JP2000510825A

JP2000510825A - 標的細胞への最適内在化をもたらす免疫リポソーム

Info

Publication number: JP2000510825A
Application number: JP09537121A
Authority: JP
Inventors: シー．ベンツ、クリストファー; パパハジョプーロス、デメトリス; ダブリュ．パーク、ジョン; ホン、キールン; カーポティン、ドミトリ
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-04-18
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2000-08-22
Also published as: US7507407B2; ATE330637T1; AU2601297A; EP1655039A2; US20010016196A1; EP0912198B1; EP0912198A4; US7135177B2; US7871620B2; US6214388B1; EP1655039A3; EP0912198A1; US20100068255A1; CA2249352A1; ES2263175T3; DE69736178T2; CA2249352C; DE69736178D1; WO1997038731A1; US20070031484A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特徴的な細胞表面マーカーを担う標的細胞への薬剤の内在化を最適化させる免疫リポソームを提供する。当該免疫リポソームは、当該特徴的マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメイン、両親媒性小胞形成脂質およびポリエチレングリコール誘導脂質を含む。本発明はまた、増殖抑制治療薬を欠くが、なお標的細胞の成長および分裂を抑制することができる増殖抑制免疫リポソームを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】標的細胞への最適内在化をもたらす免疫リポソーム本発明はリポソームの分野に関する。特に本発明は、標的細胞上の特徴的なマーカーを特異的に標的とするリポソームであって、予想外の高率で細胞への取り込みをもたらす親水性ポリマーを４モルパーセントまで含むリポソームに関する。本発明は、米国立予防衛生研究所によって付与されるグラントP50-CA58207、G M28117、CA36773およびCA25526により政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。発明の背景多くの医薬および医薬として使用される可能性を有する薬剤は、水への溶解性の低さ、高レベルの抗原性、毒性または血清中での急速な分解という問題を抱えており、このことは適切な医薬製剤の開発を妨げている。これら問題の解決法の１つとして従来、水溶液に溶け、さらに当該薬剤が組織および血液と直接接触するのを防護する配送用担体中に当該薬剤を被包化する方法があった。特に、リポソーム技術による製剤化は極めて興味深い。リポソームは、水の層を被包化する同心円的に整列したリン脂質二重層で構成された小胞である。リポソームは、リン脂質が水溶液に曝されたときに偶発的に形成され、生物活性を有する多様な分子を収容することができる。リポソームは、薬理学的に活性を有する種々の分子の効能を強化するインビボ配送系として重要な手段であることが証明されている(Ostroら、「リポソーム、その生物物理学から治療学まで(Liposomes from Biophysics to Therapeutics)」、Dekker刊、ニューヨーク、pp.1-369(1987))。動物実験によって、リポソームはいくつかの抗癌剤および抗真菌剤の毒性を減少させることが示され、このことが有望な結果が期待される臨床試験につながった(Sculierら、J．Cancer Clin． Oncol.，24:527-538;Gabizonら、Eur．J．Cancer Clin．Oncol.，25:1975-1803( 1989);Treatら、J．Natl．Cancer Inst.，82:1706-1710(1990);Lopez-Berestein ら、J．Infect．Dis.，151:704-710(1985);Presantら、Cancer，62:905-911(198 8))。さらに、リポソームは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内感染を治療する抗寄生虫薬の効果的な担体であること、転移モデルでマクロファージを活性化して殺腫瘍性を獲得させる場合に有効であること、さらに被包化抗原に対する免疫反応を強化ししたがって人工ワクチンの創出を促進する場合に有効であることが示された（「感染症および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Thera py of Infectious Diseases and Cancer）」、Lopez-Berestein & Fidler編、Li ss刊、ニューヨーク(1989);Alvingら、Immunol．Lett.，25:275-280(1990)）。これらの効果の全ては、数分以内に血液循環から大半のリポソームを除去する肝および脾のマクロファージ細胞（単核食細胞系（ＭＰＳ）および細網内皮系( ＲＥＳ))の能力から生じる（「薬剤担体としてのリポソーム（Liposomes as Dru g Carriers）」、Gregoriadis編、Wiley刊、ニューヨーク(1988)）。しかしながら、そのようにリポソームが迅速に排除される性質により、疾患部位にＲＥＳを越えて薬剤を輸送するインビボ配送系としての可能性は制限される。最近の報告にはリポソームの血清半減期を延長させるために種々のポリマーの使用が記載されている。特に、モノシアロガングリオシド（ＧＭ₁）またはポリエチレングリコールの脂質誘導体のいずれかを含むリポソームの製剤化によってＭＰＳによる除去を回避し、血清半減期を顕著に延長できることが認められた(A llenら、FEBS Lette.，223:42-46(1987);Klibanovら、FEBS Lett.，268:235-237 (1990);Blumeら、Biochim，Biophys．Acta.，1029:91-97(1990);Allenら、Bioch im．Biophys．Acta，1066:29-36(1991);Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，88:11460-11464(1991);Seniorら、Biochim．Biophys．Acta.，1062 :77-82(1991);Allenら、Biochim．Biophys．Acta.，1068:133-141(1991))。単核食細胞系（ＭＰＳ）の細胞による循環リポソームのインビボでの迅速な除去は、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた脂質誘導体の作用によって克服できることが多くの報告によって示された。これらのリポソームは立体的安定化リポソームまたは“スチールス(Stealth)”リポソームと称される。１０００から５０００の範囲の分子量を有するＰＥＧを用いると循環の延長およびＭＰＳによる取り込みの減少が達成される（Woodle & Lasic．Bi ochim．Biophys．Acta，1113:171-199(1992)）。しかしながら、ＭＰＳによるこのリポソーム除去の減少に伴い多様な細胞による取り込みの減少も見られる（K ．D．Leeら、Biochim．Biophys．Acta，1103:185-197(1992)）。さらに、リポソーム表面の親水性ポリマーの存在は、リポソームと結合させた向標的部分が固有のリガンドを認識するのに干渉するようである。おそらくこれは、長鎖ＰＥＧ分子によって向標的部分の活性部位が立体的に隠蔽されるために生じる（Klibanov ら、Biochim．Biophys．Acta，1062:148-148(1991)）。最後に、リポソームによって輸送されるほとんどの治療薬は、それらの生物学的活性を発現させるために標的細胞の細胞質に入るが、一方、ほとんどのリポソームは標的細胞によって内在化されないか、または一般にエンドサイトーシス経路を介する（ここで取り込みが生じる）と理解されている。したがって、標的細胞に送られる実際の薬剤は、典型的には（例えばリポソーム自体の崩壊によってまたは“漏出”によって）リポソームから標的細胞の近傍で遊離され、続いて（拡散、エンドサイトーシス、食食作用または能動的輸送のいずれかによって）溶液から標的細胞によって取り込まれる必要がある。実際、ひとたび向標的抗体が標的に結合するや当該リポソームの脱安定化および分断化が実際に惹起され、それによってリポソームの内容物が遊離されるように免疫リポソームがデザインされた（米国特許第4957735号参照）。これら“標的感受性”リポソームでさえも、治療薬が標的細胞によって取り込まれる以前に大量の治療薬が溶液中に失われる。また別にリポソームがエンドサイトーシス過程によって内在化されたとしても、リポソームは最終的には水解小体（リソソーム）に取り込まれ、そこには多くの治療薬（例えばタンパク質）を分解することができる強酸状態が存在する。したがって、有効用量の治療薬の標的細胞細胞質への配送は、血清中での短い在留時間、在留時間を延長させた場合でも効率の悪い向標的能、標的細胞によって取り込まれる以前に溶液中に顕著な量の治療薬が失われること、およびエンドソーム／リソソーム経路における治療薬の分解によって妨害される。血清半減期が延び、特定の細胞を特異的に標的とすることができ、さらにまた標的細胞によって細胞質中に内在化され、それによって治療薬の損失またはエンドソーム／リソソーム経路における分解を回避できるリポソームを得ることが明らかに所望される発明の要旨本発明は、治療薬を標的細胞の細胞質へ配送するために最適化された新規な免疫リポソームを提供する。これらの免疫リポソームは血中半減期が延長されており、特定の細胞を特異的に標的とすることができ、さらに標的細胞によって細胞質中に内在化され、それによって治療薬の損失またはエンドソームリソソーム経路による分解を回避できる。したがって好ましい実施態様の１つでは、本発明は、特徴的細胞表面マーカーをもつ細胞の細胞質中への治療薬の内在化を最適化させる免疫リポソームを提供する。これらの免疫リポソームは、抗体のＦａｂ’ドメイン（この場合、当該Ｆａｂ’ドメインは特徴的マーカーと特異的に結合する）、リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質、ポリエチレングリコール誘導脂質（この場合、ポリエチレングリコールは約７５０Ｄから５０００Ｄ、より好ましくは約１２００Ｄから約３０００Ｄ、最も好ましくは約１９００Ｄの分子量を有する）、およびリポソーム内に含まれる治療薬を含む。当該誘導脂質は、総脂質の約１．２モルパーセントまで、より好ましくは約２．４モルパーセントまで、最も好ましくは約３．６モルパーセントまでの量で存在する。好ましい特徴的マーカーには増殖因子レセプターが含まれる。特に好ましいものはＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む増殖因子レセプターで、ＨＥＲ２が最も好ましい。Ｆａｂ’ドメインはヒト化Ｆａｂ’ドメインでもよいが、より具体的には抗ＨＥＲ２単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである。さらに増殖抑制免疫リポソームは、抗体のＦａｂ’ドメインとチオエーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）含むことができる。小胞形成脂質は、リン脂質、糖脂質、スフィンゴリピドまたはステロールを含むことができる。免疫リポソームは、約５０ｎｍから約５００ｎｍ、より好ましくは約７５ｎｍから約３００ｎｍの範囲、最も好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有する。リポソーム中の治療薬剤には、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピルビシン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダクチノマイシン、シクロフォスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮＵ、タキソール、タキソテアー（taxotere）および他のタキサン誘導体並びに単離物、カンプトテシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸が含まれる。特に好ましい免疫リポソームでは、当該抗体のＦａｂ’ドメインはrhuMAbHER2 のＦａｂ’ドメインで、当該Ｆａｂ’ドメインはマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）と結合したＦａｂ’ドメインをもち、小胞形成脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）で、ポリエチレングリコール誘導脂質はポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）で、この場合ポリエチレングリコール成分は約１９００Ｄの分子量を有し、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比は１５０：１００：３でＰＥＧ−ＰＥは総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する。別の特に好ましい実施態様では、抗体Ｆａｂ’ドメインは、ポリエチレングリコール誘導脂質の遠位端に結合される。この場合には、当該免疫リポソームは１種類のポリエチレングリコール誘導脂質を含むことができ、この事例ではＦａｂ ’ドメインは好ましくは少量のＰＥＧ−誘導脂質分画にのみ結合されるが、また別には免疫リポソームは２種またはそれ以上の異なるＰＥＧ誘導脂質を含むことができる。この場合は１種類のＰＥＧ誘導脂質はＦａｂ’抗体ドメインのリンカーとして働き、他方のＰＥＧ誘導脂質は（好ましくはより高濃度で存在する）“ 立体的”安定性を提供し、それによってリポソームの除去速度を減少させる。好ましい実施態様の１つでは、ＰＥＧ誘導脂質に結合するＦａｂ’は総リン脂質の約０．６モルパーセントから約１モルパーセントを含み、一方、総ＰＥＧ誘導脂質は総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントを含む。Ｆａｂ’は好ましくはＰＧＥ−ＰＥまたはＰＧＥ−ＤＳＰＥに結合する。本発明はまた、特徴的なマーカーをもつ細胞内への治療薬の内在化を最適化させる方法を提供する。当該方法は、上記に要約した免疫リポソームのいずれかと細胞を接触させ、リポソームの内容物を当該細胞に内在化させることを含む。この内在化は、リポソームと細胞膜の融合によるか、またはエンドサイトーシス小胞から早期に脱出することによる。別の好ましい実施態様では、本発明は、特徴的な細胞表面マーカーをもつ細胞と特異的に結合し、それによって当該細胞の分裂増殖または成長増殖を抑制する増殖抑制免疫リポソームを提供する。この免疫リポソームは、特異的に当該マーカーと結合するＦａｂ’ドメイン、およびリポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質を含む。