WO2023054243A1 - 細胞指向性を有する脂質ナノ粒子 - Google Patents

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WO2023054243A1
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lipid
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cells
nucleic acid
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耕太 丹下
宏樹 吉岡
悠太 中井
英万 秋田
遊 櫻井
浩揮 田中
光希 岩崎
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日油株式会社
国立大学法人千葉大学
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Definitions

  • the present invention relates to cell-tropic lipid nanoparticles, methods for producing the same, and uses thereof.
  • Viral vectors are nucleic acid delivery carriers with high expression efficiency, but have practical problems from the viewpoint of safety. Therefore, non-viral nucleic acid delivery carriers that can be used more safely are being developed. is a career.
  • Ionic lipids are roughly divided into amine and lipid moieties.
  • the amine moieties which are protonated under acidic conditions, and the nucleic acids, which are polyanions, interact electrostatically to form lipid nanoparticles. It promotes uptake into cells and delivers nucleic acids into cells.
  • DODAP 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane
  • Patent Document 1 describes an ionic lipid having a structure in which compounds consisting of one or two amine sites and one lipid site are linked by a biodegradable disulfide bond.
  • the ionic lipid can improve pharmacokinetics such as blood stability and tumor targetability, and by changing the structure around the amine site, the pKa of the lipid membrane structure can be increased to cells. It has been shown that it can be adjusted to a value that is advantageous for endosomal escape from the endosome, and that it has the effect of dissociating nucleic acids from the lipid membrane structure by utilizing intracellular cleavage of disulfide bonds.
  • DODAP which is a known ionic lipid
  • DODAP which is a known ionic lipid
  • Patent Document 2 in addition to the tertiary amine site and disulfide bond, the use of an ionic lipid with an aromatic ring introduced near the lipid site enhances the fusibility with the endosomal membrane and further enhances the efficiency of nucleic acid introduction into the cytoplasm. Elevated lipid membrane structures are shown.
  • Non-Patent Document 2 shows lipid nanoparticles modified with GALA peptide, which has the effect of increasing the efficiency of endosomal escape.
  • lipid nanoparticles modified with GALA peptide are prepared by synthesizing GALA-PEG lipids by combining PEG lipids and GALA peptides in advance, and then producing lipid nanoparticles from GALA-PEG lipids and other components. has been shown to be able to produce
  • ionic lipids with improved intracellular dynamics have been developed by increasing the endosomal escape efficiency and membrane fusion ability.
  • lipid nanoparticles composed of ionic lipids in order for lipid nanoparticles composed of ionic lipids to exhibit more practical effects in vivo as nucleic acid delivery carriers, directivity to target organs and cells is required.
  • Non-Patent Document 3 shows lipid nanoparticles modified with RGD peptide as ligands for imparting organ tropism.
  • the PEG lipid and the RGD peptide are previously bound to synthesize the RGD-PEG lipid, the lipid nanoparticles composed of other components are produced, and the obtained lipid nanoparticles and the RGD-PEG lipid are incubated. It has been shown that lipid nanoparticles modified with RGD peptides are manufactured and injected intravenously to increase the efficiency of nucleic acid delivery to tumors.
  • lipid nanoparticles with improved intracellular dynamics and lipid nanoparticles with organ directivity are known.
  • further improvement of nucleic acid transfer efficiency in target cells is required.
  • the method of ligand modification to lipid nanoparticles also needs further improvement in terms of efficiency and convenience.
  • An object of the present invention is to provide lipid nanoparticles having cell tropism that could not be achieved by conventional techniques, to provide a method for producing the lipid nanoparticles, and to provide a nucleic acid transfer agent containing the lipid nanoparticles. and to provide a method for introducing nucleic acids into specific cells using the nucleic acid introduction agent.
  • lipid nanoparticles containing ionic lipids that have a pKa suitable for endosomal escape and that specifically degrade in a reductive environment in cells are targeted to cells. It was found that nucleic acids can be efficiently delivered to target cells by imparting a ligand having a specificity. Furthermore, regarding the method of ligand modification to lipid nanoparticles, after manufacturing lipid nanoparticles containing PEG lipids having reactive functional groups, the lipid nanoparticles are reacted with the ligands, whereby the ligands are efficiently attached to the surface of the lipid nanoparticles. found that it is possible to combine
  • lipid nanoparticles modified with this cell-tropic ligand have high membrane fusion ability in the endosomal environment after being efficiently taken up by the target cells, and have high endosomal escape efficiency. confirmed that the lipid possesses the property of ionic lipids that they can efficiently deliver nucleic acids into the cytoplasm of target cells, and completed the present invention.
  • the present invention based on this knowledge is as follows.
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or a residue derived from a reaction product with glutaric anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms.
  • Lipid nanoparticles comprising an ionic lipid represented by and a ligand with cell targeting attached to an activated PEG lipid.
  • the activated PEG lipid has the formula (2):
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrocarbon chain having 14 to 18 carbon atoms
  • X is formula (3):
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or a residue derived from a reaction product with glutaric anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms.
  • producing lipid nanoparticles from a lipid feedstock comprising an ionic lipid represented by and an activated PEG lipid; comprising binding a ligand having cell tropism to the resulting lipid nanoparticles, A method for producing lipid nanoparticles modified with the ligand.
  • the activated PEG lipid has the formula (2):
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrocarbon chain having 14 to 18 carbon atoms
  • X is formula (3):
  • a nucleic acid transfer agent comprising the lipid nanoparticles of any one of [1] to [9].
  • a method for introducing a nucleic acid into a cell which comprises contacting the nucleic acid-encapsulated nucleic acid-introducing agent according to [14] with the cell in vitro.
  • the cells are T cells or B cells.
  • a method for introducing a nucleic acid into a cell comprising administering the nucleic acid-encapsulating agent of [14] above to a living body so that the nucleic acid is delivered to the target cell.
  • the method of [17] above, wherein the target cells are T cells or B cells.
  • the present invention relates to lipid nanoparticles containing an ionic lipid having a tertiary amino group, a lipid moiety, and a disulfide bond that is a biodegradable group, and a ligand with cell tropism.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can encapsulate any nucleic acid, and the lipid nanoparticles can be used as nucleic acid transfer agents.
  • the ligand is recognized by the target cells and is efficiently taken up into the cells, and the disulfide bonds contained in the ionic lipids are cleaved in the cells to release inclusions (nucleic acids). is promoted. Therefore, the nucleic acid transfer agent (lipid nanoparticle) of the present invention can achieve high nucleic acid delivery efficiency into the cytoplasm of target cells.
  • FIG. 4 shows selective T-cell uptake of LNPs in spleen cells of mice administered in vivo mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD3 antibody fragments.
  • FIG. 4 shows efficient uptake of LNPs by splenic T cells from mice that received in vivo administration of mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD3 antibody fragments.
  • FIG. 4 shows efficient expression of introduced mRNA in splenic T cells from mice that received in vivo administration of mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD3 antibody fragments.
  • FIG. 4 shows the uptake efficiency of mRNA-encapsulating ligand-modified LNPs containing various activated PEG-lipids into splenic T cells.
  • FIG. 2 shows the uptake efficiency of mRNA-encapsulating ligand-modified LNPs containing various activated PEG-lipids into peripheral blood T cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing; FIG. 4 shows the effect of concentration of activated PEG lipid (DSPE-PEG2k-DBCO) on the uptake of splenic B cells of mice administered mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD19 antibody fragments in vivo.
  • FIG. 4 shows the effect of concentration of activated PEG lipid (DSPE-PEG2k-DBCO) on the uptake of LNPs into peripheral blood B cells of mice that received in vivo administration of mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD19 antibody fragments.
  • FIG. 4 shows the effect of concentration of activated PEG lipid (DSG-PEG2k-DBCO) on the uptake of splenic B cells of mice administered mRNA-encapsulated LNPs modified with anti-CD19 antibody fragments in vivo.
  • Lipid nanoparticles contains an ionic lipid represented by formula (1) (that is, an ionic lipid having a tertiary amino group, a lipid moiety, and a disulfide bond that is a biodegradable group), and furthermore cell-directed It relates to lipid nanoparticles modified with functional ligands.
  • modified with a ligand having cell tropism means that the surface of the lipid nanoparticle is modified so that the ligand interacts with a molecule with affinity expressed on the target cell and is delivered to the target cell. Means presented above.
  • the ligand is bound (preferably covalently bound) to the activated PEG lipid described below.
  • lipid nanoparticle refers to a hydrophilic group of an amphipathic lipid aligned toward the aqueous phase side of the interface. It means a particle having a thin film structure.
  • amphiphilic lipid is meant a lipid having both hydrophilic and hydrophobic groups.
  • the particle size of the lipid nanoparticles of the present invention is not particularly limited as long as it is less than 1 ⁇ m, preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle size can be measured using a particle size distribution analyzer such as Zetasizer Nano (Malvern).
  • the particle size of the lipid nanoparticles can be appropriately adjusted by the method for producing the lipid nanoparticles.
  • particle size means an average particle size (number average) measured by a dynamic light scattering method.
  • amphipathic lipids examples include ionic lipids, phospholipids, PEG lipids, and the like.
  • PEG means polyethylene glycol
  • PEG lipid means a lipid modified with PEG
  • Y modified with X e.g., X: PEG, Y: lipid
  • PEG2k PEG2k
  • the lipid nanoparticles of the present invention may contain, in addition to the ionic lipid represented by formula (1), at least one selected from the group consisting of sterols, PEG lipids and phospholipids as constituents.
  • Ionic lipid used in the present invention is an ionic lipid represented by the following formula (1) (hereinafter sometimes abbreviated as "ionic lipid (1)").
  • the ionic lipid (1) may be used alone or in combination of two or more.
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or a residue derived from a reaction product with glutaric anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms.
  • Each of R 1a and R 1b independently represents an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, which may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the alkylene group preferably has 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms include methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group, tetramethylene group, isobutylene group, pentamethylene group and neopentylene group.
  • R 1a and R 1b are preferably each independently methylene, ethylene, trimethylene, isopropylene or tetramethylene, most preferably each ethylene.
  • R 1a may be the same as or different from R 1b , but preferably R 1a is the same group as R 1b .
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups, preferably each independently having 2 to 5 carbon atoms and having 1 to 2 tertiary amino groups; is an alkylene tertiary amino group.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in the acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and one tertiary amino group may be linear or branched. or cyclic.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 1-3.
  • Specific examples of alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group and isopentyl group.
  • a cyclohexyl group and the like can be mentioned, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group, most preferably a methyl group.
  • a preferred specific structure of the acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and one tertiary amino group is represented by X 1 .
  • R 5 of X 1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, which may be linear, branched or cyclic.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is preferably 1-3.
  • Specific examples of alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group and isopentyl group.
  • a cyclohexyl group and the like can be mentioned, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group, most preferably a methyl group.
  • the number of carbon atoms in the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups is preferably 4 to 5.
  • Specific examples of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups include an aziridylene group, an azetidylene group, a pyrrolidylene group, a piperidylene group, an imidazolidylene group, It is a piperazylene group, preferably a pyrrolidylene group, a piperidylene group or a piperazylene group, most preferably a piperidylene group.
  • a preferred specific structure of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and one tertiary amino group is represented by X2 .
  • p of X2 is 1 or 2; When p is 1, X2 is a pyrrolidylene group, and when p is 2, X2 is a piperidylene group. Preferably p is two.
  • a preferred specific structure of a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and two tertiary amino groups is represented by X3 .
  • w of X3 is 1 or 2; When w is 1, X3 is an imidazolidylene group, and when w is 2, X3 is a piperazylene group.
  • Xa may be the same as or different from Xb , but preferably Xa is the same group as Xb .
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms, preferably each independently an alkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • the alkylene group having 8 or less carbon atoms may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the number of carbon atoms contained in the alkylene group is preferably 6 or less, most preferably 4 or less.
  • Examples of the alkylene group having 8 or less carbon atoms include methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group, tetramethylene group, isobutylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group and the like. are preferably methylene group, ethylene group, trimethylene group and tetramethylene group, and most preferably ethylene group.
  • oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms means an alkylene group via an ether bond (alkylene-O-alkylene, in other words, “alkyleneoxyalkylene group”), and there are two It means a group in which the total number of carbon atoms in the alkylene group is 8 or less.
  • alkylenes present may be the same or different, but are preferably the same.
  • Examples of the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms include, specifically, an oxydimethylene group, an oxydiethylene group, an oxydi(trimethylene) group (i.e., trimethyleneoxytrimethylene group), and an oxydi(tetramethylene) group (i.e., tetramethyleneoxytetramethylene group) and the like.
  • an oxydimethylene group an oxydiethylene group, an oxydi(trimethylene) group (i.e., trimethyleneoxytrimethylene group), and an oxydi(tetramethylene) group (i.e., tetramethyleneoxytetramethylene group) and the like.
  • Preferred are oxydimethylene, oxydiethylene and oxydi(trimethylene) groups, and most preferred is oxydiethylene.
  • R 2a may be the same as or different from R 2b , but preferably R 2a is the same group as R 2b .
  • Y a and Y b are each independently an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond, preferably each independently an ester bond, an amide bond or a carbamate bond, more preferably each It is independently an ester bond or an amide bond, most preferably each an ester bond.
  • the orientation of the bonds of Y a and Y b is not limited, when Y a and Y b are ester bonds, they are preferably -Z a -CO-OR 2a - and -Z b -CO-OR 2b -.
  • Y a may be the same as or different from Y b , but Y a is preferably the same group as Y b .
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom. represents The number of carbon atoms contained in the aromatic compound is preferably 6-12, most preferably 6-7. Also, the number of aromatic rings contained in the aromatic compound is preferably one.
  • Examples of types of aromatic rings contained in aromatic compounds having 3 to 16 carbon atoms include benzene ring, naphthalene ring and anthracene ring for aromatic hydrocarbon rings, imidazole ring, pyrazole ring and oxazole ring for aromatic hetero rings, isoxazole ring, thiazole ring, isothiazole ring, triazine ring, pyrrole ring, furan ring, thiophene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring, purine ring, pteridine ring, benzimidazole ring, indole ring, benzofuran ring , quinazoline ring, phthalazine ring, quinoline ring, isoquinoline ring, coumarin ring, chromone ring, benzodiazepine ring, phenoxazine ring, pheno
  • the aromatic ring may have a substituent, and examples of the substituent include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkylcarbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, and an alkylcarbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • acyloxy groups acylamino groups with 2 to 4 carbon atoms, alkoxycarbonylamino groups with 2 to 4 carbon atoms, fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms, iodine atoms, alkylsulfanyl groups with 1 to 4 carbon atoms, carbon atoms 1-4 alkylsulfonyl group, 6-10 carbon arylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, 1-4 carbon alkyl group, ureido group, 2-4 carbon alkylureido group , an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, an aryloxy group having 6 to 10 carbon atoms, and the like.
  • Preferred examples are acetyl group, methoxycarbonyl group, methylcarbamoyl group, acetoxy group, acetamide group, methoxycarbonylamino group, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group, propyl group, Examples include isopropyl group, tert-butyl group, ureido group, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, tert-butoxy group, phenyl group and phenoxy group.
  • Preferred specific structures of Z a and Z b include Z 1 .
  • s represents an integer of 0 to 3
  • t represents an integer of 0 to 3
  • u represents an integer of 0 to 4
  • u R 4 each independently represents a substituent.
  • s of Z 1 is preferably an integer of 0 to 1, more preferably 0.
  • t of Z 1 is preferably an integer of 0 to 2, more preferably 1.
  • u of Z 1 is preferably an integer of 0-2, more preferably an integer of 0-1.
