).
Allerdings wurde nur 30% der Transfektionseffizienz von solchen
Komplexen in 15% Serum in vitro beibehalten, und in vivo wurden
keine Ergebnisse berichtet.
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iii. Erhöhung der Transfektionsstabilität: Lyophilisieren
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Schließlich sind
Bedingungen für
die Stabilisierung von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen durch Lyophilisieren
ermittelt worden. Aus DDAB/Chol, suspendiert durch Schallbehandlung
in 5% (w/v) Dextran in Wasser, zusammengesetzte Liposomen konnten,
bei Vermischen mit DNA in einem Verhältnis von 1:10 (μg DNA pro nmol
DDAB), wie in "Methoden" beschrieben, ohne
Verlust von Aktivität
lyophilisiert werden. Die Endkonzentration an Dextran, in welchem
Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe gebildet wurden, betrug 8% (w/v). Die
lyophilisierten Präparationen
wurden durch Zugeben von destilliertem Wasser rekonstituiert, und
ihre Transfektionsaktivität
in den Lungen von Mäusen
nach i.v.-Injektion wurde durch Luciferase-Reportergen-Expression gemessen.
Einfrieren und Auftauen der rekonstituierten Präparation beeinflusste die Aktivität (üblicherweise
1 bis 2 ng Luciferase-Protein pro mg Gewebeprotein) nicht.
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Mehrere
der hierin beschriebenen kationisches-Lipid:Plasmid-DNA-Komplexe
sind stabil und können eine
konsistente in-vivo-Transfektionsaktivität (im Bereich von 0,5 bis 2
ng Luciferase pro mg Gewebeprotein) selbst nach langer Aufbewahrung
bei 4°C
oder Lyophilisierung ergeben. Formulierungen, die Cholesterol als das "Helfer"-Lipid enthalten,
erzeugen eine wesentlich höhere
in-vivo-Transfektionseffizienz. Die Stabilisierung der Komplexstruktur
durch PEG-PE hält
die Komplexaktivität
bei der Aufbewahrung aufrecht und kann die Kreislaufzeit im Blut
für das
Targeting zu spezifischen Geweben verlängern. Das Kondensieren der
DNA mit Polyaminen vor der Lipid-Komplexierung verbessert die in-vitro-Aufbewahrung
und Spiegel der Aktivität
in vivo. Die methodische Vorgehensweise zur Herstellung stabiler
Formulierungen von Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen, welche eine hohe
Transfektionsaktivität
in vivo aufzeigen, vermittelt Vorteile für die Einrichtung von pharmazeutisch
annehmbaren Präparaten
und erleichtert daher die Liposomen-basierende Gentherapie.
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Beispiel 2: In-vitro-Transfektion von
Lipid:Plasmid-DNA-Komplexen mit Targeting-Liganden
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A. Herstellung von Fab'-Fragmenten
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Klonierte
rhuMAbHER2-Sequenzen für
Schwer- und Leichtkette wurden in E. coli coexprimiert, wie früher beschrieben
(Carter et al., Biotechnology 10: 163–167 (1992)). Das Antikörperfragment, rhuMAbHER2-Fab' wurde aus E. coli-Fermentierungspasten
durch Affinitätschromatographie
mit Streptokokken-Protein G (Carter et al., Biotechnology 10: 163–167 (1992))
gewonnen, wodurch man typischerweise Fab' erhält,
wobei 60–90%
reduziertes freies Thiol (Fab'-SH) enthalten.
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B. Herstellung von Liposomen
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Kondensierte
DNA wurde mit drei verschiedenen Lipidzusammensetzungen komplexiert,
wobei die oben im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, mit den folgenden
Modifikationen, angewandt wurden. Der erste Komplex wurde mit DDAB/DOPE
(1/1) hergestellt, was kationische Liposomen herstellte, die nur
mit DNA komplexiert waren, wie oben beschrieben. Der zweite Komplex
wurde mit DDAB/DOPE (1/1) mit 1% PEG-PE, derivatisiert mit Maleimid
an der äußersten
Position von PEG, hergestellt, wodurch CLDC mit Hinzufügung der sterischen
Stabilisationskomponente nach Komplexierung mit der DNA produziert
wurde. Der dritte Komplex wurde mit DDAB/DOPE (1/1) mit 1% PEG-PE
hergestellt, welches mit dem Fab'-Fragment
eines humanisierten Anti-Her-2-Antikörpers derivatisiert war, der
an der äußersten
Position von PEG über
die freie Thiolgruppe an den Maleimidrest befestigt war. Dies erzeugte
CLDC, bei welchen der Targeting-Ligand,
welcher an der sterischen Stabilisationskomponente befestigt ist,
nach der Komplexierung mit der DNA zugefügt wird.
