JP2019508473A - 標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物を用いたエフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）陽性癌の治療 - Google Patents

標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物を用いたエフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）陽性癌の治療 Download PDF

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ダリル シー． ドラモンド，
ダリル シー． ドラモンド，
ワリド カモウン，
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Abstract

ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソームは、単体でも、ゲムシタビンまたはカルボプラチンなどの化学療法剤と組み合わせても、ＥｐｈＡ２を過剰発現するがんの治療に有用である。本発明は、例えば、がんを治療する方法であって、１つ以上の脂質を含む脂質小胞内にカプセル化されたドセタキセルプロドラッグと、ＰＥＧ誘導体と、前記脂質小胞の外側にあるＥｐｈＡ２結合部分とを含む、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームを投与することを含む、前記方法を提供する。
【選択図】図１Ａ

Description

相互参照
本特許出願は、以下の係属中の米国仮特許出願それぞれに対する優先権を主張し、それぞれの全体が参照により本明細書に援用される：第６２／３０９，２４０号（２０１６年３月１６日出願）、第６２／３２２，９９１号（２０１６年４月１５日出願）、第６２／４１９，０４７号（２０１６年１１月８日出願）、及び第６２／４６４，５７４号（２０１７年２月２８日出願）。
配列表
本明細書と共に提出され、「１１０８ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の、１つの４８．０ＫＢ ＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別されるコンピューター読み取り可能な配列表は、その全体が参照により援用される。
技術分野
本開示は、エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）に結合し、ＥｐｈＡ２陽性癌の治療に有用なドセタキセル産生ナノリポソームに関する。
エフリン受容体は、シグナリングを媒介し、神経反発、細胞遊走、及び脈管形成に関与する細胞間接着分子である。ＥｐｈＡ２は、細胞間接合タンパク質のエフリンファミリーの一部であり、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、及び肺癌を含めたいくつかの固形腫瘍で過剰発現する。エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、ある特定の固形腫瘍で過剰発現し、ある特定の癌状態における予後不良に関連する。Ｅｐｈ受容体は、Ｎ末端リガンド結合ドメインの相同性に基づいて２つのグループ（Ａ及びＢ）に分けられる、チロシンキナーゼ受容体の大きなファミリーから構成されている。Ｅｐｈ受容体は、細胞増殖、遊走、及び分化を制御するいくつかの主要なシグナリング経路に関与している。これらの受容体は、リガンドが近接細胞の表面に結合するという点において独特である。Ｅｐｈ受容体及びＥｐｈ受容体のリガンドは、発生中に特定のパターンの発現を示す。例えば、ＥｐｈＡ２受容体は胚発生期の神経系に発現し、成人の増殖上皮細胞の表面にも発現する。また、ＥｐｈＡ２は、リガンドエフリンＡ１を通じて媒介される脈管形成及び腫瘍血管新生で重要な役割を果たしている。さらにＥｐｈＡ２は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、及び膵臓癌を含めた様々なヒトの上皮腫瘍で過剰発現する。ＥｐｈＡ２の発現は、腫瘍血管でも検出され得る。
膵臓癌は依然として、生存期間が月数や週数で説明される致命的ながんの１つである。近年の膵臓癌治療の進歩により、最近、リポソームイリノテカン（ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）（イリノテカンリポソーム注射剤）、旧称ＭＭ−３９８）が承認されるに至った。
発明者らは、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生イムノリポソームの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６を含めた新規のＥｐｈＡ２標的ナノリポソームドセタキセル産生分子を開発し、様々な患者由来のがん異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける様々な療法の活性を、単剤療法として、そしてゲムシタビンとの組合せにおいて評価した。加えて、発明者らは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の作用機構に関連する主要なバイオマーカーの潜在的予測能力を試験した。
発明者らは、ＥｐｈＡ２陽性腫瘍（膵臓癌腫瘍を含む）の治療における、単体での、またはゲムシタビンなどのある特定の化学療法剤と組み合わせた、新規のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソームの使用を発見した。この発見は、部分的には、ある特定の患者由来膵臓癌異種移植片モデルにおけるＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソームの評価に基づくものである。ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソームは、ゲムシタビンと組み合わせて投与することができる。
いくつかのＰＤＸモデルに対し、ＥｐｈＡ２（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３標的）、ＣＤ３１（血管）、マッソントリクローム（線維症）、ＣＡ ＸＩ（低酸素症）、及びＥ−カドヘリン（標的の結びつきを潜在的に阻害し得る接着分子）の発現をスクリーニングした。８つのＥｐｈＡ２＋ＰＤＸモデルを使用して、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の活性を評価し、これをｎａｂ−パクリタキセル、リポソームイリノテカン、オキサリプラチン、及びゲムシタビンを含めた臨床上意義の高い薬剤と比較した。また、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンの組合せの潜在能力も試験した。
代表的化合物４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、全ての試験モデルにおいて、８５％を超える試験モデルの腫瘍退縮により、統計的に有意に腫瘍成長を制御することができた。腫瘍モデルにおいて標準的治療剤と比べた場合、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、ｎａｂ−パクリタキセルに対し８０％（４／５）、ゲムシタビンに対し１００％（５／５）、オキサリプラチンに対し１００％（５／５）、そしてリポソームイリノテカンに対し８０％（４／５）大きい活性を示した。ゲムシタビンは、現時点ではｎａｂ−パクリタキセルとの組合せで膵臓癌における標準的治療とみなされているため、ゲムシタビンにおける４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３との組合せの潜在的利点を評価する研究を行った。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンの準最適用量の組合せにより、いずれかの群単体の場合よりも大きい顕著な腫瘍成長制御がもたらされた。加えて、５０％の最大耐容量の等毒性投与において、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３＋ゲムシタビンではアブラキサン（注射懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合粒子）＋ゲムシタビンよりも大きな効果が示された。発明者らはこれらの研究からＥｐｈＡ２陰性モデルを除外したが、バイオマーカー解析からは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果がＥｐｈＡ２発現レベルに相関しないことが示されており、このことから、活性の媒介には低レベルのＥｐｈＡ２で十分であり得ることや、リポソーム送達が律速ステップであり得ることが示唆される。結論として、発明者らは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３が膵臓癌のいくつかの患者由来モデルにおいて高い活性を有することや、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３がほとんどの標準的治療剤と同等またはそれ以上であったことを見いだした。
ＥｐｈＡ２結合部分（抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖ ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を含むドセタキセル産生リポソームの概略図である。 スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）を捕捉剤として含むリポソームにドセタキセルプロドラッグを装填するプロセスと、ドセタキセル産生のプロセスとを示す概略図である。塩が低ｐＨ環境と組み合わせた際にリポソーム内部で不溶であることにより、プロドラッグを安定化して、活性ドセタキセルへの早期転換を低減または防止することができる。 ある特定のドセタキセルプロドラッグ合成における化学反応スキームである。 ドセタキセルプロドラッグの選択された例を示す図表である。 ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅの合成を示す反応スキームである。 Ａは、好ましいドセタキセルプロドラッグのセ氏３７度における加水分解プロファイルを示す概略図である。加水分解プロファイルは、実施例１１の方法を用いて得ることができる。 Ｂは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。Ｃは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。 Ｄは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。Ｅは、ある特定のドセタキセルプロドラッグの加水分解プロファイルである。 実施例２−９で使用されている４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３ドセタキセル産生リポソームにおける、ｓｃＦｖ ＥｐｈＡ２結合部分のアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。 ＥｐｈＡ２結合部分に有用であり、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、様々なＣＤＲ配列を示している。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができるｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製に使用することができる、ｓｃＦｖのアミノ酸配列及び対応するコードＤＮＡ配列である。当該ＤＮＡ配列はさらに、コード化ｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたはげっ歯類）細胞によって切断されるＮ末端リーダー配列をコードする。 実施例４で使用されているアミノ酸配列、及び対応するコードＤＮＡ配列である。 ＃１２４２４モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１２４２４モデルの再成長時間を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１２４２４モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１４２４４モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１４２４４モデルの再成長時間を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１４２４４モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１５０１０モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１５０１０モデルの再成長時間を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１５０１０モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を標準的治療剤と比較している。 ＃１４３１２モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１４３１２モデルの再成長時間を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１４３１２モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１２４２４モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１２４２４モデルの再成長時間を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１２４２４モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１５０１０モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１５０１０モデルの再成長時間を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１５０１０モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１４２４４モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１４２４４モデルの再成長時間を示す図表であり、ｎａｂ−パクリタキセルを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と比較している。 ＃１４２４４モデルの薬物に対する最大反応を示す図表であり、ｎａｂ−４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を比較している。 ＃１４２４４モデルの腫瘍成長曲線を示す図表であり、ゲムシタビン＋４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３をゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセルと比較している。 ＃１４２４４モデルの再成長時間を示す図表であり、ゲムシタビン＋４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３をゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセルと比較している。 薬物に対する最大反応を示す図表であり、モデル＃１４２４４において、ゲムシタビン＋４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せ療法をゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセルと比較している。 種々の組合せスケジューリングスキームで６３ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 種々の組合せスケジューリングスキームで７２ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 種々の組合せスケジューリングスキームで８４ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 種々の組合せスケジューリングスキームで１６２ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 種々の組合せスケジューリングスキームで２１４ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 種々の組合せスケジューリングスキームで２９２ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の耐容性を示す図表である。 腫瘍モデルＢＬ−０２９３における、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 腫瘍モデルＢＬ−０３８２における、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 腫瘍モデルＢＬ−０４４０における、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 腫瘍モデルＢＬ−０３８２、ＢＬ−０２９３、及びＢＬ−０４４０における、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 卵巣腫瘍モデルにおける、カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 卵巣腫瘍モデルにおける、カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。 卵巣腫瘍モデルにおける、カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果を示す図表である。
ＥｐｈＡ２標的ナノリポソームを使用して、（例えば、カプセル化されたドセタキセルプロドラッグとしての）ドセタキセルをがん細胞及び／または腫瘍に送達させ、浸透性及び保持効果の強化を通じて臓器特異性にてこ入れし、ＥｐｈＡ２標的化を通じて細胞特異性にてこ入れすることができる。
「ＥｐｈＡ２」とはエフリンＡ型受容体２を指し、エフリンＡリガンドに結合し、またエフリンＡリガンドにより活性化され得る受容体チロシンキナーゼである「上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）」とも呼ばれる。「ＥｐｈＡ２」という用語は、天然に存在する任意のＥｐｈＡ２のアイソフォームを指すことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２として記録されている。
本明細書において、「ＥｐｈＡ２陽性」とは、１細胞当たり少なくとも約３，０００ＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞（または、このようながん細胞を含む腫瘍を有する患者）を指す。ＥｐｈＡ２陽性細胞は、細胞ごとにＥｐｈ−Ａ２標的リポソームに対し、特異的に結合し得る。詳細には、ＥｐｈＡ２標的リポソームは、１細胞当たり少なくとも約３，０００以上のＥｐｈＡ２受容体を有するＥｐｈＡ２陽性癌細胞に対し、特異的に結合し得る。
本明細書において、非標的リポソームは「Ｌｓ」または「ＮＴ−Ｌｓ」と称され得る。Ｌｓ（またはＮＴ−Ｌｓ）は、ドセタキセルプロドラッグを有する非標的リポソームもドセタキセルプロドラッグを有しない非標的リポソームも指すことができる。「Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグに対する同等または代替の実施形態を含めた、任意の適したドセタキセルプロドラッグを含有するリポソームを指す。「ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグに対する同等または代替の実施形態を含めた、任意の好適なドセタキセルプロドラッグをカプセル化する標的化部分を有しないリポソームを指す。特定のドセタキセルプロドラッグを含めた非標的リポソームの例は、「Ｌｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」または「ＮＴ−ＤＴＸｐ［ｙ］」（［ｙ］は、本明細書で指定される特定の化合物番号を指す）という形式で指定することができる。例えば、別段の指示がない限り、Ｌｓ−ＤＴＸｐ１は、本明細書における化合物１のドセタキセルプロドラッグを含有し、抗体標的化部分を有しないリポソームである。
本明細書において、標的イムノリポソームは「ＩＬｓ」と称され得る。「ＩＬｓ−ＤＴＸｐ」という記載は、ｓｃＦｖなどの標的化部分を含む標的化ドセタキセル産生イムノリポソームの任意の実施形態またはバリエーションを指す。本明細書で開示されるＩＬｓとは、生物学的エピトープ結合部分（例えば、イムノリポソームのエピトープ結合ｓｃＦｖ部分）を含むイムノリポソームを指す。別段の指示がない限り、本明細書で記載されるＩＬｓとは、ＥｐｈＡ２結合イムノリポソーム（代替的に「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ」と呼ばれる）を指す。本明細書において「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ」という用語は、本開示によって有効になる、ＥｐｈＡ２に結合するように標的化された部分を有するイムノリポソームを指す。ＩＬには、（例えば、ＥｐｈＡ２に結合する任意のｓｃＦｖ配列を用いて）ＥｐｈＡ２に結合する部分を有するＥｐｈＡ２−ＩＬｓが含まれる。好ましい標的ドセタキセル産生イムノリポソームとしては、ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、ＩＬｓ−ＤＴＸｐ４、及びＩＬｓ−ＤＴＸｐ６が挙げられる。反対の指示が存在しない場合、これらは、ＥｐｈＡ２結合部分と、（それぞれ）化合物３、化合物４、または化合物６のカプセル化ドセタキセルプロドラッグとを有するイムノリポソームを含む。ＥｐｈＡ２−ＩＬは、ドセタキセルプロドラッグを有するイムノリポソームもドセタキセルプロドラッグを有しないイムノリポソーム（例えば、ドセタキセルプロドラッグを有しない、スクロースオクタサルフェートなどの捕捉剤をカプセル化するイムノリポソーム）も指すことができ、また含むことができる。
「［ｘ］ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」という省略形式は、ｓｃＦｖ「標的化」部分を含むイムノリポソーム（「ＩＬｓ」）の例を説明するために本明細書で使用され、このｓｃＦｖ「標的化」部分は、特定の配列番号［ｘ］で指定されるアミノ酸配列を有し、本明細書で指定される特定の化合物番号（［ｙ］）を有するドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸｐ」）をカプセル化または含有するリポソームに結合している。別段の指示がない限り、標的ＩＬｓのｓｃＦｖ配列はＥｐｈＡ２標的に結合することができる。
「ＮＴ−Ｌｓ」という用語は、本開示によって有効になる、標的化部分を有しない非標的リポソームを指す。「ＮＴ−ＬＳ−ＤＴＸｐ３」という用語は、本開示によって有効になる、ドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸ」）をカプセル化する非標的リポソームを指す。
本明細書において「ｍｐｋ」という用語は、動物に投与する用量における１ｋｇ当たりのｍｇを指す。
好ましくは、イムノリポソーム（ＩＬｓ）または非標的リポソーム（ＬｓまたはＮＴ−Ｌｓ）は、投与により所望の血漿半減期をもたらすために、リポソーム小胞の１つ以上の成分に結合した好適な量のＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ化）を含む。
一実施形態では、本発明は、がんを治療する方法であって、１つ以上の脂質を含む脂質小胞内にカプセル化されたドセタキセルプロドラッグと、ＰＥＧ誘導体と、前記脂質小胞の外側にあるＥｐｈＡ２結合部分とを含む、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームを投与することを含む方法である。
一部の実施形態では、当該方法は、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをゲムシタビンと組み合わせて投与することをさらに含む。一部の実施形態では、当該方法は、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをカルボプラチンと組み合わせて投与することをさらに含む。
一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３または４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６である。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３である。
一部の実施形態では、当該がんは膀胱癌である。一部の実施形態では、当該がんは肉腫癌である。
一実施形態では、本発明は、ヒト患者におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ３またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ６をヒト患者に投与することを含む方法である。
一部の実施形態では、当該リポソームは、３：２のモル比のスフィンゴミエリン及びコレステロールと、５〜７ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧとを含む。
一実施形態では、本発明は、ヒト患者における肉腫癌または膀胱癌を治療するための、ヒト患者に対するＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ３またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ６の使用であって、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ１またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ３をヒト患者に投与することを含む使用である。
一部の実施形態では、当該がんは、平均で１細胞当たり少なくとも３０００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む。一部の実施形態では、当該がんは、平均で１細胞当たり少なくとも１７５００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む。一部の実施形態では、当該がんは、平均で１細胞当たり少なくとも１００，０００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む。
一部の実施形態では、当該リポソームは、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを３：２：０．０３のモル比で含む。
一部の実施形態では、当該リポソームは、化合物３、化合物４、または化合物６のドセタキセルプロドラッグをカプセル化する。一部の実施形態では、当該リポソームは、化合物３、化合物４、または化合物６のスクロースオクタサルフェート塩をカプセル化する。
一部の実施形態では、当該がんはＥｐｈＡ２過剰発現がんである。
一部の実施形態では、当該がんは、膀胱癌または尿路上皮癌、胃癌、胃食道接合部癌、または食道癌（Ｇ／ＧＥＪ／Ｅ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、卵巣癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、前立腺癌（ＰＡＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、子宮内膜癌、及び軟組織肉腫のサブタイプ（ＧＩＳＴ、デスモイド腫瘍、及び横紋筋肉腫以外）からなる群から選択される。
ドセタキセル送達用ＥｐｈＡ２標的リポソーム
図１Ａは、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的ナノサイズイムノリポソーム（ナノリポソーム）の構造を示す概略図である（例えば、リポソームのサイズは約１００ｎｍ程度である）。イムノリポソームは、（例えば、共有結合したＰＥＧ−ＤＳＰＥ部分を通じて）当該リポソームに結合したエフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）標的部分、例えば、ｓｃＦｖを含むことができる。ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームは、ＥｐｈＡ２受容体を認識する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片を、本明細書に記載のプロドラッグの形態でドセタキセルを含有するＰＥＧ化リポソームと共有結合させることによって作成することができ、これによってイムノリポソーム薬品がもたらされる（図１Ａ）。ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソーム（本明細書では「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸ」と称される）の特定の一例では、脂質膜は、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセリルメトキシポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧ−ＤＳＧ）から構成され得る。ナノリポソームは、水性緩衝液（例えば、ヒトへの非経口投与用に配合した無菌医薬組成物）中に分散させることができる。
図１ＡのＥｐｈＡ２標的ナノリポソームは、好ましくは、直径がおよそ１１０ｎｍの単層の脂質二重膜小胞であって、本明細書で開示される化合物をスクロソファート（スクロースオクタサルフェート）塩としてゲル化状態または沈殿状態で含有する水性空間をカプセル化する、小胞である。実施例１では、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームを調製する方法を説明する。
ドセタキセルプロドラッグは、保管中やインタクトなリポソームが全身循環する間、リポソーム内部で安定化させることができるが、リポソームから放出され循環血液の環境に入ると、迅速に加水分解して（例えば、ｔ１／２＝約１０時間）活性ドセタキセルになる。図１Ｂは、本明細書で開示されるドセタキセルプロドラッグを用いたドセタキセルのナノ産生体を示している。ドセタキセルプロドラッグは、不溶性形態で安定化する電気化学的勾配を用いて、弱酸性のｐＨで装填しリポソームの酸性内部に封入することができる。リポソームから放出されると、次にドセタキセルプロドラッグは、中性ｐＨにおける単純な塩基媒介の加水分解によって活性ドセタキセルに転換される。
ドセタキセルプロドラッグ化合物
ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するＰＥＧ化ＥｐｈＡ２標的リポソームは、１つ以上の好適なドセタキセルプロドラッグをカプセル化することができる。好ましくは、ドセタキセルプロドラッグは弱塩基を含み、例えば、エステル結合を通じてドセタキセルのヒドロキシル基の２’または７位に導入されてドセタキセルプロドラッグを形成する第３級アミンを含む。リポソームに装填するための好ましい２’−ドセタキセルプロドラッグは、酸性ｐＨにおける比較的高い安定性によって特徴づけられるが、生理学的ｐＨにおいて酵素に依存しない加水分解を通じてドセタキセルに転換される。
図１Ｂに示されるように、２’−エステル結合の化学環境を系統的に調整して、比較的低いｐＨでは安定であるが生理学的ｐＨでは加水分解を通じて迅速に遊離ドセタキセルを放出するドセタキセルプロドラッグを得ることができる。ドセタキセルプロドラッグは、ポリ硫酸化ポリオール（例えば、スクロースオクタサルフェート）などの捕捉剤と共に安定した複合体を形成することにより、比較的低いｐＨでリポソームに装填される。捕捉剤のスクロースオクタサルフェートは、アミン塩（例えば、ジエチルアミン塩（ＤＥＡ−ＳＯＳ）、またはトリエチルアミン塩（ＴＥＡ−ＳＯＳ））の溶液として、リポソーム内部に含めることができる。捕捉剤のアミン塩を使用することで、プロドラッグをリポソームに装填する助けになる膜間イオン勾配の創出に役立つと共に、プロドラッグを装填したリポソームが解剖学的標的に到達する前にプロドラッグがドセタキセルに早期転換することを防ぐのに好ましい酸性のリポソーム内環境の維持にも役立つ。このようにしてドセタキセルプロドラッグをリポソーム内にカプセル化することで、患者体内でのリポソームからの放出時にｐＨをトリガーとしてドセタキセルを放出させることが実用化可能になる。したがって、ドセタキセルプロドラッグをカプセル化するリポソームは、ドセタキセルナノ産生体と呼ぶことができる。
好ましくは、ドセタキセルプロドラッグは、式（Ｉ）の化合物（その医薬的に許容される塩を含む）であり、式中Ｒ１及びＲ２は、所望のリポソーム装填及び安定性特性、そして所望のドセタキセル産生（例えば、本明細書で開示されるように、様々なｐＨ値における加水分解プロファイルによって測定される）をもたらすように選択される。ドセタキセルプロドラッグ（ＤＴＸ’）化合物は、リポソーム内に医薬的に許容される塩を形成することができる（例えば、スルホン化ポリオールなどの好適な捕捉剤との塩）。一部の例において、式（Ｉ）の化合物の式中、Ｒ１及びＲ２は独立してＨまたは低級アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４直鎖状または分枝状アルキル、最も好ましくはＣ２またはＣ３）であり、ｎは整数である（好ましくは１〜４、最も好ましくは２〜３）。
ドセタキセルプロドラッグ（式（Ｉ）の化合物を含む）は、図２Ａの反応スキームを用いて調製することができる。２つの具体的なドセタキセルプロドラッグ調製物を実施例１０Ａ（化合物３）及び実施例１０Ｂ（化合物４）で説明する。他のドセタキセルプロドラッグの例としては、２’−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセルまたは７−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセルが挙げられる。
好ましい式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ化合物としては、ｐＨ７．５において迅速な加水分解速度を提供し、ｐＨ２．５と比較してｐＨ７．５の化合物において十分に高い相対加水分解速度を提供するための、（ｎ）が２または３である化合物が挙げられる（例えば、ｐＨ２．５での加水分解速度と比較して、ｐＨ７．５においてドセタキセルへの最大加水分解速度を有するドセタキセルプロドラッグを選択する）。図３Ｃ〜３Ｇは、ドセタキセルプロドラッグの様々な例における加水分解プロファイルを示している。
ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖ部分
ドセタキセル産生リポソームは、ＥｐｈＡ２標的化部分を含むことができる。標的化部分は単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）とすることができ、これは、本明細書で開示されるドセタキセル産生リポソームを標的化するためのリポソームに共有結合することができるタンパク質である。ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬが互いに共有結合した単一のポリペプチド鎖から構成され得、典型的には、ＶＨ及びＶＬは、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲから構成された機能的抗原結合部位の形成を可能にするリンカーペプチドを介して共有結合している。Ｉｇ軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域と交互に出現する複数の「フレームワーク」領域（ＦＲ）から構成され、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレームワーク領域及びＣＤＲは、公開データベースで見いだされる配列との相同性に基づいて定義することができる。例えば、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７）を参照。本明細書で使用する全てのｓｃＦｖ配列ナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．による定義の通りである。
本明細書において、別段の指示がない限り、「抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖ」という用語は、免疫特異的にＥｐｈＡ２、好ましくはＥｐｈＡ２のＥＣＤに結合するｓｃＦｖを指す。ＥｐｈＡ２特異性ｓｃＦｖは、ＥｐｈＡ２タンパク質中に存在しない抗原には免疫特異的に結合しない。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＦｖには、表１に示すＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、ＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、及びＶＬ ＦＲ３の１つまたは任意の組合せが含まれる。一実施形態では、ｓｃＦｖは、下記表１の全てのフレームワークを含有する。
ある特定の態様では、本明細書で開示されるｓｃＦｖは熱安定性であることから、例えば、ｓｃＦｖはロバストかつスケーラブルな製造に適切である。本明細書において「熱安定性」のｓｃＦｖとは、例えば示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いた測定で、少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有するｓｃＦｖである。
好ましい抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９３１７に示される配列におけるアミノ酸残基の少なくとも２５〜５３４に及ぶＥｐｈＡ２タンパク質の一部に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖには、それぞれが表２に示す配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３が含まれる。ＶＨ ＣＤＲ２配列（ＣＤＲＨ２とも呼ばれる）は、表２に示す１８の異なるＶＨ ＣＤＲ２配列から選択される任意の１つとなることに留意されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、内在化抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖである。適切な条件下での生細胞の表面に存在するＥｐｈＡ２分子及びＥｐｈＡ２分子のＥＣＤに対するこのようなｓｃＦｖの結合によって、ｓｃＦｖの内在化がもたらされる。内在化の結果、細胞膜の外部に接触したｓｃＦｖが細胞の細胞膜結合内部に輸送される。内在化ｓｃＦｖは、例えば、薬物、毒素、酵素、ナノ粒子（例えば、リポソーム）、ＤＮＡなどの標的送達用のビヒクルとして、例えば治療用途に使用される。
本明細書に記載のある特定のｓｃＦｖは、単鎖Ｆｖ ｓｃＦｖ、例えばｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ’）２ｓである。このようなｓｃＦｖにおいて、ＶＨ及びＶＬのポリペプチドは、２つの向きのいずれかで（すなわち、ＶＬに対しＶＨがＮ末端側、またはＶＨに対しＶＬがＮ末端側）、直接またはアミノ酸リンカーを介して、互いに連結している。このようなリンカーは、例えば、１〜５０、５〜４０、１０〜３０、または１５〜２５アミノ酸長とすることができる。ある特定の実施形態では、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％のアミノ酸リンカーの残基は、セリン（Ｓ）及び／またはグリシン（Ｇ）である。好適な例示的ｓｃＦｖリンカーは、以下の配列を含む、または以下の配列からなる。
ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３２）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、
ＡＳＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号３５）、
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号３６）、
ＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳ（配列番号３７）、及び
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号３８）
例示的な内在化抗ＥｐｈＡ２ ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ ＴＳ１（配列番号４０）である。ｓｃＦｖ ＴＳ１において、そして本明細書で開示されるある特定の他のｓｃＦｖにおいて、ｓｃＦｖのＶＨは、ｓｃＦｖのアミノ末端にあり、またイタリックで示されるリンカーによってＶＬに連結している。ｓｃＦｖのＣＤＲには下線が引かれ、以下の順に提示される：ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３。
ドセタキセル産生ＥｐｈＡ２標的リポソームは、図４Ｂ（「Ｄ２−１Ａ７」と称される配列番号４１、「Ｄ２−１Ａ７ ＤＮＡ」と称される配列番号５６のＤＮＡ配列によりコードされる）、または図４Ｃ（「ＴＳ１」と称される配列番号４０、「ＴＳ１ ＤＮＡ」と称される配列番号４３のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｄ（「ｓｃＦｖ２」と称される配列番号４４、「ｓｃＦｖ２ ＤＮＡ」と称される配列番号４５のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｅ（「ｓｃＦｖ３」と称される配列番号４６、「ｓｃＦｖ３ ＤＮＡ」と称される配列番号４７のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｆ（「ｓｃＦｖ８」と称される配列番号４８、「ｓｃＦｖ８ ＤＮＡ」と称される配列番号４９のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｇ（「ｓｃＦｖ９」と称される配列番号５０、「ｓｃＦｖ９ ＤＮＡ」と称される配列番号５１のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｈ（「ｓｃＦｖ１０」と称される配列番号５２、「ｓｃＦｖ１０ ＤＮＡ」と称される配列番号５３のＤＮＡ配列によってコードされる）、または図４Ｉ（「ｓｃＦｖ１３」と称される配列番号５４、「ｓｃＦｖ１３ ＤＮＡ」と称される配列番号５５のＤＮＡ配列によってコードされる）に示される、１つ以上のＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖ配列も含むことができる。
また、上の表２に示す１８の異なるＣＤＲＨ２配列のいずれかからＶＨ ＣＤＲ２が選択される、ｓｃＦｖ ＴＳ１のバリアントも提供される。
本明細書で提供される情報を用いて、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、標準的技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で提供されるアミノ酸配列を、ｓｃＦｖをコードする適切な核酸配列の決定に使用し、次にこの核酸配列を１つ以上のｓｃＦｖの発現に使用することができる。核酸配列（複数可）は、標準的方法に従って、様々な発現系における特定のコドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
本明細書で提供される配列情報を用いて、複数の標準的方法に従って核酸を合成することができる。オリゴヌクレオチド合成は、好都合には、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機器で行うか、または手動で、例えば固相ホスホロアミダイトトリエステル法を用いて合成する。ひとたび本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードする核酸を合成したら、標準的方法に従ってこれを増幅及び／またはクローニングすることができる。
本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードする天然または合成の核酸は、ｓｃＦｖをコードする核酸をプロモーター（構成的であっても誘導的であってもよい）に作用可能に連結させ、コンストラクトを発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを産生することによって、発現を達成することができる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製及び組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、ｓｃＦｖをコードする核酸の発現を調節するのに有用な、機能的に適切に配向した転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。ベクターは、任意選択により一般的な発現カセットを含有し、これには、少なくとも１つの独立したターミネーター配列と、真核生物及び原核生物の両方でカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクターに見いだされるもの）と、原核生物系及び真核生物系の両方用の選択マーカーとが含まれる。
クローニングした核酸を高レベルで発現できるようにするために、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始用のリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネーター（それぞれが互いに対し、そしてタンパク質コード配列に対し機能的に配向）を含有する発現プラスミドを構築することは一般的である。また、ｓｃＦｖ遺伝子（複数可）は、同定、精製、及び操作を容易にするために、ｓｃＦｖ（例えば、ｓｃＦｖ）のＣ末端またはＮ末端にタグ配列（例えば、ＦＬＡＧ（商標）またはＨｉｓ６）を付加することが可能な発現ベクターにサブクローニングすることもできる。ひとたびｓｃＦｖをコードする核酸を単離及びクローニングすると、この核酸を様々な組換え操作細胞で発現させることができる。このような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状菌、昆虫、及び哺乳類細胞が挙げられる。
本明細書で開示されるｓｃＦｖの単離及び精製は、構成的にかつ／または誘導によってタンパク質を発現するように遺伝子修飾した細胞の溶解物からの単離、または合成反応混合物からの単離、精製については例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを使用）によって、遂行することができる。単離したｓｃＦｖは、透析や、タンパク質精製で通常用いられている他の方法によってさらに精製することができる。
本開示は、主題ｓｃＦｖを産生する細胞も提供する。例えば、本開示は、本明細書で開示されるｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子修飾された組換え宿主細胞を提供する。ＤＮＡは、細菌（例えば、バクテリオファージ）、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ）、昆虫（例えば、バキュロウイルス）、または哺乳類の発現系にクローニングする。好適な技法の１つは、糸状バクテリオファージベクター系を使用する。例えば、ＵＳ５，８８５，７９３；ＵＳ５，９６９，１０８；及びＵＳ６，５１２，０９７を参照。
ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２（ｓｃＦｖ）をマレイミド活性化ＰＥＧ−ＤＳＰＥに対して用いてリポソームに結合することができる。例えば、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ原薬は、ｓｃＦｖのＣ末端システイン残基を介してマレイミドＰＥＧ−ＤＳＰＥに結合している、十分にヒト化された単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）とすることができる。一部の例において、ＥｐｈＡ２標的ｓｃＦｖは、相互作用してミセル構造を形成するリポポリマー脂質との安定したチオエーテル結合、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを通じて共有結合している。好ましくは、ｓｃＦｖはグリコシル化されていない。
ドセタキセル送達用ＥｐｈＡ２標的リポソームの調製
ドセタキセルプロドラッグは、種々のアプローチを通じてリポソームに装填することができる。リモート装填法は、高い装填効率及び良好なスケーラビリティーを可能にする。典型的には、リポソームは、勾配形成イオン及び薬物沈殿剤または薬物複合化剤を含み得る装填助剤（捕捉剤）内で調製する。リポソーム外部装填助剤は、例えばダイアフィルトレーションによって除去して、リポソーム二重膜を横断してのイオン勾配を生じさせる。選択された薬物は脂質二重膜を通過し、イオン勾配を消費してリポソーム内部に蓄積し、装填助剤と共に複合体または沈殿物を形成することができる。リポソーム脂質が周囲温度でゲル状態である場合、装填は、リポソーム膜が液晶状態となる高温でもたらされる。薬物装填が完了したら、装填した薬物を堅い膜によって保持できるようにリポソームを急速冷凍する。薬物装填ステップに関与する任意の因子が装填効率に影響を及ぼし得る。
ＥｐｈＡ２標的ナノリポソームは、ｓｃＦｖをＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ部分に結合させるのに有効な条件下でＥｐｈ−Ａ２結合ｓｃＦｖをＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌと合わせることによって得ることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ結合体は、ポリ硫酸化ポリオール装填助剤及び他の脂質成分と合わせて、脂質小胞でカプセル化されたポリ硫酸化ポリオールを含有するリポソームを形成することができる。
再び図１Ｂを参照すると、薬物は、捕捉剤をカプセル化するリポソームに装填することができる。薬物の放出速度は、捕捉剤のタイプ及び濃度を変化させることによって制御することができ、プロドラッグの加水分解に対する安定性も同様に制御することができる。捕捉剤の例としては、以下に限定するものではないが、アンモニウム＝スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）、ジエチルアンモニウムＳＯＳ（ＤＥＡ−ＳＯＳ）、トリエチルアンモニウムＳＯＳ（ＴＥＡ−ＳＯＳ）、及びジエチルアンモニウム＝デキストランサルフェートが挙げられる。捕捉剤の濃度は、所望の薬物装填特性をもたらすように選択することができ、所望の薬物：脂質比に応じて２５０ｍＮ〜２Ｎに変動し得る。捕捉剤溶液の規定濃度（Ｎ）は、薬物複合化対イオンのイオン価に依存し、対イオンのモル濃度とイオン価との積である。例えば、ＤＥＡ−ＳＯＳ溶液の規定濃度は、ＳＯＳが八価イオンであることから、ＳＯＳのモル濃度×８に等しい。したがって、１ＮのＳＯＳは０．１２５ＭのＳＯＳに等しい。ＤＥＡ−ＳＯＳが捕捉剤として使用される場合、濃度は、好ましくは０．５Ｎ〜１．５Ｎの範囲であり、最も好ましくは０．８５Ｎ〜１．２Ｎの範囲である。１．１ＮのＴＥＡ−ＳＯＳを用いた配合では、リン脂質１ｍｏｌ当たり３００〜８００グラムのドセタキセル相当プロドラッグを含有する最終配合物がもたらされ得る。これにより、患者に対する２５０ｍｇドセタキセル当量／ｍ２の用量で、８〜２２ｍｇの総脂質／ｋｇ（３０２〜８０６ｍｇ／ｍ２）である脂質の用量がもたらされる。この最終配合物は、好ましい薬物：リン脂質比である２５０〜４００ｇドセタキセル当量／ｍｏｌリン脂質を有する。
ドセタキセルプロドラッグは、酸性緩衝液に直接、または他の可溶化試薬（例えば、ヘキサ（エチレングリコール）（ＰＥＧ６）、またはポリ（エチレングリコール）４００（ＰＥＧ−４００））の存在下で、溶解することができる。いかなる状況においても、塩基条件下で加水分解するドセタキセルプロドラッグの可溶化プロセスでは塩基条件を回避すべきである。
タキサンプロドラッグの装填に使用するリポソームは、エタノール押出法によって調製される。脂質成分は、所望の特性をもたらすように選択することができる。
概して、様々な脂質成分をリポソームの作製に使用することができる。通常、脂質成分としては、以下に限定するものではないが、（１）非荷電脂質成分（例えば、コレステロール、セラミド、ジアシルグリセロール、アシルポリ（エーテル）、またはアルキルポリ（エーテル））、及び（２）中性リン脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアルキルホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）が挙げられる。１つ以上の所望の機能を果たす、変更する、または付与するために様々な脂質成分を選択することができる。例えば、リン脂質は主要な小胞形成脂質として使用することができる。コレステロールを含めることは、膜の剛性を維持し薬物の漏出を減らすために有用である。ポリマー結合脂質は、肝臓及び脾臓によるリポソームクリアランスを低減することにより循環のライフタイムを増加させるために、また、循環延長効果の不在下で保管中の凝集に対するリポソームの安定性を向上するために、リポソームの配合で使用することができる。
好ましくは、リポソームは、非荷電脂質成分と、中性リン脂質成分と、ポリエチレン（ＰＥＧ）−脂質成分とを含む。好ましいＰＥＧ化脂質成分は、ＰＥＧ（分子量２，０００）−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、またはＮ−パルミトイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（ＰＥＧ−セラミド）である。例えば、脂質成分は、卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＧを好適なモル比で含むことができる（例えば、所望の量のＰＥＧ−ＤＳＧと共に、スフィンゴミエリン及びコレステロールを３：２のモル比で含む）。好ましくは、ＰＥＧ−ＤＳＧの量は、総リポソームリン脂質の１０ｍｏｌ％（例えば、４〜１０ｍｏｌ％）以下の量、例えば、総リン脂質の８ｍｏｌ％未満、好ましくは総リン脂質の５〜７ｍｏｌ％の量で組み込まれる。別の実施形態では、スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームが配合に用いられ、この配合は所与のモル比、例えば３：２：０．０３のモル比のスフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅから構成される。この配合で使用する中性リン脂質及びＰＥＧ脂質の成分は、概して、酸加水分解に対するいっそうの安定性及び耐性を有する。スフィンゴミエリン及びジアルキルホスファチジルコリンは、好ましいリン脂質成分の例である。より具体的には、３７℃より高い相転移温度（Ｔｍ）を有するリン脂質が好ましい。このようなリン脂質としては、以下に限定するものではないが、卵由来スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ｎ−ステアロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシルホスフォリルコリン、及びＮ−パルミトイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシルホスフォリルコリンが挙げられる。リポソーム配合の選択は、ある特定の条件下における特定のプロドラッグの安定性、及び製造コストに依存する。
タキサンプロドラッグは、好ましくは４〜６の範囲の酸性ｐＨで、好ましくは５〜４０ｍＭの緩衝液の存在下で、リポソームに装填する。好適な酸性緩衝液としては、以下に限定するものではないが、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、及びプロパン−１，２，３−トリカルボン酸が挙げられる。タキサンプロドラッグのリポソームへの効率的な装填を容易にするために、種々の薬物装填方法が開発されている。一実施形態では、プロドラッグ溶液は、まず室温でリポソームと混合し、次に高温でｐＨ調整及びインキュベートを行う。別の実施形態では、プロドラッグ溶液及びリポソームのｐＨをまず所望の装填ｐＨに調整し、所望の装填温度に予め温め、次に混合及びインキュベートを行う。さらに別の実施形態では、プロドラッグは、まず高濃度で８０％のＰＥＧ６溶液に可溶化させ、予め温めたリポソームに少しずつ添加する。さらなる実施形態では、プロドラッグは、まず８０％のＰＥＧ４００に溶解し、デキストロースＭＥＳ緩衝液中約８％のＰＥＧ４００へと希釈し、リポソームとまず室温で混合し、次に装填温度に温める。
カプセル化されていないポリ硫酸化ポリオール材料は、組成物から除去することができる。次に、ポリ硫酸化ポリオール装填助剤（好ましくはＴＥＡ−ＳＯＳまたはＤＥＡ ＳＯＳ）を含有するリポソームを、好適なタキサンまたはタキサンプロドラッグ、例えば式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ、好ましくは化合物３、化合物４、または化合物６のドセタキセルプロドラッグと、タキサンまたはタキサンプロドラッグをリポソームに装填するのに有効な条件下で、好ましくはカプセル化されたポリ硫酸化ポリオールを含む安定した塩をリポソーム内に形成する条件下で、接触させることができる。同時に、装填助剤の対イオン（例えば、ＴＥＡまたはＤＥＡ）は、薬物がリポソームに装填されるに伴ってリポソームから離れる。最後に、カプセル化されていない薬物（例えば、ドセタキセルプロドラッグ）を、リポソームを含む組成物から除去する。リポソーム薬物装填の方法は、参照により援用される２００５年５月２日出願の米国特許第８，１４７，８６７号に記載されている。
リポソーム組成物の作製に適した方法の例としては、押出、逆相蒸発、超音波処理、溶媒（例えば、エタノール）注入、微小溶液操作、界面活性剤透析、エーテル注入、及び脱水／再水和が挙げられる。リポソームのサイズは、低圧押出に使用する膜の孔径の制御、または微小溶液操作または他の任意の好適な方法で利用する圧力及びパス回数の制御によって、制御することができる。一実施形態では、所望の脂質は、まず薄膜水和またはエタノール注入によって水和させ、次に定義された孔径（最も一般的には０．０５μｍ、０．０８μｍ、または０．１μｍ）の膜を通じた押出によってサイズ調整する。好ましくは、リポソームの平均直径は約９０〜１２０ｎｍであり、より好ましくは約１１０ｎｍである。
別段の指示がない限り、「ＥｐｈＡ２−Ｌｓ−ＤＴＸ’」と称される例示的なＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生ナノリポソーム組成物を、以下の実施例に記載のように試験した。ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−ＤＴＸ’は、約４．４：１．６：１の重量比の卵由来スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧから形成された脂質小胞内にカプセル化された、化合物３と称される式（Ｉ）の化合物を含む標的リポソームである。脂質小胞はさらに、脂質小胞内のＰＥＧ−ＤＳＰＥの総量に対し約１：３２の重量比でＰＥＧ−ＤＳＰＥに共有結合した配列番号４６のｓｃＦｖ部分も含む。ＥｐｈＡ２−Ｌｓ−ＤＴＸ’リポソームは、緩衝液システム（例えば、クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、及び希釈剤としての滅菌水ビヒクル（例えば、注射用水）を含めた、薬品の形成に適した組成物中で配合することができる。
実施例１〜３では、膵臓癌の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍有効性を、現時点における最先端の治療選択肢であるｎａｂ−パクリタキセル＋ゲムシタビンを含めたいくつかの標準的な治療剤と比較した。外植片として連続的に維持された原発性腫瘍の異種移植片は、患者個体群で観察される異種性や遺伝的多様性をシミュレートすることができる。最も重要なことには、この異種移植片は、組織構造だけでなく、ドナーの原発性腫瘍で最初に見られた薬物感受性プロファイルも保存する傾向がある。そのため、この異種移植片は、従来型の細胞株に移植した異種移植片よりも臨床上意義の高いモデルに相当する可能性がある。膵臓異種移植片モデル系列は、増殖用に患者腫瘍切除からＳＣＩＤマウスに直接生着させ、腫瘍断片の移植によって維持した真の異種移植モデルである（Ｈｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，２０１３）。承認されたガイドラインに従って実験を実施した。初期時点で６〜８週齢のＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスをＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。別段の指示がない限り、処置群ごとに８匹の動物を扱った。腫瘍片はドナーマウスに由来するものであり、これを皮下に生着させた。腫瘍成長の変動性に応じて、動物を特定の一時点でランダムに異なる群に割り付けるか、または開始サイズの変動性を抑えるために、ある期間を通じて動物の下位群をランダム化する回転的ランダム化を実施した。別段の指示がない限り、腫瘍の平均体積が２００〜２５０ｍｍ３（１００〜４００ｍｍ３の範囲）に到達したときに、動物をランダム化し投薬を開始した。
有効性の実験については、組成物の説明に記載されているように４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を産生した。全ての標準的な治療剤をｃｕｒａｓｃｒｉｐｔ（Ｌａｋｅ Ｍａｒｙ，ＦＬ）から購入した。ＭＭ−３９８は、最終市販プロセスを用いて施設内で産生した。
腫瘍の平均体積が２００〜２５０ｍｍ３に到達したときに指示用量の各薬剤の静脈内投与を開始し、週１回用量を合計４回継続した。腫瘍が再成長するか最大監視期間１２０〜１６０日に到達するまで、あるいは動物の全体的健康状態が悪く屠殺の必要が生じるまで、投薬サイクル中に腫瘍体積を週に１〜２回測定した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９７２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝［（長さ）×（幅）２］／２
各動物の単一腫瘍体積曲線をプロットし、抗腫瘍効果を説明する２つの測定基準を以下のように計算した。
１）最大反応＝［（最小ＴＶ−０日時のＴＶ）／０日時のＴＶ］×１００
２）再成長時間＝腫瘍が初期サイズの４倍に到達する時間
処置群間の全ての統計解析をＪＭＰ ｖ１１．０ソフトウェアを用いて実施した。処置群の比較については、２方向ＡＮＯＶＡ解析を事後チューキーＨＳＤ統計解析と共に実施した。
実施例１：膵臓患者由来異種移植片における４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及び標準的なケア療法の有効性。
実施例１Ａ：＃１２４２４ ＰＤＸ腫瘍モデル：
＃１２４２４ ＰＤＸ腫瘍モデルはＨｙｌａｎｄｅｒ（２００５）に記載のものであった。生涯にわたり喫煙していない６４歳のコーカサス人男性から腫瘍材料を採取した。がん組織学的サブタイプはＣ２５．７（ＩＣＤ−Ｏ−３組織学コード８５０３３）であった。腫瘍は、病期分類ｐＴ３、ｐＮ１、及びＭ０で特定されない低分化、浸潤性腺管癌として特徴づけられた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）による組織学的病期分類は２Ｂであった。フォローアップ治療は利用できない。異種移植片モデルはＡＰＯ２Ｌ／Ｔｒａｉｌに対してもゲムシタビン治療に対しても抵抗性であった。当該モデルはＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡのレベルが高く、ドビチニブ（４０ｍｇ／ｋｇ）に対し感受性であった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。＃１２４２４モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。このＰＤＸモデルは、＃１２４２４−８Ｐ研究において第８継代であった。図５は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの腫瘍成長曲線を示す図表である。
結果：一般に使用されているいくつかの標準的な治療剤（５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、オキサリプラチン）で処置した腫瘍についての腫瘍成長プロファイルからは、対照と比較して、中程度の腫瘍成長阻害が示唆される（図５）。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）５０ｍｇ／ｋｇにおける週１回用量の４週間にわたる単回用量レベル処置から示されたのは、軽微であり統計的に有意ではない、生理食塩水対照と比較して１２日（ｐ＝０．６９６５）という腫瘍成長阻害であった。これは、再成長時間（腫瘍が処置開始時の腫瘍体積の４倍に到達するのにかかる時間として定義される）の測定により決定されたものである。同様にして、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐモデルの成長阻害は、ゲムシタビン（３５ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）単剤療法及びオキサリプラチン（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）単剤療法の両方の用量レベルにおいて、生理食塩水対照に対し、成長阻害の観点で統計的に有意ではなかった。ＭＭ−３９８（商業的にはＯｎｉｖｙｄｅとして知られている）は、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで２４日（ｐ＝０．００６５）の成長阻害を示した。これは、最も有効な「従来型」化学療法である５−ＦＵの場合のほぼ２倍である。しかし、５ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８では、非リポソームの標準的治療剤に対する腫瘍成長阻害の有意な優位性が示されなかった。全体的に見て、腫瘍成長を最も大きく阻害したのは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３コホートであり、２５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍成長阻害において対照と比較して４９日（ｐ＜０．０００１）の優位性が示され、５０ｍｇ／ｋｇでは１０４日間（ｐ＜０．０００１）成長が阻害された（図６）。
最大反応を測定基準として用いると、このモデルにおける有効性の観点で類似した傾向が見られる。標準的化学療法ならびに５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８では、対照と比較して統計的に有意な反応が生じなかった。全体的に見て、薬物に対する最も大きな反応は４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３処置群で観察され、２５ｍｇ／ｋｇでは対照と比較して２４．１６％（ｐ＝０．００８４）の薬物反応の増加が示され、一方５０ｍｇ／ｋｇ群では対照と比較して６９．５％（ｐ＜０．０００１）の増加が示された（図７）。５０ｍｐｋにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、全ての他の試験化合物よりも強力な抗腫瘍活性（最大反応及び／または再成長時間によって測定可能）を有した。
図６は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの再成長時間を示す図表である。図７は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの最大反応を示す図表である。
実施例１Ｂ：ＰＤＸモデル＃１４２４４：
ファーター膨大部（肝膵管の別名でも知られる）で生じたＰＤＸモデル＃１４２４４は、膵臓癌を代表する組織像により、適切な膵臓モデルと考えられている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このモデルは、高いレベルのＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡを有することが示されており（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、またＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理に対し感受性であった（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。移植からの成長は３９日以内に生じ、肝臓転移は２１週時に見いだされた。＃１４２４４モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。このＰＤＸモデルは、＃１４２４４−９Ｐ研究において第９継代であった。図８は、ＰＤＸ １４２４４−９Ｐの腫瘍成長を示す図表である。
結果：ＰＤＸ １４２４４−９Ｐモデルでは、オキサリプラチンの両方の用量レベル（５及び１０ｍｇ／ｋｇ）において、対照群に対する有意な生存優位性がもたらされなかった（それぞれ２日、ｐ＝０．９９９８及び１日、Ｐ＝１．０）（図８）。しかし、ゲムシタビンでは、３５ｍｇ／ｋｇで再成長が２週間遅れて（ｐ＝０．００９５）生理食塩水に対する生存優位性が示され、一方１００ｍｇ／ｋｇの用量では再成長が１８日延長された（ｐ＝０．０００４）。リポソーム薬物コホートでは、低用量レベルで同様の腫瘍成長の阻害が示され、５ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８では腫瘍成長が１７．５日遅れ（ｐ＝０．０００４）、３５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では１８．３８日遅れた（ｐ＝０．００００２）。本研究における最も大きな腫瘍阻害は５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３コホート（４２．８８、ｐ＜０．０００１）によって証明され、これに僅差で１０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８が続いた（３５日、ｐ＜０．０００１）（図９）。
有効性の第２の測定基準である薬物への最大腫瘍反応について注目すると、オキサリプラチン及びゲムシタビンの両方の用量レベル、ならびにＭＭ−３９８及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の２つの最低用量レベルでは、対照群と比較して薬物への有意な腫瘍反応が示されないことが観察された。逆に、１０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８及び５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では、いずれにおいても薬物への強力な腫瘍反応が示され、ＭＭ−３９８では５３．５４％の腫瘍体積減少（ｐ＜０．０００１）、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では６２．９％の減少（ｐ＜０．０００１）がもたらされた（図１０）。５０ｍｐｋにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、ほとんど全ての他の試験化合物（１０ｍｇ／ｋｇの用量のＭＭ−３９８を除く）よりも強力な抗腫瘍活性（最大反応及び／または再成長時間によって測定可能）を有した。
図９は、ＰＤＸ １４２４４−９Ｐの再成長時間を示す図表である。図１０は、ＰＤＸ １４２４４−９Ｐの最大反応を示す図表である。
実施例１Ｃ：膵臓ＰＤＸモデル＃１５０１０：
膵臓ＰＤＸモデル＃１５０１０の腫瘍組織を７４歳のコーカサス人女性から採取した。腫瘍は膵臓の頭部に位置していた（ＩＣＤ−Ｏ−３組織学コード８５０３３）。腫瘍は、病期分類ｐＴ３、ｐＮ１、及びＭ０で特定されない低分化、浸潤性腺管癌として特徴づけられた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）による組織学的病期分類は２Ｂであった（Ｈｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この患者は、さらなる療法を受けなかった。＃１５０１０モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。本研究における移植時には、このