JP2002514432A - 蛋白質連結脂質微粒子類の形成方法、およびその組成物類 - Google Patents

蛋白質連結脂質微粒子類の形成方法、およびその組成物類

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、延長された保存寿命と静脈注射後のインビボにおける高いトランスフェクション活性を有する脂質：核酸複合体類、およびこのような複合体類を調製する方法類を提供する。一般に、前記方法では、核酸を有機ポリカチオンに接触させ濃縮核酸を製造すること；およびその後前記濃縮核酸を両媒性カチオン性脂質を含む脂質と組み合わせて、前記脂質：核酸複合体を形成する工程を含む。この複合体は、さらに、疎水性側鎖に結合させた親水性ポリマーを添加することによって、安定化させることができる。前記複合体は、また、親水性ポリマーに結合したＦａｂ’断片のような標的部分を取り込むことによって、特定細胞に対して特異的とすることができる。本発明は、さらに、親水性ポリマードメインおよび微粒子を安定結合可能な疎水性ドメインを有するリンカー分子に最初に結合させた結合蛋白質、または親水性ドメインと微粒子との安定結合を可能とする脂質部分を含有するように工学的に処理した蛋白質類を有する脂質性微粒子類に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９７年１１月１０日出願の米国出願番号第０８／９６７、７９
１号および１９９６年１１月１２日出願の米国出願番号第６０／０３０、５７８
号の係属部分であり、その両者ともに本文で参考として引用している。 研究または開発のための連邦支援 非適用。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、カチオン性脂質：ＤＮＡ複合体類（“ＣＬＤＣ”）の分野に関する
。特に、本発明は、（１）親水性ポリマー；（２）有機ポリカチオン類によって
濃縮された核酸：および（３）親水性ポリマーおよび有機ポリカチオン類によっ
て濃縮された核酸を含有する脂質：核酸複合体類に関する。本発明の脂質：核酸
複合体類は、静脈注射後インビボで高トランスフェクション活性を示し、また、
インビボトランスフェクション活性によって調べたところ、予測外にも延長され
た保存寿命（shelf life)を示した。
【０００３】 本発明は、さらに、蛋白質に結合した,リポゾーム類、脂質：ＤＮＡ複合体類
、脂質：薬物複合体類およびミクロエマルジョン粒子のような脂質性微粒子類の
分野に関する。特に、本発明は、結合蛋白質類を有する脂質性微粒子類に関し、
それらの蛋白質類は、親水性ポリマードメインと前記微粒子に安定に結合できる
疎水性ドメインを有するリンカー分子類に最初に結合させた蛋白質であるかまた
は親水性ドメインと脂質性微粒子に安定に結合できるようにした脂質部分を含有
するように工学処理した蛋白質類である。
【０００４】
【従来の技術】
両媒性のカチオン性分子類で構成されるリポゾーム類は、インビトロおよびイ
ンビボにおける遺伝子運搬のための有用な非ウイルス性ベクター類である（Ｃｒ
ｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅ
ｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）
；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１
９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６
５４（１９９４）；およびＧａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−
７２２（１９９５）でレビューされている）。理論上、陽性荷電リポゾーム類は
、静電的相互作用によって陰性荷電核酸類と複合体を形成し、脂質：核酸複合体
類を形成する。この脂質：核酸複合体類は、遺伝子運搬ベクター類としていくつ
かの利点を有している。この脂質：核酸複合体類は、ウイルスベクター類と異な
り、本質的に大きさが無制限の発現カセット類を運搬するために使用できる。前
記複合体類は蛋白質類を有していないので、それらは、免疫源性および炎症性応
答を惹起することがほとんどないであろう。さらに、それらは、複製または再結
合して感染性物質を形成するということができず、組み込み頻度も低い。
【０００５】 インビトロでの培養細胞中におけるレポータ遺伝子の発現が検出可能であるこ
とを示すことによって、両媒性カチオン性脂質類がインビボおよびインビトロに
おいて遺伝子運搬を媒介できることを確信的に示している刊行物がいくつかある
（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：
７４１３−１７（１９８７）；Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｆｅｌｇｎｅｒら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４））。脂質
：核酸複合体類は、時として、遺伝子運搬を成功させるためのウイルスベクター
類としては効率的でないので、トランスフェクション効率の高められたカチオン
性脂質類を見出すことに多大な努力が払われてきた（Ｂｅｈｒ、Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏら、
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。脂質：核酸複
合体類は、遺伝子療法の非常に有用な手段として待望されている。
【０００６】 動物およびヒトの両者におけるインビボトランスフェクションのための両媒性
カチオン性脂質：核酸複合体類の使用については、いくつかのグループが報告し
ている（Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５
）；Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）；および
Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡＣａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９
７４２−９７４６（１９９５）でレビュー）。しかし、安定な保存寿命を有する
複合体調製のための技術的問題は解明されていない。たとえば、脂質：核酸複合
体類は、ウイルス性ベクターの調製とは異なり、粒子サイズという観点から不安
定である（Ｂｅｈｒ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８
９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７
−６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７
２２（１９９５））。ゆえに、全身注入に適したサイズ分布を有する均質な脂質
：核酸複合体類を得ることは困難である。脂質：核酸複合体類のほとんどの調製
物は、準安定である。その結果、これらの複合体類は、通常、３０分から数時間
の範囲の短い期間内に使用しなければならない。カチオン性脂質類をＤＮＡ運搬
のキャリアとして用いた最近の臨床治験では、この２つの成分をベッドサイドで
混合しすぐに用いた（Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２
２（１９９５））。脂質核酸複合体のトランスフェクション能の経時的喪失とと
もに構造的不安定性については、今後の脂質媒介遺伝子療法の発展のために取り
組むべきことである。
【０００７】 両媒性カチオン性分子類で構成されるリポゾーム類は、もちろん、脂質性微粒
子の唯一の形態ではなく、遺伝子療法は、このような微粒子類の唯一の用途とい
うわけではない。脂質性微粒子類は、また、標的部位への薬物運搬および他の物
質類の運搬のために使用されてきた。通常、微粒子による標的化は、前記微粒子
表面に結合した蛋白質を使用することで達成され、それらは、たとえば、問題の
細胞種上の細胞表面レセプター用リガンドであってもよい。それとは逆に、前記
蛋白質は、特異的マーカー類を有している疾患細胞類のような問題となっている
細胞種上で抗原を特異的に認識する抗体であってもよい。さらに、蛋白質類は、
標的化以外の目的のために結合させることができる。たとえば、リポゾーム類は
、リポゾームからゆっくりと循環系に入るプロドラッグ類を含有することができ
る。前記リポゾームに結合した酵素は、その後、前記プロドラッグをその活性型
に変換できる。
【０００８】 蛋白質類を脂質性微粒子に結合させる現在の方法には、２つの種類がある。第
１の方法では、“活性化”粒子を問題の蛋白質に結合させる前に“活性”基（蛋
白質の官能基と反応するもの）を有するリンカー分子を粒子組成物に導入するこ
とが必要となる。この種の方法の欠点として、制御がしばしば不可能で、前記リ
ンカーと蛋白質の反応が不完全であること、生成した結合物上に過剰のリンカー
が存在しこのことが粒子安定性に対して悪影響を及ぼす可能性があること、およ
びリンカーと反応性の成分類を前記粒子組成物中に組み入れることができないこ
とがある。
【０００９】 第２の方法群では、（ａ）炭化水素鎖のような疎水性部分を蛋白質分子に結合
させること、（ｂ）脂質性微粒子の成分類を工程（ａ）の結合物ともに界面活性
剤存在下において溶解させること、および（ｃ）前記界面活性剤を除去し、前記
蛋白質結合物を取り込んだ脂質性粒子を形成させることの工程を用いている（Ｔ
ｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４−２４４−２５８（１９９
４）；Ｌａｕｋｋａｎｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１１６６４−
１１６７０（１９９４））。これらの方法にはいくつか欠点があり、粒子形成可
能でかつ薬物または他の物質類を微粒子に充填する方法の範囲に厳しい制限が課
せられること（例 界面活性剤除去技術が必要である）が含まれる。さらに、工
程（ｂ）では、微粒子の溶解を必要としている。これらの方法は、ゆえに、最初
に粒子を破壊することなく事前に調製された粒子に蛋白質を結合できない。界面
活性剤がないと疎水性に改変された蛋白質が水性媒体に不溶となるので、これら
の方法において界面活性剤が存在することは不可避である。
【００１０】 小型の（アミノ酸５個）オリゴペプチドまたは小型のオリゴ糖に結合した親水
性ポリマー−脂質のリポゾーム類への“挿入”について、報告されている（Ｚａ
ｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：１１１−１１８（
１９９７））。使用した前記ペプチドおよびオリゴ糖は、しかし、リンカーその
もの（分子量２，７５０Ｄａ）よりも小さいかあるいは匹敵する大きさ（分子量
５００−３，０００Ｄａ）である。したがって、この研究は、抗体類またはその
断片類のような蛋白質を蛋白質よりも有意に小さいリンカー類に結合させてリポ
ゾーム類または他の脂質性微粒子蛋白質類中に挿入するための指針をなんら提示
していない。抗体類および他の蛋白質類の親水性を考慮し、本技術は、このよう
な結合物のより大きな蛋白質部分が、疎水性結合部分が脂質性微粒子に安定に結
合することを妨げていることを示唆している。
【００１１】
【発明の要約】
本発明は、保存寿命が延長されたカチオン性脂質：核酸複合体類を調製する新
規方法を提供するものである。一の態様においては、これらの複合体類は、核酸
を有機ポリカチオンに接触させ濃縮または部分濃縮核酸を製造し、調製する。濃
縮された核酸をその後両媒性カチオン性脂質およびコレステロールのような中性
ヘルパー脂質とモル比で約２：１から約１：２で混合すると、前記の脂質：核酸
複合体が生成する。別の方法においては、親水性ポリマーを、濃縮されなかった
核酸を含む脂質：核酸複合体に添加する。これらの脂質：核酸複合体類は、たと
えば２２℃以下に保存した際に、核酸成分を前記の有機ポリカチオンに接触させ
なかったかおよび／または前記の脂質：核酸複合体が親水性ポリマーに接触しな
かった同等の脂質：核酸複合体に比較して、保存寿命延長を示す。
【００１２】 特に好適な態様では、前記ポリカチオンはポリアミンであり、さらに好適には
、スペルミジンまたはスペルミンのようなポリアミンである。
【００１３】 別の好適な態様では、前記の脂質：核酸複合体類は、核酸を両媒性カチオン性
脂質と組み合わせ、その後形成された複合体を親水性ポリマーと組み合わせるこ
とによって、調製される。この脂質：核酸複合体は、たとえば、２２℃以下に保
存した際に、前記親水性ポリマーと組み合わせなかった同等の複合体と比較して
、長い保存寿命を示す。
【００１４】 一の態様では、前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
ホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ−ＰＥ）、ツイーンで誘導体としたポリエチレングリコール、ジステアロイル
ホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1および合成ポリマー類からなる群から選択
される。
【００１５】 一の態様では、前記脂質：核酸複合体は、凍結乾燥される。
【００１６】 本発明の方法類および組成物類のいずれにおいても、前記核酸は、実質的にい
かなる核酸であってもよく、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ
核酸（ＲＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）等であることができ、最も好適
にはＤＮＡである。特に好適な態様では、前記ＤＮＡは、前記脂質：核酸複合体
をトランスフェクトされた細胞中でポリペプチドを発現できる発現カセットであ
る。
【００１７】 一の態様において、前記脂質：核酸複合体類は、最初にリポゾームを形成させ
、その後、濃縮してあるかまたは部分濃縮してある核酸と形成されたリポゾーム
を組み合せることによって、形成される。前記脂質：核酸複合体は、その後、適
宜、親水性ポリマーに接触させる。別の方法においては前記リポゾーム類を、未
濃縮核酸と組み合せ脂質：核酸複合体を形成させ、その後親水性ポリマー（例
ＰＥＧ−ＰＥ）を添加することにより形成される。核酸と、親水性ポリマーに接
触させたリポゾームの組み合せで調製された脂質：核酸複合体を、その後、追加
親水性ポリマーと組み合わせることができる。好適な態様では、前記脂質および
核酸は、約１から約２０、好適には約４から約１６、さらに好適には約８から約
１２ｎｍｏｌｅの脂質：核酸μｇの範囲で組み合わされる。前記脂質および親水
性ポリマーは、約０．１から約１０％、さらに好適には約０．３から約５％、さ
らに最も好適には約０．５％から約２．０％（複合体のカチオン性脂質に対する
親水性ポリマーのモル比）のモル比で組み合わされる。
【００１８】 標的部分（例 抗体または抗体断片）は、前記脂質：核酸複合体の形成前また
は後で前記脂質および／またはリポゾームに結合させることができる。好適な態
様では、標的部分は親水性ポリマー（例 ＰＥＧ）に結合させ、前記標的部分／
親水性ポリマーは、その後、前記脂質：核酸複合体に添加される。これによって
、さもなければ一般的な脂質：核酸複合体の、標的特異性を改変するための便利
な手段が提供される。
【００１９】 特に好適な態様では、前記脂質：核酸複合体の保存寿命延長の方法は、スペル
ミジンまたはスペルミンを有する発現カセットを両媒性カチオン性脂質プラスコ
レステロールのようなヘルパー脂質、およびたとえばポリエチレングリコールの
ようなスぺーサーに結合した抗体Ｆａｂ’断片と組み合わせる工程を含み、その
結果、前記複合体は、約４℃に保存しても長い保存寿命を有する。
【００２０】 特に好適な態様では、前記脂質：核酸複合体の保存寿命延長の方法には、スペ
ルミジンまたはスペルミンを有する発現カセットを両媒性カチオン性脂質プラス
コレステロールのようなヘルパー脂質、およびたとえばポリエチレングリコール
誘導体に結合した抗体Ｆａｂ’断片と組み合わせる工程を含む。別の特に好適な
態様では、発現カセットを両媒性カチオン性脂質、およびポリエチレングリコー
ル誘導体に結合した抗体Ｆａｂ’断片と組み合わせる工程を含み、その結果、前
記複合体は、約４℃に保存しても長い保存寿命を有する。
【００２１】 さらに、本発明は、核酸を哺乳類細胞にトランスフェクションさせる方法を提
供し、前記方法は、上述のように調製した前記脂質：核酸複合体類のいずれかに
前記細胞を接触させることを含む。一の態様では、前記方法は、哺乳類への脂質
：核酸複合体の全身投与を用いる。好適な態様では、トランスフェクション方法
は、前記脂質：核酸複合体を哺乳類に静脈注射により投与することを用いる。特
に好適な態様では、前記方法は、Ｆａｂ’断片を認識するリガンドを発現する特
定細胞に接触させることを含む。
【００２２】 さらに別の態様では、本発明は、また、上記の脂質：核酸複合体を含む薬剤組
成物を提供する。前記の薬剤組成物類は、治療上有効量の前記脂質：核酸複合体
と薬剤学的に許容できる担体または賦形剤を含む。
【００２３】 さらに別の態様では、本発明は、また、脂質：核酸複合体を調製するためのキ
ットを提供し、前記キットは、リポゾームを含む容器；核酸を含む容器；および
親水性ポリマーを入れた容器を含み、前記リポゾームおよび核酸を混合し前記脂
質：核酸複合体を形成させ、前記脂質：核酸複合体は親水性ポリマーに接触させ
る。好適な態様では、前記親水性ポリマーは、標的部分で、好適にはＦａｂ’断
片で誘導体化される。別の好適な態様では、核酸を濃縮する。
【００２４】 本発明は、また、上記のように有機ポリカチオンで濃縮した核酸を用いて保存
寿命を長くする方法を用いて調製された脂質：濃縮核酸複合体を提供する。
【００２５】 本発明は、また、結合蛋白質類を保持した脂質性微粒子を調製する方法を提供
する。本法では、脂質性微粒子類と安定に会合するであろうリンカー分子類に結
合させた蛋白質類を用いている。本発明は、したがって、たとえば、予め形成さ
れた脂質性微粒子の表面に蛋白質類を結合させることができる。 定義 下記の略語を本文中で使用する：Ｃｈｏｌ、コレステロール；ＰＡ、ホスファ
チジン酸；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；
ＳＭ、スフィンゴミエリン；Ｍ−ＤＰＥ、マレイミド誘導ジパルミトイルエタノ
ールアミン；ＰＢＳ、りん酸緩衝生理食塩水；ＬＵＶ、大型単一ラメラ小胞；Ｍ
ＬＶ、マルチラメラ小胞；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥＧ、ポ
リエチレングリコール；ＰＥＧ−ＰＥ、ポリエチレングリコール誘導体化ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、３β［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチ
ルアミノエタン）カルバノイル］−コレステロール；ＤＤＡＢ、ジメチルイディ
オクタデシルアンモニウムブロミド；ＤＭＥＰＣ、ジミリストイルグリセロ−３
−エチルホスホコリン；ＤＯＤＡＰ、ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム
プロパン；ＤＯＥＰＣ、ジオレオイルグリセロ−３−エチルホスホコリン；ＤＯ
ＧＳ、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン；ＤＯＰＥ、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン；ＤＯＴＡＰ、ジオレオイル−３−トリメ
チルアンモニウムプロパン；ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［２、３−（ジオレオイルオキシ
）プロピル］Ｎ，Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド；ＤＳＰＥ、ジステ
アロイルホスファチジルエタノールアミン；ＰＥＧ−ＰＥ、Ｎ−［オメガ−メト
キシポリ（オキシエチレン）−アルファオキシカルボニル］−ＤＳＰＥ；ＰＯＥ
ＰＣ、パルミトイルオレオイルグリセロ−３−エチルホスホコリン。
【００２６】 用語“両媒性カチオン性脂質”とは、疎水性部分および極性頭部基部分を有し
、正味の正の荷電を有する合成脂質類および脂質アナログ類を含むあらゆる両媒
性脂質を含むことを意図しており、それ自体は、水中で２層の小胞またはミセル
を自然に形成でき、そのことはホスホリピドによって例示される。この用語は、
また、ホスホリピドとともに脂質２層類に安定に取り込まれるあらゆる両媒性脂
質を含み、２層膜の内部の疎水性領域にその疎水性部分が接触し、その極性頭部
基部分は、膜の外部極性表面の方に向いている。
【００２７】 用語“特異的結合”とは、酵素／基質、レセプター／アゴニスト、抗体／抗原
およびレクチン／炭水化物のような対になった種間で起こる結合を意味し、共有
または非共有相互作用によって媒介されるかまたは共有および非共有相互作用の
組み合せによって媒介されることができる。前記２種の相互作用が非共有結合複
合体を生成する場合は、出現する結合は、通常、静電的、水素結合的であるかま
たは脂質親和性の結果である。したがって、“特異的結合”とは、前記２種の間
で相互作用がある対になった種間で起こり、抗体／抗原または酵素／基質相互作
用の特徴を有する結合複合体を生成する。特に、前記の特異的結合は、特定種に
対する対の一員の結合を特徴とし、前記結合の一員に対応する一員が属する化合
物族内の他のいかなる種に対しても結合しない。したがって、たとえば、抗体は
、好適には、単一のエピトープに結合し、蛋白質族内の他のいかなるエピトープ
にも結合しない。
【００２８】 用語“リガンド”および“標的部分”とは、本文では、一般的に、特定標的分
子に特異的に結合し上記のように結合複合体を形成可能なあらゆる分子類を意味
している。したがって、前記リガンドおよび対応する標的分子は、特異的結合対
を形成する。例としてであり限定されるわけではないが、抗体類、リンホカイン
類、サイトカイン類、ＣＤ４およびＣＤ８のようなレセプター蛋白質類、可溶化
ＣＤ４のような可溶化レセプター蛋白質類、ホルモン類、成長因子類など、所望
の標的細胞に特異的に結合し、さらに、塩基対相補性を介して対応する核酸類に
結合する核酸類が挙げられる。特に好適な標的部分としては、抗体類および抗体
断片類（例 Ｆａｂ’断片）が含まれる。
【００２９】 用語“脂質：核酸複合体”とは、両媒性カチオン性脂質類またはリポゾーム類