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C. Transfektion und Ergebnisse
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Zellen
wurden wie oben im Beispiel 1 beschrieben transfiziert, jedoch ohne
Aufbewahrung des Lipid:Plasmid-DNA-Komplexes. In diesem Beispiel
wurden zwei Zelllinien verwendet. Die erste Zelllinie war MCF-7;
Zellen dieser Zelllinie überexprimieren
den HER-2-Rezeptor nicht. Diese Zellen wurden in DME H-21 mit 10%
bovinem Kälberserum
und in 5% CO2 kultiviert. Bei der zweiten
Zelllinie handelte es sich um SK-BR3-Zellen, deren Zellen den HER-2-Rezeptor übe rexprimieren,
kultiviert in McCoy's
5A-Medium mit bovinem Kälberserum
in 5% CO2. In beiden Fällen wurden die Zellen (~5 × 104 Zellen pro Vertiefung) transfiziert und
inkubiert mit 12 μg
Plasmid-DNA, komplexiert mit Lipid, wie oben beschrieben (PCMV/IVS-luc+,
Luciferase-Reportergen,
oben beschrieben), während
4 Stunden bei 37°C.
Der Überstand
wurde dann abgesaugt, frisches Medium wurde zugegeben, und die Zellen
wurden 24 Stunden lang bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Waschen mit PBS (Ca/Mg-frei)
geerntet und dann für
den Luciferase-Assay, wie oben beschrieben, in Lysepuffer suspendiert.
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Die 5A zeigt,
dass die Transfektion von Nicht-Zielzellen, welche den HER-2-Rezeptor
nicht überexprimieren,
durch die Addition von PEG-PE inhibiert wurde, sogar in Gegenwart
des Targeting-Liganden, welcher an die Spitze von PEG über den
terminalen Maleimidrest konjugiert war. Die 5B zeigt,
dass die Transfektion von Zielzellen, welche den HER-2-Rezeptor überexprimieren,
ebenfalls durch die Addition von PEG-PE inhibiert wurde, aber dass
die Transfektionsaktivität
wiederhergestellt und gesteigert wurde, als das PEG-PE an einen
Targeting-Ligand
konjugiert wurde, welcher den HER-2-Rezeptor erkennt.
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Der
Vergleich der 5A und 5B zeigt,
dass die targetierten Immuno-CLDC viel effizienter bei der Transfektion
von Zielzellen als von Nicht-Zielzellen aktiv waren. Dieses Ergebnis
tritt wegen der Addition des Liganden-tragenden stabilisierenden
Mittels (PEG-PE), konjugiert an Anti-HER-2-Fab', auf, welches die Transfektion von
Nicht-Zielzellen inhibiert (5A), aber
die Transfektion der Zielzellen steigert (5B).
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Beispiel 3: Herstellung des Linkers Maleimido-Propionylamido-PEG2000-Distearoylphosphatidylethanolamin (Mal-PEG-DSPE).
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100
mg (44 mol) 4-Maleimidopropionylamido-Poly(ethylenglykol)-α-succinimidylcarbonat (Mal-PEG-NHS;
Shearwater Polymers, Inc.), hergestellt aus Poly(ethylenglykol)
(Molekulargewicht 2000), 33 mg (44 μmol) Distearoylphosphatidylethanolamin
(DSPE; Avanti Polar Lipids) und 12 ml (86 μmol) Triethylamin in 1 ml Chloroform
wurden 6 Stunden lang bei 45°C
inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt zeigte die Dünnschicht-Chromatographie auf
Siliziumdioxid (Lösungsmittel:
Chloroform/Methanol bei 7:3) die vollständige Umwandlung von DSPE in
das schneller wandernde, Ninhydrin-negative Produkt, welches als
Mal-PEG-DSPE identifiziert wurde. Dieses Produkt wurde durch Säulenchromatographie
auf Siliziumdioxid unter Anwendung eines stufenweisen Gradienten
von Methanol in Chloroform (5%, 10%, 15% Methanol, bezogen auf Volumen) gereinigt.
