DE69736178T2 - Immunoliposomen zur optimierung der internalisierung in zielzellen - Google Patents

Immunoliposomen zur optimierung der internalisierung in zielzellen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Liposome. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Liposome, die einen typischen Marker auf Zielzellen speziell anvisieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt eine Anzahl von pharmazeutischen Agenzien und potentiellen pharmazeutischen Agenzien, die an einer schlechten Wasserlöslichkeit, hohen Niveaus an Antigenität, Toxizität oder einem schnellem Abbau im Serum leiden, wodurch die Entwicklung von geeigneten klinischen Formulierungen behindert werden kann. Eine Lösung für diese Probleme ist es, das pharmazeutische Agens in einem Abgabevehikel einzuschließen, das in wässrigen Lösungen löslich ist und das das Agens vor dem direkten Kontakt mit Geweben und Blut abschirmt. Insbesondere sind Formulierungen auf der Grundlage der Liposomentechnologie von erheblichem Interesse. Liposome sind Vesikel, die aus konzentrisch angeordneten Phospholipid-Doppelschichten bestehen, die eine wässrige Phase einschließen. Sie werden spontan gebildet, wenn Phospholipide wässrigen Lösungen ausgesetzt werden, und können eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen aufnehmen.
  • Liposome haben sich als wertvolles Hilfsmittel als in vivo Abgabesystem zur Erhöhung der Wirksamkeit von verschiedenen pharmakologisch aktiven Molekülen erwiesen (Ostro u.a., Liposomes from Biophysics to Therapeutics, Dekker, New York, Seite 1–369 (1987)). Tierstudien haben gezeigt, dass Liposome die Toxizität von mehreren antitumoralen und antifungalen Medikamenten senken können, was zu klinischen Studien mit viel versprechenden Ergebnissen geführt hat (Sculier u.a., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24: 527–538; Gabizon u.a., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 25: 1795–1803 (1989); Treat u.a., J. Natl. Cancer Inst., 82: 1706–1710 (1990); Lopez- Berestein u.a., J. Infect. Dis., 151: 704–710 (1985); Presant u.a., Cancer, 62: 905–911 (1988)). Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Liposome wirksame Träger von antiparasitischen Medikamenten zur Behandlung von intrazellulären Infektionen des retikuloendothelialen Systems (RES), bei der Aktivierung von Makrophagenzellen zum Abtöten von Tumorzellen, bei Metastasemodellen und bei der Erhöhung der Immunreaktion auf eingeschlossene Antigene sind, wodurch die Zubereitung von künstlichen Vakzinen erleichtert wird (Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Lopez-Berestein & Fidler, Hrsg. Liss, New York (1989); Alving u.a., Immunol. Lett., 25: 275–280 (1990)).
  • Alle diese Wirkungen rühren von der Fähigkeit von Makrophagenzellen in der Leber und der Milz her (mononukleäres phagozytisches System MPS oder retikuloendotheliales System RES), die Mehrzahl der Liposome aus dem Blutkreislauf innerhalb von Minuten zu entfernen (Liposomes as Drug Carriers, Gregoriadis, Hrsg., Wiley, New York (1988)). Eine solche schnelle Freisetzung von Liposomen hat allerdings ihre Aussichten als in vivo Abgabesystem zum Transport von Medikamenten an die erkrankten Stellen über das RES hinaus beschränkt.
  • Neuere Berichte haben die Verwendung von verschiedenen Polymeren zur Erhöhung der Serumshalbwertzeit von Liposomen beschrieben. Insbesondere ist festgestellt worden, dass Formulierungen von Liposomen, die entweder Monosialogangliosid (GM1) oder Lipidderivative von Polyethylenglycol enthalten, eine Beseitigung von MPS vermeiden und deutlich die Serumshalbwertzeit erhöhen (Allen u.a., FEBS Lett., 223: 42–46 (1987); Klibanov u.a., FEBS Lett., 268: 235–237 (1990); Blume u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1029: 91–97 (1990); Allen u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1066: 29–36 (1991); Papahadjopoulos u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991); Senior u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1062: 77–82 (1991); Allen u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1068: 133–141 (1991)).
  • Viele Berichte haben gezeigt, dass die schnelle Beseitigung von zirkulierenden Liposomen in vivo durch Zellen des mononukleären phagozytischen Systems (MPS) durch Einarbeitung von Lipiden, die mit dem hydrophilen Polymer Polyethylenglycol (PEG) derivatisiert sind, überwunden werden kann. Diese Liposome werden als sterisch stabilisiert oder „verdeckte" Liposome bezeichnet. Wenn PEG ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 5000 aufweist, wird eine verlängerte Zirkulation und reduzierte MPS-Aufnahme erzielt (Woodle & Lasic, Biochim. Biophys. Acta, 1113:171–199 (1992)). Allerdings steht diese Verringerung der Freisetzung auch mit einer Reduzierung der Aufnahme durch eine Vielzahl von Zellen in Verbindung (Lee, K.D. u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1103:185–197 (1992)). Darüber hinaus scheint das Vorhandensein von hydrophilen Polymeren an der Liposomoberfläche die spezifische Ligandenerkennung durch Zielkomponenten, die mit dem Liposom konjugiert sind, zu stören. Vermutlich tritt dies aufgrund einer sterischen Behinderung der Wirkstelle der Zielkomponente durch die langkettigen PEG-Moleküle auf. (Klibanov u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1062: 148–148 (1991)).
  • Schließlich ist es, obwohl die meisten therapeutischen Agenzien, die mittels Liposomen transportiert werden, in das Zytoplasma der Zielzelle eindringen müssen, um ihre biologische Wirksamkeit zu exprimieren, allgemein erwünscht, dass die meisten Liposome entweder nicht wirklich von den Zielzellen internalisiert werden, oder, wenn eine Aufnahme auftritt, erfolgt diese allgemein über einen endozytotischen Weg. Daher bedingt das eigentliche Medikament für die Zielzelle typischerweise die Freisetzung vom Liposom (z.B. durch Auseinanderreißen des Liposoms selbst oder durch „Auslaufen") in der Nachbarschaft der Zielzelle und dann die nachfolgende Aufnahme (entweder durch Diffusion, Endozytose, Phagozytose oder aktiven Transport) des therapeutischen Agens aus der Lösung durch die Zielzelle. Tatsächlich sind Immunoliposome ausgebildet worden, um eigentlich die Destabilisierung und Fragmentierung des Liposoms zu induzieren, sobald der Zielantikörper mit einem Ziel verbunden ist, wodurch der Liposomengehalt frei wird (siehe US-Patent Nr. 4 957 735). Selbst diese „zielempfindlichen" Liposome verlieren eine beträchtliche Menge an therapeutischem Agens in Lösung, bevor letzteres von der Zielzelle aufgenommen werden kann. Alternativ wird das Liposom, wenn es durch ein endozytotisches Verfahren internalisiert wird, schließlich in ein Lysosom aufgenommen, bei dem starke Säurebedingungen vorherrschen, die eine Anzahl therapeutischer Agenzien (z.B. Proteine) abbauen können.
  • Daher wird die Abgabe von wirksamen Dosen an therapeutischen Agenzien an das Zytoplasma der Zielzelle durch niedrige Verweilzeiten im Serum, uneffektives Anvisieren bei erhöhten Verweilzeiten, einen beträchtlichen Verlust an therapeutischem Agens in Lösung, bevor es von der Zielzelle aufgenommen werden kann, und den Abbau des therapeutischen Agens im endosomalen/lysosomalen Weg behindert. Es wäre natürlich wünschenswert, ein Liposom mit erhöhter Serum-Halbwertzeit zu erhalten, das in der Lage ist, bestimmte Zellen besonders anzuvisieren, und das auch in der Lage ist, von den Zielzellen in das Zytoplasma internalisiert zu werden, wodurch ein Verlust an therapeutischem Agens oder ein Abbau über den endosomalen/lysosomalen Weg vermieden wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Immunoliposome zur Verfügung, die zur Abgabe von therapeutischen Agenzien an das Zytoplasma einer Zielzelle optimiert sind. Diese Immunoliposomen zeigen eine erhöhte Halbwertzeit im Blut, sind in der Lage, bestimmte Zellen speziellen anzuvisieren und können durch die Zielzellen in das Zytoplasma internalisiert werden, wodurch ein Verlust an therapeutischen Agenzien oder ein Abbau über den endolysosomalen Weg vermieden wird.
  • Daher stellt die Erfindung ein Immunoliposom zur Verfügung, das in eine Zelle, die einen HER2-Wachstumsfaktorrezeptor trägt, internalisiert wird, wobei das Immunoliposom umfasst:
    ein Antikörperfragment, das spezifisch an den HER2-Rezeptor bindet, wobei das Fragment mit einem hydrophilen Polymer verbunden ist,
    ein amphipathisches vesikelbildendes Lipid, wobei das vesikelbildende Lipid ein Liposom bildet;
    ferner ein hydrophiles Polymer;
    wobei das Immunoliposom in die Zelle internalisiert wird, wenn das Immunoliposom mit der Zelle in Kontakt gebracht wird.
  • Das Antikörperfragment ist vorzugsweise eine Fab'-Domäne. Das hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein mit Polyethylenglycol (PEG) derivatisiertes Lipid. Das PEG hat vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 D und 5000 D, besonders bevorzugt zwischen etwa 1200 D und etwa 3000 D, ganz besonders bevorzugt von etwa 1900 D. Das derivatisierte Lipid ist vorzugsweise bei bis zu etwa 12 Mol-%, besonders bevorzugt bei bis zu etwa 2,4 Mol-% und ganz besonders bevorzugt bei bis zu etwa 3,6 Mol-% des gesamten Lipids vorhanden. Die Fab'-Domäne kann eine humanisierte Fab'-Domäne eines monoklonalen Antikörpers sein. Das Immunoliposom kann weiter ein mit Maleimid derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (M-PE) umfassen, das eine Thioetherverbindung mit der Fab'-Domäne eines Antikörpers bildet. Das vesikelbildende Lipid kann ein Phospholipid, ein Glycolipid, ein Sphingolipid oder ein Sterin sein. Die Immunoliposomen haben vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 50 nm bis 500 nm, besonders bevorzugt 75 nm bis 300 nm, und ganz besonders bevorzugt ist er etwa 100 nm. Das Liposom kann ein therapeutisches Agens umfassen. Therapeutische Agenzien im Liposom können Daunomycin, Idarubicin, Mitoxantron, Mitomycin, Cisplatin und andere Platin II-Analoga, Vincristin, Epirubicin, Aclacinomycin, Methotrexat, Etoposid, Doxorubicin, Cytosinarabinosid, Fluoruracil und andere fluorierte Pyrimidine, Purine oder Nukleoside, Bleomycin, Mitomycin, Plicamycin, Dactinomycin, Cyclophosphamid und Derivate davon, Thiotepa, BCNU, Taxol, Taxoter und andere Taxanderivate und -isolate, Camptothecine, Polypeptide, eine Nukleinsäure, eine Nukleinsäure mit einer Phosphorthioat-Internukleotid-Verbindung, und eine Nukleinsäure mit einer Polyamid-Internukleotid-Verbindungaufweisen.
  • In einem bevorzugten Immunoliposom ist die Antikörper-Fab'-Domäne die von rhuMAbHER2, wobei die Fab'-Domäne an mit Maleimid derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (M-PE) konjugiert ist, das vesikelbildende Lipid ist Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterin (Chol) und das mit Polyethylenglycol derivatisierte Lipid ist mit Polyethylenglycol derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE), wobei die Polyethylenglycol-Komponente ein Molekulargewicht von etwa 1900 D aufweist und wobei das Verhältnis PC:Chol:M-PE 150:100:3 beträgt und das PEG-PE in einer Menge von bis zu etwa 3,6 Mol-% des gesamten Lipids vorhanden ist.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Antikörper-Fab'-Domäne mit dem distalen Ende des mit Polyethylenglycol derivatisierten Lipids verbunden sein. In diesem Fall kann das Immunoliposom ein mit Polyethylenglycol derivatisiertes Lipid enthalten, wobei in diesem Fall die Fab'-Domäne vorzugsweise mit nur einem kleinen Anteil der mit PEG derivatisierten Lipide verbunden ist, oder alternativ kann das Immunoliposom zwei oder mehr unterschiedliche Arten von mit PEG derivatisierten Lipiden enthalten, wobei in diesem Fall eine Art von mit PEG derivatisiertem Lipid als Linker für die Fab'-Antikörperdomäne dienen kann, während das andere mit PEG derivatisierte Lipid, das vorzugsweise in einer höheren Konzentration vorhanden ist, eine „sterische" Stabilisierung vorsieht, wodurch die Liposomfreisetzungsrate reduziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das mit dem mit PEG derivatisierte Lipid verbundene Fab' 0,6 Mol-% bis 1 Mol-% des gesamten Phospholipids, während das gesamte mit PEG derivatisierte Lipid 10 Mol-% bis 12 Mol-% des gesamten Phospholipids umfasst. Das Fab' ist vorzugsweise mit dem PEG-PE oder mit dem PEG-DSPE verbunden.