しかしながら、典型的な薬剤配送リポソームと異なり、このリポソームは増殖抑制治療薬を含まず、さらに治療薬も全く含まないであろう。標的細胞の分裂増殖速度の減少が、中性緩衝液または水以外の薬剤を全く含まない“ 空の”リポソームによってもたらされる標的細胞の分裂増殖速度の減少より大きくても１０％未満、より好ましくは５％未満の場合に、ある組成物は増殖抑制治療薬ではないと定義されるであろう。好ましい特徴的マーカーは増殖因子レセプターを含む。特に好ましいものは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む増殖因子レセプターであるが、ＨＥＲ２が最も好ましい。Ｆａｂ’ドメインは、ヒト化Ｆａｂ’ドメイン、より具体的には抗ＨＥＲ２（抗P185HER2）単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインでもよい。増殖抑制免疫リポソームはさらに、抗体のＦａｂ’ドメインとチオエーテル結合を形成するマレインイミド由来ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）を含みうる。小胞形成脂質はリン脂質、糖脂質、スフィンゴリピドまたはステロールを含むであろう。増殖抑制免疫リポソームはまた親水性ポリマーを含むことができる。好ましい親水性ポリマーには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、モノシアロガングリオシド（ＧＭ₁）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）または硫酸セレブロシド（ＣＳ）が含まれる。脂質に取り込まれるとき、ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール誘導脂質、好ましくはポリエチレングリコール誘導リン脂質（例えばＰＥＧ−ＰＥ）として取り込まれるであろう。ポリエチレングリコールの分子量は、約７５０Ｄから約５０００Ｄ、より好ましくは約１２００Ｄから約３０００Ｄの範囲で、最も好ましくは約１９００Ｄである。リポソームは、約５０ｎｍから約５００ｎｍ、より好ましくは約７５ｎｍから約３００ｎｍの範囲の平均直径を有し、最も好ましくは約１００ｎｍである。特に好ましい免疫リポソームの１つでは、抗体Ｆａｂ’ドメインはrhuMAbHER2で、Ｆａｂ’ ドメインはＭ−ＰＥに結合し、小胞形成脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）で、ポリエチレングリコール誘導脂質はポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミンで、この場合、ポリエチレングリコール成分は約１９００Ｄの分子量を有し、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比は１５０：１００：３で、ＰＥＧ−ＰＥは総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する。本発明はまた、特徴的マーカーをもつ細胞の増殖を抑制する方法を提供する。この方法は、上記に要約した増殖抑制リポソームのいずれかと細胞を接触させることを含む。さらにもう１つの実施態様では、本発明はまた、上記で述べた増殖抑制剤または治療薬を運ぶ免疫リポソームのいずれかを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、治療的に有効な用量の免疫リポソームおよび医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含む。図面の簡単な説明図１は、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3細胞との結合を示す、流動細胞計測法（フローサイトメトリー）による測定結果の柱状図を示す。洗浄後に SK-BR-3細胞と結合した状態の免疫リポソームを、rhuMAbHER2−Ｆａｂ’フラグメントを認識するＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧによって検出した。SK-BR-3細胞は、通常の免疫リポソーム（Ａ）、立体的安定化（６モル％のＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム（Ｂ）、および遊離のrhuMAbHER2−Ｆａｂ’フラグメント（Ｃ）とともに同等な抗体濃度（３．３μｇ／ｍｌ）で保温した。図２は、抗ｐ１８５^HER2通常免疫リポソームのＢＴ−４７４細胞との結合を示す。（Ａ）方法の項で述べるように、単層培養のＢＴ−４７４細胞を競合¹²⁵Ｉ標識rhuMAbHER2の存在下で通常免疫リポソームで処理した。（Ｂ）（Ａ）に示したデータのスキャチャード変換（Schatchard transformation）。図３は、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3細胞に対する抗分裂増殖活性を示す。SK-BR-3細胞の単層培養を横軸に示す抗体用量の免疫リポソームで処理し、方法の項で述べるように相対的な細胞分裂増殖を求めた。抗体を欠くコントロール（対照実験）リポソームの場合はリポソーム濃度にしたがって投与し、適切に対応する免疫リポソームと同等なリポソーム濃度でプロットした。コントロール（無抗体）通常リポソーム；コントロール立体的安定化（６モル％ＰＥＧ−ＰＥ）リポソーム；通常免疫リポソーム；抗ｐ１８５^HER2立体的安定化（６モル％ＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム；遊離（無リポソーム）rhuMAbHER2−Ｆａｂ’；および遊離rhuMAbHER2二価抗体は符号一覧に表示したように示されている。図４は、ドキソルビシンを含む抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの細胞毒性を示す。ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ免疫リポソームには、方法の項で述べるようにドキソルビシンを包含させた。（Ａ）SK-BR-3細胞、（Ｂ）WI-38細胞。培養細胞を１時間以下のように処理した：通常免疫リポソーム（三角）；立体的安定化（２モル％ＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム（黒丸）；コントロール（無関係抗体）立体的安定化（２モル％ＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム（白丸）；または遊離ドキソルビシン単独（黒四角）。免疫リポソームは６０〜７０μｇ抗体／μｍｏｌリン脂質、および５５〜８０μｇドキソルビシン／μｍｏｌリン脂質を含み、抗体／ドキソルビシン比は０．８〜１．２であった。細胞は、方法の項で述べるように処理後３日で計測した。好ましい実施態様の説明定義および一般的パラメーター以下の定義は、本明細書の発明を説明するために用いられる種々の用語の意味および範囲を説明し既定するために記載される。本明細書では以下の略語が用いられる：ＤＯＸ、ドキソルビシン；Ｃｈｏｌ、コレステロール；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＳＭ、スフィンゴミエリン；Ｍ−ＤＰＥ、マレイミド誘導ジパルミチオールエタノールアミン；ＰＢＳ、燐酸緩衝食塩水；ＬＵＶ、大型単層小胞；ＭＬＶ、多層小胞；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ−ＰＥ、ポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン。 “両親媒性小胞形成脂質”という用語は、例えばリン脂質に代表されるような、疎水性および極性ヘッド基部分を有し、さらに単独で偶発的に水中で二層小胞を形成することができる脂質か、または（ｂ）リン脂質と結合して脂質二重層に安定的に取り込まれ、その際、当該二重膜の内部疎水領域とその疎水部分が接触し、さらにその極性ヘッド基部分が当該膜の外部極性表面に向かって並んでいる一切の両親媒性脂質を含むことを意図している。後者のタイプの小胞形成脂質の例はコレステロールおよびコレステロール誘導体、例えば硫酸コレステロールおよびヘミコハク酸コレステロールである。本明細書で用いられるように、“特異的な結合”という用語は、共有もしくは非共有反応または共有および非共有反応の組合せによって仲介される、酵素／基質、レセプター／作動薬、抗体／抗原、およびレクチン／炭水化物のような対合形成種の間で生じる結合を指す。当該２種の反応が非共有結合による複合体を形成する場合は、生じた結合は典型的には静電気的水素結合または親油性反応の結果である。したがって、“特異的な結合”は対合形成種の間で生じ、この場合、抗体／抗原または酵素／基質反応の特徴を有する結合複合体を生じる２つのものの間で相互反応が存在する。特に、特異的な結合は、対の一方と特定の種とが結合し、当該結合するものの相手方が所属する化合物の同一類内の他の種とは結合しないことを特徴とする。したがって、例えば抗体は、好ましくはただ１つのエピトープと結合し、タンパク質の同一類内の他のエピトープとは結合しない。本明細書で用いられる“リガンド”または“向標的部分”という用語は、一般に特定の標的分子と特異的に結合し、上記のように結合複合体を形成することができる全ての分子を指す。したがって、リガンドおよびその対応する標的分子は特異的結合対を形成する。その例には、抗体、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク質（例えばＣＤ４およびＣＤ８）、可溶化レセプタータンパク質（例えば可溶性ＣＤ４）、ホルモン、増殖因子および所望の標的細胞と特異的に結合するようなもの、並びに対応する核酸と塩基対相補性を介して結合する核酸が含まれるが、ただしこれらに限られるものではない。特に好ましい向標的部分には抗体および抗体フラグメント（例えばＦａｂ’ドメイン）が含まれる。 “免疫リポソーム”という用語は抗体または抗体フラグメントを含むリポソームを指し、当該抗体または抗体フラグメントは、溶液中に存在する可能性があるか、または細胞表面に結合している可能性がある特定の“標的”分子と当該リポソームを特異的に結合させることができる向標的部分として作用する。当該標的分子が、典型的には比較的過剰に（例えば１０倍以上）、かつ特定の細胞型、また別には、全てが特定の生理的状態を発現している多数の細胞型に付随して見出されるものである場合、当該標的分子は、当該細胞型の“特徴的マーカー”または当該生理的状態の“特徴的マーカー”と呼ばれる。したがって、例えば癌の特徴は、特定マーカー、例えば乳癌の場合はＨＥＲ２（c-erbB-2/neu）プロトオンコジーンの過剰発現ということができる。本明細書で用いられるように“親水性ポリマー”とは、脂質分子に結合した長鎖の高度に水和した可撓性天然ポリマーを指す。その例には、ポリエチレングリコール修飾またはポリプロピレングリコール修飾の脂質ＰＩもしくはＣＳ、またはガングリオシドＧＭ₁が含まれるが、ただしこれらに限られるものではない。 “モルパーセント”という用語は、リポソーム中の親水性ポリマーの百分率を指す場合は、別に記載が無いかぎりリポソーム中の総脂質に対して表される。したがって、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）対コレステロール比が１５０：１００であるリポソームでは、親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）の４モルパーセントはＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧの比が約１５０：１００：１０であることを表すであろう。 “分裂増殖”という用語は細胞の分割または有糸分裂を指す。分裂増殖は標準的アッセイ、例えば放射性ヌクレオチド（チミジン）の取り込みによって、または直接観察によって測定できる。薬剤配送における免疫リポソーム実施態様の１つでは、本発明は、治療薬をホストの特異的組織へ選択的に配送する免疫リポソームおよびこれらのリポソームの使用方法を提供する。本発明のリポソームは、標的組織細胞の細胞質中への当該リポソームの内在化を最適化させる組成物を用いる。“内在化を最適化させる”または“最適内在化”という語句は、それによって標的細胞の細胞質への最大の配送が達成され、したがって最大の治療効果が達成されるようなリポソーム内容物の配送を指すために用いられる。細胞質への免疫リポソームの内在化は、リポソームの血中半減期、リポソームのその標的細胞の認識および結合能力、並びに当該標的細胞細胞質中へのリポソームの取り込みの関数であることは理解されていろ。親水性ポリマーのリポソームへの添加は、リポソームの集塊形成（凝集）およびＲＥＳによるリポソームの取り込みの両方を低下させることによって血中半減期を高めることは周知である。高濃度の親水性ポリマーは、向標的部分またはリガンドによる認識と結合に干渉し、さらにその後の標識細胞による取り込みに干渉し、それによって標的細胞によるリポソーム内容物の内在化を減少させると一般的に考えられる。当該細胞の細胞質への最適内在化とは、親水性ポリマーおよび向標的のために適切なものを全く欠いているリポソームの半減期より極めて長い血中半減期をなお維持しながら、標的細胞細胞質への最大取り込みが達成される状態を指す。特に本発明は部分的には予想外の発見に依拠するが、これは、親水性ポリマー（例えばＰＥＧ−修飾脂質）を総（小胞形成）脂質の約３．６モルパーセントまでの量で含むリポソームは、予想外の効率で標的細胞の細胞質に内在化され、一方、親水性ポリマーを欠くリポソームで認められる血中半減期よりも実質的に長い血中半減期を維持するというものである。これは、リポソームの１つまたは２つ以上の脂質成分と結合したＦａｂ’フラグメントを含む免疫リポソームの場合に特に言えることである。さらに、３．６モルパーセントまでの親水性ポリマーを含むリポソームが向標的部分として抗体のＦａｂ’フラグメントと結合した場合、当該リポソームは、Ｆａｂ’単独の場合よりも高い細胞特異性および結合親和性を示すということもまた予想外の発見であった。実際、本発明の免疫リポソームによって達成される結合特異性は完全な抗体の結合親和性に匹敵しうるものである。完全な抗体は、抗体の特異性と反応迅速性（avidity）を大きく左右する１対の可変ドメイン“ アーム”を含む四量体であるので、この結果は特に驚くべきことである。１本の “ア一ム”のみから成るＦａｂ’領域は典型的には完全な抗体の有する特性と反応迅速性を欠いている。したがって、Ｆａｂ’フラグメントは典型的には貧弱な向標的部分を形成すると予想される。Ｆａｂ’フラグメントはリポソームのいずれの部分にも結合できるが、一方Ｆａｂ’が親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の遠位端に結合する場合は、たとえ高レベルの親水性ポリマー（例えば総リン脂質の１５モルパーセントまで、より好ましくは総リン脂質の約１０から１２モルパーセント）が存在していたとしても標的細胞による高い水準のリポソーム内在化が達成されるということは本発明の驚くべき発見であった。したがって、好ましい実施熊様の１つでは、本発明は標的細胞によって内在化されるリポソームを提供するが、当該リポソームは、親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の遠位端に結合させたＦａｂ’フラグメントを含む。