Reines Mal-PEG-DSPE wurde bei 15% Methanol eluiert. Ausbeute: 85
mg (67% der Theorie). Rf 0,27–0,29 (Silica
60, CHCl3-MeOH-H2O
65:25:4). Verhältnis
von Maleimido-Gruppen zu Phosphat: 0,95–1,02.
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Alternativ
dazu kann dieser Linker hergestellt werden, wie beschrieben in
US 5 527 528 oder in Kirpotin
et al. (Biochemistry, 36: 66–75
(1997)).
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Beispiel 4: Konjugation von Mal-PEG-DSPE
mit Fab'-Fragment
eines Antikörpers,
der gegen das HER2-Onkoprotein reaktiv ist.
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300
nmol Mal-PEG-DSPE in 0,5 ml Chloroform wurden in ein Glas-Reagenzröhrchen eingebracht,
und das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt. Der trockene Rückstand wurde in 1 ml MES-20-Puffer
(20 mM Morpholinoethansulfonsäure,
144 mM Natriumchlorid, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, und
NaOH auf pH 6,0) gelöst.
2,5 ml Lösung,
enthaltend 0,57 mg/ml Fab'-Fragmente
eines rekombinanten humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen
die extrazelluläre
Domäne
von HER2-Onkoprotein (rhuMAbHER2, Genentech, Inc.), wurden zu der
Mal-PEG-DSPE-Lösung
zugegeben, und der pH-Wert wurde sorgfältig mit verdünntem NaOH
auf 7,2–7,4
eingestellt. Die Mischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur 2,5
Stunden lang inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von
0,2 M Cysteinhydrochlorid zu einer Endkonzentration von 5 mM gestoppt.
15 Minuten nach der Zugabe des Cysteins wurde die Reaktionsmischung
gegen HEPES-gepufferte Kochsalzlösung
(20 mM Hydroxyethylpiperazino-Ethansulfonsäure, 144
mM NaCl, NaOH bis pH 7,2) dialysiert, mittels Ultrafiltration durch
eine YM-10-Membran (Amicon) unter Druck konzentriert, und durch
Filtration durch einen 0,2 μm-Celluloseacetatfilter
sterilisiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese
in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE), mit Coomassie-Blau-Färbung, analysiert. Das Gesamtprotein
wurde durch den Farbstoffbindungs-Assay (Bio-Rad) bestimmt. Der
Assay zeigte eine 62%ige Umwandlung des Ursprungproteins (M. G.
46000) in ein langsamer wanderndes Produkt (M. G. 49000), was mit
dem erwarteten Konjugat übereinstimmt.
Die Gesamtproteinausbeute in den Produkten betrug 98%.
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Beispiel 5: Konjugation von Mal-PEG-DSPE
mit Single-Chain-Fv-Antikörper,
der gegen HER2-Onkoprotein reaktiv ist.
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150
nmol Mal-PEG-DSPE wurden in 0,5 ml MES-20 gelöst und mit 0,5 ml Lösung umgesetzt,
enthaltend 0,7 mg/ml Single-Chain-Fv-Antikörper C6.5Cys, welcher gegen
die extrazelluläre
Domäne
von HER2-Onkoprotein reaktiv ist. Der Antikörper wurde hergestellt, wie
beschrieben von Schier et al. (Immunotechnology 1: 73–81 (1995)).
Die Reaktion und Produkt-Assays wurden durchgeführt, wie im oben stehenden
Beispiel beschrieben. Die Gesamtproteinausbeute betrug 86%. Ungefähr 52% des
gewonnenen Proteins (M. G. 27000) lag in der Form eines Produkts
mit höherem
Molekulargewicht (M. G. 29000–30000)
vor, was in Übereinstimmung
mit dem erwarteten Konjugat steht.
