WO2009153888A1 - 薬物担体 - Google Patents

薬物担体 Download PDF

Info

Publication number
WO2009153888A1
WO2009153888A1 PCT/JP2008/063641 JP2008063641W WO2009153888A1 WO 2009153888 A1 WO2009153888 A1 WO 2009153888A1 JP 2008063641 W JP2008063641 W JP 2008063641W WO 2009153888 A1 WO2009153888 A1 WO 2009153888A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
drug carrier
production example
pharmaceutical composition
prepared
preparation
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/063641
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
暁 園家
稔浩 上田
Original Assignee
日本新薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本新薬株式会社 filed Critical 日本新薬株式会社
Priority to BRPI0822924-4A priority Critical patent/BRPI0822924A2/pt
Priority to CN2008801299723A priority patent/CN102065901B/zh
Priority to EP08791872A priority patent/EP2292270A1/en
Priority to RU2011101733/15A priority patent/RU2476204C2/ru
Priority to MX2010014087A priority patent/MX2010014087A/es
Priority to US12/997,937 priority patent/US20110098344A1/en
Priority to CA2727428A priority patent/CA2727428A1/en
Priority to JP2010517658A priority patent/JP5299424B2/ja
Publication of WO2009153888A1 publication Critical patent/WO2009153888A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system

Abstract

　本発明の目的は、主として、ポリエチレングリコール修飾リン脂質とカチオン性脂質とを含有し、かつ当該ポリエチレングリコール修飾リン脂質をある特定の濃度範囲で含有することを特徴とする薬物担体を提供することにある。 　本発明は、次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質又はその医薬上許容される塩： ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、 ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び ２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体に関するものである。