  • R 4 of Z 1 is a substituent of an aromatic ring (benzene ring) contained in an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms that does not interfere with the reaction in the process of synthesizing the ionic lipid.
  • substituents include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkylcarbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms, and an acyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • acylamino group alkoxycarbonylamino group having 2 to 4 carbon atoms, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, alkylsulfanyl group having 1 to 4 carbon atoms, alkylsulfonyl group having 1 to 4 carbon atoms, 6 to 6 carbon atoms 10 arylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, ureido group, alkylureido group having 2 to 4 carbon atoms, alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, carbon 6 to 10 aryl groups, 6 to 10 carbon atoms aryloxy groups, etc.
  • Preferred examples include acetyl group, methoxycarbonyl group, methylcarbamoyl group, acetoxy group, acetamido group, methoxycarbonylamino group, fluorine atom. , chlorine atom, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, tert-butyl group, ureido group, methoxy groups, ethoxy groups, propoxy groups, isopropoxy groups, tert-butoxy groups, phenyl groups and phenoxy groups.
  • each R 4 may be the same or different.
  • Z a may be the same as or different from Z b , but Z a is preferably the same group as Z b .
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric acid
  • Fat-soluble vitamins having a hydroxyl group include, for example, retinol, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, colcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotachysterol, tocopherol, and tocotrienol. Fat-soluble vitamins having hydroxyl groups are preferably tocopherols.
  • sterol derivatives having a hydroxyl group examples include cholesterol, cholestanol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, and ergosterol, preferably cholesterol or cholestanol.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms may be linear or branched.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds contained in the aliphatic hydrocarbon group is generally 1-6, preferably 1-3, more preferably 1-2.
  • Unsaturated bonds include carbon-carbon double bonds and carbon-carbon triple bonds, preferably carbon-carbon double bonds.
  • the number of carbon atoms contained in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 13-19, most preferably 13-17.
  • Aliphatic hydrocarbon groups include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups and the like, and preferably include alkyl groups or alkenyl groups.
  • aliphatic hydrocarbon groups having 12 to 22 carbon atoms include dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, heptadecyl group, octadecyl group, nonadecyl group, icosyl group, henicosyl group and docosyl group.
  • dodecenyl group tridecenyl group, tetradecenyl group, pentadecenyl group, hexadecenyl group, heptadecenyl group, octadecenyl group, nonadecenyl group, icosenyl group, henicosenyl group, docosenyl group, dodecadienyl group, tridecadienyl group, tetradecadienyl group, pentadecadienyl group, hexadecadienyl group, heptadecadienyl group, octadecadienyl group, nonadecadienyl group, icosadienyl group, henicosadienyl group, docosadienyl group, octadecatrienyl group, icosatrienyl group, icosatetraenyl group,
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms is preferably tridecyl group, pentadecyl group, heptadecyl group, nonadecyl group, heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group, particularly preferably tridecyl group, They are a heptadecyl group, a heptadecenyl group and a heptadecadienyl group.
  • the C 12-22 aliphatic hydrocarbon groups represented by R 3a and R 3b are derived from fatty acids.
  • the carbonyl carbon derived from the fatty acid is included in -CO-O- in formula (1).
  • a specific example of the aliphatic hydrocarbon group is a heptadecadienyl group when linoleic acid is used as the fatty acid, and a heptadecenyl group when oleic acid is used as the fatty acid.
  • R 3a may be the same as or different from R 3b , but preferably R 3a is the same group as R 3b .
  • R 1a is the same as R 1b
  • X a is the same as Xb
  • R 2a is the same as R 2b
  • Y a is the same as Yb
  • Z a is is the same as Zb
  • R3a is the same as R3b .
  • Preferred examples of the ionic lipid (1) include the following ionic lipids (1-1) to (1-3).
  • each of R 1a and R 1b is independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group);
  • each of X a and X b is independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and having one tertiary amino group (eg, —N(CH 3 )—); or a cyclic alkylene tertiary amino group (eg, piperidylene group) having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups;
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 8 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • Z a and Z b are
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (e.g., tocopherol) and succinic anhydride or glutaric anhydride, or an aliphatic having 12 to 22 carbon atoms a hydrocarbon group (e.g., heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Ionic lipids (1).
  • a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group e.g., tocopherol
  • succinic anhydride or glutaric anhydride or an aliphatic having 12 to 22 carbon atoms a hydrocarbon group (e.g., heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group)
  • Ionic lipids (1).
  • each of R 1a and R 1b is independently an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group); each of X a and X b is independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 3 carbon atoms and having 1 tertiary amino group (eg, —N(CH 3 )—); or a cyclic alkylene tertiary amino group (e.g., piperidylene group) having 2 to 5 carbon atoms and one tertiary amino group; R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 6 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group); Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond; Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 6 to 12 carbon atoms, having one aromatic ring, and
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (e.g., tocopherol) and succinic anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 19 carbon atoms (e.g. , heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Ionic lipids (1).
  • a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group e.g., tocopherol
  • succinic anhydride e.g., an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 19 carbon atoms
  • each of R 1a and R 1b is independently an alkylene group having 1 to 2 carbon atoms (that is, a methylene group or an ethylene group);
  • X a and X b are each independently X 1 :
  • R 5 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, methyl group)
  • X 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, methyl group)
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 4 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group); Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond; Z a and Z b are each independently Z 1 :
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (e.g., tocopherol) and succinic anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 17 carbon atoms (e.g. , heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Ionic lipids (1).
  • the ionic lipid (1) include the following O-Ph-P3C1, O-Ph-P4C1, O-Ph-P4C2, O-Bn-P4C2, E-Ph-P4C2, L-Ph-P4C2, HD -Ph-P4C2, O-Ph-amide-P4C2, O-Ph-C3M.
  • O-Ph-P4C2 is preferred.
  • the amount of the ionic lipid (1) in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoint of nucleic acid encapsulation efficiency, nucleic acid release efficiency in cells, and lipid nanoparticle stability. It is preferably 10 to 90 mol %, more preferably 20 to 80 mol %, still more preferably 30 to 70 mol % relative to the total amount.
  • the “total amount of lipids in the lipid nanoparticles” means, for example, that the lipid nanoparticles contain, in addition to the ionic lipid (1), phospholipids, sterols, and PEG lipids (activated PEG lipids and inactive lipids) described later.
  • the total amount of the ionic lipid (1), the phospholipid described later, the sterol and the PEG lipid means "the total amount of the ionic lipid (1), the phospholipid described later, the sterol and the PEG lipid.
  • amount of B relative to A (mol%) means “100 ⁇ amount of B (mol)/amount of A (mol)”.
  • the amount (mol%) of ionic lipid (1) relative to the total amount of lipid means “100 x amount (mol) of ionic lipid (1)/total amount of lipid (mol)”.
  • the ionic lipid (1) can be produced by a known method (eg, the method described in WO 2019/188867 A1).
  • Phospholipids can be used as constituents of the lipid nanoparticles of the present invention. Only one type of phospholipid may be used, or two or more types may be used in combination.
  • phospholipids examples include 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PE), 1,2-diacyl-sn -glycero-3-phosphoserine (PS), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (PG), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (PA), their lyso forms etc.
  • PC 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • PE 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • PS 1,2-diacyl-sn -glycero-3-phosphoserine
  • PG 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • PA 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine are 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DDPC), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLoPC), 1,2-dierucyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC), 1-myristoy
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholines in which phosphocholine at position 3 of these 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholines is substituted with phosphoethanolamine, phosphoserine, phosphoglycerol, and phosphatidic acid, respectively Ethanolamine (PE), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine (PS), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (PG), 1,2-diacyl-sn-glycerol -3-phosphatidic acid (PA) can also be used.
  • PE Ethanolamine
  • PS 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine
  • PG 1,2-diacyl-sn-glycerol -3-phosphatidic acid
  • PA 1,2-diacyl-sn-glycerol -3-phosphatidic acid
  • the phospholipids are preferably PC and/or PE, more preferably DOPC, POPC, DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) and POPE1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
  • the amount in the lipid nanoparticles of the present invention is determined by the lipid in the lipid nanoparticles from the viewpoint of nucleic acid encapsulation efficiency, nucleic acid release efficiency in cells, and lipid nanoparticle stability. is preferably 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 30 mol%, and still more preferably 1 to 10 mol% of the total amount of
  • Sterol A sterol can be used as a constituent component of the lipid nanoparticles of the present invention (especially as a component that regulates the fluidity of lipid membranes). Only 1 type may be used for a sterol and it may use 2 or more types together.
  • sterols examples include cholesterol, lanosterol, phytosterol, dimesterol, dimesterol, desmostenol, stigmastanol, dihydrolanosterol, and 7-dehydrocholesterol.
  • the sterol is preferably at least one selected from the group consisting of cholesterol, lanosterol and phytosterol, more preferably cholesterol.
  • the amount of sterol in the lipid nanoparticles of the present invention is determined by the amount of lipids in the lipid nanoparticles from the viewpoint of nucleic acid encapsulation efficiency, nucleic acid release efficiency in cells, and lipid nanoparticle stability. It is preferably 1 to 70 mol %, more preferably 10 to 60 mol %, still more preferably 30 to 50 mol % relative to the total amount.
  • PEG lipid PEG lipid for example, suppresses the aggregation of lipid nanoparticles by coating the surface of the lipid nanoparticles with hydrophilic PEG, so that when the lipid nanoparticles are administered to the living body, the separation of the biological components and the particles It can be used to suppress interactions.
  • PEG lipids may be used alone or in combination of two or more.
  • the number average molecular weight (Mn) of the PEG portion of PEG lipids is, for example, 200-10,000. This number-average molecular weight is a value analyzed by gel permeation chromatography (GPC), and is a value calculated based on a calibration curve prepared using polyethylene glycol of various known molecular weights (hereinafter, not particularly Unless and unless otherwise contradicted, references to "molecular weight" with respect to PEG mean number average molecular weight).
  • the PEG portion of a PEG lipid can be linear or branched.
  • PEG lipids examples include PEG-linked phospholipids (PEG-phospholipids), PEG-linked ceramides (PEG-ceramides), PEG-linked diacylglycerols (PEG-diacylglycerols), PEG-linked cholesterol ( PEG-cholesterol).
  • the PEG lipid is preferably a PEG-linked diacylglycerol with a number average molecular weight of 1,000 to 10,000, more preferably a PEG-linked dimyristoyl with a number average molecular weight of 1,000 to 10,000. It is at least one selected from the group consisting of glycerol and PEG-bound distearoylglycerol having a number average molecular weight of 1,000 to 10,000.
  • Activated PEG Lipids comprise activated PEG lipids.
  • activated PEG lipid means a PEG lipid having a reactive group at the end of the PEG moiety capable of binding to a ligand.
  • a PEG lipid that does not have a reactive group capable of binding a ligand is sometimes referred to herein as a "non-activated PEG lipid.”
  • Each of the activated PEG lipid and the non-activated PEG lipid may be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of activated PEG lipid in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoint of nucleic acid encapsulation efficiency, nucleic acid release efficiency in cells, lipid nanoparticle stability and ligand modification efficiency. It is preferably 0.1 to 30 mol%, more preferably 0.5 to 20 mol%, and still more preferably 0.5 to 10 mol% relative to the total amount of lipids.
  • the amount thereof in the lipid nanoparticles of the present invention is determined by It is preferably 0.1 to 30 mol %, more preferably 0.5 to 20 mol %, still more preferably 0.5 to 10 mol %, relative to the total amount of lipids therein.
  • activated PEG lipids include the PEG lipids described above (e.g., PEG-phospholipids (preferably PEG-1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PE)), PEG-diacylglycerols, PEG-cholesterol, etc.) with azide, maleimide, NHS (N-hydroxysuccinimide), DBCO (N-dibenzocyclooctyl) or BCN (bicyclo[6.1.0]nonine) introduced at the PEG end is mentioned.
  • PEG-phospholipids preferably PEG-1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PE)
  • PEG-diacylglycerols PEG-cholesterol, etc.
  • azide maleimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • DBCO N-dibenzocyclooctyl
  • BCN bicyclo[6.1.0]nonine
  • the activated PEG lipid has formula (2):
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrocarbon chain having 14 to 18 carbon atoms
  • X is formula (3):
  • Y represents a single bond
  • X is a group represented by formula (3)
  • Y represents a single bond
  • X is a single bond
  • Y represents an oxygen atom
  • n represents an integer of 1 or 2 or more such that (OCH 2 CH 2 ) n has a molecular weight of 1,000 to 5,000.
  • activated PEG lipid (2) is a compound represented by (hereinafter also referred to as "activated PEG lipid (2)").
  • the activated PEG lipid is a compound ( DSG -PEG —DBCO), or a compound of formula (2) in which R 1 and R 2 are saturated hydrocarbon chains having 18 carbon atoms, X is a group represented by formula (3), and Y is a single bond ( DSPE-PEG-DBCO). More preferred is DSG-PEG-DBCO.
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited as long as it is within the above range, it is preferably 2000 (2k).
  • the activated PEG lipid can be DSG-PEG2k-DBCO or DSPE-PEG2k-DBCO, more preferably DSG-PEG2k-DBCO.
  • DSPE-PEG2k-DBCO is commercially available. An example of the synthesis of DSG-PEG2k-DBCO is described.
  • the resulting solution was separated twice with pure water (10 mL) and once with saturated brine. After distilling off the solvent of the organic phase and drying it, it was dissolved in pure water, and the reaction solution was transferred to a dialysis membrane with a cutoff molecular weight of 3.5 kDa and dialyzed against pure water overnight. The dialysate was lyophilized to remove the solvent to obtain 30 mg of a white solid.
  • the activated PEG lipid can be cholesterol (Chol)-PEG-BCN or dicholesterol (DiChol)-PEG-BCN.
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited as long as it falls within the range of 1,000 to 5,000, preferably 2,000 (2k).
  • the activated PEG lipid can be Chol-PEG2k-BCN or DiChol-PEG2k-BCN. Synthesis examples of these two compounds will be described.
  • the total amount of the obtained solid was dissolved in anhydrous dichloromethane (10 mL) under an argon atmosphere, and succinimidyl (1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl carbonate (70 mg), Add triethylamine (100 ⁇ L), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (250 mg), N-hydroxysuccinic acid (100 mg), and dimethylaminopyridine (10 mg) and stir overnight.
  • the resulting solution was partitioned once with a 5% by weight aqueous sodium hydrogencarbonate solution (30 mL), twice with pure water (30 mL), and once with saturated brine (30 mL). After drying the resulting solution with sodium sulfate powder, the organic layer was separated using flash chromatography (hexane/ethyl acetate gradient). The solvent of the separated solution was distilled off to obtain Chol-PEG2k-BCN (0.596 g) as a white solid.
  • Cell-tropic ligand The lipid nanoparticles of the present invention are characterized by being modified with a cell-tropic ligand.
  • the term “cell tropism” as used herein means having a higher affinity for one or more specific cells (including tissues and organs containing the cells) than for other cell types. , as a result of which lipid nanoparticles can be selectively delivered to specific cells.
  • the ligand is a target cell to which the lipid nanoparticle should be delivered (e.g., a cell in which a therapeutic effect on a disease is exhibited by introducing a drug (preferably nucleic acid) encapsulated in the lipid nanoparticle into the cell (e.g., it is not particularly limited as long as it is a substance having specific affinity for molecules expressed on the surface of cancer cells, etc.).
  • a drug preferably nucleic acid
  • it is not particularly limited as long as it is a substance having specific affinity for molecules expressed on the surface of cancer cells, etc.
  • examples thereof include peptides (including proteins), antibodies, nucleic acids (including oligonucleotides), aptamers, sugars, lipids, etc.