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Beispiel 6: Herstellung von Immunoliposomen
mit konjugierten Anti-HER2-Fab'-Fragmenten und beladen
mit einem fluoreszierenden pH-empfindlichen Indikator
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Kleine
(100 nm) unilamellare Liposomen, welche den eingeschlossenen pH-empfindlichen
Fluoreszenzindikator 8-Hydroxypyrentrisulfonsäure enthielten, wurden aus
einer Mischung von 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin
(Avanti), Cholesterol (Calbiochem) und Methoxypolyoxyethylenglykol(M.
G. 1900)-derivatisiertem Distearoylphosphatidylethanolamin (Sygena)
im Molverhältnis
von 30:20:3, wie beschrieben von Kirpotin et al. (Biochemistry,
36:66–75
(1997)), hergestellt und durch Filtration durch einen 0,2 μm-Celluloseacetatfilter
sterilisiert. 0,26 ml Liposomenpräparation, welche 2 μmol Phospholipide
enthielt, wurde mit 0,106 ml einer Lösung gemischt, enthaltend 100 μg des gemäß dem oben
stehenden Beispiel 4 hergestellten Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugats, und über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Liposomen von
nicht-gebundenem Material durch Gelfiltration auf einer Säule mit
Sepharose 4B (Pharmacia) getrennt, wobei HEPES-gepufferte Kochsalzlösung als
Elutionsmittel verwendet wurde. Die Liposomen wurden im Hohlraumvolumen
der Säule
eluiert. Die Menge an Liposomen-gebundenem Protein wurde durch den
Bio-Rad-Farbstoffbindungs-Assay
bestimmt, und die Liposomenkonzentration wurde durch Gesamt-Phosphor
unter Anwendung des Molybdat-Verfahrens gemessen (Morrison, Anal.
Biochem., 7: 218–224 (1964)).
Eine SDS-PAGE der Liposomen (siehe nachstehendes Beispiel 13) zeigte
das Vorhandensein von Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat, aber kein freies
Anti-HER2-Fab' in
der Liposomenpräparation.
Liposomen-assoziiertes Protein wurde durch SDS-PAGE (siehe Beispiel
13) quantifiziert, und die Bindung des zugesetzten Fab'-PEG-DSPE-Konjugats
mit den Liposomen wurde als Prozentsatz des Ausgangs-Protein/Phospholipid-Verhältnisses
gegenüber
dem Eingangs-Protein/Phospholipid-Verhältnis ausgedrückt. Die
Bindung von Fab'-PEG-DSPE-Konjugat
an die Liposomen betrug 80%. Das Austreten von HPTS aus den Liposomen während der
Inkubation mit dem Protein-PEG-DSPE-Konjugat an die Liposomen betrug
weniger als 2%.
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Beispiel 7: Herstellung von Immunoliposomen
mit konjugierten Anti-HER2-scFv-Antikörpern, und beladen mit einem
fluoreszenten, pH-empfindlichen Indikator
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Unter
Anwendung des Vorgehens von Beispiel 6 wurde das Konjugat von Anti-HER2-Single-Chain-Fv C6.5Cys
mit Mal-PEG-DSPE, welches gemäß Beispiel
5 erhalten wurde, mit HPTS-beladenen
Liposomen beim Eingangsverhältnis
von 15,6 μg
Protein pro 1 μmol
Liposomen-Phospholipid
inkubiert. Nach Trennen von ungebundenem Material durch Gelfiltration
auf Sepharose 4B, wurden die Liposomen wie im Beispiel 6 beschrieben
geassayt. Das Ausgangs-Protein/Phospholipid-Verhältnis betrug
14,4 μg/μmol, was
eine 92,3%ige Bindung des Konjugats an die Liposomen anzeigte.
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Beispiel 8: Aufnahme der Liposomen durch
HER2-überexprimierende
Zellen.