  • Die Immunoliposome der Erfindung können in einem Verfahren zur Internalisierung des therapeutischen Agens in die Zelle, die den HER2-Rezeptor trägt, verwendet werden, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zelle mit den Immunoliposomen umfasst, wobei das Kontaktieren zur Internalisierung des Agens in die Zelle führt.
  • Die Immunoliposome der Erfindung können auch bei einem Verfahren zur Wachstumsinhibierung einer Zelle, die einen HER2-Rezeptor trägt, durch Kontaktieren der Zelle mit den Liposomen verwendet werden.
  • Bei einer noch anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die ein oben beschriebenes Immunoliposom aufweist. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine therapeutisch wirksame Dosis des Immunoliposoms und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht die flusszytometrischen Histogramme, die die Bindung von anti-p185HERZ-Immunoliposome mit SK-BR-3-Zellen zeigen. Immunoliposome, die nach dem Waschen mit SK-BR-3-Zellen verbunden sind, wurden mittels FITC-markiertem Ziegen anti-humanem IgG erfasst, der rhuMAbHER2-Fab'-Fragmente erkennt. SK-BR-3-Zellen wurden mit herkömmlichen Immunoliposomen (A), sterisch stabilisierten (6 Mol-% PEG-PE) Immunoliposomen (B) und freien rhuMAbHER-2-Fab'-Fragmenten (C) bei äquivalenten Antikörperkonzentrationen (3,3 μg/ml) inkubiert.
  • 2 zeigt die Bindung von herkömmlichen anti-p185HER2-Liposomen mit BT-474-Zellen. (A) BT-474-Zellen in einer Monoschichtkultur wurden mit herkömmlichen Immunoliposomen in Gegenwart von konkurrierenden mit 125I markiertem rhuMabHER2 behandelt, wie in Methoden beschrieben. (B) Die Scatchard-Transformation der Daten ist in (A) gezeigt.
  • 3 zeigt die antiproliferative Aktivität von anti-p185HER''-Immunoliposomen gegenüber SK-BR-3-Zellen. SK-BR-3-Zellen in Monoschichtkultur wurden mit Immunoliposomen bei Antikörperdosen, die auf der Abszisse angegeben sind, und einer relativen Zellproliferation, die wie in Methoden beschrieben bestimmt wurde, behandelt. Kontrollliposome ohne Antikörper wurden gemäß der Liposomenkonzentration dosiert und werden bei einer äquivalenten Liposomenkonzentration gegen das in geeigneter Weise angepasste Immunoliposom aufgetragen. Herkömmliche Kontrollliposome (ohne Antikörper); sterisch stabilisierte (6 Mol-% PEG-PE) Kontrollliposome; herkömmliche Immunoliposome; sterisch stabilisierte anti-p185HER2-Immunoliposome (6 Mol-% PEG-PE); freies (nicht liposomales) rhuMAbHER2-Fab'; und freier bivalenter rhuMAbHER2-Antikörper sind wie in dem Schlüssel angegeben gezeigt.
  • 4 zeigt die Zytotoxizität von anti-p185HER2-Immunoliposomen, die Doxorubicin enthalten. HSPC: Chol-Immunoliposome wurden mit Doxorubicin beladen, wie in Methoden beschrieben. (A) SK-BR-3-Zellen. (B) WI-38-Zellen. Behandlung von Zellen in Kultur 1 Stunde lang mit: herkömmlichen Immunoliposomen (Dreiecke); sterisch stabilisierten (2 Mol-% PEG-PE) Immunoliposomen (schwarze Kreise); sterisch stabilisierten (2 Mol-% PEG-PE) Kontrollimmunoliposomen (irrelevanter Antikörper) (weiße Kreise); oder freiem Doxorubicin allein (schwarze Quadrate). Die Immunoliposome enthielten 60–70 μg Antikörper/μmol Phospholipid und 55–80 μg Doxorubicin/μmol Phospholipid; das Antikörper/Doxorubicin-Verhältnis betrug 0,8–1,2. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Behandlung gezählt, wie in Methoden beschrieben.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Definitionen und allgemeine Parameter
  • Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung und den Umfang der verschiedenen Begriffe, die zur Beschreibung der Erfindung verwendet werden, zu veranschaulichen und zu definieren.
  • Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet: DOX, Doxorubicin; Chol, Cholesterin; PA, Phosphatidinsäure; PC, Phosphatidylcholin; PI, Phosphatidylinosit; SM, Sphingomyelin; M-DPE, mit Maleimid derivatisiertes Dipalmityolethanolamin; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; LUV, große unilamellare Vesikel; MLV, multilamellare Vesikel; PE, Phosphatidylethanolamin; PEG, Polyethylenglycol; PEG-PE, mit Polyethylenglycol derivatisiertes Phosphatidylethanolamin.
  • Der Begriff „amphipathisches vesikelbildendes Lipid" soll jedes amphipathische Lipid mit hydrophoben und polaren Kopfgruppenkomponenten umfassen und kann selbst spontan Doppelschichtvesikel im Wasser ausbilden, wie durch Phospholipide beispielhaft gezeigt, oder (b) wird stabil in Lipid-Doppelschichten in Kombination mit Phospholipiden eingearbeitet, wobei die hydrophobe Komponente sich in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran befindet und die polare Kopfgruppenkomponente zur äußeren, polaren Membranoberfläche hin gerichtet ist. Ein Beispiel für letztere Art des vesikelbildenden Lipids sind Cholesterin und Cholesterinderivate, wie beispielsweise Sulfat und Cholesterinhemisuccinat.
  • Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „spezifische Bindung" die Bindung, die zwischen solchen gepaarten Arten wie Enzym/Substrat, Rezeptor/Agonist, Antikörper/Antigen und Lectin/Kohlenhydrat auftritt, die durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen oder eine Kombination aus kovalenten und nicht kovalenten Wechselwirkungen vermittelt werden kann. Wenn die Wechselwirkung der beiden Arten einen nicht kovalent gebundenen Komplex erzeugt, ist die auftretende Bindung typischerweise elektrostatisch, wasserstoffbindend oder das Ergebnis von lipophilen Wechselwirkungen. Demgemäß tritt eine „spezifische Bindung" zwischen einer gepaarten Art auf, bei der es eine Wechselwirkung zwischen den beiden gibt, die einen gebundenen Komplex mit den Charakteristika einer Antikörper/Antigen- oder Enzym/Substrat-Wechselwirkung erzeugt. Insbesondere ist die spezifische Bindung durch die Bindung eines Elements eines Paars an eine bestimmte Art und an keine andere Art innerhalb der Familie von Verbindungen gekennzeichnet, zu der das entsprechende Element der Bindungselemente gehört. Daher bindet zum Beispiel ein Antikörper vorzugsweise an ein einzelnes Epitop und an kein anderes Epitop in der Proteinfamilie.
  • Der Begriff „Immunoliposom" betrifft ein Liposom, das einen Antikörper oder ein Antikörperfragment trägt, das als Zielkomponente wirkt und es möglicht macht, dass das Liposom spezifisch an ein bestimmtes „Ziel"-Molekül bindet, das in Lösung vorkommen oder an die Oberfläche einer Zelle gebunden sein kann. Wenn das Zielmolekül typischerweise in relativem Überschuss vorgefunden wird (z.B. >10-fach) und in Verbindung mit einer bestimmten Zellart oder alternativ in einer Vielzahl von Zellarten, die alle einen bestimmten physiologischen Zustand exprimieren, dann gilt das Zielmolekül als „charakteristischer Marker" dieses Zelltyps oder dieses physiologischen Zustands. Daher kann zum Beispiel ein Krebs durch Überexpression eines bestimmten Markers, wie beispielsweise des HER2 (c-erbB-2/neu)-Protoonkogens im Fall von Brustkrebs, gekennzeichnet sein.
  • Ein „hydrophiles Polymer", wie es hier verwendet wird, betrifft langkettige, stark hydratisierte flexible neutrale Polymere, die mit Lipidmolekülen verbunden sind. Beispiele umfassen mit Polyethylenglycol und Polypropylenglycol modifizierte Lipide, Phosphatidylinsoit (PI), Cerebrosidsulfat (CS) und Monosialogangliosid (GM1), sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Der Begriff „Mol-%", wenn er den prozentualen Anteil des hydrophilen Polymers in einem Liposom bezeichnet, wird in Bezug auf das gesamte Lipid im Liposom exprimiert, wenn nicht anders angegeben. Daher stellt in einem Liposom, umfassend ein Verhältnis von Phosphatidylcholin (PC) zu Cholesterin (Chol) von 150:100, ein 4 Mol-% hydrophiles Polymer (z.B. PEG) ein Verhältnis von PC:Chol:PEG von etwa 150:100:10 dar.
  • Der Begriff „Proliferation" betrifft die Zellteilung oder Mitose. Die Proliferation kann durch Standardverfahren, wie beispielsweise durch die Aufnahme von radioaktiven Nukleotiden (Thymidin), oder durch direkte Beobachtung gemessen werden.
  • Immunoliposome in der Medikamentenabgabe
  • Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Immunoliposome zur selektiven Abgabe von therapeutischen Agenzien für spezifische Gewebe in einem Wirt und Verwendungen dieser Liposome zur Verfügung. Die Liposome der vorliegenden Erfindung verwenden eine Zusammensetzung, die die Internalisierung des Liposoms in das Zellzytoplasma des Zielgewebes optimiert. Der Ausdruck „optimiert die Internalisierung" oder „optimale Internalisierung" wird verwendet, um auf die Abgabe des Liposomengehalts zu verweisen, so dass eine maximale Abgabe an das Zytoplasma der Zielzelle und daher eine maximale therapeutische Wirkung erzielt wird. Es wird davon ausgegangen, dass die Internalisierung eines Immunoliposoms in das Zytoplasma einer Zelle eine Funktion der Bluthalbwertszeit des Liposoms, die Fähigkeit des Liposoms seine Zielzelle zu erkennen and daran zu binden, und die Aufnahme des Liposoms in das Zytoplasma der Zielzelle ist. Es ist bekannt, dass die Zugabe eines hydrophilen Polymers zu Liposomen die Serumshalbwertszeit durch Senken sowohl der Liposomenagglomeration (Aggregation) als auch der Liposomenaufnahme durch das RES erhöht. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass die hydrophilen Polymere in hohen Konzentrationen die Erkennung und Bindung durch die Zielkomponente oder den Ligand und die anschließende Aufnahme durch die Zielzelle stören, wodurch die Internalisierung des Liposomengehalts durch die Zielzelle gesenkt wird. Die optimale Internalisierung in das Zytoplasma der Zelle bezeichnet den Zustand, in dem die maximale Aufnahme in das Zytoplasma der Zielzelle erreicht ist, während eine Bluthalbwertszeit, die deutlich größer als die Bluthalbwertszeit von Liposomen ist, denen ein hydrophiles Polymer fehlt und die für die Zielzwecke angemessen ist, weiter beibehalten wird.
  • Insbesondere beruht die vorliegende Erfindung teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, dass ein Liposom, umfassend ein hydrophiles Polymer (z.B. ein mit PEG modifiziertes Lipid) in einer Menge von bis zu etwa 3,6 Mol-% des gesamten (vesikelbildenden) Lipids, eine unerwartet hohe Internalisierungsrate in das Zytoplasma der Zielzelle zeigt, während eine Bluthalbwertszeit beibehalten wird, die wesentlich länger als die in Liposomen ohne ein hydrophiles Polymer festgestellte ist. Dies gilt insbesondere dann, wenn das Immunoliposom mit Fab'-Fragmenten, die mit ein oder mehr Lipidbestandteilen des Liposoms konjugiert werden, anvisiert wird.
  • Darüber hinaus war es auch eine unerwartete Entdeckung, dass, wenn Liposomen, die bis zu 3,6 Mol-% eines hydrophilen Polymers umfassen, mit einem Fab'-Fragment eines Antikörpers als Zielkomponente konjugiert wurden, das Liposom einen hohen Grad an Zellspezifität und eine Bindungsaffinität zeigt, die größer als die der Fab'-Fragmente allein sind. Tatsächlich ist die Bindungspezifität, die durch die Immunoliposomen der vorliegenden Erfindung erzielt werden, mit der Bindungsspezifität des intakten Antikörpers vergleichbar. Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, da der intakte Antikörper ein Tetramer ist, das ein Paar variabler Domänen-„Arme" umfasst, die zum großen Teil für die Antikörperspezifität und Avidität verantwortlich sind. Fab'-Regionen, die nur aus einem "Arm" bestehen, fehlt typischerweise die Spezifität und Bindungsavidität des intakten Antikörpers. Es wird üblicherweise davon ausgegangen, dass sie schlechte Zielkomponenten bilden.