  • Preferred examples include peptides, antibodies and the like.
  • cell-tropic peptides include peptides containing an RGD motif (e.g., GRGDS pentapeptide) that have affinity for integrin ⁇ v ⁇ 3 , which is highly expressed in vasculature and some cancer cells, Examples include, but are not limited to, laminin ⁇ 2 chain-derived peptides that have affinity for expressed dystroglycan. Alternatively, polypeptides that are natural ligands for cell surface receptors such as cytokines and hormones can be mentioned.
  • RGD motif e.g., GRGDS pentapeptide
  • Antibodies with cell tropism include any antibody against molecules expressed on the surface of target cells, for example, against CD3, CD28, CD4 (helper T cells) or CD8 (killer T cells) expressed on T cells. Examples include, but are not limited to, antibodies, antibodies to CD19 expressed on B cells, and the like. Alternatively, antibodies used as existing antibody drugs or antibodies recognizing the same antigen as them can be used as ligands for targeting to target cells expressing the antigen.
  • Antibodies for use in the invention may be whole antibody molecules, such as single chain antibodies (scFv), Fab, F(ab') 2 , Fab', Fv, reduced antibodies (rIgG), dsFv, Any other antibody fragment such as sFv, diabodies, triabodies, etc. may preferably be used.
  • scFv single chain antibodies
  • Fab fragment antigen binding domain
  • F(ab') 2 fragment antigen binding
  • Fab' fragment antigen binding
  • Fv reduced antibodies
  • dsFv reduced antibodies
  • Any other antibody fragment such as sFv, diabodies, triabodies, etc.
  • nucleic acids include ligands for Toll-like receptors such as double-stranded RNA and CpG oligonucleotides
  • sugars include N-
  • lipids include acetylgalactosamine and the like
  • examples of lipids include various lipids (eg, lysophosphatidylserine) that are natural ligands for G protein-coupled receptors.
  • the amount of the ligand is preferably 0.01 to 30 mol%, more preferably 0.01 to 10 mol, relative to the total amount of lipids in the lipid nanoparticles, from the viewpoint of achieving both selectivity to target cells and preferable particle properties. %, more preferably 0.01 to 5 mol %.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can be produced by, for example, Producing lipid nanoparticles (hereinafter sometimes referred to as "the precursor of the present invention") from a lipid raw material containing an ionic lipid (1) and an activated PEG lipid (preferably an activated PEG lipid (2)), The resulting lipid nanoparticles can be produced by binding a ligand having cell tropism.
  • the precursors (i.e., ligand-free lipid nanoparticles with cell-tropic properties) of the present invention are prepared from a lipid raw material comprising an ionic lipid (1) and an activated PEG lipid (preferably an activated PEG lipid (2)). It can be produced by dispersing it in a suitable dispersion medium (eg, aqueous dispersion medium, alcoholic dispersion medium) and, if necessary, performing an operation to induce organization.
  • a suitable dispersion medium eg, aqueous dispersion medium, alcoholic dispersion medium
  • Examples of the "organization-inducing operation" for producing the precursor of the present invention include ethanol dilution using a microchannel or vortex, simple hydration, ultrasonication, heating, vortex, and ether injection. method, French press method, cholic acid method, Ca 2+ fusion method, freeze-thaw method, reverse phase evaporation method, etc., preferably ethanol dilution method using microchannel or vortex. and, more preferably, an ethanol dilution method using a microchannel.
  • an acidic buffer solution containing nucleic acids and an ethanol solution of lipids are mixed to produce a dispersion containing lipid nanoparticles.
  • the dispersion produced by this method contains lipid nanoparticles and a dispersion medium (acidic buffer and ethanol). (especially buffer solution) can be exchanged.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can be produced by binding a cell-tropic ligand to the obtained precursor of the present invention. This binding can be done by adding a cell-directing ligand to the dispersion containing the precursor of the invention.
  • concentration of total lipids of the precursor in the dispersion is preferably 1-100 mM, more preferably 1-50 mM, even more preferably 1-30 mM.
  • the ratio of the ligand used is preferably 1 to 100 mol, more preferably 1 to 50 mol, more preferably 1 to 1 mol of activated PEG lipid (preferably activated PEG lipid (2)) in the precursor of the present invention. ⁇ 10 mol.
  • the reaction temperature for this coupling is preferably 0-60° C., more preferably 0-40° C., still more preferably 0-20° C., and the reaction time is preferably 1-72 hours, more preferably 1 hour. to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • nucleic Acid Transfer Agent and Method for Introducing Nucleic Acid into Cells
  • the nucleic acid is introduced into the cell in vivo and/or in vitro. can do.
  • the present invention also provides a nucleic acid transfer agent containing the lipid nanoparticles of the present invention, and a method for transferring nucleic acid into cells using the same.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can introduce any nucleic acid into cells.
  • nucleic acids include, but are not limited to, DNA, RNA, RNA chimeric nucleic acids, DNA/RNA hybrids, and the like.
  • the nucleic acid may be either single-stranded or triple-stranded, preferably single-stranded or double-stranded.
  • Nucleic acids can be, for example, nucleotides with N-glycosides of purine or pyrimidine bases, oligomers with non-nucleotide backbones (such as commercially available peptide nucleic acids (PNA), etc.), or oligomers with special linkages (wherein said oligomers are DNA or contain nucleotides having a configuration that allows base pairing or base attachment as found in RNA).
  • PNA peptide nucleic acids
  • nucleic acids include, for example, nucleic acids with known modifications, labeled nucleic acids known in the art, capped nucleic acids, methylated nucleic acids, one or more natural nucleotides replaced with analogues.
  • Nucleic acids containing intercurrent compounds e.g., acridine, psoralen, etc.
  • nucleic acids containing chelate compounds e.g., metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents and nucleic acids having modified bonds eg, ⁇ -anomeric nucleic acids, etc.
  • DNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • Examples of DNA include plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, chromosomal DNA, PAC, BAC, CpG oligo and the like, preferably plasmid DNA, cDNA and antisense DNA, more preferably plasmid DNA.
  • Circular DNA such as plasmid DNA can be appropriately digested with a restriction enzyme or the like and used as linear DNA.
  • RNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose of use.
  • examples of RNA include siRNA, miRNA, shRNA, antisense RNA, messenger RNA (mRNA), single-stranded RNA genome, double-stranded RNA genome, RNA replicon, transfer RNA, ribosomal RNA, etc., preferably siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, antisense RNA, RNA replicon.
  • nucleic acids used in the present invention are preferably purified by methods commonly used by those skilled in the art.
  • the nucleic acid transfer agent of the present invention encapsulating a nucleic acid can be administered in vivo, for example, for the purpose of preventing and/or treating diseases. Therefore, the nucleic acid used in the present invention is preferably one having preventive and/or therapeutic activity (prophylactic/therapeutic nucleic acid) for a given disease.
  • Such nucleic acids include, for example, nucleic acids used for so-called gene therapy.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention encapsulating nucleic acid can be used as a drug delivery system for selectively delivering nucleic acid or the like into specific cells. It is useful for gene therapy drugs for cancer and tumors, nucleic acid drugs that suppress target gene expression using RNA interference, and the like.
  • the particle size of the nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle size can be measured using a particle size distribution analyzer such as Zetasizer Nano (Malvern).
  • the particle size of the nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles can be appropriately adjusted depending on the production method.
  • the surface potential (zeta potential) of the nucleic acid-encapsulated lipid nanoparticles is not particularly limited, but is preferably -15 to +15 mV, more preferably -10 to +10 mV.
  • particles with positively charged surfaces have mainly been used. This is useful as a method for promoting electrostatic interaction with negatively charged cell surface heparin sulfate and promoting cell uptake.
  • the positive surface potential can cause (a) suppression of nucleic acid release from the carrier due to interaction with delivery nucleic acid in cells, and (b) suppression of protein synthesis due to interaction of mRNA with delivery nucleic acid. have a nature. This problem can be solved by adjusting the surface potential (zeta potential) within the above range.
  • the surface potential (zeta potential) can be measured using a zeta potential measuring device such as Zetasizer Nano.
  • the surface potential (zeta potential) of lipid nanoparticles can be adjusted by the composition of the constituent components of the lipid nanoparticles.
  • nucleic acid-introducing agent lipid nanoparticle
  • Cells are suspended in an appropriate medium and cultured under appropriate conditions several days before contact with the nucleic acid-encapsulating agent of the present invention. At the time of contact with the nucleic acid introduction agent of the present invention, the cells may or may not be in the growth phase.
  • the culture medium used when the nucleic acid-introducing agent of the present invention encapsulating a nucleic acid and the cells are brought into contact may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the serum concentration in the medium is preferably 30% by weight or less, more preferably 20% by weight or less. If the medium contains excess proteins such as serum, the contact between the nucleic acid transfer agent of the present invention and cells may be inhibited.
  • the cell density at the time of contact between the nucleic acid-introducing agent of the present invention encapsulating nucleic acid and cells is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the cell type, etc., but is usually 1 ⁇ 10. It ranges from 4 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • the nucleic acid-encapsulating dispersion of the nucleic acid introduction agent of the present invention is added to the cells.
  • the amount of the dispersion to be added is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the number of cells and the like.
  • the concentration of lipid nanoparticles contained in the nucleic acid transfer agent of the present invention when brought into contact with cells is not particularly limited as long as the desired nucleic acid can be introduced into cells. is usually 1 to 100 nmol/mL, preferably 10 to 50 nmol/mL, and the concentration of the nucleic acid in the dispersion is usually 0.01 to 100 ⁇ g/mL, preferably 0.1 to 10 ⁇ g/mL.
  • the cells After adding the dispersion liquid described above to the cells, the cells are cultured.
  • the temperature, humidity, CO2 concentration, etc. during culture are appropriately set in consideration of the cell type. If the cells are of mammalian origin, typically the temperature is about 37° C., the relative humidity is about 95%, and the CO 2 concentration is about 5% by volume.
  • the culture time can be appropriately set in consideration of the conditions such as the type of cells used, but it is usually in the range of 0.1 to 76 hours, preferably 0.2 to 24 hours, more preferably 0. 0.5 to 12 hours. If the culture time is too short, the nucleic acid will not be sufficiently introduced into the cells, and if the culture time is too long, the cells will weaken.
  • Nucleic acids are introduced into the cells by the above culture, and preferably the medium is replaced with fresh medium or fresh medium is added to the medium and the culture is continued. If the cells are mammalian-derived cells, the fresh medium preferably contains serum or nutrient factors.
  • nucleic acid introduction agent of the present invention By using the nucleic acid introduction agent of the present invention encapsulating nucleic acid, it is possible to introduce nucleic acid into cells not only in vitro but also in vivo. That is, by administering the nucleic acid transfer agent of the present invention encapsulating a nucleic acid to a subject, the nucleic acid transfer agent of the present invention reaches and contacts target cells, and is encapsulated in the nucleic acid transfer agent of the present invention in vivo. A nucleic acid is introduced into the cell. Subjects to which the nucleic acid-encapsulating nucleic acid transfer agent of the present invention can be administered are not particularly limited.
  • nucleic acid transfer agent of the present invention encapsulating nucleic acid is preferably humans or other mammals.
  • the type of target cells is not particularly limited, and various tissues (e.g., liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, Nucleic acids can be introduced into cells in the brain, stomach, small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, lymph nodes, tumors, etc.).
  • tissues e.g., liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone
  • Nucleic acids can be introduced into cells in the brain, stomach, small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, lymph nodes, tumors, etc.
  • the method of administering the nucleic acid introduction agent of the present invention encapsulating a nucleic acid to a subject is such that the nucleic acid introduction agent of the present invention reaches and contacts the target cells, and the nucleic acid introduction agent of the present invention is administered.
  • the method is not particularly limited as long as it can introduce the nucleic acid enclosed in the cell into the cell, and considering the type of nucleic acid to be introduced, the type and site of the target cell, etc., an administration method known per se (e.g., oral administration , parenteral administration (eg, intravenous administration, intramuscular administration, topical administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, spray, etc.), etc.) can be selected as appropriate.
  • the dosage of the nucleic acid introduction agent of the present invention is not particularly limited as long as it is within a range that can achieve the introduction of the nucleic acid into cells. And it can be selected as appropriate in consideration of the site and the like.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can also be used to introduce compounds other than nucleic acids into cells.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention encapsulating a nucleic acid can be formulated according to conventional methods.
  • the nucleic acid transfer agent of the present invention is provided as a research reagent
  • the nucleic acid transfer agent of the present invention contains the lipid nanoparticles of the present invention and water or other physiologically acceptable dispersion medium (e.g., water-soluble dispersion).
  • nucleic acid transfer agent of the present invention can optionally contain known physiologically acceptable additives (eg, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc.).
  • the nucleic acid transfer agent of the present invention comprises the lipid nanoparticles of the present invention and known pharmaceutically acceptable additives (e.g., carriers, flavoring agents, excipients). , vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc.). Alternatively, it may be provided as a nucleic acid transfer agent containing no known additives.
  • the nucleic acid transfer agent of the present invention as a pharmaceutical is preferably a parenteral agent (more preferably an injection). In addition, the nucleic acid transfer agent of the present invention may be either an adult or pediatric formulation.
  • ionic lipid (1) is indicated by the names described in the table above.
  • Abbreviations used in the following examples and the like have the following meanings.
  • Azido-PEG4-NHS 15-azido-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid
  • N-succinimidyl Chol cholesterol
  • Chol-PEG2k-BCN cholesterylcarbamoyl, 1R,8S,9s)-bicyclo [6.1.
  • non-4-yn-9-ylmethyl polyethylene glycol (PEG number average molecular weight (Mn): 2000), Cy5-Alkyne: 3,3-dimethyl, l-1-[6-oxo-6-(prop-2-ylamino)hexyl]-2-[(1E,3E,5E)-5-(1,3,3 -trimethylindrin-2-ylidene)pent-1,3-dienyl]-3H-indolium chloride
  • DiChol-PEG2k-BCN N-(2-polyethylene glycol (PEG number average molecular weight (Mn): 2000))- 3,5-bis(cholesterylamino)pentanamide
  • DiD 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate
  • DMG-PEG2k 1,2-dimyristoyl -rac-glycerol, methoxypoly
  • the fragment solution passed through the column was transferred to Amicon Ultra 15 (MWCO: 50 kDa), diluted to 14 mL with sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9.0), and centrifuged (25 ° C., 1000 g , 5 min) was repeated and concentrated by ultrafiltration to approximately 500 ⁇ L. After that, sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9.0) was used to make up to 14 mL, and centrifugation (25° C., 1000 g, 5 minutes) was repeated to concentrate to 500 ⁇ L. Finally, the volume was adjusted to 1 mL using sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9.0).
  • the protein concentration and protein amount were calculated by measuring the absorbance at 280 nm of the introduced fragment solution of the reaction substrate using Nanodropone (Thermo Scientific). Four equivalents of Azido-PEG4-NHS were added to the fragment solution, and the mixture was shaken at room temperature for 2 hours and then at 4°C overnight to introduce the reaction substrate. After introduction of the reaction substrate, the fragment solution was subjected to removal of unreacted reagents and replacement with ultrapure water using a zeba-spin desalting column.
  • reaction substrate 100 ⁇ g equivalent of the fragment solution after introduction of the substrate was placed in a light-shielded Eppendorf tube, further 10 ⁇ L of ascorbic acid (20 mM), 10 ⁇ L of copper sulfate aqueous solution (20 mM), 2 ⁇ L of Cy5-Alkyne (10 mg/mL), Finally, ultrapure water was used to make up the volume to 100 ⁇ L, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was transferred to a dialysis membrane with a cut-off molecular weight of 3.5 kDa and dialyzed overnight. After dialysis, the amount of protein was calculated by the BCA method, and the amount of Cy5 modification was calculated by fluorescence. The number of reaction substrates introduced was obtained by dividing the amount of Cy5 modification by the amount of protein.