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HER2-überexprimierende
humane Brustkrebszellen (SK-BR-3) wurden in McCoy 5A-Medium, welches
mit 10% fötalem
Kälberserum,
50 U/ml Penicillin und 50 U/ml Streptomycin ergänzt war, bei 37°C und 5% CO
2 wachsen gelassen. 24 Stunden vor dem Assay
wurden die Zellen durch Behandlung mit 5 mM EDTA in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
geerntet und in 24-Vertiefungs-Zellkulturplatten
bei einer Dichte von 200000 Zellen/Vertiefung in 1 ml Zellkulturmedium
ausplattiert. Liposomen wurden dem Zellkulturmedium in den Vertiefungen
(in dreifacher Ausfertigung) zugesetzt, um eine Endkonzentration
von 25 μM
Liposomen-Phospholipiden zu erzielen. Die Platten wurden dann 4
Stunden unter vorsichtigem Bewegen bei 37°C und 5% CO
2 inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Medien aus den Vertiefungen abgesaugt,
die Zellschichten wurden viermal mit 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gespült, in 1
ml 5 mM EDTA in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung abgeerntet, und die Mengen
an zellgebundenen und endozytierten Liposomen wurden mittels Fluorometrie
bestimmt, wie es in Kirpotin et al., Biochemistry, 36: 66–75 (1997),
beschrieben ist. Zum Vergleich wurden Inkubationen auch mit den
Liposomen durchgeführt,
die an Anti-HER2-Fab' und -scFv über Mal-PEG-DSPE-Linker konjugiert
waren, welche im Voraus in die Liposomenzusammensetzung eingeschlossen
worden waren (Kirpotin et al., ebenda). Die Ergebnisse sind in der
folgenden Tabelle zusammengefasst:
Liposomen | Proteine
pro Liposom | Insgesamte
Zellassoziierte Liposomen, nmol Phospholipid/106 Zellen | Endozytierte
Liposomen, % v. Gesamt |
Kein
Antikörper | 0 | 0,0059 ± 0,00036 | 0 |
Anti-HER2-Fab', Konjugation an
im Voraus eingebauten Linker | 34 | 0,744 ± 0,086 | 86 ± 7,8 |
Anti-HER2-scFv,
Konjugation an im Voraus eingebauten Linker | 37 | 0,311 ± 0,025 | 59,3 ± 4,3 |
Anti-HER2-Fab', gemäß Beispiel
4 | 43 | 1,304 ± 0,054 | 95,9 ± 3,2 |
Anti-HER2-scFv,
gemäß Beispiel
5 | 39 | 0,576 ± 0,035 | 60,4 ± 0,9 |
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Wie
von diesen Daten bewiesen, war die Zielzellbindung und die Internalisierung
der Liposomen, welche gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurden, wenigstens gleich und häufig höher als
diejenige der ähnlichen
Liposomen, welche gemäß dem besten
Verfahren des Stands der Technik hergestellt worden waren.
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Beispiel 9: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem
Doxorubicin durch Modifikation von im Voraus bereitetem liposomalem
Doxorubicin mit Anti-HER2-Fab'-PEG
DSPE-Konjugat bei 55°C.
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0,38
ml kommerziell erhältliches
liposomales Doxorubicin (Doxil®, Sequus Pharmaceuticals,
Inc.), enthaltend 2 mg/ml Doxorubicin, wurden mit 0,26 ml der Präparation
von Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat gemischt,
welches gemäß Beispiel
6 erhalten worden war, bei 55°C
während
20 Minuten inkubiert und rasch in Eiswasser abgekühlt. Nicht-gebundenes
Material und niedermolekulare Komponenten wurden durch Gelfiltration
der Inkubationsprodukte durch eine Säule mit Sepharose 4B (Pharmacia)
entfernt. Die Liposomen wurden im Hohlraumvolumen der Säule gesammelt
und hinsichtlich Protein unter Anwendung von SDS-PAGE, hinsichtlich
Phospholipid unter Anwendung des Molybdatverfahrens und hinsichtlich
Doxorubicin durch Spektrophotometrie nach Solubilisierung in angesäuertem Isopropanol
(E1% 480 = 208) geassayt.
Ermittelt: ungefähr 45
Fab'/Liposom (77%
Bindung des zugegebenen Konjugats). Der Austritt von Doxorubicin
aus Liposomen wurde nicht beobachtet (Doxorubicin-Gehalt vor der
Inkubation: 145,9 μg/μmol Phospholipid;
nach Inkubation: 155,8 ^Zg bzw. μg/mol
Phospholipid).