Description

薬物担体
　本発明は、新規な血中滞留型薬物担体に関するものである。
　近年、ポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡや、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用したｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の核酸医薬が注目され、盛んに研究されている。当該核酸医薬は、単独で生体内に、例えば静脈から全身投与しても患部組織に移行され難いため、例えば、核酸医薬を適当な担体に包含して投与したり、患部組織に局所投与したりするなど、一定の工夫を施して投与する必要がある。
　核酸医薬を患部組織に移行させるための薬物担体としては、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）、オリゴフェクトアミン（登録商標）等のカチオン性リポソームや、２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロール（以下、「化合物Ａ」という）とリン脂質とを必須構成成分として含有するカチオン性リポソーム（以下、「化合物Ａリポソーム」という）等を挙げることができる（例えば、特許文献１を参照）。そして、これらカチオン性リポソームは、例えば静脈から全身投与すると肝臓や脾臓に集積し易い傾向にあるため、そこに核酸医薬を包含し肝癌や肝炎の治療剤として応用することが期待されている。実際に、例えば、化合物ＡリポソームとポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡとの複合体が肝癌や肝炎の治療に有効であることが報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
　しかしながら、これらカチオン性リポソームは、核酸医薬を肝臓等に集積させるための担体としては有用であるが、血中に滞留させると共に肝臓や脾臓以外の組織（例えば、肺、腎臓、膵臓、心臓）に移行させる担体としては十分ではない。
　リポソームを構成する脂質をポリエチレングリコールで修飾することにより、細網内皮系への取り込みが抑えられるため、血中での滞留性が向上することが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
　しかしながら、ポリエチレングリコールで修飾された脂質をリポソームの構成成分として用いる場合、当該脂質の含有量を上げることにより含有医薬の薬効が発現し難くなるため、血中滞留性を付与することができる最小限の量を添加することが重要となる（例えば、特許文献４を参照）。
　ポリエチレングリコールで修飾されたジステアロイルホスファチジルエタノールアミンをリポソームの構成成分として用いた場合、リポソームを構成する全脂質に対して、４ｍｏｌ％程度配合した場合に血中滞留性が最も延長されることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
　一方で、ポリエチレングリコールで修飾された脂質を１０又は１５ｍｏｌ％程度で配合した場合に血中滞留性が延長する例も報告されている（例えば、特許文献５～９を参照）。当該特許文献５～９の記載によれば、リポソームの構成成分として用いる、ポリエチレングリコールで修飾された脂質やカチオン性脂質の構造の違いにより、得られる血中滞留性の延長効果や含有医薬の薬効発現の程度が異なる。
ＷＯ　９４／１９３１４　Ａ１ ＷＯ　９９／２０２８３　Ａ１ ＷＯ　９９／４８５３１　Ａ１ ＷＯ　２００５／０５１３５１　Ａ２ ＷＯ　２００６／０７４５４６　Ａ１ ＷＯ　２００６／００７７１２　Ａ１ ＷＯ　２００５／１２０１５２　Ａ２ ＣＡ　２２７１５８２　Ａ１ ＵＳ　２００４／０１６６１５０　Ａ１ Ｋａｚｕｋｏ　Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．５９、ｐ．４３２５－４３３３ Ｋａｚｕｋｏ　Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．１１、ｐ．４９７－５０４ 石田　竜弘ら、リポソーム応用の新展開、２００５年６月、ｐ．５２８－５３８
　本発明の目的は、主として、ポリエチレングリコール修飾リン脂質と化合物Ａとを含有する血中滞留型の薬物担体であって、当該ポリエチレングリコール修飾リン脂質をある特定の濃度範囲で含有することを特徴とする薬物担体、及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ある特定の構造を有するポリエチレングリコール修飾リン脂質と化合物Ａとを必須の構成成分として含有する薬物担体において、ポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％という高濃度で添加した場合に、高い血中滞留性を有し、且つＩｎ　ｖｉｖｏにおいて含有医薬の薬効を発揮し得ること見出し、本発明を完成した。
　本発明として、例えば、下記１及び２に記載の発明を挙げることができる。
　１．次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質（以下、単に「ＰＥＧ修飾リン脂質」という）又はその医薬上許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び
化合物Ａを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるＰＥＧ修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体（以下、「本発明担体」という）。
２．医薬を包含する、本発明担体を含有する医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。
　Ｒ1に係る炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基としては、例えば、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１７～２０の飽和の直鎖脂肪酸残基が好ましく、ステアロイルがより好ましい。
　ｎは、３０～１５０の範囲内の整数であるが、３０～１００の範囲内の整数が好ましく、３０～６５の範囲内の整数がより好ましい。
　ＰＥＧ修飾リン脂質は、遊離の酸のままで用いることができるが、公知の方法により医学上許容される塩の形にして用いることもできる。
　当該医学上許容される塩としては、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。それらの中で、特にナトリウム塩が好ましい。
　好ましいＰＥＧ修飾リン脂質としては、例えば、１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン、Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。
図１は、製造例３で合成したＰＥＧ修飾リン脂質のマススペクトルを表す。
図２は、製造例１２～１５で使用したＰＥＧ修飾リン脂質のマススペクトルを表す。
図３は、血漿中の滞留性の経時変化を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は投与後の時間（時間）を、それぞれ示す。
図４は、投与２４時間後における血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は使用したＰＥＧ修飾リン脂質の含有量（重量％）を、それぞれ示す。
図５は、投与２４時間後における血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は使用したＰＥＧ修飾リン脂質の含有量（重量％）を、それぞれ示す。
図６は、血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図７は、血漿中の滞留性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図８は、肝臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図９は、脾臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１０は、肺への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１１は、腎臓への移行性を表す。縦軸は分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１２は、癌周辺部への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｇ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１３は、癌結節への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｇ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１４は、血漿への移行性を表す。縦軸は薬物担体の濃度（μｇ／ｍＬ）を、横軸は医薬組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
図１５は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）を、横軸は癌細胞を移植してからの時間（日）を、それぞれ示す。
図１６は、本発明組成物を連続投与した場合の抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１７は、本発明組成物を間欠投与した場合の抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１８は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は生存率（％）を、横軸は癌細胞を移植してからの生存期間（日）を、それぞれ示す。
図１９は、抗腫瘍効果を表す。縦軸は膵臓重量（ｇ）を示す。
Ｉ．ＰＥＧ修飾リン脂質の製造方法
　Ｘが前記式（ＩＩ）であるＰＥＧ修飾リン脂質（Ｉａ）は、適当な塩基の存在下、下記一般式（１ａ）で表されるアミン誘導体と下記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体とを反応させることにより製造することができる。
　下記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させる際に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ジメトキシエタン若しくはこれらの混合液を挙げることができる。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン或いは炭酸水素ナトリウム水溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、ｎ、Ｒ１は前記と同義である。）
　Ｘが前記式（ＩＩＩ）であるＰＥＧ修飾リン脂質（Ｉｂ）は、下記一般式（１ｂ）で表されるアミン誘導体のアミノ基の保護基（Ｒ２）、リン酸の保護基（Ｒ３）を常法により脱保護した後に、適当な塩基の存在下、前記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させることにより製造することができる。
　Ｒ２、Ｒ３の脱保護は、両者を同時に、或いは段階的に行うことができる。Ｒ２を脱保護する試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸等の酸を挙げることができる。Ｒ３を脱保護する試薬としては、例えば、ピリジン－トリエチルアミン－水（３：１：１）の混合液、トリエチルアミンのアセトニトリル溶液、ピリジン－２－カルボキサアルドキシムとＮ１，Ｎ１，Ｎ３，Ｎ３－テトラメチルグアニジンの５０％ジオキサン水溶液、或いはトリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸等の酸を挙げることができる。
　前記一般式（２）で表されるＰＥＧ誘導体と反応させる際に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ジメトキシエタン若しくはこれらの混合液を挙げることができる。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン或いは炭酸水素ナトリウム水溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、ｎ、Ｒ１は前記と同義である。Ｒ２はアミノ基の保護基を表し、かかる保護基としては、特に制限されないが、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルを挙げることができる。Ｒ３はリン酸の保護基を表し、かかる保護基としては、特に制限されないが、例えば、メチル、シアノエチル、ｔｅｒｔ－ブチルを挙げることができる。）
　前記一般式（１ａ）で表されるアミン誘導体は、下記一般式（３）で表されるホスファチジルコリン、下記一般式（４）で表されるアミノエタノール及びホスホリパーゼＤを用いて、文献記載の方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５、ｐ．１０４８７－１０４９１）に従い製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１は前記と同義である。）
　前記一般式（１ｂ）で表されるアミン誘導体は、下記一般式（５）で表されるアミダイト化合物を、適当な活性化剤の存在下、下記一般式（６）で表されるアミノエタノールと反応させ、次いで、適当な酸化剤で酸化することにより製造することができる。