  • Example 1 Production of ligand-modified mRNA-encapsulating LNP 1.
  • Production of mRNA-encapsulated LNP by microchannel (1) Production of lipid ethanol solution The lipid ethanol solution was prepared by adding 10 mM O-Ph-P4C2, 5 mM phospholipid, and 5 mM cholesterol to an Eppendorf tube so that the total lipid amount was 800 nmol. Mix at the desired ratio, add 1 mM DMG-PEG2k ethanol solution in an amount equivalent to 1.5% of the total lipid amount, add activated PEG lipid in an amount equivalent to 1% of the total lipid amount, and adjust the total amount to 360 ⁇ L. was prepared by adding ethanol to
  • the acidic buffer solution for nucleic acid is 6.6 ⁇ g of mRNA solution (approximately 0.6-0.8 ⁇ g/ ⁇ L, although the concentration varies depending on the efficiency of in vitro translation) in a 5 mL tube. It was weighed as described above, and an acidic malate buffer (20 mM, pH 3.0, containing 30 mM NaCl) was added so that the total volume was 990 ⁇ L.
  • the solution was made up to 4 mL using an acidic malic acid buffer (20 mM, pH 4.0, containing 30 mM NaCl), and centrifuged again (25°C, 1000 g, 5 minutes), and concentrated by ultrafiltration to about 250 ⁇ L. . Finally, an acidic malic acid buffer (20 mM, pH 4.0, containing 30 mM NaCl) was used to make up the volume to the target lipid concentration to produce an mRNA-encapsulated LNP dispersion.
  • an acidic malic acid buffer (20 mM, pH 4.0, containing 30 mM NaCl
  • ligand was added in an equimolar amount to the activated PEG lipid and diluted to 750 ⁇ L with acidic malate buffer (20 mM, pH 4.0, containing 30 mM NaCl). and allowed to react overnight at 4°C. After that, it was transferred to Amicon Ultra 4, made up to 4 mL using PBS, centrifuged (25° C., 1000 g, 5 minutes) repeatedly, and concentrated by ultrafiltration to about 500 ⁇ L.
  • the volume was made up to 4 mL using PBS, centrifugation (25° C., 1000 g, 5 minutes) was repeated, and ultrafiltration was carried out to about 250 ⁇ L for concentration. Finally, PBS was used to make up the desired lipid concentration to produce a ligand-modified mRNA-encapsulated LNP dispersion.
  • Example 2 Production of T cell-directing ligand-modified mRNA-encapsulated LNP DMG-PEG2k at 1.5 mol%, DSPE-PEG2k-DBCO (Avanti Polar Lipids) at 1 mol%, and DiD at 0.5 mol% as an index of uptake relative to the sum of P4C2, DOPC and Chol). , and manufactured by the method described in [Example 1]. Then, LNP was modified by the method of [Example 1] using F(ab')2 prepared from anti-CD3-IgG antibody as a ligand to prepare ligand-modified mRNA-encapsulated LNP.
  • F(ab')2 prepared from anti-CD3-IgG antibody
  • Example 1 Evaluation of LNP uptake ability of splenic T cells in vivo (FACS analysis)
  • the ligand-modified mRNA-encapsulated LNP prepared in Example 2 was diluted with PBS to an mRNA concentration of 2.5 ⁇ g/mL.
  • Diluted ligand-modified mRNA-encapsulated LNP was administered intravenously to 6-week-old female C57/BL6J mice at 10 ⁇ L/g body weight (0.025 mg/kg mRNA dose).
  • spleens were collected from the mice and collected in a petri dish containing 3 mL of RPMI-1640 (containing 1% FBS).
  • Spleen cells were strained out using forceps and suspended with a 5 mL syringe. The entire volume was transferred to a 15 mL centrifuge tube through a 70 ⁇ m cell strainer. After centrifugation (4° C., 500 g, 5 minutes), the supernatant was removed, and Red Blood Cell Lysing Buffer (1 mL) was added to suspend and allowed to stand at room temperature for 5 minutes for hemolysis. After that, it was diluted 5-fold with FACS buffer (0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.1% NaN 3 -containing PBS), centrifuged (4°C, 500 g, 5 minutes), and the supernatant was removed.
  • FACS buffer (0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.1% NaN 3 -containing PBS
  • Fc blocking was done.
  • CD16/32 antibody available from BioLegend was added in the amount recommended by the manufacturer and incubated on ice for 10 minutes or longer.
  • CD16/32 antibody (described above) was added in the amount recommended by the manufacturer and incubated on ice for 10 minutes or more.
  • Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 and Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 ⁇ (described above) were added in amounts recommended by the manufacturer and incubated on ice for 30 minutes to perform fluorescence labeling of cell surface antigens.
  • Cells were washed twice with FACS buffer, resuspended in FACS buffer (500 ⁇ L), and T cell isolation of 2 ⁇ 10 5 cells was performed using a BD FACSMelody TM cell sorter (Becton, Dickinson and Company). rice field.
  • Encapsulated and microscopically isolated T cells were concentrated by centrifugation (4° C., 500 g, 5 minutes) and removal of the supernatant. 10 ⁇ L of ProLong Diamond antifading mounting medium and 10 ⁇ L of the concentrated T cells were mixed, 10 ⁇ L was dropped onto a glass plate, covered with a cover glass, and encapsulated. After standing overnight at 4° C., DiD fluorescence was observed with an LSM780 confocal laser scanning microscope (Zeiss). The results are shown in FIG. In addition, "unmodified (LNP)" or “antibody-modified (LNP)" in FIG. 2 indicates the results using unmodified LNP or antibody-modified LNP, respectively. Microscopic observation also confirmed that modification with an anti-CD3 antibody fragment significantly increased LNP uptake into T cells.
  • LNP uptake capacity of splenic T cells in vivo 1.
  • the ligand-modified mRNA-encapsulated LNP prepared in 1. was diluted with PBS to an mRNA concentration of 5 ⁇ g/mL.
  • Diluted ligand-modified mRNA-encapsulated LNPs were injected into 6-week-old female Ai14 mice (the loxP-stop codon-loxP-tdTomato gene was integrated at the ROSA26 locus, the stop codon was excised in the presence of Cre recombinase, and tdTomato (purchased from The Jackson Laboratory) expressing a reporter) was intravenously administered to 10 ⁇ L per 1 g of body weight (dosage of mRNA was 0.05 mg/kg).
  • Example 3 Production of mRNA-encapsulated LNP using novel activated PEG lipids (1) Production of lipid ethanol solution The lipid ethanol solution was prepared by adding 10 mM O-Ph-P4C2, 5 mM phospholipid, 5 mM cholesterol in an Eppendorf tube. are mixed at the target ratio so that the total lipid amount is 800 nmol, 1 mM DMG-PEG2k ethanol solution is added in an amount equivalent to 1.5 mol% with respect to the total amount of lipids, and activated PEG lipid is added to the total amount of lipids. was added in an amount equivalent to 1 mol % of the solution, and ethanol was added so that the total amount was 360 ⁇ L.
  • DSPE-PEG2k-DBCO manufactured by Avanti Polar Lipids
  • DSG-PEG2k-DBCO, Chol-PEG2k-BCN or DiChol-PEG2k-BCN was used as the activated PEG lipid.
  • DSG-PEG2k-DBCO, Chol-PEG2k-BCN and DiChol-PEG2k-BCN were synthesized in the same manner as in the synthesis examples described in [Mode for Carrying Out the Invention].
  • the acidic buffer solution for nucleic acid is 6.6 ⁇ g of mRNA solution (approximately 0.6-0.8 ⁇ g/ ⁇ L, although the concentration varies depending on the efficiency of in vitro translation) in a 5 mL tube. It was weighed as described above, and an acidic malate buffer (20 mM, pH 3.0, containing 30 mM NaCl) was added so that the total volume was 990 ⁇ L.
  • LNP was modified by the method of [Example 2] using F(ab')2 prepared from anti-CD3-IgG antibody as a ligand to prepare ligand-modified mRNA-encapsulated LNP.
  • F(ab')2 prepared from anti-CD3-IgG antibody
  • Fc blocking was performed by adding the amount of CD16/32 antibody (described above) recommended by the manufacturer and incubating on ice for 10 minutes or longer.
  • F(ab')2 prepared from an anti-CD3-IgG antibody as a ligand was modified by the method of [Example 2] to prepare a ligand-modified mRNA-encapsulated LNP.
  • DSPE-PEG2k-DBCO or DSG-PEG2k-DBCO was used as the activated PEG lipid.
  • the prepared ligand-modified mRNA-encapsulated LNP was diluted with PBS to an mRNA concentration of 5 ⁇ g/mL.
  • Diluted ligand-modified mRNA-encapsulated LNP was administered intravenously to 4-week-old female Ai14 mice (described above) at 10 ⁇ L/g body weight (0.05 mg/kg mRNA dose).
  • Three days after administration spleens were collected from the mice, and cell suspensions were prepared by the method described in [Test Example 1]. 2 ⁇ 10 6 cells were dispensed and Fc blocked.
  • CD16/32 antibody (described above) was added in the amount recommended by the manufacturer and incubated on ice for 10 minutes or longer.
  • Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45, Brilliant Violet 510 anti-mouse CD19, and Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 ⁇ (described above) were added in amounts recommended by the manufacturer and incubated on ice for 30 minutes to detect fluorescent labeling of cell surface antigens. gone.
  • 7-AAD Viability Staining Solution (described above) was added in the amount recommended by the manufacturer at the remaining 5 minutes of antibody staining, and dead cell staining was performed.
  • tdTomato expression was analyzed. The results are shown in FIG. Note that “DSPE” or “DSG” in FIG. 6 indicates the results using DSPE-PEG2k-DBCO or DSG-PEG2k-DBCO, respectively, and “PBS” in FIG. 6 indicates DSPE-PEG2k-DBCO or Results are shown without DSG-PEG2k-DBCO.
  • DSPE-PEG2k-DBCO as an activated PEG lipid showed better uptake into T cells than using DSG-PEG2k-DBCO, but the number of cells expressing the introduced mRNA was higher than that of DSG-PEG2k-DBCO. better when used.
  • the fragment solution passed through the column was transferred to Amicon Ultra 15 (MWCO: 50 kDa), diluted to 14 mL with sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9.0), and centrifuged (25 ° C., 1000 g , 5 min) was repeated, and ultrafiltered and concentrated to about 500 ⁇ L.
  • sodium carbonate buffer 100 mM, pH 9.0
  • centrifugation 25° C., 1000 g, 5 min
  • the volume was adjusted to 1 mL using sodium carbonate buffer (100 mM, pH 9.0).
  • the protein concentration and protein amount were calculated by measuring the absorbance at 280 nm of the introduced fragment solution of the reaction substrate using Nanodropone (Thermo Scientific). Four equivalents of Azido-PEG4-NHS were added to the fragment solution, and the mixture was shaken at room temperature for 2 hours and then at 4°C overnight to introduce the reaction substrate. After introduction of the reaction substrate, the fragment solution was subjected to removal of unreacted reagents and replacement with ultrapure water using a zeba-spin desalting column.
  • reaction substrate 100 ⁇ g equivalent of the fragment solution after introduction of the substrate was placed in a light-shielded Eppendorf tube, further 10 ⁇ L of ascorbic acid (20 mM), 10 ⁇ L of copper sulfate aqueous solution (20 mM), 2 ⁇ L of Cy5-Alkyne (10 mg/mL), Finally, ultrapure water was used to make up the volume to 100 ⁇ L, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 2 hours. After the reaction, the reaction solution was transferred to a dialysis membrane with a cut-off molecular weight of 3.5 kDa and dialyzed overnight. After dialysis, the amount of protein was calculated by the BCA method, and the amount of Cy5 modification was calculated by fluorescence. The number of reaction substrates introduced was obtained by dividing the amount of Cy5 modification by the amount of protein.
  • Example 4 Preparation of B-cell tropic ligand-modified mRNA-encapsulated LNP 1.5 mol% of DMG-PEG2k, 0.4, 0.8, 1.2 or 1.6 mol% of DSPE-PEG2k-DBCO (manufactured by Avanti Polar Lipids) with respect to the total of P4C2, DOPC and Chol, and using 0.5 mol % of DiD as an index of uptake) were prepared by the method described in [Example 1]. Then, LNP was modified by the method of [Example 1] using F(ab')2 prepared from anti-CD19-IgG antibody as a ligand to prepare ligand-modified mRNA-encapsulated LNP.
  • F(ab')2 prepared from anti-CD19-IgG antibody
  • Example 8 In vivo evaluation of LNP uptake ability of splenic B cells The ligand-modified mRNA-encapsulated LNP prepared in Example 4 was diluted with PBS to an mRNA concentration of 1.5 ⁇ g/mL. Diluted ligand-modified mRNA-encapsulated LNP was administered intravenously to 7-week-old female C57/BL6J mice at 10 ⁇ L/g body weight (0.015 mg/kg mRNA dose). One day after administration, spleens were collected from the mice, and cell suspensions were prepared by the method described in [Test Example 1]. 1 ⁇ 10 6 cells were subjected to Fc blocking by the method of [Test Example 1].
  • LNP uptake ability of splenic B cells in vivo 1.
  • the ligand-modified mRNA-encapsulated LNP prepared in 1. was diluted with PBS to an mRNA concentration of 1.5 ⁇ g/mL.
  • Diluted ligand-modified mRNA-encapsulated LNP was administered intravenously to 7-week-old female C57/BL6J mice at 10 ⁇ L/g body weight (0.015 mg/kg mRNA dose).
  • spleens were collected from the mice, and cell suspensions were prepared by the method described in [Test Example 8].
  • Antibody staining was performed by the method of [Test Example 9], subset classification was performed using a Novocyte flow cytometer (ACEA Biosciences), and LNP peripheral blood B cells (CD45 + / CD3- / CD19+) uptake was analyzed. The results are shown in FIG. In addition, ntLNP in FIG. 10 shows the results using unmodified LNP, and “0.4 (mol%)”, “0.8 (mol%)”, “1.2 (mol%)” in FIG. %)” or “1.6 (mol%)” means that the molar ratio of activated PEG lipid (DSG-PEG2k-DBCO) to the total lipid amount is 0.4 mol%, 0.8 mol%, 1.2 mol%, respectively.
  • ligand-modified LNPs significantly increased B over unmodified LNPs.
  • Cellular uptake is elevated, especially at a molar ratio of 0.4 mol%, with the highest B-cell uptake, which is also significant for other molar ratios (0.8-1.6%). uptake into B cells was increased.
  • the lipid nanoparticles of the present invention are useful for nucleic acid medicine, gene therapy, biochemical experiments, and the like.