  • Während das Fab'-Fragment mit jedem Teil des Liposoms konjugiert werden kann, war es eine überraschende Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass, wenn das Fab'-Fragment mit den distalen Enden des hydrophilen Polymers (z.B. Polyethylenglycol) verbunden wird, hohe Internalisierungsniveaus des Liposoms durch die Zielzelle werden erreicht, selbst wenn hohe Niveaus an hydrophilem Polymer vorhanden sind (z.B. bis zu 15 Mol-% des gesamten Phospholipids, besonders bevorzugt etwa 10 bis 12 Mol-% des gesamten Phospholipids). Daher sieht in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Liposom vor, das von einer Zielzelle internalisiert wird, bei der das Liposom ein Fab'-Fragment aufweist, das mit den distalen Enden eines hydrophilen Polymers, z.B. Polyethylenglycols, verbunden ist. Das Fab'-Fragment ist vorzugsweise selbst nicht mit der Mehrheit an hydrophilem Polymer verbunden. Typischerweise wird das Fab' mit nur etwa 1 bis etwa 20 % des hydrophilen Polymers, besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa 10 Mol-% des hydrophilen Polymers und ganz besonders bevorzugt etwa 6 bis etwa 10 Mol-% des hydrophilen Polymers, verbunden. Die das hydrophile Polymer tragenden Fab'-Fragmente (z.B. PEG-Fab') sind daher in etwa 0,1 bis 2,0 Mol-% des gesamten Phospholipids, besonders bevorzugt in etwa 0,4 bis etwa 1,0 Mol-% und ganz besonders bevorzugt etwa 0,6 bis etwa 1,0 Mol-% des gesamten Phospholipids, vorhanden.
  • Die Immunoliposome der vorliegenden Erfindung optimieren die Abgabe von therapeutischen Agenzien an das Zytoplasma der Zielzelle dadurch, dass sie im Vergleich zu einem Liposom, dem ein hydrophiles Polymer fehlt, eine erhöhte Bluthalbwertszeit aufrechterhalten, dass ein hoher Grad an Zielspezifität aufrechterhalten wird und dass eine wirksame Internalisierung des Liposoms selbst erfolgt (Tragen des therapeutischen Agens), wodurch ein beträchtlicher Verlust an therapeutischem Agens in Lösung oder Abbau des Therapeutikums in dem endosomalen/lysosomalen Weg vermieden wird. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung sind daher besonders nützlich als Vehikel für die Abgabe von Therapeutika an spezifische Zielzellen.
  • Immunoliposome als Zellwachstumsinhibitoren
  • Die Immunoliposome der Erfindung können verwendet werden, um die Tumorzellproliferation zu hemmen und so eine Antitumoraktivität vorzusehen, ohne dass ein wachstumsinhibierendes therapeutisches Agens eingeschlossen wird. Tatsächlich sind die wachstumsinhibierenden Immunoliposome der vorliegenden Erfindung wirksam, wenn sie kein therapeutisches Agens enthalten. Die wachstumsinhibierenden Immunoliposome der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen die Fab'-Domäne eines anti-HER2-monoklonalen Antikörpers. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper das Fab'-Fragment des humanen monoklonalen anti-HER2-Antikörpers (rhuMAbHER2-Fab'). Anders als freies rhuMAbHer2-Fab' in Lösung führt die liposomale (Membran)-Verankerung des monovalenten Fab'-Fragments zu einer antiproliferativen und antitumoralen Aktivität vergleichbar dem bivalenten rhuMAbHER2. Der Antikörper rhuMAbHER2-Fab' in Lösung hat diese Eigenschaft nicht. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass die Membranverankerung des Fab'-Fragments im anti-HER2-Immunoliposom diese antiproliferative Eigenschaft wahrscheinlich durch das Ermöglichen einer Vernetzung von p185HER2 an der Tumorzelloberfläche verleiht.
  • Die Fab'-Fragmente können mit jedem Abschnitt des Liposoms konjugiert sein. Daher kann zum Beispiel in einer Ausführungsform das Fab' direkt mit dem Liposom konjugiert sein, während in einer anderen Ausführungsform die Fab' mit dem hydrophilen Polymer (z.B. PEG) konjugiert sein können.
  • Wie oben angegeben, enthalten die wachstumsinhibierenden Immunoliposome kein wachstumsinhibierendes Agens. Ein „wachstumsinhibierendes Agens" bezeichnet ein chemisches Agens, das die Wachstumsrate von Zellen, an die es verabreicht wird, verringert. Im extremen Fall kann ein wachstumsinhibierendes Agens zytotoxisch für die Zelle, an die es verabreicht wird, sein. Wie hier verwendet, bezeichnet die Wachstumsrate von Zellen die Proliferationsrate der Zellen. Eine erhöhte Proliferationsrate wird typischerweise mit einer erhöhten metabolischen Rate in Verbindung gebracht und so können die Proliferationsraten durch Feststellen der metabolischen Raten untersucht werden (z.B. durch Aufnahme eines markierten metabolischen Vorläufers, wie beispielsweise tritiummarkiertes Thymidin). Daher kann eine erhöhte Wachstums- oder Proliferationsrate als Anzeichen für eine erhöhte metabolische Rate oder umgekehrt genommen werden.
  • Wachstumsinhibierende Agenzien sind dem Fachmann bekannt und umfassen Doxorubicin, Ricin A, Gelonin, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist festzustellen, dass einige Zusammensetzungen (z.B. Antibiotika) eine geringe wachstumsinhibierende Aktivität als zufällige Konsequenz ihrer primären Aktivität zeigen können. Solche Zusammensetzungen werden hier nicht als wachstumsinhibierende Agenzien angesehen. Der Ausdruck ein „Liposom, das kein wachstumsinhibierendes therapeutisches Agens enthält" soll der Tatsache Rechnung tragen, dass die Inhibierung des Zellwachstums und die Proliferation, die mit den wachstumsinhibierenden Immunoliposomen der vorliegenden Erfindung erhalten wird, eine Konsequenz des Liposom/Fab'-Konstrukts selbst ist aber keine Folge des Liposomengehalts ist. Daher bezeichnet ein wachstumsinhibierendes Agens, wie es hier verwendet wird, ein Agens, das, wenn es im wachstumsinhibierenden Immunoliposom vorhanden ist, zu einer Senkung der Zellproliferationsrate führt, die mindestens 10 % größer als die Senkung der Zellproliferationsrate ist, die bei Verabreichen derselben Immunoliposome, denen ein therapeutisches oder wachstumsinhibierendes Agens fehlt, beobachtet wird.
  • Während die wachstumsinhibierenden Liposome der vorliegenden Erfindung das Zellwachstum und die Proliferation hemmen, selbst wenn sie kein therapeutisches Agens tragen und daher „leer" verabreicht werden können, wird der Fachmann feststellen, dass es erwünscht sein kann, ein therapeutisches Agens, das kein wachstumsinhibierendes therapeutisches Agens ist, einzuschließen, wodurch ein Liposom erhalten wird, das doppelte, additive oder supraadditive Aktivitäten zeigt. Daher zeigt zum Beispiel ein Immunoliposom, das mit einem Antibiotikum beladen ist, sowohl eine Antibiotikaaktivität als auch die Fähigkeit, das Wachstum und die Proliferation der Zielzellen zu hemmen.
  • Die wachstumsinhibierenden Liposome und die Immunoliposome der vorliegenden Erfindung, die die therapeutischen Agenzien tragen, können verwendet werden, um die Tumorzellproliferation zu hemmen oder um unter einer Vielzahl von Wirten Therapeutika zu spezifischen Zellen hinzudirigieren. Bevorzugte Wirte umfassen Säugetierarten, wie beispielsweise den Menschen, nicht menschliche Primaten, Hunde, Katzen, Westernpferde [cattle horses], Schafe, Nagetiere, Kaninchen [largomorph] und dergleichen.
  • Liposomzusammensetzung
  • Die Immunoliposome der vorliegenden Erfindung umfassen ein oder mehr vesikelbildende Lipide, ein Antikörperfragment, das als Zielkomponente fungiert, und ein hydrophiles Polymer. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, arbeiten die vesikelbildenden Lipide so, dass eine Doppelschicht gebildet wird, die das therapeutische Agens einschließt, wenn es vorhanden ist, das hydrophile Polymer dazu dient, um eine Agglomeration der Liposomen zu verhindern und auch die Aufnahme des Liposoms durch das RES zu senken und dadurch die Bluthalbwertszeit zu erhöhen, und der Ligand (das Antikörperfragment) dazu dient, die Liposomen spezifisch mit einer Zelle oder einem Gewebe zu verbinden, das ein Ziel (d.h. einen charakteristischen Marker) trägt, für das der Ligand spezifisch ist. Der niedrige molprozentuale Anteil des hydrophilen Polymers, der mit der Verwendung des Antikörperfragments gekoppelt ist, ermöglicht das spezifische Anvisieren des Liposoms und führt in unerwarteter Weise zu einem hohen Niveau an Internalisierung des ganzen Liposoms in das Zytoplasma der Zielzelle.
  • A) Vesikelbildende Lipide
  • Das vesikelbildende Lipid hat vorzugsweise zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und eine polare Kopfgruppe. Zu dieser Klasse gehören die Phospholipide, wie beispielsweise Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidinsäure (PA), Phosphatidylinosit (PI) und Sphingomyelin (SM), wo die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge von zwischen etwa 14–22 Kohlenstoffatome aufweisen und unterschiedliche Grade an Ungesättigtheiten oder gesättigte Phospholipide mit einer Kohlenstoffkette von 14–18 C-Atomen haben. In diese Klasse gehören auch die Glycolipide, wie beispielsweise Cerebroside und Ganglioside.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hauptlipidkomponente in den Liposomen Phosphatidylcholin. Phosphatidylcholine mit einer Vielzahl von Acylkettengruppen von unterschiedlicher Kettenlänge und Sättigungsgrad sind verfügbar oder können durch bekannte Verfahren isoliert oder synthetisiert werden. Im Allgemeinen lassen sich niedriger gesättigte Phosphatidylcholine leichter dimensionieren, insbesondere wenn die Liposome unter etwa 0,3 μm dimensioniert werden müssen, und zwar für die Zwecke einer Filtersterilisation. Phosphatidylcholine, die gesättigte Fettsäuren mit Kohlenstofflängen im Bereich von C14 bis C22 haben, sind bevorzugt. Phosphatidylcholine mit einfach oder doppelt ungesättigten Fettsäuren und Gemischen aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren können auch verwendet werden. Liposome, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können auch aus Sphingomyelin oder Phospholipiden mit Kopfgruppen außer Cholin, wie beispielsweise Ethanolamin, Serin, Glycerin und Inosit zusammengesetzt sein. Insbesondere umfassen Phospholipide, die zur Bildung von Liposomen geeignet sind, die für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin, Lecithin, β,γ-Diplamitoyl-α-lecithin, Sphingomyelin, Phosphatidylserin, Phosphatidinsäure, N-(2,3-Di(9-(Z)-octadecenyloxy))-prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, Phosphatidylethanolamin, Lysolecithin, Lysophosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Cephalin, Cardiolipin, Cerebroside, Dicetylphosphat, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Dioleoylphosphatidylglycerin, Palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholin, Di-stearoyl-phosphatidylcholin, Stearoylpalmitoylphosphatdiylcholin, Di-palmitoyl-phosphatidylethanolamin, Di-stearoylphosphatidylethanolamin, Di-myristoyl-phosphatidylserin, Di-oleylphosphatidylcholin und dergleichen. Nicht Phosphor enthaltende Lipide können auch in den Liposomen der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese umfassen z.B. Stearylamin, Docecylamin, Acetylpalmitat, Fettsäureamide und dergleichen. Zusätzliche Lipide, die zur Verwendung in den Liposomen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und werden in einer Vielzahl von bekannten Quellen genannt, z.B. McCutcheon's Detergents and Emulsifiers und McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J., die beide hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Bevorzugte Liposome umfassen ein Sterin, vorzugsweise Cholesterin, bei molaren Verhältnissen von 0,1 bis 1,0 (Cholesterin:Phospholipid). Die am meisten bevorzugten Liposomenzusammensetzungen sind Phosphatidylcholin/Cholesterin, Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin, Dipalmitoylphosphatidylcholin/Cholesterin und Sphingomyelin/Cholesterin. Kleine Mengen (d.h. < 10 %) an anderen derivatisierten Lipiden sind oft in Liposomen, die diese Zusammensetzungen aufweisen, vorhanden.
  • Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung kann das vesikelbildende Lipid ein relativ fluides Lipid sein, was typischerweise bedeutet, dass die Lipidphase eine relativ niedrige flüssig-flüssig-kristalline Schmelztemperatur hat, z.B. bei oder unter Raumtemperatur, oder ein relativ festes Lipid, was bedeutet, dass das Lipid eine relativ hohe Schmelztemperatur hat, z.B. bis zu 60°C. In der Regel tragen die festeren, d.h. gesättigten Lipide, zur Membranfestigkeit in einem Lipiddoppelschichtaufbau bei und tragen auch zu einer größeren Doppelschichtstabilität im Blut bei. Andere Lipidkomponenten, wie beispielsweise Cholesterin, tragen bekanntermaßen auch zur Membranfestigkeit und -stabilität in Lipiddoppelschichtstrukturen bei. Wie oben erwähnt, ist ein langkettiges (z.B: C14-C22) gesättigtes Lipid plus Cholesterin eine bevorzugte Zusammensetzung zur Abgabe von therapeutischen Zusammensetzungen an Zielgewebe, wie beispielsweise solide Tumoren, da diese Liposomen nicht die Tendenz haben, die Medikamente in das Plasma freizusetzen, da sie durch den Blutstrom zirkulieren. Phospholipide, deren Acylketten eine Vielzahl von Sättigungsgraden aufweisen, sind im Handel erhältlich. Zum Beispiel kann Eiphosphatidylcholin (EPC) von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) gekauft werden und hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC) kann von Natterman (Köln, Deutschland) erhalten werden. Alternativ können Phospholipide nach den veröffentlichten Verfahren hergestellt werden (siehe D.M. Small, „The physical chemistry of lipids" (1986), Plenum Press, N.Y. oder D.D. Lasic, „Liposomes: from physics to applications" (1993) Elsevier, Amsterdam; N.Y.).
  • B) Hydrophiles Polymer.
  • Wie oben angegeben, tendiert das Vorhandensein von hydrophilen Polymeren dazu, die Bluthalbwertszeit eines Liposoms zu erhöhen. (Siehe zum Beispiel Woodle u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1113: 171–199 (1992)). Daher ist es oft wünschenswert, den Liposomen ein hydrophiles Polymer, wie beispielsweise mit Polyethylenglycol (PEG) modifizierte Lipide oder Gangliosid GM1 hinzuzufügen. Die Zugabe von solchen Komponenten verhindert eine Liposomenaggregation während der Verbindung der Zielkomponente mit dem Liposom. Diese Komponenten sehen auch ein Mittel zur Erhöhung der Zirkulationslebenszeit des Phospholipids vor. Allerdings ist beobachtet worden, dass es, während hydrophile Polymere die Liposomenaufnahme durch das RES senken und dadurch die Bluthalbwertszeit erhöhen, auch eine entsprechende Reduzierung der Aufnahme durch die Zielgewebe gibt. Es war eine unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass eine Konzentration von hydrophilem Polymer (z.B. PEG) mit 1 bis 4 Mol-% vesikelbildendes Lipid (ausschließlich Cholesterin) eine optimale Zellaufnahme in Kombination mit einer angemessenen Bluthalbwertszeit vorsieht.
  • Eine Zahl von unterschiedlichen Verfahren kann zur Herstellung von PEG zur Einarbeitung in Liposomen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird PEG als mit PEG derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) oder mit PEG derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) eingearbeitet. Verfahren zur Herstellung von PEG-PE sind bekannt und beinhalten typischerweise die Verwendung eines aktivierten Methoxy-PEG (mit nur einem reaktiven Ende) und PE. Daher kann das PEG-Succinimidylsuccinat in einem basischen organischen Lösungsmittel reagiert werden (Klibanov u.a., FEBS Lett., 268: 235–237 (1990)). Ein besonders bevorzugtes Verfahren der PEG-PE-Herstellung beruht auf der Reaktion von PEG mit Carbonyldiimidazol und anschließender Zugabe von PE (siehe Woodle u.a., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 17: 77–78 (1990), Papahadjopoulos u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991), Allen u.a., Biochim, Biophys. Acta, 1066: 29–36 (1991), Woodle u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1105: 193–200 (1992) and Woodle u.a., Period. Biol., 93: 349–352 (1991)). In ähnlicher Weise wird mit Cyanurchlorid aktiviertes PEG in einem basischen organischen Lösungsmittel von Blume u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1029: 91–97 (1990) und dem US-Patent Nr. 5 213 804 beschrieben, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Ein vollständig neuer Ansatz beruht auf der Verbindung von PEG mit vorgeformten Liposomen unter Verwendung von mit Tresylchlorid aktiviertem PEG, das dann den PE enthaltenden Liposomen bei einem hohen pH-Wert zugesetzt werden (Senior u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1–62: 77–82 (1991). Derivatisiertes PEG ist auch im Handel erhältlich. So ist zum Beispiel PEG-PE von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) oder Liposome Technology (Menlo Park, Kalifornien, USA) erhältlich. Der Fachmann wird feststellen, dass viele andere Verbindungen verfügbar sind.
  • C) Antikörperfragment
  • Ein „Antikörper" bezeichnet ein Protein, das aus einem oder mehr Polypeptiden besteht, die im Wesentlichen durch Immunoglobulingene oder Fragmente von Immunoglobulingenen kodiert werden. Die festgestellten Immunoglobulingene umfassen die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene der konstanten Regionen sowie die unzähligen Immunglobulingene der variablen Region. Leichte Ketten werden entweder als kappa oder lambda untergliedert.
  • Schwere Ketten sind als gamma, mu, alpha, delta oder epsilon unterteilt, die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
  • Die grundlegende Immunglobulin (Antikörper)-Aufbaueinheit umfasst bekanntermaßen ein Tetramer. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kD) und eine „schwere" Kette (etwa 50–70 kD) hat. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die primär für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (VL) und variable schwere Kette (VH) bezeichnen diese leichte bzw. schwere Kette.
  • Antikörper können als intakte Immunoglobuline oder als ein Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten bestehen, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. Insbesondere verdaut Pepsin einen Antikörper unter den Disulfidverbindungen in der Gelenkregion, um F(ab)'2 zu erzeugen, ein Dimer von Fab, das selbst eine leichte Kette ist, die mit VH-CHI über eine Disulfidbindung verbunden ist. Das F(ab)'2 kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidverbindung in der Gelenkregion aufzubrechen, wodurch das F(ab)'2-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe Fundamental Immunology, W.E. Paul, Hrsg. Raven Press, N.X. (1993) für weitergehende Antikörperfragmentterminologie). Während die Fab'-Domäne im Hinblick auf den Verdau eines intakten Antikörpers definiert ist, weiß der Fachmann zu schätzen, dass solche Fab'-Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Verwendung von rekombinanter DNA-Methodik synthetisiert werden können. Allgemein ausgedrückt handelt es sich bei der Fab'-Region eines Antikörpers um ein Monomer, das die variablen Regionen und die CHI-Region eines Arms eines Antikörpers umfasst.
  • Die Fab'-Regionen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von Antikörpern von Tieren (insbesondere Maus oder Ratte) stammen oder menschlichen Ursprungs sein oder können chimär (Morrison u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984), beide werden durch Bezugnahme hier aufgenommen) oder humanisiert sein (Jones u.a., Nature 321, 522–525 (1986) und veröffentlichte UK- Patentanmeldung Nr. 8707252, beide werden hier durch Bezugnahme aufgenommen).
  • Die Fab'-Region wird so ausgewählt, dass sie spezifisch an den HER2-Rezeptor bindet. Brustkrebs ist durch die Überexpression des HER2 (c-erbB-2n, neu) Protoonkogen kodierten Rezeptors gekennzeichnet.
  • Es wird davon ausgegangen, dass der charakteristische Marker (der HER2-Rezeuptor) nicht ein natürlich auftretender Marker sein muss, sondern vielmehr in die bestimmte Zielzelle eingeführt werden kann. Dies kann durch direktes Markieren einer Zelle oder eines Gewebes mit dem Marker (z.B. durch direkte Injektion des bestimmten Zielgewebes mit dem Marker) oder alternativ durch Verabreichen eines Markers, der über das Zielgewebe selektiv eingebracht wird, an den gesamten Organismus erzielt werden. In einer Ausführungsform kann der Marker ein Genprodukt sein, das durch eine Nukleinsäure in einer Expressionskassette kodiert ist. Das Markergen kann unter der Kontrolle eines Promotors stehen, der nur in den bestimmten Zielzellen aktiv ist. Daher führt die Einführung eines Vektors, der die Expressionskassette enthält, zur Expression des Markers nur in den bestimmten Zielzellen. Der Fachmann wird feststellen, dass es zahlreiche Ansätze gibt, die die rekombinante DNA-Methodik verwenden, um charakteristische Marker in Zielzellen einzuführen.
  • Immunoliposome der vorliegenden Erfindung können durch Einführung des Antikörperfragments in die Liposome durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein mittels Biotin konjugiertes Fab' an ein Liposom gebunden sein, das ein Streptavidin enthält. Alternativ kann das biotinylierte Fab' über einen Avidin- oder Streptavidin-Linker mit einem mit Biotin derivatisierten Liposom konjugiert sein. Daher wurde zum Beispiel ein biotinylierter monoklonaler Antikörper biotinyliert und mit Liposomen, die biotinyliertes Phsophatidylethanolamin enthalten, mittels eines Avidin-Linkers verbunden. (Siehe zum Beispiel Ahmad u.a., Cancer Res. 52: 4817–4820 (1992)). Typischerweise werden etwa 30 bis 125 und besonders typisch etwa 50 bis 100 Fab'-Moleküle pro Liposom verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Zielkomponente direkt mit dem Liposom konjugiert sein. Solche Mittel der direkten Konjugation sind dem Fachmann bekannt. Siehe zum Beispiel G. Gregoriadis, (1984) „Liposome Technology" CRC Press, Boca Raton, Florida und D.D. Lasic, „Liposomes: from physics to applications" (1993) Elsevier, Amsterdam; N.Y. Besonders bevorzugt ist eine Konjugation mittels einer Thioether-Verbindung. Dies kann durch eine Reaktion des Antikörpers mit einem mit Maleimid derivatisierten Lipid, wie beispielsweise einem mit Maleimid derivatisierten Phosphatidylethanolamin (M-PE) oder Dipalmitoylethanolamin (M-DEP), erzielt werden. Dieser Ansatz wird ausführlich von Martin u.a., J. Biol. Chem., 257: 286–288 (1982) beschrieben, der hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Zielkomponente (z.B. das Fab'-Fragment) mit dem hydrophilen Polymer (z.B. einem PEG) verbunden sein. Mittel zum Verbinden von Zielmolekülen mit Polymerlinkern sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Kapitel 4 in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch und Lennox, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York (1995); und Blume u.a., Biochem. Biophys. Acta, 1149: 180–184 (1993)). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Fab'-Fragment mit einem mittels Maleimid derivatisierten PEG durch die -SII-Gruppe von Fab' verbunden. Um eine Linkergruppe vorzusehen, wird α-Distearoylphosphatidylethanolaminocarbonyl-ω-malimidopropionylamidopolyethylenglycol aus Distearoylphosphatidylethanolamin und einem heterobifunktionellen PEG-Derivat, N-Hydroxysuccinimidyl-PEG-Maleimid gemäß Standardverfahren synthetisiert. Das Maleimid-Derivat von PEG-PE ist in der Liposomenherstellung, wie oben und unten beschrieben, umfasst, und das Fab'-Fragment kann mit dem Liposom über die Sulfhydrylgruppe bei einem pH-Wert von 7,2 konjugiert werden.
  • Herstellung von Liposomen
  • Eine Vielzahl von Verfahren steht für die Herstellung von Liposomen zur Verfügung, wie z.B. in Szoka u.a., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), den US-Patenten Nr. 4 186 183, 4 217 344, 4 235 871, 4 261 975, 4 485 054, 4 501 728, 4 774 085, 4 837 028, 4 946 787, der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17424, Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978), Deamer und Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 443: 629–634 (1976); Fraley u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348–3352 (1979); Hope u.a., Biochim. Biophys. Acta, 812: 55–65 (1985); Mayer u.a., Biochim. Biophys. Acta, 858: 161–168 (1986); Williams u.a., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 242–246 (1988), dem Text Liposomes, Mark J. Ostro, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1, und Hope u.a., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986) beschrieben. Geeignete Verfahren umfassen z.B. die Beschallung, Extrusion, Hochdruck/Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergenzdialyse, mittels Calcium induzierte Fusion von kleinen Liposomvesikeln und die Ether-Infusions-Verfahren, die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Ein Verfahren erzeugt multilamellare Vesikel von heterogener Größe. Bei diesem Verfahren werden die vesikelbildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelsystem gelöst und im Vakuum oder einem inerten Gas getrocknet, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Falls gewünscht, kann der Film wieder in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise einem tertiären Butanol, gelöst und dann lyophilisiert werden, um ein homogeneres Lipidgemisch zu bilden, das in einer leichter hydratisierten pulverförmigen Form vorliegt. Dieser Film ist mit einer wässrigen gepufferten Lösung bedeckt und wird normalerweise über einen Zeitraum von 15 bis 60 Minuten unter Rühren hydratisieren gelassen. Die Größenverteilung der sich ergebenden multilamellaren Vesikel kann durch Hydratation der Lipide unter kräftigerem Rühren oder durch Zugabe von Lösungsdetergenzien, wie beispielsweise Desoxycholat, zu kleineren Größen hin verlagert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden multilamellare Liposome durch die Umkehrphasenverdampfungsmethode von Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978) erzeugt.
  • Unilamellare Vesikel werden allgemein durch Beschallung oder Extrusion hergestellt. Eine Beschallung wird generell mit einem Spitzen-Sonifier, wie beispielsweise einem Branson-Spitzensonifier, in einem Eisbad durchgeführt. Typischerweise wird die Suspension mehreren Beschallungszyklen unterworfen. Eine Extrusion kann mittels Biomembran-Extruder, wie beispielsweise dem Lipex Biomembrane Extruder, durchgeführt werden. Eine bestimmte Porengröße in den Extrusionsfiltern kann unilamellare liposomale Vesikel von bestimmten Größen erzeugen. Die Liposomen können auch durch Extrusion mittels eines asymmetrischen Keramikfilters, wie beispielsweise eines Ceraflow Microfilter, der im Handel von Norten Company, Worcester, MA, erhältlich ist, gebildet werden.
  • Anschließend an eine Liposomenherstellung können die Liposome, die während der Bildung nicht dimensioniert wurden, dimensioniert werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung von Liposomengrößen zu erzielen. Ein Größenbereich von etwa 0,2 bis 0,4 μm ermöglicht es der Liposomensuspension, durch Filtration mittels eines herkömmlichen Filters, typischerweise eines 0,22 μm Filters, sterilisiert zu werden. Das Filtersterilisationsverfahren kann auf einer hohen Durchsatzbasis durchgeführt werden, wenn die Liposomen auf eine Größe von etwa 0,2–0,4 μm dimensioniert wurden.
  • Mehrere Verfahren stehen zum Dimensionieren von Liposomen auf eine gewünschte Größe zur Verfügung. Ein Dimensionierungsverfahren ist in den US-Patenten Nr. 4 529 561 oder 4 737 323 beschrieben. Die Beschallung einer Liposomensuspension entweder durch Bad- oder durch Sondenbeschallung erzeugt eine progressive Größenreduzierung bis hinunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln von unter etwa 0,05 μm Größe. Eine Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf der Scherenergie beruht, um große Liposome in kleinere aufzuspalten. Bei einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsionshomogenisierer wieder zugeführt, bis ausgewählte Liposomengrößen, typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 μm, beobachtet werden. Die Größe der liposomalen Vesikel kann durch quasielektrische bzw. quasielastische Lichtstreuung (QELS) bestimmt werden, wie in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421–450 (1981) beschrieben. Der mittlere Liposomendurchmesser kann mittels Beschallung von gebildeten Liposomen reduziert werde. Unterbrochene Beschallungszyklen können sich mit einer QELS-Bewertung abwechseln, um eine wirksame Liposomensynthese zu begleiten.
  • Die Liposomenextrusion durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine asymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren zur Reduzierung der Liposomengrößen auf eine relativ gut begrenzte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals durch die Membran geführt, bis die gewünschte Liposomengrößenverteilung erzielt ist. Die Liposomen können durch aufeinander folgende kleinerporige Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Reduzierung der Liposomengröße zu erreichen. In der vorliegenden Erfindung kommen Liposomen mit einer Größe von etwa 0,05 μm bis etwa 0,15 μm zur Verwendung. Besonders bevorzugt sind Liposome mit einer Größe von etwa 0,05 bis 0,5 μm.
  • Immunoliposomengehalte
  • Bei dem therapeutischen Agens, das verwendet werden kann, handelt es sich um jede Verbindung, einschließlich den unten aufgeführten, die bei einem geeigneten Beladungsfaktor stabil in Liposomen eingeschlossen und bei einer therapeutisch wirksamen Dosis (nachfolgend nach jeder Verbindung in Klammern angegeben, m2 bezieht sich auf die Körperoberfläche) verabreicht werden können. Sie umfassen amphipathische Antitumorverbindungen, wie beispielsweise die Pflanzenalkaloide Vincristin (1,4 mg/m2), Vinblastin (4–18 mg/m2) und Etoposid (35–100 mg/m2), und die Anthracyclin-Antibiotika, einschließlich Doxorubicin (60–75 mg/m2), Epirubicin (60–120 mg/m2) und Daunorubicin (25–45 mg/m2). Die wasserlöslichen Antimetabolite, wie beispielsweise Methotrexat (3 mg/m2), Cytosinarabinosid (100 mg/m2) und Fluoruracil (10–15 mg/kg), die Antibiotika, wie beispielsweise Bleomycin (10–20 Einheiten/m2, Mitomycin (20 mg/m2), Plicamycin (25–30 μg/m2) und Dactinomycin (15 μg/m2) und die Alklyierungsmittel, einschließlich Cyclophosphamide und Derivate davon (3–25 mg/kg), Thiotepa (0,3–0,4 mg/kg) und BCNU (150–200 mg/m2) sind in diesem Zusammenhang auch von Nutzen. Andere geeignete Medikamente umfassen Aclacinomycin, Idarubicin, Mitoxantron, Cisplatin und andere Platin-II-Analoge. Die Liposome können auch die Taxane, einschließlich Taxol, Taxoter, Dihydroxytaxane, Camptothecine und andere Taxanderivate und -isolate enthalten. Darüber hinaus können die Liposome verkapselte tumortherapeutische Peptide (z.B. pflanzliche oder bakteriell abgeleitete Toxine) und Proteinmedikamente, wie beispielsweise IL-2 und/oder TNF, und/oder Immunmodulatoren, wie beispielsweise M-CSF, die allein oder in Kombination mit Antitumormedikamenten, wie beispielsweise Anthracyclin-Antiobiotika-Medikamente, vorliegen, enthalten. Die Immunoliposome können fluoriertes Pyramidin und Purinbasen oder Nukleoside enthalten. Die Immunoliposome können auch Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonucleotide, aufweisen, die natürliche oder modifizierte Basen enthalten und eine Phosphodiester-Internucleotid-Verbindung oder modifizierte Internucleotid-Verbindungen, wie beispielsweise ein Phosphorthioat oder Polyamidverbindungen, enthalten. Der Fachmann wird feststellen, dass Nukleinsäuren als antisense- oder triplexbildende Moleküle verwendet werden können, um die Transkription und die Translation durch Bindung von DNA oder RNA zu blockieren. Alternativ können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Zellen zu transformieren und die Expression von heterologen Proteinen zu induzieren. In diesem letzteren Zusammenhang wird die Nukleinsäure eine Expressionskassette umfassen, die die Nukleinsäuresequenz aufweist, die das Protein kodiert, das unter der Kontrolle eines Promotors exprimiert werden soll.
  • Beladen von Immunoliposomen mit therapeutischen Zusammensetzungen
  • Die Verfahren des Beladens von Liposomen mit herkömmlichen Medikamenten sind dem Fachmann bekannt. Die bekanntesten Verfahren umfassen eine Verkapselungstechnik und das Transmembranpotentialbeladungsverfahren. Bei der Verkapselungstechnik wird das Medikament im Puffer angeordnet, aus dem sich die Liposomen ergeben. Das letztere Verfahren ist ausführlich im US-Patent Nr. 4 885 172, dem US-Patent Nr. 5 059 421 und dem US-Patent Nr. 5 171 578 beschrieben worden.
  • Kurz gesagt kann das Transmembranpotentialbeladungsverfahren mit im Wesentlichen jedem herkömmlichen Medikament verwendet werden, das in einem geladenen Zustand existieren kann, wenn es in einem geeigneten wässrigen Medium gelöst ist. Vorzugsweise ist das Medikament relativ lipophil, so dass es sich in die Liposomenmembranen aufteilt. Ein Transmembranpotential wird über die Doppelschichten der Liposomen oder Zielkomponenten-Liposomkonjugate geladen und das Medikament wird mittels des Transmembranpotentials in das Liposom geladen. Das Transmembranpotential wird durch Erzeugen eines Konzentrationsgradienten über die Membranen für ein oder mehr geladene Arten gebildet (z.B. Na+, K+ und/oder H+). Dieser Konzentrationsgradient wird durch Erzeugen von Liposomen oder Zielkomponenten-Liposomkonjugate mit unterschiedlichen internen und externen Medien gebildet. Daher wird für ein Medikament, das positiv geladen ist, wenn es ionisiert ist, über die Membranen ein Transmembranpotential erzeugt, das ein inneres Potential aufweist, das bezüglich des äußeren Potentials negativ ist, während für ein Medikament, das negativ geladen ist, die entgegengesetzte Orientierung verwendet wird.
  • Untersuchen der Bluthalbwertszeit.
  • Eine der Anforderungen für die Liposomenlokalisierung in einem Zielgewebe ist eine ausgedehnte Immunoliposomenlebensdauer im Blutstrom nach der Verabreichung. Ein Maß für die Immunoliposomenlebensdauer im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, das eine definierte Zeit nach der Liposomenverabreichung bestimmt wird. Typischerweise werden Immunoliposome, die eine Markierung enthalten (z.B. Fluoreszenzmarker, elektronendichtes Reagens oder radioaktiver Marker), entweder intern im Liposom oder gebunden an ein Lipid, das das Liposom umfasst, in den Testorganismus injiziert. Nach einer bestimmten Zeit wird der Organismus geopfert und die Menge an Markierung, die im Blut festgestellt wird (z.B. durch Messung der Lumineszenz oder Szintillationszählung) wird mit dem in bestimmten Geweben (z.B. Leber oder Milz) lokalisierten verglichen.
  • Der Zeitverlauf der Retention von Immunoliposomen im Blut kann auch einfach durch Probenahme von Blut in bestimmten Intervallen nach der Verabreichung von Markierung enthaltenden Liposomen und durch Festlegung der Menge an Markierung, die in der Zirkulation verbleibt, bestimmt werden. Das Ergebnis kann als Fraktion der ursprünglichen Dosis ausgedrückt werden.
  • Untersuchung der Aufnahme von Zielzellen in das Zytoplasma und Bestimmung der Gewebeverteilung
  • Die Aufnahme und Internalisierung von Immunoliposomen in das Zytoplasma von Zielzellen kann in ähnlicher Weise durch die Verabreichung von eine Markierung (z.B. einen Fluoreszenzmarker, ein elektronendichtes Reagens oder einen radioaktiver Marker) enthaltenden Immunoliposomen und anschließendes Feststellen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Markierung im Zytoplasma der Zielzelle bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein Immunoliposom, enthaltend einen Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise Rhodamin, das mit dem Lipid konjugiert ist, das das Liposom selbst bildet, dem Organismus oder einfach den Zellen in der Kultur verabreicht werden. Die Gewebe oder Zellen können dann fixiert und die Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie festgestellt werden. In ähnlicher Weise kann eine elektronendichte Markierung (z.B. Gold) verwendet werden und mittels Elektronenmikroskopie festgestellt werden. Der Fachmann wird feststellen, dass viele Markierungen geeignet sind und das Bestimmungsverfahren die Wahl der Markierung reflektiert.
  • Untersuchung für die antiproliferative Aktivität von Immunoliposomen
  • Die vorliegende Erfindung sieht wachstumshemmende Immunoliposome mit einem Antikörperfragment vor, das speziell mit einem HER2-Rezeptor bindet. Die Identifikation von Immunoliposomen, die besonders wirksame Inhibitoren einer Zellproliferation sind, können mit routinemäßigem Screening erzielt werden. Dies beinhaltet das Bereitstellen einer Zellkultur, in der die Zellen einen HER2-Rezeptor tragen, der die Zellen in der Kultur mit dem zu testenden Immunoliposom kontaktiert, und das Messen der sich ergebenden Änderung der Zellproliferationsrate. Mittel zum Messen der Zellproliferationsrate sind dem Fachmann bekannt.
  • Bei einem Ansatz kann zum Beispiel die Proliferationsrate direkt durch Messen der Änderung der tatsächlichen Zellzahl über einen festen Zeitraum bestimmt werden. Daher wurden, wie im Beispiel 3 veranschaulicht ist, Tumorzellen, wie beispielsweise SK-BR-3- oder TB-474-Zellen, in einer Monoschichtkultur wachsen gelassen und dann bei 37°C mit unterschiedlichen Konzentrationen von Immunoliposomen auf der Grundlage eines Antikörpergehalts inkubiert. Nach einer kontinuierlichen Behandlung über 4 Tage wurden die Zellmonoschichten mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett-Farbstoff (0,5 % in Methanol) zur Bestimmung der relativen Proliferation gefärbt, wie zuvor beschrieben (Hudziak u.a., Mol. Cell Biol. 9: 1165–1172 (1989), der hier durch Bezugnahme aufgenommen wird).
  • Alternativ ist es bekannt, dass eine Erhöhung der Zellproliferationsrate typischerweise von einer Erhöhung der metabolischen Rate begleitet ist. Daher kann die Proliferation indirekt durch Messung der Änderungen der metabolischen Rate von Zellen, die dem zu testenden Immunoliposom ausgesetzt sind, bestimmt werden.
  • Zahlreiche Mittel zum Messen der metabolischen Rate sind dem Fachmann bekannt. Ein besonders bevorzugter Ansatz ist es, die Aufnahmerate eines markierten metabolischen Vorläufers, wie beispielsweise tritiummarkiertes Thymidin, zu messen. Kurz gesagt wird dies durch Verabreichen von [3H]-Thymidin an eine Testkultur, die das Immunoliposom enthält, und an eine Kontrollkultur, der das Immunoliposom fehlt, erzielt. Nach einem bestimmten Zeitraum werden Zellen gesammelt und die Menge an [3H]-Thymidin, die durch die Zellen aufgenommen wird, wird mittels Standardverfahren (z.B. Szintillationszählen) gemessen. Ein Vergleich der Test- und Kontrollzellen zeigt Änderungen der metabolischen Aktivität und daher die Proliferationsrate.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Immunoliposome der Erfindung umfassen, werden gemäß Standardverfahren hergestellt und umfassen weiter einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Im Allgemeinen wird eine normale Kochsalzlösung als pharmazeutisch verträglicher Träger verwendet. Andere geeignete Träger sind z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin und dergleichen, einschließlich Glyocproteine zur Erhöhung der Stabilität, wie beispielsweise Albumin, Lipoprotein, Globulin usw. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert werden. Die sich ergebenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie beispielsweise pH-Anpassungs- und Puffermittel, Tonizitätsanpassungsmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw. Darüber hinaus kann die Liposomensuspension Lipid schützende Agenzien umfassen, die Lipide vor freien Radikalen und Lipid-peroxidativen Schäden während der Lagerung schützen. Lipophile frei-radikalische Quencher, wie beispielsweise alpha-Tocopherol und wasserlösliche eisenspezifische chelatbildende Verbindungen, wie beispielsweise Ferrioxamin, sind geeignet.
  • Die Konzentration von Immunoliposomen in den pharmazeutischen Formulierungen kann stark differieren, d.h. von unter etwa 0,05 Gew.-%, gewöhnlich um oder mindestens etwa 2–5 Gew.-% bis über 10 bis 30 Gew.-%, und wird primär durch Fluidvolumen, Viskositäten usw. in Übereinstimmung mit dem bestimmten ausgewählten Verabreichungsweg ausgewählt. Zum Beispiel kann die Konzentration erhöht werden, um die Fluidbeladung, die mit der Behandlung in Verbindung steht, zu senken. Dies kann besonders wünschenswert bei Patienten sein, die einen mit Atherosklerose verbundenen kongestiven Herzfehler oder starken Bluthochdruck haben. Alternativ können Immunoliposome, die aus reizenden Lipiden zusammengesetzt sind, zu niedrigen Konzentrationen verdünnt werden, um die Entzündung an der Verabreichungsstelle zu verringern. Die verabreichte Immunoliposomenmenge hängt von dem bestimmten verwendeten Antikörperfragment, dem behandelten Krankheitszustand, dem verabreichten therapeutischen Agens und dem Urteil des Klinikarztes ab. Im Allgemeinen reicht die Menge an verabreichten Immunoliposomen aus, um eine therapeutisch wirksame Dosis des bestimmten pharmakologischen Agens zu geben. Die Menge an Immunoliposomen, die notwendig ist, um eine therapeutisch wirksame Dosis zu verabreichen, kann durch Aufnahmeuntersuchungen bestimmt werden, wie oben beschrieben. Therapeutisch wirksame Dosen für verschiedene pharmakologische Agenzien sind dem Fachmann bekannt und repräsentative Bereiche sind für eine Zahl von obigen Pharmazeutika gegeben. Typische Immunoliposomdosierungen liegen im Allgemeinen zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg/kg Körpergewicht.
  • Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, d.h. intraartikulär, intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär, verabreicht. Besonders bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös oder intraperitoneal durch eine Bolusinjektion verabreicht. Besondere Formulierungen, die für diese Verwendung geeignet sind, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Ausg. (1985) gefunden. Typischerweise umfassen die Formulierungen eine Lösung der Liposomen, die in einem verträglichen Träger suspendiert sind, vorzugsweise in einem wässrigen Träger. Eine Auswahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9 % isotonische Kochsalzlösung und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden oder steril filtriert werden. Die sich ergebenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung so wie sie sind verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie erforderlich ist, um sich physiologischen Zuständen anzunähern, wie beispielsweise eine pH-Wertanpassung und Puffermittel, Tonizitätsanpassungsmittel, Netzmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitmonolaurat, Triethanolamin, Oleat usw.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele dienen zu Veranschaulichung, nicht aber um die vorliegende Erfindung zu beschränken.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Liposomen und Immunoliposomen
  • A) Materialien
  • Eiphosphatidylcholin (EPC) wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL); Cholesterin (Chol) von Calbiochem (San Diego, CA); N-Tris[hydroxymethyl]-2-aminoethansulfonsäure (TES) von Sigma; hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC) von Natterman (Köln, Deutschland); Rhodamin-markierte Phospholipide von Avanti; Desferrioxaminmesylat (Desferal) von Ciba-Geigy (Summit, NJ); Doxorubicin von Farmitalia, Carblo Erba (Mailand, Italien) oder Cetus (Emeryville, CA); und N-[4p-maleimidophenyl)butyryl]phosphatidylethanolamin (M-PE) von Molecular Probes (Portland, OR) gekauft. Mittels PEG (Mr = 1900) derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) wurde wie beschrieben synthetisiert (Allen u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1066: 29–36 (1991)), und von Liposome Technology, Inc. (Menlo Park, CA) erhalten.
  • B) Herstellung von Fab'-Fragmenten
  • Klonierte rhuMAbHER2-Sequenzen für die schwere und leichte Kette wurden zusammen in E. coli exprimiert, wie zuvor beschrieben (Carter u.a., Biotechnology 10: 163–167 (1992)). Das Antikörperfragment rhuMAbHER2-Fab' wurde von E. coli-Fermentationspasten durch Affinitätschromatographie mit Streptokokkenprotein G gewonnen (Carter u.a., Biotechnology, 10: 163–167 (1992)), das typischerweise Fab' ergab, wobei reduziertes freies Thiol in 60–90 % enthalten war (Fab'-SH). Als Kontrolle wurde ein irrelevantes humanisiertes Fab' verwendet. Von einem anti-CD 18 Maus monoklonalen Antikörper stammend unterscheidet sich rhuMAbH42-Fab' von rhuMAbHER2-Fab' nur durch den Ersatz der antigenbindenden Schleifen und zeigte keine feststellbare Bindung mit einem bekannten Maus oder humanen Antigen (Eigenbrot u.a., Proteins: Structure, Function, and Genetics, 18: 49–62 (1994)).
  • C) Herstellung von Liposomen
  • Liposome wurden gemäß dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978) hergestellt, wobei die Lipidzusammensetzung EPC:Chol (2:1) aufwies, oder, wo angegeben, HSPC:Chol (3:2) und PEG-PE (0–6 Mol-%). Liposome wurden anschließend wiederholt unter positiven Druck mit Argongas durch Polycarbonatmembranfilter von definierter Porengröße sequentiell von 0,1 bis 0,05 μm extrudiert (Olson u.a., Biochim. Biophys. Acta, 55: 9–23 (1979); Szoka u.a., Biochem. Biophys. Acta, 601: 559–571 (1980)). Dieses Verfahren ergibt Liposome von 60–120 nm Durchmesser, wie durch dynamische Lichtstreuung bestimmt. Die Liposomenkonzentration wurde durch Phosphatuntersuchung bestimmt (Bartlett, J. Biol. Chem., 234: 466–468 (1959)). Für die Immunoliposompräparate wurde 2 Mol-% M-PE (des gesamten Phospholipids) in das Lipidgemisch in Chloroform vor der Liposomenherstellung aufgenommen (Martin und Papahadjopoulos, J. Biol. Chem., 257: 286–288 (1982)). Liposome ohne verkapseltes Doxorubicin wurden in HEPES-NaCl-Puffer, pH 7,2, 300 mOSm hergestellt. HSPC/Chol-Liposome, die Doxorubicin enthielten, wurden in 250 mM Ammoniumsulfat mit 1 mM Desferal bei einem pH-Wert von 5,5 hergestellt. Nicht verkapseltes Ammoniumsulfat wurde durch Gelfiltration mit G-75 Sephadex entfernt. Doxorubicin in Pulverform wurde dann in dieser Liposomensuspension bei 0,1 mg Doxorubicin/μmol Phospholipid gelöst (Papahadjopoulos u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991); Huang u.a., Cancer Res., 52:6774–6781 (1992)), wodurch Doxorubicin im Inneren des Liposoms festgehalten wird (Lasic u.a., FEBS Lett., 312: 255–258 (1992)). Die Wirksamkeit der Medikamentenbeladung über den Salzgradienten war hoch und erreichte > 99 % Beladung, wenn 1 mg Medikament pro 10 μmol Phospholipid verwendet wurde.
  • Fab' wurde mit den Liposomen nach der Medikamentenbeladung über die Thioetherverbindung konjugiert, wie zuvor beschrieben (Martin u.a., J. Biol. Chem., 257: 286–288 (1982). Da Maleimid bei einem niedrigen pH stabiler ist, wurden alle Verfahren bei einem pH von 5,5 durchgeführt. Nicht reagiertes Fab' wurde von Immunoliposomen durch Gelfiltration mit Sephacryl S-400 getrennt. Die Maleimidgruppe auf Immunoliposomen wurde nach Konjugation mit einem 2-fachen Überschuss an Mercaptoethanol mit M-PE deaktiviert. Die Menge an konjugiertem Fab' wurde durch den BioRad-Proteinassay bestimmt.
  • Vier Arten von Liposomen wurden hergestellt. „Herkömmliche" Liposomen ohne Antikörper wurden aus Phosphatidylcholin und Cholesterin allein zusammengesetzt. „Sterisch stabilisierte" Liposomen enthielten zusätzlich PEG-PE. Immunoliposome wurden durch Konjugation des obigen mit Fab'-Fragmenten, die vom humanisierten Antikörper rhuMAbHER2 stammten, hergestellt, um herkömmliche oder sterisch stabilisierte Immunoliposome zu ergeben. Fab'-Fragmente und nicht intakter Antikörper wurden aus den folgenden Gründen verwendet: 1) rhuMAbHER2-Fab'-Fragmente können als rekombinante Proteine in E. coli bei äußerst hoher Wirksamkeit exprimiert werden (Carter u.a., supra); 2) die freie Thiolgruppe in der Fab'-Gelenkregion sieht eine sofort verfügbare Stelle für die kovalente Anlagerung an modifizierte Liposomen vor und liegt von der Antigenbindungsstelle entfernt; und 3) rhuMAbHER2-Fab' hat eine weitaus geringere antiproliferative Aktivität als intaktes rhuMAbHER2, und daher war es von Interesse zu sehen, ob die Anlagerung von anti-p185HER2-Fab' an Liposome diese Aktivität wieder herstellen würde. Typischerweise führte die Konjugation zu ungefähr 50–100 Fab'-Molekülen pro Liposomenpartikel.
  • Beispiel 2
  • Immunoliposomenbindung
  • Die Fähigkeit von anti-p185HER2-Immunoliposomen, in vitro an Brustkrebszellen zu binden, die den p185HER2-Rezeptor überexprimieren, wurde mit zwei Verfahren bewertet; einem flusszytometrischen Assay und einem kompetitiven Bindungsassay. Für den flusszytometrischen Assay wurden SK-BR-3-Zellen, die hohe Niveaus an p185HER2 exprimieren, oder MCF-77-Zellen für 45 Minuten anti-p185HER2-Immunoliposomen auf Eis ausgesetzt, mit PBS gewaschen, mit einem sekundären anti-humanen Antikörper gefärbt, um gebundene Immunoliposome (FITC-markiertes Ziegen anti-humanes IgG) festzustellen, erneut mit PBS gewaschen und dann einer Flusszytometrie unterworfen (1). SK-BR-3-Zellen haben signifikante Mengen entweder an herkömmlichen oder sterisch stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposomen gebunden, allerdings keine Kontrollliposome, denen Fab' fehlt. MCF-7-Brustkrebszellen, die p185HER2 nicht überexprimieren, zeigten eine minimale Bindung an anti-p185HER2-Immunoliposome (Daten nicht gezeigt).
  • Eine andere Bindungsmaßnahme wurde durch den kompetitiven Bindungsassay geleistet, bei dem SK-BR-3- (Brustkrebszellen) oder BT-474-Zellen in Monoschichtkultur gleichzeitig mit 125I-markiertem rhuMAbHER2 oder muMAb4D5 bei 0,1 nM 18 Stunden lang bei 4°C und steigenden Konzentrationen an anti-p185HER2-Immunoliposomen inkubiert wurden (2). Gebundene Zählungen wurden durch gamma-Zählung bestimmt. Anti-p185HER2-Immunoliposome verlagerten wirksam die Bindung von rhuMAbHER2 sowohl an SK-BR-3-Zellen (Daten nicht gezeigt) als auch an BT-474-Zellen (die auch hohe Niveaus an p185HER2 exprimieren). Eine Näherung der Bindungsaffinität wurde über die Scatchard-Analyse der Bindungsdaten durch Aufstellen der Hypothese, dass Fab' sich auf Immunoliposomen als freier Ligand verhielt, erhalten. Unter Verwendung dieses Modells waren offensichtliche Bindungskonstanten für die Immunoliposome mit denen von freiem (d.h. nicht liposomalem) rhuMAbHER2-Fabl oder intaktem rhuMAbHER2 vergleichbar. Herkömmliche oder sterisch stabilisierte (6 Mol-% PEG-PE) Kontrollliposome, denen Fab' fehlte, zeigten eine vernachlässigbare Bindung. Eine Zusammenfassung der Bindungsdaten ist in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1. Bindung von anti-P185HER2-Immunoliposomen an BT-474-Zellen.
    Figure 00340001
  • Beispiel 3
  • Antiproliferative Aktivität der „wachstumsinhibierenden" Immunoliposome
  • Um die antiproliferative Wirkung von Immunoliposomen allein ohne eingekapselte Medikamente zu testen, wurden Tumorzellen, wie beispielsweise SK-BR-3- oder BT-474-Zellen, in einer Monoschichtkultur wachsen gelassen und dann bei 37°C mit verschiedenen Immunoliposomenkonzentrationen auf der Grundlage eines Antikörpergehalts inkubiert. Nach kontinuierlicher Behandlung für 4 Tage wurden die Zellmonoschichten mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett-Farbstoff (0,5 % in Methanol) zur Bestimmung der relativen Proliferation gefärbt, wie zuvor beschrieben (Hudziak u.a., Mol. Cell Biol. 9: 1165–1172 (1989)).
  • Während intaktes (bivalentes) rhuMAbHER2 das Wachstum von p185HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen in einer Monoschichtkultur hemmte, sind monovalente Fab'-Fragmente dieses Antikörpers (rhuMAbHER2-Fab') viel weniger wirksam bei der Wachstumshemmung (O'Connell u.a., Seiten 218–239, in: Protein Folding In Vivo and In Vitro, Cleland JL, Hrsg. Washington, D.C., American Chemical Society, (1993)). Diese Beobachtung legte nahe, dass eine Vernetzung von p185HER2-Rezeptoren durch einen bivalenten Antikörper für die antiproliferative Wirkung wichtig ist, und dadurch ergab sich die Frage, ob eine liposomale Verankerung von rhuMAbHER2-Fab'-Fragmenten die antiproliferative Wirkung von Fab' durch erhöhte wirksame Valenz verbessern könnte.
  • Die Wirkung von anti-p185HER2-Immunoliposome auf SK-BR-3-Zellen in einer Monoschichtkultur wurde getestet und mit rhuMAbHER2 und rhuMAbHER2-Fab' verglichen (3). Die Behandlung mit herkömmlichen oder sterisch stabilisierten Kontrollliposomen, denen Fab' fehlt, beeinflusste das Zellwachstum nicht signifikant. Im Gegensatz dazu hemmten sowohl die herkömmlichen als auch die sterisch stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposome das Wachstum in einer dosisabhängigen Weise. Der wachstumshemmende Effekt der Immunoliposome erreichte ein Plateau von etwa 30 % Wachstumshemmung (70 % Kontrollwachstum), was den 40 Wachstumshemmung nahe kommt, die bei freiem intaktem rhuMAbHER2 festgestellt werden. Im Gegensatz dazu induzierte freies rhuMAbHER2-Fab' nur eine mäßige Wachstumshemmung. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit p185HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen erhalten (Daten nicht gezeigt).
  • Es ist beachtenswert, dass das mit Liposomen verbundene rhuMAbHER2-Fab' eine deutlich größere antiproliferative Wirkung als dieselbe Menge an rhuMAbHER2-Fab', das sich frei in Lösung befand, erzeugte. Eine plausible Erklärung dafür ist, dass eine liposomale Verankerung von rhuMAbHER2-Fab' die Vernetzung von p185HER2 ermöglicht, wodurch eine biologische Wirkung hervorgerufen wird, die mit dem intakten bivalenten Antikörper vergleichbar ist.
  • Beispiel 4
  • Zytotoxizität von anti-p185HER2-Immunoliposomen, die Doxorubicin enthalten
  • Obwohl leere anti-p185HER2-Immunoliposome eine antiproliferative Wirkung gegenüber p185HER2-überexprimierende Brustkrebszellen in der Kultur zeigten, war es möglich, den antineoplastischen Effekt der Immunoliposomen zu steigern, indem man sie mit zytotoxischen Agenzien belud und so ein gezieltes Medikamentenabgabesystem erzeugte. Doxorubicin wurde wegen des vorklinischen und klinischen Nachweises verwendet, was nahe legt, dass Doxorubicin besonders nützlich gegen Brustkrebs überexprimierendes p185HER2 sein kann, mit oder ohne begleitende Immuntherapie. Es war daher von Interesse, die Zytotoxizität und die Spezifität von Doxorubicin-beladenen anti-p185HER2-Immunoliposomen gegen p185HER2-überexprimierende Brustkrebszellen und gegen nicht maligne Zellen, die p185HER2 nicht überexprimieren, zu bestimmen.
  • Wegen der wirksamen Internalisierung, die durch p185HER2-Immunoliposome gezeigt wurde (siehe Beispiel 5), wurde erwartet, dass die Liposomen genauso wirksam beim Abtöten von p185HER2-überexprmierende Brustkrebszellen in der Kultur sein könnten wie freies Doxorubicin, ein kleines (Molekulargewicht 544) amphipathisches Molekül, das ohne weiteres durch die Zellmembran hindurchgeht. Andererseits würden Zellen, die p185HER2 nicht überexprimieren, während sie gegenüber freiem Doxorubicin empfindlich sind, einer zytotoxischen Beschädigung von mit Doxorubicin beladenden anti-p185HER2-Immunoliposomen wegen der Unfähigkeit der Immunoliposomen, sie als Ziel auszuwählen, entgehen.
  • Um die Zytotoxizität von mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen zu testen, wurden SK-BR-3- oder WI-38-Zellen in Monoschichtkultur mit freiem Doxorubicin oder mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen 1 Stunde lang inkubiert und dann ausgiebig mit Medien gewaschen. Die Zellen wurden dann weiter bei 37°C 3 Tage lang inkubiert, wonach die Zellzahl durch Kristallviolettfärbung bestimmt wurde, wie oben beschrieben. Ein Vergleich mit anderen Zellwachstumsassays einschließlich Alamar-Blau-Färbung, MTT-Färbung und direkte Zellzählung, führte im Wesentlichen zu denselben Ergebnissen.
  • Die Ergebnisse der SK-BR-3-Zellen, die 1 Stunde lang mit verschiedenen mit Doxorubicin beladenen Immunoliposompräparaten behandelt wurden, sind in der 4 gezeigt. Unter diesen Bedingungen ist die antiproliferative Wirkung von rhuMAbHER2 nicht offensichtlich, da sie es erfordert, dass die Zellen kontinuierlich rhuMAbHER2 ausgesetzt werden (Hudziak u.a., Mol. Cell Biol., 9: 1165–1172 (1989)). Die Behandlung mit freiem Doxorubicin für 1 Stunde führte zu einer signifikanten Zytotoxizität mit einem IC50 von ungefähr 0,3 μg/ml. Mit Doxorubicin beladene anti-p185HER2-Immunoliposome zeigten eine vergleichbare dosisabhängige Zytotoxizität mit einem IC50 von ungefähr 0,2 μg/ml für herkömmliche anti-p185HER2-Immunoliposome und ungefähr 1,0 μg/ml für sterisch stabilisierte (2 Mol-% PEG-PE) anti-p185HER2-Immunoliposome. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass die anti-p185HER2-Immunoliposomabgabe von Doxorubicin an p185HER2-überexprimierende Zellen in der Kultur ein so wirksames Verfahren wie die schnelle Diffusion von freiem Doxorubicin in die Zellen war. Mit Doxorubicin beladene anti-p185HER2-Immunoliposome waren zwischen 10- und 30-fach zytotoxischer als mit Doxorubicin beladene Immunoliposome, die irrelevantes Fab' trugen, was nur das Zellwachstum bei relativ hohen Konzentrationen beeinflusste (> 3,3 μg/ml).
  • WI-38-Zellen, eine nicht maligne Lungenfibroblast-Zelllinie, die minimale Niveaus an p185HER2 exprimiert, wurden auch mit Doxorubicin und mit Doxorubicin beladenen anti-p185HER2-Immunoliposomen behandelt (4B). Freies Doxorubicin erzeugte wieder eine signifikante dosisabhängige Zytotoxizität gegenüber WI-38-Zellen. Allerdings erzeugten mit Doxorubicin beladene anti-p185HER2-Immunoliposome eine stark reduzierte (20-fach geringere) Zytotoxizität gegenüber diesen Zellen und waren von mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen, die irrelevantes Fab' trugen, nicht unterscheidbar. Diese Ergebnisse haben die Spezifität einer anti-p185HER2-Immunoliposomenbehandlung für p185HER2-überexprimierende Ziele gezeigt und weiter bestätigt, dass die Zytotoxizität, die gegenüber SK-BR3-Zellen beobachtet wurde, nicht nur einfach aufgrund des Strömens von Doxorubicin aus den anti-p185HER2-Immunoliposomen und in die Lösung erfolgte.
  • Beispiel 5
  • Internalisierung von Immunoliposomen in das Zytoplasma der Zielzelle
  • Um die Internalisierung von Immunoliposomen in das Zytoplasma der Zielzelle durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zu bestimmen, wurden Liposome und Immunoliposome wie im Beispiel 1 mit der Zugabe von Rhodaminphosphatidylethanolamin bei 1 Mol-% der Phospholipidkomponenten hergestellt. Die sich ergebenden mit Rhodamin markierten Liposome oder Immunoliposome wurden für unterschiedliche Zeitdauern bei 37°C mit SK-BR-3-Zellen inkubiert, die bis zur Subkonfluenz auf den Deckgläsern wachsen gelassen wurden. Die Zellen wurden dann mit 3 % Paraformaldehyd fixiert, in 90 % Glycerin/100 mM Tris, pH 8,5, enthaltend 0,1 % p-Phenylendiamin (Sigma) als Antibleichreagens aufgebaut und mit einem Leitz Aristoplan Fluoreszenzmikroskop oder einem Molecular Dynamics MultiProbe 2001 konfokalen Mikroskop beobachtet.
  • Um die Internalisierung und intrazelluläre Disposition durch Elektronenmikroskopie zu bestimmen, wurden Immunoliposome mit kolloidalen Goldpartikeln von 5–15 nm beladen, wie zuvor beschrieben (Huang u.a., Cancer Res., 52: 5135–5143 (1992); Straubinger u.a., Cell, 32: 10639–1079 (1983). Gold enthaltende Immunoliposome wurden bei 37°C mit SK-BR-3-Zellen inkubiert, die auf Deckgläsern über verschiedene Zeiträume wachsen gelassen wurden, und die Zellen wurden dann fixiert und für die Elektronenmikroskopie bearbeitet. Eine Stabilisierung der Liposome wurde mittels Gerbsäure in der primären Fixierung erzielt (Straubinger u.a., supra), was eine angemessene wenngleich nicht optimale Konservierung der Ultrastruktur vorsah.
  • Der Antikörper rhuMAbHER2 wird schnell durch p185HER2-überexprimierende Tumorzellen über rezeptorvermittelte Endocytose internalisiert (Sarup u.a., Growth Regul. 1: 72–82 (1991)). Um zu bestimmen, ob anti-p185HER2-Immunoliposome in SK-BR-3-Zellen internalisiert werden, wurden Zellen mit Rhodamin markierten Immunoliposomen über unterschiedliche Zeitdauern behandelt, fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. SK-BR-3-Zellen, die mit herkömmlichen oder sterisch stabilisierten Kontrollliposomen, denen Fab' fehlte, behandelt wurden, zeigten weder an der Oberfläche noch im Inneren eine Rhodaminfluroreszenz, was mit der Unfähigkeit der Kontrollliposome, an die Zellen zu binden, konsistent ist. Bei Behandlung mit herkömmlichen anti-p185HER2-Immunoliposomen zeigten SK-BR-3-Zellen innerhalb einer Behandlungsdauer von 30 Minuten intensive Fluoreszenzherde sowohl an der Zelloberfläche als auch intrazellulär. Durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurde bestätigt, dass Rhodaminfluoreszenz sowohl an der Zelloberfläche als auch internalisiert im Zytoplasma von SK-BR-3-Zellen vorhanden war. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit sterisch stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposomen, die hohe Konzentrationen an PEG-PE (6 Mol-%) enthielten, nach 30 Minuten zu einer minimalen intrazellulären Fluoreszenz. Weil es schien, dass das Vorhandensein von PEG-PE die Immunoliposominternalisierung retardierte, wurden sterisch stabilisierte Immunoliposome mit reduzierten Konzentrationen an PEG-PE bewertet. Immunoliposome, die 2 Mol-% PEG-PE enthielten, ergaben nach 30 Minuten einen dazwischen liegenden Grad an intrazellulärer Fluoreszenz, d.h. weniger als mit herkömmlichen Immunoliposomen gesehen aber mehr als mit 6 Mol-% PEG-PE enthaltenden Immunoliposomen gesehen. Trotz einer etwas retardierten Internalisierung reicherten sich bei längerer Inkubationszeit, wie beispielsweise 2 Stunden, die sterisch stabilisierten Immunoliposome, die 2 % PEG-PE enthielten, intrazellulär an. Daher wurde, während anti-p185HER2-Immunoliposome in SK-BR-3-Zellen internalisiert wurden, die Internalisierungsrate umgekehrt auf den PEG-PE-Gehalt der Immunoliposome bezogen.
  • Um die intrazelluläre Disposition von Immunoliposomen und ihren Gehalt zu untersuchen, wurde eine Elektronenmikroskopie mittels Immunoliposomen, die verkapselte kolloidale Goldpartikel enthielten, durchgeführt. SK-BR-3-Zellen, die 30 Minuten lang mit herkömmlichen anti-p185HER2-Immunoliposomen behandelt wurden, zeigten zahlreiche Gold enthaltende Immunoliposome, die an die Zelloberfläche gebunden waren und intrazellulär vorhanden waren. Es wurden viele Immunoliposome benachbart zu und offensichtlich gebunden an die Zellmembran beobachtet. Einige Immunoliposome wurden in überzogenen Vertiefungen sowie in überzogenen Vesikeln, Endosomen, multivesikulären Körpern und Lysosomen gefunden. Diese intrazelluläre Verteilung stimmt mit der Internalisierung über den Überzugsvertiefungsweg überein. Allerdings wurden auch Immunoliposome beobachtet, die offensichtlich mit der Zellmembran verschmolzen, und zwar ohne die Ausbildung einer überzogenen Vertiefung. Darüber hinaus tauchten einige Goldpartikel frei im Zytoplasma auf und waren nicht mit einer liposomalen Kapsel oder einer membrangebundenen Organelle verbunden. Goldpartikel, die frei im Zytoplasma auftraten, könnten von Fusionsereignissen zwischen Immunoliposomen und der Zellmembran herrühren. Alternativ können sie anschließend an eine Endocytose entstanden sein, wobei ein Entkommen der eingekapselten Goldpartikel irgendwo entlang des Überzugvertiefungswegs auftritt.
  • Beispiel 6
  • In vivo Tumor Lokalisierung und Bioverteilung von Immunoliposomen und Immunoliposomengehalt
  • Jungen (4–6 Wochen) weiblichen SCID-Mäusen wurden BT-474-Zellen in das subkutane Gewebe der Flanke oder der Brustfettpolster injiziert und die Tiere zusätzlich mit subkutan implantierten Östrogenkügelchen behandelt, um das Tumorwachstum dieser Zellen zu unterstützen. Wenn die palpierbaren Tumoren eine Größe von mindestens 300 mm3 erreicht hatten (normalerweise 14 Tage nach der Inokulation), wurden Immunoliposome durch eine einzelne intravenöse Injektion (über die Schwanzvene) oder eine einzelne intraperitoneale Injektion in einem Volumen von ungefähr 200 μl, enthaltend ungefähr I μmol an gesamtem Lipid verabreicht. Die Tiere wurden zu festgelegten Zeiten nach der Injektion geopfert, die Organe mit Kochsalzlösung in situ durchschwemmt und die Gewebe sofort für eine Analyse operativ entfernt. Für die Bioverteilung und Bildanalyse nach der Injektion von mit Rhodamin markierten Immunoliposomen wurden frisch operativ entfernte Gewebe fixiert und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Für die quantitative Lokalisierung von Doxorubicin, das durch Immunoliposome abgegeben wurde, wurden operativ entfernte Gewebe homogenisiert und einer azidifizierten Ethanolextraktion unterworfen; das extrahierte Doxorubicin wurde dann durch spektrofluorimetrische Untersuchung gemessen, wie zuvor beschrieben (Gabizon u.a., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1484–1488 (1989)).
  • Die Bioverteilung von anti-p185HER2-Immunoliposomen und ihre Fähigkeit, sich auf Tumore zu begrenzen und dort in vivo anzureichern, wurde in einem Tumor-Heterotransplantatmodell bestimmt. In diesem Modell wurden immunodefiziente Mäuse, die etablierte subkutane BT-474-Tumor-Heterotransplantate trugen, durch eine einzelne intravenöse oder intraperitoneale Injektion mit Immunoliposomen behandelt. Bilduntersuchungen mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie wurden durchgeführt, um mit Rhodamin markierte Immunoliposome in verschiedenen Geweben von Tieren, die nach der Behandlung geopfert wurden, zu finden. Innerhalb von 6 Stunden intravenöser Injektion wurde eine Rhodaminfluoreszenz im Heterotransplantattumor sichtbar gemacht, während keine signifikante Fluoreszenz im umgebenden Muskel beobachtet wurde. Diese Technik erlaubte allerdings keine präzise Darstellung von Immunoliposomen im Tumorgewebe. Für eine quantitative Bestimmung der Bioverteilung und Lokalisierung von durch Immunoliposome abgegebenes Doxorubicin wurde Doxorubicin von Gewebeextrakten von behandelten Tieren untersucht. 24 Stunden nach der intraperitonealen Injektion hatte Doxorubicin, das durch sterisch stabilisierte anti-p185HER2-Immunoliposome abgegeben wurde, sich in den Tumorheterotransplantaten angereichert, wobei niedrigere Niveaus an Doxorubicin in dem umgebenden Muskel und im Blut gefunden wurden (Tabelle 2).
  • Tabelle 2. anti-p185HER2-Immunoliposomabgabe von Doxorubicin in vivo: Bioverteilung 24 Stunden nach einer einzelnen ip-Injektion.
    Figure 00410001
  • Beispiel 7
  • Herstellung von Fab' tragenden Immunoliposomen auf PEG
  • Um das spezifische Anvisieren und die Internalisierung der Immunoliposome der vorliegenden Erfindung zu verbessern, wurden tumorspezifische Fab'-Fragmente (rhuMAbHEr2-Fab') mit distalen Enden von mit Liposomen transplantierten Polyethylenglycolketten über Sulfhydryl-reaktive Maleimidgruppen konjugiert. Um die Linkergruppe (Maleimid) für eine Reaktion mit SII von Fab' vorzusehen, wurde α-Distearoylphosphatidylethanolaminocarbonyl-ω-malimidopropionylamidopolyethylenglycol aus Distearoylphosphatidylethanolamin und einem heterobifunktionellem PEG-Derivat (N-Hydroxysuccinimidyl-PEG-Maleimid) gemäß Standardverfahren synthetisiert. Das Maleimid-Derivat von PEG-PE wurde wie oben beschrieben in die Liposomenherstellung aufgenommen, und das Fab'-Fragment wurde mit dem Liposom über die Sulfhydrylgruppe bei einem pH von 7,2 konjugiert.
  • Die Liposomzusammensetzung war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass M-PE entfernt wurde, da es nicht länger für die Verbindung des Antikörperfragments notwendig war. Typischerweise lag PEG (PEG-PE) im Bereich von etwa 10 bis etwa 12 Mol-% des gesamten Phospholipids und Fab'-konjugiertes PEG-derivatisiertes Lipid lag im Bereich von etwa 0,6 Mol-% bis etwa 1 Mol-% des gesamten Lipids.
  • In der Kultur der HER-überexprimierenden Brustkrebszellen hatten solche anti-Her2 sterisch stabilisierten Liposome dieselbe Bindungs- und Internalisierungswirksamkeit unabhängig von der Menge an mit Polyethylenglycol modifiziertem Phospholipid.

Claims (14)

  1. Immunoliposom, welches in eine Zelle, die einen HER2-Wachstumsfaktorrezeptor trägt, internalisiert wird, wobei das Immunoliposom umfasst: ein Antikörperfragment, das spezifisch an den HER2-Rezeptor bindet, wobei das Fragment mit einem hydrophilen Polymer verbunden ist, ein amphipathisches vesikelbildendes Lipid, wobei das vesikelbildende Lipid ein Liposom bildet; ferner ein hydrophiles Polymer; wobei das Immunoliposom in die Zelle internalisiert wird, wenn das Immunoliposom mit der Zelle in Kontakt gebracht wird.
  2. Immunoliposom nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymer ein Polyethylenglykol (PEG)-derivatisiertes Lipid ist.
  3. Immunoliposom nach Anspruch 2, wobei das Polyethylenglykol ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 750 D und 5000 D aufweist.
  4. Immunoliposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Antikörperfragment eine Fab'-Domäne ist.
  5. Immunoliposom nach Anspruch 4, wobei die Fab'-Domäne eine humanisierte Fab'-Domäne eines monoklonalen Antikörpers ist.
  6. Immunoliposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das vesikelbildende Lipid aus einem Phospholipid, einem Glykolipid, einem Sphingolipid und einem Sterin ausgewählt ist.
  7. Immunoliposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner ein therapeutisches Agens umfasst.
  8. Immunoliposom nach Anspruch 7, wobei das therapeutische Agens ausgewählt ist aus Daunomycin, Idarubicin, Mitoxantron, Mitomycin, Cisplatin und anderen Platin II-Analoga, Vincristin, Epirubicin, Alacinomycin, Methotrexat, Etoposid, Doxorubicin, Cytosin, Arabinosid, Fluorouracil und anderen fluorierten Pyrimidinen, Purinen, oder Nucleosiden, Bleomycin, Mitomycin, Plicamycin, Dactinomycin, Cyclophosphamid und Derivaten davon, Thiotepa, BCNU, Taxol, Taxoter und anderen Taxan-Derivaten und -Isolaten, Camptothecinen, Polypeptiden, einer Nukleinsäure, einer Nukleinsäure mit einer Phosphorothioat-Internukleotidverbindung, und einer Nukleinsäure mit einer Polyamid-Internukleotidverbindung.
  9. Immunoliposom nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das Antikörperfragment mit dem distalen Ende des PEG-derivatisierten Distearoylphosphatidylethanolamins (DSPE) verbunden ist.
  10. Immunoliposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hydrophile Polymer in einer Menge von bis zu 3,6 Mol-% der gesamten Lipide vorhanden ist.
  11. Immunoliposom nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Verwendung in einem Verfahren zum Internalisieren des therapeutischen Agens in die Zelle, welche den HER2-Rezeptor trägt, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zelle mit dem Immunoliposom umfasst, wobei das Kontaktieren zur Internalisierung des Agens in die Zelle führt.
  12. Immunoliposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Wachstumsinhibierung der Zelle, welche den HER2-Rezeptor trägt, durch Kontaktieren der Zelle mit dem Immunoliposom.
  13. Verwendung des Immunoliposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Wachstumsinhibierung der Zelle, welche den HER2-Rezeptor trägt.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Immunoliposom nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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