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Beispiel 10: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem
Doxorubicin durch Modifikation von im Voraus bereitetem liposomalem
Doxorubicin mit Anti-HER2-scFv-PEG DSPE-Konjugat bei 55°C
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Die
Modifikation wurde wie im Beispiel 9 beschrieben unter Verwendung
von 0,4 ml C6.5Cys-PEG-DSPE-Konjugat-Präparat (Beispiel
5) und 0,31 ml Doxil® durchgeführt. Ermittelt:
48 Proteine/Liposom (quantitative Bindung des Konjugats an Liposomen);
Arzneistoffaustritt 3,7% (Doxorubicin-Gehalt vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid;
nach Modifikation: 140,5 μg/μmol Phospholipid).
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Beispiel 11: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem
Doxorubicin durch Modifikation von Doxil® mit Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Konjugat
bei 37°C
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Die
Modifikation wurde wie im obigen Beispiel 9 beschrieben unter Anwendung
von 0,31 ml Doxil® und 0,212 ml Anti-HER2-Fab'-PEG-DSPE-Präparat (Beispiel
4) durchgeführt,
aber die Inkubation erfolgte bei 37°C über Nacht. Ermittelt: 46 Fab'/Liposom (82% Bindung
des hinzugefügten
Konjugats an Liposomen); Ein Arzneistoffaustritt wurde nicht beobachtet
(Doxorubicin vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Modifikation:
146,0 μg/μmol Phospholipid).
Die Übergangstemperatur
des Lipidbestandteils von Doxil® (hydriertes Soja-Phosphatidylcholin)
liegt nahe bei 55°C.
Somit ist die Modifikation gleichermaßen wirksam, wenn die Liposomenlipide
im Gelzustand sind.
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Beispiel 12: Herstellung von Anti-HER2-immunoliposomalem
Doxorubicin durch Modifikation von Doxil® mit Anti-HER2-scFv-PEG-DSPE-Konjugat
bei 37°C
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Die
Modifikation wurde wie im obigen Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung
von 0,31 ml Doxil® und 0,4 ml C6.5Cys-PEG-DSPE-Konjugat-Präparat (Beispiel
5) durchgeführt.
Ermittelt: 49 Proteine/Liposom (quantitative Bindung des Konjugats
an Liposomen). Ein Arzneistoffaustritt wurde nicht nachgewiesen
(Doxorubicin vor Modifikation: 145,9 μg/μmol Phospholipid; nach Modifikation:
150,3,0 μg/μmol Phospholipid).
Somit war die Modifikation der Liposomen mit scFv-PEG-DSPE-Konjugat
gleichermaßen
wirksam, wenn die Liposomenlipide im Gelzustand waren.
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Beispiel 13: Quantifizierung von Antikörperkonjugat
in den Liposomen und Konjugationsprodukten, welche gemäß den Beispielen
6–12 hergestellt
wurden.
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Die
Menge an Protein-PEG-Konjugat im Konjugationsprodukt und in den
Liposomen wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart
von Natriumdodecylsulfat (SDS-Page) unter nicht-reduzierenden Bedingungen
gemäß Laemmli
(1974) geassayt. Typischerweise wurden 5–20 μl große Aliquots von analytischer
Probe mit 6×-Probenpuffer
gemischt, der SDS und Spur-Farbstoff
(Bromphenolblau) enthielt, 1 Minute lang bei 60°C inkubiert und auf ein Polyacrylamidgel
(Abmessungen 10 × 10 × 0,075
cm) mit einer Konzentration von 10–12% und einem Vernetzungsmittel-Gehalt
von 2,6% aufgetragen. Die Trennung wurde in einer vertikalen Flachgelelektrophorese-Vorrichtung
bei einem konstanten Strom von 30 mA durchgeführt. Die Proteinbanden wurden
durch Coomassie-Blau-Färbung
unter Anwendung von herkömmlichen
Verfahren entwickelt. Das Konjugat bildete eine getrennte Bande
mit geringerer elektrophoretischer Mobilität als das Ursprungsprotein.