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Abstract

本発明は、下記式（１）で表されるイオン性脂質（式中の記号の定義は明細書に記載の通りである）および活性化ＰＥＧ脂質に結合した細胞指向性を有するリガンドを含む脂質ナノ粒子を提供する。

Description

細胞指向性を有する脂質ナノ粒子
　本発明は、細胞指向性を有する脂質ナノ粒子、その製造方法、およびその用途に関する。
　核酸治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、安全性の観点から実用上問題がある。そのため、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められており、そのなかでもイオン性脂質を用いたキャリアである脂質ナノ粒子は、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。
　イオン性脂質は大別してアミン部位と脂質部位から構成されており、酸性条件下でプロトン化するアミン部位とポリアニオンである核酸が静電的に相互作用し、脂質ナノ粒子を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。
　一般に広く用いられている公知のイオン性脂質としては１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）が挙げられる。公知のイオン性脂質とリン脂質、コレステロール、ＰＥＧ脂質を組み合わせることによって、脂質ナノ粒子を形成し、細胞内に核酸を送達し得ることが知られている（非特許文献１）。
　特許文献１では、一つまたは二つのアミン部位と一つの脂質部位からなる化合物同士を、生分解性を示すジスルフィド結合で繋いだ構造を有するイオン性脂質について述べられている。この文献では、該イオン性脂質が血中安定性や腫瘍標的性などの体内動態を改善することができ、また、アミン部位周辺の構造を変更することで、脂質膜構造体としてのｐＫａを細胞内でのエンドソーム脱出に有利な値に調整でき、さらに、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果を有することが示されている。実際、公知のイオン性脂質であるＤＯＤＡＰと比較して、高い核酸送達効率を示すことから、該イオン性脂質は核酸の細胞質内への送達効率の向上などの細胞内動態を改善できることが明らかとなっている。
　特許文献２では、３級アミン部位、ジスルフィド結合に加えて、脂質部位近傍に芳香環を導入したイオン性脂質を用いることで、エンドソーム膜との融合能を高め、細胞質への核酸導入効率をさらに高めた脂質膜構造体が示されている。
　非特許文献２では、エンドソーム脱出効率を高める効果をもつＧＡＬＡペプチドで修飾した脂質ナノ粒子が示されている。該文献では予めＰＥＧ脂質とＧＡＬＡペプチドとを結合させてＧＡＬＡ－ＰＥＧ脂質を合成後に、ＧＡＬＡ－ＰＥＧ脂質と、その他の成分とから脂質ナノ粒子を製造することで、ＧＡＬＡペプチドで修飾した脂質ナノ粒子が製造できることが示されている。
　上述のようにエンドソーム脱出効率や膜融合能を高めることで、細胞内動態を改善したイオン性脂質が開発されている。一方で、イオン性脂質からなる脂質ナノ粒子が、核酸送達キャリアとして生体内でより実用的な効果を発揮するためには、標的とする臓器や細胞への指向性が求められている。
　非特許文献３では、臓器指向性を持たせるためのリガンドとしてＲＧＤペプチドで修飾した脂質ナノ粒子が示されている。該文献では予めＰＥＧ脂質とＲＧＤペプチドを結合させてＲＧＤ－ＰＥＧ脂質を合成し、その他の成分からなる脂質ナノ粒子を製造し、得られた脂質ナノ粒子とＲＧＤ－ＰＥＧ脂質とをインキュベーションすることでＲＧＤペプチドで修飾した脂質ナノ粒子を製造し、これを静注することで腫瘍への核酸送達効率が高まることが示されている。
　上述のように、細胞内動態を改善した脂質ナノ粒子、臓器指向性を持たせた脂質ナノ粒子は複数知られている。しかしながら、臓器指向性を持たせた脂質ナノ粒子を実用化するためには、標的細胞における核酸導入効率のさらなる改善が求められている。また脂質ナノ粒子へのリガンド修飾方法についても効率や簡便性の観点でさらなる改善が必要である。
US 2014/0335157 A1 WO 2019/188867 A1
Biomaterials 29 (24-25): 3477-96, 2008 Journal of Pharmaceutical Sciences 106 (2017) 2420-2427 Journal of Controlled Release 173 (2014) 110-118
　本発明の課題は、従来技術では達成し得なかった細胞指向性を有する脂質ナノ粒子を提供すること、該脂質ナノ粒子の製造方法を提供すること、該脂質ナノ粒子を含む核酸導入剤を提供すること、および該核酸導入剤を用いて特定の細胞に核酸を導入する方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、エンドソーム脱出に適したｐＫａを有し、かつ細胞内の還元的環境で特異的に分解するイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に、細胞指向性を有するリガンドを付与することで目的の細胞に効率よく核酸を送達できることを見出した。さらに脂質ナノ粒子へのリガンド修飾方法に関して、反応性官能基を有するＰＥＧ脂質を含む脂質ナノ粒子を製造後に、該脂質ナノ粒子とリガンドとを反応させることで、該脂質ナノ粒子表面に効率よくリガンドを結合できることを見出した。
　本発明者らは、この細胞指向性を有するリガンドで修飾した脂質ナノ粒子は、目的とする細胞に効率よく取り込まれた後、エンドソーム内環境において高い膜融合能を有し、エンドソーム脱出効率が高く、核酸を効率良く標的とする細胞の細胞質内へ送達できるというイオン性脂質の特性を保持していることを確認し、本発明を完成させるに至った。この知見に基づく本発明は、以下の通りである。
　［１］　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、並びに
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
で表されるイオン性脂質、および
　活性化ＰＥＧ脂質に結合した細胞指向性を有するリガンド
を含む脂質ナノ粒子。
　［２］　活性化ＰＥＧ脂質が式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式（２）中、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、炭素数１４～１８の炭化水素鎖を示し、
　Ｘは式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される基、または単結合を示し、
　Ｘが式（３）で表される基である場合、Ｙは単結合を示し、
　Ｘが単結合である場合、Ｙは酸素原子を示し、並びに
　ｎは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎの分子量が１０００～５０００を満たす整数を示す。）
で表される、前記［１］記載の脂質ナノ粒子。
　［３］　前記式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが単結合であり、並びにＹは酸素原子である、前記［２］に記載の脂質ナノ粒子。
　［４］　リガンドが標的細胞の表面上に発現する分子に対して特異的親和性を有するペプチドまたは抗体である、前記［１］～［３］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
　［５］　リガンドが抗ＣＤ３抗体である、前記［４］に記載の脂質ナノ粒子。
　［６］　リガンドが抗ＣＤ１９抗体である、前記［４］に記載の脂質ナノ粒子。
　［７］　リガンドがＴ細胞への指向性を有する、前記［１］～［５］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
　［８］　リガンドがＢ細胞への指向性を有する、前記［１］～［４］および［６］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
　［９］　式（１）で表されるイオン性脂質が、表１－１に記載のＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２である前記［１］～［８］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
　［１０］　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、並びに
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
で表されるイオン性脂質、および活性化ＰＥＧ脂質を含む脂質原料から脂質ナノ粒子を製造し、
　得られた脂質ナノ粒子に、細胞指向性を有するリガンドを結合させることを含む、
該リガンドで修飾された脂質ナノ粒子の製造方法。
　［１１］　活性化ＰＥＧ脂質が式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式（２）中、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、炭素数１４～１８の炭化水素鎖を示し、
　Ｘは式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
で表される基、または単結合を示し、
　Ｘが式（３）で表される基である場合、Ｙは単結合を示し、
　Ｘが単結合である場合、Ｙは酸素原子を示し、並びに
　ｎは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎの分子量が１０００～５０００を満たす整数を示す。）
で表される、前記［１０］に記載の方法。
　［１２］　前記式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが単結合であり、並びにＹは酸素原子である、前記［１１］に記載の方法。
　［１３］　式（１）で表されるイオン性脂質が、表１－１に記載のＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２である前記［１０］～［１２］のいずれか一つに記載の方法。
　［１４］　前記［１］～［９］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子を含む核酸導入剤。
　［１５］　生体外において、核酸を内封した前記［１４］に記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、該核酸を該細胞内に導入する方法。
　［１６］　細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、前記［１５］に記載の方法。
　［１７］　核酸を内封した前記［１４］に記載の核酸導入剤を、標的細胞に送達されるように、生体へ投与することを含む、該核酸を該細胞内へ導入する方法。
　［１８］　標的細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、前記［１７］に記載の方法。
　本発明は、３級アミノ基、脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有するイオン性脂質、および細胞指向性を有するリガンドを含む脂質ナノ粒子に関するものである。本発明の脂質ナノ粒子は、任意の核酸を内封することができ、また該脂質ナノ粒子は、核酸導入剤として使用することができる。本発明の脂質ナノ粒子は、リガンドが標的細胞に認識され、効率よく細胞内に取り込まれるとともに、細胞内ではイオン性脂質に含まれるジスルフィド結合が切断されることで、内包物（核酸）の放出が促進される。そのため、本発明の核酸導入剤（脂質ナノ粒子）は、標的細胞の細胞質内への高い核酸送達効率を達成することができる。
抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓細胞において、該ＬＮＰがＴ細胞選択的に取り込まれることを示す図である。 抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓Ｔ細胞に該ＬＮＰが効率よく取り込まれることを示す図である。 抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓Ｔ細胞において、導入されたｍＲＮＡが効率よく発現していることを示す図である。 種々の活性化ＰＥＧ脂質を含むｍＲＮＡ封入リガンド修飾ＬＮＰの脾臓Ｔ細胞への取り込み効率を示す図である。 種々の活性化ＰＥＧ脂質を含むｍＲＮＡ封入リガンド修飾ＬＮＰの末梢血Ｔ細胞への取り込み効率を示す図である。 抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓Ｔ細胞における導入されたｍＲＮＡの発現効率に及ぼす活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ及びＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の効果を示す図である。 抗ＣＤ１９抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓Ｂ細胞への該ＬＮＰの取り込みに及ぼす活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の濃度の効果を示す図面である。 抗ＣＤ１９抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの末梢血Ｂ細胞への該ＬＮＰの取り込みに及ぼす活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の濃度の効果を示す図である。 抗ＣＤ１９抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの脾臓Ｂ細胞への該ＬＮＰの取り込みに及ぼす活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の濃度の効果を示す図面である。 抗ＣＤ１９抗体フラグメントで修飾したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをインビボ投与されたマウスの末梢血Ｂ細胞への該ＬＮＰの取り込みに及ぼす活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の濃度の効果を示す図である。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
脂質ナノ粒子
　本発明は、式（１）で表されるイオン性脂質（即ち、３級アミノ基、脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有するイオン性脂質）を含み、さらに細胞指向性を有するリガンドで修飾された脂質ナノ粒子に関するものである。ここで「細胞指向性を有するリガンドで修飾された」とは、該リガンドが標的細胞上に発現する親和性を有する分子と相互作用して標的細胞に送達されるように、脂質ナノ粒子の表面上に提示されていることを意味する。本発明の脂質ナノ粒子において、該リガンドは、後述する活性化ＰＥＧ脂質と結合（好ましくは共有結合）している。
　本明細書中、「脂質ナノ粒子」（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ、本明細書中「ＬＮＰ」と略称することがある）とは、両親媒性脂質の親水性基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味する。「両親媒性脂質」とは、親水性基および疎水性基の両方を有する脂質を意味する。
　本発明の脂質ナノ粒子の粒子径は、１μｍ未満であれば特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の粒子径は、脂質ナノ粒子の製造方法により、適宜調整することができる。本明細書中、「粒子径」とは、動的光散乱法により測定した平均粒子径（個数平均）を意味する。
　両親媒性脂質としては、例えば、イオン性脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質等を挙げることができる。本明細書中、「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを意味し、「ＰＥＧ脂質」とは、ＰＥＧで修飾した脂質を意味し、「Ｘで修飾したＹ」（例えば、Ｘ：ＰＥＧ、Ｙ：脂質）とは、Ｘが結合したＹを意味する。また、本明細書中、「数平均分子量が２，０００であるＰＥＧ」を「ＰＥＧ２ｋ」と記載することがある。
　本発明の脂質ナノ粒子は、構成成分として、式（１）で表されるイオン性脂質に加えて、ステロール、ＰＥＧ脂質およびリン脂質からなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでいてもよい。
イオン性脂質
　本発明で使用するイオン性脂質は、下記式（１）で表されるイオン性脂質（本明細書中「イオン性脂質（１）」と略称することがある）である。イオン性脂質（１）は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、並びに
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～２である。炭素数１～６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基であり、最も好ましくはそれぞれエチレン基である。
　Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基中の炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基の好ましい具体的な構造は、Ｘ１で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　Ｘ１のＲ５は炭素数１～６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基中の炭素数は、好ましくは４～５である。炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基としては、具体的にはアジリジレン基、アゼチジレン基、ピロリジレン基、ピペリジレン基、イミダゾリジレン基、ピペラジレン基であり、好ましくはピロリジレン基、ピペリジレン基、ピペラジレン基であり、最も好ましくはピペリジレン基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ２で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　Ｘ２のｐは１または２である。ｐが１のときＸ２はピロリジレン基であり、ｐが２のときＸ２はピペリジレン基である。好ましくはｐは２である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が２の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ３で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Ｘ３のｗは１または２である。ｗが１のときＸ３はイミダゾリジレン基であり、ｗが２のときＸ３はピペラジレン基である。
　ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基である。
　炭素数８以下のアルキレン基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基に含まれる炭素数は、好ましくは６以下であり、最も好ましくは４以下である。炭素数８以下のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができ、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
　本明細書中、「炭素数８以下のオキシジアルキレン基」とは、エーテル結合を介したアルキレン基（アルキレン－Ｏ－アルキレン、言い換えると「アルキレンオキシアルキレン基」）であって、二つ存在するアルキレン基の炭素数の合計が８以下の基を意味する。ここで、二つ存在するアルキレンは同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。炭素数８以下のオキシジアルキレン基としては、具体的にはオキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基（即ち、トリメチレンオキシトリメチレン基）、オキシジ（テトラメチレン）基（即ち、テトラメチレンオキシテトラメチレン基）等を挙げることができる。好ましくは、オキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基であり、最も好ましくはオキシジエチレン基である。
　Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていても良いが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合またはカーバメート結合であり、より好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合またはアミド結合であり、最も好ましくはそれぞれエステル結合である。ＹａおよびＹｂの結合の向きは制限されないが、ＹａおよびＹｂがエステル結合の場合、好ましくは、－Ｚａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－および－Ｚｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造を呈する。
　ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。該芳香族化合物に含まれる炭素数は好ましくは６～１２であり、最も好ましくは６～７である。また、該芳香族化合物に含まれる芳香環は、好ましくは一つである。
　炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環の種類として、芳香族炭化水素環については、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、芳香族ヘテロ環についてはイミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができ、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環であり、最も好ましくは、ベンゼン環である。
　芳香環は置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のアルキルカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、ウレイド基、炭素数２～４のアルキルウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。
　ＺａおよびＺｂの好ましい具体的な構造としては、Ｚ１が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　式中、ｓは０～３の整数を表し、ｔは０～３の整数を表し、ｕは０～４の整数を表し、ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。
　Ｚ１のｓは、好ましくは０～１の整数であり、より好ましくは０である。
　Ｚ１のｔは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　Ｚ１のｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０～１の整数である。
　Ｚ１のＲ４は、該イオン性脂質の合成過程における反応を阻害しない、炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環（ベンゼン環）の置換基である。該置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のアルキルカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、ウレイド基、炭素数２～４のアルキルウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。Ｒ４が複数個存在する場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよい。
　ＺａはＺｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＺａはＺｂと同一の基である。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくはそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロール等が挙げられ、好ましくはコレステロール、またはコレスタノールである。
　炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良い。該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であっても良い。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合および炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基またはアルケニル基が含まれる。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　本発明の一態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂで表される炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル炭素は式（１）中の－ＣＯ－Ｏ－に含まれる。脂肪族炭化水素基の具体例としては、脂肪酸としてリノール酸を用いた場合ではヘプタデカジエニル基となり、脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合ではヘプタデセニル基となる。
　Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
　本発明の一態様において、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一であり、ＺａはＺｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　イオン性脂質（１）の好適な例としては、以下のイオン性脂質（１－１）ないし（１－３）が挙げられる。
［イオン性脂質（１－１）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－２）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～４のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～３であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数６以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が６～１２であり、一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１９の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－３）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～２のアルキレン基（即ち、メチレン基またはエチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、Ｘ１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｒ５は炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）である。）、またはＸ２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、ｐは１または２である。）
であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数４以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、Ｚ１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、ｓは０～１の整数であり、ｔは０～２の整数であり、ｕは０～２の整数（好ましくは０）であり、ｕ個のＲ４は、それぞれ独立して置換基を表す。）
であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１７の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
　イオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍを挙げることができる。イオン性脂質（１）の具体例の中でも、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　本発明の脂質ナノ粒子中のイオン性脂質（１）の量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは１０～９０ｍｏｌ％、より好ましくは２０～８０ｍｏｌ％、さらに好ましくは３０～７０ｍｏｌ％である。ここで、「脂質ナノ粒子中の脂質の総量」とは、例えば、脂質ナノ粒子が、イオン性脂質（１）に加えて、後述するリン脂質、ステロール、ＰＥＧ脂質（活性化ＰＥＧ脂質および非活性化ＰＥＧ脂質を含む）を構成成分として含有する場合、「イオン性脂質（１）、後述するリン脂質、ステロールおよびＰＥＧ脂質の合計量」を意味する。また、本明細書中、「Ａに対するＢの量（ｍｏｌ％）」とは、「１００×Ｂの量（ｍｏｌ）／Ａの量（ｍｏｌ）」を意味する。例えば「脂質の総量に対するイオン性脂質（１）の量（ｍｏｌ％）」とは、「１００×イオン性脂質（１）の量（ｍｏｌ）／脂質の総量（ｍｏｌ）」を意味する。
　イオン性脂質（１）は、公知の方法（例えば、ＷＯ　２０１９／１８８８６７　Ａ１に記載の方法）によって製造することができる。
リン脂質
　リン脂質は、本発明の脂質ナノ粒子の構成成分として用いることができる。リン脂質は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　リン脂質の例としては、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＳ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＧ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＡ）、これらのリゾ体等が挙げられる。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬｏＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）
が挙げられる。これらの１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンの３位のホスホコリンを、それぞれホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホグリセロール、ホスファチジン酸で置換した１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＳ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＧ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＡ）を用いることもできる。
　リン脂質は、好ましくはＰＣおよび／またはＰＥであり、より好ましくはＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、およびＰＯＰＥ１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）からなる群から選ばれる少なくとも一つである。
　リン脂質を使用する場合、本発明の脂質ナノ粒子中のその量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは１～５０ｍｏｌ％、より好ましくは１～３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１～１０ｍｏｌ％である。
ステロール
　ステロールは、本発明の脂質ナノ粒子の構成成分として（特に、脂質膜の流動性を調節する成分として）用いることができる。ステロールは、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　ステロールの例としては、コレステロール、ラノステロール、フィトステロール、ジモステロール、ジモステノール、デスモステロール、スティグマスタノール、ジヒドロラノステロール、および７－デヒドロコレステロールが挙げられる。ステロールは、好ましくはコレステロール、ラノステロールおよびフィトステロールからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはコレステロールである。
　ステロールを使用する場合、本発明の脂質ナノ粒子中のその量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは１～７０ｍｏｌ％、より好ましくは１０～６０ｍｏｌ％、さらに好ましくは３０～５０ｍｏｌ％である。
ＰＥＧ脂質
　ＰＥＧ脂質は、例えば、脂質ナノ粒子の表面を親水性のＰＥＧで被覆して脂質ナノ粒子同士の凝集を抑制するため、脂質ナノ粒子を生体に投与した際に、生体成分と該粒子の相互作用を抑制するために用いることができる。ＰＥＧ脂質は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　本発明で使用するＰＥＧ脂質のＰＥＧ部分の分子量に特に限定はない。ＰＥＧ脂質のＰＥＧ部分の数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、２００～１０，０００である。この数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析した値であり、様々な既知分子量のポリエチレングリコールを用いて作成した検量線をベースに算出される値である（以下、特にことわらない限り、また矛盾しない限り、ＰＥＧに関して「分子量」という場合には、数平均分子量を意味する）。ＰＥＧ脂質のＰＥＧ部分は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
　ＰＥＧ脂質の例としては、ＰＥＧが結合したリン脂質（ＰＥＧ－リン脂質）、ＰＥＧが結合したセラミド（ＰＥＧ－セラミド）、ＰＥＧが結合したジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ジアシルグリセロール）、ＰＥＧが結合したコレステロール（ＰＥＧ－コレステロール）が挙げられる。ＰＥＧ脂質は、好ましくは数平均分子量が１，０００～１０，０００であるＰＥＧが結合したジアシルグリセロールであり、より好ましくは数平均分子量が１，０００～１０，０００であるＰＥＧが結合したジミリストイルグリセロールおよび数平均分子量が１，０００～１０，０００であるＰＥＧが結合したジステアロイルグリセロールからなる群から選ばれる少なくとも一つである。
活性化ＰＥＧ脂質
　本発明の脂質ナノ粒子は、活性化ＰＥＧ脂質を含む。本明細書中、「活性化ＰＥＧ脂質」とは、リガンドと結合できる反応性基をＰＥＧ部分の末端に有しているＰＥＧ脂質を意味する。この活性化ＰＥＧ脂質と区別するために、リガンドと結合できる反応性基を有さないＰＥＧ脂質を、本明細書中、「非活性化ＰＥＧ脂質」と記載することがある。活性化ＰＥＧ脂質および非活性化ＰＥＧ脂質は、いずれも、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　本発明の脂質ナノ粒子中の活性化ＰＥＧ脂質の量は核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率、脂質ナノ粒子の安定性およびリガンドの修飾効率の観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは０．１～３０ｍｏｌ％、より好ましくは０．５～２０ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．５～１０ｍｏｌ％である。
　非活性化ＰＥＧ脂質を使用する場合、本発明の脂質ナノ粒子中のその量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは０．１～３０ｍｏｌ％、より好ましくは０．５～２０ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．５～１０ｍｏｌ％である。
　活性化ＰＥＧ脂質の例としては、前記のＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ－リン脂質（好ましくはＰＥＧ－１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ））、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール、ＰＥＧ－コレステロール等）のＰＥＧ末端に、アジド、マレイミド、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド）、ＤＢＣＯ（Ｎ－ジベンゾシクロオクチル）やＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン）が導入されたものが挙げられる。
　好ましい一実施態様において、活性化ＰＥＧ脂質は式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式（２）中、
　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、炭素数１４～１８の炭化水素鎖を示し、
　Ｘは式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
で表される基、または単結合を示し、
　Ｘが式（３）で表される基である場合、Ｙは単結合を示し、
　Ｘが単結合である場合、Ｙは酸素原子を示し、並びに
　ｎは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎの分子量が１０００～５０００を満たす１または２以上の整数を示す。）
で表される化合物（以下、「活性化ＰＥＧ脂質（２）」ともいう）である。
　好ましくは、活性化ＰＥＧ脂質として、式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが単結合であり、Ｙが酸素原子である化合物（ＤＳＧ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ）、または式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが式（３）で表される基であり、Ｙが単結合である化合物（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ）が挙げられる。より好ましくは、ＤＳＧ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯである。
　ＰＥＧの分子量は上記範囲内であれば特に制限はないが、好ましくは２０００（２ｋ）であり得る。従って、特に好ましい実施態様において、活性化ＰＥＧ脂質は、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯまたはＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、より好ましくはＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯであり得る。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯは市販されている。ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯの合成例について述べる。
ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯの合成例
　ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＮＨＳ（日油社製、製品名ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）　ＧＳ－０２０ＴＳ、５３ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチロキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオクサオクタン（７ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。得られた溶液を純水（１０ｍＬ）で２回分液後、飽和食塩水で１回分液した。有機相の溶媒を留去し乾固させた後に、純水に溶解し、分画分子量３．５ｋＤａの透析膜に反応溶液を移し、一晩純粋に対して透析を行った。透析液を凍結乾燥により溶媒を留去し、白色の固体３０ｍｇを得た。
　別の実施態様において、活性化ＰＥＧ脂質は、コレステロール（Ｃｈｏｌ）－ＰＥＧ－ＢＣＮまたはジコレステロール（ＤｉＣｈｏｌ）－ＰＥＧ－ＢＣＮであり得る。ＰＥＧの分子量は１０００～５０００の範囲内であれば特に制限はないが、好ましくは２０００（２ｋ）であり得る。従って、好ましい実施態様において、活性化ＰＥＧ脂質は、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮであり得る。これら２化合物の合成例について述べる。
Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮの合成例
　コレステロール　クロロホルマート（１８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、ＰＥＧ－ジアミン（ＰＥＧの数平均分子量：２，０００）（５００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびジアザビシクロウンデセン（１００μＬ）を添加し、一晩撹拌した。得られた溶液を５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で１回、純水（３０ｍＬ）で２回、飽和食塩水（３０ｍＬ）で１回、分液した。得られた溶液を硫酸ナトリウム粉末で乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノールのグラジエント）を用いて有機層を分取した。分取した溶液の溶媒を留去し、白黄色の固体０．５０７ｇを得た。
　得られた固体全量をアルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、炭酸スクシンイミジル（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（７０ｍｇ）、トリエチルアミン（１００μＬ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２５０ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸（１００ｍｇ）、およびジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）を添加し、一晩撹拌する。得られた溶液を５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で１回、純水（３０ｍＬ）で２回、飽和食塩水（３０ｍＬ）で１回分液した。得られた溶液を硫酸ナトリウム粉末で乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチルのグラジエント）を用いて有機層を分取した。分取した溶液の溶媒を留去し、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮ（０．５９６ｇ）を白色固体として得た。
ＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮの合成例
　コレステロール（１．０８ｇ）をアルゴン雰囲気下で無水ピリジン（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液に対し、氷冷下でメタンスルホニルクロリド（０．４１８ｍｇ）を加え、一晩室温で撹拌した。溶媒を留去後、残留物を酢酸エチルに溶解し、５重量％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で１回、純水（３０ｍＬ）で２回、飽和食塩水（３０ｍＬ）で１回分液した。得られた溶液を硫酸ナトリウム粉末で乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチルのグラジエント）を用いて有機層を分取した。分取した溶液の溶媒を留去し、白黄色の固体（０．４３２ｇ）を得た。
　得られた固体全量をアルゴン雰囲気下で無水テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）に溶解し、Ｎ－(ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル)－セリン（０．６１０ｇ）と水酸化カリウム（１６０ｍｇ）を加え、一晩撹拌した。得られた溶液を硫酸ナトリウム粉末で乾燥後、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチルのグラジエント）を用いて分取した。分取した溶液の溶媒を留去し、白色固体（０．２３１ｇ）を得た。
　得られた固体全量をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解後、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加え、２時間撹拌した。溶媒を留去後、残留物をアルゴン雰囲気下で無水ピリジン（３０ｍＬ）に溶解し、コレステロール　クロロホルマート（０．４１０ｇ）を混合し、一晩撹拌した。析出した固体を濾取し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄および乾燥して、白色固体（０．１８８ｇ）を得た。
　この固体を無水クロロホルム（１０ｍＬ）に溶解し、ＰＥＧ－ジアミン（ＰＥＧの数平均分子量：２，０００）（２５０ｍｇ）、トリエチルアミン（１００μＬ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１５０ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸（７５ｍｇ）、ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）を添加し、一晩撹拌した。析出した固体を濾取し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄し、白色固体（０．１２０ｇ）を得た。
　得られた固体全量をアルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、炭酸スクシンイミジル（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（２０ｍｇ）、トリエチルアミン（５０μＬ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（１００ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸（３０ｍｇ）、およびジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）を添加し、一晩撹拌した。析出した固体を濾取し、テトラヒドロフラン３０ｍＬで洗浄することによって、ＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮ（０．０５８ｇ）を白色固体として得た。
細胞指向性を有するリガンド
　本発明の脂質ナノ粒子は、細胞指向性を有するリガンドで修飾されていることを特徴とする。ここで「細胞指向性」とは、１種または２種以上の特定の細胞（該細胞を含む組織・臓器を含む）に対して、それ以外の細胞種よりも親和性が高いことを意味し、その結果として、脂質ナノ粒子を特定の細胞により選択的に送達させることができる。
　該リガンドは、脂質ナノ粒子を送達させるべき標的細胞（例えば、脂質ナノ粒子に内包される薬物（好ましくは、核酸）が細胞内に導入されることにより、疾患に対する治療効果が奏される細胞（例、がん細胞等））の表面上に発現する分子に対して特異的親和性を有する物質である限り、特に制限されない。例えば、ペプチド（タンパク質を含む）、抗体、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）、アプタマー、糖、脂質等が挙げられるが、好ましい例としては、ペプチド、抗体等が挙げられる。
　細胞指向性を有するペプチドの例として、血管系や一部のがん細胞で高発現するインテグリンαｖβ３に親和性を有するＲＧＤモチーフを含むペプチド（例、ＧＲＧＤＳペンタペプチド）、筋細胞に高発現するジストログリカンに親和性を有するラミニンα２鎖由来ペプチド等が挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは、サイトカインやホルモン等の細胞表面受容体に対する天然のリガンドであるポリペプチドを挙げることもできる。
　細胞指向性を有する抗体としては、標的細胞の表面に発現する分子に対する任意の抗体が挙げられ、例えば、Ｔ細胞で発現するＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）又はＣＤ８（キラーＴ細胞）に対する抗体、Ｂ細胞で発現するＣＤ１９に対する抗体等を挙げることができるが、それらに限定されない。あるいは、既存の抗体医薬として使用される抗体またはそれらと同じ抗原を認識する抗体を、該抗原を発現する標的細胞に標的化するためのリガンドとして使用できる。
　本発明で使用される抗体は完全抗体分子であってもよいが、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、還元抗体（ｒＩｇＧ）、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ等の他の任意の抗体フラグメントが、好ましく使用され得る。本明細書では、特に断らない限り、「抗体」とは、抗体フラグメントを包含する意味で用いられる。
　その他、核酸としては、例えば、二本鎖ＲＮＡやＣｐＧオリゴヌクレオチド等のＴｏｌｌ様受容体に対するリガンド等を、糖としては、例えば、肝細胞で発現するアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有するＮ－アセチルガラクトサミン等を、脂質としては、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体の天然リガンドである各種脂質（例、リゾホスファチジルセリン）等を挙げることができる。
　リガンドの量は、標的細胞への選択性と好ましい粒子物性を両立させる観点から、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは０．０１～３０ｍｏｌ％、より好ましくは０．０１～１０ｍｏｌ％、さらに好ましくは０．０１～５ｍｏｌ％である。
脂質ナノ粒子の製造方法
　本発明の脂質ナノ粒子（即ち、細胞指向性を有するリガンドで修飾された脂質ナノ粒子）は、例えば、
　イオン性脂質（１）および活性化ＰＥＧ脂質（好ましくは活性化ＰＥＧ脂質（２））を含む脂質原料から脂質ナノ粒子（以下「本発明の前駆体」と記載することがある）を製造し、
　得られた脂質ナノ粒子に、細胞指向性を有するリガンドを結合させること
によって製造することができる。
　本発明の前駆体（即ち、細胞指向性を有するリガンドを含まない脂質ナノ粒子）は、イオン性脂質（１）および活性化ＰＥＧ脂質（好ましくは活性化ＰＥＧ脂質（２））を含む脂質原料を適当な分散媒（例えば水性分散媒、アルコール性分散媒）中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより製造することができる。
　本発明の前駆体を製造するための「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路またはボルテックスを用いたエタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられ、好ましくはマイクロ流路またはボルテックスを用いたエタノール希釈法であり、さらに好ましくはマイクロ流路を用いたエタノール希釈法である。マイクロ流路を用いたエタノール希釈法では、例えばＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、核酸を含む酸性緩衝液と、脂質のエタノール溶液とを混合することによって脂質ナノ粒子を含む分散液を製造することができる。この方法で製造した分散液は、脂質ナノ粒子と、分散媒（酸性緩衝液およびエタノール）とを含むが、限外ろ過、透析、希釈等の操作によって分散媒（特にエタノール）の除去、分散媒（特に緩衝液）の交換等を行うことができる。
　得られた本発明の前駆体に、細胞指向性を有するリガンドを結合させることによって本発明の脂質ナノ粒子を製造することができる。この結合は、本発明の前駆体を含む分散液中に、細胞指向性リガンドを添加することによって行うことができる。分散液中の前駆体の総脂質の濃度は、好ましくは１～１００ｍＭ、より好ましくは１～５０ｍＭ、さらに好ましくは１～３０ｍＭである。
　リガンドの使用割合は、本発明の前駆体中の活性化ＰＥＧ脂質（好ましくは活性化ＰＥＧ脂質（２））１ｍｏｌに対して、好ましくは１～１００ｍｏｌ、より好ましくは１～５０ｍｏｌ、さらに好ましくは１～１０ｍｏｌである。この結合のための反応温度は、好ましくは０～６０℃、より好ましくは０～４０℃、さらに好ましくは０～２０℃であり、その反応時間は、好ましくは１～７２時間、より好ましくは１～４８時間、さらに好ましくは１～２４時間である。
核酸導入剤および核酸を細胞内に導入する方法
　本発明の脂質ナノ粒子に核酸を内封させ、これを細胞へ接触させることにより、生体内および／または生体外において該核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は、本発明の脂質ナノ粒子を含む核酸導入剤、およびこれを用いる核酸を細胞内に導入する方法も提供する。
　本発明の核酸導入剤は、任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖または２本鎖である。核酸は、例えば、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドを有するヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、または特殊な結合を有するオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を有するヌクレオチドを含有する）等であってもよい。
　さらに核酸は、例えば、公知の修飾が付加された核酸、該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、ヌクレオチドが修飾された核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を有する核酸、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有する核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を含有する核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を有する金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を有する核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
　本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＤＮＡとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
　本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、例えば疾患の予防および／または治療を目的として、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／または治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療薬や、ＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬品などに有用である。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。核酸を内封した脂質ナノ粒子の粒子径は、その製造方法により、適宜調整することができる。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の表面電位（ゼータ電位）は、特に制限は無いが、好ましくは－１５～＋１５ｍＶ、さらに好ましくは－１０～＋１０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用である。しかし、正の表面電位によって、（ａ）細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制、（ｂ）ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質合成の抑制が、生じる可能性がある。表面電位（ゼータ電位）を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。表面電位（ゼータ電位）の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の表面電位（ゼータ電位）は、脂質ナノ粒子の構成成分の組成により、調整することができる。
