MXPA00010974A - Metodos para formar microparticulas lipidicas enlazadas a proteinas y composiciones de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a complejos de lípido:ácido nucleico que tienen vida media incrementada y actividad de transfeccion alta in vivo después de la inyección intravenosa, y métodos para preparación de tales complejos. Los métodos generalmente implican poner en contacto unácido nucleico con un polication orgánico para producir unácido nucleico condensado, y después se combina elácido nucleico condensado con un lípido que comprende un lípido catiónico anfifílico para producir el complejo de lípido:ácido nucleico. Este complejo puede además ser estabilizado por la adición de un polímero hidrofílico unido a las cadenas laterales hidrofobicas. Este complejo puede además construido para células especificas, incorporando una porción de objetivacion tales como fragmentos de Fab'unido a un polímero hidrofílico. La presente invención además se relaciona a microparticulas lipidicas con proteinas unidas que han sido primero conjugadas a moleculas enlazadoras que tienen un dominio de polímero hidrofílico y un dominio hidrofóbico capaz de asociación estable con la micropartícula, o proteinas que han sido modificadas para contener un dominio hidrofílico y una porción de lípido que permite la asociación estable con la microparticula.

Description

MÉTODOS PARA FORMAR MICROPARTICULAS LIPIDICAS ENLAZADAS A PROTEÍNAS Y COMPOSICIONES DE LAS MISMAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud No. 08/967,791 de serie de los Estados Unidos presentada el 10 de Noviembre de 1997, y la No. 60/030,578 de serie de los Estados Unidos presentada el 12 de Ncviembre de 1996, ambas que se incorporan en la presente para referencia. Investigación o desarrollo patrocinado federalmente No aplicable. La presente' invención se relaciona al campo de complejos de lípidos catiónicos: ADN ("CLCA"). En particular, la presente invención se relaciona a coir.plejos de lípido: ácido nucleico que contienen (1) polímero r. drofílico; (2) ácido nucleico que ha sido condensado con pclicationes orgánicos; y (3) polímero hidrofílico y ácido nucleico que ha sido condensado con policationes orgánicos. Los complejos de lípido: ácido nucleico de esta invención muestran alta actividad de trar.sfección in vivo después de inyección intravenosa y un incremento inesperado en vida media, como se determina por actividad de transfección in vivo. La presente invención además se relaciona al campo de micropartículas lipídicas, tales como liposomas, complejos de lípidos:ADN, complejos de lípiccs :drcgas, y gotas de microemulsión, unidos a proteínas. En particular, la invención se relaciona a micropartículas lipídicas con proteínas anexas que han sido conjugadas primero a moléculas enlazadoras que tienen un dominio de polimero hidrofílico y un dominio hidrofóbico capaz de asociación estable con la micropartícula, o proteínas que han sido modificadas para contener un dominio hidrofílico y una porción lipídica que permite asociación estable con una micropartícula lipídica. Los liposomas que consisten de moléculas catiónicas amfifílicas son útiles vectores no virales para suministro de genes in vitro y in vivo (investigado en Cristal, Science 270:404-410 (1995); Baléese et al., Cáncer Gene Ther. 2:291- 297 (1995); Eeher et al., ?iccor. ugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); y Gao et al., Gene Therapy 2: 713-722 (1995)). En teoría, los liposomas cargado positivamente forman complejo con ácidos nucleicos cargados negativamente via interacciones electrostáticas para formar complejos de lípido: ácido nucleico. Los complejos de iípido: ácido nucleico tienen varias desventajas como vectores de transferencia de genes. Diferente a vectores virales, los complejos de lípido: ácido nucleico pueden ser usados para transferir casetes de expresión de esencialmente tamaño no limitado. Ya que los complejos carecen de proteínas, los mismos pueden provocar pocas respuestas inmunogénicas e inflamatorias. Por otra parte, no pueden replicarse o recombinarse para formar un agente infeccioso y tienen baja frecuencia de integración. Hay un número de publicaciones que demuestran convincentemente que los lípidos catiónicos anfifílicos pueden mediar el suministro de genes in vivo e in vitro, al mostrar expresión detectable de un gen reportador en células de cultivo in vitro (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-17 (1987); Loeffier et al., Methods in Enzymology 217:599-618 (1993); Felgner er al., J. Biol. Chem. 269:2550-2561 (1994)). Ya que los complejos de lípidos : ácido nucleico ser. en ocasiones no tan eficientes como los vectores virales para lograr transferencia de genes exitosa, ha sido implicado rr. cho esfuerzo para er.c;r.rrar lípidcs catiónicos con eficiencia de transfección incrementada (Behr, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); err.y et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)). Los complejos de lípido: ácido nucleicoson vistos con entusiasmo como una herramienta potencialmente útil para rerapia de genes. Varios grupos har. reportado el uso de complejos de iípidos catiónicos anfifílicos : ácidos nucleicos para tzransfección in vivo ambos en animales, y en humanos (investigado en Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Zhu et al., Science 261:209-211 (1993); y Thierry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 : 3"742-9746 (1995)). Sin embargo, los problemas técnicos para preparación de complejos que tienen vidas medias estables no han sido manejados. Por ejemplo, diferente a las preparaciones de vectores virales, los complejos de lípidos : ácidos nucelicos son inestables en términos de tamapo de partícula (Behr, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)). Es por lo tanto difícil obtener complejos homogéneos de lípidos : ácidos nucleicos con una distribución de tamaño estable para inyección sistemática. La mayoría de las preparaciones de complejos de lípido:ácido nucleico son metaestables . Consecuentemente, estos complejos deben ser usados típicamer.re dentro de un periodo corto de tiempo en el intervalo de 30 minutos a unas cuantas horas. En pruebas clínicas recientes usando lipidos catiór.icos como un portador para sumir.istro de ADN, los dos componentes son mezclados en el lecho lateral y se usan inmediatamente (Gao, et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)). La inestabilidad estructural junto con la pérdida de actividad de transfección del complejo de lípidos : ácido nucleico con el tiempo han sido retos para el futuro desarrollo de la terapia de genes mediada por lípidos. Los liposomas que consisten de moléculas catiónicas anfifílicas no son, por supuesto, la única forma de micropartículas lipídicas y la terapia de genes no es solamente ei beneficio para tales partículas. Las micropartículas lipídicas han sido usadas también para suministro de drogas y otros agentes a sitios objetivos. El objetivado de las micropartículas se logra típicamente a través del uso de una proteína unida a la superficie de la micropartícula, la cual, por ejemplo es un ligando para receptor de superficie celular en un tipo celular de interés. Inversamente, la proteína puede ser un anticuerpo ei cual reconoce específicamente un antígeno o un tipo celular de interés, tal como células enfermas que portan marcadores específicos. Adicionalmente, las proteínas pueden ser unidas para propósitos diferentes al objetivado. Por ejemplo, los liposomas pueden contener prodrogas que se filtran lentamente del liposorr-a hacia la circulación. Una enzima ur.ida al liposoma puede entonces convertir la prodroga hacia su forma activa. Los métodos actuales para efectuar la unión de proteínas a micropartículas lipídicas han sido de dos tipos. El primer tipo requiere introducir una molécula enlazadora que porta un grupo "activo" (uno el cual reacciona con un grupo funcional de la proteína) en la composicicr. de micropartículas antes de conjugación de la partícula "activada" con la proteína de interés. Las desventajas de los métodos de este tipo son: con freceucnai reacción incontrolable, incompleta de la proteína con el enlazador; la presencia de exceso de enlazador en el conjugado resultante, efecto potencialmente adverso del enlazador en la estabilidad de la partícula, y la incapacidad para incorporar componentes reactivos con el enlazador en la composición de la partícula. El segundo grupo de métodos emplea las etapas de (a) unión de una porción hidrofóbica, tal como una cadena de hidrocarburo, a la molécula de proteína, (b) disolver los componentes de la micropartícula lipídica, junto con el conjugado de la etapa (a) en la presencia de un detergente, y (c) eliminar el detergente, efectuar la formación de la partícula lipídica incorporando el conjugado de proteína (Torchilin, Immunomethods 4-244-258 (1994); Laukkanen et al., Biochemistry 33:11664-11670 (1994)). Estos métodos tienen un número de desventajas, incluyendo la imposición de limitaciones severas en el intervalo de métodos por los cuales puede ser formada la partícula, (por ejemplo, se requiere la técnica de eliminación de detergente) y por los cuales la droga u otro agente puede ser cargada en la micropartícula. Por otra parte, la etapa (b) requiere la disolución de la micropartícula. Estos métodos son por lo tanto incapaces de unir una proteína a una partícula hecha anteriormente sin primero destruirla. La presencia de detergente en estos métodos es inevitable ya que sin un detergente la proteína hidrofóbicamente modificada es insoluble en un medio acuoso. La "inserción" en liposomas de polímero hidrofóbico-lípido enlazado a un oligopéptido pequeño (5 aminoácidos) u oligosacárido pequeño ha sido reportada. (Zalipsky et al., Bioconjugate Chem. 8:111-118 (1997). El péptido y oligosácarido empleados son, sin embargo, de un tamaño (peso molecular, 500-3,000 Da) más pequeño que, o comparable a, el mismo enlazador (peso molecular, 2,750 Da). Este estudio por lo tanto no proporciona una guía para insertar en los liposomas u otras proteínas de micropartículas lipídicas, tales como anticuerpos, o fragmentos de los mismos, conjugados a enlazadores significativamente más pequeños que la proteina. En vista de la naturaleza hidrofílica de anticuerpos y otras proteínas, la técnica ha enseñado que entre mayor sea la ccrción de proteína de tal conjugado se evita la porción de enlace hidrofóbica de asociación estable con una micrcpartícula lipídica. La presente invención proporciona un método novedoso para preparar complejos de lípidos catiónicos: ácidos nucleicos que tienen vida media incrementada. En una modalidad, estos complejos son preparados al cr.er er. contacto un ácido nucleico con un policatión orgánico, para producir un ácido nucleico condensado o parcialmente condensado. ' El ácido nucleico condensado es entonces combinado con un lípido catiónico anfifílico más un lípido auxiliador neutral tal como colesterol en una prcporciór. molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2, produciendo el complejo de iípido: ácido nucleico. Opcionalmente, se agrega subsecuentemente un polímero hidrofílico a un complejo de lípido: ácido nucleico. Alternativamente, se agrega el polímero hidrofílico a un complejo de lípido: ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que no ha sido condensado. Estos complejos de lípidos : ácido nucleico tienen una vida media incrementada, por ejemplo, cuando se almacenan a 22°C o abajo, comparado con un complejo de lípido: ácido nucleico idéntico en el cual el componente de ácido nucleico no ha sido puesto en contacto con el policatión orgánico y/o en el cual el complejo de lípido: ácido nucleico no ha siác puesto en ccr-tacto con ur. polimero hidrofílico. En una modalidad particularmente preferida, ei policatión es una poliamina, más preferentemente una poliamina tal como espermidina o espermina. En otra modalidad preferida, los complejos de lípidos : ácido nucleico son preparados al combinar un ácido nucleico con un lípido caticr.icc anfifílicc y después combinar el complejo formado de esta forma ccn un polímero hidrofílico. Este complejo de lípidc: ácido nucleico tiene una vida media incrementada , por ejemplo cuando se almacena a 22°C o abajo como se compara con un complejo idéntico que no ha sido combinado con ei polímero iirofílico. En una modalidad, se selecciona el polímero hidrofílico del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG) , polietilenglicol derivado con fosfatidiletanolamina (PEG-PE), polietilenglicol derivado con tween, polietilenglicol derivado con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSFE) , gangliosuro Gm y polímeros sintéticos. En una modalidad, el complejo de lípido: ácido nucleico se liofiliza. En cualquiera de los métodos y composiciones de esta invención, el ácido nucleico puede ser virtualmente cualquier ácido nucleico, per ejemplc, un ácido deoxirribonucleico (ADN) , o un ácido ácido (RNA) , y ácido nucleico y péptido (ANP) etc., y es más preferentemente un ADN. En una modalidad particularmente preferida, el ADN es un cásete de expresión capaz de expresar un polipéptido en una célula transfectada con el complejo de lípido:ácido nucleico. En una modalidad los complejos de lípidos : ácido nucleico se forman primero formando un liposoma, y después combinando el liposoma formado con ácido nucleico condensado o parcialmente condensado para fermar ur. complejo de lípido: ácido nucleico. Opcionalrr.er.te, el complejo de lípido: ácido nucleico es subsecuentemente puesto en contacto con un polímero hidrofílico. Les liposomas pueden ser combinados alternativamente con un ácido nucleico no conder.sado para formar un complejo ie lípidc: ácido nucleico al cual se agrega después un polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG-PE). Un complejo de lípido:ácido nucleico preparado por la combinación de ácido nucleico y un liposoma puesto en contacto con un polímero hidrofílico puede ser combinado subsecuentemente con polímero hidrofílico adiconal. En una modalidad preferida, el lípido y el ácido nucleico son combinados en una proporción en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, más preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 16, y más preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 nmoles de lípido:µg de ácido nucleico. El lipido y el polímero hidrofílico son combinados en una proporción molar en el intervalo de aproximadamente C.l a aproximadamente 10%, más preferentemente de aproximadamer.te 0.3 a aproximadamente 5% y más preferentemente de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 2.0% (proporció molar de polímero hidrofílico a lípido catiónico del complejo) . Será apreciado que una porción objetivo (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) puede ser unido al lípiao y/o liposoma antes o después de la formación del complejo de lípido: ácido nucleico. En una modalidad preferida, la porción objetiva es acoplada al polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG) , donde la porción objetivo/polímero hidrofílico se agrega subsecuentemente al complejo de lípidc: ácido nucleico. ?sto proporciona un medio conveniente para modificar la especificidad objetivo de un p complejo de lípido:ácido nucleico genérico diferente. En una modalidad particularmente preferida, el método para incrementar la vida media del complejo de lípido: ácido nucleico incluye las etapas de combinar un cásete de expresión con espermidina o espermina con un lípido catiónico anfifílico más ur. lípido auxiliador tal como colesterol, y un fragmento Fab' de un anticuerpo unido a un espaciador, por ejemplo, plietilenglicol, de tal forma que el complejo tiene vida media incrementada cuando se almacena a aproximadamente 4°C. En una modalidad particularmente preferida, el método para incrementar la vida media del complejo de lípido: ácido nucleico incluye las etapas de combinar un cásete de expresión con espermidina o espermina con un lípido catiónico anfifílico, y un fragmento Fab' de un anticuerpo unido a un derivado de polietilenglicol. En otra modalidad particularmente preferida, incluye las etapas de combinar un cásete de expresión con un lípido catiónico anfifílico, y un fragmento Fab' de un anticuerpo unido a un derivado de polietilgnlicol de tal forma que el complejo tiene vida media incrementada cuando se almacena a 4°C. Esta invención también proporciona un método para transfectar un ácido nucleico en una célula mamífera, el método que comprende pcr.er en contacto la célula con cualquiera de los complejos de lípios: ácido nucleico preparados como se describen anteriormente. En una modalidad, el método usa administración sistemática de un complejo de lípido: ácido nucleico en un mamífero. En una modalidad preferida, el método de transfectar usa administración intravenosa del complejo de lípido: ácido nucleico en un mamífero. En una modalidad particularmente preferida, el método comprende poner en contacto una célula específica que expresa un ligando que reconoce el fragmento Fab'. En aún otra modalidad, esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el complejo de lípido: ácido nucleico condensado descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas comprenden una dosis terapéuticamente efectiva del complejo de lípido: ácido nucleico y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En aún otra modalidad, la invención también proporciona un equipo para preparar un complejo de lípido: ácido nucleico, el equipo que comprende un recipiente con un liposoma; un recipiente con un ácido nucleico; y un recipiente con un polímero hidrofílico, en donde el liposoma y el ácido nucleico se mezclan para formar el complejo de lípido: ácido nucleico y en donde el complejo de lípido: ácido nucleico se pone en contacto con el polímero hidrofílico. En una modalidad preferida, el polímero hidrofílico se deriva con una porción objetivo, preferentemente un fragmento Fab'.

En otra modalidad preferida, se condensa el ácido nucleico. Esta invención también proporciona un complejo de lípido: ácido nucleico condensado preparado usando el método de incrementar la vida media usando ácido nucleico condensado con un policatión orgánico, como se resume anteriormente. La invención además proporciona un método para hacer micropartícula lipídicas que portan proteínas unidas. El método emplea proteínas que han sido conjugadas a moléculas enlazadoras que se asociaran establemente con micropartículas lipidicas. La invención por lo tanto permite la unión de proteínas a la superficie, por ejemplo, de micropartículas lipídicas que han sido preformadas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura ÍA y IB ilustra ei papel del lípido neutral en el suministro de genes. Se prueban tres formulaciones de lipsomas para suministro de genes a ambas células de cultivo (SKBR-3, cé41ula de cáncer de seno humana) y ratones (CD1, hembra, 20-25 g) . Las muestras son: (1) BDDA/Chol (1:1); (2) BDDA/Chol/DOPE (1:0.5:0.5); (3) BDDA/DOPE (1:1); y (4) BDDA solo. La Figura ÍA ilustra la transfección celular. Se colocan en placas las células SKBR-3 en 50,000 células por pozo en placas de doce pozos y se incuban durante la noche. Cada pozo recibe 1 µg de P-CMWIVSLuc + plásmido que ha sido formado en complejo con liposorr.as en 5 nmoles de BDDA. Se cosechan las células después de 24 hr de incubación con complejos a 37 °C. Los valores presentados son promedio de 2 pozos. Los valores están en el intervalo dentro de 10-30% de promedio. La Figura IB ilustra transfección in vivo en ratones. Los ratones reciben vía inyección de vena de cola 40 µg de P-CMVIVS-Luc + plásmido, que ha formado un complejo con liposomas en proporción de 8 nmoles de BDDA por µg de ADN. Los valores presentados son promedios de dos ratones. Los valores están en el intervalo de 20-25% de promedio. La Figura 2 ilustra expresión de genes reportadores en extractos de tejidos de ratón. Los ratones reciben (vía inyección de vena de cola) 60 µg de P-CMVIVS-Luc + piásmido, que ha sido formado en complejo cor. liposomas BDDA/Cr.cl (1:1) en una proporción de 8-nmoles de BDDA por µg de ADN (sin espermidina) . Los valores presentados son promedio de 3 ratones. La Figura 3 ilustra la duración de expresión del gen reportador en ratones luna. Cada animal recibe 40 µg de P-CMVIVS-Luc + plásmido, que ha sido formado en complejo con liposomas BDDA/Chol (1:1) en una proporción de 8 rutóles de BDDA por µg de ADN. La Figura 4 ilustra el suministro de genes en pulmón de ratón por varios complejos estabilizados. Cada ratón recibe 60 µg de P-CMVIVS-Luc ->- , el cual ha sido formado en complejo con liposomas BDDA/Chcl (1:1) en una prcporción de 8 nmoles de BDDA/µg de ADN. Los valores presentados son promedio de tres ratones. Barras ccn líneas: complejos recientemente hechos; barras de filtro; muestra de un mes. Las muestras son como sigue: (1) No se agrega agente estabilizante; (2) se agrega PEG-PE en 1% del lípido total a los complejos formados; y (3) se agrega espermidina (0.5 nmoles por µg de ADN) al plásmido anterior para la formación de complejo. La Figura 5A y 5B ilustra transfección in vitro de líneas celulares con complejos de inmunolípidos : ADN. Las muestras son como sigue: (1) BDDA/DCPE (1:1), produciendo liposomas catiónicos en complejo cor. ADN solamente; (2) BDDA/DOPE (1:1), con 1% de PEG-P? derivado cor. maleimida en la última posición de PEG, produciendo liposomas con el componente de estabilización esférica agregado después de ia formación del complejo con el ADN; y '3) BDDA/DOPE (1:1) con 1% de PEG-FE derivado con el fragmento Fab' de un anticuerpo anti Her-2 humano unido a la última posición de PEG vía el grupo tio libre al residuo de maleimida. DEFINICIONES Las siguientes abreviaciones son usadas en la presente: Chol. Colesterol; AF, ácido fosfatídico; PC, fosfatidilcolina; Pl, fosfatidilinositol; EM, esfingomielina; M-DPE, maleimida derivado de dipalrr.itioletanolamina; SAF, solución salina amortiguada con fosfato; r G, vesículas unilaminares grandes; VML, vesículas multilaminares; FE, fosfatidiletanolamina; PEG, polietilenglicol; PEG-FE, polietilnglico derivado de fosfatidiletanolamina, DC-chol, 3ß [N- (N' ,N'-dimetilaminoetano) carbanoil] -colesterol; BDDA, bromuro de dimetilidioctadecilamonio; DMEFC, dimiristoilglicero-3-etilfosfocolina; PDODA, propano de dioleoil-3-dimetilamonio; DOEFC, dioleoilglicero-3- etilfosfocolina; DOGS, N, N-dioctadecilamidoglicilespermina; DOPE, dioleoilfosfatidiletanolamina; PDOTA, propano de dioleoil-3-trimetilamonio; DOTMA, bromuro de N-[2,3- (dioleiloxi) propil] -N, N, -trimetilamonio; DSFE, diestearoilfosfatidiletanolamina; PEG-PE, N-[t¡t-metcxipoli (oxietile o) -a oxicarbonil] -DSFE; POEFC, falmitoiloleoilglicero-3-etilfosfocolina. Se propone el término "lípido catiónico ar.fifílico" para incluir cualquier lípido anfifílico, incluyendo lípidos sintéticos y análogos de lípidos, que tienen porciones de grupos de cabeza polar e hidrofóbicos, una carga postiva neta, y que por si mismos pueden formarse espontáneamente en vesículas bicapas o micelas en agua, como se ejemplifica por fosfolípidos. El término incluye también cualquier lípido anfifílico que es incorporado establemente en bicapas de lípidos en combinación con fosfolípidos con su porción hidrofóbica en contacto con la región interior, hidrofóbica de la membrana de bicapa, y su porción de grupc de cabeza polar orientada hacia la superficie polar, exterior de la membrana . El término "enlace específico" se refiere a aquel enlace que ocurre entre tales especies de par como enzima/substrato, receptor/agonista, anticuerpo/antígeno, y lectina/carbohidrato que puede ser mediado por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de interacciones covalentes y no covalentes. Cuando la interacción de las dos especies produce un complejo no enlazado covalentemente, el enlace que ocurre es típicamente electrostático, enlace de hidrógeno, o el resultado de interacciones lipofílicas. Por consiguiente, el "enlace específico" ocurre entre especies en par donde hay ir.teracción entre los dos le cual produce un complejo de enlace que tiene las características de un anticuerpo/antíger.o o interacción enzima/substrato. En particular, se caracteriza el enlace especifico por el enlace de un miembro de un par a una especie particular y no a otra especie dentro de la familia de compuestos a los cuales el miembro correspondiente del miembro de enlace pertenece. De esta forma, por ejemplo, un anticuerpo se enlaza preferentemente a un solo epitcpo y no a otro epitopo, dentro de la familia de proteínas. Los términos "ligando" o "porción de objetivación", como se usa en ia presente, se refieren generalmente a todas las moléculas taraces de enlazar específicamente a una molécula objetivo particular y formar un complejo enlazado come se describe anteriormente. Ce esta forma el ligando y su molécula objetiva correspondiente forman un par de enlace específico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos, linfocinas, citocinas, proteínas receptoras tales como CD4 y CD8, proteínas receptor solubilizadas tales como CD4 soluble, hormonas, factores de crecimiento, y similares que se enlazan específicamente a células objetivo deseadas, y ácidos nucleicos que se enlazan a ácidos nucleicos correspondientes a través de la complementaridad de par base. Porciones de objetivación particularmente preferida incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, el fragmento Fab'). El término "complejo de lípido: ácido nucleico" se refiere al producto hecho al mezclar lípidos catiónicos anfifílicos o liposomas con un ácido nucleico. El 'termino "CLCA" que es para "complejo de lípido catiónico :ADN" como se usa en la presente no se limita a ADN y es una abreviación conveniente para el complejo de lípido: ácido nucleico. El complejo de lípido: ácido nucleico puede incluir también un lípido auxiliador. El lipido auxiliador es con frecuencia un lípido neutral tal como DOFE o colesterol con colesterol que es más preferido. El complejo de lípido: ácido nucleico puede contener también otros compuestos tales como un policatión que r.a está en contacto cor. el ácido nucleico del complejo, produciendo el ácido nucleico condensado, y polímeros hidrofílicos tales como PEG y PEG derivados. Los términos "in unoliposoma" y "complejo de inmunolípido: ácido nucleico" se refiere a un liposoma o un complejo de lípido: ácido nucleico que porta un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que actúa como una porción objetiva que permite que el complejo de lípido: ácido nucleico se enlace específicamente a una molécula "objetivo" particular que puede existir en solución o puede ser enlazada a la superficie de una célula. En donde la molécula objetivo es una que se encuentra típicamente en exceso relativo (por ejemplo, 10 veces) y en asociación con un tipo celular particular o alternativamente en una multiplicidad de tipos celulares todos que expresan una condición fisiológica particular la molécula objetivo será un "marcador característico" de aquel tipo celular o aquella condición fisiológica. De esta forma, por ejemplo, un cáncer puede ser caracterizado por la sobre expresón de un marcador particular tal como el prot-oncogen HER2 (c-erbB-2/neu) en el caso de cáncer de seno. Un "polímero hidrofílico" como se usa en la presente se refiere a polímeros neutrales flexibles altamente hidratados unidos a moléculas de lipidos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) , polietilengliccl derivado con fosfatidiletnolamina (PEG-PE) , polietilenglicol derivado con tween, polietilgnlicol derivdo con diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DEFE), gangliosida GMI y polímeros sintéticos. Tales polímeros tienen típicamente un peso molecular en el intervalo de 1000-10,000. Preferentemente, el peso molecular para PEG es aproximadamente 2000. "Transfección" se refiere a poner en contacto una célula viva con un ácido nucleico, por ejemplo, como parte de un complejo de lípido: ácido nucleico. "Actividad de transfección" se refiere a la eficiencia de introducir un ácido nucleico en una célula viva. La eficiencia de transfección puede ser medida al determinar la cantidad de expresión de un gen reportador que ha sido transfectado en la célula como parte de un complejo de lípido: ácido nucleico, por ejemplo, por ensayos fluorescentes o funcionales. Los términos "ácido nucleico condensado" y "ácido nucleico parcialmente condensado" son usados para referirse a un ácido nucleico que ha sido puesto en contacto con un catión orgánico por ejemplo, poliaminas, que incluyen espermina y espermidina, moléculas de poliamonio tales como Polybrene (bromuro de hexadimetrina) , poliaminoácidos básicos, y proteínas básicas. Los ácidos nucleicos ocupan típicamente un volumen significativamente menor que los ácidos nucleicos no condensados. Se reconoce, sin embargo, que el grado de condensación puede variar con ambiente local (por ejemplo, lípido opuesto a ambiente acuoso) . El término "vida media" cuando se usa para referirse a lípido: ácidos nucleicos descritos en la presente se refiere al periodo de tiempo que puede ser almacenado el complejo de lípido: ácido nucleico (bajo condiciones definidas por ejemplo, a 4°C) antes de perder su actividad biológica. La actividad biológica ensayada para determinación de vida media en la presente invención es la capacidad del complejo de lípido: ácido nucleico para transfectar células mamíferas in vivo después de la administración intravenosa. La "vida media" de un complejo de lípido: ácido nucleico es determinada convenientemente al ensayar la expresión ae genes de ácidos nucleicos reportadores en el complejo de lípido: ácido nucleico como se describe en la presente. Un "cásete de expresión" se refiere a un promotor enlazado operablemente a una molécula de ADN, que contiene todos los elementos requeridos para expresión de aquella molécula de ADN en una célula viva. El cásete de expresión puede contener elementes adicionales tales como mejoradores, orígenes de replicación y similares, formando un vector de expresión. El "policatión orgánico" o "policatión" se refieren a una estructura polimérica orgánica donde más de una unidad del polímero porta u a carga negativa y la carga neta del polímero es positiva. Ejemplos de tal catión orgánico son poliaminas, incluyendo espermina y espermidina, moléculas de poliamonio tales como polibreno (bromuro de hexadimetrina) , poliaminoácidos básicos, o proteínas básicas. Un "portador farmacéuticamente aceptable" es un material que no es biológicamente o en forma diferente indeseable, es decir, el material puede ser administrar a un individuo junto con el complejo de lípido: ácido nucleico sin provocar efectos biológicos inaceptables o interaccionar en una forma dañina con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la cual está contenida. El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero u oligómero compuesto de unidades nucleótidas (ribonucleótidos, deoxirribonucleótidos o variantes estructurales relacionadas o análogos sintetices de los mismos) enlazados via enlaces fosfodiéster [ z variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de las mismas) . De esta forma, el término se refiere a un polímero de nucleótido en el cual los nucleótidos y los enlaces entre los mismos se presentan en froma natural (ADN c .-.?.-. , así come también varios análogos, por ejemplo y sin limitación, péptido-ácidos nucleicos (PAN) , fosferamidatos, fosforotioatos, fosfenatos de metilo, ácidos 2-0-metilrribonucleicos, y similares. El término "por ciento en mol" cuande se refiere al porcentaje del polímero hidrofílico en un liposoma es expresado con relación al lípido catiónico en el liposoma a menos que se establezca otra cosa. De esta forma, por ejemplo, en un liposoma que comprende una proporción de BDDA a colesterol (Chol) de 100:100, un 4 por ciento en mol de polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG) puede representar una proporción de BDDA: Chol : PEG de aproximadamente 100:100:4. El término "idéntico" se refiere a una composición que se forma usando los mismos compuestos como otra composición, donde las composiciones no difieren en una forma estadísticamente significativa. El término "administración sistemática" se refiere a un método para incrementar un compuesto o una cc-r.pesicicr. a un mamífero de tal forma que el compuesto o la composición se suministra a muchos sitios en el cuerpo via el sistema circulatorio. Como se usa en la presente, "molécula enlazadora" significa una molécula que comprende (a) un dominio hidrofóbico, (b) una cadena de polímero hidrofílico unido terminalmente al demino hidrofebico, y (c) un gr_;ec químico reactivo a uno o más grupos funcionales en una molécula de proteína y unido a ia cadena de polímero en, o cerca de, la terminación contralateral al dominio hidrofóbico. El término "dominio hidrofóbico" de, per ejemplo, una molécula enlazadora, significa un ácido grase, alcohol graso, esterol, u otra molécula hidrofóbica capaz de distribución en una fase lípida desde un medio acuoso. Por ejemplo, un dominio hidrofóbico puede ser un diacilglicerol, un fosfolípido, un esterol, tal como colesterol, o un derivado de diacilamida, tal como N, N-diestearoil-glicineamida. El término "porción de lipido" con referencia a una molécula de proteína significa una disposición compuesta de uno o más dominios hidrofóbicos enlazados directa y covalentemente a la molécula de proteína. Los términos "proteína" y "péptido" son diferenciados generalmente en la técnica por pese molecular, con polipéptidos debajo de 6, CCC Daltcr.es que son considerados péptidos y aquellos en o arriba de 6, 000 Daltones que se consideran proteínas. Véase, per ejemplo, McMurray, Organic Chemistry (Brooks/Cole Publishing Co., Belmont, Ca) (1988), en pag. 971. El uso de estos términos en la presente siguen esta distinción. Esta invención proporciona métodos para incrementar la vida media de complejos de iípidos catiénicos : ácidos nucleicos, y eficiencia de transfección in vivo y/o in vitro de estos complejos. Tales complejos han atraído interés considerable como un medio de suministro de los mismos ácidos nucleicos terapéuticos (por ejemplo, antisentido) . Desafortunadamente, ha sido difícil mantener y almacenar complejos de lípidos: ácido nucleico homogéneos adecuados para administración in vivo. Los complejos tienden a agregarse rápidamente o descomponerse dentro de un tiempo relativamente corto. Esta inestabilidad ha requerido el uso de estos complejos dentro de un periodo de tiempo corto después de la preparación., con frecuencia tan poco como 30 minutos hasta unas cuantas horas. De esta forma, per ejemplo, en pruebas clínicas recientes usando lípidos catiónicos como un portador para suministro de ADN, el ADN y los componentes de lípidos se mezclan en el lecho lateral y se usan inmediatamente (Gao et al. Gene Therapy 2:710-722 (1995)). Esta inestabilidad de lípido: ácido nucleico proporciona un impedimento significativo para la aceptación mundial de los complejos de lípido catiónico: ácido nucleico como agentes terapéuticos. La necesidad de preparación corta del complejo antes de uso requiere que una instalación farmacéutica esté en proximidad relativamente cercana al área de uso. Alternativamente, la combinación del lípido y ácido nucleico en el lecho lateral impone un trabajo substancial de escritorio, introduce problemas de control de calidad para asegurar la formación adecuada del complejo, y crea una fuente de error potencial. La presente invención soluciona estos problemas al proporcionar métodos para incrementar significativamente la vida media (almacenamiento) de los complejos de lípido: ácido nucleico. Los métodos generalmente implican: (1) condensar el ácido nucleico antes de incorporación en el complejo de lípido:ácido nucleico, (2) combinar un complejo de lípido: ácido nucleico con un polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG) ; y (3) ambos condensar el ácido nucleico antes a la formación del complejo y combinar el complejo con un polímero hidrofílico. Mientras que la condensación de ácidos nucleicos puede llevar a la estabilidad del ácido nucleico en aislamiento (por ejemplo, en un amortiguador acuoso) , es un descubrimiento sorprendente de esta invención que el uso de un agente de condensación (por ejemplo, un policatión orgánico) proporciona un complejo de lipidc: ácido nucleico que permanece capaz de transfectar una célula in vivo incluso después de un periodo de almacenamiento prolongado (por ejemplo, almacenamiento a u a temperatura de aproximadamente 22 °C o abajo, más preferentemente en el intervalo de aproximadote 0°C a aproximadamente 22 °C, y más preferentemente en aproximadamente 4°C). ES también un descubrimiento sorprendente que los complejos de lípido: ácido nucleico combinados con un polímero hidrofílico unido a un lípido anfipático (por ejemplo, PEG-PE) muestra también una vida media incrementada. Sin querer unirse a alguna teoría particular, se cree que cuando se pone en contacto el complejo de lípido catiónico: DN ("CLCA") con el polímero hidrofílico, el polímero hidrofílico se ubica y se incorpora en los huecos hidrofóbicos en el complejo vía sus cadenas laterales hidrofóbicas, mientras que llevan a la parte hidrofílica a la superficie exterior, por lo que se estabiliza el complejo completo. En vista de estos descubrimientos, esta invención proporciona métodos para incrementar la vida media de complejos de lípidos catiónicos: ácidos nucleicos. Los métodos implican generalmente ya sea el condensar el ácido nucleico usando un policatión y/o poner en contacto, por ejemplo, recubrir, el complejo de lípido: ácido nucleico con un polímero hidrofílico. Esta invención también incluye los complejos de lípido: ácido nucleico preparados de esta forma. Esta invención además proporciona métodos para formar micropartículas con proteínas unidas adecuadas, por ejemplo, para objetivar las micropartículas a células o tejidos seleccionados. Los métodos proporcionan un número de ventajas sobre los métodos de la técnica anterior: (1) debido a la naturaleza cuantitativa de inserción, el número de proteínas por partícula es altamente reproducible y puede ser más definida con precisión; (2) más de un tipo de proteína de un tipo de proteína puede ser unida a la superficie de la misma partícula, en una proporción precisa; (3) si se purifica el conjugado de proteína-enlazador antes de la inserción en una superficie de la partícula, la partícula no portará enlazadores no conjugados; (4) la partícula puede contener, en su composición, moléculas reactivas con el grupo activo enlazador. Por ejemplo, la partícula puede contener tioles, incluso si el grupo activo es maleimida; (5) si la partícula es una vesícula, las moléculas de enlazador/proteína estarán solamente presentes en la superficie externa; y, (6) el método incrementa la utilidad de partículas conocidas, prehechas, tales como lipcsomas farmacéuticas comercialmente hechas, permitiendo la adición de conjugados unidos por la superficie que portan proteínas de interés. I. Complejos de lipido catiónico : ácido nucleico Como se explica anteriormente, esta invención proporciona métodos para incrementar la vida de almacenamiento (vida media) de complejos de lípidos : ácido nucleico. En una modalidad preferida se forman los complejos por combinación de un ácido nucleico con un liposoma. Se reconoce, sin embargo, que los lípides no necesitan ser proporcionados como un liposoma. Se reconoce también que después de la formación del complejo, el complejo de lípido: ácido nucleico no puede existir más como una vesícula verdadera y por lo tanto no se observa generalmente como un liposoma. La preparación de los complejos de lípidos : ácido nucleico es bien conocida para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, investigación en Cristal, Science 270:404-410 (1995); Baléese et al., Cáncer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); y Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995)). Los varios componentes y la construcción de los complejos de lípido: ácido nucleico estabilizados de la invención se describen detalle a continuación. A. lípidos cationicos anfifílicos Como se indica anteriormente, los métodos de esta invención implican formar en complejo un lípido catiónico con un ácido nucleico. El término "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de un número de especies de lípidos que portan una carga positiva neta en pH fisiológico. Tales iípidos incluyen, pero no se limitan a, DODAC, DOTMA, BDDA, PDOTA, DC-Chol y DMRIE. Adicionalmente, un número de preparaciones comerciales de lípidos catiónicos están disponibles los cuales pueden ser usados en la presente invención. Estos incluyen, por ejemplo, LIPOFECTIN® (liposomas catiénicas comercialmente disponibles que comprenden DOTMA y DOP?, de GIBCO/BRL, Grand Island, Nueva York, E.U.); LIPOFECTAMINE® (liposomas catiónicos comercialmente disponibles que comprenden DOSAPy DOPE, de GIBCO/BRL) ; y TRANSF?CTAM® (lípidos catiónicos comercialmente disponibles que comprenden DOGS en etanol de Promega Corp., Madison, Wisconsin, E.U.).

El lipido catiónico puede ser usado solo, o en combinación con un lípido "auxiliador". Lípidos auxiliadores preferidos son no iónicos o no cargados en pH fisiológico. Lípidos no iónicos particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a colesterol y DOPE, con colesterol que es más preferido. La proporción molar del lípido catiónico a auxiliador puede estar en el intervalo de 2:1 a aproximadamente 1:2, más preferentemente de aproximadamente 1.5:1 a aproximadamente 1:1.5, y más preferentemente es aproximadamente 1:1. Lípidos catiónicos y no iónicos adicionales adecuados para uso en los complejos de iípidos : ácido nucleico de la presente invención son bien conocidos para personas de experiencia en la técnica y se citan en una variedad de fuentes bien conocidas, por ejemplo, McCutcheon's Detergents and Emulsifiers y McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J. Lípidos preferidos incluyen BDDA: colesterol o PDOTA: colesterol en una proporción molar de 1:1. B. Acido nucleico Los complejos de lípidos: ácido nucleico contienen un ácido nucleico, típicamente un cásete de expresión que se construye usando técnicas recombinantes. Se prepara un ácido nucleico recombinante primero aislando el ácido nucleico de interés. El ácido nucleico aislado es entonces ligado en un cásete o vector adecuado para expresión del gen. Métodos para preparar un ácido nucleico recombinante son conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (2a. Edición, 1989)). El gen de interés, por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido terapéutico, o un gen reportador, puede ser insertado en un "vector de expresión". "Vector de clonación" o "vector", términos que usualmente se refieren a plásmidos u otras moléculas de ácidos nucleicos que son capaces de replicarse en una célula huésped elegida y expresar el gen de interés. Los vectores de expresión pueden replicarse autónomamente, o pueden replicarse por ser insertados en el genoma de la célula huésped. Con frecuencia, es deseable un vector para ser usable en más de una célula huésped, por ejemplo, en E. coli para clonación y construcción, y en una célula de mamífero para expresión. Elementos adicionales del vector pueden incluir, por ejemplo, marcadores e incrementadores seieccionables . Los marcadores seleccionables, por ejemplo, resistencia a tetraciclina o resistencia a higrcmicina, permiten detección y/o selección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, la Patente de ios Estados Unidos 4,704,362;. El vector particular usado para transportar la información genética en la célula no es también particularmente crítico. Cualquiera de los vectores convencionales usados para expresión de proteínas recombinantes en células procarióticas o eucarióticas pueden ser usadas. Los vectores de expresión tiene típicamente una unidad de transcripción o cásete de expresión que contiene todos los elementos para la expresión del ácido nucleico en las células huésped. Un cásete de expresión típico contiene un promotor enlazado operablemente a ia secuencia de ADN que codifica una proteína. El promotor es colocado preferentemente alrededor de la misma distancia desde el sitio de inicio de transcripción heterólogo ya que es de su sitio de inicio de transcripción en su fijación natural. Como es conocido en la técnica, sin embargo, alguna variación en esta distancia puede ser acomodada sin pérdida de función promotora. En el cásete de expresión, la secuencia de ácido nucleico de interés puede ser enlazada a una secuencia que codifica una secuencia de péptico de señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transformada. El cásete de expresión debe contener también una región de terminación de transcripción corriente abajo del gen estructural para proporcionar terminación eficiente. La región de terminación puede ser obtenida del mismo gen como la secuencia de promotor o puede ser obtenida de un gen diferente. Para traducción más eficiente en células de mamífero del ARNm codificado por el gen estructural, las secuencias de poliadenilación son agregadas también comúnmente al cásete de expresión. Las señales de terminación y poliadenilación que son adecuadas para la presente invención incluyen aquellas derivadas de SV40, o una copia genómica parcial de un gen ya residente en el vector de expresión. Además del cásete de expresión, muchos vectores de expresión incluyen óptimamente elementos mejoradores que pueden estimular la transcripción hasta 1,C00 veces de los promotores homólogos y heterólogos enlazados. Muchos elementos mejoradores derivados de virus tienen un intervalo de huésped amplio y son activos en una variedad de tejidos. Por ejemplo, el mejorador temprano del gen es adecuado para muchos tipos celulares. Otras combinaciones de mejorador/promotor que son adecuadas para la presente invención incluyen aquellas derivadas del virus de polioma, citomegalovirus, repetición de terminación grande de varios retrovirus tales como el virus de leucemia de murino, virus de murino o de sarcoma Rous, y VIH (véase Enhancer and Eukaryotic Expression (1983) ) . Además a los ácidos nucleicos recombinantes discutidos anteriormente, pueden ser usados también los ácidos nucleicos sintéticos u oligonucleótidos en la invención. Como un punto general con respecto a los ácidos nucleicos usados en la invención, aquellos expertos en la técnica reconocerán que los ácidos nucleicos usados en la invención incluyen ambas moléculas ADN y ARN, así como también análogos que no se presentan en forma natural, sintéticos de los mismos, y heteropolímeros, de deoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o análogos de cualquiera de ellos. La composición particular de un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico dependerá del propósito para el cual será usado el material y el ambiente en el cual el material será colocado. Los nucleótidos no se presentan naturalmente, modificados o sintéticos han sido diseñados para servir una variedad de propósitos y permanecer estables en una variedad de ambientes, tales como aquellos en los cuales las nucleasas están presentes, así como es bien conocido en la técnica. Los nucleótidos que no se presentan naturalmente, modificados o sintéticos, comparados con los ribo o deoxirribunucleótidos que se encuentran naturalmente pueden diferir con respecto al carbohidrato (azúcar) , enlace fosfato o porciones base del nucleótido, o pueden incluso contener una base no nucleótido (o ninguna base) en algunos casos (véase, por ejemplo, Arnold et al., no. de publicación de patente PCT WO 89/02439). Por ejemplo, los ácidos nucleicos que ne se presentan naturalmente o modificados de la invención pueden incluir ácidos nucleicos bioestañados, ácidos nucleicos O-metilados, ácidos nucleicos de estructura principal de metilfosfato, ácidos nucleicos de estructura principal de fosforotioato, o ácidos nucleicos de poliamida. Los oligonucleótidos, tales como ARN antisentido descritos posteriormente, preferentemente son sintetizados en un Applied BioSystems u otro sintetizador de oligonucleótidos comercíalmente disponible de acuerdo a las especificaciones proporcionadas por el fabricante. Los oligonucleótidos pueden ser preparados usando cualquier método adecuado, tal como los métodos de fosfotriéster y fosfodiéster, o modalidades automatizadas de los mismos. En una de tal modalidad automatizada, se usan las dietilfosforamiditas como materiales de partida y pueden ser sintetizados como se describe por Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22: 1859 (1981), y la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066. C. Acido nucleico condensado Las moléculas policatiónicas pequeñas son conocidas para condensar ácidos nucleicos vía interacciones de carga-carga electrostática (Plum et al., Biopolymers 30:631-643 (1990) ) . El pretratamiento de ácido nucleico con poliaminas pueden por lo tanto reducir el número de sitios de carga para formar el complejo con liposomas catiónicos. Sin embargo, el ácido nucleico de condensación antes a la formación del complejo de lípidos produce el resultado sorprendente de vida media incrementada para complejos de lípido: ácido nucleico, como se mide por eficiencia de transfección. Los complejos de lípido: ácido nucleico formados con tal pretratamiento son estables en una proporción inferior de lípido a ADN sin agregación. Los policationes orgánicos tales como poliaminas, moléculas de poliamonio y ácidos poliamino básicos, y sus derivados se usan para condensar el ácido nucleico antes a la formación del complejo de lípidos. Una modalidad preferida usa poliaminas tales como espermidina y espermina para condensar el ácido nucleico (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1) - D. Polímero hidrofílico Se ha establecido recientemente que la incorporación de PEG-FE en liposomas produce estabilización esférica resultando en tiempos de circulación superiores en sangre (Alien et al., Biochem. Biophys. Acta 1066: 29-36 (1991); Papahadjopoulos et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 11460-11464 (1991)). En la presente invención, insertando PEG-FE (por ejemplo, 1% del lipido total) en los complejos de lípido: ácido nucleico recientemente formados evita que los complejos se agreguen durante el almacenamiento. Es un descubrimiento sorprendente, sin embargo, que la incorporación de PEG-FE no inhibe ia actividad de trapsfección in vivo y también que la actividad de transfección in vitro, que se inhibe, se vuelve a obtener por la incorporación del fragmento Fab' conjugado en el final del PEG-PE. La presencia de polímeros hidrofílicos en el complejo de lípido: ácido nucleico proporciona vida media incrementada, como se mide por la eficiencia de transfección después del almacenamiento. De esta forma, es deseable agregar un polímero hidrofílico tal como polietilenglicol (PEG) -lípidos modificados o gangliosida GM? a los liposomas. El PEG puede ser derivado también con otras moléculas antipáticas tales como ácidos grasos, esfingolípidos, glicolípidos y colesterol. La adición de tales componentes evita la agregación de liposomas durante el acoplamiento de la porción de objetivación al liposoma. Estos componentes también proporcionan un medio para incrementar el tiempo de vida de circulación de los complejos de lipido: acide nucleico. Puede ser usado un número de métodos diferentes para la preparación de PEG para incorporación en los liposomas. En una modalidad preferida, se incorpora PEG como PEG derivado de fosfatidiletanolamina (PEG-PE) o PEG derivado de diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSFE) . Los métodos para preparar PEG-PEG son bien conocidos e implica típicamente usar un PEG metoxi activado (con solamente un extremo reactivo) y PE. De esta forma el PEG-succinato de succinimidilo pueden ser reaccionados en un solvente organice básico (Klibanov et al., FEBS Lett. 268:235-237 (1990)). Un método particularmente preferido de preparación de PEG-FE se basa en la reacción de PEG con carbonildiimidazol seguido por la adición de FE (véase Woodle et al., Proc. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 17:77-78 (1990); Papahadjopoulos et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 11460-11464 (1991); Alien et al., Biochim. Biophys. Acta. 1366: 29-36 (1991); Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105: 193-200 (1992); y Woodle et al., Period. Biol. 93: 349-352 (1991)). Similarmente, el PEG activado, con cloruro cianúrico en un solvente orgánico básico se describe por Blume et al., Biochim. Biophys. Acta. 1029: 91-97 (199C) y Patente de los Estados Unidos NO. 5,213,804. Un procedimiento completamente diferente se basa en el acoplamiento del PEG con liposomas preformados utilizando PEG activado con cloruro de tresilo el cual es entonces agregado a los liposomas que contienen el PEG en un pH superior (Sénior et al., biochim. Biophys. Acta. 1062:77-82 (1991)). El PEG derivado está también comercialmente disponible. De esta forma, por ejemplo, el PEG-FE es disponible de Avanti Polar lipids (Alabaster, Alabama) . Un experto en la técnica reconocerá que muchos otros enlaces están disponibles, por ejemplo, detergentes enlazados a PEG tales como tweens e inserción de PEG derivado de lípido en complejos de lípido: ácido nucleico formados. E. fragmento del anticuerpo de Fab' En una modalidad preferida, los complejos de lípido: ácido nucleico de la presente invención sen conjugados al fragmento Fab' de un anticuerpo, el cual actúa como una porción de objetivación permitiendo al complejo de lípido: ácido nucleico enlazarse específicamente a una célula objetivo que porta la molécula objetivo (por ejemplo, el marcador característico) al cual el fragmento de anticuerpo Fab' se dirige. Los péptidos más pequeños de la región hipervariable o de otro péptido que interacciona con un ligando de superficie celular específico pueden también ser conjugados a los complejos. En términos generales, el fragmento Fab' de un anticuerpo representa un monómero que comprende las regiones variables y la región C 1 de una extremidad de un anticuerpo. Una de tal modalidad preferida se describe en el Ejemplo 2. Un "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos substancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de imunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu constantes, así cerno también los genes de la región variable de inmunoglcbulina miríada. Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea cerno kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas gamma, mu, alfa, delta c epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente .

Es conocida la unidad estructural (anticuerpo) de inmunoglobulina básica para comprender el tetrá ero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kD) . La terminación N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables para reconocimiento de antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a aquellas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. En particular, la pesina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región impedida para producir un dimero F(ab) '2 de Fab' el cual por si mismo es una cadena ligera unida a VH-CK1 por un enlace disulfuro. El F(ab) '2 puede ser reducido bajo condiciones suaves para romper el enlace disuifuro en la región impedida por lo que convierte el dímero F(ab) '2 al monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región impedida (véase Fundamental Im unology, W.?. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) para más terminología de fragmento de anticuerpo). Mientras el fragmento Fab' se define en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que tales fragmentos Fab' pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Los fragmentos Fab' usados en la presente invención pueden ser derivados de anticuerpos de animal (especialmente ratón o rata) u origen humano o pueden ser quiméricos (Morrision et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)) o humanizados (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) , y publicado per la solicitud de patente del Reino Unido No. 8707252) . Se selecciona el fragmento Fab' para enlazarse específicamente a una molécula c marcador característico de la superficie de las células a las cuales se desea suministrar los contenidos del complejo de lípido catiónico: ácido nucleico. Una molécula es característica de células, tejido, o estado fisiológico cuando aquella molécula es encontrada típicamente en asociación con aquel tipo celular o alternativamente e una multiplicidad de tipos celulares todos que expresan una condición fisiológica particular (por ejemplo, transformación) . Un marcador característico específico se encuentra preferentemente en las superficies de células de un tejido particular o tipo celular o en las superficies de tejidos o células que expresan una condición fisiológica particular y no en otro tejido o tipo celular en el organismo, un experto en la técnica reconocerá sin embargo, que tal nivel de especificidad del marcador no se requiere con frecuencia. Por ejemplo, un marcador de superficie celular característico mostrará suficiente especificidad a tejido si los tejidos no objetivos únicos no son accesibles al complejo de lípido: ácido nucleico. Alternativamente, la especificidad efectiva puede ser lograda por sobre expresión del marcador en el tejido marcador como se compara con otros tejidos. Esto resultará en una captación preferencial por el tejido objetivo llevando a especificidad de tejido efectiva. De esta forma por ejemplo, muchos cánceres se caracterizan por la sobre expresión de marcadores de superficie celular tal como el receptor codificado de prot-oncogen HER2 (c-erbB-2) en el caso de cáncer de mama. Un experto en la técnica reconocerá que hay numerosos marcadores de superficie celular que proporcionan buenas características de marcadores dependiendo del tejido particular deseado para objetivar. Los marcadores de superficie celular incluyen, pero no se limitan a carbohidratos, proteínas, glicoproteínas, complejos MHC, interleucinas, y proteínas receptoras tales como proteínas receptoras HER, CD4 y CD8 así como también otras proteínas receptoras de factor de crecimiento y hormonas. Los receptores de factor de crecimiento son marcadores de superficie celular característicos particularmente preferidos. Los receptores de factor de crecimiento son receptores de superficie celular que enlazan específicamente factores de crecimiento y por lo tanto median una respuesta celular característica del factor de crecimiento particular. El término "factor de crecimiento" como se usa en la presente, se refiere a una proteína o ligando de polipéptido que activa o estimula la división o diferenciación celular o estimula la respuesta biológica como motilidad o secreción de proteínas. Los factores de crecimiento son bien conocidos a aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento de transformación ß (NGF) , factores de crecimiento de fibroblasto (FGF) , interleucina 2 (IL2) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , interleucina 3 (IL3) , interleucina 4 (IL4), interleucina 1 (IL1) , interleucina 6 (IL6) , interleucina 7 (IL7) , factor de colonias-estimulación de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) , factor de colonias-estimulación de granulocitos (G-CSF) , factor de colonias-estimulación de macrófagos (M-CSF) , eritropoyetina, receptor de interleucina 13 (IL13R) , y similares. Un experto en la técnica reconoce que el término de factor de crecimiento como se usa en la presente incluye generalmente citocinas y factores de estimulación de colonias . Marcadores particularmente preferidos se encuentran en la familia HER de receptores de factores de crecimiento. Más específicamente HERÍ, HER2, HER3 y HER4 son más preferidos con HER que es el más preferido. Los receptores HER comprenden proteínas tirosina quinasas que por si mismas proporcionan objetivos de anticuerpos altamente específicos. De esta forma, en una modalidad, la tirosina quinasa P185 de HER2 proporciona un objetivo más preferido para el fragmento de Fab' del utilizado en los complejos de inmunolipidos: ácido nucleico, de la presente invención. Se apreciará que el marcador característico no será un marcador que se presenta naturalmente, sino que puede ser introducido a la célula objetivo particular. Esto puede ser realizado al etiquetar directamente una célula o tejido con un marcador particular (por ejemplo, al inyectar directamente el tejido objetivo particular con un marcador, o alternativamente al administrar al organismo entero un marcador que es incorporado selectivamente por el tejido objetivo. En una modalidad, el marcador puede ser un producto de gen que se codifica por un ácido nucleico en un cásete de expresión. El gen marcador puede estar bajo el control de un promotor que se activa solamente en las células objetivo particulares. De esta forma la introducción de un vector que contiene el cásete de expresión resultará en la expresión del marcador en solamente las células objetivo particulares. Un experto en la técnica reconocerá que hay numerosos procedimientos que utilizan metodología de ADN recombinante para introducir marcadores característicos en células objetivo. En una modalidad preferida, la porción de objetivación enlazará específicamente productos o componentes de un receptor de factor de crecimiento, en particular productos del proto-oncogen HER2 (c-erbB-2, neu) . Es particularmente preferido que la porción de objetivación enlaza el receptor de factor de crecimiento tirosina quinasa codificada por HER2, proteína pl85HERB2, la cual es sobre expresada en cánceres de seno (Slamon et al., Science 235: 177-182 (1987) . Otros objetivos adecuados para la porción de objetivación incluyen, pero no se limitan a EGFR (HERÍ), HER3, y HER4, combinaciones de estos receptores, y otros marcadores asociados con cánceres. Otros anticuerpos de interés incluyen, pero no se limitan a BR96 (Friedmar. et al., Cáncer Res. 53:334-339 (1993), e23 a erb32 (Batra et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5867-5871 (1992)). PR1 en cáncer de próstata (Brinkman et al., Proc. Nati. A.cad. Sci. USA. 90: 547-551 (1993)). Y Kl en cáncer de ovario (Chang et al., Int. J. Cáncer 50: 373-381 (1992). Los complejos de inumnolipidos : ácido nucleico de la presente invención pueden ser preparados al incorporar el fragmento Fab' en los liposomas o iípidos por una variedad de técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se agrega el Fab' al complejo de lípido: ácido nucleico ya sea antes o después de la formación del complejo. Por ejemplo, puede ser enlazado un conjugado de bioestaño Fab' a un liposoma que contiene una estreptavidina. Alternativamente, el Fab' bioestañado puede ser conjugado a una biotina derivada de liposoma por un enlazador de avidina o estreptavidina. De esta froma, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal bioestañado es bioestañado y unido a lipoeomas que contienen fosfatidiletanolamina bioestañada por medio de un enlazador de avidina (véase, por ejemplo, Ahmad et al., Cáncer Res. 52: 4817-4820 (1992)). Típicamente se usan aproximadamente 30 a 125 y más típicamente aproximadamente 50 a 100 fragmentos Fab' por complejo de lípido: ácido nucleico. En una modalidad preferida, la porción de objetivación puede ser conjugada directamente al liposoma. Tales medios de conjugación directa son bien conocidos por aquellos expertos en al técnica (véase, por ejemplo, Gregoriadis, Liposoma Technology (1984) y Lasic, Liposomes : from Physics to Applications (1993 ). Es particularmente preferida la conjugación a través de un enlace tioéter. Esto puede ser realizado al reaccionar el anticuerpo con una maleimida derivada de lípido tal oomo una maleimida derivada de fosfatidiletanolamina (M-PE) o dipalmitoiletanolamina (M-DEP) . Este procedimiento se describe en detalle por Martin et al., J. Biol. Chem. 257:257-288 (1982). II. Preparación de liposomas Están disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas como se describe en por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); Patentes de los Estados Unidos No. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787; Publicación PCT No. WO 91/17424; Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198 (1978); Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634 (1976); Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55-65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161-168 (1986); Williams et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 242-246 (1988), Liposomes, chi. 1 (Ostro, ed., 1983); y Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986). Métodos adecuados incluyen, por ejemplo, sonicación, extrusión, presión alta/homogenización, microfluidización, diálisis de detergente, fusión inducida por calcio de vesículas de liposoma pequeña, y métodos de infusión de éter, todos bien conocidos en la técnica. Un método produce vesículas multilaminares de tamaños heterogéneos. En este método, se disuelven los lípidos que forman vesículas en un solvente o sistema de solvente orgánico adecuado y se seca bajo vacío o un gas inerte para formar una película de lípido delgada. Si se desea, la película puede ser redisuelta en un solvente adecuado, tal como butanol terciario, y después se liofiliza para formar una mezcla lípida más homogénea la cual es una forma similar a polvo más fácilmente hidratada. Esta película se cubre con una solución amortiguada acuosa y se permite hidratar, típicamente sobre un periodo de 15-60 minutos con agitación. La distribución de tamaño de las vesículas multilaminares resultantes pueden ser desplazadas hacia tamaños más pequeños al hidratar los lípidos bajo condiciones de agitación más vigorosas o al agregar detergentes de solubilización tales como deoxicolato. En una modalidad preferida, los liposomas más unilaminares son producidos por el método de evaporación de fase inversa de Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978). Las vesículas unilaminares son preparadas generalmente por sonicación c extrusión. La sonicación es realizada generalmente con un sonificador del tipo de baño, tal como sonificador de puntal Branson en una temperatura controlada como se determina por el punto de fusión del lípido. La extrusión puede ser llevada a cabo por extrusores de biemembrana, tales como el ?xtrusor de Biomembrana Lipex. El tamaño de poro definido en los filtros de extrusión puede generar vesículas liposomales unilaminares de tamaños específicos. Los liposomas pueden también ser formados por extrusión a través de un filtro de cerámica asimétrico, tal como Ceraflow Microfilter, disponible comercialmente de Norton Company, Worcester, MA. Siguiendo la preparación de liposomas, los liposomas que no han sido dimensionados durante la formación pueden ser dimensionados por extrusión para lograr un intervalo de tamaño deseado y distribución relativamente estrecha de tamaños de liposomas. Un intervalo de tamaño de aproximadamente 0.2-0.4 micrones permite que la suspensión de liposomas sea esterilizada por filtración a través de un filtro convencional, típicamente un filtro de 0.22 micrones. El método de esterilización de filtro puede ser realizado en una base de puesta de paso alta si los liposomas han sido dimensionados a aproximadamente 0.2-0.4 micrones. Varias técnicas son disponibles para di ensionar liposomas a un tamaño deseado. Un método de dimensionamiento se describe en las Patentes de los Estados Unidos NO. 4,529,561 ó 4,737,323. Sonicar una suspensión de liposomas ya sea por sonicación de baño o sonda produce una reducción de tamaño progresiva a vesículas unilaminares pequeñas menores a aproximadamente 0.05 micrones en tamaño. La homogenización es otro método que confía en la energía de compartición para fragmentar liposomas grandes en más pequeñas. En un procedimiento de homogenización típico, las vesículas multilaminares son recirculadas a través de un homogenizador de emulsión estándar hasta que los tamaños de liposoma seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0.1 y 0.5 micrones, se observan. El tamaño de las vesículas liposomales pueden ser determinadas por difusión de luz cuasi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981). El diámetro de liposoma promedio puede ser reducido por sonicación de liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitentos pueden ser alternados con evaluación QELS para guiar la síntesis de liposomas. La extrusión de liposomas a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana cerámica asimétrica es también un método efectivo para reducir los tamaños de liposomas a una distribución de tamaño relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión se hacer circular a través la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño de liposoma deseada, los liposomas pueden ser extruidos a través de membranas de toro sucesivamente más pequeñas, para lograr una reducción gradual en el tamaño del liposoma. Para uso en la presente invención, los liposomas tienen un tamaño de aproximadamente 0.05 micrones a aproximadamente 0.5 micrones. Son más preferidos los liposomas que tienen un tamaño de aproximadamente 0.C? a 0.2 micrones.

III. Formación de complejos de lipido: ácido nucleico Es un descubrimiento de la invención que los complejos de lípido: ácido nucleico estabilizados (por ejemplo, que tienen un ácido nucleico condensado y/o polímero hidrofílico) no tienden a formar agregados grandes visibles y tienen eficiencia de transfección y vida media incrementadas. Las proporciones de ácido nucleico/liposoma para preparar complejos de lípido: ácido nucleico que no forman agregados grandes visibles pueden ser determinadas por un experto en la técnica. Típicamente, se determina la proporción al mezclar cantidades fijas de un ácido nucleico, por ejemplo, un piásmido, a varias cantidades de liposcmas véase el ejemplo 1). En general, se forman los complejos de lípidos : ácido nucleico al pipetear el ácido nucleico (por ejemplo, ADN de plásmido) en una suspensión de liposoma de igual volumen y mezclar rápidamente. Rutinariamente, los liposomas que contienen 5-15 nmoles de un lípido tal como 33DA o DOPE (como se describe anteriormente) forman un complejo con 1 µg de plásmido, sin formar agregados grandes visibles. La inspección para agregados grandes visibles se realiza típicamente sin la ayuda de un microscopio. ?l punto final de la titulación de las cantidades de lípido y ácido nucleico se logra también al ensayar para eficiencia de transfección incrementada, ya sea in vitro o in vivo, comparado con un control no estabilizado (como se describe posteriormente) .

Para mantener los complejos de lípidos : ácido nucleico sin formar agregados grandes y perder actividad de transfección con el tiempo, se toman dos procedimientos: (1) incorporar una cantidad pequeña de un polímero hidrofílico tal como PEG-FE (aproximadamente 1% de proporción molar) en los complejos de lípido:ácido nucleico dentro de unos cuantos minutos después de su preparación; y/o (2) condensar el ácido nucleico con un policatión tal como una poliamina (por ejemplo, aproximadamente 0.05 a 5.0 nmoles de espermidina por µg de ADN) antes de mezclar con los liposomas. La cantidad opcional de las poliaminas y el polímero hidrofílico puede ser determinada por u experto en la técnica al titular la poliamina o polímero hidrofílico con el ácido nucleico de tal forma que los complejos formados no forman agregados grandes, por ejemplo visibles. El tamaño de estos complejos de lípido: ácido nucleico puede ser estimado por difusión de luz dinámico para estar en ei intervalo de 410 +_ 150 nm. El punto final de la titulación se logra también al ensayar eficiencia de transfección incrementada ya sea ip vitro o ir. vivo, comparado con un control no estabilizado (como se describe posteriormente) . IV. Transfección y terapia de genes con complejos de lipido: ácido nucleico La presente invención proporciona complejos de lípido: ácido nucleico que tiene vida media incrementada, para transfección de células de mamíferos in vitro, in vivo, y ex vivo, y métodos de producción y transfección de tales complejos. En particular, esta invención depende en parte del descubrimiento inesperado que un complejo de lípido: ácido nucleico que comprende ácido nucleico que ha sido condensado por contactar con un policatión orgánico demuestra una vida media incrementada. Además, esta invención descansa en el descubrimiento inesperado que un complejo de lípido: ácido nucleico, el cual se mezcla con un polímero hidrofílico después de la formación del compiejo de lípido: ácido nucleico, exhibe actividad de transfección alta y vida media incrementada, como se mide por actividad de transfección después del almacenamiento. Tales complejos de lípido: ácido nucleico que tienen vida media incrementada son útiles, por ejemplo, para transfección in vitro y ex vivo de células y para suministro de ácidos nucleicos en las células para terapia de genes mamíferos in vivo y siguiendo administración intravenosa. Usar complejos de líptde: ácido nucleico para suministrar ácidos nucleicos en diferentes tipos celulares de mamíferos resulta en un. método segure de transferencia, y alta eficiencia de transferencia de genes. La transfección de células in vivo con complejos de lípido: ácido nucleico es conocida para aquellos expertos en la técnica y puede ser realizada usando técnicas estándar, como se discute en el Ejemplo 1 (véase, por ejemplo, Sambrcck et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) ) . Cualquier ácido nucleico heterólogo que es adecuado para introducción en una célula huésped puede ser usado en la presente invención por un experto en la técnica. Genes útiles para terapia de genes pueden ser introducidos en mamíferos usando los métodos y vectores de esta invención. Los genes que codifican proteínas sanguíneas, enzimas, hormonas, ribozimas, ARN antisentido, inhibidores virales, y proteínas de canal de iones son ejemplos de ácidos nucleicos heterólogos útiles en terapia de genes. Un gen heterólogo funcional puede ser usado para reemplazar un gen mutado en un mamífero usando terapia de genes. ?cr ejemplo, el gen que codifica ß-globina puede ser usado para tratar ß-talasemia; y el gen que codifica CFTR puede ser usado para tratar fibrosis cística. Los genes que codifican marcadores seleccionalbes, tales como aquellos que confieren resistencia a antibióticos, pueden ser usados para detectar y asilar células transfectadas con el complejo de lípido: ácido nucleico. Los genes reportadore tales como luciferasa, ß-galactosidasa, cloranfenicolacetil transferasa (CAT) , hormona de crecimiento humana (hGH) , y la protéina fluorescente verde (GFP) se prefieren ejemplos de genes que pueden ser usados en ensayos para determinar eficiencia de transfección. En una modalidad de la invención, puede ser usada la luciferasa como un gen reportador para determinar eficiencia de transfección. La eficiencia de transfección de un gen reportador puede ser determinada con un ensayo que es apropiado para el gen reportador en uso. Tales ensayos son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de reportador HGH se basa inmunológicamente y emplea equipos de radioinmunoensayo comercialmente disponibles. En una modalidad preferida de la invención, el ensayo de luciferasa se usa para detectar transfección y expresión del gen reportador de luciferasa. El ensayo de luciferasa se prefiere ya que es altamente sensible y no usa radioactividad. Un luminómetro puede ser usado para medir la actividad de enzima luciferasa, como se describe en el Ejemplo 1. La terapia de genes proporciona métodos para combatir enfermedades infecciosas crónicas tales como infección de VIH, así como también enfermedades no infecciosas tales como cáncer y defectos de nacimiento (véase generalmente Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Yu et al., gene Ther. 1: 13-26 (1994)). La terapia de genes puede ser usada para transducir células con ya sea un procedimiento ex vivo o in vivo. Métodos ex vivo para terapia de genes implican transducir el exterior de la célula del mamífero con un complejo de lípidc: ácido nucleico de esta invención, e introducir de nuevo la célula en el organismo. Las células pueden ser células germinales hematopoyéticas aisladas de médula ósea u otras células que pueden ser transfectadas por complejos de lípido:ácido nucleico. En humanos, las células germinales hematopoyéticas pueden ser obtenidas de una variedad de fuentes incluyendo sangre de la médula, médula espinal, y sangre periférica movilizada. La purificación de células CD34+ puede ser realizada por procedimientos de afinidad de anticuerpos (véase Ho et al., Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105 (1995); véase también Brenner, J. Hematotherapy 2: 7-17 (1993)). Las células pueden ser aisladas también y cultivadas de pacientes. Alternativamente, las células usadas para procedimientos ex vivo pueden ser aquellas almacenadas en un banco de células (por ejemplo, banco de sangre) . La ventaja de usar células germinales es que pueden ser diferenciadas en otros tipos celulares in vitro, o pueden ser introducidas en un mamífero (tal como el donador de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Los métodos para diferenciar células de médula espinal in vitro en tipos celulares inmunes clínicamente importantes usando citocinas tales como GM-CSF, IFN-? y TNF-28 son conocidos (véase, por ejemplo, Inaba et al., J. Expr. Med. 176: 1693-1702 (1992)). El suministro de un ácido nucleico puede ser logrado también usando terapia de genes in vivo. Los complejos de lípido: ácido nucleico de la invención pueden ser administrados directamente a un paciente, preferentemente un humano. La administración in vivo y ex vivo es por cualquiera de las rutas usadas normalmente para introducir una molécula o célula en último contacto con sangre o células de tejido. Los complejos de lípido -.ácido nucleico de la invención son administrados en cualquier forma adecuada, preferentemente con portadores farmacéuticamente aceptables. Métodos adecuaods de administrar tales partículas no virales en el contexto de la presente invención a un paciente son conocidos por aquellos epxertos en la técnica. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas son administradas usando administración de aerosol (por ejemplo, usando un nebulizador u otro dispositivo de formación de aerosol) , y parentalmente, es decir, intra arterialmente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutáneamente, o intramuscularmente. Más preferentemente, las composiciones farmacéuticas son administradas vía administración de aerosol o intravenosamente o intraperitonealmente por una inyección de bolo. Formulaciones particulares que sen adecuadas para este uso se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed. 1985) . Típicamente, las formulaciones comprenderán una solución de complejos de lípido: ácido nucleico suspendidos en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. V. Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas que comprenden los complejos de lípido: ácido nucleico de la invención se preparan de acuerdo a técnicas estándar y además comprenden un portador farmacéuticamente aceptables. Generalmente, será empleada solución salina normal como el portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados incluyen, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución isotónica (por ejemplo, dextrosa), solución salina al 0.4%, glicina al 0.3%, y similares, incluyendo glicoprotéinas para estabilidad incrementada, tales como albúmina, lipoproteína, globulina, etc. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser empacadas para uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada que se combina con una solución acuosa estéril antes a la administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para condiciones fisiológicas aproximadas, tales como agentes de ajuste y amortiguamiento de pH, agentes de ajuste de tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Adicionalmente, la suspensión del complejo de lípido: ácido nucleico puede incluir agentes protectores de lípidos que protegen a los lípidos contra los daños y almacenamiento de radicales libres y lípidos peroxidativos. Los detenedores de radicales libres lipofílicos, tales como alfatocoferol y quelantes específicos a fierro solubles en agua, tales como ferrioxamina, son adecuados. La concentración de complejos de lípido: ácido nucleico en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente C.05%, usualmente en o por lo menos aproximadamente 2-5% a tanto como 10 a 30% en peso y será seleccionada principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Por ejemplo, la concentración puede ser incrementada para disminuir la carga de fluido asociada con el tratamiento. Esto puede ser particularmente deseable en pacientes que tienen insuficiencia cardiaca congestiva asociada a ateroscleresis o hipertensión severa. Alternativamente, los complejos de inmunolípidos: ácidos nucleicos compuestos de lípidcs de irrigación pueden ser diluidos a concentraciones bajas para disminuir la inflamación en el sitio de administración. La cantidad del complejo de lípido: ácido nucleico administrado dependerá del Fab' particular usado, el estado de enfermedad que se trate, y el juicio del médico. Generalmente la cantidad de complejos de lípido: ácido nucleico administrados será suficiente para suministrar una dosis terapéuticamente efectiva del ácido nucleico. La cantidad del complejo de Iípido:ácido nucleico necesaria para suministrar una dosis terapéuticamente efectiva puede ser determinada por un experto en la técnica. Dosis de complejo de lípido: ácido nucleico típicos generalmente estarán entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 50 mg de ácido nucleico por kilograma de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 10 mg de ácido nucleicc/kg de peso corporal, y más preferentemente entre aproximadamente 2.0 y aproximadamente 5.0 mg de ácido nucleico/kg de peso corporal. Para administración a ratones, la dosis es típicamente 50-100 µg por g de ratón. VI. Ensayo de vida media de sangre Un auxiliar para localización de lípido: ácido nucleico en un tejido objetivo es la vida media del complejo de lípido: ácido nucleico extendida en la corriente sanguínea después de la administración. Una medición de la vida media del complejo de lípido: ácido nucleico en la corriente sanguínea es la proporción de sangre/RES determinada en un tiempo seleccionadc después de la administración del complejo. Típicamente ios complejos de lípido:ác?ce nucleico que contienen una etiqueta (por ejemplo, un marcador fluorescente, reactivo denso de electrones, o marcador radioactivo) , ya sea interno en el complejo o enlazado a un lípido que comprende el complejo se inyectar, en el organismo de prueba. Un periodo fijo de tiempo posterior, se sacrifica el organismo y la cantidad de etiqueta detectada en la sangre (por ejemplo, al medir luminiscencia, o conteo de escintilación) se compara con aquella ubicada en tejidos particulares (por ejemplo hígado o bazo) . El curso de tiempo de retención de los complejos de lípidos: ácido nucleico en la sangre pueden también ser simplemente determinados al muestrear sangre en intervalos fijos después de la administración de complejos de lípido: ácido nucleico que contienen etiquetas y determinar la cantidad de etiqueta que permanece en ia circulación. El resultado puede ser expresado como la fracción de la dosis original . VII. Ensayo de transfección de tejido por los complejos de lipido:ácido nucleico La transfección de células objetivo por los complejos de lípido: ácido nucleico de esta invención puede ser determinada similarmente al administrar complejos de lípido: ácido nucleico que contienen un ácido nucleico que es por sí mismo detectable o que codifica un producto detectable. Se recolectan entonces muestras biológicas (por ejemplo, biopsias de tejido o muestras de fluido) y se ensayan para transfección al detectar la presencia del ácido nucleico transfectado por si mismo o por detectar la presencia del producto expresado del ácido nucleico. El mismo ácido nucleico puede ser seleccionado para tener una secuencia que es fácilmente detectable, por ejemplo, por amplificación de ácido nucleico. En este ejemplo, el ácido nucleico puede ser seleccionado que tenga sitios de imprimidor seleccionados para permitir así amplificación única del ácido nucleico objeto y no a otra muestra del tejido biológico que se ensaya para transfección. Los medios para detectar secuencias de ADN específicas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden ser usadas sondas de oligonucleótidos elegidas para ser complementarias a una subsecuencia seleccionada con la región. Alternativamente, las secuencias o subsecuencias pueden ser amplificadas por una variedad de técnicas de amplificación de ADN incluyendo, pero no limitado a reacción de cadena polimerasa (RCP) (Innis et al., PCR Protocols: Aguide to Methods and Application (1990)), reacción de cadena ligasa (RCL) (véase Wu & Wallace, Genomics 4:560 (1989)); Landegren et al., Science 241: 1077 (1988); Barringer et al., Gene 89:117 (1990), amplificación de transcripción (Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86:1173 (1989)), y replicación de secuencia autoscstenida (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 87:1874 (1990)). En una modalidad particularmente preferida, la transfección se evalúa por detectar la presencia o ausencia o cuantificar un producto de gen en uno o más tejidos. Cualquier gen que exprese un producto ensayable fácilmente proporcionará un indicador adecuado para el presente ensayo. Los genes reportadores adecuados son bien conocidos para aquellos de experiencia en la técnica. Ellos incluyen, pero no se limitan a, cloranfenicolacetil transferasa bacteriana (CAT), o luciferasa (véase, por ejemplo, Alam et al., Analytical Biochemistry 188: 245-254 (1990). Un gen reportador particularmente preferido es el gen Flux como se ilustra en los Ejemplos. VIII. Ensayo de vida media Como se indica anteriormente, el término de "vida media" se usa en la presente para referirse al periodo de tiempo del complejo de lípido: ácido nucleico que puede ser almacenado (bajo condiciones definidas por ejemplo, en un amortiguador en 4°C) antes de perder su actividad biológica. La actividad biológica ensayada para determinación de la vida media en la presente invención es la capacidad del complejo de lípido: ácido nucleico para transfectar células mamíferas in vivo después de administración intravenosa. En una modalidad preferida ia vida media se determina al almacenar los complejos de iípido: ácido nucleico por varios periodos de tiempo, inyectar uno o más animales de prueba con el complejo y ensayar tejidos seleccionados en el animal para transfección (por ejemplo, expresión de un gen reportador) como se describe anteriormente y como se ilustra en los ejemplos.

Se apreciará que la vida media puede ser expresada en términos absolutos, es decir, la longitud de tiempo que la composición puede ser almacenada antes de perder la actividad. Alternativamente, la vida media puede ser expresada en términos relativos por referencia a una composición diferente. De esta forma, por ejemplo, cuando el complejo objeto muestra actividad de transfección después de un periodo fijo de almacenamiento para la misma cantidad de tiempo, el complejo objeto es para tener una vida media incrementada comparado con el complejo diferente. IX. Objetivar los complejos de lipido: ácido nucleico a tejidos específicos Las porciones de objetivación especificas pueden ser usadas con los complejos de lípido: ácido nucleico de la invención para objetivar células o tejidos específicos. En una modalidad, la porción de objetivación, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se une a un polímero hidrofílico y se combina con el complejo de lípido: ácido nucleico después de la formación del complejo. De esta forma, el uso de una porción de objetivación en combinación con un efecto genérico de complejo de lípido: ácido nucleico proporciona la capacidad para hacer al gusto convenientemente el complejo para suministrar a tejidos y células específicos. Ejemplos de efectores en complejos de lípido: ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos que codifican citotoxinas (por ejemplo, toxina difteria (DT) , exotoxina de Pseudomonas A (PE), toxina de pertussis (PT), y la adenilato ciclasa de pertussis (CYA) , ácido nucleico antisentido, ribozimas, ácidos nucleicos etiquetados, y ácidos nucleicos que codifican genes supresores de tumores tales como p53, pllORb, y p72. Estos efectores pueden ser objetivados específicamente a células tales como células cancerosas, células inmunes (por ejemplo, células B y T) , y otros objetivos celulares deseados con una porción de objetivación. Por ejemplo, como se describe anteriormente, muchos cánceres se caracterizan por sobre expresión de marcadores de superficie celular tales come H?R2, que se expresa en células de cáncer de seno, o IL17R, que se expresa en gliomas. Las porciones de objetivación tales como anticuerpos anti-HER2 y anticuerpos anti-IL17R o fragmentos de anticuerpos se usan para suministrar ei complejo de lípido: ácidonucleico a la célula de elección. La molécula efectora es suministrada de esta forma al tipo celular específico, proporcionando un tratamiento terapéutico específico y útil. X. Equipos de complejo de lípido: ácido nucleico La presente invención proporciona también equipos para preparar les complejos de lípido: ácido nucleico descritos anteriormente. Tales equipos pueden ser preparados de materiales y reactivos fácilmente disponibles, como se describe anteriormente. Por ejemplo, tales equipos pueden comprender cualquiera o más de los siguientes materiales: liposomas, ácido nucleico (condensado o no condensado), polímeros hidrofílicos, polímeros hidrofílicos derivados con porciones de objetivación tales como fragmento de Fab', e instrucciones. Una amplia variedad de equipos y componentes pueden ser preparados de acuerdo a la presente invención, dependiendo del usuario prepuesto del equipo y las necesidades particulares del usuario. Por ejemplo, el equipo puede contener cualquiera de un número de porciones de objetivación para objetivar el complejo a un tipo celular específico, como se describe anteriormente. El equipo puede incluir opcionalmente materiales de instrucción que contienen direcciones (es decir, protocolos) que proporcionan el uso del complejo de lipido: ácido nucleico catiónico para transfectar células in vivo, ex vivo, o in vitro. Típicamente, los materiales de instrucción describen el procedimiento para preparar el complejo de lípido: ácido nucleico de liposomas y ácido nucleico, como se describe anteriormente. Los materiales de instrucción también describen cómo mezclar el polímero hidrofílico con el compiejo de lípido: ácido nucleico. Adicionalmente, los materiales de instrucción pueden describir procedimientos para transfectar células con el complejo de lípido: ácido nucleico. Mientras que los materiales de instrucción típicamente comprenden materiales escritos o impresos, no se limitan a tales. Cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final está contemplado por esta invención. Tales medios incluyen, pero no se limitan a medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips) , medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Tales medios pueden incluir direcciones a sitios de internet que proporcionan tales materiales de instrucción. XI. Preparación de micropartículas lipídicas con proteínas unidas a superficies A. General La presente invención también proporciona la preparación de micropartícuias lipídicas con proteínas unidas en la superficie. Como se nota en la sección de antecedentes, anterior, la técnica enseña que proteínas solubles tales como anticuerpos son tan grandes que su tendencia para solubilizar arrolla la tendencia de un dominio hidrofóbico de una molécula enlazadora unida a la proteína para llegar a ser asociada establemente con micropartícula lipídica. La enseñanza ha sido por lo tanto que, mientras péptidos pequeños conjugados a una molécula enlazadora de aproximadamente el mismo tamaño o mayor puede permitir el dominio hidrofóbico de una molécula enlazadora para llegar a ser asociada establemente con una micropartícula lipídica, proteínas conjugadas a una molécula enlazadora, que son mucho menors que la proteína, pueden no permitir hacerlo. Se ha encontrado en la presente que, contrario a las enseñanzas de la técnica, las proteínas muchas veces más grandes que una molécula enlazadora pueden ser conjugadas a una molécula enlazadora y todavía ser exitosa y establemente enlazada a una micropartícula lipídica. Los Ejemplos, posteriores, demuestran que las proteínas muchas veces más grandes que las moléculas enlazadoras a las cuales se conjugan pueden ser enlazadas exitosamente a micropartículas lipídicas. Este descubrimiento expande los tipos de agentes con los cuales tales micropartículas pueden ser cargadas. Además, este expande el intervalo de métodos por los cuales tales micropartículas pueden ser hechas y todavía unidas a proteínas, ya que el enlace puede ahora tomar lugar bajo condiciones donde la estabilidad de la micropartícula, tal como un liposoma, no serán arriesgadas. Preferentemente, las proteínas usadas en este método tienen un peso molecular entre aproximadamente 6,000 y aproximadamente 1,000,000 daltones. Más preferentemente, las proteínas tienen un peso molecular entre aproximadamente 10,000 y aproximadamente 600,000 daltones. Incluso más preferentemente, las proteínas tienen un peso molecular entre aproximadamente 15,000 y aproximadamente 250,000 daltones. Más preferentemente, las proteínas tienen un peso molecular entre aproximadamente 20,000 y aproximadamente 75,000 daltones. B. Unión de proteínas incubando micropartículas lipídicas con proteínas conjugadas a moléculas enlazadoras . Para uso en esta invención, una proteína puede primero ser conjugada a una molécula enlazadora que comprende (a) un dominio hidrofóbico, (b) una cadena de polimero hidrofílico enlazada terminalmente al dominio hidrofóbico, y (c) un grupo químico reactivo a uno o más grupos funcionales en una molécula de proteína y enlazada a la cadena de polímero hidrofílico en, o cerca de, las terminaciones contralaterales al dominio hidrofóbico. Tales moléculas enlazadoras son conocidas en la técnica (Alien & Martín, US 5,527,528; Shahinian & Sylvius, Biochim. Biophys, Acta, 1239:157-167 (1995); Zalipsky et al., J. Controlled Reléase 39:153-161, 1996; Kirpotin et al., Biochemistry, 36:66-75 (1997) ) . El dominio hidrofóbico de la molécula enlazadora puede ser, por ejemplo, un diacilglicerol, un fosfolípido, tal como colesterol, o un derivado de diacilamida, tal como N,N-diestearoil-glicineamida. La cadena de polímero hidrofílico puede ser, por ejemplo, poli (etilenglicol) , poliglicidol, poli (alcohol vinílico) , poli (vinilpirrolidona) , polioxazolidinona, polisacárido, o un copolímero que incluye los bloques de los polímeros anteriores. El grupo reactivo químico puede ser, por ejemplo, un grupo amino, grupo carboxi, grupo tilo, grupo malemido, grupo yodoacetamido, grupo de vinilsulfona, grupo aldehido, grupo de hidracina, grupo cetona, grupo cloruro de cianuro, o cualquier otro grupo funcional conocido en la técnica para formar enlaces con proteínas. Una proteína puede ser un anticuerpo, una enzima, un factor de crecimiento, una hormona, una proteína de enlace de ácido nucleico, o cualquier otra proteína de utilidad para una aplicación propuesta particular. En una modalidad preferida de la invención, la proteina es un fragmento Fab'' de un anticuerpo, o un anticuerpo de una cadena. En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo de una cadena es un anticuerpo Fv producido a través de la selección de una biblioteca de exhibición de fago. Grupos maleimido, que reaccionan con residuos de cisteína en la proteína, son preferidos como el grupo reactivo para uso con un fragmento de anticuerpo Fab' o un anticuerpo de una sola cadena. La conjugación de la proteína al enlatader puede ser efectuada por cualquiera de un numero de métodos conocidos en la técnica para conjugación de prcteír.a. En un método preferido, el enlazador puede ser disuelto simplemente en amortiguador acuoso (el cual es posible debido a la presencia del dominio de polímero hidrofílico) y se incuba con la proteína de elección para producir formación de un enlace estable entre el grupo reactivo químico del enlazador y el grupo funcional apropiado de ia proteína. El conjugado puede además ser purificado del enlazador excesivo y cualquier proteína no conjugada por salteado, diálisis, cromatografía y otros métodos conocidos en la técnica de purificación de proteína. Alternativamente, el conjugado puede ser usado sin purificación adicional. La proteína conjugada es entonces incubada con las micropartículas lipídicas en un medio acuoso por un tiempo suficiente para el dominio hidrofóbico del conjugado para que emerge dentro de la capa de lípido superficial de la partícula. El tiempo requerido dependerá de la composición de lípido de la micropartícula, la naturaleza dei dominio hidrofóbico, y la temperatura de incubación. Típicamente, el tiempo de incubación estará en el intervalo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 50 horas. El tiempo necesario para incubación disminuirá en cuanto se incremente la temperatura en la cual se realiza la incubación. De esta forma, a 37 °C, la incubación generalmente se realizará durante la noche, mientras a 55-60°C, la incubación generalmente tomará 5-6C minutos, con 15-30 minutos que se prefieren. Los tiempos de incubación apropiados para cualquier combinación particular de micropartículas, dominio hidrofóbicc, y temperatura, puede ser determinados usando los ensayos enseñados en los Ejemplos, posteriores. C. Preparación de proteínas que contienen dominios hidrofóbicos que se autosinsertarán en una micropartícula lipidica En una modalidad alternativa, un anclaje hidrofóbico y una cadena de polímero hidrofílico se introducen en una molécula de proteína por ADN recombinante y métodos de modificación de proteínas. En este caso, un dominio polímerico hidrofílico, como se describe anteriormente, se introduce en la proteína de interés por una secuencia de poliaminoácido tenr.inalir.ente anexo que contiene principalmente aminoácidos ccn cadenas laterales hidrofílicas. Se introduce un anclaje hidrofóbico en la construcción durante su biosíntesis vía un sitio de modificación de lípidos colocado en eí extremo distal de la secuencia de poliaminoácidos terminalmente anexos. EJEMPLOS La invención se ilustra por los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la presente invención. Ejemplo 1: Preparación de complejos de lípidos:ADN de plásmido estables para suministro de gen in vivo A. Materiales y métodos 1. Lípidos y otros reactivos Se compra DOPE de Avanti (Alabaster, AL) . Se obtiene colesterol altamente purificado de Calbiochem (San Diego, CA) . Se compran BDDA y dextrano (P.M. 40,000) de Sigma (San Luis, MO) . Se recristaliza el BDDA una vez de la solución de acetona metanol. Se obtiene D-luciferina de Boehringer Mannheim. PEG-FE es un regalo de Sequus Pharmaceuticals (Menlo Park, CA) . Se obtienen DC-Chol, MMCE y DOGS de UCSF Gene Transfer Vehicle Core de Gene Therapy Center. ESPM, PDOTA, POEFC, DOEFC, DMEFC y PDODA son regalos de Avanti (Alabaster, AL) . Se almacena la solución de cloroformo de cada lípido bajo argón en ampollas selladas a - 40°C. Otros reactivos de mayor grado posible se compran y se usan sin purificación adicional. 2. Preparación de liposomas Se preparan liposomas catiónicos pequeños en soluci'n de dextrosa al 5% (p/v) en la siguiente modalidad. DDAN u otros lípidos catiónicos en cloroformo se mezclan con DOPE o/y colesterol en una proporción molar deseada, y se elimina el solvente lentamente bajo presión reducida a 50°C en un evaporader rotatorio. Se hidrata la película de lpiod seca con solución de dextrosa al 5% precalentada a 50 °C y se sella el recipiente bajo argón. Se sónica la suspensión de lípidos hidratada en un sonicador de baño (Lab Supplies, Hicksville, N.Y.), por 5-10 minutos a 50°C. La concentración final de lipescmas es lípido catiónico a 5 M y el tamaño de liposomas se mide por difusión de luz dinámica a 195 + 65 nm.

Se almacenan los liposomas sonicados bajo argón a 4°C hasta uso. 3. Sistema de reportador de luciferaza Se construye el plásmido, pCMV/IVS-luc* como sigue. Un fragmento que contiene el promotor CMV y el intrón IgE sintético se escinde de pBGt2.CAT usando Spe I y Hind III y se clona en pBSIIKS+. El ADNc que codifica la luciferasa de luciérnaga (luc +) incluyendo la señal poli (A) tarde SV40 se corta del vector pGL3-Basic (Promega) con Hind III y Sal I y se coloca en el clon pBS-CMV-IVS del empalme. Se purifican los plásmidos usando procedimiento de lisis alcalina adaptado y se observa por Qiagen Corp. (Chatsworth, CA) . Se mide la pureza del plásmido por la proporción de absorbancia a 260 nm contra 280 nm, y se almacena en amortiguador que contiene Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM en pH 8.0 en concentraciones de 1-2 mg/ml . 4. Preparación de complejos de transfección Antes a los experimentos de transfección, la proporción óptima de ADN/liposoma para formar complejos que no son agregados grandes se determina al mezclar una cantidad fija de plásmidos a una cantidad variada de liposomas. En general, los complejos de transfección se forman al pipetear una suspensión de plásmido a liposoma de igual volumen y mezclar rápidamente. Rutinariamente, los liposomas que contienen 8-12 nmoles de BDDA pueden formar un complejo con 1 µg de plásmido sin formar agregados visibles grandes. Tales complejos tienen carga positiva en exceso, pero todavía tienden a agregarse con el tiempo durante almacenamiento a 4°C y pierden actividad de transfección en 4 días. Para experimentos in vitro, que se llaman por muchos complejos diluidos, se usan complejos de lípido catiónico:ADN de plásmido ("CLDC") en 5 nmoles de BDDA por µ de ADN. Para mantener que los complejos de lípidos:ADN de plásmido formen agregados grandes y pierdan actividad de transfección con el tiempo, se toman dos procedimientos; (1) incorporar una cantidad pequeña de PEG-FE (aproximadamente 1% en proporción molar) en complejos de lípidos:ADN de plásmido dentro de unos "cuantos minutos después de su preparación, y/o (2) condensar plásmido con poliaminas (por ejemplo, 0.05 a 5.0 nmoles de espermidina por µg de ADN) antes e mezclar con liposomas. La cantidad óptima de las poliaminas se determina por titular poliaminas a ADN antes e formar agregados grandes. El tamaño de estos complejos se estima por difusión d luz dinámica para estar en el intervalo de 410 + 150 nm. 5. Ensayo de expresión del gen reportador Se compra la luciferasa purificada de Boehringer Mannheim como un estándar para calibrar el luminómetro y construir un estándar de control para la actividad específica relativa de luciferasa. La expresión del gen reportador en un extracto de tejido se presenta en cantidades de nanogramos al convertir una unidad de luz relativa medida de un luminómetro en una unidad de peso de acuerdo a una curva estándar. La luciferasa expresada en células o tejidos se extrae con lisis celular química. El amoartiguador de lisis efectivo de amortiguador de fosfato de potasio 0.1 M en pH 7.8, 1% de Tritón X-100, DTT 1 mM y EDTA 2 mM. Se obtienen ratones CD1 hembra (4-6 semanas de edad, pesando aproximadamente 25 g) de Charles River Laboratory. Los complejos reciben complejos de lípido:ADN de plásmido por inyección de vena de cola y se sacrifican 24 horas más tarde. Se prefusionan los animales anestesiados con solución salina amortiguada on fosfato frió (SAF) vía punción del corazón. Se disecciona cada tejido y se lava con SAF, y después se homogeniza en un tubo de cultivo de fondo redondo de 6 ml que contiene 500 µl de amortiguador de lisis. Se mantienen las muestras a temperatura ambiente por 20 minutos con mezclado ocasional. Se centrifugan las muestras homogenizadas por 10 minutos a 3000 rpm en una centrífuga Eppendorf. La actividad e luciferasa de cada tejido se mide al mezclar 100 µl del substrato de luciferasa reconstituido (Promega, Madison, Wl) con 20 µl del sobrenadante de homogenado de tejido en el sistema de inyección de un luminómetro. Se mide la emisión de luz de pico por 10 segundos a 20 °C. Las unidades de luz relativas de cada muestra se convierten a la cantidad de luciferasa en el extracto de tejido al comparar con una curva estándar que se establece para cada grupo de experimentos. El contenido de proteína del extracto se determina usando equipos de ensayo de proteína (BioRad, Richmond, CA) . El antecedente es el conteo de amortiguador de lisis solamente. Las células SK-BR-3 (Park et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 92:1327-1331 (1995)) se cultivan en McCoy's 5 un medio suplementado con 10% de suero de ternera bovina inactivado con calor y en 5% de C02. Se colocan en placas las células SK-BR-3 en un cultivo monocapa en 50,000 células por pozo en placas con 12 pozos y se incuban durante la noche.

Cada pozo recibe 0.5 ~ 1 µg de pCMV/IVS-luc+ dentro de los 20 minutos de la formación del complejo. Se cosechan las células durante 24 horas de incubación con complejos a 37 °C. La actividad de luciferasa en células se determina como se describe anteriormente. B. Resultados 1. Optimizar el lípido "auxiliador" El uso de liposomas catiónicos para transferencia de genes in vitro ha llegado a ser mundial desde que Feigner et al. publicó su estudio (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-17 (1987)). Se estableció desués (Felgner et al., J. Biol. Chem. 269:2550-2561 (1994)) que el DO?? está muy lejos de ser el lípido "auxiliador" más eficiente para transfección de genes in vitro y este resultado ha sido confirmado por varios laboratorios (Farhood et al., en Gene Therapy for Neoplastic Diseases, pág. 23-55 (Huber & Lazo eds., 1994); Zhou et al., Biochim. Biophys. Acta 1189: 195-203 (1994)). Se ha sugerido, en la base de estudios in vitro, que el DOPE puede facilitar el suministro citoplásmico vía fusión de membrana una vez que los complejos de lípidos cargados positiviamente:ADN de plásmido se enlazan a la membrana celular (Zhou et al., biochim. Biophys. Acta 1189:195-203 (1994)). A pesar de que Friend et al. no obtienen ninguna evidencia morfológica que los complejos de DOTMA/DOPE lípido:ADN de plásmido se fusionan directamente con la membrana de plasma, elics ne excluyen la posibilidad de eventos de fusión (Friend et al., Biochim. Biophys. Acta 1278: 41-50 (1996)). Ellos sugieren que los complejos son endocitados y los lípidos catiónicos alteran las membranas endosomales/lisosomales y después facilitan un escape de los complejos de ADN en el citoplasma y eventualmente en el núcleo. Contrario a la mayoría de las expectaciones, el papel "auxiliador" del DOPE establecido de los estudios in vitro no es evidente para suministro de genes in vivo después de inyección i.v. de los complejos. Cuando se incluye DOPE en liposomas catiónicos BDDA, se inhibe ia transfección de genes in vivo. Esta' inhibición dependiente a DOPE se muestra en la Figura 1. El colesterol, no DOPE, se encuentra que es efectivo como un lípido "auxiliador" para suministro de genes in vivo. Hay una reducción de diez veces en la expresión de luciferasa en pulmones de ratón cuando la mitad del colesterol se reemplaza con DOPE. Los resultados in vivo de BDDA y otros liposomas catiónicos no son consistentes con la presunción general que el DOPE es adecuado como un lípido "auxiliador". Por el contrario, el DOPE en complejos de lípidos catiónicos:ADN de plásmido atenúa la transfección in vivo para tal grado mayor que se considera el DOPE como un agente inhibidor en formulaciones para suministro de genes in vivo. El colesterol ha sido elegido para estuidos in vivo en reportes publicados recientes (Liu et al., J. Biol. Chem. 270:24864-70 (1995), Solodin et al., biochemistry 34:13537-44 (1995) ) en los cuales los autores no elaboran el cómo y porqué ellos seleccionan diferentes lípidos "auxiliadores" para sus diseños experimentales, es decir para estudios in vitro de DOPE y colesterol in vivo. La estabilización de liposomas aniónicos y neutrales en sangre por colesterol ha sido conocida por un gran tiempo (Mayhew et ai., Cáncer Treat. Rep. 63:1923-1928 (1979)). Es por lo tanto obvio que para un suministro de genes sistemático, une tiene que considerar la estabilidad de los complejos de líidos:ADN de plásmido en sangre, varios componentes de los cuales son conocidos para reaccionar con complejos macro eleculares . De hecho, el estudio preliminar de vaias formulaciones de los complejos de lípidos: ADN de plásmido usando microscopía de electrones de fractura por congelación ha mostrado que los complejos que contienen colesterol son estructuralmente más estables que los complejos que contienen DOPE en la presencia de suero. Usando complejos de lípidos:ADN de plásmido BDDA/Chol (8 nmoles BDDA/µg de ADN) para experimentos de transfección in vivo, expresión de luciferasa detectable en el pulmón de 25 g de ratón requiere una dosis de ADN en el intervalo de 30 µg a 60 µg. Rutinariamente 40 C 60 µg de ADN de plásmido por ratón da expresión de gen consistente. La cantidad de BDDA usualmente asociada con 80 µg de ADN (0 más) por ratón se encuentra que es muy tóxica para el animal. La expresión de luciferasa en varios tejidos se muestra en la Figura 2. Como se observa antes (Zhu et al., Science 261:209-211 (1993); Liu et al., J. Biol. Chem. 270:24864-70 (1995); solodin et al, Biochemistry 34: 13537-44 (1995)), se encuentra expresión máxima en tejido de pulmón. Para 60 µg de plásmido inyectado, se obtiene rutinariamente 1-2 ng de luciferasa por mg de protéina de tejido. La Figura 3 muestra la duración de la expresión del gen reportador en tejido de pulmón. La expresión de luciferasa disminuye rápidamente y alcanza niveles no detectables en 2 semanas. Zhu et al. reportan que después de la inyección i.v. de los complejos de plásmido DOTMA/DOPE (1:1) en ratones adultos, la expresión del gen reportador (CAT) es amplia entre varios tejidos y la expresión máxima es de complejos con una proporción de 1 I µg de plásmido a 8 nmoles de lípidos totales (Zhu et al., Science 261: 209-211 (1993)). Sin embargo, en esta proporción (que corresponde a 1 µg de plásmido para 4 nmoles de lípido catiónico), los complejos de lípido:ADN de plásmido BDDA/Chol tienden a agregarse y no producen expresión de genes medible en esta investigación. Ya que han . sido usados diferentes genes reportadores entre diferentes laboratorios, ha sido difícil atribuir las variaciones en la eficiencia de suministro de genes in vivo a cambios en la formulación de liposomas. Para una comparación directa de los resultados en la literatura, las unidades de luz relativas de actividad de lucífera medida de un luminómetro son convertidas a un estándar de luciferasa purificas. Al hacer eso, la actividad de transfección de pico de formulaciones de BDDA/Chol es de 3 ordenes de magnitud superior a valores reportados recientemente en experimentos comparables (Thierry et al., Proc. Nati. Acad. Soi USA 92:9742-9746 (1995)). De hecho, el BDDA/Chol es uno de los vehículos de suministro de gen más eficiente entre muchas formulaciones de 18 lípidos catiónicos diferentes que se tamiza recientemente. Los estudios preliminares de resultados de expresión en pulmón de ratón después de la inyección de i.v. indican que DOMTA/Chol, PDOTA/Chol, MMCE/Chol y ESPM/Chol dan 10-100% de actividad de transfección de BDDA/Chol, DOGS/Chol, POEFC/Chol, LYSPE/DOPE y DC-Chol/DOPE dan 1-10% de BDDA/Chol. DOEFC/Chol, DMEFC/Chol, PDODA/Chol y BDDA/DOPE no dan una actividad medible. En paralelo con los estuidos de transfección, la morfología de estos complejos en suero y en medio celular se examina por microscopía de electrones de fractura por congelación. Cuando se examina en 50% de suero de ratón (10 minutos de tiempo de incubación) , el CLDC de un dia, no estabilizado es tan pequeño como cuando están en el amoartiguador en resistencia iónica baja (100-250 nm) pero muestran muy pocas proyecciones. CLDC de seis días, no estabilizado incubado en suero de ratón al 50}% parece como agregados densamente empacados de partículas esféricas, con un mayor número de partículas unidas. Tales formulaciones han perdido toda su actividad de transfección in vivo dentro de 4 días. No se observan las proyecciones fibrilares residuales. CLDC estabilizado con PEG-FE incubado en suero de ratón al 50% es pequeño (1C3-230 nm) incluso en los seis días. Similarmente, CLDC preparado con ADN condensado es un poco pequeño incluso después de seis días de almacenamiento. Específicamente, el CLDC se conforma como "puntos de intersección de mpa" que son estructuralmente estables en la presencia de suero. Después de 1 aincubación en medio celular (RPMI- 1640 con FCS) , el CLDC de seis días no estabilizado es morfológicamente similar a aquellos incubados en suero de ratón, como se describe anteriormente. Estos complejos, sin embargo, son empacados en forma foja y no muestran proyecciones fibrilares. Se observa morfología similar con CLDC estabilizado con PEG-FE y CLDC con ADN condensado incubados en medio celular. 2. Vida media incrementada para actividad de transfección la relación entre la estabilidad estructural y actividad de transfección de complejos de lípidos:ADN de 'plásmido no ha sido detallada en los reportes publicados hasta ahora. Han sido establecidos procedimientos de tamizado para evitar agregados grandes de complejos de lípidos:ADN de plásmido al cambiar la proporción de ADN a lípido de cargado negativamente neto a cargado positivamente. Los complejos de lípido:ADN de plásmido de cada iípido catiónico particular en varias proporciones de ADN/lípido se prepara y se usan las formulaciones estables y met estables resultantes para transfección in vivo. Los complejos que contienen 8 a 12 nmoles de lípido catiónico por µ de ADN se encuentran que tienen la actividad más alta de transfección in vivo. Sin embargo, la actividad de transfección de estos complejos disminuye con el tiempo. Sin meeiíiear los procedimientos de formar los complejos de lípidcs:ADN de plásmido, hay una agregación visible dentro de unos cuantos días, y la actividad de transfección disminuye por más de mil veces a casi niveles bajos después de un mes de almacenamiento a 4°C (Figura 4) . Por lo tanto, la formulación de complejos de lípidos:ADN de plásmidos estabilizados esta garantizada, lo cual puede mantener actividad de transfección in vivo alta durante almacenamiento. i. Estabilidad de transfección incrementada: PEG-FE El insertar PEG-FE (1% de lípido total) en los complejos de lípidos:ADN de plásmido recientemente formados no solo puede prevenir que los complejos se agreguen durante el almacenamiento sino que los complejos que contienen PEG-F? también exhiban actividad de transfección razonablemente alta in vivo, solamente actividad ligeramente inferior comparada con los complejos sin PEG-FE (Figura 4). La incorporación de PEG-FE en los complejos es evidente en vista de la inhibición relacionada a dosis de la actividad de transfección con porcentaje incrementado de PEG-F? (resultados no mostrados) . Inesperadamente, el almacenamientc de los complejos que contienen PEG-FE en 4°C recuperan lentamente la actividad original, como se muestra en la Figura 4. Los aspectos mecanísticos del efecto de inhibición en la transfección por PEG-FE , así cerne también la recuperación de la actividad después del almacenamiento a baj a temperatura, no se conocen hasta el momento . 11. Estabilidad de transfección incrementada : poliaminas Además del papel del PEG-FE para incrementar la vida media de los complejos de lípido: ácido nucleico, condensar el ácido nucleico con poliaminas también da un incremento inesperado similar en la vida media de los complejos. Los complejos de lípidos: ADN de plásmido formados con ADN condensado se estables en una proporción inferior de lípido a ADN sin formación de agregados. La Figura 4 muestra el nivel de actividad de transfección in vivo de tal preparación, y su destino durante almacenamiento. Otra vez, un incremento inesperado de la actividad de transfección se encuentra en complejos de lípido:ADN de plásmidc tratado con poliamina madurados, cuando se compara con aquellas muestras que no se pretratan con poliaminas y uso inmediatamente después de que se forman los complejos. Un procedimiento diferente para obtener complejos de lipides catiónicos estables:ADN al formar en complejo un plásmidc ton un lípido en micelas de lípidos-detergentes se publicó recientemnte (Hofland et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7305-7309 (1996) ) . Sin embargo, se reporta solamente 30% de la eficiencia de transfección se mantiene para tales complejos en 15% de suero para resultados in vitro, y no in vivo. iii. Estabilidad de transfección incrementada: liofilización Finalmente, las condiciones han sido establecidas para la estabilización de complejos de líppidos:ADN de plásmido por liofilización. Los liposomas compuestos de BDDA/Chol suspendidos por soríicación en 5% (p/v) de dextrano en agua, cuando se mezclan con ADN en una proporción 1:10 (µg de ADN por nmoles de BDDA) como se describe en métodos, pueden ser liofilizados sin pérdida de actividad. La concentración final de dextrano en la cual se forman los complejos de lípidos:ADN de plásmidos es 8% (p/v) . Las preparaciones liofilizadas se reconstituyen al agregar agua destilada y su actividad de transfección en los pulmones de ratones después de inyección i.v. se mide por expresión de gen reportador de luciferasa. El congelado y descongelado de la preparación reconstituida no afecta la actividad (usualmente 1-2 ng de protéina luciferasa por mg de protéina de tejido) . Varios de los complejos de lípidos catiónicos: ADN de plásmido descritos en la presente son estables y pueden dar actividad de transfección in vivo consistente (en el intervalo de 0.5 a 2 ng de luciferasa por g de proteína de tejido) incluso después de almacenamiento mayor a 4°C o liofilización. Las formulaciones que contienen colesterol como el iípido "auxiliador" generan eficiencia de transfección in vivo mucho mayor. Estabilizar la estructura de complejo por PEG-FE mantiene la actividad del complejo en almacenamiento y puede prolongar el tiempo de circulación en sangre por objetivar a tejidos específicos. Condensar el ADN con poliaminas antes de la formación del complejo de lípido incrementa el almacenamiento in vitro y niveles de actividad in vivo. El procedimiento metódico para producir formulaciones estables de complejos de Lípidos: ADN de plásmido que exhiben actividad de transfección alta in vivo confiere ventajas para establecer preparaciones farmacéuticamente aceptables, y por lo tanto facilita la terapia de genes en base a liposomas. Ejemplo 2: transfecsión in vitro de complejos de lípido: ácido nucleico con ligandos de objetivación A. Preparación de fragmentos Fab' Se co expresan secuencias de rhuMAbHER2 clonadas para cadena pesada y ligera en E. coli como se describe previamente (Cárter et al., biotechnology 10:163-167 (1992)). El fragmento de anticuerpo, rhuMAbHER2-Fab' , se recupera de pastas de fermentación de E. coli por cromatografía de afinidad con proteína G de Streptococos (Cárter et al., biotechnology 10:163-167 (1992)), típicamente produciendo Fab' con 60-90% que contiene tiol libre reducido (Fab'-SH). B. Preparación de liposomas Se forma en complejo el ADN condensado con tres composiciones de lípidos diferentes, usando los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 1, con las siguientes modificaciones. Se hace el primer complejo con BDDA/DOPE (1/1) , lo cual produce liposomas catiónicos en complejo con ADN solamente, como se describe anteriormente. Se hace el segundo complejo con BDDA/DOPE (1/1) con 1% de PEG-FE derivado con maleimida en la última posición de PEG, produciendo CLDC con el componente de estabilización esférica agregado después de formación de complejo con el ADN. Se hace el tercer complejo con BDDA/DOPE (1/1) con 1% de PEG-FE derivado con el fragmento Fab' de un anticuerpo anti-Her-2 humanizado unido a la última posición de PEG vía el grupo tiol libre al residuo de maleimida. Este CLDC producido con el ligando de objetivación unido al componente de estabilización estérico agregado después de la terminación del complejo con el ADN. C. Transfección y resultados Se transfectan las células como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, pero sin el almacenamiento del complejo de lípido:ADN de plásmido. Se usan dos líneas celulares en este Ejemplo. La primera línea celular es MCF-7; las células de esta línea celular no sobreexpresan el receptor HER-2. Estas células se cultivan en DME H-21 con 10% de suero de ternera bovina y en 5% de C02. La segunda línea celular es células SK-BR3, célulasde las cuales se sobre expresan el receptor HER-2, se cultivan en medio McCoy's 5a con suero de ternera bovina en 5% de C02. En ambos casos, las células (~5 x 104 células por pozo) se transfectan y se incuban con 12 µg de ADN de plásmido en complejo con lípido como se describe anteriormente (PCMV/IVS-luc +, gen reportador de luciferasa) por 4 horas a 37 °C. El sobrenadante se aspira entonces, se agrega medio fresco y se incuban células por 24 horas en 37°C. Las células se cosechan entonces al lavar con SAF (Ca/Mg libre) y después se suspenden en amortiguador de lisis por el ensayo de luciferasa, como se describe anteriormente. La Figura 5A muestra la transfección de células no objetivo, que no sobre expresan el receptor HER-2, se inhibe por la adición de PEG-FE , incluso en la presencia de ligando de objetivación conjugado a la punta de PEG vía el residuo de maleimida terminal. La Figura 5B muestra que la transfección de células objetivo que sobre expresan el receptor HER-2 es también inhibida por la adición de PEG-FE , pero la actividad de transfección se restablece y se aumenta cuando se conjuga el PEG-FE a un ligando de objetivación, el cual reconoce el receptor HER-2. La comparación de Figuras 5A y 5B indica que el inmuno-CLDC objetivo en células objetivo de transfección mucho más eficiente que células no objetivo. Este resultado ocurre debido a la adición del agente de estabilización que porta el ligando (PEG-FE ) conjugado a anti-HER-2-Fab' , que inhibe la transfección de células no objetivo (Figura 5A) pero aumenta la transfección de células objetivo (Figura 5B) . Ejemplo 3: Preparación del enlazador maleimido- propionilantido-PE62000-diestearoilfosf idiletanolamina (Mal-PEG-DSFE) 100 mg (44 moles) de 4-maie?midopropion?iamido- poli {etilenglicol) -a-succinimidilcarbonato (Mal-PEG-NHS) ; Shearwater Polymers, Inc.) preparado de poli (etilenglicol) (peso molecular 2,000), 33 mg (44 µmoles) de diestearol- fosfatidiletanolamina (DSFE; Avanti Polar Lipids) , y 12 ml (86 µmoles) de trietilamina en 1 ml de cloroformo, se incuban por 6 horas a 45°C. En este momento, la cromatografía de capa fina en sílice (solvente, cloroformo/metanol 7:3) indica conversión completa de DSFE en un producto negativo a ninhidrina en movimiento, más rápido, identificado mo Mal-PEG-DSFE. Este producto se purifica por cromatografía de columna en sílice, usando gradiente de un paso de metanol en cloroformo (5%, 10%, 15% de metnaol por volumen) . Se eluye Mal-PEG-DSFE puro en 15% de metanol. Produciendo, 85 rg (65% de teoría), Rf 0.27-0.29 (Sílice 60, CHCl3-Me0H-H20 65:25:4). Proporción de grupos de maleimido a fosfato, 0.95-1.02. Alternativamente, este enlazador puede ser preparado como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5,527,528 o en Kirpotin et al., 'Biochemistry, 36:66-75 (1997) .

Ejemplo 4: Conjugación de Mal-PEG-DSFE con fragmento Fab' de un anticuerpo reactivo contra oncoproteína HER2. Se colocan 300 nmoles de Mal-PEG-DSFE en 0.5 ml de cloroformo en un tubo de prueba de vidrio y se elmina el solvente en vacío. Se disuelve el residuo seco en 1 ml de amortiguador MES-20 (20 mM ácido morfolinoetanosulfonico, 1444 mM de cloruro de sodio, 2 mM de ácido etilendiaminatetraacético, y NaOH para pH 6.0). 2.5 ml de solución que contiene 0.57 mg/ml de fragmentos Fab' de un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante contra dominio extracelular de HER2 oncoprotéina (rhuMAbHER2, Genentech, Inc.) se agrega a la solución Mal-PEG-DSFE, y el pH se ajusta cuidadosamente a 7.2-7.4 con NaOH diluido. La mezcla se incuba bajo argón a temperatura ambiente por 2.5 horas, y se detiene la reacción por adición de clorhidrato de cisteína 0.2 M a una concentración final de 5 mM. Quince minutos después de la adición de cisteína, la mezcla de reacción se dializa contra solución salina amortiuada HEPEs (20 mM de ácido hidroxietilpiperazinoetansulfónico, 144 mM NaCl, NaOH a pH 7.2), concentrado por ultrafiltración a través de membrana YM-10 (Amicon) bajo presión, y se esteriliza por filtración a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.2 µm. Los productos de racción se analizan por electroforesis de gel de poliacrilamida en la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), con tinción de Coomassie Blue. Se determina la proteína total del ensayo de enlace de tinte (Bio-Rad) . El ensayo revela 62% de conversión de la proteína original (P.M. 46,000) en producto de movimiento más lento (P.M. 49,000) consistente con el conjugado esperado. La recuperación de proteína total en los productos es 98%. Ejemplo 5: Conjugación de Mal-PEG-DSFE con un anticuerpo Fv de una cadena reactiva contra oncoprotéina HER2 Se disuelven 150 nmoles de Mal-PEG-DSFE en 0.5 ml de Mes-20 y se reaccionan con 0.5 ml de solución que contiene 0.7 mg/ml de anticuerpo Fv de una cadena reactivo C6.5Cis contra dominio extracelular de oncoproteína HER2. El anticuerpo se prepara como se describe por Schier et al. (Immunotechnology 1:73-81 (1995)). La reacción y ensayos de productos se realizan como se describen en ei Ejemplo anterior. La recuperación de proteína total es 86%. Aproximadamente 52% de la proteína recuperada (P.M. 27,000) está en la forma de un producto con peso molecular superior (P.M. 29,000-30,000), consistente con el conjugado esperado. Ejemplo 6: Preparación de inmunoliposomas con ' fragmentos Fab' anti-HER2 conjugado y se cargan con un indicador sensible a pH fluorescente Se preparan liposomas unilaminares pequeñas (100 mn) que contienen ácido 8-hidroxipirentrisulfónico indicador fluorescente sensible a pH atrapado de una mezcla de 1-palmitoil-2oleoil-fosfatidlcolina (Avanti) , colesterol (Calbiocherm) , y metoxipolioxietilenglicol (P.M. 1,900) derivado de diestearoilfosfatidiletanolamina (Sygena) en la proporción molar de 30:20:3 como se describe por Kirpotin et al. (Biochemistry, 36:66-75 (1997)), y se esteriliza por filtración a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.2 µm, 0.26 ml de preparación de liposoma que contiene 2 µmoles de fosfolípidos se mezclan con 0.106 mi de una solución que contiene 100 µg del conjugado de anti-HER2-Fab'- PEG-DSFE preparado de acuerdo con el Ejemplo 4, anterior, y se incuba durante la noche a 37 °C. Después de la incubación, los liposomas se separan de material no enlazado por filtración en gel en una columna con Sec arose 4B (Pharmacia) , usando solución salina amortiguada con HEPEs como eluyente. Se eluyen los liposomas en el volumen vacío de la columna. La cantidad de protéina enlazada a iiposoma se determina por el ensayo de enlace de tinte Bio-Rad, y se mide la concentración de liposoma por fósfor total usando método de molibdato (Morrison, Anal. Biochem. 7:218-224 ,1964). SDS-PAGe de los liposomas (véase Ejemplo 13, posterior1 , revela la presencia de anti-HER2 Fab '-PEG-DSFE conjugado, pero no anti-HER2Fab' libre en la preparación de iipesomas. Se cuantifica proteína asociada a liposomas por SDS-PAGE (véase el Ejemplo 13) y el enlace el conjugado de Fab' -PEG-DSFE agregado con los liposomas se expresa como porcentaje de la proporción de proteína/fosfolípido de salida sobre la proporción de proteína/fosfolípido de entrada. El enlace de conjugado Fab '-PEG-DSFE a los liposomas es 80%. La filtración de HPTS de liposomas durante incubación con el conjugado de proteína PEG-DSFE a los liposomas es menos de 2&. Ejemplo 7: Preparación de inmunoliposomas con anticuerpos anti-HER2 scFV conjugado y se carga con un indicador sensible a pH fluorescente Usando el procedimiento del Ejemplo 6, el conjugado de Fv de una cadena anti-HER2 C6.5Cys con Mal-PEG-DSFE, obtenido de acuerdo con el Ejemplo 5, se incuba con liposomas cargadas con HPTS en la proporción de entrada de 15.6 µg de proteína por 1 µmoles de fosfolípidc de liposoma. Después de la separación de material enlazado por filtración de gel en Sepharose 4B, los liposomas se ensayan como se describe en el Ejemplo 6. La proporción de proteína/fosfolípidos es 14.4 µg/µmoles, que indica 92.3% de enlace del conjugado de los liposomas . Ejemplo 8: Captación de los liposomas por células de sobre expresión de HER2 Las células cancerosas de seno humano que sobre expresan HER2 (SK-BR-3) se hacen crecer en medio McCoy 5a suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 50 U/ml de penicilina, y 50 U/ml de estreptomicina a 37 °C y 5% de C02. Veinticuatro horas antes del ensayo, se cosechan las células por tratamiento con EDTA 5 mM en solución salina amortiguada con fosfato, y se coloca en placa en placas de cultivo de células de 24 pozos en una densidad de 200,000 células/pozo en 1 ml de medio de cultivo celular. Se agregan liposomas al medio de cultivo celular en los pozos (en triplicado) para lograr una concentración final de 25 µM de fosfolípidos de liposoma. Se incuban las placas entonces 4 horas con agitación suave a 37 °C y 5% de C02. Después de la incubación los medios se aspiran de los pozos, las capas celulares se enjuagan cuatro veces con 1 ml de solución salina amortiguada de fosfato, se cosechan en 1 ml de EDTA de 5 mM en solución salina amortiguada con fosfato, y las cantidades de liposomas enlazados a células y endocitados se determinan por fluorometría como se describe en Kirpotin et al., Biochemistry, 36:66-75 (1997). Para comparación, se realizan también incubaciones con los liposomas conjugadas con anti- HER2 Fab' y scFv vía enlazadores Mal-PEG-DSFE pre incluidos en la composición liposomal (Kirpotin et al, Ibid) . Los resultados se resumen en la si uiente tabla: Como se evidencia por estos datos, el enlace de células objetivos e internacionalización de los liposomas preparados de acuerdo a la presente invención es por lo menos igual, y con frecuencia superior a, aquellos de los liposomas similares preparados de acuerdo al mejor método anterior. Ejemplo 9: Preparación de doxorrubicina inmunoliposomal anti-?ER2 por modificación de doxorrubicina prefabricada con conjugado antiHER2 Fab' -PEG-DSFE a 55°C. 0.38 ml de doxorrubicina liposomal comercialmente disponible (Doxil®, Sequus Pharmaceuticals, Inc.) que contiene 2 mg/ml de doxorrubicina se mezcla con 0.26 ml de la preparación de conjugado antiHER2 Fab ' -PEG-DSFE obtenido de acuerdo al Ejemplo 6, incubado a 55 °C por 20 min., y se enfría rápidamente en agua hielo. Se retiran el material no enlazado y componentes de bajo peso molecular por filtración en gel de los productos de incubación a través de una columna con Sepharose 4B (Pharmacia) . Se recolectan los liposomas en el volumen hueco de la columna, y se ensayan para protéina usando SDS-PAGE, para fosfolípidos usando el método de molibdato, y para doxorrubicina por espectrofotometría después de solubilización en isopropanol acidificado (E1% 8o=208) . Encontrado: aproximadamente 45 Fab'/liposoma (77% de enlace del conjugado agregado) . La filtración de doxorrubicina de liposomas no se observa (contenido de doxorrubicina antes a la incubación, 145.9 µg/µmoles de fosfolípido; después de la incubación, 155.8 ?Zg/moles de fosfolípido) . Ejemplo 10 : Preparación de doxorrubicina inmunoliposomal anti-HER2 por modificación de doxorrubicina liposomal prefabricada con conjugado de anti-HER2 scFv-PEG-DSFE a 55°C Se realiza la modificación como se describe en el Ejemplo 9, usando preparación de conjugado de 0.4 ml de C6.5Cys-PEG-DSFE (Ejemplo 5) y 0.31 de Doxil®. Encontrado: 48 proteínas/liposoma (enlace cuantitativo del conjugado a liposomas); filtración de droga 3.7% (contenido de doxorrubicina antes a la modificación, 145.9 µg/µmoles de fosfolípido; después de la modificación, 140.5 µg/µmoles de fosfolípido) . Ejemplo 11 : Preparación de doxorrubicina inmunolipossomal anti-HER2 por modificación de Doxil® con conjugado de anti- HER2 Fab'-PEG-DSFE en 37°C. Se realiza la modificación como se describe en el Ejemplo 9 anterior, usando 0.31 ml de preparación de Doxil® y 0.212 ml de anti-HER2 Fab'-PEG-DSFE (Ejemplo 4), pero la incubación es durante la noche a 37 °C. Encontrado: 46 Fab'/liposoma (enlace de 82% del conjugado agregado a liposomas) ; filtración de droga no se observa (doxorrubicina antes a la modificación 145.9 µg/µmoles de fosfolípido; después de la modificación, 146.0 µg/µmoles de fosfolípido). Temperatura de transición del constituyente de lípido de Doxil® (fosfatidilcolina de soya hidrogenada) está cercana a 55°C. De esta forma, la modificación es igualmente efectiva cuando los lípidos de liposomas están en el estado de gel. Ejemplo 12 : Preparación de doxorrubicina inmunoliposomal anti-HER2 por modificación de Doxil® con conjugado de anti-HER2 scFv-PEG-DSFE a 37°C Se realiza la modificación como se describe en el Ejemplo 11, anterior, usando 0.31 ml de Doxil® y 0.4 ml de preparación de conjugado de C6.5Cys-PEG-DSFE (Ejemplo 5). Encontrado: 49 proteínas/liposoma (enlace cuantitativo del conjugado a liposomas) . No se detecta filtración de drogas (doxorrubicina antes a la modificación 145.9 µg/µmoles de fosfolípido) . De esta forma, la modificación de los liposomas con conjugado de scFv-PEG-DSFE es igualmetne efectivo cuando los lípidos de lipposoma están en el estado de gel. Ejemplo 13 : Cuanti icación de conjugado de anticuerpo en los liposomas y productos de conjugación preparados de acuerdo con los Ejemplos 6-12 Se ensaya la cantidad del conjugado de proteína- PEG en el producto de conjugación y en los liposomas por electroforesis de gel de poliacrilamida en la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) bajo condiciones no reductoras de acuerde a Laemmli (1974) . Típicamente, alícuotas de 5-20 µl de muestra analítica se mezclan con amortiguador de muestra 6 veces que contiene SDS y tinte de seguimiento (azul de bromofenol) , se incuba 1 minuto a 60°C, y se aplica en un gel de poliacrilamida (dimensiones 10 x lOx 0.075 cm) con una concentración de 10-12%, y contenido de reticulador de 2.6% . La separación se efectúa en un aparato de electroforesis de gel de plancha vertical en corriente constante de 30 mA. Las bandas de proteínas se desarrollan por tinción de azul de Coomassie usando métodos convencionales. El conjugado forma una banda distinta con movilidad electroforética inferior que la proteína original. Para cuantificación de proteína, las bandas se escinden, y se extrae el tinte en 50% de dimetilformamida acuosa a 100 °C por 30 minutos. La cantidad del tinet extraído se cuantifica por espectrofotometría a595 nm, y la cantidad de proteína por banda se determina por comparación a una curva estándar producida de bandas similarmente procedasas de cantidades estándar de corrida concomitante de proteína correspondiente 9(Fab'o scFv) . Ejemplo 14; Suministro de doxorrubicina a células cnacerosas de sobre expresión de HER2 por inmunoliposomas anti-HER2 preparados de acuerdo con los Ejemplos 9-12 Se hacen crecer células cancerosas de seno humano que sobre expresan HER-2 (SK-BR-3) y se colocan en placas como se describe en el Ejemplo 8, anterior. Las preparaciones de doxorrubicina inmunoliposomal anti-HER2 (Ejemplos 9-12 anteriores) se agregan al medio de cultivo celular en los pozos (por trilicado) para lograr concentración final de 200 µM de fosfolípidos de liposoma (0.030 + 0.001 mg/ml de doxorrubicina) . Se incuban entonces las placas 4 horas con agitación suave a 37 °C y 5% de C02. Después de la incubación se aspira el líquido de los pozos, se enjuagan las capas celulares 3 veces con 1 ml cada vez de solución salina amortiguada con fosfato, se forman granulos por centrifugación, y se extraen con 0.3 N de HCl/50% de mezcla de etanol. La cantidad de doxorrubicina en extractos de etanol-HCl se determina por espectrefluorometría (longitud de onda de excitación, 470 nm; longitud de onda de emisión 590 nm) y se normaliza a la cantidad de células de placas. Para comparación, se realizan incubaciones también con los liposomas conjugados a anti-HER2 scFv (C6.5Cys) vía enlazadores de Mal-PEG-DSFE incorporados en la matriz de lípidos liposomales (Kirpotin et al., 1997). Para evalúa la especificada del enlace, en algunos pozos las células se preincuban con 5 µg del anticuero monoclonal bivalente anti- HER2 (anti-HER2Mab) . Los resultados se resumen en la si uiente tabla: Ejemplo 9 + anti-HER2 Mab 0.372 + 0.015 Los inmunoliposomas preparados de acuerdo a la presente invención son capaces de suministrar liposoma- doxorrubicina encapsulada a células objetivos incluso más eficientemente que los inmunoliposomas preparados por métodos previos, es decir, conjugación del fragmento de anticuerpo a los liposomas que contiene el enlazador activado. La preincubación de las células con el reactivo de anticuerpo libre al antígeno objetivo protéina HER2) en la superficie celular provoca disminución de diez veces en la captación de la doxorrubicina inmunoliposomal preparada de acuerdo con la presente invención; por lo tanto, ia capatación es específica a objetivo. Ejemplo 15: Preparación de micropartículas del complejo de ADN-lípido con fragmentos de anticuerpo conjugados Una suspensión de micropartículas de lípido_ADN (medición 410 + 150 nm en tamaño por difusión de luz dinámica) compuesta de ADN de plásmido (pCMY/IVS-Luc+, 10 µg/ml), bromuro de dimetildicotadecilamcnie (BDDA, 6C nmoles/mL) , y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, 60 nmoles/mL) , en 5% de dextrosa acuosa, se prepara como se describe por Hong et al. (FEBS Lett. 400:233-237, 1997) . Se prepara el conjugado de Fab'-PEG-DSFE por co incubación de Mal-PEG-DSFE y fragmetnos de Fab' de anticuerpo anti-HER2 en una proporción molar de 4:1, en una concentración de la protéina of 0.3 mg/mL en amortiguador fisiológico acuoso, er. pH 7.2 por 2 horas. Las micropartículas de lípido-ADN con conjugados Fab' de anti-HER2 conjugados se preparan por incubación de las micropartículas de lípido-ADN con el conjugado en la cantidad de 0.5 moles % con relación al contenido de lípidos de partículas totales per al menos 3C min. A temperatura ambiente. Se preparan partículas de control con enlazador solo (control no objetivo) en la forma similar, pero no se conjugan, se substituye Mal-PEG-DSFE detenido con ß-mercaptoetanol para el conjugado de Fab'-PEG- DSFE. Ejemplo 16: Transfección de ADN objetivado de las células por micropartículas de lípido-ADN con fragmentos de anticuerpo conjugados Se estudia la actividad de transfección de pCMV/IVS-Luc+ ADN- micropartículas de lípido preparado como en el Ejemplo 15, en los cultivos de células de cáncer de seno humano: SK-BR-3 (sobre expresión el antígeno bjetivo, oncoproteína HER2) y MCF-7 (la linea con expresión baja de HER2) . La expresión del gen reportador (luciferasa) se determina por luminometría después de exposición de 24 horas de las células a complejos de lípido:ADN (l?Zg de ADN por 50-100,000 células) en 10% de medio de crecimiento suplementado con suero, y servido como la medición de eficiencia de transfección. La descripción detallada de este procedimiento experimental se da en Hong et al., FEBS Lett. 400:233-237 (1997) . Las micropartículas de ADN-lípido conjugadas a anti-HER2 Fab' preparadas de acuerdo a esta invención son aproximadamente 25 veces más eficientes para el suministro de plásmido a células SK-BR-3 positivas a objetivo que acoplan partículas no objetivas. En las células MCF-7 negativas a objetivo, objetivo y part 'culas de ADN no objetivado-lípido tiene eficiencia igual. De esta forma, las partículas de lípido modificado con anticuerpo -ADN de acuerdo a la invención, son capaces de suministro específico a objetivo de ADN funcional en células cancerosas humanas.

Se proporcionan los ejemplos anteriores para ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes para un experto ordinario en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas en la presente para referencia.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una micropartícula lipídica unida a una proteína por medio de una molécula enlazadora, el método que comprende la etapa de: incubar una micropartícula lipídica con una proteína conjugada a una molécula enlazadora que comprende un dominio hidrofóbico, y un grupo químico reactivo a uno ó más grupos funcionales en una molécula de proteína y unido a la cadena de polímero hidrofílico en una terminación contralateral al dominio hidrofóbicc, por un tiempo suficiente que permite que el dominio hidrofóbico se asocie establemente con la micropartícula lipídica.
2. 2. Un método para preparar una micropartícula lipídica unida a una prcteína, caracterizado porque el método comprende la etapa de: incubar una prcteína que comprende una secuencia de aminoácido unida terminalmente que comprende principalmente aminoácidos con cadenas laterales hidrofílicas, dicha secuencia es seguida por un sitio de modificación de lípido con una porción de lípido unida sintéticamente, con una micropartícula lipídica por un tiempo suficiente que permite que la porción del lípido se asocie establemente con la micropartícula lipídica.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la micropartícula lipídica es un liposoma.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la micropartícula lipídica es un complejo de lípido: ácido nucleico.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la micropartícula lipídica es un complejo de lípido: droga.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la micropartícula lipídica es una gota de microemulsión.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es un anticuerpo.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es un fragmento Fab' de un anticuerpo.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es un anticuerpo Fv de una cadena.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es una enzima.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es una hormona.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es un factor de crecimiento.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es una proteína de enlazamiento de ácido nucleico.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo reactivo es un grupo maleimido.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación ocurre en un medio acuoso.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína conjugada sufre una etapa de purificación para separarla del enlazador no reaccionado y la proteína no modificada antes a la incubación.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la etapa de purificación se selecciona del grupo que consiste de salteada, diálisis, y cromatografía.
18. 18. Una micropartícula lipídica conjugada a una proteína por el método de conformidad con la reivindicación 1.
19. 19. Un liposoma conjugado a proteína por el método de conformidad con la reivindicación 1.
20. 20. Un complejo de lípido: nucleico conjugado a una proteína por el método de conformidad con la reivindicación 1.
21. 21. Un complejo de lípido: droga conjugado a una proteína por el método de conformidad con la reivindicación 1 .
22. 22. Una gota de microemulsión conjugada a una proteína por el método de conformidad con la reivindicación 1.