Für die
Quantifizierung von Protein wurden die Banden herausgeschnitten,
und der Farbstoff wurde in 50% wässrigem
Dimethylformamid bei 100°C
während
30 Minuten extrahiert. Die Menge an extrahiertem Farbstoff wurde
durch Spektrophotometrie bei 595 nm quantifiziert, und die Proteinmenge
pro Bande wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve ermittelt, die
aus den ähnlich
verarbeiteten Banden von einhergehend aufgetragenen Standardmengen
an entsprechendem Protein 9 (Fab' oder
scFV) erstellt wurde.
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Beispiel 14: Zuführung von Doxorubicin an HER2-überexprimierende
Krebszellen durch gemäß den Beispielen 9–12 hergestellte
Anti-HER2-Immunoliposomen.
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HER2-überexprimierende
humane Brustkrebszellen (SK-BR-3) wurden kultiviert und ausplattiert,
wie oben im Beispiel 8 beschrieben. Präparationen von Anti-HER2-immunoliposomalem
Doxorubicin (obige Beispiele 9–12)
wurden dem Zellkulturmedium in den Vertiefungen (in dreifacher Ausfertigung)
zugesetzt, um eine Endkonzentration von 200 μM Liposom-Phospholipiden (0,030 ± 0,001
mg/ml Doxorubicin) zu erzielen. Die Platten wurden dann 4 Stunden
bei vorsichtigem Bewegen bei 37°C
und 5% CO
2 inkubiert. Nach der Inkubation
wurde die Flüssigkeit
aus den Vertiefungen abgesaugt, die Zellschichten wurden 3 Mal mit
jeweils 1 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und die Zellen wurden in
0,5 ml 5 mM EDTA in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung abgeerntet,
durch Zentrifugation pelletiert und mit 0,3N HCl/50% Ethanol-Mischung
extrahiert. Die Mengen an Doxorubicin in den Ethanol-HCl-Extrakten
wurden mittels Spektrofluorometrie (Anregungswellenlänge 470
nm; Emissionswellenlänge
590 nm) bestimmt und an die Menge der ausplattierten Zellen normiert.
Zum Vergleich wurden Inkubationen auch mit den Liposomen durchgeführt, welche über im Voraus
in die Liposom-Lipidmatrix eingebundene Mal-PEG-DSPE-Linker an Anti-HER2-scFv
(C6.5Cys) konjugiert waren (Kirpotin et al., 1997). Um die Spezifität der Bindung
zu überprüfen, wurden
in einigen Vertiefungen die Zellen mit 5 μg des freien, zweiwertigen monoklonalen
Anti-HER2-Antikörpers
(Anti-HER2MAb) vorinkubiert. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Liposomale
Doxorubicin-Präparation: | Doxorubicin-Aufnahme,
pg/Zelle (Mittelwert ± Standardabweichung) |
Beispiel
9 | 1,652 ± 0,046 |
Beispiel
10 | 1,364 ± 0,016 |
Beispiel
11 | 1,518 ± 0,040 |
Beispiel
12 | 1,118 ± 0,005 |
Anti-HER2-scFv,
Konjugation an Liposomen-eingebundenen aktiven Linker | 0,372 ± 0,015 |
Beispiel
9 + Anti-HER2MAb | 0,372 ± 0,015 |
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellte Immunliposomen waren sogar effizienter zur
Zuführung
von Liposomen-verkapseltem Doxorubicin an Zielzellen fähig als
Immunliposomen, welche durch frühere Verfahren
hergestellt worden waren, d. h. Konjugation des Antikörperfragments
an die Liposomen, welche aktivierten Linker enthielten. Die Vorinkubation
der Zellen mit freiem Antikörper,
welcher gegen das Zielantigen (HER2-Protein) auf der Zelloberfläche reaktiv
war, verursachte eine zehnfache Verringerung der Aufnahme von immunoliposomalem
Doxorubicin, welches gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt worden war; daher war die Aufnahme zielspezifisch.