当該Ｆａｂ’フラグメントは好ましくは大半の親水性ポリマーには結合されない。典型的には、Ｆａｂ’は、約１から約２０％の親水性ポリマーに、より好ましくは約４から約１０モルパーセントの親水性ポリマーに、最も好ましくは約６から約１０モルパーセントの親水性ポリマーにのみ結合されるであろう。したがってＦａｂ’フラグメントを含む親水性ポリマー（例えばＰＥＧ−Ｆａｂ’）は、したがって総リン脂質の０．１から２．０モルパーセント、より好ましくは約０．４から約１．０モルパーセント、最も好ましくは総リン脂質の約０．６から約１．０モルパーセントで存在する。本発明の免疫リポソームは、高レベルの標的特異性を維持し、（治療薬を運ぶ）リポソームそれ自体を効果的に内在化し、それによって治療薬の溶液中への顕著な損失または該治療薬のエンドソーム／リソソーム経路での分解を回避して、親水性ポリマーを欠くリポソームと比較してより長い血中半減期を維持し標的細胞細胞質への当該治療薬の配送を最適化させる。本発明のリポソームは、したがって特異的な標的細胞に治療薬を配送する担体として特に有用である。細胞増殖抑制物質としての免疫リポソーム本発明はまた、腫瘍細胞の分裂増殖を抑制するために用いられ、したがって増殖抑制治療薬を被包化することなく抗腫瘍活性を提供することができる増殖抑制免疫リポソームを提供する。実際、本発明の増殖抑制免疫リポソームは、それらが治療薬を含まないときに有効である。一般に、本発明の増殖抑制免疫リポソームは、特徴的なマーカーをもつ細胞と特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインおよび両親媒性小胞形成脂質を含む。特に当該リポソームは抗ＨＥＲ２単クローン性抗体のＦａｂ’ドメインと結合させることができる。好ましい実施態様では、当該抗体はヒト単クローン性抗ＨＥＲ２抗体のＦａｂ’フラグメント(rhuMAbH ER2-Fab')である。溶液中の遊離rhuMAbHER2−Ｆａｂ’と異なり、一価のＦａｂ ’フラグメントのリポソーム（膜）固着によって二価のrhuMAbHER2に匹敵する抗分裂増殖活性および抗腫瘍活性がもたらされる。溶液中の抗体rhuMAbHER2−Ｆａｂ ’はこの特性を持たない。一般的に、抗ＨＥＲ２免疫リポソーム中のＦａｂ’フラグメントの膜固着は、おそらくは腫瘍細胞表面上のｐ１８５^HER2の架橋を可能にすることによってこの抗分裂増殖活性を付与すると考えられる。Ｆａｂ’フラグメントはリポソームのいずれの部分にも結合させることができる。したがって、例えば実施態様の１つでは、当該Ｆａｂ’は直接リポソームに結合されるが、一方、別の実施態様では当該Ｆａｂ’は親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）に結合させることができる。上記で示したように、増殖抑制免疫リポソームは増殖抑制剤を含まない。“増殖抑制剤”とは、当該薬剤が投与された細胞の増殖速度を減少させる化学物質を指す。極端な事例では、増殖抑制剤はそれが投与された細胞に対して細胞毒性を有するかもしれない。本明細書で用いられるように、細胞の増殖速度とは細胞の分裂速度を指す。分裂速度の増加は典型的には代謝速度の増加に付随し、したがって分裂速度は（例えば標識された代謝前駆物質（例えばトリチウム標識チミジン）の取り込みによって）代謝速度を検出することによってアッセイできる。したがって、成長速度または分裂速度の増加は代謝速度の増加を示すと考えられ、逆もまた同様である。増殖抑制剤は当業者には周知で、ドキソルビシン、リシンＡ、ゲロニンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの組成物（例えば抗生物質）はそれらの主要な活性に付随する結果として僅かの増殖抑制活性を示すかもしれない。そのような組成物は本明細書では増殖抑制剤とは見做されない。“増殖抑制治療薬を含まないリポソーム”という語句は、本発明の増殖抑制免疫リポソームで得られる細胞の成長および分裂の抑制が、リポソーム／Ｆａｂ’構築物それ自体の結果であり、リポソーム内容物の結果ではないという事実を捉えることを意図している。したがって、本明細書で用いられる増殖抑制剤は、増殖抑制免疫リポソームに存在するとき、一切の治療薬または増殖抑制剤を欠く同じ免疫リポソームの投与によって認められる細胞分裂速度の減少より少なくとも１０％より大きい細胞分裂速度の減少を生じるリポソームが治療薬を全く含まず、したがって“空”のリポソームを投与した場合でさえ、本発明の増殖抑制リポソームは細胞の成長および分裂を抑制するが、一方、当業者には、増殖抑制治療薬以外の治療薬を被包化し、それによって二重の活性、追加活性、更なる追加活性を示すリポソームを達成することが望ましいことは理解されよう。したがって、例えば抗生物質を担持した免疫リポソームは、標的細胞の成長および分裂を抑制する能力と同様に抗生物質活性も合わせて示すであろう。本発明の増殖抑制リポソームおよび治療薬含有免疫リポソームは、腫瘍細胞の分裂増殖を抑制するために、または広範囲のホストで特定の細胞を標的として治療薬を送り込むために用いることができる。好ましいホストには哺乳類の種、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ゲッ歯類、ラルゴモルフ（largomorphs）などが含まれる。リポソーム組成物一般に、本発明の免疫リポソームは、１つまたは２つ以上の小胞形成脂質、向標的部分として作用する抗体のＦａｂ’ドメイン、および特に治療薬配送免疫リポソームの場合には、親水性ポリマーを含む。一般的には、小胞形成脂質は、治療薬が存在する場合はそれを被包化する二重層を形成するために作用し、親水性ポリマーはリポソームの集塊形成の防止およびＲＥＳによるリポソームの取り込みの低下のために作用してそれによって血中半減期を延長し、リガンドはリポソームを標的（すなわち特徴的マーカー、当該マーカーに対して当該リガンドは特異的である）を含む細胞または組織とリポソームを特異的に結合させるために作用する。Ｆａｂ’フラグメントの使用と合わせた低いモル百分率の親水性ポリマーによって、リポソームが特異的に標的に向かうことが可能になり、さらに予想外にも完全なリポソームが、標的細胞の細胞質内に高レベルで内在化されることになった。Ａ）小胞形成脂質小胞形成脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖（典型的にはアシル鎖および極性ヘッド基）をもつ脂質である。この部類に含まれるものは、リン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）で、この場合２つの炭化水素鎖は典型的には長さが約１４〜２２炭素原子で、さらに様々な程度の不飽和を有するか、または１４〜１８炭素鎖の飽和リン脂質である。またこの部類に含まれるものは、糖脂質（例えばセレブロシドおよびガングリオシド）である。好ましい実施態様では、リポソーム中の主要脂質成分はホスファチジルコリンである。多様な鎖の長さおよび多様な飽和度をもつ種々のアシル鎖基を有するホスファチジルコリンは利用可能であるか、または周知の技術によって分離もしくは合成できる。一般に、リポソームが濾過滅菌の目的のために特に約０．３ミクロン未満の大きさでなければならないときは、飽和度の低いホスファチジルコリンの方がより容易に大きさによって分けることができる。炭素鎖の長さがＣ₁₄からＣ₂₂の飽和脂肪酸を含むホスファチジルコリンが好ましい。一または二不飽和脂肪酸並びに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の混合物をもつホスファチジルコリンもまた用いることができる。本発明で有用なリポソームはまた、コリン以外のヘッド基（例えばエタノールアミン、セリン、グリセロールおよびイノシトール）を有するスフィンゴミエリンまたはリン脂質を含むことができる。特に、本発明の方法および組成物で有用なリポソームの生成に適切なリン脂質には、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β，γ−ジパルミトイル−α−レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、Ｎ−(２，３−ジ(９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ))−プロプ −１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、燐酸ジセチル、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン、ジ−ステアロイル−ホスファチジルコリン、ステアロイル−パルミトイル−ホスファチジルコリン、ジ−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ステアロイル −ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイル−ホスファチジルセリン、ジ−オレイル−ホスファチジルコリンなどが含まれる。燐非含有脂質もまた本発明の組成物のリポソームで用いることができる。これらには、例えばステアリルアミン、ドセシルアミン、パルミチン酸アセチル、脂肪酸アミドなどが含まれる。本発明のリポソームでの使用に適切な別の脂質は当業者には周知で、種々の周知の刊行物に記載されている（例えば以下の刊行物であるが、これらはともに援用により本明細書に含まれる：「マッカチョンの洗剤と乳濁剤(McCutcheon's De tergents and Emulsifiers)」および「マッカチョンの機能性素材(McCutcheon's Functional Materials)」、Allured Publishing Co.刊、リッジウッド、ニュージャージ）。好ましいリポソームは、ステロール（好ましくはコレステロール）を０．１から１．０のモル比（コレステロール：リン脂質）で含むであろう。最も好ましいリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン／コレステロール、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、およびスフィンゴミエリン／コレステロールである。少量（すなわち１０％未満）の他の誘導脂質もこれら上記の組成物を有するリポソームにしばしば存在する。本発明の重要な特徴にしたがえば、小胞形成脂質は比較的流動性の脂質でも、また比較的硬質な脂質でもよい。前者は、典型的には当該脂質相が、液体から液体結晶質への比較的低い融点（例えば室温または室温以下）を有することを意味し、後者は、当該脂質が比較的高い融点（例えば６０℃まで）を有することを意味する。一般に、より硬質な（すなわち飽和）脂質は、脂質二重層構造において膜剛性に寄与し、またより大きな二重層の血中での安定性にも寄与する。他の脂質成分（例えばコレステロール）もまた脂質二重層構造の膜剛性および安定性に寄与することが知られている。上記で述べたように、長鎖（例えばＣ₁₄〜Ｃ₂₂）飽和脂質＋コレステロールが標的組織（例えば固形腫瘍）に治療用組成物を配送する好ましい組成物の１つである。なぜならば、これらのリポソームは、それらが血流中を循環しているときに血漿中に薬剤を遊離する傾向を持たないからである。アシル鎖が種々の飽和度をもつリン脂質は市販ルートで入手できる。例えば、卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）はアバンチポーラリピド（Avanti Polar Lipids，Alabaster，アラバマ）から購入でき、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はナッターマン(Natterman，コローン、ドイツ)から入手できる。また別には、リン脂質は公表された方法にしたがって調製できる（例えば、 D．M．Small，「脂質の物理化学（The physical chemistry of lipids）」、Ple num Press刊、ニューヨーク(1986);D.D．Laslc，「リポソーム：その物理学から応用まで(Liposomes:from physics to applications)」、Elsevier刊、アムステルダム、ニューヨーク(1993)）。Ｂ）親水性ポリマー上記で述べたように、親水性ポリマーの存在はリポソームの血中半減期を延長させる傾向を有する（例えば次の文献を参照された：Woodleら、Biochim．Bioph ys．Acta.，1113:171-199(1992))。したがって、親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質またはガングリオシドＧ_M1）をリポソームに添加することがしばしば所望される。そのような成分の添加は、向標的部分がリポソームに結合するときにリポソームが凝集するのを防止する。これらの成分はまた当該リン脂質の循環寿命を増加させる手段を提供する。しかしながら、親水性ポリマーはＲＥＳによるリポソームの取り込みを減少させ、それによって血中半減期を延長させる一方で、同様に標的細胞による取り込みも付随して減少することが認められた。小胞形成脂質（コレステロールを除く）の１から４モルパーセントの濃度の親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）は、適切な血中半減期と合わせて最適な細胞取り込みを提供するということは、本発明の予想外の発見であった。種々の多くの方法をリポソームへの取り込みのためにＰＥＧ調製に用いることができる。好ましい実施態様では、ＰＥＧはＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）またはＰＥＧ誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）として取り込まれる。ＰＥＧ−ＰＥを調製する方法は周知で、典型的には活性化メトキシＰＥＧ（ただ１つの反応性末端をもつ）およびＰＥを用いることを必要とする。したがって、ＰＥＧ−スクシンイミジルコハク酸塩を塩基有機溶媒中で反応させることができる(Klibanovら、FEBS Lett.，268:235-237(1990))。ＰＥＧ−ＰＥの特に好ましい調製方法は、ＰＥＧとカルボニルジイミダゾルとの反応とそれに続くＰＥの添加を基にしている(Woo dleら、Proc．Intern．Symp．Control．Rel．Bioact．Mater.，17:77-78(1990); Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:11460-11464(1991);Alle nら、Biochim．Blophys．Acta.，1066:29-36(1991);Woodleら、Biochim．Biophy s．Acta.，1105:193-200(1992);Woodleら、Period．Biol.，93:349-352(1991)) 。同様に、塩基性有機溶媒中の塩化シアヌル活性化ＰＥＧも文献に記載されている(Blumeら、Biochim．Biophys．Acta.，1029:91-97(1990)および米国特許第521 3804号(これは参照により本明細書に含まれる))。完全に異なる手法は予め形成したリポソームにＰＥＧを結合させることによるもので、塩化トレシル活性化ＰＥＧを用い、これを続いてＰＥ含有リポソームに高ｐＨ条件下で添加する(Senio rら、Biochim．Biophys．Acta.，1-62:77-82(1991))。誘導ＰＥＧもまた市販ルートで入手できる。