　活性化剤としては、例えば、テトラゾール、５－フェニル－１Ｈ－テトラゾールを挙げることができる。酸化剤としては、例えば、ヨウ素溶液（０．１Ｍ　ヨウ素/テトラヒドロフラン：ピリジン：水＝７：１：２）、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド溶液を挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができる。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は前記と同義である。Ｒ４はアルキルを表す。かかるアルキルとしては、特に制限されないが、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピルを挙げることができる。）
　前記一般式（５）で表されるアミダイト化合物は、適当な活性化剤の存在下、下記一般式（７）で表されるアルコールをアミダイト化することにより製造することができる。
　活性化剤としては、例えば、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド、テトラゾール、５－フェニル－１Ｈ－テトラゾール、ジイソプロピルエチルアミンを挙げることができる。アミダイト化する際に使用する試薬としては、例えば、ビス（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイト、２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、ｔｅｒｔ－ブチル　テトライソプロピルホスホロアミダイトを挙げることができる。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができる。反応温度は０℃～５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１～３０時間の範囲内が適当である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４は前記と同義である。）
　前記一般式（７）で表されるアルコールは、二量体のジヒドロキシアセトン（８）を用い、文献記載の方法（例えば、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７０、ｖｏｌ．３５、ｐ．２０８２－２０８３）に従い製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウムを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｒ１は前記と同義である。）
II．本発明担体
　本発明担体は、ＰＥＧ修飾リン脂質と化合物Ａとを必須の構成成分とするものである。具体的には、本発明担体は、リポソームや脂肪乳剤等の形態をとることができる。リポソームの形態としては、マルチラメラベシクル、シングルラメラベシクルを挙げることができる。
　化合物Ａは、国際公開第９４／１９３１４号パンフレットに記載の方法により合成することができる。
　本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質の配合量は、本発明担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内が適当であり、４０～５０重量％の範囲内が好ましい。
　本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質と化合物Ａとの配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、化合物Ａ０．２～２０重量部の範囲内が適当であり、０．５～１０重量部の範囲内が好ましく、０．７～１．３重量部の範囲内がより好ましい。
　本発明担体には、必須の構成成分であるＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ以外にリン脂質を更に加えることができる。かかるリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ホスファチジルコリン、大豆レシチンが好ましい。
　リン脂質を加える場合、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質とリン脂質との配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、リン脂質０．０３～１００重量部の範囲内が適当であり、０．０５～２０重量部の範囲内が好ましく、０．２～１．１重量部の範囲内がより好ましい。
　本発明担体には、必須の構成成分であるＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ以外にコレステロールを添加することができる。コレステロールを加える場合、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質とコレステロールとの配合比率は、ＰＥＧ修飾リン脂質１重量部に対して、コレステロール０．０１～２００重量部の範囲内が適当であり、０．０２～１００重量部の範囲内が好ましい。
　本発明担体の分散液は、例えば、ＰＥＧ修飾リン脂質及び化合物Ａ、ＰＥＧ修飾リン脂質、化合物Ａ及びリン脂質、又はＰＥＧ修飾リン脂質、化合物Ａ及びコレステロールを混合し、常法により、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。
III．本発明組成物
　本発明組成物に係る医薬を包含する本発明担体の粒子径は、特に制限されないが、例えば、５０～２００ｎｍの範囲内が適当であり、６０～１５０ｎｍの範囲内が好ましい。
　本発明組成物に用い得る「医薬」としては、例えば、水溶性陰イオン性化合物、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質を挙げることができる。具体的には、核酸化合物である一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡあるいはオリゴ核酸、酸性糖であるヘパラン硫酸やデキストラン硫酸等、サイトカイン類、サイクリックＡＭＰ、ＡＴＰやＩＰ３等のセカンドメッセンジャー類、ペニシリン類やセファロスポリン類、ビタミンＣやレチノール類等のビタミン類、その他酸性基をもった既知の医薬、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レバミゾール、ペスタチン、レチノイックアシッド、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、アデニンアラビノシド（Ａｒａ－Ａ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、アジドチミジン（ＡＺＴ）等を挙げることができる。
　合成二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．ホモポリマー・ホモポリマー複合体
　ポリイノシン酸・ポリシチジル酸、
　ポリイノシン酸・ポリ（５－ブロモシチジル酸）、
　ポリイノシン酸・ポリ（２－チオシチジル酸）、
　ポリ（７－デアザイノシン酸）・ポリシチジル酸、
　ポリ（７－デアザイノシン酸）・ポリ（５－ブロモシチジル酸）、
　ポリ（２’－アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸、
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジン－５’－チオリン酸）。
２．ホモポリマー・コポリマー複合体
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、
　ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、４－チオウリジン酸）。
３．合成核酸とポリカチオンとの複合体
　ポリイノシン酸・ポリシチジル酸・ポリ－Ｌ－リジン。
４．その他
　ポリイノシン酸・ポリ（１－ビニルシチジル酸）。
　オリゴ核酸としては、一分子内に１０～３０００、好ましくは１５～２０００、より好ましくは１８～１０００の範囲内の核酸塩基を有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの化合物を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、非コードＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマーを挙げることができる。
　上記オリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。かかる修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基をＨ、ＯＲ５、Ｒ５、Ｒ６ＯＲ５、ＳＨ、ＳＲ５、ＮＨ２、ＮＨＲ５、Ｎ（Ｒ５）２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒ５はアルキル又はアリールを表す。また、Ｒ６はアルキレンを表す。
　Ｒ５のアルキルとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。かかるアルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。かかるアルコキシとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルコキシを挙げることができる。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、特に炭素数１～３のアルコキシが好ましい。
　Ｒ５のアリールとしては、例えば、炭素数６～１０のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。それらの中で、特にフェニルが好ましい。
　Ｒ６のアルキレンとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１～６のアルキレンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２－（エチル）トリメチレン、１－（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。
　本発明組成物中に含まれる本発明担体と医薬との重量比（本発明担体／医薬）は、医薬の種類、本発明担体におけるＰＥＧ修飾リン脂質や化合物Ａの配合量等によって異なるが、０．０１～１０００の範囲内が適当であり、１０～３００の範囲内が好ましく、１００～２００の範囲内がより好ましい。更に、含有医薬がオリゴ核酸である場合には、０．０１～１００の範囲内が適当であり、１～５０の範囲内が好ましく、５～３０の範囲内がより好ましい。
　本発明組成物には、上述した本発明担体と医薬以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。
　本発明組成物は、本発明担体の分散液に医薬を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、本発明担体の製造過程において、医薬を加えることによっても調製することができる。上述した添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
　本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。液剤の場合、本発明組成物中に含まれる本発明担体の濃度は、０．００１～５０％ｗ／ｖの範囲内が適当であり、０．０１～２５％ｗ／ｖの範囲内が好ましく、０．１～１０％ｗ／ｖの範囲内がより好ましい。
　上記凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
　本発明組成物の適用疾患は、特に制限されず、例えば、癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経疾患を挙げることができる。
　本発明組成物の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができる。例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、直腸内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与、胸腔内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜投与が好ましい。また、本発明組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤を挙げることができる。
　本発明組成物の医薬としての用量は、医薬の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与形態、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して医薬量として、１日当たり０．０１ｍｇ～１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。更に、本発明組成物に含有されている医薬がオリゴ核酸である場合には、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇ～１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とする場合もある。また、１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。
　以下に、製造例、比較例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記に示される範囲に限定されるものではない。
製造例１　オリゴＲＮＡの合成
　配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの合成は、核酸自動合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　８９０９：アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、ｖｏｌ．１２、ｐ．４５３９－４５５７）に記載のアミダイト法により合成した。
　濃水酸化アンモニウム－エタノール（３／１）混合液を用いてＣＰＧより開裂させ、更に同溶液中で、５５℃で１８時間反応させることにより、塩基部分の保護基を脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて、室温で２０時間反応させることにより、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴＲＮＡを逆相クロマトグラフィーにて精製した。更に、８０％酢酸水溶液を用いて、室温で３０分間反応させることにより、５’位のジメトキシトリチル基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。得られた配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの濃度は、それぞれ３．３７ｍｇ／ｍＬ、３．４５ｍｇ／ｍＬ、１０．００ｍｇ／ｍＬ、１０．００ｍｇ／ｍＬであった。
　なお、得られたオリゴＲＮＡは、キャピラリー電気泳動により９０％以上が全長物質であることを確認した。
製造例２　トリチウムで標識されたオリゴ二本鎖ＲＮＡの合成
　トリチウムで標識された、配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡからなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｔ７　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、トリチウムで標識された［２５’８－３Ｈ］アデノシン５’－３リン酸アンモニウム塩（アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませることにより合成した。
　その後、フェノール／クロロホルム混合溶液を用いてタンパク質を除去し、更にＧ－２５スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて未反応モノマーの除去を行った。得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡの濃度は４．０７ｍｇ／ｍＬであった。また、その比放射活性は、５．３×１０５ｄｐｍ／μｇであった。
　なお、得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１５％ポリアクリルアミド電気泳動により、その鎖長が２１塩基対付近であることを確認した。
製造例３　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンの合成
工程１　１，３－ジステアロイルグリセロールの合成
　３．０ｇの二量体のジヒドロキシアセトン、２２．７ｇのステアリン酸、１６．８ｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０．８ｇの４－ジメチルアミノピリジンを１００ｍＬのジクロロメタン中、室温で終夜攪拌した。反応液に０．５Ｌのメタノールを加えて生じた粉末をろ取し、更にメタノールで洗浄した後、乾燥させた。かかる粉末６ｇを、４００ｍＬのテトラヒドロフランと２０ｍＬの１０％酢酸水溶液との混合液に懸濁し、０℃にて１．１ｇの水素化ほう素ナトリウムを少しずつ加えた。室温で６時間攪拌後、反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出操作を行い、有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を３．５ｇ得た。
工程２　ジイソプロピルアミンテトラゾリドの合成
　３６５ｍｇのテトラゾールを８ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１．２０ｇのジイソプロピルアミンを滴下した。室温で２０分間攪拌した後、反応液を減圧下で濃縮し、乾燥して目的物を８５２ｍｇ得た。
工程３　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
　上記工程１で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール１．３９ｇを、３０ｍＬのアセトニトリルと１０ｍＬのジクロロメタンとの混合液に懸濁し、４５６ｍｇの上記工程２で得られたジイソプロピルアミンテトラゾリド、１ｇのビス（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン）シアノエチルホスファイトを加えて４０℃にて１．５時間攪拌した。反応液をろ過し、ろ液を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を８００ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: １５２．２８３
工程４　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　２－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノエチルリン酸）の合成
　上記工程３で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）７００ｍｇ、１１４ｍｇのＮ－（２－ヒドロキシエチル）カルバミン酸　ｔｅｒｔ－ブチル、１１９ｍｇのテトラゾールを、０．５ｇのモレキュラーシーブス４Ａと共に５ｍＬのアセトニトリルと５ｍＬのジクロロメタンとの混合液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。反応液に２０ｍＬのヨウ素溶液（０．１Ｍ　ヨウ素/テトラヒドロフラン：ピリジン：水＝７：１：２）を加え、更に室温で２０分間攪拌した。反応液をろ過し、ろ液に飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液をヨウ素の色が無くなるまで加えた後、酢酸エチルで抽出操作を行った。有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を７００ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: ０．１２４５３
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝９２３．５６４（［Ｍ+Ｎａ］+）
工程５　１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－アミノエチルリン酸）の合成
　上記工程４で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－シアノエチル　２－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノエチルリン酸）６６０ｍｇにピリジン－トリエチルアミン－水（３：１：１）の混合液１５ｍＬを加え、室温で２時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、ピリジンで３回共沸した。その後、更にジクロロメタンで３回共沸した。残渣を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、５ｍＬのトリフルオロ酢酸を０℃にて加え、室温で３０分間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、ジクロロメタンで３回共沸して目的物を４１０ｍｇ得た。
３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、 ＣＤＣｌ３、δ）: －０．０８３３
工程６　１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンの合成
　上記工程５で得られた１，３－ジステアロイルグリセロール　２－Ｏ－（２－アミノエチルリン酸）４００ｍｇ、１．２４ｇのα－スクシンイミジロキシスクシニル－ω－メトキシ－ポリオキシエチレン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）　ＭＥ－０２０ＣＳ：日本油脂社製］に４０ｍＬのジメトキシエタン、４０ｍＬのジクロロメタン、１０ｍＬの飽和重曹水を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加えた後ジクロロメタンで３回抽出操作を行った。有機層を乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を９５０ｍｇ得た。
　得られた目的物の分子量を、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより測定した結果、図１に示すように、得られた目的物は、分子量２，０００～３，８００の範囲内で分布を有していた。
製造例４　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び９２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（日本油脂社製。以下同じ。）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１，０００ｍｇのマルトース（大塚製薬社製）、４．０ｍＬの注射用水（大塚製薬社製。以下同じ。）及び８１μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１０分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの薬物担体の分散液を調製した。その後、注射用水を用いて５．０ｍＬにメスアップした。
製造例５　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した１６ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び８４ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例６　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した３２ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び６８ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例７　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した４８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び５２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例８　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した６４ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び３６ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例９　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８０ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１０　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８８ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び１２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１１　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ及び製造例３で合成した１００ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質を用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１２　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、３２ｍｇのＮ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）　ＤＳＰＥ－０２０Ｃ：日本油脂社製。以下同じ。］（以下、「化合物Ｂ」という）及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
　なお、使用した化合物Ｂの分子量を、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより測定した結果、図２に示すように、使用した化合物Ｂは、分子量２，２００～３，６００の範囲内で分布を有していた。
製造例１３　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、４８ｍｇの化合物Ｂ及び５２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１４　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、８０ｍｇの化合物Ｂ及び２０ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１５　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、８８ｍｇの化合物Ｂ及び１２ｍｇの１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１６　薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ、製造例３で合成した８０ｍｇのＰＥＧ修飾リン脂質及び２０ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製。以下同じ。）を用い、製造例４と同様に薬物担体の分散液を調製した。
製造例１７　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例２で合成した、トリチウムで標識されたオリゴ二本鎖ＲＮＡ３６μＬ、製造例１で合成した配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ１．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ１．４３ｍＬ、及び２．０７ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量に、製造例４で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを添加し、５分間の超音波処理を行った。５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った後、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過を行うことにより、１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
（３）薬物担体の平均粒子径の測定
　医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径（体積平均）は、注射用水を用いて、上記（２）で作成した本発明組成物を０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈して測定した。具体的には、粒子径測定装置［Ｎｉｃｏｍｐ　Ｃ３８０（登録商標）：Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製。以下同じ。］を用い、屈折率を０．９９３に、粘度を１．３３３、測定時間を５分間に設定して、３回測定を行った。その結果、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、１０２．７ｎｍであった。
製造例１８　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例５で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０４．０ｎｍであった。
製造例１９　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例６で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０３．４ｎｍであった。
製造例２０　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例７で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１０２．５ｎｍであった。
製造例２１　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例８で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．９ｎｍであった。
製造例２２　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９１．６ｎｍであった。
製造例２３　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１０で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、６５．１ｎｍであった。
製造例２４　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１１で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、６３．５ｎｍであった。
製造例２５　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１２で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．３ｎｍであった。
製造例２６　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１３で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９７．７ｎｍであった。
製造例２７　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１４で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９８．０ｎｍであった。
製造例２８　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１５で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、７８．２ｎｍであった。
製造例２９　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例１６で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９２．７ｎｍであった。
製造例３０　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、８４．９ｎｍであった。
製造例３１　医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１で合成した配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ０．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ０．５０ｍＬ及び４．０ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び製造例９で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの医薬組成物を調製した。
　なお、医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、９５．７ｎｍであった。
　また、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡからなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂｃｌ－２の発現抑制活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡである（国際公開第２００４／１０６５１１号パンフレットを参照）。
比較例１　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　６０ｍｇの化合物Ａ及び１００ｍｇの卵黄レシチンを用い、製造例４と同様に比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例２　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　リポフェクチン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例３　比較対照用薬物担体の分散液の調製
　オリゴフェクトアミン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用薬物担体の分散液を調製した。
比較例４　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１４８．１ｎｍであった。
比較例５　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例１７の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例１７の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例１７の（３）と同様の方法により測定したところ、１６８．９ｎｍであった。
比較例６　比較対照用医薬組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
　製造例３１の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
　上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した薬物担体の分散液５．０ｍＬを用い、製造例３１の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用医薬組成物を調製した。
　なお、比較対照用医薬組成物中の薬物担体の平均粒子径は、製造例３１の（３）と同様の方法により測定したところ、１３８．６ｎｍであった。
試験例１　血中滞留性の評価
　製造例３で合成したＰＥＧ修飾リン脂質を含有する薬物担体の血中滞留性を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例１７～２４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与から２時間、８時間及び２４時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーター（Ｈｉｏｎｉｃ－Ｆｌｕｏｒ：パーキンエルマー社製。以下同じ。）を加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。
（２）実験結果
　図３及び図４に示すように、製造例３に係るＰＥＧ修飾リン脂質の含有量が３０～５０重量％の範囲内にある場合に、血中での滞留性が最も高かった。
試験例２　血中滞留性の評価
　化合物Ｂを含有する薬物担体の血中滞留性を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２５～２８で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与から２４時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーターを加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。
（２）実験結果
　図５に示すように、化合物Ｂの含有量が３０重量％以上である場合に血中での滞留性が高かった。
試験例３　本発明担体の体内動態の評価
　本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２９又は比較例４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間及び７２時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３又は４匹のマウスを用いた。
　５０μＬの血漿に１０ｍＬのシンチグラフィレーターをそれぞれ加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、血漿における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）、及び分布容積（Ｌ／ｋｇ）、消失半減期（ｈｏｕｒｓ）、血漿中濃度下面積（μｇ・ｈｏｕｒｓ／ｍＬ）、クリアランス（Ｌ／ｈｏｕｒｓ・ｋｇ）を算出した。
（２）実験結果
（ｉ）血漿中濃度
　図６に示すように、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも血漿中での滞留性が高かった。
（ｉｉ）薬物動態学的パラメータ値
　表１に示すように、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の血漿中濃度下面積（ＡＵＣ０－８）は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体の血漿中濃度下面積（ＡＵＣ０－８）と比較すると、約５倍高かった。また、本発明担体の分布容積は、比較対照用薬物担体の分布容積と比較すると、約１／８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
試験例４　本発明担体の体内動態の評価
　本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）実験方法
　製造例２９又は比較例４で調製した医薬組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）に、２．５ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、３０分、２時間、８時間及び２４時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。また、採血と同時に肝臓、肺、脾臓及び腎臓を摘出し、それぞれの湿重量を秤量した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３又は４匹のマウスを用いた。
　各臓器は、バイアル中で１ｍＬの組織溶解剤（ソルバブル：パーキンエルマー社製）を加え、４０℃で二晩振とうさせることにより溶解させた。
　５０～２００ｍｇの各臓器を溶解させた試料に１０ｍＬのシンチグラフィレーターをそれぞれ加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、それぞれの試料の放射活性を測定した。その結果より、各臓器における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）を算出した。なお、血漿における薬物担体の分布率（％　ｏｆ　ｄｏｓｅ）は、試験例１と同様に算出した。
（２）実験結果
　図７に示すように、血漿中での製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。図８、９に示すように、肝臓及び脾臓における、製造例２９に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例４に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも低かった。図１０、１１に示すように、肺及び腎臓における分布率は、製造例２９及び比較例４に係る医薬組成物中の薬物担体の間で差はなかった。
試験例５　癌細胞移植マウスにおける本発明担体の体内動態の評価
　癌細胞移植マウスにおける本発明担体の体内動態を、薬物担体に含有されている核酸の放射活性を指標として評価した。
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＡ４３１細胞（ヒト扁平上皮細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、９週齢、日本クレア社製）の皮下に移植し、移植後９日間飼育することにより作成した。
（２）実験方法
　製造例３０又は比較例５で調製した医薬組成物を、上記（１）で作成したマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与後、８時間、２４時間及び７２時間に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血漿を得た。血漿を得るための抗血液凝固剤としてヘパリンを用いた。また、採血と同時に癌周辺部、癌結節を摘出し、それぞれの湿重量を秤量した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、３匹のマウスを用いた。
　癌周辺部、癌結節及び血漿における薬物担体の移行量（μｇ／ｇ又はμｇ／ｍＬ）は、試験例１又４と同様に測定した。
（３）実験結果
　図１２に示すように、癌周辺部における、製造例３０に係る本発明組成物中の本発明担体の移行量は、比較例５に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。一方、図１３に示すように、癌結節における分布率は、製造例３０及び比較例５に係る医薬組成物中の薬物担体の間で差はなかった。なお、図１４に示すように、血漿中での製造例３０に係る本発明組成物中の本発明担体の分布率は、比較例５に係る比較対照用医薬組成物中の比較対照用薬物担体よりも高かった。
試験例６　本発明担体の溶血性の評価
（１）実験方法
　雄性ラット（Ｓｌｃ：ＳＤ、７週齢、日本エスエルシー社製）より採取した血液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層を除き、赤血球懸濁液を得た。得られた赤血球懸濁液に対し２倍量の注射用生理食塩水（大塚製薬工場社製。以下同じ。）を加え、混和した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この操作を更に２回繰り返した。得られた赤血球懸濁液は、注射用生理食塩水を用いて１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように希釈した。
　製造例１６又は比較例１～３で調製した薬物担体の分散液を、０．３μｇ／μＬ～３０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。２８５μＬの希釈した薬物担体の分散液を３７℃で１０分間予備加温した後、１５μＬの赤血球懸濁液を加え混和し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。４０５ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。
　溶血度は、薬物担体を加えなかった場合の吸光度を溶血度０％とし、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えた場合の吸光度を溶血度１００％として算出した。また、算出した溶血度より、５０％溶血濃度を算出した。
（２）実験結果
　表２に示すように、製造例１６に係る本発明担体の５０％溶血濃度は、比較例１～３に係る比較対照用薬物担体の５０％溶血濃度と比較して高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
試験例７　本発明担体の細胞毒性の評価
（１）実験方法
　ヒトさい帯静脈内皮細胞（三光純薬社製）を３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。製造例１６又は比較例１～３で調製した薬物担体の分散液を、３μｇ／μＬ～１０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。希釈した薬物担体の分散液を培地の１／１０容量添加した。７２時間培養後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（ＷＳＴ－８：同仁化学社製）を用いて、生存細胞数を測定し、その値より５０％細胞増殖阻害濃度を算出した。なお、ヒトさい帯静脈内皮細胞の培養には、Ｍ１９９培地（ニッスイ社製）を用いた。
（２）実験結果
　表３に示すように、製造例１６に係る本発明担体の５０％細胞増殖阻害濃度は、比較例１～３に係る比較対照用薬物担体の５０％細胞増殖阻害濃度と比較して高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
試験例８　本発明組成物のサイトカイン誘導能の評価
（１）実験方法
　ヒト新鮮血を採取し、凝固を防ぐため血液１０ｍＬあたり１ｍＬのヘパリンナトリウム注 (味の素社製) を混合した。等量のＰｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ (ＧＥ　ヘルスケア　バイオサイエンス社製)３ｍＬあたり１０ｍＬの血液を、界面を乱さないよう穏やかに重層した。４００×ｇ、室温で３０分間遠心し、末梢血単核球を得た。得られた末梢血単核球をＰＢＳで２度洗浄した。その後、末梢血単核球を１０％牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ナカライテスク社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）に浮遊させ、細胞数を測定し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
　調製した細胞懸濁液を４８穴プレートに３００μＬ (６×１０５ｃｅｌｌｓ)／ｗｅｌｌ で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３時間培養した後、製造例１７～２４、製造例３１又は比較例６で調製した医薬組成物を所望の濃度（製造例１７～２４：１００ｎＭ、製造例３１、比較例６：３０、１００、３００ｎＭ）になるように培地中に添加した。医薬組成物を添加してから２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡを行った。ＩＦＮ－αの測定はヒトインターフェロン－ａｌｐｈａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ (バイオソース社製) を用いて添付のプロトコールに従い行った。
（２）実験結果
　表４に示すように、製造例１７～１９に係る医薬組成物のＩＦＮ－αの誘導能は、製造例２０～２４に係る医薬組成物と比較して高かった。
　表５に示すように、製造例３１に係る本発明組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ－α量は、比較例６に係る比較対照用医薬組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ－α量と比較して低かった。
　なお、表４及び表５中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
試験例９　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、３×１０５ｃｅｌｌｓのＰＣ－３細胞（ヒト前立腺癌細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の皮下に移植することにより作成した。
（２）実験方法
　移植１０日後から５日間連続で、製造例３１で調製した本発明組成物を、上記（１）で作成したマウスに、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。更に、移植１７日後から５日間連続で同様に投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
　腫瘍体積は、移植１０、１３、１７、２０及び２４日後に、腫瘍の短径と長径とを測定し、「（短径）２×（長径）÷２」の式により算出した。
（３）実験結果
　図１５に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、腫瘍体積の増加が抑制された。
試験例１０　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、７×１０５ｃｅｌｌｓのＭＣＡＳ細胞（ヒト卵巣癌細胞）を雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の腹腔内に移植することにより作成した。
（２）実験方法
　評価は、本発明組成物を連続投与した場合と間欠投与した場合とで行った。連続投与スケジュールでは、移植後３～７日目及び１０～１４日目に、製造例３１で調製した本発明組成物を１日１回投与した。間欠投与スケジュールでは、移植後４、７、１１、１４、１８、２１、２５、２８、３２及び３５日目に、製造例３１で調製した本発明組成物を１日１回投与した。本発明組成物は１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で尾静脈内投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１６及び図１７に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、生存率が延長した。
試験例１１　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞肝転移マウスの作成
　癌細胞肝転移マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＡ５４９細胞（ヒト非小細胞肺癌）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、６週齢、日本クレア社製）の脾臓に移植し、移植１０分後に脾臓を摘出することにより作成した。
（２）実験方法
　上記（１）で作成したマウスに、製造例３１で調製した本発明組成物を、移植７日後から５日間連続で、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。更に、移植１４日後から５日間連続で同様に投与した。投与用量は全て１０ｍＬ／ｋｇで行った。１群あたり、６匹のマウスを用いた。なお、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１８に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、生存率が延長した。
試験例１２　本発明組成物の薬効評価
（１）癌細胞移植マウスの作成
　癌細胞移植マウスは、１×１０６ｃｅｌｌｓのＨＰＡＣ細胞（ヒト膵臓がん細胞）を雄性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ、７週齢、日本クレア社製）の膵臓に移植することにより作成した。ＨＰＡＣ細胞の代わりに培地を用いて同様の操作を行ったマウスを偽手術群とした。
（２）実験方法
　上記（１）で作成したマウスに、製造例３１で調製した本発明組成物を、移植後６～１０日目及び１３～１７日目にかけて、１０ｍｇ／ｋｇ（核酸濃度）で１日１回尾静脈内投与した。移植２９日後にマウスを解剖し、膵臓重量の測定を行い、抗腫瘍効果を評価した。なお、１群あたり８匹のマウスを用いた。また、１０％マルトースを投与したマウスを陰性対照とした。
（３）実験結果
　図１９に示すように、製造例３１で調製した本発明組成物を投与することにより、膵臓重量の増加が抑制された。

Claims (6)

  1. 　次の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質又はその医薬上許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、Ｘは次の（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を表す。ｎは３０～１５０の整数を表す。］、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｒ１は炭素数１７～２２の飽和の直鎖脂肪酸残基を表す。］、及び
    ２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールを含有し、かつ前記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール修飾リン脂質を、薬物担体中の脂質の総重量に対して、３０～５０重量％の範囲内で含有することを特徴とする血中滞留型薬物担体。
  2. 　ポリエチレングリコール修飾リン脂質が１，３－ジステアロイルグリセロ－２－ホスファチジル－Ｎ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン又はＮ－（メトキシ　ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の血中滞留型薬物担体。
  3. 　更にリン脂質を含有する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の血中滞留型薬物担体。
  4. 　医薬を包含する、請求項１～３のいずれか１項に記載の血中滞留型薬物担体を含有する医薬組成物。
  5. 　医薬が、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸、又は水溶性陰イオン化合物である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　オリゴ核酸が、ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマー又は非コードＲＮＡである、請求項５に記載の医薬組成物。
PCT/JP2008/063641 2008-06-19 2008-07-30 薬物担体 WO2009153888A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRPI0822924-4A BRPI0822924A2 (pt) 2008-06-19 2008-07-30 Veículo de fármaco
CN2008801299723A CN102065901B (zh) 2008-06-19 2008-07-30 药物载体
EP08791872A EP2292270A1 (en) 2008-06-19 2008-07-30 Drug carrier
RU2011101733/15A RU2476204C2 (ru) 2008-06-19 2008-07-30 Носитель лекарственного средства
MX2010014087A MX2010014087A (es) 2008-06-19 2008-07-30 Portador de farmaco.
US12/997,937 US20110098344A1 (en) 2008-06-19 2008-07-30 Drug carrier
CA2727428A CA2727428A1 (en) 2008-06-19 2008-07-30 Drug carrier
JP2010517658A JP5299424B2 (ja) 2008-06-19 2008-07-30 薬物担体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-160231 2008-06-19
JP2008160231 2008-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009153888A1 true WO2009153888A1 (ja) 2009-12-23