を核酸と混合し形成される生成物を意味している。用語“ＣＬＤＣ”とは、本文
では“カチオン性脂質：ＤＮＡ複合体”を意味しているが、ＤＮＡに限定されず
、脂質：核酸複合体の便利な略語である。前記脂質：核酸複合体には、ヘルパー
脂質も含ませることができる。ヘルパー脂質は、また、ＤＯＰＥまたはコレステ
ロールのような中性脂質であり、コレステロールが最も好適である。前記脂質：
核酸複合体には、また、前記複合体の核酸と接触し濃縮核酸を生成するポリカチ
オンのような他の化合物類も含まれることができ、さらに、ＰＥＧおよび誘導Ｐ
ＥＧのような親水性ポリマー類を含有させることができる。
【００３０】 用語“イムノリポゾーム”および“イムノリピド：核酸複合体”とは、溶液中
に存在するかもしれないかまたは細胞表面に結合しているかもしれない特定の“
標的”分子に特異的に前記脂質：核酸複合体を結合させることができる標的部分
として作用する抗体または抗体断片を有するリポゾームまたは脂質：核酸複合体
を意味する。標的分子が、相対的に過剰に（例 およそ（ＡＥ）１０倍）見られ
かつ特定の細胞種または特定の生理的条件を発現する多数のすべての細胞種と会
合して典型的に見られるものであると、前記標的分子は、この細胞種またはその
生理的条件の“特徴的マーカー”であるといわれる。したがって、たとえば、癌
は、乳癌の場合、ＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ）プロトオンコジーンの
ような特定マーカーの過剰発現により特徴づけられる。
【００３１】 “親水性ポリマー”とは、脂質分子類に結合した高度に水和された可撓性の中
性ポリマー類を本文で意味するものとして使用している。限定するものではない
が例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスファチジルエタノールア
ミン誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ツイーン誘導体化ポリ
エチレングリコール、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン誘導体化
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1および合成
ポリマー類が挙げられる。このようなポリマー類は、典型的には、１０００−１
０，０００の範囲の分子量を有している。好適には、ＰＥＧの分子量は、約２０
００である。
【００３２】 “トランスフェクション”とは、たとえば、脂質：核酸複合体の一部としての
核酸と生細胞を接触させることを意味している。
【００３３】 “トランスフェクション活性”とは、核酸を生細胞に導入する効率を意味して
いる。トランスフェクション効率は、脂質：核酸複合体の一部として細胞に移入
されたレポータ遺伝子の発現量を例えば蛍光または機能アッセイによって決定す
ることで、測定することができる。
【００３４】 用語“濃縮核酸”および“部分濃縮核酸”とは、たとえば、スペルミンおよび
スペルミジンを含むポリアミン類、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；ヘキサジ
メトリンブロミド）のようなポリアンモニウム分子類、塩基性ポリアミノ酸類、
および塩基性蛋白質類のような有機カチオンと接触させた核酸を意味するために
使用している。典型的には、濃縮核酸類は、非濃縮核酸類よりも有意に少ない体
積を占めている。しかし、濃縮度は、局所環境（例 水性環境に対しての脂質）
によって異なると考えられている。
【００３５】 本文に開示した脂質：核酸複合体を意味して用語“保存寿命”を使用した際に
は、前記脂質：核酸複合体がその生物活性を失うまで保存できる（例として４℃
などの規定された条件下）期間を意味している。本発明で保存寿命決定のために
アッセイした生物活性は、静脈注射による投与後インビボで哺乳類細胞にトラン
スフェクションする前記脂質：核酸複合体の能力である。脂質：核酸複合体の“
保存寿命”は、本文に記載のように前記脂質：核酸複合体中におけるレポータ核
酸類からの遺伝子発現によるアッセイによって簡易に決定される。
【００３６】 “発現カセット”とは、ＤＮＡ分子に操作可能に結合させたプロモータを意味
し、生細胞中でＤＮＡ分子が発現するために必要な全要素類を含んでいる。この
発現カセットは、エンハンサー類、複製開始点類などの付加的要素類を含むこと
ができ、発現ベクターを形成する。
【００３７】 “有機ポリカチオン”または“ポリカチオン”は、ポリマーの１以上のユニッ
トが負の荷電を有しかつポリマーの正味の荷電が正である有機高分子性構造を意
味する。このような有機カチオンの例として、スペルミンおよびスペルミジンを
含むポリアミン類、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；ヘキサジメトリンブロミ
ド）のようなポリアンモニウム分子類、塩基性ポリアミノ酸類、および塩基性蛋
白質類がある。
【００３８】 “薬剤学的に許容できる担体”とは、生物学的にもそうでなくても望ましくな
いということはない物質であり、すなわち、前記物質は、前記脂質：核酸複合体
とともに各人に投与でき、許容できない生物効果をもたらすことがないかまたは
それが含まれる薬剤組成物の他のいかなる成分とも不都合な相互作用をしない。
【００３９】 用語“核酸”とは、ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチド単位
類（リボヌクレオチド類、デオキシリボヌクレオチド類または関連する構造的変
異体類またはその合成アナログ類）で構成されたポリマーまたはオリゴマー（ま
たは関連する構造的変異体またはその合成アナログ類）を意味する。したがって
、本用語は、ヌクレオチド類およびそれらの間の結合が天然由来であるヌクレオ
チドポリマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ならびに、例としてであり限定するもの
ではないがペプチド−核酸類（ＰＮＡ類）、ホスホルアミデート類、ホスホロチ
オアート類、メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボ核酸類等の種々のアナ
ログ類を意味する。
【００４０】 リポゾーム中の親水性ポリマーの百分率を意味する時、用語“モル百分率”と
は、他にことわりがなければ、前記リポゾーム中のカチオン性脂質に対して相対
的に示される。したがって、たとえば、コレステロール（Ｃｈｏｌ）に対するＤ
ＤＡＢの比率が１００：１００であるリポゾーム中において、親水性ポリマー（
例 ＰＥＧ）の４モルパーセントは、約１００：１００：４のＤＤＡＢ：Ｃｈｏ
ｌ：ＰＥＧの比率を示すであろう。
【００４１】 用語“同等の”とは、別の組成物と同一の化合物類を用いて形成された組成物
を意味し、前記組成物類は統計的に有意に異なっていない。
【００４２】 用語“全身投与”とは、哺乳類に化合物または組成物を投与する方法で、循環
系を介して全身の多くの部位に前記化合物または組成物を運搬する方法を意味し
ている。
【００４３】 本文で使用したように、“リンカー分子”とは、（ａ）疎水性領域、（ｂ）末
端で前記の疎水性領域に結合した親水性ポリマー鎖および（ｃ）蛋白質分子上で
１個以上の官能基に反応し前記ポリマー鎖の、前記疎水性領域と反対側の末端又
はその近くで前記ポリマー鎖に結合する化学基、を含む分子を意味する。
【００４４】 たとえばリンカー分子の用語“疎水性領域”とは、脂肪酸、脂肪アルコール、
ステロールまたは水性媒体から脂質相に分布可能な他の疎水性分子を意味してい
る。たとえば、疎水性領域は、ジアシルグリセロール、ホスホリピド、コレステ
ロールのようなステロール、またはＮ，Ｎ−ジステアロイル−グリシンアミドの
ようなジアシルアミド誘導体であることができる。
【００４５】 蛋白質分子を参考にすると、用語“脂質部分”とは、前記蛋白質分子に共有結
合で直接結合した１個以上の疎水性領域で構成される配列を意味する。
【００４６】 用語“蛋白質”および“ペプチド”は、一般的に、分子量によって当該分野で
区別されており、６０００ダルトン未満のポリペプチドはペプチド類と考えられ
、６０００ダルトン以上のものは蛋白質類と考えられている。ＭｃＭｕｒｒａｙ
、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）（１９８８）の９７１ページ参
照。これらの用語を以下で使用する際には、この区別に従う。 好適な態様の説明 本発明は、カチオン性脂質：核酸複合体類の保存寿命を長くする方法およびイ
ンビボおよび／またはインビトロにおけるこれらの複合体類のトランスフェクシ
ョン効率を高める方法を提供する。このような複合体類は、治療用（例 アンチ
センス）核酸類自体を運搬する手段として、種々の治療用ポリペプチド類を発現
する核酸類を運搬する手段として、かなりの関心を集めてきた。残念なことに、
インビボ投与に適した均質な脂質：核酸複合体類を維持しかつ保存することが困
難であった。前記複合体類は、迅速に凝集するかまたは比較的短い時間に分解す
る傾向がある。この不安定性は、これらの複合体類を調製後短い時間内に、しば
しば３０分から数時間の短い間に使用することを必要としてきた。したがって、
たとえば、ＤＮＡ運搬のための担体としてカチオン性脂質類を用いた最近の臨床
治験では、ＤＮＡおよび脂質成分類をベッドサイドで混合し、すぐに使用した（
Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。
【００４７】 この脂質：核酸複合体の不安定性は、治療剤としてカチオン性脂質：核酸複合
体類が広く受け入れられることをかなり妨げてきた。前記複合体を使用直前に調
製する必要性は、薬剤施設が使用エリアのかなり近くにあることを必要としてい
る。これとは別に、脂質および核酸のベッドサイドでの組み合せは、多大な労力
を負荷することになり、適切な複合体化を確保する上での品質管理問題を生じ、
かつ、潜在的エラー源を生じる。
【００４８】 本発明は、脂質：核酸複合体類の保存（貯蔵）寿命を有意に延長する方法を提
供することで、これらの問題を解決する。前記方法では、通常、（１）前記脂質
：核酸複合体中に取り込む前に核酸を濃縮すること、（２）脂質：核酸複合体を
親水性ポリマー（例 ＰＥＧ）と組み合わせること、および（３）複合体形成前
に前記核酸を濃縮することおよび前記複合体を親水性ポリマーと組み合わせるこ
との両者を含む。
【００４９】 核酸の濃縮は単離した核酸（例 水性緩衝液中）の安定性につながる一方、濃
縮剤（例 有機ポリカチオン）の使用によって、長い保存寿命（例 約２２℃以
下、さらに好適には約０℃から約２２℃および最も好適には約４℃の温度におけ
る冷保存）の後でさえも細胞にインビボでトランスフェクションできる能力を保
持する脂質：核酸複合体を提供できることは、本発明の驚くべき発見であった。
【００５０】 また、両媒性脂質（例 ＰＥＧ−ＰＥ）に結合させた親水性ポリマーと組み合
わせた脂質：核酸複合体類が同様に長くなった保存寿命を示すことも驚くべき発
見であった。特定の理論に縛られることなく、カチオン性脂質：ＤＮＡ複合体（
“ＣＬＤＣ”）を親水性ポリマーに接触させた時、前記親水性ポリマーは前記複
合体中の疎水性ポケットに局在しその疎水性側鎖を介してその中に取り込まれ、
一方、この親水性部分を外表面に留め、それによって全複合体を安定化させると
考えられる。
【００５１】 これらの発見を考慮し、本発明は、カチオン性脂質：核酸複合体類の保存寿命
を延長する方法を提供する。この方法では、通常、ポリカチオンを用いて核酸を
濃縮するかおよび／または前記脂質：核酸複合体を親水性ポリマーで被覆するな
どの接触させることを含む。本発明は、また、このように調製された脂質：核酸
複合体類も含む。
【００５２】 本発明は、さらに、たとえば、微粒子類を選択された細胞類または組織類に標
的化するために適した結合蛋白質類とともに脂質性微粒子類を形成する方法を提
供する。本方法では、先行技術の方法に比べていくつか利点を有している。
【００５３】 （１）挿入の定量的性質のゆえに、各粒子あたりのタンパク質数を高度に再現
できかつ厳密に規定できる； （２）１種以上のタンパク質を同一粒子表面に厳密に比例させて付着できる。
【００５４】 （３）もしタンパク質−リンカー結合物を粒子表面に挿入する前に精製するな
らば、この粒子は未結合リンカー類を保持していないであろう。
【００５５】 （４）前記粒子は、その組成物中において、リンカー活性基と反応性の分子を
含有できる。たとえば、前記粒子は、活性基がマレイミドであってもチオールを
含有できる。
【００５６】 （５）もし粒子が小胞であるならば、前記のリンカー／蛋白質分子類は、外表
面上にのみ存在するであろう。
【００５７】 （６）本法は、問題の蛋白質類を保持する表面付着結合物を付加させることに
よって、市販の薬剤学的リポゾーム類のような予め調製された公知の粒子の用途
を拡大させる。
【００５８】 Ｉ．カチオン性脂質：核酸複合体類 上記で説明した通り、本発明は、脂質：核酸複合体類の貯蔵寿命（保存寿命）
を延長させる方法類を提供する。好適な態様において、前記複合体類は、核酸と
リポゾームの併用によって形成される。しかし、前記脂質類はリポゾームとして
供される必要はないことがわかっている。また、複合体化後、前記脂質：核酸複
合体はもはや真の小胞として存在せず、したがって、一般的にはリポゾームとし
てみなされない。脂質：核酸複合体類の調製は、当業者に公知である（たとえば
、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂ
ｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２：２９１−２９７（１
９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３
８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６
４７−６５４（１９９４）；およびＧａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：
７１０−７２２（１９９５）を参照）。本発明の安定化された脂質：核酸複合体
類の種々の成分類および構造を下記で詳細に説明する。
【００５９】 Ａ．両媒性カチオン性脂質類 上記でも示唆したように、本発明の方法類は、カチオン性脂質を核酸と複合体
にすることを含む。用語“カチオン性脂質”とは、生理的ｐＨで正味の正の荷電
を有する脂質種でありその数はいずれであってもよい。このような脂質類として
、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭ
ＲＩＥなどが含まれるが、それらに限定されない。さらに、いくつかの市販され
ているカチオン性脂質類調製物類も利用でき、本発明で使用できる。これらには
、たとえば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ 登録商標（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎ
ｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡから市販されているＤＯＴＭＡお
よびＤＯＰＥを含むカチオン性リポゾーム類）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ
登録商標（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されているＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを
含むカチオン性リポゾーム類）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ 登録商標（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから
市販されているＤＯＧＳを含むカチオン性リポゾーム類）が挙げられる。
【００６０】 カチオン性脂質は単独でまたは“ヘルパー”脂質と併用して使用できる。好適
なヘルパー脂質類は、生理的ｐＨにおいて非イオン性または非荷電性である。特
に好適な非イオン性脂質類として、コレステロールおよびＤＯＰＥがあげられる
が、それらに限定されず、コレステロールは、最も好適である。
【００６１】 ヘルパーに対するカチオン性脂質のモル比は、２：１から約１：２の範囲であ
ることができ、さらに好適には、約１．５：１から約１：１．５であり、最も好
適には約１：１である。
【００６２】 本発明の脂質：核酸複合体類における使用に適した他のカチオン性および非イ
オン性脂質類は、当業者に周知でありたとえば、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄ
ｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ ＭｃＣｕｔｃ
ｈｅｏｎ’ｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ａｌｌｕｒｅｄ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ、 Ｎ．Ｊのような種々の
周知の出典に引用されている。好適な脂質類として、モル比が１：１のＤＤＡＢ
：コレステロールまたはＤＯＴＡＰ：コレステロールが挙げられる。
【００６３】 Ｂ．核酸 前記脂質：核酸複合体類は、典型的には組換え技術を用いて構築された発現カ
セットである核酸を含有する。組換え核酸は、最初に問題の核酸を単離すること
で調製される。この単離された核酸を、次に、この遺伝子の発現に適したカセッ
トまたはベクターに連結する。組換え核酸調製方法類は、当業者に公知である（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(第２版、１９８９）参照)。
【００６４】 たとえば治療用ペプチドをコードする遺伝子またはレポータ遺伝子のような問
題の遺伝子を、“発現ベクター”、“クローニングベクター”または“ベクター
”中に挿入できるが、それらの用語は、選択された宿主細胞で複製でき問題の遺
伝子を発現できるプラスミド類または他の核酸分子類を称する。発現ベクター類
は、自律的に複製できるか、または、宿主細胞のゲノム中に挿入されることで複
製できる。ベクターがたとえばクローニングおよび構築用大腸菌中においておよ
び発現用哺乳類細胞中においてのように１種以上の宿主細胞で使用できることが
望ましいことが多い。前記ベクターの付加的要素類として、たとえば選択マーカ
ーおよびエンハンサー類が挙げられるが、それらに限定されない。たとえばテト
ラサイクリン耐性またはハイグロマイシン耐性のような選択マーカー類は、所望
のＤＮＡ配列類によって形質転換された細胞類の検出および／または選択を可能
とする（たとえば、米国特許４，７０４，３６２を参照）。細胞に遺伝的情報を
運ぶために使用された特定のベクターは、また、特に限定があるというわけでは
ない。原核または真核細胞中で組換え蛋白質類を発現するために使用した従来の
ベクター類のいずれも、使用することができる。
【００６５】 典型的には、発現ベクター類は、宿主細胞中での核酸発現に必要なすべての要
素類を含む転写ユニットまたは発現カセットを有している。典型的な発現カセッ
トは、蛋白質をコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結したプロモータを含んで
いる。前記プロモータは、好適には、その天然の配置で転写開始位置からの距離
とほぼ同距離にある非相同転写開始位置からの距離に位置している。しかし、当
該分野で公知であるように、この距離についてはプロモータ機能を失うことがな
ければいくらか変更も可能である。
【００６６】 この発現カセット中において、問題の核酸配列は、切断可能なシグナルペプチ
ド配列をコードする配列に連結でき、形質転換細胞によるコードされた蛋白質の
分泌を可能とする。発現カセットは、また、構造遺伝子の下流に転写終止領域を
含み、効率的終止を行う。終止領域は、プロモータ配列と同一の遺伝子から得る
ことができ、または、異なる遺伝子から得ることもできる。
【００６７】 哺乳類細胞中における構造遺伝子でコードされたｍＲＮＡのさらに効率的な翻
訳のため、ポリアデニル化配列も同様に、通常、前記の発現カセットに添加され
る。本発明に適した終止およびポリアデニル化配列として、ＳＶ４０由来のもの
およびすでに発現ベクター上にある遺伝子の部分ゲノムコピーが挙げられる。
【００６８】 前記の発現ベクターに加えて、多くの発現ベクター類は、最適には、連結した
同種または異種のプロモータ類から１０００倍まで転写を刺激することが可能な
エンハンサー要素類を含む。ウイルス由来の多くのエンハンサー要素類は、宿主
範囲が広く、種々の組織で活性である。例えば、初期の遺伝子エンハンサーＳＶ
４０は様々な細胞タイプに適している。本発明に適した他のエンハンサー／プロ
モータ組み合せとして、ポリオーマウイルス、ヒトまたはげっ歯類サイトメガロ
ウイルス、又は、げっ歯類白血病ウイルス、げっ歯類またはラウス肉腫ウイルス
、ＨＩＶなどの種々のレトロウイルス由来のロングターミナルリピートが挙げら
れる。 （参照：Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ（１９８３）） 上記で述べた組換え核酸類に加えて、合成核酸類またはオリゴヌクレオチド類
もまた、本発明で使用できる。本発明で使用した核酸類に関して一般的な点とし
て、当業者は、本発明で使用した核酸類がＤＮＡおよびＲＮＡ分子類の両者を含
み、また合成、非天然由来の前記のアナログ類、およびデオキシリボヌクレオチ
ド類、リボヌクレオチド類および／またはいずれかのアナログ類のヘテロポリマ
ー類が挙げられることを理解する。核酸または核酸アナログの特定の組成物は、
その物質を使用する目的とその物質を導入する環境に依存するであろう。改変ま
たは合成の非天然由来ヌクレオチド類が、種々の目的に供されるため、およびヌ
クレアーゼ類が存在する環境のような種々の環境で安定に保たれるため、設計さ
れることは、当該分野で周知である。天然のリボ−またはデオキシリボヌクレオ
チド類に比較して、改変または合成された非天然由来ヌクレオチド類は、炭水化
物（糖）、りん酸結合、ヌクレオチドの塩基部分に関して異なることがあり、ま
たは、ある場合には非ヌクレオチド塩基（または、全く塩基なし）をも含むこと
がある（たとえば、Ａｒｎｏｌｄら、ＰＣＴ特許公報 第ＷＯ ８９／０２４３
９号参照）。たとえば、本発明の改変または非天然由来の核酸類として、ビオチ
ン化核酸類、Ｏ−メチル化核酸類、メチルホスホン酸骨格核酸類、ホスホロチオ
アート核酸類、またはポリアミド核酸類を挙げることができる。
【００６９】 下記で述べるアンチセンスＲＮＡのようなオリゴヌクレオチド類は、好適には
、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ上でまたは他の市販されているオリゴ
ヌクレオチドシンセサイザー上で製造業者の取扱説明書にしたがって合成される
。オリゴヌクレオチド類は、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法のよ
うないかなる適切な方法またはその自動化された態様を用いることで、調製する
ことができる。このような自動化態様のひとつにおいて、ジエチルホスホルアミ
ダイト類は出発物質類として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９（１９８１）および米国特許第４，４
５８，０６６号に記載されたように合成することもできる。
【００７０】 Ｃ．濃縮核酸 小型のポリカチオン性分子類は、静電的荷電−荷電相互作用によって核酸類を
濃縮することが公知となっている（Ｐｌｕｍら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３０
：６３１−６４３（１９９０））。核酸のポリアミン類による前処理は、したが
って、カチオン性リポゾーム類を複合体化するための荷電部位の数を減らすこと
ができる。しかし、脂質複合体形成前に核酸を濃縮し、トランスフェクション効
率で測定したところ、脂質：核酸複合体類の保存寿命延長として驚くべき結果が
もたらされた。このような前処理によって形成された脂質：核酸複合体類は凝集
することなく、ＤＮＡに対する脂質の比率が低い場合でも安定であった。ポリア
ミン類、ポリアンモニウム分子類および塩基性ポリアミノ酸類のような有機ポリ
カチオン類、およびそれらの誘導体類も、脂質複合体形成前に核酸を濃縮するた
めに使用される。好適な態様では、スペルミジンおよびスペルミンのようなポリ
アミン類を使用し、核酸を濃縮させる（たとえば、実施例１参照）。
【００７１】 Ｄ．親水性ポリマー 最近、リポゾーム中へのＰＥＧ−ＰＥの取り込みが立体的安定性をもたらし、
血液中での循環時間が長くなるという結果が得られた（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０６６：２９−３６（１９９１）；Ｐａ
ｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８８：１１４６０−１１４６４ （１９９１））。本発明において、形成さ
れたばかりの脂質：核酸複合体類中にＰＥＧ−ＰＥ（例 総脂質の１％）を挿入
すると、保存寿命中前記複合体類の凝集を防止する。しかし、ＰＥＧ−ＰＥの取
り込みがインビボにおけるトランスフェクション活性を阻害しなかったことおよ
びインビトロトランスフェクション活性は阻害されたがこれはＰＥＧ−ＰＥ末端
に結合されたＦａｂ’断片を取り込むことで再獲得されたことは、驚くべき発見
であった。脂質：核酸複合体中における親水性ポリマー類の存在は、保存後トラ
ンスフェクション効率で測定したところ、保存寿命延長を生じる。したがって、
前記リポゾームに対してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）改変脂質類のような
親水性ポリマーまたはガングリオシドＧM1を添加することが望ましい。また、Ｐ
ＥＧは、脂肪酸類、スフィンゴリピド類、グリコリピド類およびコレステロール
のような他の両媒性分子類によって誘導体とすることができる。上記成分類を添
加すると、リポゾームへの標的部分の結合時にリポゾーム凝集を防止する。これ
らの成分類は、また、脂質：核酸複合体類の循環寿命を増大させる手段を提供す
る。
【００７２】 リポゾーム中への取り込み用ＰＥＧを調製するため、いくつかの異なる方法類
を使用することができる。ひとつの好適な態様において、ＰＥＧは、ＰＥＧ誘導
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）またはＰＥＧ誘導ジステアロ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）として取り込まれる
。ＰＥＧ−ＰＥ調製方法は周知であり、一般的に、活性化メトキシＰＥＧ（反応
末端を一つだけ有する）およびＰＥを用いることを含む。ＰＥＧ−サクシンイミ
ジルコハク酸は塩基性有機溶媒中で反応させることができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ
ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６８：２３５−２３７（１９９０））。ＰＥＧ−Ｐ
Ｅ調製の特に好適な方法は、ＰＥＧのカルボニルイミダゾールとの反応とその後
のＰＥ添加に基づいている（Ｗｏｏｄｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１７：７７−７８（
１９９０）；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４６０−１１４６４（１９９１）；Ａｌｌｅｎ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０６６：２９−３６（１９
９１）；Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１０
５：１９３−２００（１９９２）；およびＷｏｏｄｌｅら、Ｐｅｒｉｏｄ．Ｂｉ
ｏｌ．９３：３４９−３５２（１９９１）参照）。同様に、塩基性有機溶媒中シ
アヌルクロリド活性化ＰＥＧについても、Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０２９：９１−９７（１９９０）および米国特許第５
，２１３，８０４号に記載されている。全く異なる手法は、トレシルクロリド活
性化ＰＥＧを用いて前形成リポゾーム類とＰＥＧを結合させ、それをその後高ｐ
ＨでＰＥ含有リポゾーム類に添加する（Ｓｅｎｉｏｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０６２：７７−８２（１９９１））。誘導体化ＰＥＧ
は、また、市販されている。したがって、たとえば、ＰＥＧ−ＰＥは、Ａｖａｎ
ｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ）から
入手できる。当業者は、たとえばツイーンのようなＰＥＧ連結界面活性剤類のよ
うな多くの他の連結物類が利用でき、形成された脂質：核酸複合体類中へのＰＥ
Ｇ誘導脂質の挿入を理解するであろう。
【００７３】 Ｅ．Ｆａｂ’抗体断片 好適な態様において、本発明の脂質：核酸複合体類は抗体のＦａｂ’断片に結
合され、それは、Ｆａｂ’抗体断片の特異的な標的分子（例 特徴的マーカー）
を有する標的細胞を前記脂質：核酸複合体が特異的に結合できるようにする標的
部分として作用する。前記の高変異領域または特異的細胞表面リガンドと相互作
用する別のペプチド由来の小型ペプチド類は、同様に、前記複合体類に結合する
ことができる。一般的用語において、抗体のＦａｂ’断片とは、前記の可変領域
と抗体の１腕のＣH１領域を含む単量体を意味する。このような一つの好適な態
様は、実施例２において記載されている。
【００７４】 “抗体”とは、イムノグロブリン遺伝子類またはイムノグロブリン遺伝子類の
断片によって実質的にコードされた１個以上のポリペプチド類で構成されるタン
パク質を称する。認識されたイムノグロブリン遺伝子類として、カッパ、ラムダ
、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常部遺伝子類ならびに
無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子類があげられる。重鎖は、ガンマ、ミュ
ー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、それらは、それぞれ
、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのイムノグロブリン群を規定す
る。
【００７５】 塩基性イムノグロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含むことが公知で
ある。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２個の同一対から構成され、各対は、
１個の“Ｌ”鎖（約２５ｋＤ）と１個の“Ｈ”鎖（約５０−７０ｋＤ）を有して
いる。各鎖のＮ末は、本質的に抗原認識を司る約１００から１１０個以上のアミ
ノ酸類の変異可能な領域を定義する。用語可変領域Ｌ鎖（ＶL）および可変領域
Ｈ鎖（ＶH）とは、これらのＬおよびＨ鎖類をそれぞれ称している。
【００７６】 抗体類は、未変化のイムノグロブリン類としてまたは種々のペプチダーゼによ
る消化によって産生され十分に解析されたいくつかの断片類として存在すること
もできる。特に、ペプシンは、そのヒンジ領域中のジスルフィド結合以下の抗体
を消化し、Ｆａｂ’ダイマーであるＦ（ａｂ）’2を産生し、それは、それ自体
、ジスルフィド結合によってＶH−ＣH１に結合したＬ鎖である。このＦ（ａｂ）
’2は温和な条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それ
によって、Ｆ（ａｂ）’2ダイマーをＦａｂ’単量体に変換する。このＦａｂ’
単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（より多くの抗体
断片用語については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ
．Ｐａｕｌ編著、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照）。Ｆ
ａｂ’断片は未変化抗体の消化の観点から定義される一方、当業者は、このよう
なＦａｂ’断片類がデノボで化学的にまたは組換えＤＮＡ技術を利用することに
よって、合成できることを理解するであろう。
【００７７】 本発明で使用したＦａｂ’断片類は、動物（特にマウスまたはラット）または
ヒト起源の抗体類に由来することができ、またはキメラであることもできる（Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６
８５１−６８５５（１９８４））、またはヒト化することもできる（Ｊｏｎｅｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；および公表英国特許
出願第８７０７２５２）。
【００７８】 Ｆａｂ’断片は、カチオン性脂質：核酸複合体の内容物を運搬することを望む
細胞類の表面に特徴的な分子またはマーカーに特異的に結合されるように、選択
する。この分子が典型的にはその細胞種と結合して見られるかまたはこれとは別
に特定の生理的条件（例 形質転換）を発現するすべての複数の細胞種に見られ
る場合には、細胞、組織または生理的状態にこの分子は特徴的である。特異的特
徴的マーカーは、好適には、特定組織または細胞種の細胞表面上または特定生理
的条件を発現する組織または細胞の表面上に見られ、かつ、前記生物中の他の組
織または細胞種には見られない。しかし、当業者は、この程度のマーカー特異性
がしばしば必要とされていないことに気づくであろう。たとえば、特徴的細胞表
面マーカーは、非標的細胞だけが脂質：核酸複合体に到達できないならば、十分
な組織特異性を示すであろう。これとは別に、効果的特異性は、他の組織に比較
して標的組織中におけるマーカーの過剰発現によって達成できる。この結果、標
的組織による優先的取り込みが起こることになり、効果的組織特異性が生じるこ
とになる。したがって、たとえば、多くの癌は、乳癌の場合におけるＨＥＲ２（
ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｎｅｕ）プロトオンコジーンによってコードされたレセプタ
ーのような細胞表面マーカー類の過剰発現を特徴としている。
【００７９】 当業者は、標的を必要とする特定組織に応じて、良好な特徴的マーカー類を提
供する多数の表面マーカー類があることを認識するであろる。これらの細胞表面
マーカー類には、炭水化物類、蛋白質類、糖蛋白質類、ＭＨＣ複合体類、インタ
ーロイキン類、およびＨＥＲ、ＣＤ４およびＣＤ８レセプター蛋白質類のような
レセプター蛋白質類ならびに他の成長因子類およびホルモンレセプター蛋白質類
が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】 成長因子レセプター類は、特に好適な特徴的細胞表面マーカー類である。成長
因子レセプター類は、成長因子類を特異的に結合し、それによって前記特定成長
因子の細胞応答特性を媒介する細胞表面レセプター類である。本文で使用した用
語“成長因子”とは、細胞分裂または分化を活性化するかまたは刺激するかある
いは蛋白質類の運動性または分泌のような生物応答を刺激する蛋白質またはポリ
ペプチドリガンドを称する。成長因子類は当業者に周知であり、血小板誘導成長
因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様因子（ＩＧＦ）、
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、
インタロイキン２（ＩＬ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インタロイキン３（Ｉ
Ｌ３）、インタロイキン４（ＩＬ４）、インタロイキン１（ＩＬ１）、インタロ
イキン６（ＩＬ６）、インタロイキン７（ＩＬ７）、顆粒球／マクロファージコ
ロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、インタロイキン１３レセ
プター（ＩＬ１３Ｒ）などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、
本文で使用した用語成長因子が一般的にサイトカイン類およびコロニー刺激因子
類を含むことがわかるであろう。
【００８１】 特に好適なマーカー類は、成長因子レセプター類のＨＥＲファミリー中に見ら
れる。さらに具体的には、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４がさら
に好適であり、ＨＥＲ２が最も好適である。ＨＥＲレセプター類は、それ自体が
高度に特異的な抗体標的類を提供する蛋白質チロシンキナーゼ類を含む。したが
って、一の態様において、ＨＥＲ２のＰ１８５チロシンキナーゼは、本発明のイ
ムノ脂質：核酸複合体類で利用されたＦａｂ’断片に対して非常に好適な標的を
提供する。
【００８２】 前記の特徴的マーカーが天然のマーカーである必要はなく、むしろ、特定の標
的細胞に導入できることがわかるであろう。このことは、特定のマーカーで（例 マーカー付き特定標的細胞を直接注入するかまたはこれとは別に生物全体に標
的組織に選択的に取り込ませるマーカーを投与することによって）細胞または組
織に標識を直接付けることによって、可能となるであろう。一の態様において、
前記マーカーは、発現カセット中の核酸によってコードされた遺伝子産物である
ことができる。前期マーカー遺伝子は、特定標的細胞中でのみ活性であるプロモ
ーターの制御下におくこともできる。したがって、発現カセットを含有するベク
ターの導入の結果、特定標的細胞中にのみ前記マーカーの発現が生じるであろう
。当業者は、組換えＤＮＡ技術を用いて標的細胞に特徴的マーカー類を導入する
多くの手法があることを理解するであろう。
【００８３】 好適な一の態様において、標的部分は、特異的に成長因子レセプターの生成物
または成分類を結合し、特にＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｎｅｕ）プロトオン
コジーンの生成物を結合する。特に、標的部分が、通常、乳癌で過剰発現される
ＨＥＲ２、蛋白質ｐ１８５HER2によってコードされた成長因子レセプター−チロ
シンキナーゼを結合するのが好適である。（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３５：１７７−１８２（１９８７））。標的部分のための他の適切な標的類と
して、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、これらのレセプター類
の組み合せ、および癌関連の他のマーカー類が挙げられるが、これらに限定され
ない。問題の他の抗体類として、ＢＲ９６（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５３：３３４−３３９（１９９３））、ｅ２３からｅｒｂＢ２（Ｂａ
ｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５８６７−
５８７１（１９９２））、前立せん癌におけるＰＲ１（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５４７−５５１（１９
９３））および卵巣癌におけるＫ１（Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０：３７３−３８１（１９９２））が挙げられるが、それらに限定されない
。
【００８４】 本発明のイムノ脂質：核酸複合体類は、当業者に周知の種々の技術によって前
記のＦａｂ’断片をリポゾーム中または脂質中に取り込ませることによって調製
することができる。このＦａｂ’は、脂質：核酸複合体に対して、複合体形成前
または後に添加される。たとえば、ビオチン結合Ｆａｂ’は、ストレプトアビジ
ン含有リポゾームに結合できる。これとは別に、前記のビオチン化Ｆａｂ’は、
アビジンまたはストレプトアビジンリンカーによってビオチン誘導リポゾームに
結合させることができる。したがって、たとえば、ビオチン化モノクローナル抗
体は、ビオチン化し、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン含有リポゾー
ム類にアビジンリンカーという手段で付着させることができる（例 Ａｈｍａｄ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）参照）。各
脂質：核酸複合体当たり、典型的には、約３０から１２５、およびさらに典型的
には約５０から１００のＦａｂ’断片類が使用される。
【００８５】 好適な態様において、標的部分は直接リポゾームに結合させることができる。
直接結合のこのような手段は当業者に周知である（例 Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ
、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ、Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ（１９９３）参照）。これは、前記の抗体をマレイミド誘導ホスファチジルエ
タノールアミン（Ｍ−ＰＥ）またはジパルミトイルエタノールアミン（Ｍ−ＤＥ
Ｐ）のようなマレイミド誘導脂質と反応させることで、達成することもできる。
この手法は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８
８（１９８２）に詳細に記載されている。
【００８６】 ＩＩ．リポゾーム類の調製 種々の方法がリポゾーム類調製のために利用可能であり、たとえば、Ｓｚｏｋ
ａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０
）；米国特許第４，１８６，１８３；４，２１７，３４４；４，２３５，８７１
；４，２６１，９７５；４，４８５，０５４；４，５０１，７２８；４，７７４
，０８５；４，８３７，０２８；４，９４６，７８７；ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／
１７４２４；Ｓｚｏｋａ＆Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８（１９７８）；Ｄｅ
ａｍｅｒ＆Ｂａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４
３：６２９−６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８−３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８１２：５５−６５（１９８５）
；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１
−１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４２−２４６（１９８８）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｃ
ｈ．１、（Ｏｓｔｒｏ編著、１９８３）；およびＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙ
ｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）に記載されている。適切な方法として、た
とえば、音波処理、押し出し、高圧／均質化、微細粉末化、界面活性剤透析、小
リポゾーム小胞のカルシウム誘発融合、およびエーテル注入方法などが挙げられ
、全て当該分野で周知である。ひとつの方法では、不均一な大きさのマルチラメ
ラ小胞を生成する。この方法において、小胞形成脂質類は、適切な有機溶媒中ま
たは溶媒系に溶解させ、真空中または不活性気体中で乾燥させ、薄い脂質膜を形
成させる。もし所望であれば、この膜を再度三級ブタノールのような適切な溶媒
に溶解させ、その後凍結乾燥させ、より均質な脂質混合物を形成させ、これは、
より容易に水和された粉末様形態となる。この膜を水性緩衝液で被覆させ、典型
的には１５−６０分にわたり攪拌下に水和させる。生成したマルチラメラ小胞の
径分布は、前記脂質類をより強く攪拌することで水和させてまたはデオキシコー
レートのような可溶性界面活性剤を添加することで、より小さい径にシフトさせ
ることができる。
【００８７】 好適な態様において、ほとんどがユニラメラなリポゾーム類は、Ｓｚｏｋａ＆
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７５：４１９４−４１９８（１９７８）の逆相蒸留法によって産生される
。
【００８８】 ユニラメラ小胞類は、一般的に、音波処理または押し出しによって調製される
。音波処理は、一般的に、ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）チップ音波処理機のよ
うなバスタイプ音波処理機を用いて、脂質の融点で決定した制御温度で行われる
。押し出しは、リペックスバイオメンブレンエクストルーダー（Ｌｉｐｅｘ Ｂ
ｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）のような生体膜押し出し機によって
、実行することもできる。押し出しフィルター中の規定された孔径は、特定の大
きさのユニラメラリポゾーム小胞類を産生できる。前記リポゾーム類は、また、
Ｎｏｒｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡから市販されている
セラフローミクロフィルター（Ｃｅｒａｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏ ｆｉｌｔｅｒ）
のような非シンメトリックなセラミックフィルターを介しての押し出しによって
も形成することができる。
【００８９】 リポゾーム調製後、形成時には大きさが分類されていなかった前記リポゾーム
類を押し出しによって大きさをそろえ所望の大きさ範囲とし、比較的狭いリポゾ
ーム径の分布とする。約０．２−０．４ミクロンの径範囲は、前記のリポゾーム
懸濁液を、通常は０．２２ミクロンフィルターである従来のフィルターを介して
殺菌可能とする。フィルター殺菌法は、もし、リポゾーム類が約０．２−０．４
ミクロンの大きさより小さくなっていたならば、高生産性ベースで実行すること
ができる。
【００９０】 ２−３の技術は、所望の大きさにリポゾーム類をそろえるために利用可能であ
る。ひとつのサイジング法は、米国特許第４，５２９，５６１または４，７３７
，３２３に記載されている。バスまたはプローブ音波処理のいずれかによるリポ
ゾーム懸濁液の音波処理で、大きさが０．０５ミクロン未満の小型のユニラメラ
小胞類に漸次大きさを小さくすることができる。均質化は、大きなリポゾーム類
を小さなリポゾーム類に断片化するせん断エネルギーに依存している別法である
。典型的な均質化操作において、マルチラメラ小胞類は、標準的エマルジョンホ
モジナイザーによって再循環され、典型的には約０．１から０．５ミクロンの間
にある選択されたリポゾームサイズが観察されるまで再循環させる。リポゾーム
性小胞の大きさは、カイ電気光分散（ＱＥＬＳ）によってＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ
、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−４５０（
１９８１）に記載のようにして、決定することができる。平均的リポゾーム直径
は、形成されたリポゾーム類の音波処理によって小さくすることができる。間欠
的音波処理サイクルは、ＱＥＬＳ評価で変更することができ、効率的リポゾーム
合成を誘導する。
【００９１】 小孔ポリカーボネート膜または非シンメトリックセラミック膜を介したリポゾ
ームの押し出しは、同様に、リポゾームサイズを比較的よく規定されたサイズ分
布に低減するための効果的方法である。典型的には、懸濁液を１回以上、前記膜
を介して循環させ、所望のリポゾーム径分布が得られるまで循環させる。前記リ
ポゾーム類を連続的に小さくした孔を有する膜を介して押し出しで、リポゾーム
径を漸次小さくすることができる。本発明で使用するため、約０．０５ミクロン
から約０．５ミクロンのサイズを有するリポゾーム類。さらに好適であるのは、
約０．０５から約０．２ミクロンのサイズを有するリポゾーム類である。
【００９２】 ＩＩＩ．脂質：核酸複合体類の形成 安定化脂質：核酸複合体類（例 濃縮核酸および／または親水性ポリマーを有
する）が可視可能な大きな凝集物を形成しない傾向があることおよびトランスフ
ェクション効率上昇および保存寿命延長を示すことは、本発明の発見であった。
可視可能な大きな凝集物を形成しない脂質：核酸複合体類調製のための核酸／リ
ポゾーム比率は、当業者が決定できる。典型的には、この比率は、固定された量
のたとえばプラスミドのような核酸を種々の量のリポゾーム類と混合することに
よって、決定される（実施例１参照）。一般的に、脂質：核酸複合体類は、核酸
（例 プラスミドＤＮＡ）を同量のリポゾーム懸濁液中にピペット操作で注入し
急激に混合することによって、形成される。通常、５−１５ｎｍｏｌｅのＤＤＡ
ＢまたはＤＯＰＥ（上記に記載）のような脂質を含有するリポゾーム類は、１μ
ｇのプラスミドと複合体を形成するが、可視可能な大きい凝集物を形成しない。
可視可能な大きな凝集物の検査は、典型的には、顕微鏡の助けをなくして実施さ
れる。脂質および核酸量の滴定の終点は、また、インビトロまたはインビボのい
ずれかで、非安定化対照（下記に説明）と比較してトランスフェクション効率増
大をアッセイすることによって、得られる。
【００９３】 脂質：核酸複合体が大きい凝集物を形成し時間の経過とともにトランスフェク
ション活性を失わないようにするため、２つの手法を用いる：（１）ＰＥＧ−Ｐ
Ｅのような少量の親水性ポリマー（約１％モル比）を、調製後数分以内の脂質：
核酸複合体利に取り込ませること；および／または（２）リポゾーム類と混合す
る前に、前記核酸をポリアミン（例 ＤＮＡ１μｇ当たり約０．０５乃至５．０
ｎｍｏｌｅのスペルミジン）で濃縮すること。前記ポリアミン類および親水性ポ
リマーの最適量は、形成された複合体類が大きな、たとえば可視可能な凝集物類
を形成しないようにポリアミンまたは親水性ポリマーを核酸で滴定することによ
って、当業者が決定することができる。これらの脂質：核酸複合体類の大きさは
、ダイナミック光分散によって範囲４１０±１５０ｎｍであると推定できる。滴
定の終点は、また、インビトロまたはインビボのいずれかでトランスフェクショ
ン効率増大をアッセイし非安定化対照（下記に記載）と比較することで、得られ
る。
【００９４】 ＩＶ．脂質：核酸複合体類によるトランスフェクションおよび遺伝子療法 本発明は、インビトロ、インビボおよびエクスビボにおいて哺乳動物細胞のト
ランスフェクションのための保存寿命が延長した脂質：核酸複合体類および前記
複合体類を製造しトランスフェクションさせる方法類を提供する。特に、本発明
は、一部ではあるが、有機ポリカチオンに接触させることで濃縮された核酸を含
む脂質：核酸複合体が保存寿命延長を示すという予測外の発見に基づいている。
さらに、本発明は、脂質：核酸複合体形成後、脂質：核酸複合体を親水性ポリマ
ーと混合すると、高トランスフェクション活性と保存寿命延長を示し、これは保
存後のトランスフェクション活性を測定することでわかるという予測外の発見に
基づいている。このような延長された保存寿命を有する脂質：核酸複合体類は、
たとえば、細胞のインビトロおよびエクスビボトランスフェクションのために有
用であり、さらに、インビボでかつ静注投与後の哺乳類遺伝子療法のために核酸
を細胞中に運搬するために有用である。
【００９５】 脂質：核酸複合体類を用いて核酸類を異なる哺乳類細胞種に用いることで、運
搬の安全な方法と遺伝子運搬の高効率がもたらされる。脂質：核酸複合体類によ
るインビボにおける細胞類のトランスフェクションは当業者に公知であり、実施
例１に述べたように標準的手法を用いて実行できる（たとえば Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）参照）。
【００９６】 当業者は、宿主細胞中への導入に適したいかなる非相同核酸も本発明で用いる
ことができる。遺伝子療法に有用な遺伝子類は、本発明の方法類およびベクター
類を用いて哺乳類に導入できる。血液蛋白質類、酵素類、ホルモン類、リボザイ
ム類、アンチセンスＲＮＡ、ウイルス阻害剤類およびイオンチャンネル蛋白質類
をコードする遺伝子類は、遺伝子療法に有用な非相同核酸類の例である。機能的
非相同遺伝子を用いて、遺伝子療法を用いて変異遺伝子を置換することができる
。たとえば、ベータグロブリンをコードする遺伝子を用いて、ベータサラセミア
を治療することができる；さらに、ＣＦＴＲをコードする遺伝子を用いて嚢胞性
線維症を治療することができる。抗生物質耐性を賦与するもののような選択性マ
ーカー類をコードする遺伝子類は、脂質：核酸複合体でトランスフェクションさ
れた細胞を検出し単離するために用いることができる。ルシフェラーゼ、βガラ
クトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のようなレポー
タ遺伝子類が、トランスフェクション効率を決定するためのアッセイに使用でき
る遺伝子類の好適な例である。本発明の一の態様において、ルシフェラーゼはト
ランスフェクション効率を求めるためのレポータ遺伝子として使用できる。
【００９７】 レポータ遺伝子のトランスフェクション効率は、使用しているレポータ遺伝子
に適したアッセイによって求めることができる。このようなアッセイは、当業者
に公知である。たとえば、ＨＧＨレポータアッセイは、免疫学に基づいておりか
つ市販されているラジオイムノアッセイキットを用いている。本発明の好適な一
の態様において、ルシフェラーゼアッセイを用いてルシフェラーゼレポータ遺伝
子のトランスフェクションおよび発現を検出する。前記ルシフェラーゼアッセイ
は、感度が高くかつ放射能を使用しないので、好適である。ルミノメータを用い
て、実施例１に記載のようにルシフェラーゼ酵素活性を測定できる。
【００９８】 遺伝子療法は、ＨＩＶ感染のような慢性感染性疾患類ならびに癌および出生異
常のような非感染性疾患類に対処するための方法類を提供する（一般的に、Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｙｕら
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１３−２６（１９９４）参照）。遺伝子療法は、エ
クスビボまたはインビボ操作のいずれかで細胞に形質導入するために使用できる
。遺伝子療法のためのエクスビボの方法は、本発明の脂質：核酸複合体によって
哺乳類外部で細胞に形質導入することおよび前記細胞を前記生物に再度戻して導
入することを含む。前記細胞類は、骨髄から単離した造血器幹細胞または脂質：
核酸複合体類でトランスフェクション可能な他の細胞類である。
【００９９】 ヒトにおいて、造血器幹細胞は、臍帯血、骨髄、および可動化させた（ｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄ）末梢血を含む種々の起源から得ることができる。ＣＤ３４+細胞
の精製は、抗体アフィニティ操作によって達成できる（Ｈｏら、Ｓｔｅｍ Ｃｅ
ｌｌｓ １３（補遺３）：１００−１０５（１９９５）参照；Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２：７−１７（１９９３））参照）。細胞は
、また、患者から単離培養できる。これとは別に、エクスビボ操作に使用した細
胞は、細胞バンク（例 血液銀行）に保存されたものであることもできる。幹細
胞を使用する利点は、インビトロで他の細胞種に分化できること、または（細胞
ドナーのような）骨髄に移植して哺乳類に導入できるということである。ＧＭ−
ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−２８のようなサイトカイン類を用いてイン
ビトロで骨髄細胞を臨床的に重要な免疫細胞種類に分化させる方法類は、公知で
ある（例 Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（
１９９２）参照）。
【０１００】 核酸運搬は、また、インビボ遺伝子療法を用いて達成できる。本発明の脂質：
核酸複合体類は、直接、好適にはヒトである患者に投与できる。インビボおよび
エクスビボ投与は、通常、分子または細胞を血液または組織細胞に最終的に接触
させるべく導入するために使用される経路のいずれかによる。本発明の脂質：核
酸複合体類は、いかなる適切な方法によっても投与され、好適には、薬剤学的に
許容できる担体とともに投与される。
【０１０１】 このような非ウイルス性粒子類を本発明の範囲で患者に投与する適切な方法は
、当業者に公知である。好適には、前記薬剤組成物類は、エアゾール投与（例
ネブライザーまたは他のアエゾール用具を用いて）、非経口ですなわち動脈内、
静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内に投与される。さらに好適には、前記薬剤組
成物類は、エアゾール投与を介してまたは静脈内または腹腔内にボーラス注入に
よって投与される。この用途に適した特定の処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、１９８５）に見
られる。典型的には、前記処方は、好適には水性担体である許容できる担体に懸
濁した脂質：核酸複合体類の溶液を含むであろう。
【０１０２】 Ｖ．薬剤組成物類 本発明の脂質：核酸複合体類を含む薬剤組成物類は、標準的技術にしたがって
調製され、かつ、さらに薬剤学的に許容できる担体を含む。一般的に、通常の生
理食塩水を、薬剤学的に許容できる担体として使用するであろう。他の適切な単
体として、たとえば、水、緩衝水、等張液（例 デキストロース）、０．４％生
理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられるが、アルブミン、リポプロテイン
、グロブリン等のような安定性増強のための糖蛋白質類も含まれる。これらの組
成物類は、従来周知の滅菌手法によって滅菌される。生成した水性溶液類を袋に
入れ使用することもできるしまたは無菌条件下でろ過し凍結乾燥することもでき
、この凍結乾燥調製物を無菌水性溶液と組み合わせて投与できる。前記組成物類
は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム等のようなｐＨ調製および緩衝性の物質類、調整剤等のような、生理的
条件に近似させるために必要な薬剤学的に許容できる補助剤を含むことができる
。さらに、脂質：核酸複合体懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸
化性傷害に対して脂質を保護する脂質保護性物質類を含むことができる。アルフ
ァトコフェロールおよびフェリオキサミンのような水溶性鉄特異的キレート剤の
ような脂質親和性フリーラジカルクエンチャー類が適切である。
【０１０３】 脂質：核酸複合体類の前記薬剤処方中における濃度は広く変化でき、すなわち
、０．０５％未満、通常は約２−５重量％であるか少なくともそうである濃度か
ら１０乃至３０重量％まで大きく変化し、選択した投与の特定方式にしたがって
、液体量、粘度などによって主に選択されるであろう。たとえば、濃度は、治療
に関連した液体負荷量を低減させるために増加させることもできる。これは、動
脈硬化関連先天性心不全または重篤な高血圧を有する患者において特に望ましい
。これとは別に、刺激性脂質類で構成されたイムノ脂質：核酸複合体類を低濃度
に希釈して投与部位における炎症を低減させることもできる。投与した脂質：核
酸複合体の量は、使用した特定のＦａｂ’、治療している疾病状態および臨床医
の判断に依存するであろう。一般的に、投与した脂質：核酸複合体類の量は、治
療上有効量の核酸を運搬するために十分となるであろう。治療上有効量を運搬す
るために必要な脂質：核酸複合体の量は、当業者によって決定できる。典型的な
脂質：核酸複合体投与量は、一般的に、体重１ｋｇ当たり約０．０１乃至約５０
ｍｇの核酸、好適には体重１ｋｇ当たり約０．１乃至約１０ｍｇの核酸、最も好
適には体重１ｋｇ当たり約２．０乃至約５．０ｍｇの核酸である。マウス投与の
ため、この投与量は、典型的には、マウス２０ｇ当たり５０−１００μｇである
。
【０１０４】 ＶＩ．血液半減期のアッセイ 標的組織中における脂質：核酸複合体を局在化させるためのためのひとつの手
段として、投与後の血流中における脂質：核酸複合体寿命の延長がある。血流中
脂質：核酸複合体寿命のひとつの尺度は、複合体投与後の選択された時点に求め
た血液／網状系比である。典型的には、複合体の内部にまたは前記複合体を含む
脂質に結合させてのいずれかで標識（例 蛍光マーカー、電子密度反応剤または
放射性マーカー）を含有する脂質：核酸複合体類を試験生物中に注入する。その
後の一定の時点において、生物を屠殺し血液中で検出した（例 発光測定によっ
てまたはシンチレーション測定によって）標識の量を、特定組織（例 肝または
脾臓）中に局在したそれと比較する。
【０１０５】 血液中における脂質：核酸複合体類の滞留の時間的経過は、また、標識含有脂
質：核酸複合体類を投与後の一定の時点で血液をサンプリングし循環血液中に残
留している標識量を測定することによって求めることができる。結果は、当初の
投与量の分画として示すことができる。
【０１０６】 ＶＩＩ．脂質：核酸複合体類による組織トランスフェクションのアッセイ 本発明の脂質：核酸複合体類による標的細胞のトランスフェクションは、同様
に、それ自体検出可能であるかまたは検出可能な生成物をコードする核酸を含有
する脂質：核酸複合体類を投与することによって、求めることができる。血液試
料類（例 組織生検または液体試料）を次に採取し、トランスフェクションされ
た核酸それ自体を検出するかまたは前記核酸の発現生成物の存在を検出すること
によって、トランスフェクションをアッセイする。
【０１０７】 核酸それ自体は、たとえば、核酸増幅によってのように容易に検出可能な配列
を有するものが選択できる。この場合、核酸は、トランスフェクションのために
アッセイする生物組織試料中において対象核酸だけを特徴的に増幅できるように
選択されたプライマーサイトを有するように、選択されるであろう。
【０１０８】 特異的ＤＮＡ配列を検出するための手段は、当業者に周知である。たとえば、
前記領域を有する選択部分配列に対して相補性であるとして選択されたオリゴヌ
クレオチドプローブ類を使用できる。これとは別に、配列類または部分配列類を
、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ（１９９０）、リガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）（Ｗｕ＆Ｗａｌｌ
ａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅ
ｎｅ ８９： １１７（１９９０）、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３（１９８９））、および自己持
続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７：１８７４（１９９０））を含む種々のＤＮＡ増幅技術によって増幅
できるが、これらに限定されない。
【０１０９】 特に好適な態様において、トランスフェクションは、１個以上の組織中におけ
る遺伝子産物の存在または非存在を検出することによってまたは定量することに
よって評価される。容易にアッセイ可能なあらゆる遺伝子が、本アッセイのため
の適切なインジケータを提供するであろう。適切なレポータ遺伝子類は当業者に
周知である。それらには細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼ（例 Ａｌａｍ
ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８８：２４５−２５
４（１９９０）参照）が含まれるが、それらに限定されない。特に好適なひとつ
のレポータ遺伝子は、実施例に示したＦｆｌｕｘ遺伝子である。
【０１１０】 ＶＩＩＩ．保存寿命アッセイ 上記にも述べたように、用語“保存寿命”とは、前記脂質：核酸複合体がその
生物活性を失うまで（４℃の緩衝液中のような規定された条件下における）保存
可能な期間を称するものとして本文で使用している。本発明で保存寿命決定のた
めにアッセイする前記の生物活性とは、静脈注射後哺乳類細胞にトランスフェク
ションする脂質：核酸複合体の能力である。
【０１１１】 好適な態様において、保存寿命とは、脂質：核酸複合体類を種々の時間保存し
、１種以上の動物に前記複合体を注入しかつ上記のようにかつ実施例で例示した
ようにトランスフェクション用（例 レポータ遺伝子の発現）動物中における選
択された組織をアッセイすることによって、求める。
【０１１２】 保存寿命は、絶対期間ですなわち前記組成物を活性消失前に保存可能な時間的
長さであらわすことができることがわかるであろう。これとは別に、保存寿命は
、異なる組成物を参考にして相対的期間で表すこともできる。したがって、たと
えば、対象複合体が一定の保存寿命後トランスフェクション活性を示しかつこの
活性が同一時間同様に保存された異なる複合体の活性よりも高い時、対象複合体
はこの異なる複合体に比較して延長された保存寿命を有するという。
【０１１３】 ＩＸ．特異的組織への脂質：核酸複合体類の標的化 本発明の脂質：核酸複合体類とともに特異的標的部分を使用して、特異的細胞
または組織を標的とすることができる。一の態様において、抗体または抗体部分
のような標的部分を親水性ポリマーに付着させ、複合体形成後において脂質：核
酸複合体と組み合わせる。したがって、一般的エフェクター脂質：核酸複合体と
併用して標的部分を使用すると、前記複合体を特異的細胞類および組織類への運
搬のために都合よく調整できる能力が付与される。
【０１１４】 脂質：核酸複合体類中のエフェクター類の例として、サイトトキシン類をコー
ドする核酸類（例 ジフテリアトキシン（ＤＴ）、シュードモナスエクソトキシ
ンＡ（ＰＥ）、百日咳トキシン（ＰＴ）および百日咳アデニレートサイクラーゼ
（ＣＹＡ））、アンチセンス核酸、リボザイム類、標識核酸類、およびｐ５３、
ｐ１１０Ｒｂおよびｐ７２のような腫瘍抑制遺伝子類をコードする核酸類が挙げ
られる。これらのエフェクター類は、腫瘍細胞類、免疫細胞類（例 ＢおよびＴ
細胞）、および標的化部分を有する他の所望の細胞性ターゲット類のような細胞
類を標的とすることができる。たとえば、上記にも述べたように、多くの腫瘍類
は、乳癌で発現されるＨＥＲ２またはグリオーマで発現されるＩＬ１７Ｒのよう
な細胞表面マーカー類の過剰発現を特徴とする。抗ＨＥＲ２および抗ＩＬ１７Ｒ
抗体類および抗体断片類のような標的化部分を用いて、選択した細胞に脂質：核
酸複合体を運搬する。前記のエフェクター分子はしたがって特異的細胞種に運搬
され、有用かつ特異的な治療処置を提供する。
【０１１５】 Ｘ．脂質：核酸複合体キット類 本発明は、また、上述の脂質：核酸複合体類を調製するキット類を提供する。
このようなキット類は、上記のような容易に入手可能な材料類および試薬類から
調製できる。たとえば、下記の材料類のいずれかひとつまたはそれ以上を含むこ
とができる：リポゾーム類、核酸（濃縮または非濃縮）、親水性ポリマー類、Ｆ
ａｂ’断片類のような標的化部分で誘導体とした親水性ポリマー類、および指示
書類。実にさまざまなキット類および成分類を本発明にしたがって調製でき、キ
ットを使用するユーザーおよびユーザーの特定の必要性に応じて調製できる。た
とえば、このキットは、上記のように前記複合体が特異的細胞種を標的とするよ
うにいくつかの標的化部分のいずれかひとつを含むことができる。
【０１１６】 本キットは、適宜、カチオン性脂質：核酸複合体のインビボ、エクスビボまた
はインビトロにおける細胞トランスフェクションのための用途を提供する指示書
（すなわち、プロトコール類）を含めて指示材料を含むことができる。典型的に
は、前記指示材料は、また、親水性ポリマーと脂質：核酸複合体の混合方法を記
載している。さらに、前記指示材料類は、脂質：核酸複合体で細胞をトランスフ
ェクションさせる操作類を説明できる。
【０１１７】 前記指示材料類が典型的には書面のまたは印刷された材料類を含むのに対して
、それらはそれに限定されない。前記指示書類を保存可能でそれを末端のユーザ
ーに伝えることができるいかなる媒体も本発明によって考慮されている。このよ
うな媒体としては、電子保存媒体（例 磁気ディスク類、テープ類、カートリッ
ジ類、チップ類）、光媒体（例 ＣＤ ＲＯＭ）等が挙げられるが、それらに限
定されない。このような媒体は、このような指示材料を提供するためのインター
ネットサイトへのアドレス類を含むことができる。
【０１１８】 ＸＩ．表面結合蛋白質類を有する脂質性微粒子の調製 Ａ．全般 本発明は、また、表面結合蛋白質類を有する脂質性微粒子類を調製することを
提供する。上記で背景の項でも述べたように、従来技術は、抗体類のような可溶
性蛋白質類は極めて大きいため、それらの可溶化傾向が、脂質性微粒子に安定に
結合するために蛋白質に結合したリンカー分子の疎水性領域の傾向を圧倒するこ
とを示唆する。この教示は、ゆえに、およそ同一サイズかまたは大きいリンカー
分子に結合した小型のペプチド類はリンカー分子の疎水性領域が脂質性微粒子に
安定に結合するのを許す一方、蛋白質よりもはるかに小さいリンカー分子に結合
した蛋白質類はそうすることができないであろうということであった。
【０１１９】 われわれは、現在、当該従来技術の教示に反して、リンカー分子の何倍も大き
い蛋白質類がリンカー分子に結合でき、さらに安定して脂質性微粒子に良好に結
合できることを見出した。下記の実施例では、蛋白質類が結合したリンカー分子
よりも何倍も大きい蛋白質類が脂質性微粒子に良好に結合できることを示す。こ
の発見は、このような微粒子に負荷できる物質の種類を拡大する。さらに、それ
は、このような微粒子類を作成しさらに蛋白質類に結合できる方法の範囲を拡大
し、その理由として、前記結合がリポゾームのような微粒子の安定性が危険にさ
らされない条件下で起こりうることが挙げられる。
【０１２０】 好適には、本方法で使用した蛋白質類は、分子量約６，０００と約１，０００
，０００ダルトンの間を有している。さらに好適には、前記蛋白質類は、分子量
約１０，０００と約６００，０００ダルトンの間を有している。さらにより好適
には、前記蛋白質類は分子量約１５，０００と約２５０，０００ダルトンの間を
有している。最も好適には、前記蛋白質類は、分子量約２０，０００と約７５，
０００ダルトンの間を有している。
【０１２１】 Ｂ．リンカー分子類に結合した蛋白質類と脂質性微粒子類のインキュベーショ
ンによる蛋白質類の結合 本発明の用途において、蛋白質は最初に（ａ）疎水性ドメイン、（ｂ）末端で
前記の疎水性ドメインに結合した親水性ポリマー鎖、および（ｃ）蛋白質分子上
の１個以上の官能基と反応性で前記疎水性ドメインの反対側の末端あるいはその
近くで親水性ポリマー鎖に結合した化学基、を含むリンカー分子に結合できる。
このようなリンカー分子類は、当該技術で公知である（Ａｌｌｅｎ＆Ｍａｒｔｉ
ｎ、ＵＳ５，５２７，５２８；Ｓｈａｈｉｎｉａｎ＆Ｓｙｌｖｉｕｓ、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２３９：１５７−１６７（１９９５）
；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ３９：１
５３-１６１、１９９６；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３
６：６６−７５（１９９７））。
【０１２２】 前記リンカー分子の疎水性ドメインは、たとえば、ジアシルグリセロール、ホ
スホリピド、コレステロールのようなステロール、またはＮ，Ｎ−ジステアロイ
ルグリシンアミドのようなジアシルアミド誘導体であることができる。前記親水
性ポリマー鎖は、たとえば、ポリ（エチレングリコール）、ポリグリシドール、
ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオキサゾリジノン
、ポリサッカライド、または上記ポリマー類のブロックを含むコポリマーである
ことができる。化学反応基は、たとえば、アミノ基、カルボキシ基、チオール基
、マレイミド基、ヨードアセタミド基、ビニルスルホン基、アルデヒド基、ヒド
ラチン基、ケトン基、塩化シアヌル基または他の蛋白質と結合を形成できる当該
技術で公知の他のいかなる官能基であることもできる。蛋白質は、抗体、酵素、
成長因子、ホルモン、核酸結合蛋白質または特定の目的とする応用のための用途
を有する他のいかなる蛋白質であることもできる。
【０１２３】 本発明の好適な態様において、前記蛋白質は、抗体のＦａｂ’断片であるか一
本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）抗体である。さらに好適な態様において、前
記一本鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリからの選択によって産生され
たＦｖ抗体である。マレイミド基は蛋白質のシステイン残基と反応するが、Ｆａ
ｂ’抗体断片とともにまたは一本鎖抗体とともに使用するための反応基として好
適である。
【０１２４】 リンカーに対する前記蛋白質の結合は、当該技術で蛋白質結合のために公知の
いくつかの方法類のいずれかによって実施できる。好適な方法において、前記の
リンカーは水性緩衝液中に簡単に溶解させ、（それは、親水性ポリマードメイン
の存在のゆえに可能である）さらに選択した蛋白質とインキュベーションして、
前記リンカーの化学反応基と前記蛋白質の適当な官能基との間に安定な結合を形
成させることができる。前記結合物は、さらに、塩析、透析、クロマトグラフィ
および他の蛋白質精製の分野で公知の他の方法類によって、過剰のリンカーおよ
びあらゆる未結合蛋白質から精製される。これとは別に、前記結合物をさらに精
製することなく、用いることができる。
【０１２５】 前記結合物の疎水性ドメインが前記粒子の表面脂質層中へ出るために十分な時
間、結合蛋白質をその後水性媒体中で脂質性微粒子類とインキュベーションする
。必要な時間は、前記微粒子の脂質組成、疎水性ドメインの性質、およびインキ
ュベーション温度に依存するであろう。典型的には、インキュベーション時間は
、約１分から約５０時間の範囲にある。インキュベーションに必要な時間は、イ
ンキュベーション実施温度が上昇するに伴い、短くなるであろう。したがって、
３７℃において前記インキュベーションは通常一晩かかるが、５５−６０℃にお
いて前記インキュベーションは通常５−６０分であり、１５−３０分が好適であ
る。微粒子、疎水性ドメインおよび温度のいかなる特定の組み合せにも適したイ
ンキュベーション時間は、下記の実施例で教示したアッセイを用いて、求めるこ
とができる。
【０１２６】 Ｃ．脂質性微粒子に自己挿入するであろう疎水性ドメインを含有する蛋白質類
の調製 別の態様では、疎水性アンカーおよび親水性ポリマー鎖が組換えＤＮＡおよび
蛋白質工学方法によって蛋白質分子中に導入される。この場合、上記に述べた親
水性高分子性ドメインは、主に親水性側鎖を有するアミノ酸類を含有する末端付
加ポリアミノ酸配列によって、問題の蛋白質に導入される。疎水性アンカーは、
末端付加ポリアミノ酸配列の遠位端に位置する脂質改変部位を介して、その生合
成時にその構築体中に導入される。
【０１２７】
【実施例】
本発明を下記の実施例によって例示する。これらの実施例は、例示のために示
しており、本発明を限定するためではない。
【０１２８】 （実施例１） インビボ遺伝子運搬のための安定脂質：核酸複合体類の調製 Ａ．材料類および方法類 １．脂質類＆他の試薬類 ＤＯＰＥは、Ａｖａｎｔｉ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。高度
精製コレステロールは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）か
ら入手した。ＤＤＡＢおよびデキストラン（分子量４０、０００）は、Ｓｉｇｍ
ａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。 ＤＤＡＢは、アセトン−メタノ
ール溶液から一度再結晶した。Ｄ−ルシフェリンは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍから購入した。ＰＥＧ−ＰＥは、Ｓｅｑｕｕｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から供与された。ＤＣ−Ｃｈ
ｏｌ、ＭＭＣＥおよびＤＯＧＳは、ＵＣＳＦ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖ
ｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｒｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒから
入手した。ＥＳＰＭ、ＤＯＴＡＰ，ＰＯＥＰＣ、ＤＯＥＰＣ，ＤＭＥＰＣおよび
ＤＯＤＡＰは、Ａｖａｎｔｉ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から供与された。各
脂質のクロロホルム溶液は、密封されたアンプル中で−４０℃のアルゴン中で保
存した。可能な限り高い等級の他の試薬類は、購入後さらに精製することなく使
用した。
【０１２９】 ２．リポゾーム類の調製 小型のカチオン性リポゾーム類は、下記のようにして５％（ｗ／ｖ）デキスト
ロース溶液中で調製した。クロロホルム中ＤＤＡＢまたは他のカチオン性脂質類
は、ＤＯＰＥまたは／およびコレステロールと所望のモル比で混合し、溶媒をゆ
っくりとロータリエバポレータで５０℃で減圧下で除去した。５０℃に前加温し
た５％デキストロース溶液で乾燥した脂質膜を水和させ、容器をアルゴン中で密
封した。水和脂質懸濁液をバスソニケータ（Ｌａｂ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｈｉｃ
ｋｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｙ．）中で５−１０分間、５０℃で音波処理した。リポゾー
ム類の最終濃度は５ｍＭカチオン性脂質であり、リポゾーム類の大きさは、ダイ
ナミック光分散によって測定し、１９５±６５ｎｍであった。音波処理したリポ
ゾーム類を使用するまで、４℃でアルゴン中に保存した。
【０１３０】 ３．ルシフェラーゼレポータ系 プラスミドｐＣＭＶ／ＩＶＳ−ｌｕｃ＋は、下記のようにして構築した。ＣＭ
Ｖプロモータおよび合成ＩｇＥイントロンを、含有する断片をｐＢＧｔ２．ＣＡ
ＴからＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切りとり、ｐＢＳＩＩＫＳ+中に
クローニングした。ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルを含む改変蛍ルシフェラー
ゼ（ｌｕｃ＋）をコードするｃＤＮＡを、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ
（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによって切断し、前記切
断部の下流のｐＢＳ−ＣＭＶ−ＩＶＳクローンに入れた。Ｑｉａｇｅｎ社（Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）によって採択され考案されたアルカリ融解操作法を用
いて、プラスミド類を精製した。プラスミド純度は、２６０ｎｍ対２８０ｎｍの
吸光度比によって測定し、１−２ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌお
よび１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ｐＨ８．０の緩衝液中に保存した。
【０１３１】 ４．トランスフェクション複合体類の調製 トランスフェクション実験前に、一定量のプラスミドを種々の量のリポゾーム
類に対して混合することによって、大きい凝集物ではない複合体類を形成するた
めの最適ＤＮＡ／リポゾーム比を求めた。一般に、トランスフェクション複合体
類は、プラスミドを等量のリポゾーム懸濁液中にピペット操作でいれその後急激
に混合することによって、形成させた。通常、８−１２ｎｍのＤＤＡＢを含有す
る、リポゾーム類は、可視可能な大凝集物を形成することなく、１μｇのプラス
ミドと複合体を形成するであろう。このような複合体類は、過剰の正の荷電を有
しているが、しかし、まだ、４℃における保存中に時間とともに凝集し４日後に
はトランスフェクション活性を消失する傾向がある。インビトロ実験のためには
非常に希釈された複合体類を必要とするが、１μｇＤＮＡ当たり５ｎｍｏｌｅの
ＤＤＡＢを含むカチオン性脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類（“ＣＬＤＣ”）を
使用した。脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類が大凝集物を形成しトランスフェク
ション活性を時間とともに喪失しないようにするため、２つの手法を用いた。（
１）ＰＥＧ−ＰＥのような少量の親水性ポリマー（約１％モル比）を調製後数分
以内の脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類に取り込ませること；および／または（
２）リポゾーム類と混合する前に、プラスミドをポリアミン（例 ＤＮＡ１μｇ
当たり約０．０５乃至５．０ｎｍｏｌｅのスペルミジン）で濃縮すること。前記
ポリアミン類の最適量は、大凝集物形成前にＤＮＡに対してポリアミン類を滴定
することによって、決定した。これらの複合体類の大きさは、ダイナミック光分
散によって範囲４１０±１５０ｎｍであると推定された。
【０１３２】 ５．レポータ遺伝子発現のアッセイ 精製されたルシフェラーゼは、ルミノメータを校正し相対的ルシフェラーゼ比
活性の対照スタンダードを構築するための標準として、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した。組織抽出物中におけるレポータ遺伝子発現は、
ルミノメータで測定した相対的光単位を標準曲線に従って重量単位に変換するこ
とによって、ナノグラム量で示した。細胞または組織中で発現したルシフェラー
ゼは、化学的細胞溶解によって抽出した。効果的な溶解緩衝液は、ｐＨ７．８の
０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴおよ
び２ｍＭのＥＤＴＡで構成されていた。
【０１３３】 雌性ＣＤ１マウス（４−６週齢、約２５ｇ体重）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスに対して、脂質：プラスミドＤ
ＮＡ複合体類を尾静脈注入によって投与し、２４時間後屠殺した。麻酔動物を、
心穿刺によって冷りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で潅流した。各組織を切除し
ＰＢＳで洗浄し、その後、溶解緩衝液５００μｌを含有する６ｍｌの丸底培養試
験管中でホモジナイズした。試料をときどき混合しながら室温に２０分間保持し
た。ホモジナイズされた試料を、エッペンドルフ遠心機により３０００ｒｐｍで
１０分間、遠心分離した。各組織のルシフェラーゼ活性は、再構成ルシフェラー
ゼ基質１００μｌを、２０μｌの組織ホモジネート上清とともにルミノメータの
注入系で混合し、測定した。ピーク光放出を２０℃で１０秒間、測定した。各試
料の相対的光単位は、各実験群について確定した標準曲線と比較することによっ
て、組織抽出物中におけるルシフェラーゼ量に変換させた。前記抽出物の蛋白質
含量は、蛋白質アッセイキットを用いて求めた（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、ＣＡ）。バックグランドは、溶解緩衝液のみのカウントとした。
【０１３４】 ＳＫ−ＢＲ−３細胞（Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９２：１３２７−１３３１（１９９５））は、１０％熱不活化ウシ胎児
血清添加ＭｃＣｏｙ’ｓの媒体中および５％ＣＯ2中で培養した。単層培養にお
けるＳＫ−ＢＲ−３細胞類は、１２穴プレート中の各ウェル当たり５００００細
胞で添加し、一晩攪拌した。各ウェルには、複合体形成２０分以内に、０．５−
１μｇのｐＣＭＶ／ＩＶＳ−ｌｕｃ＋を入れた。細胞を、３７℃において複合体
類と２４時間インキュベーション後、採取した。細胞中のルシフェラーゼ活性は
、上記のようにして求めた。
【０１３５】 Ｂ．結果 １．“ヘルパー”脂質の最適化 カチオン性リポゾーム類のインビトロ遺伝子運搬のための使用は、Ｆｅｌｇｎ
ｅｒらがかれらの研究を公表して以降、広く普及した（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７（１９８７
））。後日、ＤＯＰＥがインビトロ遺伝子トランスフェクションのためのこれま
でで最も効率的な“ヘルパー”脂質であることが確立され（Ｆｅｌｇｎｅｒら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４））、この結
果は、数箇所の研究室で確認された（Ｆａｒｈｏｏｄら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ｆｏｒ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｐｐ．２３−５５（
Ｈｕｂｅｒ＆Ｌａｚｏ編著、１９９４）；Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９：１９５−２０３（１９９４））。インビトロ研
究に基づいて、いったん正に荷電された脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類が細胞
膜に結合すると、ＤＯＰＥは、膜融合によって細胞質運搬を促進することができ
ると示唆されている（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＢｉｏＰｈｙｓ．Ａｃｔａ
．１１８９：１９５−２０３（１９９４））。ＦｒｉｅｎｄらはＤＯＴＭＡ／Ｄ
ＯＰＥ脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類が直接形質膜に融合することの形態的証
拠を全く得ているというものではないものの、彼らは、融合事象の可能性を排除
していない（Ｆｒｉｅｎｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＢｉｏＰｈｙｓ．Ａｃｔａ １
２７８：４１−５０（１９９６））。彼らは、前記複合体類がエンドサイトーシ
スの作用を受けカチオン性脂質類がエンドソーム性／ライソゾーム性の膜を破壊
し、その後ＤＮＡ複合体類が細胞質に逃げ込み最終的に核内に入りこむのを促進
すると示唆している。
【０１３６】 多くの予測に違い、インビトロ研究から確立されたＤＯＰＥの“ヘルパー”の
役割は、前記複合体類の静脈注射後インビボ遺伝子運搬について明確ではない。
ＤＯＰＥがＤＤＡＢカチオン性リポゾーム中に包含されると、このインビボ遺伝
子トランスフェクションは、阻害された。このＤＯＰＥ依存性の阻害を図１に示
した。ＤＯＰＥではなくコレステロールがインビボ遺伝子運搬のために“ヘルパ
ー”脂質として効果的であることがわかった。コレステロールの半分をＤＯＰＥ
に置換すると、マウス肺中でルシフェラーゼ発現が１０分の１に減少する。ＤＤ
ＡＢおよび他のカチオン性リポゾーム類のインビボ結果は、ＤＯＰＥが適切な“
ヘルパー”脂質であるという一般的想定と矛盾している。反対に、カチオン性脂
質：プラスミドＤＮＡ複合体類中のＤＯＰＥは、ＤＯＰＥがインビボ遺伝子運搬
のための処方において阻害剤としてみなされる程、インビボトランスフェクショ
ンを減弱させる。コレステロールは、最近公表された報告でインビボ研究のため
に選択されており（Ｌｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８６４−
７０（１９９５）；Ｓｏｌｏｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１３
５３７−４４（１９９５））、著者らは、いかにしておよびなぜかれらがその実
験計画に異なる“ヘルパー”脂質類を選択したのか、すなわち、インビトロには
ＤＯＰＥおよびインビボ研究にはコレステロールを選択したのかについて、十分
に記載していない。アニオン性および中性リポゾーム類の血液中におけるコレス
テロールによる安定化は、長い間公知であった（Ｍａｙｈｅｗら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６３：１９２３−１９２８）１９７９）。したがって、
全身遺伝子運搬について、血液中脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の安定性を検
討しなければならないのは明白で、その種々の成分類は、大分子の複合体類と反
応することが公知である。実際、脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の種々の処方
についての凍結割断電子顕微鏡を用いた予備的研究では、コレステロール含有複
合体類が血清存在下においてＤＯＰＥ含有複合体類よりもより構造的に安定であ
ることを示している。
【０１３７】 インビボトランスフェクション実験用ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ脂質：プラスミドＤ
ＮＡ複合体類（８ｎｍｏｌｅ ＤＤＡＢ／μｇＤＮＡ）を用いて、２５ｇマウス
の肺中における検出可能なルシフェラーゼ発現は、３０μｇから６０μｇの範囲
のＤＮＡ量を必要とした。通常、マウス１匹当たり４０(６０μｇのプラスミド
ＤＮＡが一貫した遺伝子発現を起こした。各マウス当たり通常行われている８０
μｇ（またはそれ以上）のＤＮＡを伴うＤＤＡＢの量は、この動物に毒性が強す
ぎることがわかった。種々の組織中におけるルシフェラーゼの発現を図２に示し
てある。前にも観察されているように（Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２
０９−２１１（１９９３）；Ｌｉｅら、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２
４８６４−７０（１９９５）；Ｓｏｌｏｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３４：１３５３７−４４（１９９５））、最大発現は、肺組織で見られた。注入
プラスミド６０μｇに対して、組織蛋白質１ｍｇ当たり１−２ｎｇのルシフェラ
ーゼが通常得られた。図３は、肺組織中におけるレポータ遺伝子発現の持続時間
を示している。ルシフェラーゼ発現は、急激に低下し、２週後には検出不可能な
レベルになった。Ｚｈｕらは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（１：１）−プラスミド複
合体類の成熟マウスへの静脈注射後、前記レポータ遺伝子（ＣＡＴ）の発現が種
々の組織に広がり、最大発現は総脂質類８ｎｍｏｌｅに対してプラスミド１μｇ
の比率の複合体類から得られることを示唆する（Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６１：２０９−２１１（１９９３））。しかし、この比率（カチオン性脂質４ｎ
ｍｏｌｅに対するプラスミド１μｇに対応する）では、ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ脂質
：プラスミドＤＮＡ複合体類は凝集する傾向があり、本研究では測定可能な遺伝
子発現を生じなかった。
【０１３８】 異なるレポータ遺伝子類が異なる研究室で用いられたきたので、インビボ遺伝
子運搬の効率の変動をリポゾーム類処方の変化に帰することが困難である。前記
文献の結果を直接比較するため、ルミノメータで測定したルシフェラーゼ活性の
相対的光単位類を精製ルシフェラーゼのスタンダードに対して変換した。そうす
ることによって、ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ処方のピークトランスフェクション活性は
、最近相当する実験で報告された値よりも３桁も高かった（Ｔｈｉｅｒｒｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４２−９７４６（
１９９５））。実験計画において同一プロモータとともに同一レポータ遺伝子と
すると、発現における差は、リポゾーム処方の選択を反映することができる。実
際、ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌは、最近スクリーニングした１８種の異なるカチオン性
脂質類由来の多くの処方中、最も効率的な遺伝子運搬担体（ビーヒクル）のひと
つであった。静脈注射後のマウス肺における発現の予備的結果は、ＤＯＴＭＡ／
Ｃｈｏｌ，ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ，ＭＭＣＥ／ＣｈｏｌおよびＥＳＰＭ／Ｃｈｏ
ｌがＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌの１０−１００％のトランスフェクション活性を示し、
ＤＯＧＳ／Ｃｈｏｌ，ＰＯＥＰＣ／Ｃｈｏｌ，ＬＹＳＰＥ／ＤＯＰＥおよびＤＣ
−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥが、ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌの１−１０％を示し、ＤＯＥＰＣ
／Ｃｈｏｌ，ＤＭＥＰＣ／Ｃｈｏｌ，ＤＯＤＡＰ／ＣｈｏｌおよびＤＤＡＢ／Ｄ
ＯＰＥは、全く測定可能な活性を示さなかった。
【０１３９】 トランスフェクション研究と平行し、これらの複合体類の血清中および細胞培
地中における形態は、凍結割断電子顕微鏡によって検査した。５０％マウス血清
（１０分のインキュベーション時間）中で検査すると、１日齢の非安定化ＣＬＤ
Ｃは、低イオン強度の緩衝液中におけると同様、小型であるが（１００−２５０
ｎｍ）、突起物は観察されなかった。６日齢になると、５０％マウス血清中でイ
ンキュベーションした非安定化ＣＬＤＣは、球状粒子の密に充填された凝集物と
して出現し、付着粒子の数も多かった。このような処方類は、それらのインビボ
トランスフェクション活性を４日以内にすべて喪失した。残留しているフィブリ
ル状突起物は、観察されなかった。
【０１４０】 ５０％マウス血清中でインキュベーションしたＰＥＧ−ＰＥ安定化ＣＬＤＣは
、６日時点でも小型（１００−２００ｎｍ）であった。同様に、濃縮ＤＮＡで調
製したＣＬＤＣは、保存６日後でさえも同様に極めて小型であった。特に、ＣＬ
ＤＣは、構造的には血清存在下で構造的に安定な“マップピン”のような形態で
あった。
【０１４１】 細胞培地（１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０）中におけるインキュベーシ
ョン後、非安定化６日齢ＣＬＤＣは、上記に述べたマウス血清中でインキュベー
ションしたものと形態的に類似であった。しかし、これらの錯体類は、充填がよ
りゆるくフィブリル状突起物は全くなかった。類似の形態が、ＰＥＧ−ＰＥ安定
化ＣＬＤＣおよび細胞培地中でインキュベーションした濃縮ＤＮＡ ＣＬＤＣで
も観察された。
【０１４２】 ２．トランスフェクション活性のための保存寿命延長 脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の構造的安定性およびトランスフェクション
活性の関係は、これまで公表された報告ではあまり詳細に説明されていない。脂
質に対するＤＮＡの比率を変更することによって正味で負の荷電から正の荷電に
することで、脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の大きい凝集物を避けるため、ス
クリーニング操作を確立した。種々のＤＮＡ／脂質比率にある各粒子カチオン性
脂質の脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類を調製し、結果として生成した安定処方
類および準安定処方類をインビボトランスフェクションのために使用した。ＤＮ
Ａ１μｇ当たりカチオン性脂質８−１２ｎｍｏｌｅを含む複合体類は、最大のイ
ンビボトランスフェクション活性を有することがわかった。しかし、これらの複
合体類のトランスフェクション活性は、時間とともに低下した。脂質：プラスミ
ドＤＮＡ複合体類形成操作を改変することなく、数日以内に可視可能な凝集物が
あり、４℃において１ヶ月間保存した後、トランスフェクション活性は１０００
倍を超える程低下し、ほとんどバックグランドレベルまで低下した（図４）。し
たがって、保存中高いインビボトランスフェクション活性を保持できる、安定化
脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の処方が保証される。
【０１４３】 ｉ．トランスフェクション安定性の増大：ＰＥＧ−ＰＥ 新鮮形成脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類中にＰＥＧ−ＰＥ（総脂質の１％）
を挿入することは、保存時にこの複合体類が凝集することを防止できるだけでは
なく、このＰＥＧ−ＰＥ含有複合体類は、インビボにおいて妥当な高いトランス
フェクション活性を示し、ＰＥＧ−ＰＥを含まない複合体類に比較してわずかに
低い活性であった（図４）。前記複合体類中へＰＥＧ−ＰＥを取り込むことは、
ＰＥＧ−ＰＥの百分率増をもたらし、トランスフェクション活性の阻害が用量に
関連して生じることが解る（結果は示していない）。予測外ではあるが、ＰＥＧ
−ＰＥ含有複合体類を４℃において保存すると、ゆっくりではあるが当初の活性
を回復することは、図４に示した通りである。ＰＥＧ−ＰＥによるトランスフェ
クションに及ぼす阻害効果の機序面についておよび低温保存後の活性回復につい
ては、現時点では公知でない。
【０１４４】 ｉｉ．トランスフェクション安定性の増大：ポリアミン類 ＰＥＧ−ＰＥの脂質：核酸複合体類の保存寿命延長における役割に加えて、ポ
リアミンで濃縮された核酸は、また、前記複合体類の保存寿命に対して同様の予
測外の増大をもたらした。濃縮ＤＮＡで形成された脂質：プラスミドＤＮＡ複合
体類は凝集することなく、ＤＮＡに対する低比率の脂質において安定であった。
図４は、このような調製物のインビボトランスフェクション活性レベルとその保
存時の動向を示している。再び、ポリアミンで前処理せず複合体形成後すぐに使
用した試料の活性と比較した際、トランスフェクション活性の予測外の増大は、
熟成させたポリアミン処理脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類で見られた。脂質−
界面活性剤ミセル中においてプラスミドを脂質と複合体化させることによって、
安定なカチオン性脂質／ＤＮＡ複合体類を得るための異なる手法は、最近公表さ
れた（Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
３：７３０５−７３０９（１９９６））。しかし、トランスフェクション効率の
３０％しか、インビトロ１５％血清中でこのような複合体類によって保持されず
、インビボ結果については、全く報告されなかった。
【０１４５】 ｉｉｉ．トランスフェクション安定性の増大：凍結乾燥 最後に、凍結乾燥による脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の安定化のため、条
件を確立した。５％（ｗ／ｖ）デキストラン水溶液中における音波処理で懸濁さ
せたＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌで構成したリポゾーム類を、方法類で記載したようにＤ
ＮＡと１：１０比で（ＤＤＡＢ １ｎｍｏｌｅに対するＤＮＡのμｇ）で混合す
ると、活性を喪失することなく凍結乾燥できた。脂質：プラスミドＤＮＡ複合体
類を形成したデキストランの最終濃度は、８％（ｗ／ｖ）であった。凍結乾燥し
た調製物は、精製水を添加することによって再構成し、静脈注射後のマウス肺中
におけるそれらのトランスフェクション活性をルシフェラーゼレポータ遺伝子発
現によって測定した。再構成した調製物の凍結及び融解は、前記活性に影響を及
ぼさなかった（通常、組織蛋白質１ｍｇ当たり１−２ｎｇのルシフェラーゼ蛋白
質）。
【０１４６】 本文で記載したカチオン性脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類のいくつかは安定
で、４℃で長期保存後もまたは凍結乾燥後も一定したインビボトランスフェクシ
ョン活性（組織蛋白質当たり０．５から２ｎｇのルシフェラーゼ）を賦与できる
。コレステロールを“ヘルパー”脂質として含有する処方類は、はるかに高いイ
ンビボトランスフェクション効率をもたらす。前記複合体構造をＰＥＧ−ＰＥに
よって安定化することで、保存時における複合体活性を保持し、特異的組織へ標
的化するための血液中循環時間を延長させることができる。脂質複合体化の前に
ポリアミン類でＤＮＡを濃縮することで、インビトロ保存を増強しかつインビボ
活性レベルを高める。インビボにおける高トランスフェクション活性を発揮する
脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類の安定処方類を産生するための方法論的手段は
、薬剤学的に許容できる調製物を確立するための利点を供し、それゆえに、リポ
ゾームに基づいた遺伝子療法を促進する。
【０１４７】 （実施例２） 標的リガンドによる脂質：プラスミドＤＮＡ複合体類のイン
ビトロトランスフェクション Ａ．Ｆａｂ’断片の調製 Ｈ鎖およびＬ鎖のためのクローニングされたｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２配列類は、
先に記載されているように大腸菌中で同時発現された（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。抗体断片である
ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２−Ｆａｂ’は、溶連菌蛋白質Ｇ（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））によるアフィニテ
ィクロマトグラフィによって大腸菌発酵ペーストから得られ、通常、還元遊離チ
オール（Ｆａｂ’−ＳＨ）を含有する６０−９０％のＦａｂ’を得た。
【０１４８】 Ｂ．リポゾーム類の調製 濃縮ＤＮＡは、３種の異なる脂質組成物類と実施例１に記載の方法を用いて複
合体としたが、下記の改変を行った。第１の複合体は、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１
／１）により作成され、上記のようにＤＮＡのみで複合体となったカチオン性リ
ポゾーム類を生成した。第２の複合体は、ＰＥＧの最終位置でマレイミドで誘導
体とした１％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１／１）により作成さ
れ、ＤＮＡとの複合体化後添加された立体安定化成分を有するＣＬＤＣを生成し
た。第３の複合体は、ＰＥＧの最終位置にマレイミド残基に対する遊離のチオー
ル基を介して付着したヒト化抗ＨＥＲ−２抗体のＦａｂ’断片で誘導体とした１
％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１／１）により作成された。これ
によって、ＤＮＡと複合体形成後添加された立体安定化成分に付着した標的リガ
ンドを有するＣＬＤＣを産生した。
【０１４９】 Ｃ．トランスフェクションおよび結果 上記実施例１で記載したように細胞をトランスフェクションしたが、脂質：プ
ラスミドＤＮＡ複合体の保存はしなかった。２種の細胞系統をこの実施例で用い
た。第１の細胞系統はＭＣＦ−７であり、この細胞系統の細胞は、ＨＥＲ−２レ
セプターを過剰発現しない。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清を有するＤＭ
Ｅ Ｈ−２１および５％ＣＯ2中で培養した。第２の細胞系統はＳＫ−ＢＲ３細
胞類であり、それらの細胞は、ＨＥＲ−２レセプターを過剰発現し、５％ＣＯ2
中のウシ胎児血清を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地で培養した。両者の場合、
細胞（約５×１０4細胞／ウェル）は、上記のように脂質と複合体としたプラス
ミドＤＮＡ１２μｇと３７℃で４時間、トランスフェクションさせかつインキュ
ベーションした。その後上清をアスピレーションし、新鮮培地を添加し、細胞を
３７℃で２４時間インキュベーションした。細胞をその後ＰＢＳ（Ｃａ／ＭＧ非
含有）で洗浄し採取し、上記のようなルシフェラーゼアッセイのために溶解緩衝
液中に懸濁させた。
【０１５０】 図５Ａは、末端マレイミド残基を介してＰＥＧの先端で結合した標的リガンド
を有していても、ＨＥＲ−２レセプターを過剰発現しない非標的細胞のトランス
フクションがＰＥＧ−ＰＥ添加によって阻害されたことを示している。図５Ｂは
、ＨＥＲ−２レセプターを過剰発現する標的細胞のトランスフェクションがＰＥ
Ｇの添加によって同様に阻害されたが、前記のＰＥＧ−ＰＥを標的リガンドに結
合させた場合にはトランスフェクション活性が回復し促進され、それがＨＥＲ−
２レセプターを認識していることを示している。
【０１５１】 図５Ａおよび５Ｂを比較すれば、標的イムノＣＬＤＣが非標的細胞よりもはる
かに効率的に標的細胞のトランスフェクションにおいて活性であることを示唆し
ている。この結果は、抗ＨＥＲ−２−Ｆａｂ’に結合したリガンド保持安定化剤
（ＰＥＧ−ＰＥ）のゆえに起こり、それは、非標的細胞（図５Ａ）のトランスフ
ェクションを阻害するが標的細胞のトランスフェクションを促進する（図５Ｂ）
。
【０１５２】 （実施例３） リンカーマレイミド−プロピオニルアンチド−ＰＥＧ２００
０−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰ
Ｅ）の調製 ポリ（エチレングリコール）（分子量２、０００）から調製された４−マレイ
ミドプロピオニルアミド−ポリ（エチレングリコール）−アルファ−スクシンイ
ミジルカーボネート（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒｓ社）１００ｍｇ（４４ｍｍｏｌ）、ジステアロイル−ホスファチジル
エタノールアミン（ＤＳＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）３３
ｍｇ（４４μｍｏｌ）および１ｍｌのクロロホルム中トリエチルアミン１２ｍｌ
（８６μｍｏｌ）を４５℃で６時間インキュベーションした。この時点で、シリ
カによる薄層クロマトグラフィ（溶媒、クロロホルム／メタノール７：３）は、
ＤＳＰＥがよりはやく移動しニンヒドリン陰性生成物に完全に転換したことを示
唆しており、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥと同定された。この生成物を、クロロホ
ルム中のメタノールの段階的勾配（５容量％、１０容量％、１５容量％のメタノ
ール）を用いてシリカによるカラムクロマトグラフィによって精製した。純粋な
Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥが１５％メタノールで溶出された。収率は、８５ｍｇ
（理論値の６７％）であった。Ｒf０．２７−０．２９（シリカ６０、ＣＨＣｌ3 −ＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ６５：２５：４）。マレイミド基のりん酸に対する比率は、
０．９５−１．０２であった。
【０１５３】 これとは別に、このリンカーを、米国５、５２７、５２８またはＫｉｒｐｏｔ
ｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：６６−７５（１９９７））に記載の
ようにして調製することもできる。
【０１５４】 （実施例４） ＨＥＲ２オンコプロテインに反応性の抗体のＦａｂ’断片と
のＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの結合 ０．５ｍｌのクロロホルム中Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ ３００ｎｍｏｌｅを
ガラス試験管に入れ、溶媒を真空中で除去した。乾燥した残査を１ｍｌのＭＥＳ
−２０緩衝液（２０ｍＭモルホリノエタン硫酸、１４４ｍＭ塩化ナトリウム、２
ｍＭエチレンジアミン４酢酸、およびＮＡＯＨでｐＨ６．０とした）に溶解させ
た。ＨＥＲ２オンコプロテインの細胞外ドメインに対する組換えヒト化モノクロ
ーナル抗体の０．５７ｍｇ／ｍｌＦａｂ’断片類を含有する溶液２．５ｍｌをＭ
ａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液に添加し、注意しながら希釈ＮａＯＨでそのｐＨを
７．２−７．４に調整した。この混合物を室温下アルゴン中で２．５時間インキ
ュベーションし、０．２Ｍシステイン塩酸を最終濃度５ｍＭまで添加し、その反
応を停止させた。システイン添加１５分後に、反応混合物をＨＥＰＥＳ緩衝生理
食塩水（２０ｍＭヒドロキシエチルピペラジノエタンスルホン酸、１４４ｍＭＮ
ａＣｌ，ＮａＯＨでｐＨ７．２とした）に対して透析し、加圧下にＹＭ−１０膜
（Ａｍｉｃｏｎ）を介して限外ろ過によって濃縮し、０．２μｍの酢酸セルロー
スフィルタを介してのろ過によって殺菌した。この反応生成物を、ドデシル硫酸
ナトリウム存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）によって分析し、クーマシーブルー染色を行った。総蛋白質は色素結合アッセ
イ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって求めた。このアッセイで、当初の蛋白質（分子量
４６、０００）がよりゆっくりと動く生成物（分子量４９，０００）に６２％変
換されていることが明らかになった。生成物中の総蛋白質回収は、９８％であっ
た。
【０１５５】 （実施例５） ＨＥＲ２オンコプロテインに対して反応性の一本鎖Ｆｖ抗体
とのＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの結合 Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ１５０ｎｍｏｌｅを０．５ｍｌのＭＥＳ−２０に溶
解させ、ＨＥＲ２オンコプロテインの細胞外ドメインに対して反応性の０．７ｍ
ｇ／ｍｌの一本鎖Ｆｖ抗体Ｃ６．５Ｃｙｓ含有溶液０．５ｍｌと反応させた。こ
の抗体は、Ｓｈｉｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：７３−８１（
１９９５））によって記載されているように、調製した。反応および生成物アッ
セイは、上記実施例に記載のように実行した。総蛋白質回収は、８６％であった
。回収された蛋白質（分子量２７、０００）の約５２％が、高分子量（分子量２
９、０００−３０、０００）を有する生成物の形態であり、予測した結合物に一
致していた。
【０１５６】 （実施例６） 結合抗−ＨＥＲ２Ｆａｂ’断片類を有しかつ蛍光ｐｈ感受性
インジケータを負荷したイムノリポゾーム類の調製 トラップされたｐＨ感受性蛍光インジケータ８−ハイドロキシピレントリスル
ホン酸を含有する小型（１００ｍｍ）のユニラメラリポゾーム類を、１−パルミ
トイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ）、コレステロ
ール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびメトキシポリオキシエチレングリコール（
分子量１９００）誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｓｙｇ
ｅｎａ）をモル比３０：２０：３でＫｉｒｐｏｔｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，３６：６６−７５（１９９７））の混合物中で調製し、０．２μｍｏｌの
酢酸セルロースフィルターでろ過滅菌した。ホスホリピド類２μｍｏｌ含有リポ
ゾーム調製物を０．２６ｍｌを、上記実施例４にしたがい調製した抗ＨＥＲ２−
Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物１００μｇ含有溶液０．１０６ｍｌと混合し
、３７℃で一晩攪拌した。インキュベーション後、未結合物質からＨＥＰＥＳ−
緩衝生理食塩水を溶離液として用いて、前記リポゾーム類をセファロース４Ｂ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を入れたカラム上でゲルろ過によって分離した。このリポ
ゾーム類は、カラムボイドボリュームのところに溶出した。リポゾーム結合蛋白
質の量はＢｉｏ−Ｒａｄ色素結合アッセイによって求め、リポゾーム濃度は、モ
リブデート法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎａｌ．ＢｉｏＣｈｅｍ．，７：２１８−
２２４（１９６４））を用いて総りん酸によって求めた。前記リポゾーム類のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（下記の実施例１３参照）は、抗ＨＥＲ２Ｆａｂ’−ＰＥＧ−Ｄ
ＳＰＥ結合物の存在を示唆したが、前記リポゾーム調製物中に遊離の抗ＨＥＲ２
Ｆａｂ’はなかった。リポゾーム会合蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって（実
施例１３参照）定量し、添加したＦａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物の前記リポ
ゾーム類との結合は、投入蛋白質／ホスホリピド比に対する取り出した蛋白質／
ホスホリピド比の百分率として示した。Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのリポゾー
ム類への結合は、８０％であった。リポゾーム類との蛋白質−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ
結合物とのインキュベーション時におけるリポゾーム類からのＨＴＰＳのもれは
、２％未満であった。
【０１５７】 （実施例７） 結合抗−ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体類を有しかつ蛍光ｐＨ感受性
インジケータを負荷したイムノリポゾーム類の調製 実施例６の操作を用いて、実施例５にしたがって得られた抗ＨＥＲ２一本鎖Ｆ
ｖ Ｃ６．５ＣｙｓのＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとの結合物を、リポゾームホス
ホリピド１μｍｏｌ当たり蛋白質１５．６μｇの投入比率でＨＰＴＳ負荷リポゾ
ーム類とインキュベーションした。未結合物質をセファロース４Ｂ上でのゲルろ
過によって分離した後、前記リポゾーム類を実施例６に記載のようにアッセイし
た。取り出した蛋白質／ホスホリピド比は１４．４μｇ／μｍｏｌであり、前記
リポゾーム類に対してこの結合物が９２．３％結合していることを示唆した。
【０１５８】 （実施例８） ＨＥＲ２過剰発現細胞によるリポゾーム類の取り込み ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）は、１０％ウシ胎児血清、
５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン添加ＭｃＣｏｙ
５Ａ培地中３７℃でかつ５％ＣＯ2で増殖させた。アッセイ２４時間前に、細胞
をりん酸緩衝生理食塩水中の５ｍＭ ＥＤＴＡによる処理で採取し、細胞培地１
ｍｌ中密度２００，０００細胞／ウェルで２４穴培養プレート中に入れた。リポ
ゾーム類をウェル中の細胞培地に添加し（３重検定）、最終リポゾームホスホリ
ピド濃度２５μＭを達成した。その後このプレートを４時間、ゆっくりと３７℃
でかつ５％ＣＯ2で攪拌しながらインキュベーションした。インキュベーション
後培地をウェルから吸引し、細胞層を４回、１ｍｌのりん酸緩衝生理食塩水で洗
浄し、りん酸緩衝生理食塩水中の５ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌ中に採取し、細胞に
結合しかつエンドサイトーシスを受けたリポゾーム類の量をＫｉｒｐｏｔｉｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：６６−７５（１９９７）に記載のように、
フルオロメトリによって求めた。比較のため、同様に、前記リポゾーム組成物に
先に入れたＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥによって、抗ＨＥＲ２Ｆａｂ’およびｓｃ
Ｆｖに結合させたリポゾーム類で行った。結果は下記の表に要約してある：
【０１５９】
【表１】
【０１６０】 これらのデータから明らかなように、本発明にしたがって調製した前記リポゾ
ーム類の標的細胞結合およびインタナリゼーションは、最適な先行技術で調製し
た類似のリポゾーム類のそれに比較して少なくとも同等であるかまたはそれをし
のぐことも多かった。
【０１６１】 （実施例９） 抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物による５５
℃における前製造リポゾーム性ドキソルビシンの改変による抗ＨＥＲ２イムノリ
ポゾーム性ドキソルビシンの調製 ２ｍｇ／ｍｌのドキソルビシンを含有する商業的に入手可能なドキソルビシン
（Ｄｏｘｉｌ Ｒ、Ｓｅｑｕｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）０．３
８ｍｌを、実施例６にしたがって調製した抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳ
ＰＥ結合物の調製物０．２６ｍｌと混合し、５５℃で２０分間インキュベーショ
ンし、氷水ですばやく冷却した。未結合物質および低分子量成分類を、セファロ
ース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通してインキュベーション生成物のゲ
ルろ過によって除去した。前記リポゾーム類をカラムのボイドボリューム中に集
め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて蛋白質をアッセイし、モリブデート法を用いてホ
スホリピドを、また、酸性にしたイソプロパノール中で分光分析によって（Ｅ1% 480 ＝２０８）、ドキソルビシンをアッセイした。結果：約４５Ｆａｂ’／リポ
ゾーム（添加結合物の７７％結合）、リポゾーム類からのドキソルビシンのもれ
は、観察されなかった（インキュベーション前のドキソルビシン含量は、１４５
．９μｇ／μｍｏｌホスホリピド；インキュベーション後、１５５．８^Ｚｇ／
ｍｏｌホスホリピド）。
【０１６２】 （実施例１０） 抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物による５５
℃における前製造リポゾーム性ドキソルビシンの改変による抗ＨＥＲ２イムノリ
ポゾーム性ドキソルビシンの調製 実施例９に記載のように、Ｃ６．５Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合調製物（実
施例５）０．４ｍｌおよびドキシル（Ｄｏｘｉｌ Ｒ）０．３１ｍｌを用いて改
変を実施した。結果：４８蛋白質／リポゾーム（リポゾーム類に対する定量的結
合物の結合）；薬物もれ３．７％（改変前のドキソルビシン含量は、１４５．９
μｇ／μｍｏｌホスホ；改変後、１４０．５μｇ／ｍｏｌホスホリピド）。
【０１６３】 （実施例１１） 抗ＨＥＲ２Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物による３７
℃における前製造リポゾーム性ドキソルビシンの改変による抗ＨＥＲ２イムノリ
ポゾーム性ドキソルビシンの調製 上記実施例９に記載のように、ドキシル０．３４ｍｌおよび抗ＨＥＲ２−Ｆａ
ｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合調製物（実施例４）０．２１２ｍｌを用いて改変を
実施したが、インキュベーションは３７℃で一晩とした。結果：４６Ｆａｂ’／
リポゾーム（リポゾーム類に対する添加した結合物の結合は８２％）；薬物もれ
は観察されなかった（改変前のドキソルビシン含量は、１４５．９μｇ／μｍｏ
ｌホスホリピド；改変後、１４６．０μｇ／ｍｏｌホスホリピド#）。ドキシル
（水和した大豆ホスファチジルコリン）の脂質構成物の転移温度は、５５℃に近
い。したがって、前記リポゾーム脂質類がゲル状態であるときと、同等に改変が
効果的である。
【０１６４】 （実施例１２） 抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物による３７
℃におけるドキシルの改変による抗ＨＥＲ２イムノリポゾーム性ドキソルビシン
の調製 上記実施例１１に記載のように、ドキシル０．３１ｍｌおよびＣ６．５Ｃｙｓ
−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合調製物（実施例５）０．４ｍｌを用いて改変を実施した
。結果：４９蛋白質／リポゾーム（リポゾーム類に対する定量的結合物の結合）
；薬物もれは検出されなかった（改変前のドキソルビシン含量は、１４５．９μ
ｇ／μｍｏｌホスホリピド；改変後、１５０．３．０μｇ／ｍｏｌホスホリピド
）。したがって、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物による前記リポゾーム脂質
類の改変は、リポゾーム脂質類がゲル状態であるときと、同等に改変が効果的で
ある。
【０１６５】 （実施例１３） 前記リポゾーム類中の抗体結合物の定量と実施例６−１２
により調製した結合生成物類 前記結合生成物およびリポゾーム類中の蛋白質−ＰＥＧ結合物の量を、Ｌａｅ
ｍｍｌｉ（１９７４）にしたがい、ドデシル硫酸ナトリウム存在下におけるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって、非還元性条件を用いてアッセイした。典
型的には、分析試料５−２０μｌをＳＤＳおよびトラック色素（ブロモフェノー
ルブルー）を含有する６×試料緩衝液と混合し、６０℃で１分間インキュベーシ
ョンし、さらに、１０−１２％濃度のポリアクリルアミドゲル（１０×１０×０
．０７５ｃｍ）でクロスリンカー２．６％のものにかけた。分離は、定電流３０
ｍＡで垂直のスラブゲル電気泳動装置中で行った。蛋白質バンド類は、従来の方
法を用いて、クーマシーブルー染色法によって発色させた。結合物は明確なバン
ドを形成し、当初の蛋白質よりも低い電気泳動運動性を示した。蛋白質定量のた
め、バンドを切りだし、色素を１００℃で３０分間、水性５０％ジメチルホルム
アミド中に抽出した。抽出色素の量は、５９５ｎｍにおける分光分析によって定
量し、バンド当たりの蛋白質量は、同時に実験した標準量の対応する蛋白質９（
Ｆａｂ’またはｓｃＦｖ）の類似処理バンドで産生される標準曲線と比較するこ
とで、定量した。
【０１６６】 （実施例１４） 実施例９−１２にしたがって調製した抗ＨＥＲ２イムノリ
ポゾーム類によるＨＥＲ２過剰発現癌細胞類に対するドキソルビシンの運搬 ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）を、上記実施例８に記載の
ように増殖させプレートにはん種した。抗ＨＥＲ２イムノリポゾーム性ドキソル
ビシン（上記の実施例９−１２）の調製物を、ウェル中の細胞培地に添加し（３
重検定）、リポゾームホスホリピド最終濃度２００μＭ濃度になるようにした（
ドキソルビシン０．０３０±０．００１ｍｇ／ｍｌ）。その後、このプレートを
ゆっくりと攪拌しながら４時間、３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーション
した。インキュベーション後液体をウェルから吸引し、細胞層を３回、りん酸緩
衝生理食塩水で各回１ｍｌで洗浄し、細胞をりん酸緩衝生理食塩水中で５ｍＭ
ＥＤＴＡ０．５ｍｌ中に採取し、遠心分離でペレットとし、０．３Ｎ ＨＣｌ／
５０％エタノール混合物中で抽出した。エタノ−ル−ＨＣｌ抽出物中のドキソル
ビシン量は、蛍光分光分析（励起波長、４７０ｎｍ；発光波長、５９０ｎｍ）に
よって定量し、プレートにはん種した細胞の量で規格化した。比較のため、インキ
ュベーションを同様に、リポゾーム脂質マトリックス中に取り込ませたＭａｌ−
ＰＥＧ−ＤＳＰＥリンカー類を介して抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ（Ｃ６．５Ｃｙｓ）に
結合したリポゾーム類で実施した（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、１９９７）。結合の特
異性を評価するため、いくつかのウェル中では、細胞を遊離抗ＨＥＲ２の二価の
モノクローナル抗体（抗ＨＥＲ２ＭＡｂ）５μｇと前インキュベーションした。
結果を、下記の表に要約した。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】 本発明にしたがって調製したイムノリポゾーム類は、リポゾームにカプセル化
されたドキソルビシンの標的細胞に対して、活性化リンカーを含有するリポゾー
ム類に対する抗体断片の結合という先行方法類によって調製したイムノリポゾー
ム類よりもはるかに効率的に運搬可能であった。細胞表面上の標的抗原（ＨＥＲ
２蛋白質）に反応性の遊離抗体と前記細胞類をプレインキュベーションすると、
本発明にしたがって調製したイムノリポゾーム性ドキソルビシンの取り込みが１
０倍低下した；したがって、この取り込みは、標的特異性であった。
【０１６９】 （実施例１５） 結合抗体断片類による脂質−ＤＮＡ複合体微粒子の調製 脂質−ＤＮＡ微粒子類の懸濁液（ダイナミックレーザー分散により４１０±１
５０ｎｍと大きさが測定された）はプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ／ＩＣＳ−Ｌｕ
ｃ+；１０μｇ／ｍＬ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤ
ＡＢ，６０ｎｍｏｌ／ｍＬ）および５％水性デキストロース中のジオレイルホス
ファチジルエタノールアルミン（ａｒｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ、６０ｍｎｏｌ／ｍ
Ｌ）で構成され、これは、Ｈｏｎｇら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４００：２３３−
２３７、１９９７）に記載のように調製した。Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合
物は、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥおよび抗ＨＥＲ２抗体Ｆａｂ’断片類とのモル
比４：１で、水性生理緩衝液、ＰＨ７．２で２時間、蛋白質濃度０．３ｍｇ／ｍ
Ｌで同時インキュベーションすることで、調製した。結合された抗ＨＥＲ２Ｆａ
ｂ’断片類を有する脂質−ＤＮＡ微粒子類は、少なくとも３０分間、室温で総粒
子脂質含量に対して０．５モル％の量の結合物と前記脂質−ＤＮＡ微粒子類をイ
ンキュベーションすることによって、調製した。リンカー単独（非標的対照）の
対照粒子も同様に調製したが、非結合ベータメルカプトエタノールでクエンチさ
せたＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥが、Ｆａｂ’−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物の代わり
に置換していた。
【０１７０】 （実施例１６） 結合抗体断片類を有する脂質−ＤＮＡ微粒子類による細胞
類の標的ＤＮＡトランスフェクション 上記実施例１５で調製したｐＣＭＶ／ＩＶＳ−Ｌｕｃ+ＤＮＡ−脂質微粒子類
のトランスフェクション活性は、ヒト乳癌細胞培養物中で検討した：ＳＫ−ＢＲ
−３（標的抗原ＨＥＲ２オンコプロテインを過剰発現する）およびＭＣＦ−７（
ＨＥＲ２低発現の系統）。レポータ遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現は、前記細
胞を脂質−ＤＮＡ複合体類（細胞５０−１００、０００個当たり１^ＺｇのＤＮ
Ａ）に対して１０％血清添加増殖培地中で２４時間暴露させた後ルミノメトリに
よって求め、それは、トランスフェクション効率の尺度として機能した。この実
験操作の詳細な記載については、Ｈｏｎｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４００：２
３３−２３７（１９９７）に述べられている。本発明にしたがって調製した抗Ｈ
ＥＲ２Ｆａｂ’結合ＤＮＡ−脂質微粒子類は、標的陽性のＳＫ−ＢＲ−３に対す
るプラスミド運搬について、相当する非標的粒子よりも約２５倍、より効率的で
あった。標的陰性ＭＣＦ−７細胞中において、標的および非標的ＤＮＡ−脂質粒
子類は、同等の効率を有していた。したがって、本発明により調製した抗体改変
脂質−ＤＮＡ粒子類は、ヒト癌細胞への機能的ＤＮＡの標的特異的運搬ができる
。
【０１７１】
【表３】
【０１７２】 上記の実施例は、本発明を例示するために述べられており、その範囲を限定す
るものではない。本発明の他の変化体も容易に当業者に明らかであろうし、付属
の請求の範囲によって包含される。本文に述べたすべての刊行物類、特許類およ
び特許出願類は、本文で参考として引用されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 遺伝子運搬における中性脂質の役割を例示している。３種のリポゾーム製剤に
ついて、培養細胞（ＳＫＢＲ−３、ヒト乳癌細胞）およびマウス（ＣＤ１、雌性
、２０−２５ｇ）の両者に対する遺伝子運搬を試験した。試料は、（１）ＤＤＡ
Ｂ／Ｃｈｏ１（１：１）；（２）ＤＤＡＢ／Ｃｈｏ１／ＤＯＰＥ（１：０．５：
０．５）；（３）ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１）；および（４）ＤＤＡＢ単独と
した。図１Ａは、細胞トランスフェクションを示している。ＳＫＢＲ−３は、１
２穴プレート中 に５０，０００細胞／ウェルで入れ、一晩インキュベーション
した。各ウェルに対して、ＤＤＡＢ ５ｎｍｏｌｅでリポゾームと複合体を形成
した、１μｇのプラスミドＰ−ＣＭＶ／ＩＶＳＬｕｃ＋を導入したが、それは、
。３７℃で複合体と細胞を２４時間インキュベーション後、採取した。示した値
は、ウェル２個の平均である。値は、平均の１０−３０％内に範囲していた。図
１Ｂは、マウスにおけるインビボトランスフェクションを示している。尾静脈注
射によりマウスにＤＮＡ１μｇ当たりＤＤＡＢ ８ｎｍｏｌｅの比率でリポゾー
ムと複合体化された４０μｇのＰ−ＣＭＶ／ＩＶＳ−Ｌｕｃ＋プラスミドを投与
した。示した値は、マウス２匹の平均である。値は、平均の２０−２５％内に範
囲していた。
【図１Ｂ】 遺伝子運搬における中性脂質の役割を例示している。３種のリポゾーム製剤に
ついて、培養細胞（ＳＫＢＲ−３、ヒト乳癌細胞）およびマウス（ＣＤ１、雌性
、２０−２５ｇ）の両者に対する遺伝子運搬を試験した。試料は、（１）ＤＤＡ
Ｂ／Ｃｈｏ１（１：１）；（２）ＤＤＡＢ／Ｃｈｏ１／ＤＯＰＥ（１：０．５：
０．５）；（３）ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１）；および（４）ＤＤＡＢ単独と
した。図１Ａは、細胞トランスフェクションを示している。ＳＫＢＲ−３は、１
２穴プレート中 に５０，０００細胞／ウェルで入れ、一晩インキュベーション
した。各ウェルに対して、ＤＤＡＢ ５ｎｍｏｌｅでリポゾームと複合体を形成
した、１μｇのプラスミドＰ−ＣＭＶ／ＩＶＳＬｕｃ＋を導入したが、それは、
。３７℃で複合体と細胞を２４時間インキュベーション後、採取した。示した値
は、ウェル２個の平均である。値は、平均の１０−３０％内に範囲していた。図
１Ｂは、マウスにおけるインビボトランスフェクションを示している。尾静脈注
射によりマウスにＤＮＡ１μｇ当たりＤＤＡＢ ８ｎｍｏｌｅの比率でリポゾー
ムと複合体化された４０μｇのＰ−ＣＭＶ／ＩＶＳ−Ｌｕｃ＋プラスミドを投与
した。示した値は、マウス２匹の平均である。値は、平均の２０−２５％内に範
囲していた。
【図２】 マウス組織抽出物中におけるレポータ遺伝子発現を示している。マウスに対し
て６０μｇのＤＮＡ１μｇ当たり８−ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ（１：１
）比率のリポゾームと複合体化された（スペルミジンなし）Ｐ−ＣＭＶＩＶＳ−
Ｌｕｃ＋プラスミドを（尾静脈注射により）投与した。示した値は、マウス３匹
の平均である。
【図３】 ルナマウス（ｌｕｎａ）におけるレポータ遺伝子発現の持続を示している。各
動物に対して、ＤＮＡ１μｇ当たり８ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢの比率で、ＤＤＡＢ
／Ｃｈｏｌ（１：１）のリポゾームと複合体化された、４０μｇのプラスミドＰ
−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕｃ＋を投与した。
【図４】 種々の安定化複合体類によるマウス肺中の遺伝子運搬を示している。各マウス
に対して、ＤＮＡ１μｇ当たり８ｎｍｏｌｅのＤＤＡＢ比率でＤＤＡＢ／Ｃｈｏ
ｌ（１：１）リポゾームと複合体化された、６０μｇのＰ−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕ
ｃ＋を投与した。示した値は、マウス３匹の平均である。点付棒グラフ：新鮮調
製複合体類；斜線棒グラフ：１ヶ月前の試料。試料は下記のようである：（１）
安定化剤無添加；（２）前記複合体類に対する総脂質１％でＰＥＧ−ＰＥ添加；
および（３）スペルミジン（０．５ｎｍｏｌｅ／ＤＮＡ１μｇ）を複合体形成前
にプラスミドに添加した。
【図５】 イムノリピド：ＤＮＡ複合体類による細胞系のインビトロトランスフェクショ
ンを示している。試料は、下記のようである：（１）ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：
１）は、ＤＮＡとのみ複合体を形成したカチオン性リポゾーム類を産生している
；（２）ＰＥＧの究極的位置でマレイミドで誘導体とした１％ＰＥＧ−ＰＥを有
するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１）は、ＤＮＡと複合体を形成後添加した立体安
定化成分を有するリポゾーム類を産生している；および（３）前記マレイミド残