したがって、例えばＰＥＧ−ＰＥはアバンチポーラリピド（ Avanti Polar Lipids，Alabaster，アラバマ）、またはリポソームテクノロジー (Liposome Technology，Menlo Park，カリフォルニア)から入手できる。他の多くの結合も利用できることは当業者には理解されるところである。Ｃ）Ｆａｂ’抗体フラグメント好ましい実施態様では、本発明のリポソームは抗体のＦａｂ’領域と共役させられるが、当該領域は、Ｆａｂ’抗体フラグメントを誘導した標的分子（例えば特徴的マーカー）をもつ標的細胞とリポソームを特異的に結合させる向標的部分として作用する。一般的には、抗体のＦａｂ’領域は、抗体の一方のアームの可変領域およびＣ_H１領域を含む単量体を表す。 “抗体”とは、実質的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによってコードされた１つまたは２つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。認定された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常領域遺伝子とともに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロンとして分類されるが、これらは順にそれぞれ免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含むことが分かっている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの“軽鎖”（約２５ｋＤ）および１つの“重鎖”（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ−末端は、主に抗原認識に必要な約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）という用語はそれぞれこれら軽鎖および重鎖を指す。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼの消化によって生成された多数のよく性状が調べられたフラグメントとして存在するかもしれない。特に、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合より下で抗体を消化しＦ(ａｂ)'₂を生じる。Ｆ(ａｂ)'₂は、それ自体Ｖ_H−Ｃ_H1にジスルフィド結合によって結合した軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ(ａｂ)'₂は温和な条件下で還元され、ヒンジ領域内のジスルフィド結合が破壊され、それによってＦ( ａｂ)'₂二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、本質的にはヒンジ領域の一部分をもつＦａｂである（抗体フラグメントのより詳細な専門用語については以下を参照されたい：「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」、W．E．Paul編、Raven Press刊、ニューヨーク(1993)）。Ｆａｂ’ドメインが無傷の完全な抗体の消化の関係から規定される一方で、そのようなＦａｂ’フラグメントは、化学的または組換えＤＮＡ技術のいずれかによって新規に合成できることは当業者には理解されよう。本発明で用いられるＦａｂ’領域は、動物（特にマウスまたはラット）またはヒト起源の抗体に由来するか、またはキメラ（Morrisonら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA，81:6851-6855(1984)、この文献は参照により本明細書に含まれる）もしくはヒト化(Jonesら、Nature，321:522-525(1986)およびイギリス特許出願公告公報第8707252号、両文献とも参照により本明細書に含まれる）されていてもよい。Ｆａｂ’領域は、リポソーム内容物を配送することを所望する細胞の表面分子または特徴的マーカーと特異的に結合するように選択される。分子は、それが細胞型また別にはその全てが特定の生理的状態（例えば形質転換）を発現している多数の細胞型に付随して見出される場合、当該細胞、組織または生理学的条件に特徴的である。固有の特徴的マーカーは、好ましくは特定の組織もしくは細胞型の細胞表面に、または特定の生理的状態を発現している組織もしくは細胞型の表面に見出され、当該生物の他の組織もしくは細胞型には見出されない。しかしながら、それほどの当該マーカーの特異性レベルが要求されないことがしばしばであることは当業者には理解されよう。例えば、特徴的な細胞表面マーカーは、非標的組織のみが当該リポソームに接近可能でない場合十分な組織特異性を示すであろう。また別には、有効な特異性は、他の組織と比較したとき標的組織におけるマーカーの過剰発現によって達成できるであろう。これによって標的組織による優先的な取り込みがもたらされ、有効な組織特異性が得られるであろう。したがって、例えば多くの癌は、細胞表面マーカー(例えば乳癌の場合はＨＥＲ２(c- erbB-2，neu)プロトオンコジーンによってコードされるレセプター)の過剰発現によって特徴づけられる。標的として所望される個々の組織にしたがって、リポソームに良好な特徴的マーカーを提供する多数の細胞表面マーカーが存在することは当業者には理解されるところであろう。これらの細胞表面マーカーには、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、ＭＨＣ複合体、およびレセプタータンパク質（例えばＨＥＲ、ＣＤ４およびＣＤ８レセプタータンパク質）とともに他の増殖因子レセプタータンパク質が含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない。増殖因子レセプターは特に好ましい特徴的細胞表面マーカーである。増殖因子レセプターは、特異的に増殖因子と結合し、それによって個々の増殖因子に特徴的な細胞反応を仲介する細胞表面レセプターである。本明細書で用いられる“増殖因子”という用語は、細胞の分裂もしくは分化を活性化もしくは刺激するか、または運動性もしくはタンパク質の分泌のような生物学的反応を刺激するタンパク質またはポリペプチドリガンドを指す。当業者には増殖因子はよく知られており、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン１（ＩＬ１）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン７（ＩＬ７）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない。本明細書で用いられる増殖因子という用語にはサイトカインおよびコロニー刺激因子が含まれるということは当業者には理解されよう。特に好ましいマーカーは、増殖因子レセプターのＨＥＲ類に見出される。さらに具体的には、ＨＥＲＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４がより好ましく、ＨＥＲ２が最も好ましい。ＨＥＲレセプターは、それ自体高度に特異的な抗体標的を提供するタンパク質のチロシンキナーゼを含む。したがって実施態様の１つでは、ＨＥＲ２のＰ１８５チロシンキナーゼは、本発明の免疫リポソームで用いられるＦａｂ’抗体に対して最も好ましい標的を提供する。特徴的マーカーは天然に存在するマーカーである必要はなく、むしろ個々の標的細胞に導入できることが必要であることは理解されよう。これは、細胞または組織に特定のマーカーを直接付加することによって達成できるが、例えば特定の標的組織にマーカーを直接注射するか、また別には標的組織によって選択的に取り込まれるマーカーを生物体全体に投与することによって実施される。ある実施態様では、マーカーは、発現カセット中の核酸によってコードされる遺伝子産物であろう。当該マーカー遺伝子は、特定の標的細胞でのみ活性を有するプロモーターの制御下にあるであろう。したがって、当該発現カセットを含むベクター導入は、当該特定の標的細胞でのみ当該マーカーの発現をもたらすであろう。特徴的マーカーを標的細胞に導入するために組換えＤＮＡ技術を用いる多数の手法があることは当業者には理解されよう。好ましい実施態様の１つでは、当該向標的部分は、増殖因子レセプターの生成物または成分、特にＨＥＲ２(c-erbB-2，neu)プロトオンコジーンの生成物と特異的に結合するであろう。向標的部分がＨＥＲ２によってコードされる増殖因子レセプター−チロシンキナーゼであるタンパク質ｐ１８５^HER2と結合することが特に好ましい。タンパク質ｐ１８５^HER2は乳癌で通常過剰に発現される（Slamon ら、Science，235:177-182(1987)）。向標的部分の、他の適切な標的には、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、これらレセプターの組合せ、並びに他の癌に付随するマーカーが含まれるが、ただしこれらに限られるものではない。他の興味がもたれる抗体には、ＢＰ９６(Friedmanら、Cancer Res.，53:33 4-339(1993))、ｅ２３からｅｒｂＢ２(Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 89:5867-5871(1992))、前立腺癌のＰＲ１(Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，90:547-551(1993))および卵巣癌のＫ１(Changら、Int．J．Cancer，50:3 73-381(1992))が含まれる、ただしこれらに限られるものではない。本発明の免疫リポソームは、当業者に周知の種々の技術によりＦａｂ’抗体ドメイン部分をリポソームに取り込ませることによって調製できる。例えば、ビオチン共役Ｆａｂ’はストレプトアビジン含有リポソームと結合させることができる。また別にはビオチン付加Ｆａｂ’は、アビジンまたはストレプトアビジンリンカーによってビオチン誘導リポソームに共役させることができる。したがって、例えばビオチン付加単クローン性抗体はビオチンを付加して、アビジンリンカーの手段によりビオチン付加ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームに結合させられた（例えば次の文献を参照のこと:Ahmadら、Cancer Res.，52:48 17-4820(1992)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。リポソーム当たり典型的には約３０から１２５、より好ましくは典型的には約５０から１００Ｆａｂ’分子が用いられる。好ましい実施態様では、向標的部分は直接リポソームに共役させることができる。直接共役させる手段は当業者には周知である。例えば次の文献を参照されたい :G．Gregoriadis，「リポソーム技術（Liposome Technolog）」、（CRC Press刊、Boca Raton，フロリダ(1984)）およびD.D．Lasic，「リポソーム：その物理学から応用まで(Liposomes:from physics to applications)」、（Elsevier刊、アムステルダム、ニューヨーク(1993)）。特に好ましいものはチオエーテル連結による共役である。これは、抗体をマレイミド誘導脂質(例えばマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）またはジパルミトイルエタノールアミン(Ｍ−ＤＥＰ))と反応させることによって達成できる。この手法はマーチンらにより詳細に記載されている（Martinら、J．Biol．Chem.，257:286-288(1982 )、この文献は参照により本明細書に含まれる）。別の好ましい実施態様では、向標的部分（例えばＦａｂ’フラグメント）は親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）に結合される。向標的分子をポリマーリンカーに結合させる手段は当業者には周知である(例えば以下を参照のこと：「単クローン性抗体:基礎と応用(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications)」、第４章、Birch & Lennox編、John Wiley & Sons，Inc.刊、ニューヨーク(1995 );Blumeら、Biochem．Biophys．Acta.，1149:180-184(1993))。特に好ましい実施態様では、Ｆａｂ’フラグメントはＦａｂ’の−ＳII基を介してマレイミド誘導ＰＥＧに連結される。リンカー基を供給するために、標準的な方法にしたがってジステアロイルホスファチジルエタノールアミンおよび異種二官能基ＰＥＧ誘導体、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ−マレイミドからα−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ω−マルイミドプロピオニルアミドポリエチレングリコールを合成する。このＰＥＧ−ＰＥのマレイミド誘導体を前述および下記で述べるようにリポソームの調製物に混合し、Ｆａｂ’フラグメントをｐＨ７．２でスルフヒドリル基を介してリポソームと共役させることができる。リポソームの調製例えば以下の文献に記載されているように多様な方法がリポソームの調製に用いられる:Szokaら、Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，9:467(1980);米国特許第4186 183号、4217344号、4235871号、4261975号、4485054号、4501728号、4774085号、4837028号、4946787号；ＰＣＴ出願公告公報WO91/17424号；Szoka & Papahadj opoulos，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:4194-4198(1978);Deamer & Bangham ，Biochim．Biophys．Acta.，443:629-634(1976);Fraleyら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，76:3348-3352(1979);Hopeら、Biochim．Biophys．Acta.，812:55-6 5(1985);Mayerら、Biochim．Biophys．Acta.，858:161-168(1986);Williamsら、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:242-246(1988)；「リポソーム(Liposomes)」、Marc J．Ostro編、Marcel Dekker，Inc.,刊、ニューヨーク(1983)、第１章；H opeら、Chem．Phys．Lip.，40:89(1986)（これらは全て参照により本明細書に含まれる）。適切な方法には、例えば、音波破砕、噴射、高圧／均質化、微細流動化、洗剤透析、小型リポソーム小胞のカルシウム誘発融合、およびエーテル注入法が含まれろが、全て当技術分野では周知である。１つの方法によって多様なサイズの多重薄膜小胞が生成される。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性気体下で乾燥させて薄い脂質フィルムを形成する。