　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において核酸を内封した本発明の核酸導入剤（脂質ナノ粒子）と細胞とを接触させる方法を、以下、具体的に説明する。
　細胞は、核酸を内封した本発明の核酸導入剤との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。本発明の核酸導入剤との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞との接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよい。培地中の血清濃度は３０重量％以下であることが好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、本発明の核酸導入剤と細胞との接触が阻害される可能性がある。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤と細胞との接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４～１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
　細胞に、例えば、核酸を内封した本発明の核酸導入剤の分散液を添加する。該分散液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の、本発明の核酸導入剤に含まれる脂質ナノ粒子の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特には限定されないが、分散液中の脂質濃度は、通常１～１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０～５０ｎｍｏｌ／ｍＬであり、分散液中の核酸の濃度は、通常０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１～１０μｇ／ｍＬである。
　上述の分散液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、相対湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５体積％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１～７６時間の範囲であり、好ましくは０．２～２４時間の範囲であり、より好ましくは０．５～１２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
　上述の培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、または培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清または栄養因子を含むことが好ましい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤を用いることで、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、核酸を内封した本発明の核酸導入剤を対象へ投与することにより、本発明の核酸導入剤が標的細胞へ到達および接触し、生体内で本発明の核酸導入剤に内封された核酸が細胞内へ導入される。核酸を内封した本発明の核酸導入剤を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。核酸を内封した本発明の核酸導入剤の投与対象は、好ましくはヒトまたは他の哺乳類である。
　標的細胞の種類は特に限定されず、核酸を内封した本発明の核酸導入剤を用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組組織、リンパ節、腫瘍等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ本発明の核酸導入剤が到達および接触し、発明の核酸導入剤に内封された核酸を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入する核酸の種類、標的細胞の種類および部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。本発明の核酸導入剤の投与量は、核酸の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入する核酸の種類、標的細胞の種類および部位等を考慮して適宜選択することができる。なお、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸以外の化合物を細胞に導入するためにも用いることができる。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、常套手段に従って製剤化することができる。
　本発明の核酸導入剤が研究用試薬として提供される場合、本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質ナノ粒子と、水または生理学的に許容し得る他の分散媒（例えば、水溶性分散媒（例えば、リンゴ酸緩衝液、等）、有機分散媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）、水溶性分散媒と有機分散媒との混合分散媒等）との無菌性の分散液として提供されてもよく、分散媒を含まない核酸導入剤として提供されてもよい。本発明の核酸導入剤は、適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことができる。
　本発明の核酸導入剤が医薬として提供される場合、本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質ナノ粒子と、医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とを混合することによって得られる経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）または非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として提供されてもよく、公知の添加剤を含まない核酸導入剤として提供されてもよい。医薬としての本発明の核酸導入剤は、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）である。また、本発明の核酸導入剤は、成人用または小児用の製剤のいずれでもよい。
　以下、実施例等を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例等に何ら限定されない。
　以下の実施例等では、イオン性脂質（１）を、上述の表に記載の名称で示した。また、以下の実施例等において使用する略号の意味は、それぞれ以下の通りである。
Ａｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ：１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカン酸　Ｎ－スクシンイミジル
Ｃｈｏｌ：コレステロール
Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮ：コレステリルカルバモイル、１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００）、
Ｃｙ５－Ａｌｋｙｎｅ：３，３－ジメチル，ｌ－１－［６－オキソ－６－（プロプ－２－イルアミノ）ヘキシル］－２－［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－５－（１，３，３－トリメチリンドリン－２－イリデン）ペンタ－１，３－ジエニル］－３Ｈ－インドリウムクロリド
ＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮ：Ｎ－（２－ポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００））－３，５－ビス（コレステリルアミノ）ペンタナミド
ＤｉＤ：１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン　過塩素酸塩
ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ：１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００）
ＤＯＰＣ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ：１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロール，ジベンゾシクロオクチントキシポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００），Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチロキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオクサオクタン
ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ：１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロフォスフォエタノールアミン，ジベンゾシクロオクチントキシポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００），Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチロキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオクサオクタン
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＭＥＳ：２－モルホリノエタンスルホン酸
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
［参考例１］ＣＤ３－ＩｇＧのフラグメント化および反応基質の導入
１．抗体のフラグメント化および精製
　抗ＣＤ３ ＩｇＧ抗体（ＣＤ３－ＩｇＧ、入手元：ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製）をｚｅｂａ－ｓｐｉｎ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩、および酢酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ，ｐＨ４．５）への置換を行った。置換後のＣＤ３－ＩｇＧをＣＤ３－ＩｇＧ：ペプシン＝１０ｍｇ：０．１２５ｍｇの比で３７℃、３日間撹拌し、フラグメント化を行った。フラグメント溶液をエンプティカラムに通すことで、ペプシンとの分離を行った。精製とバッファー置換を目的とし、カラムに通したフラグメント溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ１５（ＭＷＣＯ：５０ｋＤａ）へ移し、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１４ｍＬまでメスアップし、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、５００μＬまで濃縮した。最後に、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１ｍＬになるようメスアップした。
２．反応基質の導入
　フラグメント溶液をＮａｎｏｄｒｏｐ　ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することで、タンパク質濃度およびタンパク質量を算出した。フラグメント溶液に対し４等量のＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳを加え、室温２時間、４℃一晩振とうし、反応基質の導入を行った。反応基質導入後のフラグメント溶液をｚｅｂａ－ｓｐｉｎ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　ｃｏｌｕｍｎを用いて未反応試薬の除去および超純水へ置換を行った。
３．反応基質導入の確認
　遮光エッペンドルフチューブに基質導入後のフラグメント溶液を１００μｇ相当量取り、さらにアスコルビン酸（２０ｍＭ）を１０μＬ、硫酸銅水溶液（２０ｍＭ）を１０μＬ、Ｃｙ５－Ａｌｋｙｎｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ、最後に超純水を用いて１００μＬになるようにメスアップし、室温で２時間反応させた。反応後、分画分子量３．５ｋＤａの透析膜に反応溶液を移し、一晩透析を行った。透析後、タンパク質量はＢＣＡ法、Ｃｙ５修飾量は蛍光を元に、それぞれ算出した。Ｃｙ５修飾量をタンパク質量で除することで、反応基質の導入数とした。
［実施例１］リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
１．マイクロ流路によるｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
（１）脂質のエタノール溶液の製造
　脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに１０ｍＭのＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量８００ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、１ｍＭ ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ エタノール溶液を総脂質量の１．５％相当量添加し、活性化ＰＥＧ脂質をさらに総脂質量の１％相当量添加し、全量が３６０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の製造
　核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６－０．８μｇ／μＬ）を６．６μｇとなるようにはかり取り、全量が９９０μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
（３）マイクロ流路を用いたｍＲＮＡ封入ＬＮＰ製造
　核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（ネッパジーン社製）を用いて、核酸溶液を３ｍＬ／分、脂質溶液を１ｍＬ／分の流速にてＬＮＰ製造を行い、０．８ｍＬを１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへ２０ｍＭ ＭＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整）を３２００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ４．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し約２５０μＬまで限外濾過し濃縮した。最後に、酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ４．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を用いて目的の脂質濃度になるようメスアップして、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液を製造した。
２．ＬＮＰへのリガンドの修飾
　製造したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液に、活性化ＰＥＧ脂質と等モルのリガンドを添加し、酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ４．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を用いて７５０μＬまでメスアップし、４℃にて一晩反応させた。その後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約２５０μＬまで限外濾過し濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップして、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ分散液を製造した。
［実施例２］Ｔ細胞指向性リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
　ｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ社製）を１ｍｏｌ％、および取込みの指標としてＤｉＤを０．５ｍｏｌ％使用）を、［実施例１］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ３－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を用いて［実施例１］の方法でＬＮＰの修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。
［試験例１］インビボにおける脾臓Ｔ細胞のＬＮＰ取込み能評価（ＦＡＣＳ解析）
　実施例２で製造したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で２．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０２５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウスから脾臓を採取し、ＲＰＭＩ－１６４０（１％ＦＢＳを含む）を３ｍＬ入れたシャーレに回収した。ピンセットを用いて脾臓細胞を濾しだし、５ｍＬシリンジで懸濁した。７０μｍセルストレーナーを介して、全量を１５ｍＬ遠沈管に移した。遠心（４℃，５００ｇ，５分）を行った後、上清を除去し、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を加えて懸濁し、室温にて５分静置して溶血処理を行った。その後、ＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）を用いて５倍希釈し、遠心（４℃，５００ｇ，５分）を行った後、上清を除去した。ＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）５ｍＬを用いて２回洗浄し、細胞計数（ＬＵＮＡ）を行い、１×１０６細胞を分注し、Ｆｃブロッキングをした。Ｆｃブロッキングは、ＣＤ１６／３２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（入手元：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）をメーカー推奨量添加し、氷上で１０分以上インキュベートした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε、ＰＥ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４およびＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ８α（入手元：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（入手元：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー（２００μＬ）に再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、各サブセットについてＤｉＤ蛍光を解析した。
　結果を図１に示す。なお、図１中の「未修飾」または「抗体修飾」は、それぞれ、未修飾ＬＮＰまたは抗体修飾ＬＮＰを使用した結果を示し、図１中の「ＰＢＳ」は、未修飾ＬＮＰまたは抗体修飾ＬＮＰを使用しなかった結果を示す。ＬＮＰを抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾することにより、Ｔ細胞への選択的な取り込みが認められた。
［試験例２］インビボにおけるＬＮＰ取込み能評価（顕微鏡観察）
１．ＬＮＰ投与と脾臓Ｔ細胞の単離
　実施例２に記載の方法で製造したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で２．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０２５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例１］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。３×１０６細胞を分注し、Ｆｃブロッキングをした。Ｆｃブロッキングは、ＣＤ１６／３２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で１０分以上インキュベートした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー（５００μＬ）に再懸濁し、ＢＤ　ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙＴＭ　セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて２×１０５細胞のＴ細胞の単離を行った。
２．封入と顕微鏡観察
　単離を行ったＴ細胞を、遠心（４℃，５００ｇ，５分）を行った後、上清を除去することで、濃縮をおこなった。ＰｒｏＬｏｎｇ　Ｄｉａｍｏｎｄ　褪色防止用封入剤１０μＬと濃縮後のＴ細胞１０μＬを混合し、ガラスプレートへ１０μＬ滴下し、カバーガラスをかけ、封入した。４℃で一晩静置後、ＬＳＭ７８０共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）にて、ＤｉＤの蛍光を観察した。
　結果を図２に示す。なお、図２中の「未修飾（ＬＮＰ）」または「抗体修飾（ＬＮＰ）」は、それぞれ、未修飾ＬＮＰまたは抗体修飾ＬＮＰを使用した結果を示す。顕微鏡観察でも、抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾することによりＬＮＰのＴ細胞への取り込みが有意に上昇していることが確認された。
［試験例３］インビボにおけるＬＮＰ取込み能評価（リポーター遺伝子発現）
１．ＬＮＰの製造
　Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを１ｍｏｌ％使用）を、［実施例２］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ３－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を用いて［実施例２］の方法でＬＮＰの修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。
２．インビボにおける脾臓Ｔ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　上記１．で製造したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＡｉ１４マウス（ＲＯＳＡ２６遺伝子座にｌｏｘＰ－終止コドン－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子が組み込まれており、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で終止コドンが切り出され、ｔｄＴｏｍａｔｏリポーターを発現する；Ｔｈｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社より購入）に体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ／ｋｇ）。投与後３日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例１］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。２×１０６細胞を分注し、Ｆｃブロッキングをした。Ｆｃブロッキングは、ＣＤ１６／３２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で１０分以上インキュベートした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上述）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー（４００μＬ）に再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、Ｔ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ１９－）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現を解析した。
　結果を図３に示す。なお、図３中の「ＰＢＳ」は、未修飾ＬＮＰまたは抗体修飾ＬＮＰを使用しなかった結果を示す。抗ＣＤ３抗体フラグメントで修飾したＬＮＰでは、未修飾ＬＮＰと比較してｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞数が増加しており、抗体修飾ＬＮＰによりＴ細胞へのｍＲＮＡ送達効率が向上することが明らかとなった。
［実施例３］新規活性化ＰＥＧ脂質を用いたｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
（１）脂質のエタノール溶液の製造
　脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに１０ｍＭのＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを、総脂質量が８００ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、１ｍＭ ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋエタノール溶液を脂質の総量に対して１．５ｍｏｌ％相当量で添加し、さらに活性化ＰＥＧ脂質を脂質の総量の１ｍｏｌ％相当量で添加し、全量が３６０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。なお、活性化ＰＥＧ脂質として、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮを使用した。これらのうち、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮは、［発明を実施するための形態］に記載の合成例と同様にして合成したものを使用した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の製造
　核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６－０．８μｇ／μＬ）を６．６μｇとなるようにはかり取り、全量が９９０μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰ製造
　核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置を用いて、核酸溶液を３ｍＬ／分、脂質溶液を１ｍＬ／分の流速にてＬＮＰ製造を行い、０．８ｍＬを１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへ２０ｍＭ　ＭＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整）を３２００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５分）を繰り返し約２５０μＬまで限外濾過し濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップして、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを製造した。
［試験例４］ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径および表面電位の測定
　実施例３で製造したｍＲＮＡ封入ＬＮＰの平均粒子径（個数基準）およびゼータ電位は、動的光散乱法により測定した。得られたＬＮＰの平均粒子径、多分散度指数（Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ、以下「ＰｄＩ」と記載する）、ゼータ電位、粒子作製時に使用したｍＲＮＡに対する、作製後の溶液に含まれるｍＲＮＡの割合（以下「回収率」と記載する）、および粒子作製後の溶液中の全ｍＲＮＡに対する粒子に搭載されたｍＲＮＡの割合（以下「封入率」と記載する）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
［試験例５］インビボにおけるＬＮＰ取込み能評価（ＦＡＣＳ解析）
１．リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
　ｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、活性化ＰＥＧ脂質を１ｍｏｌ％、取込みの指標としてＤｉＤを０．５ｍｏｌ％使用）を、［実施例２］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ３－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を用いて［実施例２］の方法でＬＮＰの修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。なお、活性化ＰＥＧ脂質として、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮを使用した。
２．インビボにおける脾臓Ｔ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　上記１．で製造した各リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で２．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０２５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例１］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。１×１０６細胞を［試験例１］の方法でＦｃブロッキング、抗体染色を行い、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、ＤｉＤ蛍光を指標としてＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ１９－）への各種ＬＮＰの取り込みを解析した。
　結果を図４に示す。なお、図４中の「ＤＳＰＥ」、「ＤＳＧ」、「Ｃｈｏｌ」または「ＤｉＣｈｏｌ」は、それぞれ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮを使用した結果を示す。特に、活性化ＰＥＧ脂質としてＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを用いた場合に、Ｔ細胞へのＬＮＰの取り込みが顕著に増加した。
［試験例６］インビボにおける末梢血Ｔ細胞へのＬＮＰ取込み能評価
　試験例５の１．に記載の方法で製造した各リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で２．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０２５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウス尾静脈から２０μＬ採血し、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＬ）を加えて懸濁し、室温にて１０分混合して溶血処理を行った。その後、遠心（４℃，５００ｇ，５分）を行い、上清を除去した。ＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）１ｍＬを用いて再度懸濁し、遠心（４℃，５００ｇ，５分）を行った後、上清を除去した。ＣＤ１６／３２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で１０分以上インキュベートすることで、Ｆｃブロッキングをした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε、ＰＥ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４、およびＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ８α（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上述）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー（２００μＬ）に再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、ＤｉＤ蛍光を指標としてＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ１９－）への各種ＬＮＰの取り込みを解析した。
　結果を図５に示す。なお、図５中の「ＤＳＰＥ」、「ＤＳＧ」、「Ｃｈｏｌ」または「ＤｉＣｈｏｌ」は、それぞれ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮまたはＤｉＣｈｏｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＢＣＮを使用した結果を示す。脾臓Ｔ細胞と同様、特に、活性化ＰＥＧ脂質としてＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを用いた場合に、末梢血Ｔ細胞へのＬＮＰの取り込みが顕著に増加した。
［試験例７］インビボにおけるＬＮＰ取込み能評価
１．リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの製造
　試験例３の１．と同様にして、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、および活性化ＰＥＧ脂質を１ｍｏｌ％使用）を［実施例２］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ３－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を［実施例２］の方法で修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。なお、活性化ＰＥＧ脂質として、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯまたはＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを使用した。
２．インビボにおける脾臓Ｔ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　製造したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、４週齢の雌のＡｉ１４マウス（上述）に体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ／ｋｇ）。投与後３日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例１］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。２×１０６細胞を分注し、Ｆｃブロッキングをした。Ｆｃブロッキングは、ＣＤ１６／３２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で１０分以上インキュベートした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上述）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー（４００μＬ）に再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、Ｔ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ１９－）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現を解析した。
　結果を図６に示す。なお、図６中の「ＤＳＰＥ」または「ＤＳＧ」は、それぞれ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯまたはＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを使用した結果を示し、図６中の「ＰＢＳ」は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯまたはＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを使用しなかった結果を示す。活性化ＰＥＧ脂質としてＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを用いた方が、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを用いた場合よりＴ細胞への取り込みは優れていたが、導入ｍＲＮＡの発現細胞数はＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを用いた場合の方が優れていた。
［参考例２］ＣＤ１９－ＩｇＧのフラグメント化および反応基質の導入
１．抗体のフラグメント化および精製
　抗ＣＤ１９　ＩｇＧ抗体（ＣＤ１９－ＩｇＧ、入手元：Ｌｅｉｎｃｏ社）をｚｅｂａ－ｓｐｉｎ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩および、酢酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ，ｐＨ４．５）への置換を行った。置換後のＣＤ１９－ＩｇＧをＣＤ１９－ＩｇＧ：ペプシン＝１０ｍｇ：０．１２５ｍｇの比で３７℃、２日間撹拌し、フラグメント化を行った。フラグメント溶液をエンプティカラムに通すことで、ペプシンとの分離を行った。精製とバッファー置換を目的とし、カラムに通したフラグメント溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ１５（ＭＷＣＯ：５０ｋＤａ）へ移し、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１４ｍＬまでメスアップし、遠心（２５℃，１０００ｇ，５ｍｉｎ）を繰り返し、約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，５ｍｉｎ）を繰り返し、５００μＬまで濃縮した。最後に、炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いて１ｍＬになるようメスアップした。
２．反応基質の導入
　フラグメント溶液をＮａｎｏｄｒｏｐ　ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することで、タンパク質濃度およびタンパク質量を算出した。フラグメント溶液に対し４等量のＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳを加え、室温２時間、４℃一晩振とうし、反応基質の導入を行った。反応基質導入後のフラグメント溶液をｚｅｂａ－ｓｐｉｎ　ｄｅａｓａｌｔｉｎｇ　ｃｏｌｕｍｎを用いて未反応試薬の除去および超純水へ置換を行った。
３．反応基質導入の確認
　遮光エッペンドルフチューブに基質導入後のフラグメント溶液を１００μｇ相当量取り、さらにアスコルビン酸（２０ｍＭ）を１０μＬ、硫酸銅水溶液（２０ｍＭ）を１０μＬ、Ｃｙ５－Ａｌｋｙｎｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ、最後に超純水を用いて１００μＬになるようにメスアップし、室温で２時間反応させた。反応後、分画分子量３．５ｋＤａの透析膜に反応溶液を移し、一晩透析を行った。透析後、タンパク質量はＢＣＡ法、Ｃｙ５修飾量は蛍光を元に、それぞれ算出した。Ｃｙ５修飾量をタンパク質量で除することで、反応基質の導入数とした。
［実施例４］Ｂ細胞指向性リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
　ｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を０．４、０．８、１．２または１．６ｍｏｌ％、および取込みの指標としてＤｉＤを０．５ｍｏｌ％使用）を、［実施例１］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ１９－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を用いて［実施例１］の方法でＬＮＰの修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。
［試験例８］インビボにおける脾臓Ｂ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　実施例４で調製したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で１．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、７週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０１５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例１］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。１×１０６細胞を［試験例１］の方法でＦｃブロッキングをした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５，Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｂ２２０，Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε（上述）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上述）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー４００μＬに再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、ＤｉＤ蛍光を指標として、各濃度の活性化ＰＥＧ脂質を含むＬＮＰのＢ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋）への取り込みを解析した。
　結果を図７に示す。なお、図７中の「ｎｔＬＮＰ」は、未修飾のＬＮＰを使用した結果を示し、図７中の「０．４（ｍｏｌ％）」、「０．８（ｍｏｌ％）」、「１．２（ｍｏｌ％）」または「１．６（ｍｏｌ％）」は、それぞれ、活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％または１．６ｍｏｌ％であるリガンド修飾ＬＮＰを使用した結果を示す。活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％の場合に、最もＢ細胞への取り込みが高く、未修飾のＬＮＰに対して有意にＢ細胞への取り込みが上昇していた。
［試験例９］インビボにおける末梢血Ｂ細胞へのＬＮＰ取込み能評価
　実施例４に記載の方法で調製したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で１．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、７週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０１５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウス尾静脈から２０μＬ採血し、［試験例１］の方法で細胞懸濁液の作製およびＦｃブロッキングをした。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　６０５　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε（上述）、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｂ２２０（入手元：ＢｉｏＬｅｇｅｎｅｄ社）をメーカー推奨量添加し、氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞表面抗原の蛍光標識を行った。抗体染色残り５分の段階で７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上述）をメーカー推奨量添加し、死細胞染色を行った。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を２度洗った後、ＦＡＣＳバッファー４００μＬに再懸濁し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、Ｂ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋）への取り込みを解析した。
　結果を図８に示す。なお、図８中の「ｎｔＬＮＰ」は、未修飾のＬＮＰを使用した結果を示し、図８中の「０．４（ｍｏｌ％）」、「０．８（ｍｏｌ％）」、「１．２（ｍｏｌ％）」または「１．６（ｍｏｌ％）」は、それぞれ、活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％または１．６ｍｏｌ％であるリガンド修飾ＬＮＰを使用した結果を示す。脾臓Ｂ細胞と同様、末梢血Ｂ細胞でも活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％の場合に、最もＬＮＰの取り込みが高く、未修飾のＬＮＰに対して有意にＢ細胞への取り込みが上昇していた。
［試験例１０］インビボにおけるＬＮＰ取込み能評価
１．ＬＮＰの調製
　実施例４と同様に、ｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比＝５２．５：７．５：４０、さらにＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＣおよびＣｈｏｌの合計に対して、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを１．５ｍｏｌ％、ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯを０．４、０．８、１．２または１．６ｍｏｌ％、および取込みの指標としてＤｉＤを０．５ｍｏｌ％使用）を、［実施例１］に記載の方法にて製造した。その後、リガンドとして抗ＣＤ１９－ＩｇＧ抗体より作製したＦ（ａｂ’）２を用いて［実施例１］の方法でＬＮＰの修飾を行い、リガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製をした。
２．インビボにおける脾臓Ｂ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　上記１．で調製したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で１．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、７週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０１５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウスから脾臓を採取し、［試験例８］に記載の方法で細胞懸濁液を作製した。１×１０６細胞を［試験例８］の方法でＦｃブロッキング、抗体染色を行い、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、各濃度の活性化ＰＥＧ脂質を含むＬＮＰの脾臓Ｂ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋）への取り込みを解析した。
　結果を図９に示す。なお、図９中のｎｔＬＮＰは、未修飾のＬＮＰを使用した結果を示し、図９中の「０．４（ｍｏｌ％）」、「０．８（ｍｏｌ％）」、「１．２（ｍｏｌ％）」または「１．６（ｍｏｌ％）」は、それぞれ、活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％または１．６ｍｏｌ％であるリガンド修飾ＬＮＰを使用した結果を示す。調べられたすべての活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比（０．４～１．６ｍｏｌ％）で、リガンド修飾ＬＮＰは、未修飾のＬＮＰに対して有意にＢ細胞への取り込みが上昇しており、特にモル比が０．４ｍｏｌ％の場合に、最もＢ細胞への取り込みが高く、他のモル比（０．８～１．６％）に対しても有意にＢ細胞への取り込みが上昇していた。
［試験例１１］インビボにおける末梢血Ｂ細胞のＬＮＰ取込み能評価
　試験例１０の１．に記載の方法で調製したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で１．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したリガンド修飾ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、７週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０１５ｍｇ／ｋｇ）。投与後１日後にマウス尾静脈から２０μＬ採血し、［試験例９］の方法で細胞懸濁液の作製をした。［試験例９］の方法で抗体染色を行い、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーター（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブセット分類をし、各濃度の活性化ＰＥＧ脂質を含むＬＮＰの末梢血Ｂ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３－／ＣＤ１９＋）への取り込みを解析した。
　結果を図１０に示す。なお、図１０中のｎｔＬＮＰは、未修飾のＬＮＰを使用した結果を示し、図１０中の「０．４（ｍｏｌ％）」、「０．８（ｍｏｌ％）」、「１．２（ｍｏｌ％）」または「１．６（ｍｏｌ％）」は、それぞれ、活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比が０．４ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％または１．６ｍｏｌ％であるリガンド修飾ＬＮＰを使用した結果を示す。調べられたすべての活性化ＰＥＧ脂質（ＤＳＧ－ＰＥＧ２ｋ－ＤＢＣＯ）の総脂質量に対するモル比（０．４～１．６ｍｏｌ％）で、リガンド修飾ＬＮＰは、未修飾のＬＮＰに対して有意にＢ細胞への取り込みが上昇しており、特にモル比が０．４ｍｏｌ％の場合に、最もＢ細胞への取り込みが高く、他のモル比（０．８～１．６％）に対しても有意にＢ細胞への取り込みが上昇していた。
　本発明の脂質ナノ粒子は、核酸医薬、遺伝子治療、生化学実験等に有用である。
　本願は、日本で出願された特願２０２１－１６１２３５号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。

Claims (16)

  1. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）中、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
    　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、並びに
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
    で表されるイオン性脂質、および
    　活性化ＰＥＧ脂質に結合した細胞指向性を有するリガンド
    を含む脂質ナノ粒子。
  2. 　活性化ＰＥＧ脂質が式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）中、
    　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、炭素数１４～１８の炭化水素鎖を示し、
    　Ｘは式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表される基、または単結合を示し、
    　Ｘが式（３）で表される基である場合、Ｙは単結合を示し、
    　Ｘが単結合である場合、Ｙは酸素原子を示し、並びに
    　ｎは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎの分子量が１０００～５０００を満たす整数を示す。）
    で表される、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
  3. 　前記式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが単結合であり、並びにＹは酸素原子である、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　リガンドが標的細胞の表面上に発現する分子に対して特異的親和性を有するペプチドまたは抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　リガンドが抗ＣＤ３抗体である、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　リガンドが抗ＣＤ１９抗体である、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　リガンドがＴ細胞への指向性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
  8. 　リガンドがＢ細胞への指向性を有する、請求項１～４および６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
  9. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（１）中、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
    　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、並びに
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
    で表されるイオン性脂質、および活性化ＰＥＧ脂質を含む脂質原料から脂質ナノ粒子を製造し、
    　得られた脂質ナノ粒子に、細胞指向性を有するリガンドを結合させることを含む、
    該リガンドで修飾された脂質ナノ粒子の製造方法。
  10. 　活性化ＰＥＧ脂質が式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式（２）中、
    　Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、炭素数１４～１８の炭化水素鎖を示し、
    　Ｘは式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で表される基、または単結合を示し、
    　Ｘが式（３）で表される基である場合、Ｙは単結合を示し、
    　Ｘが単結合である場合、Ｙは酸素原子を示し、並びに
    　ｎは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎの分子量が１０００～５０００を満たす整数を示す。）
    で表される、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記式（２）中、Ｒ１およびＲ２が炭素数１８の飽和炭化水素鎖であり、Ｘが単結合であり、並びにＹは酸素原子である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子を含む核酸導入剤。
  13. 　生体外において、核酸を内封した請求項１２に記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、該核酸を該細胞内に導入する方法。
  14. 　細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　核酸を内封した請求項１２に記載の核酸導入剤を、標的細胞に送達されるように、生体へ投与することを含む、該核酸を該細胞内へ導入する方法。
  16. 　標的細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１５に記載の方法。
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