基に対する遊離のチオール基を介して究極的位置のＰＥＧに結合したヒト化抗Ｈ
ｅｒ−２抗体のＦａｂ’断片で誘導体とした１％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ
／ＤＯＰＥ（１：１）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１２月１５日（１９９９．１２．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ホン、 キールン アメリカ合衆国 94107 カリフォルニア 州サン フランシスコ デ ハロ ストリ ート 1360 (72)発明者 ツェン、 ウェイウェン アメリカ合衆国 94112 カリフォルニア 州サン フランシスコ サンノゼ アヴェ ニュー 1915 (72)発明者 カーポティン、 ドミトリ アメリカ合衆国 94121 カリフォルニア 州サン フランシスコ フォーティーサー ド アヴェニュー 435 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA11 DA02 GA13 HA15 HA17 4C057 BB04 MM09 4C076 AA19 BB13 CC26 DD49Q DD63F EE23 FF16 FF63 4C084 AA13 MA01 MA65 NA14 ZB212 ZC192 ZC802 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA07 MA65 NA14 ZB21 ZC19 ZC80

Claims (80)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 脂質：核酸複合体の保存寿命を延長する方法で、 前記方法は、 核酸を有機ポリカチオンに接触させ濃縮核酸を製造する工程；および 前記濃縮核酸を両媒性カチオン性脂質を含む脂質と組み合わせて、前記脂質：
    核酸複合体を形成する工程を含み、前記濃縮核酸を含む前記脂質：核酸複合体は
    、前記有機ポリカチオンを欠いた同等の脂質：核酸複合体に比較して、延長され
    た保存寿命を有することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記有機ポリカチオンが、ポリアミン、ポリアンモニウムお
    よび塩基性ポリアミノ酸からなる群から選択される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ポリアミンが、スペルミンおよびスペルミジンからなる
    群から選択される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される
    請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記濃縮核酸を前記脂質と組み合わせる工程が、最初に、前
    記両媒性カチオン性脂質を含むリポゾームを形成させることを含む請求項１記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 前記濃縮核酸を前記脂質と組み合わせる工程が、前記脂質お
    よび前記核酸を１乃至２０ｎｍｏｌｅ（ナノモル）の脂質：μｇ核酸の範囲の比
    率で組み合わせることを含む請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記濃縮核酸を前記有機ポリカチオンと接触させる工程が、
    ０．０５乃至５．０ｎｍｏｌｅの有機ポリカチオン：μｇ核酸の範囲の比率で前
    記有機カチオンと前記核酸を接触させることを含む請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記方法が、 発現カセットをスペルミジンおよびスペルミンからなる群から選択されたポリ
    アミンと接触させ濃縮発現カセットを製造する工程；および 前記濃縮発現カセットを２：１から１：２のモル比のＤＤＡＢおよびコレステ
    ロールを含む脂質と組み合わせて、前記脂質：発現カセット複合体を形成する工
    程を含み、前記濃縮発現カセットを含む前記脂質：発現カセット複合体が、前記
    有機ポリカチオンを欠いた同等の脂質：発現カセット複合体に比較して、４℃に
    おいて、延長された保存寿命を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記脂質複合体が抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエ
    チレングリコールに結合させた両媒性脂質と混合されることを特徴とする請求項
    ９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記脂質：核酸複合体が凍結乾燥されている請求項１記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 脂質：核酸複合体の保存寿命を延長する方法で、 前記方法は、 核酸を両媒性カチオン性脂質に接触させ前記脂質：核酸複合体を製造する工程
    ；および 前記脂質：核酸複合体を親水性ポリマーと混合する工程を有し、前記脂質：核
    酸複合体が、前記親水性ポリマーを欠いた同等の脂質：核酸複合体に比較して、
    延長された保存寿命を有することを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
    ）、ホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（
    ＰＥＧ−ＰＥ）、ツイーンで誘導体としたポリエチレングリコール、ジステアロ
    イルホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（
    ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1からなる群から選択される請求項１２
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択され
    る請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記核酸がＤＮＡである請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記核酸を前記脂質と組み合わせる工程が、最初に、前記
    両媒性カチオン性脂質を含むリポゾームを形成させることを含む請求項１２記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 前記核酸を前記脂質と組み合わせる工程が、前記脂質およ
    び前記核酸を１乃至２０ｎｍｏｌｅの脂質：μｇ核酸の範囲の比率で組み合わせ
    ることを含む請求項１２記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記脂質：核酸複合体を前記親水性ポリマーと混合する工
    程が、前記親水性ポリマーおよび前記脂質：核酸複合体がモル比において、脂質
    ：核酸複合体内部の脂質に対し親水性ポリマーが０．１乃至１０％になるように
    混合することを含む請求項１２記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記方法が、 発現カセットを前記両媒性カチオン性脂質を含む前記脂質と組み合せ脂質：発
    現カセット複合体を製造する工程；および 前記脂質：発現カセット複合体をホスファチジルエタノールアミンで誘導体と
    したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）と混合する工程を有し、前記脂質
    ：発現カセット複合体が４℃において、ホスファチジルエタノールアミンで誘導
    体としたポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）を欠いた同等の脂質：発現カ
    セット複合体に比較して、延長された保存寿命を有する請求項１２記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記脂質が抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエチレン
    グリコールを含む請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記脂質：核酸複合体が凍結乾燥されている請求項１２記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 核酸を細胞中にトランスフェクションさせる方法で、前記
    方法は、 前記細胞を脂質：核酸複合体に接触させる工程を含み、 前記脂質：核酸複合体が、有機ポリカチオンに接触させ濃縮核酸を生成させた
    前記核酸；および両媒性カチオン性脂質を含む脂質を含み、 前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させることで、前記核酸が前記細胞中
    にトランスフェクションされることを特徴とする方法。
  23. 【請求項２３】 前記脂質：核酸複合体が、約２２℃またはそれ以下の温度
    で保存される請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記有機ポリカチオンが、ポリアミン、ポリアンモニウム
    および塩基性ポリアミノ酸からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ポリアミンは、スペルミンおよびスペルミジンからな
    る群から選択される請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記核酸が、ＤＮＡである請求項２２記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させる工程が、前
    記脂質：核酸複合体を哺乳類に全身投与することを含む請求項２２記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させる工程が、前
    記脂質：核酸複合体を哺乳類に静脈注射により投与することを含む請求項２２記
    載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記方法が、前記細胞を脂質：発現カセット複合体に接触
    させる工程を含み、前記脂質：発現カセット複合体が、 濃縮発現カセットを生成させるべくスペルミジンおよびスペルミンからなる群
    から選択されたポリアミンに接触させた発現カセットおよび前記両媒性カチオン
    性脂質を含む前記脂質を含み、前記脂質：発現カセット複合体が、約２２℃また
    はそれ以下の温度で保存されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記脂質が抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエチレン
    グリコールを含む請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 核酸を細胞にトランスフェクションさせる方法で、前記方
    法は、前記細胞を脂質：核酸複合体に接触させる工程を含み、前記脂質：核酸複
    合体が、前記核酸、両媒性カチオン性脂質を含む脂質、および親水性ポリマーを
    含み、前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させることで、前記核酸を前記細
    胞中にトランスフェクションできる方法。
  32. 【請求項３２】 前記脂質：核酸複合体が約２２℃またはそれ以下の温度で
    保存される請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
    ）、ホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（
    ＰＥＧ−ＰＥ）、ツイーンで誘導体としてポリエチレングリコール、ジステアロ
    イルホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（
    ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1からなる群から選択される請求項３１
    記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記核酸が、ＤＮＡである請求項３１記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させる工程が、前
    記脂質：核酸複合体を哺乳類に全身投与することを含む請求項３１記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記細胞を前記脂質：核酸複合体に接触させる工程が、前
    記脂質：核酸複合体を哺乳類に静注投与することを含む請求項３１記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記方法が、前記細胞を脂質：発現カセット複合体に接触
    させる工程を含み、前記脂質：発現カセット複合体が、 発現カセット； 前記両媒性カチオン性脂質を含む前記脂質；および ホスファチジルエタノールアミンで誘導体としたポリエチレングリコール（Ｐ
    ＥＧ−ＰＥ）を含み、前記脂質：発現カセット複合体が、約２２℃またはそれ以
    下の温度で保存されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記脂質が抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエチレン
    グリコールを含む請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 有機ポリカチオンに接触させて濃縮核酸とした核酸；およ
    び 両媒性カチオン性脂質を含む脂質を含み、前記脂質：核酸複合体は、前記有機
    ポリカチオンを欠いた同等の脂質：核酸複合体に比較して、延長された保存寿命
    を有することを特徴とする脂質：核酸複合体。
  40. 【請求項４０】 前記有機ポリカチオンが、ポリアミン、ポリアンモニウム
    および塩基性ポリアミノ酸からなる群から選択される請求項３９記載の複合体。
  41. 【請求項４１】 前記ポリアミンが、スペルミンおよびスペルミジンからな
    る群から選択される請求項４０記載の複合体。
  42. 【請求項４２】 前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択され
    る請求項３９記載の複合体。
  43. 【請求項４３】 前記核酸が、ＤＮＡである請求項３９記載の複合体。
  44. 【請求項４４】 前記脂質および前記核酸の量が、１乃至２０ｎｍｏｌｅの
    脂質：μｇ核酸の範囲の比率にある請求項３９記載の複合体。
  45. 【請求項４５】 前記核酸が、０．０５乃至５．０ｎｍｏｌｅの有機ポリカ
    チオン：μｇ核酸の範囲の比率で前記有機ポリカチオンと接触させられる請求項
    ３９記載の複合体。
  46. 【請求項４６】 前記複合体が、スペルミジンおよびスペルミンからなる群
    から選択された有機ポリアミンと接触させ濃縮発現カセットを生成する発現カセ
    ット；および 前記両媒性カチオン性脂質を含む前記脂質を含み、前記脂質：発現カセット複
    合体が、約４℃において、前記スペルミジンを欠いた同等の脂質：発現カセット
    複合体と比較して、延長された保存寿命を有する請求項３９記載の複合体。
  47. 【請求項４７】 前記脂質が、抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエチレ
    ングリコールを含む請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ポリカチオンで濃縮され両媒性カチオン性脂質を含む脂質
    と複合体とされた核酸を薬学的に許容できる担体中に含む薬剤組成物であって、
    前記薬剤組成物が前記有機ポリカチオンを欠いた同等の薬剤組成物と比較して延
    長された保存寿命を有することを特徴とする薬剤組成物。
  49. 【請求項４９】 前記有機ポリカチオンが、ポリアミン、ポリアンモニウム
    、および塩基性ポリアミノ酸からなる群から選択される請求項４８記載の組成物
    。
  50. 【請求項５０】 前記ポリアミンが、スペルミンおよびスペルミジンからな
    る群から選択された請求項４９記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 前記核酸が、ＤＮＡである請求項４８記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 前記脂質および前記核酸の量が、１乃至２０ｎｍｏｌｅの
    脂質：μｇ核酸の範囲の比率にある請求項４８記載の複合体。
  53. 【請求項５３】 前記組成物が、スペルミジンおよびスペルミンからなる群
    から選択された有機ポリアミンと接触させ濃縮発現カセットを生成する発現カセ
    ット；および 前記両媒性カチオン性脂質を含む前記脂質を含み、前記組成物が、４℃におい
    て、前記ポリアミンを欠いた同等の組成物に比較して、延長された保存寿命を有
    する請求項４８記載の複合体。
  54. 【請求項５４】 前記脂質が、抗体のＦａｂ’断片に結合させたポリエチレ
    ングリコールを含む請求項５３記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 脂質：核酸複合体を調製するためのキットで、前記キット
    は、 （ｉ）リポゾーム含有容器； （ｉｉ）核酸含有容器；および （ｉｉｉ）親水性ポリマー含有容器を含み、 前記リポゾームおよび核酸を混合し前記脂質：核酸複合体を形成させることお
    よび前記脂質：核酸複合体を前記親水性ポリマーに接触させることを特徴とする
    キット。
  56. 【請求項５６】 前記親水性ポリマーが、標的部分により誘導体とされる請
    求項５５記載のキット。
  57. 【請求項５７】 前記標的部分が、Ｆａｂ’断片である請求項５６記載のキ
    ット。
  58. 【請求項５８】 前記核酸が、濃縮された核酸である請求項５５記載のキッ
    ト。
  59. 【請求項５９】 リンカー分子という手段で蛋白質に結合させた脂質性微粒
    子を調製する方法であって、 疎水性ドメイン、前記疎水性ドメインに末端で結合した親水性ポリマー鎖およ
    び蛋白質分子上の１個以上の官能基と反応性でかつ前記疎水性領域の反対側の末
    端で前記親水性ポリマー鎖に結合した化学基を含むリンカー分子に結合した蛋白
    質と、脂質性微粒子とを、前記疎水性ドメインが安定に前記脂質性微粒子に結合
    するようになるまで十分な時間インキュベーションする工程を含む前記方法。
  60. 【請求項６０】 蛋白質に結合させた脂質性微粒子を調製する方法であって
    、 主に親水性側鎖を有するアミノ酸を含む末端付加アミノ酸配列を含み、前記配
    列には合成付加脂質部分による脂質改変部位が続いている蛋白質を、前記脂質部
    分が安定に前記脂質性微粒子に結合できるようになるまで十分な時間脂質性微粒
    子とインキュベーションさせる工程を含むことを特徴とする前記方法。
  61. 【請求項６１】 前記脂質性微粒子が、リポゾームである請求項５９記載の
    方法。
  62. 【請求項６２】 前記脂質性微粒子が、脂質：核酸複合体である請求項５９
    記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記脂質性微粒子が、脂質：薬物複合体である請求項５９
    記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記脂質性微粒子が、ミクロエマルジョン液滴である請求
    項５９記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記蛋白質が、抗体である請求項５９記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記蛋白質が、抗体のＦａｂ’断片である請求項５９記載
    の方法。
  67. 【請求項６７】 前記蛋白質が、一本鎖Ｆｖ抗体である請求項５９記載の方
    法。
  68. 【請求項６８】 前記蛋白質が、酵素である請求項５９記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記蛋白質が、ホルモンである請求項５９記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記蛋白質が、成長因子である請求項５９記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記蛋白質が、核酸結合蛋白質である請求項５９記載の方
    法。
  72. 【請求項７２】 前記反応基が、マレイミド基である請求項５９記載の方法
    。
  73. 【請求項７３】 前記インキュベーションが、水性媒体中で起こる請求項５
    ９記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記結合蛋白質が、精製工程を受け、それを未反応リンカ
    ーおよび未改変蛋白質からインキュベーション前に分離する請求項５９記載の方
    法。
  75. 【請求項７５】 前記精製工程が、塩析、透析およびクロマトグラフィから
    なる群から選択される請求項７４記載の方法。
  76. 【請求項７６】 請求項５９記載の方法によって蛋白質に結合させた脂質性
    微粒子。
  77. 【請求項７７】 請求項５９記載の方法によって蛋白質に結合させたリポゾ
    ーム。
  78. 【請求項７８】 請求項５９記載の方法によって蛋白質に結合させた脂質：
    核酸複合体。
  79. 【請求項７９】 請求項５９記載の方法によって蛋白質に結合させた脂質：
    薬物複合体。
  80. 【請求項８０】 請求項５９記載の方法によって蛋白質に結合させたミクロ
    エマルジョン液滴。
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