所望される場合は、当該フィルムを適切な溶媒（例えば第三ブタノール）に再溶解し、続いて凍結乾燥させてより均質な脂質混合物を生成する。これはさらに容易に水和することができる粉末様の形状である。このフィルムを緩衝水溶液で覆い、典型的には１５〜６０分震盪して水和させる。得られる多重薄膜小胞のサイズ分布は、より激しい震盪状態の下で脂質を水和させることによって、またはデオキシコレートのような可溶化洗剤を添加することによって一層小さなサイズへとシフトさせることができる。好ましい実施態様では、多重薄膜リポソームは、報告された逆相蒸発法(Szoka & Papahadjopoulos，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:4194-4198(1978)）によって製造される。単層薄膜小胞は一般に音波破砕または噴射によって調製される。音波破砕は一般に、氷浴中でチップ型音波発生装置（例えばブランソン(Branson)チップ型音波発生装置）を用いて実施される。典型的には、懸濁物は数回の音波破砕サイクルに付される。噴射は生体膜噴射装置(例えばリペックスバイオメンブレン噴射装置(Lipex Biomembrane Extruder))によって実施できる。噴射膜の規定された孔サイズによって特定サイズの単層薄膜リポソーム小胞を生成することが可能である。リポソームはまた、非対称性セラミックフィルター（例えばセラフローマイクロフィルター（Ceraflow Microfilter、ノートン社(Norton Company，Worce ster，メリーランド)より市販）を通して噴射させて生成できる。リポソームの調製に続いて、生成中にサイズ分けされていないリポソームを所望のサイズ範囲を得るためにサイズ分けして比較的狭いリポソームサイズ分布を達成することができる。０．２〜０．４ミクロンのサイズ範囲ではリポソーム懸濁液を通常のフィルター（典型的には０．２２ミクロンフィルター）によって濾過滅菌することができる。フィルター滅菌法は、リポソームが約０．２〜０．４ミクロンまでサイズ分けされている場合は高処理量で実施できる。リポソームを所望のサイズに分けるにはいくつかの技術が利用できる。サイズ分け方法の１つは米国特許第4529561号または4737323号（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。水浴式またはプローブ式音波破砕によってリポソーム懸濁液を音波破砕して、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さな単層薄膜小胞まで徐々にサイズを減少させる。別の方法は均質化（ホモジェナイゼーション）で、これは、大きなリポソームを小さなものに分断する剪断エネルギーを用いる。典型的な均質化方法では、選択したリポソームサイズ（典型的には約０．１から０．５ミクロン）が認められるまで、多層薄膜小胞を標準的な乳濁液均質化装置中において再循環させる。リポソーム小胞のサイズは、ブルームフィールドが記載したように擬似電気光分散（ＱＥＬＳ）によって決定できる（Bloomfield，Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，10:421-450(1981)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。リポソームの平均直径は生成リポソームの音波破砕によって減少させることができる。断続的音波破砕サイクルとＱＥＬＳ測定を交互に実施して効果的なリポソーム合成を導くことができる。小孔ポリカーボネート膜または非対称性セラミック膜を通すリポソーム噴射もまた、リポソームサイズを減少させて比較的良好に限定されたサイズ分布を得る有効な方法である。典型的には、所望のリポソームサイズが得られるまで懸濁液を当該膜に１回または２回以上通して循環させる。リポソームをより小さな孔の膜から連続的に噴射させ、リポソームサイズを徐々に減少させることができる。本発明で使用するためにはリポソームは約０．０５ミクロンから約０．１５ミクロンのサイズを有する。より好ましくはリポソームは約０．０５から０．５ミクロンのサイズを有する。免疫リポソームの内容物使用できる治療薬は下記に挙げた化合物を含むいずれかの化合物である。これらは、適切な積載率でリポソームに安定的に捕捉され、治療的に有効な用量で投与できる（用量は下記の各化合物の後ろの括弧内に表示されている、ｍ²は体表面積を指す）。これらは、両親媒性抗腫瘍化合物、例えば植物アルカロイドビンクリスチン（１．４ｍｇ／ｍ²）、ビンブラスチン（４〜１８ｍｇ／ｍ²）およびエトポシド（３５〜１００ｍｇ／ｍ²）、並びにアントラサイクリン系抗生物質( ドキソルビシン（６０〜７５ｍｇ／ｍ²）、エピルビシン（６０〜１２０ｍｇ／ｍ²）およびダウノルビシン(２５〜４５ｍｇ／ｍ²))を含む。水溶性抗代謝物質（例えばメトトレキセート（３ｍｇ／ｍ²）、シトシンアラビノシド（１００ｍｇ／ｍ²）およびフルオロウラシル(１０〜１５ｍｇ／ｍ²))、抗生物質（例えばブレオマイシン（１０〜２０単位／ｍ²）、マイトマイシン（２０ｍｇ／ｍ²）、プリカマイシン（２５〜３０μｇ／ｍ²）およびダクチノマイシン（１５μｇ／ｍ²）、並びにアルキル化剤（シクロホスファミドおよびその誘導体（３〜２５ｍｇ／ｋｇ）、チオテパ（０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇおよびＢＣＮＵ（１５０〜２００ｍｇ／ｍ²）を含む）もまたこの場合に有用である。他の適切な薬剤には、アクラシノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、シスプラチンおよび他の白金II類似体が含まれる。リポソームはまた、タキソール、タキソテア、ジヒドロキシタキサン、カンプトテシン並びに他のタキサン誘導体および単離物を含むタキサン系物質を含むことができる。さらに、リポソームは被包化した腫瘍治療用ペプチド（例えば植物または細菌由来毒素）およびタンパク質薬剤（例えばＩＬ−２および／またはＴＮＦ）、および／または免疫調節剤（例えばＭ−ＣＳＦ）を含むことができる。これらは、単独でも抗腫瘍薬剤（例えばアントラサイクリン系抗生物質）と組み合わされて存在してもよい。免疫リポソームは、フッ素化ピラミジンおよびプリン塩基またはヌクレオシド含むことができる。免疫リポソームはまたオリゴヌクレオチドのような核酸を含むことができるが、これらは、天然または修飾塩基を含み、ホスホジエステルヌクレオチド間連結または修飾ヌクレオチド間連結（例えばホスホロチオエートまたはポリアミド連結）を有する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合による転写または翻訳を阻止するためにアンチセンスまたは三重体形成分子を用いてもよいことは当業者には理解されよう。また別には、核酸を用いて細胞を形質転換させ、異種タンパク質の発現を誘発させてもよい。この後者の場合には当該核酸は発現カセットを含むが、このカセットはプロモーターの制御下で発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列を含む。治療組成物の免疫リポソームへの積載通常の薬剤をリポソームに積載する方法は当業者には周知である。最も一般的な方法には、被包化技術および膜電位差積載法が含まれる。被包化技術では、リポソームを作製する緩衝液中に薬剤を入れる。後者の方法は、米国特許第488517 2号、5059421号および5171578号に詳細に開示されている（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。簡単に記せば、膜電位差積載法は、適切な水性媒体中に溶解させたとき荷電された状態で存在することができる薬剤であれば、本質的にいずれの一般的薬剤にも用いることができる。薬剤はリポソーム膜中に割入できるように比較的親油性であることが好ましいであろう。膜電位差は、リポソーム二重層間または向標的部分リポソーム共役物間で生じ、薬剤はこの膜電位差の手段によってリポソームに積載される。膜電位差は、１つまたは２つ以上の荷電種（例えばＮａ⁺、Ｋ⁺および／またはＨ⁺）について膜の表裏で濃度勾配をつくるこによって得られる。この濃度勾配は、異なる内部媒体と外部媒体をもつリポソームまたは向標的部分リポソーム共役物を生成することによって作製される。したがって、イオン化したとき陽性に荷電される薬剤については、外部電位と比較して陰性の内部電位を有する膜電位差を膜の表裏で作製し、一方、陰性に荷電される薬剤については反対の向きが用いられる。血中半減期のアッセイ標的組織にリポソームを局在化させるために要求されることの１つは、投与後の免疫リポソームの血中における寿命の延長である。免疫リポソームの血中寿命の測定法の１つとして、リポソーム投与後のそれぞれの時間で求められる血液／ＲＥＳ比がある。典型的には、標識（例えば蛍光マーカー、高密度電子試薬または放射性マーカー）をリポソームの内部に含むかまたはリポソームを構成する脂質と結合した状態で含む免疫リポソームをテスト生物に注射する。一定の時間後に、当該生物を殺処分し、血中で検出される標識量（例えば発光測定またはシンチレーション計測による）を個々の組織（例えば肝または脾）に局在する量と比較する。血中免疫リポソームの保持タイムコースもまた、標識含有リポソームの投与後一定間隔で血液をサンプリングして当該循環中に残留する標識量を決定することによって簡単に求めることができる。結果は最初の投与量の部分として表すことができる。標的細胞の細胞質内への取り込みのアッセイと組織分布の決定標的細胞細胞質内への免疫リポソームの取り込みおよび内在化は、標識（例えば蛍光マーカー、高密度電子試薬または放射性マーカー）を含む免疫リポソームを投与し、続いて標的細胞の細胞質内の当該標的の有無を検出することによって同様に決定できる。例えば、リポソームを構成すろ脂質に共役させた蛍光マーカー（例えばローダミン）を含む免疫リポソームを生物に、または簡単に培養細胞に投与できる。続いて組織または細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出できる。同様に、高密度電子標識（例えば金）を用い電子顕微鏡により検出してもよい。適切な多くの標識が有り、検出方法は標識の選択により左右されることは当業者には理解されよう。免疫リポソームの抗分裂活性のアッセイ本発明は、細胞表面レセプターに対して作製されたＦａｂ’向標的部分をもつ、本質的に空の免疫リポソームを構成する増殖抑制免疫リポソームを提供する。特に好ましいものは増殖因子レセプターである。細胞分裂の特に効果的な抑制物質であるＦａｂ’免疫リポソームの特定は日常的なスクリーニングを用いて達成できる。このスクリーニングは、細胞が増殖因子または他の特徴的な細胞表面マーカー（それに対してＦａｂ’フラグメントが作製される）をもつ細胞培養を提供し、当該培養細胞を被験免疫リポソームと接触させ、さらに細胞分裂速度に生じた変化を測定することを必要とする。細胞の分裂速度を測定する手段は当業者には周知である。例えばある手法では、分裂速度は、一定の時問における実際の細胞数における変化を測定することによって直接評価できる。したがって、実施例３で説明するように、腫瘍細胞（例えばSK-BR-3またはBT-474細胞）を単層培養で増殖させ、続いて抗体濃度を基準に種々の濃度の免疫リポソームと３７℃で保温した。４日間の持続処理の後、細胞単層培養をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット色素（０．５％メタノール溶液）で染色し、以前に報告(Hudziakら、Mol．Cell Bi ol.，9:1165-1172(1982)、この文献は参照により本明細書に含まれる)にしたがって相対分裂を求めた。また別には、細胞分裂速度の増加は、典型的には代謝速度の増加を伴うことは周知である。したがって分裂は、被験免疫リポソームに暴露した細胞の代謝速度の変化を測定することによって間接的に評価できる。代謝速度を測定する多くの手段は当業者には周知である。特に好ましい手法の１つは、標識した代謝前駆物質（例えばトリチウム化チミジン）の取り込み速度を測定することである。簡単に記せば、これは〔³Ｈ〕−チミジンを免疫リポソームを含むテスト培養および免疫リポソームを欠くコントロール培養に与えることによって達成される。一定時間後、細胞を採集し、細胞によって取り込まれた〔³Ｈ〕−チミジン量を標準的技術（例えばシンチレーション計測）を用いて測定する。テスト細胞とコントロール細胞の比較によって代謝における変化、したがって分裂速度の変化が示される。医薬組成物本発明の免疫リポソームを含む医薬組成物は標準的な技術にしたがって調製され、さらに医薬的に許容される担体を含む。一般に通常の食塩水が医薬的に許容できる担体として用いられるであろう。他の適切な担体には、例えば水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが含まれるが、これらの担体は安定性強化のために糖タンパク質（例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含む。これらの組成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌できる。得られた水溶液は使用のために梱包されるか、または無菌的状態で濾過され凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と混合される。組成物は、生理的状態に近づけるために医薬的に許容される補助剤(例えばｐＨ調節および緩衝剤、浸透圧調節剤(例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど))を含むことができる。さらに、リポソーム懸濁液は、貯蔵時の遊離ラジカルおよび脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。親油性遊離ラジカル吸収剤、例えばアルファトコフェノールおよび水溶性鉄特異的キレーター（例えばフェリオキサミン）が適切である。医薬製剤中の免疫リポソームの濃度は大きく変動し（すなわち、重量で約０．０５％未満から、通常は約２〜５％もしくはそれ未満から１０〜３０％まで）、用いられる投与態様にしたがって主に液体の容量、粘度によって選択される。例えば、濃度は、処置に関連して液体の充填量を減少させるために増加させることができる。これは、粥状硬化症付随うっ血性心不全または重篤な高血圧の患者では特に所望されるであろう。また別には、刺激性脂質を含む免疫リポソームは、投与部位における炎症を軽減させるために希釈してもよい。投与される免疫リポソーム量は、用いられる個々のＦａｂ’、処置される症状、配送される治療薬および医師の判断によって左右される。投与される免疫リポソームの量は、一般に、治療的に有効用量の個々の薬理学的物質を配送するために十分な量であろう。治療的に有効な用量を配送するために必要な免疫リポソームの量は、上記の取り込みアッセイによって決定できる。種々の薬理学的物質について治療的に有効な用量は当業者には周知で、上記の多数の薬剤について代表的な範囲が示されている。典型的な免疫リポソーム用量は、一般的には約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重であろう。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に（すなわち動脈内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内）投与される。より好ましくは、当該医薬組成物は、瞬時大量（ボーラス）注射により静脈内または腹腔内に投与される。このような使用に適した具体的な製剤化は成書に記載されている（「レミントンの医薬品科学(Remin gton's Pharmaceutical Sciences)」（１７版）、Mack Publishing Company刊、フィラデルフィア、ペンシルバニア(1985)）。典型的には、これら製剤は、許容可能な担体（好ましくは水性担体）中に懸濁させたリポソーム溶液を含むであろう。多様な水性担体（例えば水、緩衝水、０．９％等張食塩水など）を用いることができる。これらの組成物は通常のよく知られた滅菌方法によって滅菌するか、または濾過滅菌される。得られた水溶液を使用のために梱包するか、または凍結乾燥する。この凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と混合される。当該組成物は、生理的条件に近似させるために必要な医薬的に許容できる補助剤、例えばｐＨ調節および緩衝剤、浸透圧調節剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウリル酸塩、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含むことができる。実施例本発明を以下の実施例によって説明する。これらの実施例は説明のために提供されるが、本発明を制限するものではない。実施例１リポソームおよび免疫リポソームの調製Ａ）材料）鶏卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）はアバンチポーラーリピド（Avanti P olar Lipids，Alabaster，アラバマ）から、コレステロール（Ｃｈｏｌ）はカルビオケム（Calbiochem，サンディエゴ、カリフォルニア）から、Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕−２アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）はシグマ(Sigma)から、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はナッターマン（Natterman, コローン、ドイツ）から、ローダミン標識リン脂質はアバンチから、デスフェリオキサミンメシレート（デスフェラル）はチバガイギー（Ciba-Geigy，サミット、ニュージャージ）から、ドキソルビシンはファルミタリア、カルロエルバ（Fa rmitalia，Carlo Erba，ミラノ、イタリア）またはシータス（Cetus，Emeryvill e，カリフォルニア）から、およびＮ−〔４ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル〕ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）はモリキュラープローブ（Mole cular Probes，ポートランド、オレゴン）から購入した。ＰＥＧ（Ｍ_r＝１９００）誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）は記載にしたがって合成し(Allenら、Biochim．Biophys．Acta，1066:29-36(1991))、さらにリポソームテクノロジー(Liposome Technology，Inc.，Menlo Park，カリフォルニア) から入手した。Ｂ）Ｆａｂ’フラグメントの調製重鎖および軽鎖のクローニングrhuMAbHER2配列を先行文献記載(Carterら、Bio technology，10:163-167(1992))にしたがって大腸菌(E．Coli)で同時発現させた。抗体フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')を大腸菌の醗酵ペーストからストレプトコッカスプロテインＧを用いて(Carterら、Biotechnology，10:163-167(1992)、この文献は参照により本明細書に含まれる）アフィニティークロマトグラフィーによって回収した。典型的には、６０〜９０％が還元遊離チオール（Ｆａｂ’− ＳＨ）を含むＦａｂ’が得られた。コントロールとして無関係のヒト化Ｆａｂ’ を用いた。抗ＣＤ１８ネズミ単クローン性抗体に由来するrhuMAbH52-Fab’は、r huMAbHER2-Fab’と抗原結合ループが置換している点だけが異なり、既知のネズミまたはヒトの既知の抗原のいずれとも検出可能な結合を示さなかった(Eigenbr otら、Proteins:Structure，Function and Genetics，18:49-62(1994))。Ｃ）リポソームの調製リポソームは、ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１）または記載が有る場合はＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ（３：２）およびＰＥＧ−ＰＥ（０〜６モルパーセント）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法（Szoka & Papahadjopoulos，Proc．Natl．Acad．Sci． USA，75:4194-4198(1987))にしたがって調製した。続いて、連続的に０．１から０．０５μｍの限定された孔サイズをもつポリカーボネート膜フィルターから陽圧下でアルゴンガスとともに繰り返しリポソームを噴射した(Olsonら、Biochim ．Biophys．Acta，55:9-23(1979);Szokaら、Biochim．Biophys．Acta，601:559- 571(1980))。この方法によって、動的光分散で測定した場合６０〜１２０ｎｍの直径を呈するリポソームが得られた。リポソーム濃度はホスフェートアッセイによって決定した（Bartlettら、J．Biol．Chem.，234:466-468(1959))。免疫リポソームの調製のためには、２モル％のＭ−ＰＥ（総リン脂質に対して）をリポソーム作製前にクロロホルム中の脂質混合物に混合した(Martin & Papahadjopoulo s，J．Biol．Chem.，257:286-288(1982))。被包化ドキソルビシンを含まないリポソームはＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で３００mOsmで調製した。ドキソルビシンを含むＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームは１ｍＭデスフェラルを含む２５０ｍＭ硫酸アンモニウム中でｐＨ５．５で調製した。被包化されなかった硫酸アンモニウムはＧ−７５セファデクスを用いてゲル濾過によって除去した。続いてこのリポソーム懸濁液に粉末形のドキソルビシンを０．１ｍｇドキソルビシン／μモルリン脂質で溶解した(Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA，88:11460-11464(1991);Huangら、Cancer Res.，52:6774-6781(1992)) 。リポソームはその内部空間にドキソルビシンを捕捉する(Lasicら、Febs Lett. ，312:255-258(1992))。塩勾配による薬剤の積載効率は高く、１０μモルのリン脂質に対して１ｍｇの薬剤を用いた場合は当該効率は９９％超の積載率に達した。Ｆａｂ’は、チオエーテル連結を介して薬剤を積載した後で先行文献記載にしたがって(Martinら、J．Biol．Chem.，257:286-288(1982))リポソームに共役させた。マレイミドは低いｐＨでより安定であるので、全ての工程はｐＨ５．５で実施した。未反応Ｆａｂ’は、セファクリルＳ−４００を用いてゲル濾過で免疫リポソームから分離した。免疫リポソーム上のマレイミド基は、共役後Ｍ−ＰＥに対して２倍過剰のメルカプトエタノールで不活性化した。共役Ｆａｂ’の量はバイオラド（BioRad）タンパク質アッセイによって決定した４種類のリポソームを調製した。抗体をもたない“通常の”リポソームはホスファチジルコリンおよびコレステロールのみで構成され、“立体的安定化”リポソームはさらにＰＥＧ−ＰＥを含んでいた。免疫リポソームは、ヒト化抗体rhuM AbHER2に由来するＦａｂ’フラグメントを上記のものと共役させ、通常または立体的安定化免疫リポソームを調製した。完全な抗体ではなくＦａｂ'フラグメントを用いた理由は以下の通りである。１）rhuMAbHER2-Fab’フラグメントは組換えタンパク質として大腸菌内で極めて高効率で発現できる（Carterら、上掲書）；２）Ｆａｂ’ヒンジ領域内の遊離チオール基は修飾リポソームに対して容易に利用できる共有結合部位を提供し、さらに抗原結合部位から離れている；３）rh uMAbHER2-Fab'は完全な抗体よりもはるかに少ない抗分裂活性を有し、したがって抗ｐ１８５^HER2−Ｆａｂ’のリポソームへの結合がこの活性を再構成するか否かを調べるために重要であった。典型的には、共役によってリポソーム粒子当たり約５０〜１００のＦａｂ’分子がもたらされた。実施例２免疫リポソームの結合抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの乳癌細胞（ｐ１８５^HER2レセプターを過剰発現する）へのインビトロ結合能を２つの方法、流動細胞計測（フローサイトメトリー）アッセイおよび競合結合アッセイによって調べた。流動細胞計測アッセイでは、高レベルのｐ１８５^HER2を発現するSK-BR-3細胞またはMCF-7細胞を氷上で４５分間抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームに暴露し、ＰＢＳで洗浄し、結合した免疫リポソーム（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を検出するために抗ヒト二次抗体で染色した。ＰＢＳで再び洗浄し、続いて流動細胞計測に付した（図１）。SK -BR-3細胞は、顕著な量の通常または立体的安定化抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのいずれとも結合したが、Ｆａｂ’を欠くコントロールリポソームとは結合しなかった。ｐ１８５^HER2を過剰発現していないMCF-7乳癌細胞は抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームとは極めてわずかの結合を示しただけであった（データは提示されていない）。別の結合測定は競合結合アッセイによって実施した。このアッセイでは、単層培養のSK-BR-3細胞（乳癌細胞）またはBT-474細胞を同時に¹²⁵Ｉ標識rhuMAbHER2 またはmuMAb4D5とともに０．１ｎＭで１８時間４℃で保温し、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの濃度を上昇させていった（図２）。結合カウントはガンマ計測によって求めた。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームは、SK-BR-3細胞（データは提示されていない）およびBT-474細胞（これもまた高レベルのｐ１８５^HER2を発現する）の両方に対してrhuMAbHER2の結合に効果的にとってかわった。結合親和性の概算値は、免疫リポソーム上のＦａｂ’が遊離リガンドとして機能すると仮定してスキャチャード分析によって得た。このモデルを用いた場合、免疫リポソームの見かけの結合定数は、遊離（すなわち非リポソーム性）rhuMAbHER2-Fab1または無傷の完全なrhuMAbHER2のそれに匹敵するものであった。Ｆａｂ’を欠く通常または立体的安定化（６モル％のＰＥＧ−ＰＥ）コントロールリポソームはほとんど結合を示さなかった。結合データの要旨は表１に示す。表１．抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのBT-474細胞との結合実施例３ “増殖抑制”免疫リポソームの抗分裂活性免疫リポソーム単独（被包化薬剤を含まない）の抗分裂活性を調べるために、腫瘍細胞（例えばSK-BR-3細胞またはBT-474細胞）を単層培養に増殖させ、続いて抗体を基準にして免疫リポソームの濃度を変えながら３７℃で保温した。４日間処理を持続させた後、単層細胞培養をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット（０．５％メタノール溶液）で染色して先の記載(Hudziakら、Mol．Cell Biol .， 9:1165-1172(1989)）にしたがって相対分裂を決定した。完全な（二価）rhuMAbHER2が単層培養のｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞の増殖を抑制し、一方、この抗体の一価のＦａｂ’フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')は増殖抑制での効果ははるかに小さかった(O'Connellら、「インビボおよびインビトロのタンパク質の折り畳み」より、（218-239ページ）、J.L．Cleland編、ワシントンD.C．アメリカ化学学会(1993))。この発見は、二価抗体によるｐ１８５^HER2 レセプターの架橋が抗分裂活性作用に重要であろことを示唆し、有効原子価を増すことによってrhuMAbHER2-Fab'フラグメントのリポソーム固着がＦａｂ'の抗分裂活性を改善するか否かという疑問が浮上した。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3単層培養細胞に対する影響を調べ、r huMAbHER2およびrhuMAbHER2-Fab'と比較した（図３）。Ｆａｂ’を欠く通常または立体的安定化コントロールリポソームによる処理は細胞増殖に顕著な影響を与えなかった。対照的に、通常および立体的安定化抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームは用量依存的に増殖を抑制した。免疫リポソームの増殖抑制効果は約３０％の増殖抑制（コントロール増殖の７０％）のプラトーに達し、無傷の完全な遊離rhuM AbHER2で認められる４０％増殖抑制に迫った。対照的に、遊離rhuMAbHER2-Fab' は僅かな増殖抑制を誘発しただけであった。同様な結果は、ｐ１８５^HER2過剰発現BT-474乳癌細胞でも得られた（データは提示されていない）。リポソーム結合rhuMAbHER2-Fab'は、溶液中に遊離している同じ量のrhuMAbHER 2-Fab'よりはるかに強い抗分裂作用をもたらすということは特記すべきことである。妥当な説明の１つは、rhuMAbHER2-Fab'のリポソーム固着によってｐ１８５^H ^ER2 の架橋が可能になり、それによって完全な二価抗体の生物学的活性に匹敵するものが得られるというものである。実施例４ドキソルビシン含有抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの細胞毒性空の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームはｐ１８５^HER2過剰発現乳癌培養細胞に対して抗分裂活性を示すが、細胞毒性剤をそれらリポソームに積載して当該免疫リポソームの抗新形成作用を大きく増大させ、それによって向標的薬剤配送システムを作製することを考えた。ドキソルビシンは、ｐ１８５^HER2過剰発現乳癌に対して、免疫療法が併用されていてもいなくても、特に有用であることが予備臨床的にも臨床的にも示唆されたので用いた。したがって、ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞および非悪性細胞( ｐ１８５^HER2を過剰発現していない）に対する細胞毒性および特異性を調べることは重要である。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームによって示された効果的な内在化（実施例５参照）のために、ｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞を殺すについて当該リポソームは遊離ドキソルビシン(容易に細胞膜を通過する小さい（ＭＷ５４４）両親媒性分子))と同じように有効であると期待された。他方、ｐ１８５^HER2を過剰に発現しない細胞（しかし遊離ドキソルビシンに感受性を有する）は、当該免疫リポソームがそれらを標的とすることができないのでドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームの細胞毒性損傷から逃避できるであろう。ドキソルビシン積載免疫リポソームの細胞毒性を調べるために、単層培養した SK-BR-3細胞またはWI-38細胞を遊離ドキソルビシンまたはドキソルビシン積載免疫リポソームと１時間保温し、続いて培養液で十分洗浄した。その後細胞をさらに３７℃で３日間保温し、その後で上記で述べたようにクリスタルバイオレット染色によって細胞数を概算した。アラマーブルー染色、ＭＴＴ染色および直接細胞数計測を含む他の細胞増殖アッセイとの比較によって実質的に同じ結果が得られた。種々のドキソルビシン積載免疫リポソーム調製物で１時間処理したSK-BR-3細胞の結果を図４に示す。これらの条件下では、rhuMAbHER2の抗分裂作用は、細胞をrhuMAbHER2に持続して曝すことが要求されるので明白ではない(Hudziakら、Ce ll Biol.，9:1165-1172(1989))。遊離ドキソルビシンで１時間処理した場合、１Ｃ₅₀が約０．３μｇ／ｍｌの顕著な細胞毒性が得られた。ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームは、通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームについては約０．２μｇ／ｍｌ、立体的安定化（２モル％のＰＥＧ−ＰＥ）抗ｐ１８５^HE ^R2 免疫リポソームについては約１．０μｇ／ｍｌのＩＣ₅₀で用量依存細胞毒性を示した。これらの結果は、ｐ１８５^HER2過剰発現培養細胞への抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームによるドキソルビシンの配送は、遊離ドキソルビシンの細胞への迅速な拡散と同じ有効な方法であることを示した。ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームは、無関係のＦａｂ’を含むドキソルビシン積載免疫リポソームよりも１０から３０倍高い細胞毒性をもっていた。後者の免疫リポソームは比較的高い濃度（３．３μｇ／ｍｌ超）でのみ細胞増殖に影響を与えた。 WI-38細胞（わずかのレベルのｐ１８５^HER2を発現する非悪性肺線維芽細胞株）もまたドキソルビシンおよびドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームで処理した（図４Ｂ）。遊離ドキソルビシンは、WI-38細胞に対してもまた顕著な用量依存細胞毒性を示した。しかしながら、ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームは、これら細胞に対してはるかに低い（２０倍低い）細胞毒性を示し、無関係のＦａｂ’を含むドキソルビシン積載免疫リポソームと変わりがなかった。これらの結果は、ｐ１８５^HER2過剰発現標的に対する抗ｐ１８５^HE ^R2 免疫リポソーム処理の特異性を示し、さらにSK-BR-3細胞に対して認められた細胞毒性は、単にドキソルビシンが抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームから、さらに溶液中に漏出したためではないことを確認させた。実施例５標的細胞の細胞質内への免疫リポソームの内在化標的細胞の細胞質内への免疫リポソームの内在化を蛍光顕微鏡によって調べるために、リン脂質成分の１モル％でローダミン−ホスファチジルエタノールアミンが添加されたリポソームおよび免疫リポソームを実施例１で述べたように調製した。生じたローダミン標識リポソームまたは免疫リポソームを、カバースリップ上に準融合状態に増殖させたSK-BR-3細胞とともに３７℃で種々の時間保温した。続いて細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定し、抗漂白試薬として０．１％ｐ−フェニレンジアミン(Sigma)を含む９０％グリセロール／１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）中に包埋し、ライツアリストプラン（Leitz Aristoplan）蛍光顕微鏡またはモレキュラーダイナミクスマルチプローブ(Molecular Dynamics Mu ltiProbe)２００１共焦点顕微鏡を用いて観察した。内在化および細胞内配置を電子顕微鏡で調べるために、免疫リポソームに以前の報告(Huangら、Cancer Res.，52:5135-5143(1992);Straubingerら、Cell，32: 10639-1079(1983))にしたがってコロイド状金粒子を加えた。金含有免疫リポソームをカバースリップ上に増殖させたSK-BR-3細胞とともに３７℃で種々の時間保温し、続いて細胞を固定して電子顕微鏡のために処理した。リポソームの固定は一次固定ではタンニン酸を用いて実施した(Straubingerら、上掲書）。この一次固定は適切ではあるが超微細構造の最適な保存は提供しない。抗体（rhuMAbHER2）は、レセプター仲介エンドサイトーシスを介してｐ１８５^HER2 過剰発現腫瘍細胞によって迅速に内在化される（Sarupら、Growth Regul.， 1:72-82(1991)）。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームがSK-BR-3細胞内に内在化されるか否かを調べるために、細胞をローダミン標識免疫リポソームで種々の時間処理して固定し蛍光顕微鏡によって観察した。Ｆａｂ’を欠く通常または立体的安定化コントロールリポソームで処理されたSK-BR-3細胞は表面のローダミン蛍光も内部ローダミン蛍光も示さず、これら細胞にコントロールリポソームは結合する能力をもたないということと一致した。通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームで処理したとき、SK-BR-3細胞は、処理後３０分以内に細胞表面および細胞内の両方に濃い蛍光のフォーカスを示した。共焦点蛍光顕微鏡によって、ローダミンの蛍光はSK-BR-3細胞の表面およびその細胞内に内在化されることが確認された。対照的に、高濃度のＰＥＧ−ＰＥ（６モル％）を含む立体的安定化抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームによる処理は、３０分後にわずかの細胞内蛍光をもたらすに留まった。ＰＥＧ−ＰＥの存在によって免疫リポソームの内在化は遅延するらしいので、低い濃度のＰＥＧ−ＰＥを含む立体的安定化免疫リポソームを調べた。２モル％のＰＥＧ−ＰＥを含む免疫リポソームは３０分後には中程度の（すなわち通常の免疫リポソームで認められたものより少なく、６モル％のＰＥＧ−ＰＥ含有免疫リポソームで認められたものより多い）細胞内蛍光をもたらした。幾分遅延した内在化にもかかわらず、２％ＰＥＧ−ＰＥ含有立体的安定化免疫リポソームはより長い保温時間（例えば２時間）で細胞内に蓄積された。したがって、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームはSK-BR-3細胞内に内在化されるが、一方、内在化速度は免疫リポソームのＰＥＧ−ＰＥ含有量に反比例した。免疫リポソームの細胞内配置およびそれらの含有量を調べるために、カプセル化コロイド状金粒子を含む免疫リポソームを用いて電子顕微鏡検査を実施した。通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームで３０分処理したSK-BR-3細胞は、細胞表面に結合し、さらに細胞内に存在する多数の金含有免疫リポソームを示した。多くの免疫リポソームは、細胞膜に接した状態および明らかに細胞膜と結合した状態で観察された。いくつかの免疫リポソームは、被覆された凹みの中以外にも被覆された小胞内、エンドソーム、多小胞性小体およびリソソーム内にも見出された。このような細胞内分布は、被覆された凹みを経由して内在化されるということと一致する。しかしながら、被覆された凹みを形成せずに細胞膜と融合しているように見える免疫リポソームもまた観察された。さらに、いくつかの金粒子はリポソームカプセル内や膜結合細胞内小器官とは結合して存在せず、細胞質内に遊離しているように見えた。細胞質内に遊離している金粒子は、リポソームと細胞膜との融合現象から生じたのかもしれない。また別に、遊離金粒子は、エンドサイトーシスに続いて被覆された凹みのどこかで生じたカプセル化金粒子の漏出で生じたのかもしれない。実施例６免疫リポソームのインビボ腫瘍における局在化および生体内分布並び免疫リポソームの含有量若い（４〜６週齢）雌のＳＣＩＤマウスの大腿部の皮下組織または乳房脂肪パッドの皮下組織にBT-474細胞を注射し、さらにこれら細胞の腫瘍形成増殖を助けるために皮下にエストロジェンペレットを埋め込んだ。触診可能腫瘍が少なくとも３００ｍｍ³に達したとき（典型的には接種後１４日）、総脂質約１μモルを含む約２００μＬの容積で１回静注（尾静脈から）するか、または１回腹腔内注射することによつて免疫リポソームを投与した。注射後指定した期間で動物を殺処分し、その場で食塩水を器官に灌流させ、直ちに組織を分析のために切り出した。ローダミン標識免疫リポソームの注射後の生体内分布および画像分析のために、直ちに切り出した組織を固定し共焦点蛍光顕微鏡で検査した。免疫リポソームによって配送されたドキソルビシンの局在化の定量のために、切り出した組織を均質化して酸性化エタノール抽出を実施した。続いて抽出ドキソルビシンを先の報告(Gablzonら、J．Natl．Cancer Inst.，81:1484-1488(1989))にしたがって分光蛍光測定アッセイによって測定した。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの生体内分布およびインビボで腫瘍内に局在しさらに蓄積することができるそれらの能力を腫瘍の異種移植モデルで調べた。このモデルでは、定着した皮下BT-474腫瘍の異種移植片をもつ免疫不全マウスに免疫リポソームを１回静注するか、または腹腔内注射して処理した。共焦点蛍光顕微鏡による画像化調査を実施し、処理後殺処分した動物の種々の組織内のローダミン標識免疫リポソームを検出した。静注後６時間以内に、ローダミンの蛍光はこの異種移植腫瘍内に認められ、一方、顕著な蛍光は周辺の筋肉内には認められなかった。しかしながらこの技術は腫瘍組織内の免疫リポソーム量を精確には表すことができなかった。免疫リポソームによって配送されたドキソルビシンの生体内分布および局在化の定量的評価のために、処理動物の組織抽出物からドキソルビシンをアッセイした。腹腔内注射してから２４時間で、立体的安定化抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームによって配送されたドキソルビシンは異種移植腫瘍内に蓄積され、ドキソルビシンは周辺の筋肉内および血中にも低量見出された(表２) 。表２．抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのドキソルビシンのインビボ配送：静注１回２４時間後の生体内分布実施例５ＰＥＧ上にＦａｂ’をもつ免疫リポソームの調製発明の免疫リポソームの向標的特異性および内在化を改善するために、リポソームに埋め込まれたポリエチレングリコール鎖の遠位端に腫瘍特異的Ｆａｂ’ フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')をスルフヒドリル反応性マレイミド基を介して共役させた。Ｆａｂ’のＳIIと反応するリンカー基（マレイミド）を提供するために、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンおよび異種二官能基ＰＥＧ誘導体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ−マレイミド）から、α− ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ω−マルイミドプロピオニルアミドポリエチレングリコールを標準的な方法にしたがって合成した。ＰＥＧ−ＰＥのマレイミド誘導体をリポソーム調製時に混合し、ｐＨ７．２条件下でＦａｂ’フラグメントをスルフヒドリル基を介してリポソームと共役させた。リポソーム組成物は、Ｍ−ＰＥはもはや抗体フラグメントの結合に必要とされないので除外されているという点を除き上記に述べたとおりであった。典型的にはＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）は総燐脂質の約１０から約１２モルパーセントの範囲で、Ｆａｂ’共役ＰＥＧ誘導体脂質は総脂質の約０．６から約１モルパーセントの範囲であった。ＨＥＲ過剰発現乳癌細胞の培養では、そのような立体的に安定な抗ＨＥＲ２リポソームは、ポリエチレングリコール修飾リン脂質の量に関係なく同じ結合効率と内在化効率を有した。上記の実施例は本発明の説明のために提供され、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の他の変化型は当業者には極めて明白であり、添付の請求の範囲に包含される。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は援用して本文の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/136 Ａ６１Ｋ 31/135 ６０１ 31/407 31/40 ６０９ 31/704 31/70 ６１１ 33/24 33/24 38/00 39/395 Ｙ 39/395 39/44 39/44 47/24 47/24 47/28 47/28 Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｃ０７Ｋ 17/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者パーク、ジョンダブリュ. アメリカ合衆国 94131 カリフォルニア州サンフランシスコダイアモンドハイツブルヴァード＃300 5235 (72)発明者ホン、キールンアメリカ合衆国 94107 カリフォルニア州サンフランシスコデハロストリート 1360 (72)発明者カーポティン、ドミトリアメリカ合衆国 94121 カリフォルニア州サンフランシスコフォーティサードアベニュ 435

Claims