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Beispiel 15: Herstellung von Lipid-DNA-Komplex-Mikropartikeln
mit konjugierten Antikörperfragmenten
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Eine
Suspension von Lipid-DNA-Mikropartikeln (mit Größenabmessungen von 410 ± 150 nm
bei dynamischer Laserstreuung), welche aus Plasmid-DNA (pCMV/IVS-Luc+; 10 μg/ml),
Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB, 60 nmol/ml) und Dioleoylphosphatidylethanolamin
(DOPE, 60 nmol/ml) zusammengesetzt waren, in 5% wässriger
Dextrose, wurde wie von Hong et al. (FEBS Lett. 400: 233–237, 1997)
beschrieben hergestellt. Fab'-PEG-DSPE-Konjugat
wurde durch Coinkubation von Mal-PEG-DSPE und Anti-HER2-Antikörper-Fab'-Fragmenten bei einem Molverhältnis von
4:1, bei einer Konzentration des Proteins von 0,3 mg/ml in wässrigem
physiologischen Puffer, bei pH 7,2 während 2 Stunden zubereitet.
Lipid-DNA-Mikropartikel mit konjugierten Anti-HER2-Fab'-Fragmenten wurden
durch Inkubation der Lipid-DNA-Mikropartikel mit dem Konjugat in
der Menge von 0,5 Mol-% relativ zum gesamten Partikellipidgehalt
während
mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur zubereitet. Kontrollpartikel
mit Linker allein (nicht-zielgerichtete Kontrolle) wurden auf gleiche
Weise hergestellt, aber nicht-konjugiertes, β-Mercaptoethanol-abgelöschtes Mal-PEG-DSPE
wurde für das
Fab'-PEG-DSPE-Konjugat
substituiert.
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Beispiel 16: Zielgerichtete DNA-Transfektion
der Zellen durch Lipid-DNA-Mikropartikel mit konjugierten Antikörperfragmenten
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Die
Transfektionsaktivität
von pCMV/IVS-Luc
+-DNA-Lipid-Mikropartikeln,
die wie im obigen Beispiel 15 hergestellt worden waren, wurde in
den folgenden Kulturen von humanen Brustkrebszellen untersucht: SK-BR-3
(welche das Zielantigen, HER2-Onkoprotein, überexprimieren) und MCF-7 (die
Linie mit geringer Expression von HER2). Die Expression des Reportergens
(Luciferase) wurde durch Luminometrie nach 24-ständigem Aussetzen der Zellen
an Lipid-DNA-Komplexe (1 μg
bzw. ^Zg DNA pro 50–100
000 Zellen) in mit 10% Serum ergänztem
Wachstumsmedium ermittelt, und diente als das Maß der Transfektionseffizienz.
Die ausführliche
Beschreibung dieses experimentellen Vorgehens wird in Hong et al.,
FEBS Lett. 400: 233–237 (1997),
angegeben. Gemäß dieser
Erfindung zubereitete Anti-HER2-Fab'-konjugierte DNA-Lipid-Mikropartikel waren
etwa 25 Mal wirkungsvoller für
die Plasmidzuführung
an Ziel-positive SK-BR-3-Zellen als entsprechende nicht-zielgerichtete
Partikel. In den Ziel-negativen MCF-7-Zellen wiesen zielgerichtete
und nicht-zielgerichtete DNA-Lipid-Partikel die gleiche Effizienz
auf. Somit sind gemäß der Erfindung
hergestellte Antikörper-modifizierte
Lipid-DNA-Partikel zur zielspezifischen Zuführung von funktioneller DNA
in humane Krebszellen in der Lage.
Zellen: | Mikropartikel | Luciferaseexpression,
ng/mg Zellprotein (Mittelwert ± Standardabweichung) |
| | |
SK-BR-3 | DNA/Lipid
allein | 116,2 ± 35,4 |
SK-BR-3 | DNA/Lipid
+ Mal-PEG-DSPE (*Nicht-Ziel-Kontrolle) | 40,4 ± 0,1 |
SK-BR-3 | DNA-Lipid
+ Fab'-PEG-DSPE (zielgerichtet) | 995 ± 197 |
| | |
MCF-7 | DNA/Lipid
allein | 6,44 ± 0,34 |
MCF-7 | DNA/Lipid
+ Mal-PEG-DSPE (Nicht-Ziel-Kontrolle) | 0,58 ± 0,30 |
MCF-7 | DNA-Lipid
+ Fab'-PEG-DSPE (zielgerichtet) | 0,71 ± 13 |