Family

ID=41433816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/063641 WO2009153888A1 (ja) 2008-06-19 2008-07-30 薬物担体

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20110098344A1 (ja)
EP (1) EP2292270A1 (ja)
JP (1) JP5299424B2 (ja)
KR (1) KR20110031168A (ja)
CN (1) CN102065901B (ja)
BR (1) BRPI0822924A2 (ja)
CA (1) CA2727428A1 (ja)
MX (1) MX2010014087A (ja)
RU (1) RU2476204C2 (ja)
WO (1) WO2009153888A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9446090B2 (en) 2012-03-23 2016-09-20 Amicrobe, Inc. Compositions and uses of antimicrobial materials with tissue-compatible properties
CN105985373A (zh) * 2015-04-10 2016-10-05 江苏东南纳米材料有限公司 一种制备（r）-1,2-二脂肪酸甘油磷酯酰甘油酯的新方法
WO2018187617A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Amicrobe, Inc. Compositions and uses of locally applied antimicrobials with enhanced performance and safety
CN108727426B (zh) * 2018-04-26 2020-09-29 安庆润科生物医药科技有限公司 一种二酰基磷脂酰乙醇胺的制备方法

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59204198A (ja) * 1983-03-07 1984-11-19 リピッド・スペシャルティズ・インコーポレイテッド 合成ホスホリピド化合物、製造法及び用法
WO1994019314A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
WO1999020283A1 (fr) 1997-10-16 1999-04-29 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Activateur de nuclease de cellules intracancereuses
WO1999048531A1 (fr) 1998-03-24 1999-09-30 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nouveaux remedes contre l'hepatite
CA2271582A1 (en) 1998-05-14 1999-11-14 Sean C. Semple Method for administration of therapeutic agents, including antisense, with repeat dosing
JP2000516948A (ja) * 1996-08-26 2000-12-19 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム カチオン性脂質―核酸複合体
JP2002514432A (ja) * 1998-05-12 2002-05-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 蛋白質連結脂質微粒子類の形成方法、およびその組成物類
JP2002518313A (ja) * 1998-06-19 2002-06-25 ジエンザイム コーポレイション カチオン性両親媒性ミセル複合体
JP2002363278A (ja) * 2001-03-02 2002-12-18 Nof Corp ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質およびその製造方法
US20040166150A1 (en) 1999-10-08 2004-08-26 Shi-Kun Huang Neutral-cationic lipid for systemic delivery of Factor VIII gene
WO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
WO2004106511A1 (ja) 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物
WO2005051351A2 (en) 2003-11-21 2005-06-09 Alza Corporation Gene delivery mediated by liposome-dna complex with cleavable peg surface modification
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006074546A1 (en) 2005-01-13 2006-07-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU729655B2 (en) * 1996-11-12 2001-02-08 Regents Of The University Of California, The Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery
US6679822B2 (en) * 2001-03-02 2004-01-20 Nof Corporation Polyalkylene oxide-modified phospholipid and production method thereof

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59204198A (ja) * 1983-03-07 1984-11-19 リピッド・スペシャルティズ・インコーポレイテッド 合成ホスホリピド化合物、製造法及び用法
WO1994019314A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
JP2000516948A (ja) * 1996-08-26 2000-12-19 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム カチオン性脂質―核酸複合体
WO1999020283A1 (fr) 1997-10-16 1999-04-29 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Activateur de nuclease de cellules intracancereuses
WO1999048531A1 (fr) 1998-03-24 1999-09-30 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nouveaux remedes contre l'hepatite
JP2002514432A (ja) * 1998-05-12 2002-05-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 蛋白質連結脂質微粒子類の形成方法、およびその組成物類
CA2271582A1 (en) 1998-05-14 1999-11-14 Sean C. Semple Method for administration of therapeutic agents, including antisense, with repeat dosing
JP2002518313A (ja) * 1998-06-19 2002-06-25 ジエンザイム コーポレイション カチオン性両親媒性ミセル複合体
US20040166150A1 (en) 1999-10-08 2004-08-26 Shi-Kun Huang Neutral-cationic lipid for systemic delivery of Factor VIII gene
JP2002363278A (ja) * 2001-03-02 2002-12-18 Nof Corp ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質およびその製造方法
WO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
WO2004106511A1 (ja) 2003-05-30 2004-12-09 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物
WO2005051351A2 (en) 2003-11-21 2005-06-09 Alza Corporation Gene delivery mediated by liposome-dna complex with cleavable peg surface modification
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006074546A1 (en) 2005-01-13 2006-07-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.AM. CHEM. SOC., vol. 115, 1993, pages 10487 - 10491
KAZUKO HIRABAYASHI ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 59, 1999, pages 4325 - 4333
KAZUKO HIRABAYASHI ET AL., ONCOLOGY RESEARCH, vol. 11, 1999, pages 497 - 504
NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 4539 - 4557
TATSUHIRO ISHIDA ET AL., RIPOSOMU OYO NO SHINTENKAI, June 2005 (2005-06-01), pages 528 - 538
THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 35, 1970, pages 2082 - 2083

Also Published As

Publication number Publication date
CN102065901A (zh) 2011-05-18
EP2292270A1 (en) 2011-03-09
KR20110031168A (ko) 2011-03-24
RU2011101733A (ru) 2012-07-27
JPWO2009153888A1 (ja) 2011-11-24
RU2476204C2 (ru) 2013-02-27
BRPI0822924A2 (pt) 2015-06-23
CN102065901B (zh) 2013-03-06
US20110098344A1 (en) 2011-04-28
MX2010014087A (es) 2011-01-21
CA2727428A1 (en) 2009-12-23
JP5299424B2 (ja) 2013-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5347510B2 (ja) ポリエチレングリコール誘導体
JP5087924B2 (ja) ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物
JP5093095B2 (ja) ガラクトース誘導体、薬物担体及び医薬組成物
JP6355145B2 (ja) 核酸デリバリー用ユニット構造型医薬組成物
US20100004315A1 (en) Biodegradable Cross-Linked Branched Poly(Alkylene Imines)
KR20060103957A (ko) 치료제 전달용의 리포솜 조성물
EP3842412A1 (en) Biodegradable compound, lipid particles, composition containing lipid particles, and kit
KR20060063788A (ko) 올리고 핵산 담지 복합체, 이 복합체를 함유하는 의약조성물
CN105283441B (zh) 用于递送药剂的二硫化合物
JP5299424B2 (ja) 薬物担体
CN104471062A (zh) 抑制KRAS基因表达的RNAi医药组合物
US6342485B1 (en) Synergistic compositions useful as anti-tumor agents
WO2011125943A1 (ja) 修飾オリゴヌクレオチド
JP7016084B2 (ja) 核酸導入用脂質誘導体
WO2010131695A1 (ja) 二本鎖修飾ｒｎａ
US20220202952A1 (en) Immunostimulatory lipoplex, pharmaceutical composition including immunostimulatory lipoplex, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200880129972.3

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08791872

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010517658

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2727428

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12997937

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2010/014087

Country of ref document: MX

Ref document number: 2008791872

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20107029820

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 237/CHENP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011101733

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0822924

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20101220