【特許請求の範囲】１．特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞に特異的に結合する増殖抑制免疫リポソームであって、当該免疫リポソームは、当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインおよび両親媒性小胞形成脂質を含み、当該脂質は増殖抑制治療剤を含まないリポソームを形成し、当該免疫リポソームは当該細胞の増殖を抑制する前記増殖抑制免疫リポソーム。２．当該マーカーが増殖因子レセプターである請求項１に記載の免疫リポソーム。３．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２に記載の免疫リポソーム。４．当該マーカーがＨＥＲ２である請求項３に記載の免疫リポソーム。５．当該Ｆａｂ’ドメインが抗ＨＥＲ２単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ ドメインである請求項４に記載の免疫リポソーム。６．さらに、当該リポソームが、当該抗体のＦａｂ’ドメインとのチオエーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン(Ｍ−ＰＥ) を含む請求項１に記載の免疫リポソーム。７．Ｆａｂ’が当該リポソームにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して結合される請求項１に記載の免疫リポソーム。８．当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドおよびステロールから成る群から選ばれる脂質を含む請求項１に記載の免疫リポソーム。９．さらにポリエチレングリコール誘導脂質を含み、当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有する請求項１に記載の免疫リポソーム。１０．当該Ｆａｂ’が当該ポリエチレングリコールに結合される請求項９に記載の免疫リポソーム、１１．当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にある請求項１に記載の免疫リポソーム。１２．当該リポソームの平均直径が約１００ｎｍである請求項９に記載の免疫リポソーム。１３．抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）に共役され；当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン(ＰＣ)およびコレステロール(Ｃｈｏｌ)であり；さらに当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を有し、比ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥが約１５０：１００：３で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する請求項８に記載の免疫リポソーム。１４．特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の増殖を抑制する方法であって、当該方法が当該細胞を増殖抑制免疫リポソームと接触させることを含み、当該免疫リポソームが、当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインおよび増殖抑制治療剤を含まないリポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質を含む、前記の細胞の増殖を抑制する方法。１５．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項１２に記載の方法。１６．当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである請求項１３に記載の方法。１７．さらに、当該リポソームが、当該抗体とのチオエーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）を含む請求項１２に記載の方法。１８．当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドおよびステロールから成る群から選ばれる脂質を含む請求項１２に記載の方法。１９．当該免疫リポソームが、さらにポリエチレングリコール誘導脂質を含み、当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有する請求項１２に記載の方法。２０．当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にある請求項１２に記載の方法。２１．抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；抗体の当該Ｆａｂ ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）に共役され；当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；さらに当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を有し；比ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＤＰＥが約１５０：１００：３で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する請求項１２に記載の方法。２２．特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内への治療薬の内在化を最適化させる免疫リポソームであって、当該免疫リポソームが、当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインと；リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質と；ポリエチレングリコール誘導脂質のポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有し、その誘導脂質が総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在するポリエチレングリコール誘導脂質；および当該リポソーム内に含有される治療薬を含む、前記治療薬の内在化を最適化させる免疫リポソーム。２３．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２０に記載の免疫リポソーム。２４．当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである請求項２１に記載の免疫リポソーム。２５．さらに、当該リポソームが、抗体のＦａｂ’ドメインとの当該チオエーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）を含む請求項２０に記載の免疫リポソーム。２６．当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドおよびステロールから成る群から選ばれる請求項２０に記載の免疫リポソーム。２７．当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にある請求項２０に記載の免疫リポソーム。２８．当該治療薬が、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピルビシン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダクチノマイシン、シクロホスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮＵ、タキソール、タキソテアおよび他のタキサン誘導体並びに単離物、カンプトテシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸から成る群から選ばれる請求項２０に記載の免疫リポソーム。２９．抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を有し；当該抗体がマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＤＰＥ）に共役され；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比が約１５０：１００：３：６で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセント未満の量で存在する請求項２０に記載の免疫リポソーム。３０．ａ）当該細胞をｉ）当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインと、 ii）リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質と、 iii）ポリエチレングリコールの平均分子量が約７５０Ｄから５０００Ｄであり、ポリエチレングリコール誘導脂質が総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在するポリエチレングリコール誘導脂質、および iv）当該リポソーム内に含有される治療薬を含む免疫リポソームと接触させる工程、及びｂ）当該リポソーム自体を当該細胞内に内在化させる工程を含む、特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内への治療薬の内在化を最適化させる方法。３１．当該内在化が、当該リポソームを当該細胞の細胞質内に直接輸送することを含む請求項２８に記載の方法。３２．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２８に記載の方法。３３．当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである請求項３０に記載の方法。３４．当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドおよびステロールから成る群から選ばれる請求項２８に記載の方法。３５．当該治療薬が、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピルビシン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダクチノマイシン、シクロホスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮＵ、タキソール、タキソテアおよび他のタキサン誘導体並びに単離物、カンプトテシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸から成る群から選ばれる請求項２８に記載の免疫リポソーム。３６．抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を有し；抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）に共役され；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＤＰＥの比が約１５０：１００：３：６で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する請求項２８に記載の免疫リポソーム。３７．特徴的な細胞表面マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインでポリエチレングリコール誘導脂質に結合されたものと、リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質、及びポリエチレングリコール誘導脂質を含む、当該特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内に内在化される免疫リポソームであって、当該免疫リポソームを当該細胞と接触させるとき、当該免疫リポソームが当該細胞の細胞質内に内在化される前記細胞質内に内在化される免疫リポソーム。３８．当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有する請求項３７に記載の免疫リポソーム。３９．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項３７に記載の免疫リポソーム。４０．当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである請求項３９に記載の免疫リポソーム。４１．ポリエチレングリコール誘導脂質に結合された当該Ｆａｂ’がＰＥＧ誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の遠位端に結合されたrhuMAbHER2であり；当該ポリエチレングリコール誘導脂質がＰＥＧ−ＰＥであり、当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌの比が約３：２で、当該ＰＥＧ− ＰＥが総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントの範囲で、さらにポリエチレングリコール誘導脂質に結合した当該Ｆａｂ’が総リン脂質の約０．６から約１．０モルパーセントの範囲である、請求項３７に記載の免疫リポソーム。４２．特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞を免疫リポソームと接触させることを含む当該特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内にリポソームを内在化させる方法であって、当該リポソームが、当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインであってポリエチレングリコール誘導脂質に結合されたものと、リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質、及びポリエチレングリコール誘導脂質を含み、当該接触によって当該細胞の細胞質内への当該リポソームの内在化がもたらされる前記細胞質内にリポソームを内在化させる方法。４３．当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有する請求項４２に記載の免疫リポソーム。４４．当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項４２に記載の方法。４５．当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである請求項４２に記載の方法。４６．ポリエチレングリコール誘導脂質に結合された当該Ｆａｂ’がＰＥＧ誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の遠位端に結合されたrhuMAbHER2であり；当該ポリエチレングリコール誘導脂質がＰＥＧ−ＰＥであり、当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌの比が約３：２で、当該ＰＥＧ− ＰＥが総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントの範囲で、さらにポリエチレングリコール誘導脂質に結合した当該Ｆａｂ’が総リン脂質の約０．６から約１．０モルパーセントの範囲である、請求項４２に記載の方法。