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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Liposome. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung Liposome, die einen typischen
Marker auf Zielzellen speziell anvisieren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
gibt eine Anzahl von pharmazeutischen Agenzien und potentiellen
pharmazeutischen Agenzien, die an einer schlechten Wasserlöslichkeit,
hohen Niveaus an Antigenität,
Toxizität
oder einem schnellem Abbau im Serum leiden, wodurch die Entwicklung
von geeigneten klinischen Formulierungen behindert werden kann.
Eine Lösung
für diese
Probleme ist es, das pharmazeutische Agens in einem Abgabevehikel
einzuschließen,
das in wässrigen
Lösungen
löslich
ist und das das Agens vor dem direkten Kontakt mit Geweben und Blut
abschirmt. Insbesondere sind Formulierungen auf der Grundlage der
Liposomentechnologie von erheblichem Interesse. Liposome sind Vesikel,
die aus konzentrisch angeordneten Phospholipid-Doppelschichten bestehen, die eine wässrige Phase
einschließen.
Sie werden spontan gebildet, wenn Phospholipide wässrigen
Lösungen
ausgesetzt werden, und können
eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen aufnehmen.
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Liposome
haben sich als wertvolles Hilfsmittel als in vivo Abgabesystem zur
Erhöhung
der Wirksamkeit von verschiedenen pharmakologisch aktiven Molekülen erwiesen
(Ostro u.a., Liposomes from Biophysics to Therapeutics, Dekker,
New York, Seite 1–369
(1987)). Tierstudien haben gezeigt, dass Liposome die Toxizität von mehreren
antitumoralen und antifungalen Medikamenten senken können, was
zu klinischen Studien mit viel versprechenden Ergebnissen geführt hat
(Sculier u.a., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24: 527–538; Gabizon
u.a., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 25: 1795–1803 (1989); Treat u.a., J.
Natl. Cancer Inst., 82: 1706–1710 (1990);
Lopez- Berestein
u.a., J. Infect. Dis., 151: 704–710
(1985); Presant u.a., Cancer, 62: 905–911 (1988)). Darüber hinaus
hat sich gezeigt, dass Liposome wirksame Träger von antiparasitischen Medikamenten
zur Behandlung von intrazellulären
Infektionen des retikuloendothelialen Systems (RES), bei der Aktivierung
von Makrophagenzellen zum Abtöten
von Tumorzellen, bei Metastasemodellen und bei der Erhöhung der
Immunreaktion auf eingeschlossene Antigene sind, wodurch die Zubereitung
von künstlichen
Vakzinen erleichtert wird (Liposomes in the Therapy of Infectious
Diseases and Cancer, Lopez-Berestein & Fidler, Hrsg. Liss, New York (1989);
Alving u.a., Immunol. Lett., 25: 275–280 (1990)).
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Alle
diese Wirkungen rühren
von der Fähigkeit
von Makrophagenzellen in der Leber und der Milz her (mononukleäres phagozytisches
System MPS oder retikuloendotheliales System RES), die Mehrzahl
der Liposome aus dem Blutkreislauf innerhalb von Minuten zu entfernen
(Liposomes as Drug Carriers, Gregoriadis, Hrsg., Wiley, New York
(1988)). Eine solche schnelle Freisetzung von Liposomen hat allerdings
ihre Aussichten als in vivo Abgabesystem zum Transport von Medikamenten
an die erkrankten Stellen über
das RES hinaus beschränkt.
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Neuere
Berichte haben die Verwendung von verschiedenen Polymeren zur Erhöhung der
Serumshalbwertzeit von Liposomen beschrieben. Insbesondere ist festgestellt
worden, dass Formulierungen von Liposomen, die entweder Monosialogangliosid
(GM1) oder Lipidderivative von Polyethylenglycol
enthalten, eine Beseitigung von MPS vermeiden und deutlich die Serumshalbwertzeit
erhöhen
(Allen u.a., FEBS Lett., 223: 42–46 (1987); Klibanov u.a.,
FEBS Lett., 268: 235–237
(1990); Blume u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1029: 91–97 (1990);
Allen u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1066: 29–36 (1991); Papahadjopoulos
u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991); Senior u.a.,
Biochim. Biophys. Acta, 1062: 77–82 (1991); Allen u.a., Biochim.
Biophys. Acta, 1068: 133–141
(1991)).
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Viele
Berichte haben gezeigt, dass die schnelle Beseitigung von zirkulierenden
Liposomen in vivo durch Zellen des mononukleären phagozytischen Systems
(MPS) durch Einarbeitung von Lipiden, die mit dem hydrophilen Polymer
Polyethylenglycol (PEG) derivatisiert sind, überwunden werden kann. Diese
Liposome werden als sterisch stabilisiert oder „verdeckte" Liposome bezeichnet. Wenn PEG ein Molekulargewicht
im Bereich von 1000 bis 5000 aufweist, wird eine verlängerte Zirkulation
und reduzierte MPS-Aufnahme erzielt (Woodle & Lasic, Biochim. Biophys. Acta, 1113:171–199 (1992)).
Allerdings steht diese Verringerung der Freisetzung auch mit einer
Reduzierung der Aufnahme durch eine Vielzahl von Zellen in Verbindung
(Lee, K.D. u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1103:185–197 (1992)).
Darüber
hinaus scheint das Vorhandensein von hydrophilen Polymeren an der
Liposomoberfläche
die spezifische Ligandenerkennung durch Zielkomponenten, die mit dem
Liposom konjugiert sind, zu stören.
Vermutlich tritt dies aufgrund einer sterischen Behinderung der
Wirkstelle der Zielkomponente durch die langkettigen PEG-Moleküle auf.
(Klibanov u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1062: 148–148 (1991)).
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Schließlich ist
es, obwohl die meisten therapeutischen Agenzien, die mittels Liposomen
transportiert werden, in das Zytoplasma der Zielzelle eindringen
müssen,
um ihre biologische Wirksamkeit zu exprimieren, allgemein erwünscht, dass
die meisten Liposome entweder nicht wirklich von den Zielzellen
internalisiert werden, oder, wenn eine Aufnahme auftritt, erfolgt
diese allgemein über
einen endozytotischen Weg. Daher bedingt das eigentliche Medikament
für die
Zielzelle typischerweise die Freisetzung vom Liposom (z.B. durch Auseinanderreißen des
Liposoms selbst oder durch „Auslaufen") in der Nachbarschaft
der Zielzelle und dann die nachfolgende Aufnahme (entweder durch
Diffusion, Endozytose, Phagozytose oder aktiven Transport) des therapeutischen
Agens aus der Lösung
durch die Zielzelle. Tatsächlich
sind Immunoliposome ausgebildet worden, um eigentlich die Destabilisierung
und Fragmentierung des Liposoms zu induzieren, sobald der Zielantikörper mit
einem Ziel verbunden ist, wodurch der Liposomengehalt frei wird
(siehe US-Patent Nr. 4 957 735). Selbst diese „zielempfindlichen" Liposome verlieren
eine beträchtliche
Menge an therapeutischem Agens in Lösung, bevor letzteres von der
Zielzelle aufgenommen werden kann. Alternativ wird das Liposom,
wenn es durch ein endozytotisches Verfahren internalisiert wird,
schließlich
in ein Lysosom aufgenommen, bei dem starke Säurebedingungen vorherrschen,
die eine Anzahl therapeutischer Agenzien (z.B. Proteine) abbauen können.
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Daher
wird die Abgabe von wirksamen Dosen an therapeutischen Agenzien
an das Zytoplasma der Zielzelle durch niedrige Verweilzeiten im
Serum, uneffektives Anvisieren bei erhöhten Verweilzeiten, einen beträchtlichen
Verlust an therapeutischem Agens in Lösung, bevor es von der Zielzelle
aufgenommen werden kann, und den Abbau des therapeutischen Agens
im endosomalen/lysosomalen Weg behindert. Es wäre natürlich wünschenswert, ein Liposom mit
erhöhter
Serum-Halbwertzeit
zu erhalten, das in der Lage ist, bestimmte Zellen besonders anzuvisieren,
und das auch in der Lage ist, von den Zielzellen in das Zytoplasma
internalisiert zu werden, wodurch ein Verlust an therapeutischem
Agens oder ein Abbau über
den endosomalen/lysosomalen Weg vermieden wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Immunoliposome zur Verfügung, die
zur Abgabe von therapeutischen Agenzien an das Zytoplasma einer
Zielzelle optimiert sind. Diese Immunoliposomen zeigen eine erhöhte Halbwertzeit
im Blut, sind in der Lage, bestimmte Zellen speziellen anzuvisieren
und können
durch die Zielzellen in das Zytoplasma internalisiert werden, wodurch
ein Verlust an therapeutischen Agenzien oder ein Abbau über den
endolysosomalen Weg vermieden wird.
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Daher
stellt die Erfindung ein Immunoliposom zur Verfügung, das in eine Zelle, die
einen HER2-Wachstumsfaktorrezeptor trägt, internalisiert wird, wobei
das Immunoliposom umfasst:
ein Antikörperfragment, das spezifisch
an den HER2-Rezeptor bindet, wobei das Fragment mit einem hydrophilen
Polymer verbunden ist,
ein amphipathisches vesikelbildendes
Lipid, wobei das vesikelbildende Lipid ein Liposom bildet;
ferner
ein hydrophiles Polymer;
wobei das Immunoliposom in die Zelle
internalisiert wird, wenn das Immunoliposom mit der Zelle in Kontakt gebracht
wird.
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Das
Antikörperfragment
ist vorzugsweise eine Fab'-Domäne. Das
hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein mit Polyethylenglycol (PEG)
derivatisiertes Lipid. Das PEG hat vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht
zwischen etwa 750 D und 5000 D, besonders bevorzugt zwischen etwa
1200 D und etwa 3000 D, ganz besonders bevorzugt von etwa 1900 D.
Das derivatisierte Lipid ist vorzugsweise bei bis zu etwa 12 Mol-%,
besonders bevorzugt bei bis zu etwa 2,4 Mol-% und ganz besonders
bevorzugt bei bis zu etwa 3,6 Mol-% des gesamten Lipids vorhanden.
Die Fab'-Domäne kann
eine humanisierte Fab'-Domäne eines
monoklonalen Antikörpers
sein. Das Immunoliposom kann weiter ein mit Maleimid derivatisiertes
Phosphatidylethanolamin (M-PE) umfassen, das eine Thioetherverbindung
mit der Fab'-Domäne eines
Antikörpers
bildet. Das vesikelbildende Lipid kann ein Phospholipid, ein Glycolipid,
ein Sphingolipid oder ein Sterin sein. Die Immunoliposomen haben
vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 50 nm bis
500 nm, besonders bevorzugt 75 nm bis 300 nm, und ganz besonders
bevorzugt ist er etwa 100 nm. Das Liposom kann ein therapeutisches
Agens umfassen. Therapeutische Agenzien im Liposom können Daunomycin,
Idarubicin, Mitoxantron, Mitomycin, Cisplatin und andere Platin
II-Analoga, Vincristin, Epirubicin, Aclacinomycin, Methotrexat,
Etoposid, Doxorubicin, Cytosinarabinosid, Fluoruracil und andere
fluorierte Pyrimidine, Purine oder Nukleoside, Bleomycin, Mitomycin,
Plicamycin, Dactinomycin, Cyclophosphamid und Derivate davon, Thiotepa,
BCNU, Taxol, Taxoter und andere Taxanderivate und -isolate, Camptothecine,
Polypeptide, eine Nukleinsäure,
eine Nukleinsäure
mit einer Phosphorthioat-Internukleotid-Verbindung, und eine Nukleinsäure mit
einer Polyamid-Internukleotid-Verbindungaufweisen.
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In
einem bevorzugten Immunoliposom ist die Antikörper-Fab'-Domäne
die von rhuMAbHER2, wobei die Fab'-Domäne
an mit Maleimid derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (M-PE) konjugiert
ist, das vesikelbildende Lipid ist Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterin
(Chol) und das mit Polyethylenglycol derivatisierte Lipid ist mit
Polyethylenglycol derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE),
wobei die Polyethylenglycol-Komponente ein Molekulargewicht von
etwa 1900 D aufweist und wobei das Verhältnis PC:Chol:M-PE 150:100:3
beträgt
und das PEG-PE in einer Menge von bis zu etwa 3,6 Mol-% des gesamten
Lipids vorhanden ist.
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Bei
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
kann die Antikörper-Fab'-Domäne mit dem
distalen Ende des mit Polyethylenglycol derivatisierten Lipids verbunden
sein. In diesem Fall kann das Immunoliposom ein mit Polyethylenglycol
derivatisiertes Lipid enthalten, wobei in diesem Fall die Fab'-Domäne vorzugsweise mit
nur einem kleinen Anteil der mit PEG derivatisierten Lipide verbunden
ist, oder alternativ kann das Immunoliposom zwei oder mehr unterschiedliche
Arten von mit PEG derivatisierten Lipiden enthalten, wobei in diesem
Fall eine Art von mit PEG derivatisiertem Lipid als Linker für die Fab'-Antikörperdomäne dienen
kann, während
das andere mit PEG derivatisierte Lipid, das vorzugsweise in einer
höheren
Konzentration vorhanden ist, eine „sterische" Stabilisierung vorsieht, wodurch die
Liposomfreisetzungsrate reduziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das mit dem mit PEG derivatisierte Lipid verbundene Fab' 0,6 Mol-% bis 1
Mol-% des gesamten Phospholipids, während das gesamte mit PEG derivatisierte
Lipid 10 Mol-% bis 12 Mol-% des gesamten Phospholipids umfasst.
Das Fab' ist vorzugsweise
mit dem PEG-PE oder mit dem PEG-DSPE verbunden.
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Die
Immunoliposome der Erfindung können
in einem Verfahren zur Internalisierung des therapeutischen Agens
in die Zelle, die den HER2-Rezeptor trägt, verwendet werden, wobei
das Verfahren das Kontaktieren der Zelle mit den Immunoliposomen
umfasst, wobei das Kontaktieren zur Internalisierung des Agens in die
Zelle führt.
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Die
Immunoliposome der Erfindung können
auch bei einem Verfahren zur Wachstumsinhibierung einer Zelle, die
einen HER2-Rezeptor trägt,
durch Kontaktieren der Zelle mit den Liposomen verwendet werden.
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Bei
einer noch anderen Ausführungsform
sieht die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung
vor, die ein oben beschriebenes Immunoliposom aufweist. Die pharmazeutische
Zusammensetzung umfasst eine therapeutisch wirksame Dosis des Immunoliposoms
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Exzipienten.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
die flusszytometrischen Histogramme, die die Bindung von anti-p185HERZ-Immunoliposome mit SK-BR-3-Zellen zeigen.
Immunoliposome, die nach dem Waschen mit SK-BR-3-Zellen verbunden
sind, wurden mittels FITC-markiertem
Ziegen anti-humanem IgG erfasst, der rhuMAbHER2-Fab'-Fragmente erkennt.
SK-BR-3-Zellen wurden mit herkömmlichen
Immunoliposomen (A), sterisch stabilisierten (6 Mol-% PEG-PE) Immunoliposomen
(B) und freien rhuMAbHER-2-Fab'-Fragmenten (C) bei äquivalenten
Antikörperkonzentrationen
(3,3 μg/ml)
inkubiert.
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2 zeigt
die Bindung von herkömmlichen
anti-p185HER2-Liposomen mit BT-474-Zellen. (A) BT-474-Zellen
in einer Monoschichtkultur wurden mit herkömmlichen Immunoliposomen in
Gegenwart von konkurrierenden mit 125I markiertem
rhuMabHER2 behandelt, wie in Methoden beschrieben. (B) Die Scatchard-Transformation der
Daten ist in (A) gezeigt.
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3 zeigt
die antiproliferative Aktivität
von anti-p185HER''-Immunoliposomen
gegenüber
SK-BR-3-Zellen. SK-BR-3-Zellen in Monoschichtkultur wurden mit Immunoliposomen
bei Antikörperdosen,
die auf der Abszisse angegeben sind, und einer relativen Zellproliferation,
die wie in Methoden beschrieben bestimmt wurde, behandelt. Kontrollliposome
ohne Antikörper
wurden gemäß der Liposomenkonzentration
dosiert und werden bei einer äquivalenten
Liposomenkonzentration gegen das in geeigneter Weise angepasste
Immunoliposom aufgetragen. Herkömmliche
Kontrollliposome (ohne Antikörper);
sterisch stabilisierte (6 Mol-% PEG-PE) Kontrollliposome; herkömmliche
Immunoliposome; sterisch stabilisierte anti-p185HER2-Immunoliposome
(6 Mol-% PEG-PE); freies (nicht liposomales) rhuMAbHER2-Fab'; und freier bivalenter
rhuMAbHER2-Antikörper
sind wie in dem Schlüssel
angegeben gezeigt.
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4 zeigt die Zytotoxizität von anti-p185HER2-Immunoliposomen, die Doxorubicin enthalten.
HSPC: Chol-Immunoliposome wurden mit Doxorubicin beladen, wie in
Methoden beschrieben. (A) SK-BR-3-Zellen. (B) WI-38-Zellen. Behandlung
von Zellen in Kultur 1 Stunde lang mit: herkömmlichen Immunoliposomen (Dreiecke);
sterisch stabilisierten (2 Mol-% PEG-PE) Immunoliposomen (schwarze
Kreise); sterisch stabilisierten (2 Mol-% PEG-PE) Kontrollimmunoliposomen
(irrelevanter Antikörper)
(weiße
Kreise); oder freiem Doxorubicin allein (schwarze Quadrate). Die
Immunoliposome enthielten 60–70 μg Antikörper/μmol Phospholipid
und 55–80 μg Doxorubicin/μmol Phospholipid;
das Antikörper/Doxorubicin-Verhältnis betrug
0,8–1,2.
Die Zellen wurden 3 Tage nach der Behandlung gezählt, wie in Methoden beschrieben.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Definitionen
und allgemeine Parameter
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Die
folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung und den
Umfang der verschiedenen Begriffe, die zur Beschreibung der Erfindung
verwendet werden, zu veranschaulichen und zu definieren.
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Die
folgenden Abkürzungen
werden hier verwendet: DOX, Doxorubicin; Chol, Cholesterin; PA,
Phosphatidinsäure;
PC, Phosphatidylcholin; PI, Phosphatidylinosit; SM, Sphingomyelin;
M-DPE, mit Maleimid derivatisiertes Dipalmityolethanolamin; PBS,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung;
LUV, große
unilamellare Vesikel; MLV, multilamellare Vesikel; PE, Phosphatidylethanolamin;
PEG, Polyethylenglycol; PEG-PE,
mit Polyethylenglycol derivatisiertes Phosphatidylethanolamin.
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Der
Begriff „amphipathisches
vesikelbildendes Lipid" soll
jedes amphipathische Lipid mit hydrophoben und polaren Kopfgruppenkomponenten
umfassen und kann selbst spontan Doppelschichtvesikel im Wasser ausbilden,
wie durch Phospholipide beispielhaft gezeigt, oder (b) wird stabil
in Lipid-Doppelschichten in Kombination mit Phospholipiden eingearbeitet,
wobei die hydrophobe Komponente sich in Kontakt mit der inneren, hydrophoben
Region der Doppelschichtmembran befindet und die polare Kopfgruppenkomponente
zur äußeren, polaren
Membranoberfläche
hin gerichtet ist. Ein Beispiel für letztere Art des vesikelbildenden
Lipids sind Cholesterin und Cholesterinderivate, wie beispielsweise
Sulfat und Cholesterinhemisuccinat.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff „spezifische Bindung" die Bindung, die
zwischen solchen gepaarten Arten wie Enzym/Substrat, Rezeptor/Agonist,
Antikörper/Antigen
und Lectin/Kohlenhydrat auftritt, die durch kovalente oder nicht kovalente
Wechselwirkungen oder eine Kombination aus kovalenten und nicht kovalenten
Wechselwirkungen vermittelt werden kann. Wenn die Wechselwirkung
der beiden Arten einen nicht kovalent gebundenen Komplex erzeugt,
ist die auftretende Bindung typischerweise elektrostatisch, wasserstoffbindend
oder das Ergebnis von lipophilen Wechselwirkungen. Demgemäß tritt
eine „spezifische
Bindung" zwischen
einer gepaarten Art auf, bei der es eine Wechselwirkung zwischen
den beiden gibt, die einen gebundenen Komplex mit den Charakteristika
einer Antikörper/Antigen-
oder Enzym/Substrat-Wechselwirkung erzeugt. Insbesondere ist die
spezifische Bindung durch die Bindung eines Elements eines Paars
an eine bestimmte Art und an keine andere Art innerhalb der Familie
von Verbindungen gekennzeichnet, zu der das entsprechende Element
der Bindungselemente gehört.
Daher bindet zum Beispiel ein Antikörper vorzugsweise an ein einzelnes
Epitop und an kein anderes Epitop in der Proteinfamilie.
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Der
Begriff „Immunoliposom" betrifft ein Liposom,
das einen Antikörper
oder ein Antikörperfragment trägt, das
als Zielkomponente wirkt und es möglicht macht, dass das Liposom
spezifisch an ein bestimmtes „Ziel"-Molekül bindet,
das in Lösung
vorkommen oder an die Oberfläche
einer Zelle gebunden sein kann. Wenn das Zielmolekül typischerweise
in relativem Überschuss
vorgefunden wird (z.B. >10-fach)
und in Verbindung mit einer bestimmten Zellart oder alternativ in
einer Vielzahl von Zellarten, die alle einen bestimmten physiologischen
Zustand exprimieren, dann gilt das Zielmolekül als „charakteristischer Marker" dieses Zelltyps
oder dieses physiologischen Zustands. Daher kann zum Beispiel ein
Krebs durch Überexpression
eines bestimmten Markers, wie beispielsweise des HER2 (c-erbB-2/neu)-Protoonkogens
im Fall von Brustkrebs, gekennzeichnet sein.
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Ein „hydrophiles
Polymer", wie es
hier verwendet wird, betrifft langkettige, stark hydratisierte flexible neutrale
Polymere, die mit Lipidmolekülen
verbunden sind. Beispiele umfassen mit Polyethylenglycol und Polypropylenglycol
modifizierte Lipide, Phosphatidylinsoit (PI), Cerebrosidsulfat (CS)
und Monosialogangliosid (GM1), sind aber
nicht darauf beschränkt.
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Der
Begriff „Mol-%", wenn er den prozentualen
Anteil des hydrophilen Polymers in einem Liposom bezeichnet, wird
in Bezug auf das gesamte Lipid im Liposom exprimiert, wenn nicht
anders angegeben. Daher stellt in einem Liposom, umfassend ein Verhältnis von
Phosphatidylcholin (PC) zu Cholesterin (Chol) von 150:100, ein 4
Mol-% hydrophiles Polymer (z.B. PEG) ein Verhältnis von PC:Chol:PEG von etwa
150:100:10 dar.
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Der
Begriff „Proliferation" betrifft die Zellteilung
oder Mitose. Die Proliferation kann durch Standardverfahren, wie
beispielsweise durch die Aufnahme von radioaktiven Nukleotiden (Thymidin),
oder durch direkte Beobachtung gemessen werden.
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Immunoliposome
in der Medikamentenabgabe
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Wie
oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung Immunoliposome
zur selektiven Abgabe von therapeutischen Agenzien für spezifische
Gewebe in einem Wirt und Verwendungen dieser Liposome zur Verfügung. Die
Liposome der vorliegenden Erfindung verwenden eine Zusammensetzung,
die die Internalisierung des Liposoms in das Zellzytoplasma des
Zielgewebes optimiert. Der Ausdruck „optimiert die Internalisierung" oder „optimale
Internalisierung" wird
verwendet, um auf die Abgabe des Liposomengehalts zu verweisen,
so dass eine maximale Abgabe an das Zytoplasma der Zielzelle und
daher eine maximale therapeutische Wirkung erzielt wird. Es wird
davon ausgegangen, dass die Internalisierung eines Immunoliposoms
in das Zytoplasma einer Zelle eine Funktion der Bluthalbwertszeit
des Liposoms, die Fähigkeit
des Liposoms seine Zielzelle zu erkennen and daran zu binden, und
die Aufnahme des Liposoms in das Zytoplasma der Zielzelle ist. Es
ist bekannt, dass die Zugabe eines hydrophilen Polymers zu Liposomen
die Serumshalbwertszeit durch Senken sowohl der Liposomenagglomeration
(Aggregation) als auch der Liposomenaufnahme durch das RES erhöht. Ohne
an eine Theorie gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass die
hydrophilen Polymere in hohen Konzentrationen die Erkennung und
Bindung durch die Zielkomponente oder den Ligand und die anschließende Aufnahme
durch die Zielzelle stören,
wodurch die Internalisierung des Liposomengehalts durch die Zielzelle
gesenkt wird. Die optimale Internalisierung in das Zytoplasma der
Zelle bezeichnet den Zustand, in dem die maximale Aufnahme in das
Zytoplasma der Zielzelle erreicht ist, während eine Bluthalbwertszeit, die
deutlich größer als
die Bluthalbwertszeit von Liposomen ist, denen ein hydrophiles Polymer
fehlt und die für
die Zielzwecke angemessen ist, weiter beibehalten wird.
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Insbesondere
beruht die vorliegende Erfindung teilweise auf der unerwarteten
Entdeckung, dass ein Liposom, umfassend ein hydrophiles Polymer
(z.B. ein mit PEG modifiziertes Lipid) in einer Menge von bis zu etwa
3,6 Mol-% des gesamten (vesikelbildenden) Lipids, eine unerwartet
hohe Internalisierungsrate in das Zytoplasma der Zielzelle zeigt,
während
eine Bluthalbwertszeit beibehalten wird, die wesentlich länger als
die in Liposomen ohne ein hydrophiles Polymer festgestellte ist.
Dies gilt insbesondere dann, wenn das Immunoliposom mit Fab'-Fragmenten, die
mit ein oder mehr Lipidbestandteilen des Liposoms konjugiert werden,
anvisiert wird.
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Darüber hinaus
war es auch eine unerwartete Entdeckung, dass, wenn Liposomen, die
bis zu 3,6 Mol-% eines hydrophilen Polymers umfassen, mit einem
Fab'-Fragment eines Antikörpers als
Zielkomponente konjugiert wurden, das Liposom einen hohen Grad an
Zellspezifität
und eine Bindungsaffinität
zeigt, die größer als
die der Fab'-Fragmente
allein sind. Tatsächlich
ist die Bindungspezifität,
die durch die Immunoliposomen der vorliegenden Erfindung erzielt
werden, mit der Bindungsspezifität
des intakten Antikörpers
vergleichbar. Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, da der intakte
Antikörper
ein Tetramer ist, das ein Paar variabler Domänen-„Arme" umfasst, die zum großen Teil
für die
Antikörperspezifität und Avidität verantwortlich
sind. Fab'-Regionen,
die nur aus einem "Arm" bestehen, fehlt
typischerweise die Spezifität
und Bindungsavidität
des intakten Antikörpers.
Es wird üblicherweise
davon ausgegangen, dass sie schlechte Zielkomponenten bilden.
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Während das
Fab'-Fragment mit
jedem Teil des Liposoms konjugiert werden kann, war es eine überraschende
Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass, wenn das Fab'-Fragment mit den
distalen Enden des hydrophilen Polymers (z.B. Polyethylenglycol)
verbunden wird, hohe Internalisierungsniveaus des Liposoms durch
die Zielzelle werden erreicht, selbst wenn hohe Niveaus an hydrophilem
Polymer vorhanden sind (z.B. bis zu 15 Mol-% des gesamten Phospholipids,
besonders bevorzugt etwa 10 bis 12 Mol-% des gesamten Phospholipids).
Daher sieht in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende
Erfindung ein Liposom vor, das von einer Zielzelle internalisiert
wird, bei der das Liposom ein Fab'-Fragment aufweist, das mit den distalen Enden
eines hydrophilen Polymers, z.B. Polyethylenglycols, verbunden ist.
Das Fab'-Fragment
ist vorzugsweise selbst nicht mit der Mehrheit an hydrophilem Polymer
verbunden. Typischerweise wird das Fab' mit nur etwa 1 bis etwa 20 % des hydrophilen
Polymers, besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa 10 Mol-% des hydrophilen Polymers
und ganz besonders bevorzugt etwa 6 bis etwa 10 Mol-% des hydrophilen
Polymers, verbunden. Die das hydrophile Polymer tragenden Fab'-Fragmente (z.B.
PEG-Fab') sind daher
in etwa 0,1 bis 2,0 Mol-% des gesamten Phospholipids, besonders
bevorzugt in etwa 0,4 bis etwa 1,0 Mol-% und ganz besonders bevorzugt etwa
0,6 bis etwa 1,0 Mol-% des gesamten Phospholipids, vorhanden.
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Die
Immunoliposome der vorliegenden Erfindung optimieren die Abgabe
von therapeutischen Agenzien an das Zytoplasma der Zielzelle dadurch,
dass sie im Vergleich zu einem Liposom, dem ein hydrophiles Polymer
fehlt, eine erhöhte
Bluthalbwertszeit aufrechterhalten, dass ein hoher Grad an Zielspezifität aufrechterhalten
wird und dass eine wirksame Internalisierung des Liposoms selbst
erfolgt (Tragen des therapeutischen Agens), wodurch ein beträchtlicher
Verlust an therapeutischem Agens in Lösung oder Abbau des Therapeutikums
in dem endosomalen/lysosomalen Weg vermieden wird. Die Liposomen
der vorliegenden Erfindung sind daher besonders nützlich als
Vehikel für
die Abgabe von Therapeutika an spezifische Zielzellen.
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Immunoliposome
als Zellwachstumsinhibitoren
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Die
Immunoliposome der Erfindung können
verwendet werden, um die Tumorzellproliferation zu hemmen und so
eine Antitumoraktivität
vorzusehen, ohne dass ein wachstumsinhibierendes therapeutisches Agens
eingeschlossen wird. Tatsächlich
sind die wachstumsinhibierenden Immunoliposome der vorliegenden Erfindung
wirksam, wenn sie kein therapeutisches Agens enthalten. Die wachstumsinhibierenden
Immunoliposome der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen
die Fab'-Domäne eines
anti-HER2-monoklonalen Antikörpers.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Antikörper
das Fab'-Fragment
des humanen monoklonalen anti-HER2-Antikörpers (rhuMAbHER2-Fab'). Anders als freies
rhuMAbHer2-Fab' in
Lösung
führt die
liposomale (Membran)-Verankerung des monovalenten Fab'-Fragments zu einer
antiproliferativen und antitumoralen Aktivität vergleichbar dem bivalenten
rhuMAbHER2. Der Antikörper
rhuMAbHER2-Fab' in
Lösung hat
diese Eigenschaft nicht. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden
zu sein, wird davon ausgegangen, dass die Membranverankerung des
Fab'-Fragments im
anti-HER2-Immunoliposom diese antiproliferative Eigenschaft wahrscheinlich
durch das Ermöglichen
einer Vernetzung von p185HER2 an der Tumorzelloberfläche verleiht.
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Die
Fab'-Fragmente können mit
jedem Abschnitt des Liposoms konjugiert sein. Daher kann zum Beispiel
in einer Ausführungsform
das Fab' direkt
mit dem Liposom konjugiert sein, während in einer anderen Ausführungsform
die Fab' mit dem
hydrophilen Polymer (z.B. PEG) konjugiert sein können.
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Wie
oben angegeben, enthalten die wachstumsinhibierenden Immunoliposome
kein wachstumsinhibierendes Agens. Ein „wachstumsinhibierendes Agens" bezeichnet ein chemisches
Agens, das die Wachstumsrate von Zellen, an die es verabreicht wird,
verringert. Im extremen Fall kann ein wachstumsinhibierendes Agens
zytotoxisch für
die Zelle, an die es verabreicht wird, sein. Wie hier verwendet,
bezeichnet die Wachstumsrate von Zellen die Proliferationsrate der
Zellen. Eine erhöhte
Proliferationsrate wird typischerweise mit einer erhöhten metabolischen
Rate in Verbindung gebracht und so können die Proliferationsraten
durch Feststellen der metabolischen Raten untersucht werden (z.B.
durch Aufnahme eines markierten metabolischen Vorläufers, wie
beispielsweise tritiummarkiertes Thymidin). Daher kann eine erhöhte Wachstums-
oder Proliferationsrate als Anzeichen für eine erhöhte metabolische Rate oder
umgekehrt genommen werden.
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Wachstumsinhibierende
Agenzien sind dem Fachmann bekannt und umfassen Doxorubicin, Ricin
A, Gelonin, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist festzustellen,
dass einige Zusammensetzungen (z.B. Antibiotika) eine geringe wachstumsinhibierende
Aktivität
als zufällige
Konsequenz ihrer primären
Aktivität
zeigen können.
Solche Zusammensetzungen werden hier nicht als wachstumsinhibierende
Agenzien angesehen. Der Ausdruck ein „Liposom, das kein wachstumsinhibierendes
therapeutisches Agens enthält" soll der Tatsache Rechnung
tragen, dass die Inhibierung des Zellwachstums und die Proliferation,
die mit den wachstumsinhibierenden Immunoliposomen der vorliegenden
Erfindung erhalten wird, eine Konsequenz des Liposom/Fab'-Konstrukts selbst
ist aber keine Folge des Liposomengehalts ist. Daher bezeichnet
ein wachstumsinhibierendes Agens, wie es hier verwendet wird, ein
Agens, das, wenn es im wachstumsinhibierenden Immunoliposom vorhanden
ist, zu einer Senkung der Zellproliferationsrate führt, die
mindestens 10 % größer als
die Senkung der Zellproliferationsrate ist, die bei Verabreichen
derselben Immunoliposome, denen ein therapeutisches oder wachstumsinhibierendes
Agens fehlt, beobachtet wird.
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Während die
wachstumsinhibierenden Liposome der vorliegenden Erfindung das Zellwachstum
und die Proliferation hemmen, selbst wenn sie kein therapeutisches
Agens tragen und daher „leer" verabreicht werden
können,
wird der Fachmann feststellen, dass es erwünscht sein kann, ein therapeutisches
Agens, das kein wachstumsinhibierendes therapeutisches Agens ist,
einzuschließen,
wodurch ein Liposom erhalten wird, das doppelte, additive oder supraadditive
Aktivitäten
zeigt. Daher zeigt zum Beispiel ein Immunoliposom, das mit einem
Antibiotikum beladen ist, sowohl eine Antibiotikaaktivität als auch
die Fähigkeit,
das Wachstum und die Proliferation der Zielzellen zu hemmen.
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Die
wachstumsinhibierenden Liposome und die Immunoliposome der vorliegenden
Erfindung, die die therapeutischen Agenzien tragen, können verwendet
werden, um die Tumorzellproliferation zu hemmen oder um unter einer
Vielzahl von Wirten Therapeutika zu spezifischen Zellen hinzudirigieren.
Bevorzugte Wirte umfassen Säugetierarten,
wie beispielsweise den Menschen, nicht menschliche Primaten, Hunde,
Katzen, Westernpferde [cattle horses], Schafe, Nagetiere, Kaninchen
[largomorph] und dergleichen.
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Liposomzusammensetzung
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Die
Immunoliposome der vorliegenden Erfindung umfassen ein oder mehr
vesikelbildende Lipide, ein Antikörperfragment, das als Zielkomponente
fungiert, und ein hydrophiles Polymer. Ohne an eine bestimmte Theorie
gebunden zu sein, arbeiten die vesikelbildenden Lipide so, dass
eine Doppelschicht gebildet wird, die das therapeutische Agens einschließt, wenn
es vorhanden ist, das hydrophile Polymer dazu dient, um eine Agglomeration
der Liposomen zu verhindern und auch die Aufnahme des Liposoms durch
das RES zu senken und dadurch die Bluthalbwertszeit zu erhöhen, und
der Ligand (das Antikörperfragment)
dazu dient, die Liposomen spezifisch mit einer Zelle oder einem
Gewebe zu verbinden, das ein Ziel (d.h. einen charakteristischen Marker)
trägt,
für das
der Ligand spezifisch ist. Der niedrige molprozentuale Anteil des
hydrophilen Polymers, der mit der Verwendung des Antikörperfragments
gekoppelt ist, ermöglicht
das spezifische Anvisieren des Liposoms und führt in unerwarteter Weise zu
einem hohen Niveau an Internalisierung des ganzen Liposoms in das
Zytoplasma der Zielzelle.
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A) Vesikelbildende Lipide
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Das
vesikelbildende Lipid hat vorzugsweise zwei Kohlenwasserstoffketten,
typischerweise Acylketten, und eine polare Kopfgruppe. Zu dieser
Klasse gehören
die Phospholipide, wie beispielsweise Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin
(PE), Phosphatidinsäure
(PA), Phosphatidylinosit (PI) und Sphingomyelin (SM), wo die beiden
Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge von zwischen etwa 14–22 Kohlenstoffatome
aufweisen und unterschiedliche Grade an Ungesättigtheiten oder gesättigte Phospholipide
mit einer Kohlenstoffkette von 14–18 C-Atomen haben. In diese Klasse gehören auch
die Glycolipide, wie beispielsweise Cerebroside und Ganglioside.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Hauptlipidkomponente in den Liposomen Phosphatidylcholin.
Phosphatidylcholine mit einer Vielzahl von Acylkettengruppen von
unterschiedlicher Kettenlänge
und Sättigungsgrad
sind verfügbar
oder können
durch bekannte Verfahren isoliert oder synthetisiert werden. Im
Allgemeinen lassen sich niedriger gesättigte Phosphatidylcholine
leichter dimensionieren, insbesondere wenn die Liposome unter etwa
0,3 μm dimensioniert
werden müssen,
und zwar für
die Zwecke einer Filtersterilisation. Phosphatidylcholine, die gesättigte Fettsäuren mit
Kohlenstofflängen
im Bereich von C14 bis C22 haben, sind
bevorzugt. Phosphatidylcholine mit einfach oder doppelt ungesättigten
Fettsäuren
und Gemischen aus gesättigten
und ungesättigten
Fettsäuren
können
auch verwendet werden. Liposome, die in der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, können
auch aus Sphingomyelin oder Phospholipiden mit Kopfgruppen außer Cholin, wie
beispielsweise Ethanolamin, Serin, Glycerin und Inosit zusammengesetzt
sein. Insbesondere umfassen Phospholipide, die zur Bildung von Liposomen
geeignet sind, die für
die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin, Lecithin, β,γ-Diplamitoyl-α-lecithin, Sphingomyelin, Phosphatidylserin,
Phosphatidinsäure,
N-(2,3-Di(9-(Z)-octadecenyloxy))-prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid,
Phosphatidylethanolamin, Lysolecithin, Lysophosphatidylethanolamin,
Phosphatidylinosit, Cephalin, Cardiolipin, Cerebroside, Dicetylphosphat,
Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin,
Dioleoylphosphatidylglycerin, Palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholin,
Di-stearoyl-phosphatidylcholin, Stearoylpalmitoylphosphatdiylcholin,
Di-palmitoyl-phosphatidylethanolamin, Di-stearoylphosphatidylethanolamin,
Di-myristoyl-phosphatidylserin, Di-oleylphosphatidylcholin und dergleichen.
Nicht Phosphor enthaltende Lipide können auch in den Liposomen
der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Diese umfassen z.B. Stearylamin, Docecylamin, Acetylpalmitat, Fettsäureamide
und dergleichen. Zusätzliche
Lipide, die zur Verwendung in den Liposomen der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und werden in einer Vielzahl von
bekannten Quellen genannt, z.B. McCutcheon's Detergents and Emulsifiers und McCutcheon's Functional Materials,
Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J., die beide hier durch Bezugnahme
aufgenommen werden. Bevorzugte Liposome umfassen ein Sterin, vorzugsweise
Cholesterin, bei molaren Verhältnissen
von 0,1 bis 1,0 (Cholesterin:Phospholipid). Die am meisten bevorzugten
Liposomenzusammensetzungen sind Phosphatidylcholin/Cholesterin,
Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin, Dipalmitoylphosphatidylcholin/Cholesterin und
Sphingomyelin/Cholesterin. Kleine Mengen (d.h. < 10 %) an anderen derivatisierten Lipiden
sind oft in Liposomen, die diese Zusammensetzungen aufweisen, vorhanden.
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Gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung kann das vesikelbildende Lipid ein
relativ fluides Lipid sein, was typischerweise bedeutet, dass die
Lipidphase eine relativ niedrige flüssig-flüssig-kristalline Schmelztemperatur
hat, z.B. bei oder unter Raumtemperatur, oder ein relativ festes
Lipid, was bedeutet, dass das Lipid eine relativ hohe Schmelztemperatur
hat, z.B. bis zu 60°C.
In der Regel tragen die festeren, d.h. gesättigten Lipide, zur Membranfestigkeit
in einem Lipiddoppelschichtaufbau bei und tragen auch zu einer größeren Doppelschichtstabilität im Blut
bei. Andere Lipidkomponenten, wie beispielsweise Cholesterin, tragen
bekanntermaßen
auch zur Membranfestigkeit und -stabilität in Lipiddoppelschichtstrukturen
bei. Wie oben erwähnt,
ist ein langkettiges (z.B: C14-C22)
gesättigtes
Lipid plus Cholesterin eine bevorzugte Zusammensetzung zur Abgabe
von therapeutischen Zusammensetzungen an Zielgewebe, wie beispielsweise
solide Tumoren, da diese Liposomen nicht die Tendenz haben, die
Medikamente in das Plasma freizusetzen, da sie durch den Blutstrom zirkulieren.
Phospholipide, deren Acylketten eine Vielzahl von Sättigungsgraden
aufweisen, sind im Handel erhältlich.
Zum Beispiel kann Eiphosphatidylcholin (EPC) von Avanti Polar Lipids
(Alabaster, AL) gekauft werden und hydriertes Sojaphosphatidylcholin
(HSPC) kann von Natterman (Köln,
Deutschland) erhalten werden. Alternativ können Phospholipide nach den
veröffentlichten
Verfahren hergestellt werden (siehe D.M. Small, „The physical chemistry of
lipids" (1986),
Plenum Press, N.Y. oder D.D. Lasic, „Liposomes: from physics to
applications" (1993)
Elsevier, Amsterdam; N.Y.).
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B) Hydrophiles Polymer.
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Wie
oben angegeben, tendiert das Vorhandensein von hydrophilen Polymeren
dazu, die Bluthalbwertszeit eines Liposoms zu erhöhen. (Siehe
zum Beispiel Woodle u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1113: 171–199 (1992)).
Daher ist es oft wünschenswert,
den Liposomen ein hydrophiles Polymer, wie beispielsweise mit Polyethylenglycol
(PEG) modifizierte Lipide oder Gangliosid GM1 hinzuzufügen. Die
Zugabe von solchen Komponenten verhindert eine Liposomenaggregation
während
der Verbindung der Zielkomponente mit dem Liposom. Diese Komponenten
sehen auch ein Mittel zur Erhöhung
der Zirkulationslebenszeit des Phospholipids vor. Allerdings ist
beobachtet worden, dass es, während
hydrophile Polymere die Liposomenaufnahme durch das RES senken und
dadurch die Bluthalbwertszeit erhöhen, auch eine entsprechende
Reduzierung der Aufnahme durch die Zielgewebe gibt. Es war eine
unerwartete Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass eine Konzentration
von hydrophilem Polymer (z.B. PEG) mit 1 bis 4 Mol-% vesikelbildendes
Lipid (ausschließlich
Cholesterin) eine optimale Zellaufnahme in Kombination mit einer
angemessenen Bluthalbwertszeit vorsieht.
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Eine
Zahl von unterschiedlichen Verfahren kann zur Herstellung von PEG
zur Einarbeitung in Liposomen verwendet werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird PEG als mit PEG derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE)
oder mit PEG derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) eingearbeitet.
Verfahren zur Herstellung von PEG-PE sind bekannt und beinhalten
typischerweise die Verwendung eines aktivierten Methoxy-PEG (mit
nur einem reaktiven Ende) und PE. Daher kann das PEG-Succinimidylsuccinat
in einem basischen organischen Lösungsmittel
reagiert werden (Klibanov u.a., FEBS Lett., 268: 235–237 (1990)).
Ein besonders bevorzugtes Verfahren der PEG-PE-Herstellung beruht auf der Reaktion
von PEG mit Carbonyldiimidazol und anschließender Zugabe von PE (siehe
Woodle u.a., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 17:
77–78
(1990), Papahadjopoulos u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991),
Allen u.a., Biochim, Biophys. Acta, 1066: 29–36 (1991), Woodle u.a., Biochim.
Biophys. Acta, 1105: 193–200
(1992) and Woodle u.a., Period. Biol., 93: 349–352 (1991)). In ähnlicher
Weise wird mit Cyanurchlorid aktiviertes PEG in einem basischen
organischen Lösungsmittel
von Blume u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1029: 91–97 (1990) und dem US-Patent
Nr. 5 213 804 beschrieben, das hier durch Bezugnahme aufgenommen
wird. Ein vollständig
neuer Ansatz beruht auf der Verbindung von PEG mit vorgeformten
Liposomen unter Verwendung von mit Tresylchlorid aktiviertem PEG,
das dann den PE enthaltenden Liposomen bei einem hohen pH-Wert zugesetzt
werden (Senior u.a., Biochim. Biophys. Acta, 1–62: 77–82 (1991). Derivatisiertes
PEG ist auch im Handel erhältlich.
So ist zum Beispiel PEG-PE
von Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) oder Liposome Technology
(Menlo Park, Kalifornien, USA) erhältlich. Der Fachmann wird feststellen,
dass viele andere Verbindungen verfügbar sind.
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C) Antikörperfragment
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Ein „Antikörper" bezeichnet ein Protein,
das aus einem oder mehr Polypeptiden besteht, die im Wesentlichen
durch Immunoglobulingene oder Fragmente von Immunoglobulingenen
kodiert werden. Die festgestellten Immunoglobulingene umfassen die
kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene der
konstanten Regionen sowie die unzähligen Immunglobulingene der
variablen Region. Leichte Ketten werden entweder als kappa oder
lambda untergliedert.
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Schwere
Ketten sind als gamma, mu, alpha, delta oder epsilon unterteilt,
die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE
definieren.
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Die
grundlegende Immunglobulin (Antikörper)-Aufbaueinheit umfasst
bekanntermaßen
ein Tetramer. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren
von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kD) und eine „schwere" Kette (etwa 50–70 kD)
hat. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von
etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die primär für die Antigenerkennung
verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (VL) und variable schwere Kette (VH)
bezeichnen diese leichte bzw. schwere Kette.
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Antikörper können als
intakte Immunoglobuline oder als ein Anzahl von gut charakterisierten
Fragmenten bestehen, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen
erzeugt werden. Insbesondere verdaut Pepsin einen Antikörper unter
den Disulfidverbindungen in der Gelenkregion, um F(ab)'2 zu
erzeugen, ein Dimer von Fab, das selbst eine leichte Kette ist,
die mit VH-CHI über eine
Disulfidbindung verbunden ist. Das F(ab)'2 kann unter
milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidverbindung in
der Gelenkregion aufzubrechen, wodurch das F(ab)'2-Dimer in ein
Fab'-Monomer umgewandelt
wird. Das Fab'-Monomer
ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe
Fundamental Immunology, W.E. Paul, Hrsg. Raven Press, N.X. (1993)
für weitergehende
Antikörperfragmentterminologie).
Während
die Fab'-Domäne im Hinblick
auf den Verdau eines intakten Antikörpers definiert ist, weiß der Fachmann
zu schätzen,
dass solche Fab'-Fragmente de
novo entweder chemisch oder durch Verwendung von rekombinanter DNA-Methodik
synthetisiert werden können.
Allgemein ausgedrückt
handelt es sich bei der Fab'-Region eines Antikörpers um
ein Monomer, das die variablen Regionen und die CHI-Region eines Arms
eines Antikörpers
umfasst.
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Die
Fab'-Regionen, die
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von
Antikörpern
von Tieren (insbesondere Maus oder Ratte) stammen oder menschlichen
Ursprungs sein oder können
chimär (Morrison
u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984), beide werden
durch Bezugnahme hier aufgenommen) oder humanisiert sein (Jones
u.a., Nature 321, 522–525
(1986) und veröffentlichte
UK- Patentanmeldung
Nr. 8707252, beide werden hier durch Bezugnahme aufgenommen).
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Die
Fab'-Region wird
so ausgewählt,
dass sie spezifisch an den HER2-Rezeptor bindet. Brustkrebs ist durch
die Überexpression
des HER2 (c-erbB-2n, neu) Protoonkogen kodierten Rezeptors gekennzeichnet.
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Es
wird davon ausgegangen, dass der charakteristische Marker (der HER2-Rezeuptor) nicht
ein natürlich
auftretender Marker sein muss, sondern vielmehr in die bestimmte
Zielzelle eingeführt
werden kann. Dies kann durch direktes Markieren einer Zelle oder
eines Gewebes mit dem Marker (z.B. durch direkte Injektion des bestimmten
Zielgewebes mit dem Marker) oder alternativ durch Verabreichen eines
Markers, der über das
Zielgewebe selektiv eingebracht wird, an den gesamten Organismus
erzielt werden. In einer Ausführungsform
kann der Marker ein Genprodukt sein, das durch eine Nukleinsäure in einer
Expressionskassette kodiert ist. Das Markergen kann unter der Kontrolle
eines Promotors stehen, der nur in den bestimmten Zielzellen aktiv ist.
Daher führt
die Einführung
eines Vektors, der die Expressionskassette enthält, zur Expression des Markers nur
in den bestimmten Zielzellen. Der Fachmann wird feststellen, dass
es zahlreiche Ansätze
gibt, die die rekombinante DNA-Methodik verwenden, um charakteristische
Marker in Zielzellen einzuführen.
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Immunoliposome
der vorliegenden Erfindung können
durch Einführung
des Antikörperfragments
in die Liposome durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden,
die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann ein mittels Biotin
konjugiertes Fab' an
ein Liposom gebunden sein, das ein Streptavidin enthält. Alternativ
kann das biotinylierte Fab' über einen
Avidin- oder Streptavidin-Linker mit einem mit Biotin derivatisierten
Liposom konjugiert sein. Daher wurde zum Beispiel ein biotinylierter
monoklonaler Antikörper
biotinyliert und mit Liposomen, die biotinyliertes Phsophatidylethanolamin
enthalten, mittels eines Avidin-Linkers verbunden. (Siehe zum Beispiel
Ahmad u.a., Cancer Res. 52: 4817–4820 (1992)). Typischerweise
werden etwa 30 bis 125 und besonders typisch etwa 50 bis 100 Fab'-Moleküle pro Liposom
verwendet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Zielkomponente direkt mit dem Liposom konjugiert sein.
Solche Mittel der direkten Konjugation sind dem Fachmann bekannt.
Siehe zum Beispiel G. Gregoriadis, (1984) „Liposome Technology" CRC Press, Boca
Raton, Florida und D.D. Lasic, „Liposomes: from physics to applications" (1993) Elsevier,
Amsterdam; N.Y. Besonders bevorzugt ist eine Konjugation mittels
einer Thioether-Verbindung. Dies kann durch eine Reaktion des Antikörpers mit
einem mit Maleimid derivatisierten Lipid, wie beispielsweise einem
mit Maleimid derivatisierten Phosphatidylethanolamin (M-PE) oder
Dipalmitoylethanolamin (M-DEP),
erzielt werden. Dieser Ansatz wird ausführlich von Martin u.a., J.
Biol. Chem., 257: 286–288 (1982)
beschrieben, der hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kann die Zielkomponente (z.B. das Fab'-Fragment) mit dem hydrophilen Polymer
(z.B. einem PEG) verbunden sein. Mittel zum Verbinden von Zielmolekülen mit Polymerlinkern
sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Kapitel 4 in Monoclonal Antibodies:
Principles and Applications, Birch und Lennox, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New
York (1995); und Blume u.a., Biochem. Biophys. Acta, 1149: 180–184 (1993)).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Fab'-Fragment mit einem
mittels Maleimid derivatisierten PEG durch die -SII-Gruppe von Fab' verbunden. Um eine
Linkergruppe vorzusehen, wird α-Distearoylphosphatidylethanolaminocarbonyl-ω-malimidopropionylamidopolyethylenglycol
aus Distearoylphosphatidylethanolamin und einem heterobifunktionellen
PEG-Derivat, N-Hydroxysuccinimidyl-PEG-Maleimid gemäß Standardverfahren
synthetisiert. Das Maleimid-Derivat von PEG-PE ist in der Liposomenherstellung,
wie oben und unten beschrieben, umfasst, und das Fab'-Fragment kann mit dem Liposom über die
Sulfhydrylgruppe bei einem pH-Wert von 7,2 konjugiert werden.
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Herstellung
von Liposomen
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Eine
Vielzahl von Verfahren steht für
die Herstellung von Liposomen zur Verfügung, wie z.B. in Szoka u.a.,
Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), den US-Patenten Nr. 4 186
183, 4 217 344, 4 235 871, 4 261 975, 4 485 054, 4 501 728, 4 774
085, 4 837 028, 4 946 787, der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17424,
Szoka & Papahadjopoulos,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978), Deamer und Bangham,
Biochim. Biophys. Acta, 443: 629–634 (1976); Fraley u.a., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348–3352
(1979); Hope u.a., Biochim. Biophys. Acta, 812: 55–65 (1985);
Mayer u.a., Biochim. Biophys. Acta, 858: 161–168 (1986); Williams u.a.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 242–246
(1988), dem Text Liposomes, Mark J. Ostro, Hrsg., Marcel Dekker, Inc.,
New York, 1983, Kapitel 1, und Hope u.a., Chem. Phys. Lip. 40: 89
(1986) beschrieben. Geeignete Verfahren umfassen z.B. die Beschallung,
Extrusion, Hochdruck/Homogenisierung, Mikrofluidisierung, Detergenzdialyse,
mittels Calcium induzierte Fusion von kleinen Liposomvesikeln und
die Ether-Infusions-Verfahren,
die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Ein Verfahren erzeugt
multilamellare Vesikel von heterogener Größe. Bei diesem Verfahren werden
die vesikelbildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel
oder Lösungsmittelsystem
gelöst
und im Vakuum oder einem inerten Gas getrocknet, um einen dünnen Lipidfilm
zu bilden. Falls gewünscht,
kann der Film wieder in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise
einem tertiären
Butanol, gelöst
und dann lyophilisiert werden, um ein homogeneres Lipidgemisch zu
bilden, das in einer leichter hydratisierten pulverförmigen Form
vorliegt. Dieser Film ist mit einer wässrigen gepufferten Lösung bedeckt
und wird normalerweise über
einen Zeitraum von 15 bis 60 Minuten unter Rühren hydratisieren gelassen.
Die Größenverteilung
der sich ergebenden multilamellaren Vesikel kann durch Hydratation
der Lipide unter kräftigerem
Rühren
oder durch Zugabe von Lösungsdetergenzien,
wie beispielsweise Desoxycholat, zu kleineren Größen hin verlagert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden multilamellare Liposome durch die Umkehrphasenverdampfungsmethode
von Szoka & Papahadjopoulos,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198 (1978) erzeugt.
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Unilamellare
Vesikel werden allgemein durch Beschallung oder Extrusion hergestellt.
Eine Beschallung wird generell mit einem Spitzen-Sonifier, wie beispielsweise
einem Branson-Spitzensonifier, in einem Eisbad durchgeführt. Typischerweise
wird die Suspension mehreren Beschallungszyklen unterworfen. Eine
Extrusion kann mittels Biomembran-Extruder, wie beispielsweise dem
Lipex Biomembrane Extruder, durchgeführt werden. Eine bestimmte
Porengröße in den
Extrusionsfiltern kann unilamellare liposomale Vesikel von bestimmten
Größen erzeugen.
Die Liposomen können
auch durch Extrusion mittels eines asymmetrischen Keramikfilters,
wie beispielsweise eines Ceraflow Microfilter, der im Handel von
Norten Company, Worcester, MA, erhältlich ist, gebildet werden.
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Anschließend an
eine Liposomenherstellung können
die Liposome, die während
der Bildung nicht dimensioniert wurden, dimensioniert werden, um
einen gewünschten
Größenbereich
und eine relativ enge Verteilung von Liposomengrößen zu erzielen. Ein Größenbereich
von etwa 0,2 bis 0,4 μm
ermöglicht
es der Liposomensuspension, durch Filtration mittels eines herkömmlichen
Filters, typischerweise eines 0,22 μm Filters, sterilisiert zu werden.
Das Filtersterilisationsverfahren kann auf einer hohen Durchsatzbasis
durchgeführt
werden, wenn die Liposomen auf eine Größe von etwa 0,2–0,4 μm dimensioniert
wurden.
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Mehrere
Verfahren stehen zum Dimensionieren von Liposomen auf eine gewünschte Größe zur Verfügung. Ein
Dimensionierungsverfahren ist in den US-Patenten Nr. 4 529 561 oder
4 737 323 beschrieben. Die Beschallung einer Liposomensuspension
entweder durch Bad- oder durch Sondenbeschallung erzeugt eine progressive
Größenreduzierung
bis hinunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln von unter etwa 0,05 μm Größe. Eine
Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf der Scherenergie
beruht, um große
Liposome in kleinere aufzuspalten. Bei einem typischen Homogenisierungsverfahren
werden multilamellare Vesikel durch einen Standard-Emulsionshomogenisierer
wieder zugeführt,
bis ausgewählte
Liposomengrößen, typischerweise zwischen
etwa 0,1 und 0,5 μm,
beobachtet werden. Die Größe der liposomalen
Vesikel kann durch quasielektrische bzw. quasielastische Lichtstreuung
(QELS) bestimmt werden, wie in Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,
10: 421–450
(1981) beschrieben. Der mittlere Liposomendurchmesser kann mittels
Beschallung von gebildeten Liposomen reduziert werde. Unterbrochene
Beschallungszyklen können
sich mit einer QELS-Bewertung
abwechseln, um eine wirksame Liposomensynthese zu begleiten.
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Die
Liposomenextrusion durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder
eine asymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren
zur Reduzierung der Liposomengrößen auf
eine relativ gut begrenzte Größenverteilung.
Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals durch die
Membran geführt,
bis die gewünschte
Liposomengrößenverteilung
erzielt ist. Die Liposomen können durch
aufeinander folgende kleinerporige Membranen extrudiert werden,
um eine allmähliche
Reduzierung der Liposomengröße zu erreichen.
In der vorliegenden Erfindung kommen Liposomen mit einer Größe von etwa
0,05 μm
bis etwa 0,15 μm
zur Verwendung. Besonders bevorzugt sind Liposome mit einer Größe von etwa
0,05 bis 0,5 μm.
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Immunoliposomengehalte
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Bei
dem therapeutischen Agens, das verwendet werden kann, handelt es
sich um jede Verbindung, einschließlich den unten aufgeführten, die
bei einem geeigneten Beladungsfaktor stabil in Liposomen eingeschlossen
und bei einer therapeutisch wirksamen Dosis (nachfolgend nach jeder
Verbindung in Klammern angegeben, m2 bezieht
sich auf die Körperoberfläche) verabreicht
werden können.
Sie umfassen amphipathische Antitumorverbindungen, wie beispielsweise
die Pflanzenalkaloide Vincristin (1,4 mg/m2),
Vinblastin (4–18 mg/m2) und Etoposid (35–100 mg/m2),
und die Anthracyclin-Antibiotika, einschließlich Doxorubicin (60–75 mg/m2), Epirubicin (60–120 mg/m2)
und Daunorubicin (25–45
mg/m2). Die wasserlöslichen Antimetabolite, wie beispielsweise
Methotrexat (3 mg/m2), Cytosinarabinosid
(100 mg/m2) und Fluoruracil (10–15 mg/kg),
die Antibiotika, wie beispielsweise Bleomycin (10–20 Einheiten/m2, Mitomycin (20 mg/m2),
Plicamycin (25–30 μg/m2) und Dactinomycin (15 μg/m2)
und die Alklyierungsmittel, einschließlich Cyclophosphamide und
Derivate davon (3–25
mg/kg), Thiotepa (0,3–0,4
mg/kg) und BCNU (150–200
mg/m2) sind in diesem Zusammenhang auch
von Nutzen. Andere geeignete Medikamente umfassen Aclacinomycin,
Idarubicin, Mitoxantron, Cisplatin und andere Platin-II-Analoge. Die Liposome
können
auch die Taxane, einschließlich
Taxol, Taxoter, Dihydroxytaxane, Camptothecine und andere Taxanderivate
und -isolate enthalten. Darüber
hinaus können
die Liposome verkapselte tumortherapeutische Peptide (z.B. pflanzliche
oder bakteriell abgeleitete Toxine) und Proteinmedikamente, wie
beispielsweise IL-2 und/oder TNF, und/oder Immunmodulatoren, wie
beispielsweise M-CSF, die allein oder in Kombination mit Antitumormedikamenten,
wie beispielsweise Anthracyclin-Antiobiotika-Medikamente, vorliegen,
enthalten. Die Immunoliposome können
fluoriertes Pyramidin und Purinbasen oder Nukleoside enthalten.
Die Immunoliposome können
auch Nukleinsäuren,
wie beispielsweise Oligonucleotide, aufweisen, die natürliche oder
modifizierte Basen enthalten und eine Phosphodiester-Internucleotid-Verbindung
oder modifizierte Internucleotid-Verbindungen,
wie beispielsweise ein Phosphorthioat oder Polyamidverbindungen, enthalten.
Der Fachmann wird feststellen, dass Nukleinsäuren als antisense- oder triplexbildende
Moleküle verwendet
werden können,
um die Transkription und die Translation durch Bindung von DNA oder
RNA zu blockieren. Alternativ können
die Nukleinsäuren
verwendet werden, um Zellen zu transformieren und die Expression
von heterologen Proteinen zu induzieren. In diesem letzteren Zusammenhang
wird die Nukleinsäure
eine Expressionskassette umfassen, die die Nukleinsäuresequenz
aufweist, die das Protein kodiert, das unter der Kontrolle eines
Promotors exprimiert werden soll.
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Beladen von
Immunoliposomen mit therapeutischen Zusammensetzungen
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Die
Verfahren des Beladens von Liposomen mit herkömmlichen Medikamenten sind
dem Fachmann bekannt. Die bekanntesten Verfahren umfassen eine Verkapselungstechnik
und das Transmembranpotentialbeladungsverfahren. Bei der Verkapselungstechnik
wird das Medikament im Puffer angeordnet, aus dem sich die Liposomen
ergeben. Das letztere Verfahren ist ausführlich im US-Patent Nr. 4 885
172, dem US-Patent Nr. 5 059 421 und dem US-Patent Nr. 5 171 578
beschrieben worden.
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Kurz
gesagt kann das Transmembranpotentialbeladungsverfahren mit im Wesentlichen
jedem herkömmlichen
Medikament verwendet werden, das in einem geladenen Zustand existieren
kann, wenn es in einem geeigneten wässrigen Medium gelöst ist.
Vorzugsweise ist das Medikament relativ lipophil, so dass es sich
in die Liposomenmembranen aufteilt. Ein Transmembranpotential wird über die
Doppelschichten der Liposomen oder Zielkomponenten-Liposomkonjugate
geladen und das Medikament wird mittels des Transmembranpotentials
in das Liposom geladen. Das Transmembranpotential wird durch Erzeugen
eines Konzentrationsgradienten über
die Membranen für
ein oder mehr geladene Arten gebildet (z.B. Na+,
K+ und/oder H+).
Dieser Konzentrationsgradient wird durch Erzeugen von Liposomen
oder Zielkomponenten-Liposomkonjugate mit unterschiedlichen internen
und externen Medien gebildet. Daher wird für ein Medikament, das positiv
geladen ist, wenn es ionisiert ist, über die Membranen ein Transmembranpotential
erzeugt, das ein inneres Potential aufweist, das bezüglich des äußeren Potentials
negativ ist, während
für ein
Medikament, das negativ geladen ist, die entgegengesetzte Orientierung
verwendet wird.
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Untersuchen der Bluthalbwertszeit.
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Eine
der Anforderungen für
die Liposomenlokalisierung in einem Zielgewebe ist eine ausgedehnte
Immunoliposomenlebensdauer im Blutstrom nach der Verabreichung.
Ein Maß für die Immunoliposomenlebensdauer
im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, das
eine definierte Zeit nach der Liposomenverabreichung bestimmt wird.
Typischerweise werden Immunoliposome, die eine Markierung enthalten
(z.B. Fluoreszenzmarker, elektronendichtes Reagens oder radioaktiver
Marker), entweder intern im Liposom oder gebunden an ein Lipid,
das das Liposom umfasst, in den Testorganismus injiziert. Nach einer
bestimmten Zeit wird der Organismus geopfert und die Menge an Markierung,
die im Blut festgestellt wird (z.B. durch Messung der Lumineszenz oder
Szintillationszählung)
wird mit dem in bestimmten Geweben (z.B. Leber oder Milz) lokalisierten
verglichen.
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Der
Zeitverlauf der Retention von Immunoliposomen im Blut kann auch
einfach durch Probenahme von Blut in bestimmten Intervallen nach
der Verabreichung von Markierung enthaltenden Liposomen und durch Festlegung
der Menge an Markierung, die in der Zirkulation verbleibt, bestimmt
werden. Das Ergebnis kann als Fraktion der ursprünglichen Dosis ausgedrückt werden.
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Untersuchung
der Aufnahme von Zielzellen in das Zytoplasma und Bestimmung der
Gewebeverteilung
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Die
Aufnahme und Internalisierung von Immunoliposomen in das Zytoplasma
von Zielzellen kann in ähnlicher
Weise durch die Verabreichung von eine Markierung (z.B. einen Fluoreszenzmarker,
ein elektronendichtes Reagens oder einen radioaktiver Marker) enthaltenden
Immunoliposomen und anschließendes
Feststellen des Vorhandenseins oder Fehlens dieser Markierung im
Zytoplasma der Zielzelle bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein
Immunoliposom, enthaltend einen Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise
Rhodamin, das mit dem Lipid konjugiert ist, das das Liposom selbst
bildet, dem Organismus oder einfach den Zellen in der Kultur verabreicht
werden. Die Gewebe oder Zellen können
dann fixiert und die Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie
festgestellt werden. In ähnlicher
Weise kann eine elektronendichte Markierung (z.B. Gold) verwendet
werden und mittels Elektronenmikroskopie festgestellt werden. Der
Fachmann wird feststellen, dass viele Markierungen geeignet sind
und das Bestimmungsverfahren die Wahl der Markierung reflektiert.
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Untersuchung
für die
antiproliferative Aktivität
von Immunoliposomen
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Die
vorliegende Erfindung sieht wachstumshemmende Immunoliposome mit
einem Antikörperfragment
vor, das speziell mit einem HER2-Rezeptor bindet. Die Identifikation
von Immunoliposomen, die besonders wirksame Inhibitoren einer Zellproliferation
sind, können
mit routinemäßigem Screening
erzielt werden. Dies beinhaltet das Bereitstellen einer Zellkultur,
in der die Zellen einen HER2-Rezeptor tragen, der die Zellen in
der Kultur mit dem zu testenden Immunoliposom kontaktiert, und das
Messen der sich ergebenden Änderung
der Zellproliferationsrate. Mittel zum Messen der Zellproliferationsrate
sind dem Fachmann bekannt.
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Bei
einem Ansatz kann zum Beispiel die Proliferationsrate direkt durch
Messen der Änderung
der tatsächlichen
Zellzahl über
einen festen Zeitraum bestimmt werden. Daher wurden, wie im Beispiel
3 veranschaulicht ist, Tumorzellen, wie beispielsweise SK-BR-3-
oder TB-474-Zellen, in einer Monoschichtkultur wachsen gelassen
und dann bei 37°C
mit unterschiedlichen Konzentrationen von Immunoliposomen auf der
Grundlage eines Antikörpergehalts
inkubiert. Nach einer kontinuierlichen Behandlung über 4 Tage
wurden die Zellmonoschichten mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett-Farbstoff
(0,5 % in Methanol) zur Bestimmung der relativen Proliferation gefärbt, wie
zuvor beschrieben (Hudziak u.a., Mol. Cell Biol. 9: 1165–1172 (1989),
der hier durch Bezugnahme aufgenommen wird).
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Alternativ
ist es bekannt, dass eine Erhöhung
der Zellproliferationsrate typischerweise von einer Erhöhung der
metabolischen Rate begleitet ist. Daher kann die Proliferation indirekt
durch Messung der Änderungen
der metabolischen Rate von Zellen, die dem zu testenden Immunoliposom
ausgesetzt sind, bestimmt werden.
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Zahlreiche
Mittel zum Messen der metabolischen Rate sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugter Ansatz ist es, die Aufnahmerate eines
markierten metabolischen Vorläufers,
wie beispielsweise tritiummarkiertes Thymidin, zu messen. Kurz gesagt
wird dies durch Verabreichen von [3H]-Thymidin
an eine Testkultur, die das Immunoliposom enthält, und an eine Kontrollkultur,
der das Immunoliposom fehlt, erzielt. Nach einem bestimmten Zeitraum
werden Zellen gesammelt und die Menge an [3H]-Thymidin,
die durch die Zellen aufgenommen wird, wird mittels Standardverfahren
(z.B. Szintillationszählen)
gemessen. Ein Vergleich der Test- und Kontrollzellen zeigt Änderungen
der metabolischen Aktivität
und daher die Proliferationsrate.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die die Immunoliposome der Erfindung umfassen,
werden gemäß Standardverfahren
hergestellt und umfassen weiter einen pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Im Allgemeinen wird eine normale Kochsalzlösung als pharmazeutisch verträglicher
Träger
verwendet. Andere geeignete Träger
sind z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Kochsalzlösung, 0,3
% Glycin und dergleichen, einschließlich Glyocproteine zur Erhöhung der
Stabilität,
wie beispielsweise Albumin, Lipoprotein, Globulin usw. Diese Zusammensetzungen
können
durch herkömmliche,
bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert werden. Die sich
ergebenden wässrigen
Lösungen
können
zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert
und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor
der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen
können
pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich
sind, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie beispielsweise pH-Anpassungs-
und Puffermittel, Tonizitätsanpassungsmittel
und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid,
Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw. Darüber hinaus kann die Liposomensuspension
Lipid schützende
Agenzien umfassen, die Lipide vor freien Radikalen und Lipid-peroxidativen
Schäden
während
der Lagerung schützen.
Lipophile frei-radikalische Quencher, wie beispielsweise alpha-Tocopherol
und wasserlösliche
eisenspezifische chelatbildende Verbindungen, wie beispielsweise
Ferrioxamin, sind geeignet.
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Die
Konzentration von Immunoliposomen in den pharmazeutischen Formulierungen
kann stark differieren, d.h. von unter etwa 0,05 Gew.-%, gewöhnlich um
oder mindestens etwa 2–5
Gew.-% bis über
10 bis 30 Gew.-%, und wird primär
durch Fluidvolumen, Viskositäten
usw. in Übereinstimmung
mit dem bestimmten ausgewählten
Verabreichungsweg ausgewählt.
Zum Beispiel kann die Konzentration erhöht werden, um die Fluidbeladung,
die mit der Behandlung in Verbindung steht, zu senken. Dies kann
besonders wünschenswert
bei Patienten sein, die einen mit Atherosklerose verbundenen kongestiven
Herzfehler oder starken Bluthochdruck haben. Alternativ können Immunoliposome,
die aus reizenden Lipiden zusammengesetzt sind, zu niedrigen Konzentrationen
verdünnt
werden, um die Entzündung
an der Verabreichungsstelle zu verringern. Die verabreichte Immunoliposomenmenge
hängt von
dem bestimmten verwendeten Antikörperfragment,
dem behandelten Krankheitszustand, dem verabreichten therapeutischen
Agens und dem Urteil des Klinikarztes ab. Im Allgemeinen reicht
die Menge an verabreichten Immunoliposomen aus, um eine therapeutisch
wirksame Dosis des bestimmten pharmakologischen Agens zu geben.
Die Menge an Immunoliposomen, die notwendig ist, um eine therapeutisch
wirksame Dosis zu verabreichen, kann durch Aufnahmeuntersuchungen
bestimmt werden, wie oben beschrieben. Therapeutisch wirksame Dosen
für verschiedene
pharmakologische Agenzien sind dem Fachmann bekannt und repräsentative
Bereiche sind für
eine Zahl von obigen Pharmazeutika gegeben. Typische Immunoliposomdosierungen
liegen im Allgemeinen zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg pro Kilogramm
Körpergewicht,
vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg/kg Körpergewicht.
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Vorzugsweise
werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, d.h. intraartikulär, intravenös, intraperitoneal,
subkutan oder intramuskulär,
verabreicht. Besonders bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen
intravenös
oder intraperitoneal durch eine Bolusinjektion verabreicht. Besondere
Formulierungen, die für
diese Verwendung geeignet sind, werden in Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Ausg. (1985)
gefunden. Typischerweise umfassen die Formulierungen eine Lösung der
Liposomen, die in einem verträglichen
Träger
suspendiert sind, vorzugsweise in einem wässrigen Träger. Eine Auswahl von wässrigen
Trägern
kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9 % isotonische
Kochsalzlösung
und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche,
bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden oder steril
filtriert werden. Die sich ergebenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung so wie
sie sind verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte
Präparat
vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen
können
pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie erforderlich
ist, um sich physiologischen Zuständen anzunähern, wie beispielsweise eine
pH-Wertanpassung und Puffermittel, Tonizitätsanpassungsmittel, Netzmittel
und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid,
Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitmonolaurat, Triethanolamin,
Oleat usw.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese
Beispiele dienen zu Veranschaulichung, nicht aber um die vorliegende
Erfindung zu beschränken.
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Beispiel 1
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Herstellung
von Liposomen und Immunoliposomen
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A) Materialien
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Eiphosphatidylcholin
(EPC) wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL); Cholesterin
(Chol) von Calbiochem (San Diego, CA); N-Tris[hydroxymethyl]-2-aminoethansulfonsäure (TES)
von Sigma; hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC) von Natterman
(Köln,
Deutschland); Rhodamin-markierte Phospholipide von Avanti; Desferrioxaminmesylat
(Desferal) von Ciba-Geigy (Summit, NJ); Doxorubicin von Farmitalia,
Carblo Erba (Mailand, Italien) oder Cetus (Emeryville, CA); und
N-[4p-maleimidophenyl)butyryl]phosphatidylethanolamin
(M-PE) von Molecular Probes (Portland, OR) gekauft. Mittels PEG
(Mr = 1900) derivatisiertes Phosphatidylethanolamin
(PEG-PE) wurde wie beschrieben synthetisiert (Allen u.a., Biochim.
Biophys. Acta, 1066: 29–36
(1991)), und von Liposome Technology, Inc. (Menlo Park, CA) erhalten.
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B) Herstellung von Fab'-Fragmenten
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Klonierte
rhuMAbHER2-Sequenzen für
die schwere und leichte Kette wurden zusammen in E. coli exprimiert,
wie zuvor beschrieben (Carter u.a., Biotechnology 10: 163–167 (1992)).
Das Antikörperfragment rhuMAbHER2-Fab' wurde von E. coli-Fermentationspasten
durch Affinitätschromatographie
mit Streptokokkenprotein G gewonnen (Carter u.a., Biotechnology,
10: 163–167
(1992)), das typischerweise Fab' ergab,
wobei reduziertes freies Thiol in 60–90 % enthalten war (Fab'-SH). Als Kontrolle
wurde ein irrelevantes humanisiertes Fab' verwendet. Von einem anti-CD 18 Maus
monoklonalen Antikörper
stammend unterscheidet sich rhuMAbH42-Fab' von rhuMAbHER2-Fab' nur durch den Ersatz der antigenbindenden
Schleifen und zeigte keine feststellbare Bindung mit einem bekannten
Maus oder humanen Antigen (Eigenbrot u.a., Proteins: Structure,
Function, and Genetics, 18: 49–62
(1994)).
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C) Herstellung von Liposomen
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Liposome
wurden gemäß dem Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren
(Szoka & Papahadjopoulos, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198
(1978) hergestellt, wobei die Lipidzusammensetzung EPC:Chol (2:1)
aufwies, oder, wo angegeben, HSPC:Chol (3:2) und PEG-PE (0–6 Mol-%).
Liposome wurden anschließend
wiederholt unter positiven Druck mit Argongas durch Polycarbonatmembranfilter
von definierter Porengröße sequentiell
von 0,1 bis 0,05 μm
extrudiert (Olson u.a., Biochim. Biophys. Acta, 55: 9–23 (1979);
Szoka u.a., Biochem. Biophys. Acta, 601: 559–571 (1980)). Dieses Verfahren
ergibt Liposome von 60–120
nm Durchmesser, wie durch dynamische Lichtstreuung bestimmt. Die
Liposomenkonzentration wurde durch Phosphatuntersuchung bestimmt
(Bartlett, J. Biol. Chem., 234: 466–468 (1959)). Für die Immunoliposompräparate wurde
2 Mol-% M-PE (des gesamten Phospholipids) in das Lipidgemisch in
Chloroform vor der Liposomenherstellung aufgenommen (Martin und
Papahadjopoulos, J. Biol. Chem., 257: 286–288 (1982)). Liposome ohne
verkapseltes Doxorubicin wurden in HEPES-NaCl-Puffer, pH 7,2, 300
mOSm hergestellt. HSPC/Chol-Liposome, die Doxorubicin enthielten,
wurden in 250 mM Ammoniumsulfat mit 1 mM Desferal bei einem pH-Wert
von 5,5 hergestellt. Nicht verkapseltes Ammoniumsulfat wurde durch
Gelfiltration mit G-75 Sephadex entfernt. Doxorubicin in Pulverform
wurde dann in dieser Liposomensuspension bei 0,1 mg Doxorubicin/μmol Phospholipid
gelöst
(Papahadjopoulos u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11460–11464 (1991);
Huang u.a., Cancer Res., 52:6774–6781 (1992)), wodurch Doxorubicin
im Inneren des Liposoms festgehalten wird (Lasic u.a., FEBS Lett.,
312: 255–258
(1992)). Die Wirksamkeit der Medikamentenbeladung über den
Salzgradienten war hoch und erreichte > 99 % Beladung, wenn 1 mg Medikament pro
10 μmol
Phospholipid verwendet wurde.
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Fab' wurde mit den Liposomen
nach der Medikamentenbeladung über
die Thioetherverbindung konjugiert, wie zuvor beschrieben (Martin
u.a., J. Biol. Chem., 257: 286–288
(1982). Da Maleimid bei einem niedrigen pH stabiler ist, wurden
alle Verfahren bei einem pH von 5,5 durchgeführt. Nicht reagiertes Fab' wurde von Immunoliposomen
durch Gelfiltration mit Sephacryl S-400 getrennt. Die Maleimidgruppe
auf Immunoliposomen wurde nach Konjugation mit einem 2-fachen Überschuss
an Mercaptoethanol mit M-PE deaktiviert. Die Menge an konjugiertem
Fab' wurde durch
den BioRad-Proteinassay bestimmt.
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Vier
Arten von Liposomen wurden hergestellt. „Herkömmliche" Liposomen ohne Antikörper wurden aus
Phosphatidylcholin und Cholesterin allein zusammengesetzt. „Sterisch
stabilisierte" Liposomen
enthielten zusätzlich
PEG-PE. Immunoliposome wurden durch Konjugation des obigen mit Fab'-Fragmenten, die
vom humanisierten Antikörper
rhuMAbHER2 stammten, hergestellt, um herkömmliche oder sterisch stabilisierte
Immunoliposome zu ergeben. Fab'-Fragmente
und nicht intakter Antikörper
wurden aus den folgenden Gründen verwendet:
1) rhuMAbHER2-Fab'-Fragmente können als
rekombinante Proteine in E. coli bei äußerst hoher Wirksamkeit exprimiert
werden (Carter u.a., supra); 2) die freie Thiolgruppe in der Fab'-Gelenkregion sieht
eine sofort verfügbare
Stelle für
die kovalente Anlagerung an modifizierte Liposomen vor und liegt
von der Antigenbindungsstelle entfernt; und 3) rhuMAbHER2-Fab' hat eine weitaus
geringere antiproliferative Aktivität als intaktes rhuMAbHER2,
und daher war es von Interesse zu sehen, ob die Anlagerung von anti-p185HER2-Fab' an Liposome
diese Aktivität
wieder herstellen würde.
Typischerweise führte
die Konjugation zu ungefähr
50–100 Fab'-Molekülen pro
Liposomenpartikel.
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Beispiel 2
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Immunoliposomenbindung
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Die
Fähigkeit
von anti-p185HER2-Immunoliposomen, in vitro
an Brustkrebszellen zu binden, die den p185HER2-Rezeptor überexprimieren,
wurde mit zwei Verfahren bewertet; einem flusszytometrischen Assay
und einem kompetitiven Bindungsassay. Für den flusszytometrischen Assay
wurden SK-BR-3-Zellen, die hohe Niveaus an p185HER2 exprimieren,
oder MCF-77-Zellen für
45 Minuten anti-p185HER2-Immunoliposomen auf Eis ausgesetzt,
mit PBS gewaschen, mit einem sekundären anti-humanen Antikörper gefärbt, um
gebundene Immunoliposome (FITC-markiertes Ziegen anti-humanes IgG)
festzustellen, erneut mit PBS gewaschen und dann einer Flusszytometrie
unterworfen (1). SK-BR-3-Zellen haben signifikante
Mengen entweder an herkömmlichen
oder sterisch stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposomen gebunden,
allerdings keine Kontrollliposome, denen Fab' fehlt. MCF-7-Brustkrebszellen, die
p185HER2 nicht überexprimieren, zeigten eine
minimale Bindung an anti-p185HER2-Immunoliposome
(Daten nicht gezeigt).
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Eine
andere Bindungsmaßnahme
wurde durch den kompetitiven Bindungsassay geleistet, bei dem SK-BR-3-
(Brustkrebszellen) oder BT-474-Zellen in Monoschichtkultur gleichzeitig
mit 125I-markiertem rhuMAbHER2 oder muMAb4D5
bei 0,1 nM 18 Stunden lang bei 4°C
und steigenden Konzentrationen an anti-p185HER2-Immunoliposomen inkubiert
wurden (2). Gebundene Zählungen
wurden durch gamma-Zählung
bestimmt. Anti-p185HER2-Immunoliposome verlagerten
wirksam die Bindung von rhuMAbHER2 sowohl an SK-BR-3-Zellen (Daten
nicht gezeigt) als auch an BT-474-Zellen (die auch hohe Niveaus
an p185HER2 exprimieren). Eine Näherung der
Bindungsaffinität
wurde über
die Scatchard-Analyse der Bindungsdaten durch Aufstellen der Hypothese,
dass Fab' sich auf
Immunoliposomen als freier Ligand verhielt, erhalten. Unter Verwendung
dieses Modells waren offensichtliche Bindungskonstanten für die Immunoliposome
mit denen von freiem (d.h. nicht liposomalem) rhuMAbHER2-Fabl oder
intaktem rhuMAbHER2 vergleichbar. Herkömmliche oder sterisch stabilisierte
(6 Mol-% PEG-PE) Kontrollliposome, denen Fab' fehlte, zeigten eine vernachlässigbare
Bindung. Eine Zusammenfassung der Bindungsdaten ist in der Tabelle
1 gezeigt.
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Tabelle
1. Bindung von anti-P185
HER2-Immunoliposomen
an BT-474-Zellen.
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Beispiel 3
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Antiproliferative Aktivität der „wachstumsinhibierenden" Immunoliposome
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Um
die antiproliferative Wirkung von Immunoliposomen allein ohne eingekapselte
Medikamente zu testen, wurden Tumorzellen, wie beispielsweise SK-BR-3-
oder BT-474-Zellen,
in einer Monoschichtkultur wachsen gelassen und dann bei 37°C mit verschiedenen
Immunoliposomenkonzentrationen auf der Grundlage eines Antikörpergehalts
inkubiert. Nach kontinuierlicher Behandlung für 4 Tage wurden die Zellmonoschichten
mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett-Farbstoff (0,5 % in Methanol)
zur Bestimmung der relativen Proliferation gefärbt, wie zuvor beschrieben
(Hudziak u.a., Mol. Cell Biol. 9: 1165–1172 (1989)).
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Während intaktes
(bivalentes) rhuMAbHER2 das Wachstum von p185HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen
in einer Monoschichtkultur hemmte, sind monovalente Fab'-Fragmente dieses
Antikörpers (rhuMAbHER2-Fab') viel weniger wirksam
bei der Wachstumshemmung (O'Connell
u.a., Seiten 218–239,
in: Protein Folding In Vivo and In Vitro, Cleland JL, Hrsg. Washington,
D.C., American Chemical Society, (1993)). Diese Beobachtung legte
nahe, dass eine Vernetzung von p185HER2-Rezeptoren
durch einen bivalenten Antikörper
für die
antiproliferative Wirkung wichtig ist, und dadurch ergab sich die
Frage, ob eine liposomale Verankerung von rhuMAbHER2-Fab'-Fragmenten die antiproliferative
Wirkung von Fab' durch
erhöhte
wirksame Valenz verbessern könnte.
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Die
Wirkung von anti-p185HER2-Immunoliposome
auf SK-BR-3-Zellen in einer Monoschichtkultur wurde getestet und
mit rhuMAbHER2 und rhuMAbHER2-Fab' verglichen (3). Die
Behandlung mit herkömmlichen oder
sterisch stabilisierten Kontrollliposomen, denen Fab' fehlt, beeinflusste
das Zellwachstum nicht signifikant. Im Gegensatz dazu hemmten sowohl
die herkömmlichen
als auch die sterisch stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposome
das Wachstum in einer dosisabhängigen
Weise. Der wachstumshemmende Effekt der Immunoliposome erreichte
ein Plateau von etwa 30 % Wachstumshemmung (70 % Kontrollwachstum), was
den 40 Wachstumshemmung nahe kommt, die bei freiem intaktem rhuMAbHER2
festgestellt werden. Im Gegensatz dazu induzierte freies rhuMAbHER2-Fab' nur eine mäßige Wachstumshemmung. Ähnliche
Ergebnisse wurden auch mit p185HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen
erhalten (Daten nicht gezeigt).
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Es
ist beachtenswert, dass das mit Liposomen verbundene rhuMAbHER2-Fab' eine deutlich größere antiproliferative
Wirkung als dieselbe Menge an rhuMAbHER2-Fab', das sich frei in Lösung befand, erzeugte. Eine
plausible Erklärung
dafür ist,
dass eine liposomale Verankerung von rhuMAbHER2-Fab' die Vernetzung von
p185HER2 ermöglicht, wodurch eine biologische
Wirkung hervorgerufen wird, die mit dem intakten bivalenten Antikörper vergleichbar
ist.
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Beispiel 4
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Zytotoxizität von anti-p185HER2-Immunoliposomen, die Doxorubicin enthalten
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Obwohl
leere anti-p185HER2-Immunoliposome eine
antiproliferative Wirkung gegenüber
p185HER2-überexprimierende Brustkrebszellen
in der Kultur zeigten, war es möglich,
den antineoplastischen Effekt der Immunoliposomen zu steigern, indem
man sie mit zytotoxischen Agenzien belud und so ein gezieltes Medikamentenabgabesystem
erzeugte. Doxorubicin wurde wegen des vorklinischen und klinischen
Nachweises verwendet, was nahe legt, dass Doxorubicin besonders
nützlich
gegen Brustkrebs überexprimierendes
p185HER2 sein kann, mit oder ohne begleitende
Immuntherapie. Es war daher von Interesse, die Zytotoxizität und die Spezifität von Doxorubicin-beladenen
anti-p185HER2-Immunoliposomen gegen p185HER2-überexprimierende
Brustkrebszellen und gegen nicht maligne Zellen, die p185HER2 nicht überexprimieren, zu bestimmen.
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Wegen
der wirksamen Internalisierung, die durch p185HER2-Immunoliposome
gezeigt wurde (siehe Beispiel 5), wurde erwartet, dass die Liposomen
genauso wirksam beim Abtöten
von p185HER2-überexprmierende Brustkrebszellen
in der Kultur sein könnten
wie freies Doxorubicin, ein kleines (Molekulargewicht 544) amphipathisches
Molekül,
das ohne weiteres durch die Zellmembran hindurchgeht. Andererseits
würden
Zellen, die p185HER2 nicht überexprimieren,
während
sie gegenüber
freiem Doxorubicin empfindlich sind, einer zytotoxischen Beschädigung von
mit Doxorubicin beladenden anti-p185HER2-Immunoliposomen
wegen der Unfähigkeit
der Immunoliposomen, sie als Ziel auszuwählen, entgehen.
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Um
die Zytotoxizität
von mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen zu testen, wurden
SK-BR-3- oder WI-38-Zellen in Monoschichtkultur mit freiem Doxorubicin
oder mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen 1 Stunde lang inkubiert
und dann ausgiebig mit Medien gewaschen. Die Zellen wurden dann
weiter bei 37°C
3 Tage lang inkubiert, wonach die Zellzahl durch Kristallviolettfärbung bestimmt
wurde, wie oben beschrieben. Ein Vergleich mit anderen Zellwachstumsassays
einschließlich
Alamar-Blau-Färbung,
MTT-Färbung
und direkte Zellzählung,
führte
im Wesentlichen zu denselben Ergebnissen.
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Die
Ergebnisse der SK-BR-3-Zellen, die 1 Stunde lang mit verschiedenen
mit Doxorubicin beladenen Immunoliposompräparaten behandelt wurden, sind
in der 4 gezeigt. Unter diesen Bedingungen
ist die antiproliferative Wirkung von rhuMAbHER2 nicht offensichtlich,
da sie es erfordert, dass die Zellen kontinuierlich rhuMAbHER2 ausgesetzt
werden (Hudziak u.a., Mol. Cell Biol., 9: 1165–1172 (1989)). Die Behandlung
mit freiem Doxorubicin für
1 Stunde führte
zu einer signifikanten Zytotoxizität mit einem IC50 von
ungefähr
0,3 μg/ml. Mit
Doxorubicin beladene anti-p185HER2-Immunoliposome
zeigten eine vergleichbare dosisabhängige Zytotoxizität mit einem
IC50 von ungefähr 0,2 μg/ml für herkömmliche anti-p185HER2-Immunoliposome
und ungefähr 1,0 μg/ml für sterisch
stabilisierte (2 Mol-%
PEG-PE) anti-p185HER2-Immunoliposome. Diese
Ergebnisse haben gezeigt, dass die anti-p185HER2-Immunoliposomabgabe
von Doxorubicin an p185HER2-überexprimierende Zellen in
der Kultur ein so wirksames Verfahren wie die schnelle Diffusion
von freiem Doxorubicin in die Zellen war. Mit Doxorubicin beladene
anti-p185HER2-Immunoliposome waren zwischen 10- und
30-fach zytotoxischer als mit Doxorubicin beladene Immunoliposome,
die irrelevantes Fab' trugen,
was nur das Zellwachstum bei relativ hohen Konzentrationen beeinflusste
(> 3,3 μg/ml).
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WI-38-Zellen,
eine nicht maligne Lungenfibroblast-Zelllinie, die minimale Niveaus
an p185HER2 exprimiert, wurden auch mit
Doxorubicin und mit Doxorubicin beladenen anti-p185HER2-Immunoliposomen
behandelt (4B). Freies Doxorubicin erzeugte
wieder eine signifikante dosisabhängige Zytotoxizität gegenüber WI-38-Zellen.
Allerdings erzeugten mit Doxorubicin beladene anti-p185HER2-Immunoliposome
eine stark reduzierte (20-fach geringere) Zytotoxizität gegenüber diesen
Zellen und waren von mit Doxorubicin beladenen Immunoliposomen,
die irrelevantes Fab' trugen,
nicht unterscheidbar. Diese Ergebnisse haben die Spezifität einer
anti-p185HER2-Immunoliposomenbehandlung für p185HER2-überexprimierende
Ziele gezeigt und weiter bestätigt,
dass die Zytotoxizität,
die gegenüber
SK-BR3-Zellen beobachtet wurde, nicht nur einfach aufgrund des Strömens von
Doxorubicin aus den anti-p185HER2-Immunoliposomen und in die Lösung erfolgte.
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Beispiel 5
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Internalisierung
von Immunoliposomen in das Zytoplasma der Zielzelle
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Um
die Internalisierung von Immunoliposomen in das Zytoplasma der Zielzelle
durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zu bestimmen, wurden
Liposome und Immunoliposome wie im Beispiel 1 mit der Zugabe von
Rhodaminphosphatidylethanolamin bei 1 Mol-% der Phospholipidkomponenten
hergestellt. Die sich ergebenden mit Rhodamin markierten Liposome
oder Immunoliposome wurden für
unterschiedliche Zeitdauern bei 37°C mit SK-BR-3-Zellen inkubiert,
die bis zur Subkonfluenz auf den Deckgläsern wachsen gelassen wurden.
Die Zellen wurden dann mit 3 % Paraformaldehyd fixiert, in 90 %
Glycerin/100 mM Tris, pH 8,5, enthaltend 0,1 % p-Phenylendiamin
(Sigma) als Antibleichreagens aufgebaut und mit einem Leitz Aristoplan Fluoreszenzmikroskop
oder einem Molecular Dynamics MultiProbe 2001 konfokalen Mikroskop
beobachtet.
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Um
die Internalisierung und intrazelluläre Disposition durch Elektronenmikroskopie
zu bestimmen, wurden Immunoliposome mit kolloidalen Goldpartikeln
von 5–15
nm beladen, wie zuvor beschrieben (Huang u.a., Cancer Res., 52:
5135–5143
(1992); Straubinger u.a., Cell, 32: 10639–1079 (1983). Gold enthaltende
Immunoliposome wurden bei 37°C
mit SK-BR-3-Zellen inkubiert, die auf Deckgläsern über verschiedene Zeiträume wachsen
gelassen wurden, und die Zellen wurden dann fixiert und für die Elektronenmikroskopie
bearbeitet. Eine Stabilisierung der Liposome wurde mittels Gerbsäure in der
primären
Fixierung erzielt (Straubinger u.a., supra), was eine angemessene
wenngleich nicht optimale Konservierung der Ultrastruktur vorsah.
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Der
Antikörper
rhuMAbHER2 wird schnell durch p185HER2-überexprimierende
Tumorzellen über
rezeptorvermittelte Endocytose internalisiert (Sarup u.a., Growth
Regul. 1: 72–82
(1991)). Um zu bestimmen, ob anti-p185HER2-Immunoliposome
in SK-BR-3-Zellen
internalisiert werden, wurden Zellen mit Rhodamin markierten Immunoliposomen über unterschiedliche
Zeitdauern behandelt, fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar
gemacht. SK-BR-3-Zellen, die mit herkömmlichen oder sterisch stabilisierten
Kontrollliposomen, denen Fab' fehlte,
behandelt wurden, zeigten weder an der Oberfläche noch im Inneren eine Rhodaminfluroreszenz,
was mit der Unfähigkeit
der Kontrollliposome, an die Zellen zu binden, konsistent ist. Bei
Behandlung mit herkömmlichen
anti-p185HER2-Immunoliposomen zeigten SK-BR-3-Zellen innerhalb
einer Behandlungsdauer von 30 Minuten intensive Fluoreszenzherde
sowohl an der Zelloberfläche
als auch intrazellulär.
Durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurde bestätigt, dass
Rhodaminfluoreszenz sowohl an der Zelloberfläche als auch internalisiert
im Zytoplasma von SK-BR-3-Zellen
vorhanden war. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit sterisch
stabilisierten anti-p185HER2-Immunoliposomen,
die hohe Konzentrationen an PEG-PE (6 Mol-%) enthielten, nach 30
Minuten zu einer minimalen intrazellulären Fluoreszenz. Weil es schien,
dass das Vorhandensein von PEG-PE die Immunoliposominternalisierung
retardierte, wurden sterisch stabilisierte Immunoliposome mit reduzierten
Konzentrationen an PEG-PE bewertet. Immunoliposome, die 2 Mol-%
PEG-PE enthielten, ergaben nach 30 Minuten einen dazwischen liegenden
Grad an intrazellulärer
Fluoreszenz, d.h. weniger als mit herkömmlichen Immunoliposomen gesehen
aber mehr als mit 6 Mol-% PEG-PE enthaltenden Immunoliposomen gesehen.
Trotz einer etwas retardierten Internalisierung reicherten sich
bei längerer
Inkubationszeit, wie beispielsweise 2 Stunden, die sterisch stabilisierten
Immunoliposome, die 2 % PEG-PE enthielten, intrazellulär an. Daher
wurde, während
anti-p185HER2-Immunoliposome in SK-BR-3-Zellen internalisiert
wurden, die Internalisierungsrate umgekehrt auf den PEG-PE-Gehalt der Immunoliposome
bezogen.
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Um
die intrazelluläre
Disposition von Immunoliposomen und ihren Gehalt zu untersuchen,
wurde eine Elektronenmikroskopie mittels Immunoliposomen, die verkapselte
kolloidale Goldpartikel enthielten, durchgeführt. SK-BR-3-Zellen, die 30
Minuten lang mit herkömmlichen
anti-p185HER2-Immunoliposomen behandelt wurden,
zeigten zahlreiche Gold enthaltende Immunoliposome, die an die Zelloberfläche gebunden
waren und intrazellulär
vorhanden waren. Es wurden viele Immunoliposome benachbart zu und
offensichtlich gebunden an die Zellmembran beobachtet. Einige Immunoliposome
wurden in überzogenen
Vertiefungen sowie in überzogenen
Vesikeln, Endosomen, multivesikulären Körpern und Lysosomen gefunden.
Diese intrazelluläre
Verteilung stimmt mit der Internalisierung über den Überzugsvertiefungsweg überein.
Allerdings wurden auch Immunoliposome beobachtet, die offensichtlich
mit der Zellmembran verschmolzen, und zwar ohne die Ausbildung einer überzogenen
Vertiefung. Darüber
hinaus tauchten einige Goldpartikel frei im Zytoplasma auf und waren
nicht mit einer liposomalen Kapsel oder einer membrangebundenen
Organelle verbunden. Goldpartikel, die frei im Zytoplasma auftraten,
könnten
von Fusionsereignissen zwischen Immunoliposomen und der Zellmembran
herrühren.
Alternativ können
sie anschließend
an eine Endocytose entstanden sein, wobei ein Entkommen der eingekapselten
Goldpartikel irgendwo entlang des Überzugvertiefungswegs auftritt.
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Beispiel 6
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In vivo Tumor
Lokalisierung und Bioverteilung von Immunoliposomen und Immunoliposomengehalt
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Jungen
(4–6 Wochen)
weiblichen SCID-Mäusen
wurden BT-474-Zellen in das subkutane Gewebe der Flanke oder der
Brustfettpolster injiziert und die Tiere zusätzlich mit subkutan implantierten Östrogenkügelchen behandelt,
um das Tumorwachstum dieser Zellen zu unterstützen. Wenn die palpierbaren
Tumoren eine Größe von mindestens
300 mm3 erreicht hatten (normalerweise 14
Tage nach der Inokulation), wurden Immunoliposome durch eine einzelne
intravenöse
Injektion (über
die Schwanzvene) oder eine einzelne intraperitoneale Injektion in
einem Volumen von ungefähr
200 μl,
enthaltend ungefähr
I μmol an
gesamtem Lipid verabreicht. Die Tiere wurden zu festgelegten Zeiten
nach der Injektion geopfert, die Organe mit Kochsalzlösung in
situ durchschwemmt und die Gewebe sofort für eine Analyse operativ entfernt.
Für die
Bioverteilung und Bildanalyse nach der Injektion von mit Rhodamin
markierten Immunoliposomen wurden frisch operativ entfernte Gewebe
fixiert und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Für die quantitative
Lokalisierung von Doxorubicin, das durch Immunoliposome abgegeben
wurde, wurden operativ entfernte Gewebe homogenisiert und einer
azidifizierten Ethanolextraktion unterworfen; das extrahierte Doxorubicin
wurde dann durch spektrofluorimetrische Untersuchung gemessen, wie
zuvor beschrieben (Gabizon u.a., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1484–1488 (1989)).
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Die
Bioverteilung von anti-p185HER2-Immunoliposomen
und ihre Fähigkeit,
sich auf Tumore zu begrenzen und dort in vivo anzureichern, wurde
in einem Tumor-Heterotransplantatmodell
bestimmt. In diesem Modell wurden immunodefiziente Mäuse, die
etablierte subkutane BT-474-Tumor-Heterotransplantate trugen, durch
eine einzelne intravenöse
oder intraperitoneale Injektion mit Immunoliposomen behandelt. Bilduntersuchungen
mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie wurden durchgeführt, um
mit Rhodamin markierte Immunoliposome in verschiedenen Geweben von
Tieren, die nach der Behandlung geopfert wurden, zu finden. Innerhalb
von 6 Stunden intravenöser
Injektion wurde eine Rhodaminfluoreszenz im Heterotransplantattumor
sichtbar gemacht, während
keine signifikante Fluoreszenz im umgebenden Muskel beobachtet wurde.
Diese Technik erlaubte allerdings keine präzise Darstellung von Immunoliposomen
im Tumorgewebe. Für
eine quantitative Bestimmung der Bioverteilung und Lokalisierung
von durch Immunoliposome abgegebenes Doxorubicin wurde Doxorubicin
von Gewebeextrakten von behandelten Tieren untersucht. 24 Stunden
nach der intraperitonealen Injektion hatte Doxorubicin, das durch
sterisch stabilisierte anti-p185HER2-Immunoliposome
abgegeben wurde, sich in den Tumorheterotransplantaten angereichert,
wobei niedrigere Niveaus an Doxorubicin in dem umgebenden Muskel
und im Blut gefunden wurden (Tabelle 2).
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Tabelle
2. anti-p185
HER2-Immunoliposomabgabe von
Doxorubicin in vivo: Bioverteilung 24 Stunden nach einer einzelnen
ip-Injektion.
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Beispiel 7
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Herstellung von Fab' tragenden Immunoliposomen
auf PEG
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Um
das spezifische Anvisieren und die Internalisierung der Immunoliposome
der vorliegenden Erfindung zu verbessern, wurden tumorspezifische
Fab'-Fragmente (rhuMAbHEr2-Fab') mit distalen Enden
von mit Liposomen transplantierten Polyethylenglycolketten über Sulfhydryl-reaktive
Maleimidgruppen konjugiert. Um die Linkergruppe (Maleimid) für eine Reaktion
mit SII von Fab' vorzusehen,
wurde α-Distearoylphosphatidylethanolaminocarbonyl-ω-malimidopropionylamidopolyethylenglycol
aus Distearoylphosphatidylethanolamin und einem heterobifunktionellem
PEG-Derivat (N-Hydroxysuccinimidyl-PEG-Maleimid)
gemäß Standardverfahren
synthetisiert. Das Maleimid-Derivat von PEG-PE wurde wie oben beschrieben
in die Liposomenherstellung aufgenommen, und das Fab'-Fragment wurde mit
dem Liposom über
die Sulfhydrylgruppe bei einem pH von 7,2 konjugiert.
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Die
Liposomzusammensetzung war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme,
dass M-PE entfernt wurde, da es nicht länger für die Verbindung des Antikörperfragments
notwendig war. Typischerweise lag PEG (PEG-PE) im Bereich von etwa
10 bis etwa 12 Mol-% des gesamten Phospholipids und Fab'-konjugiertes PEG-derivatisiertes
Lipid lag im Bereich von etwa 0,6 Mol-% bis etwa 1 Mol-% des gesamten
Lipids.
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In
der Kultur der HER-überexprimierenden
Brustkrebszellen hatten solche anti-Her2 sterisch stabilisierten
Liposome dieselbe Bindungs- und Internalisierungswirksamkeit unabhängig von
der Menge an mit Polyethylenglycol modifiziertem Phospholipid.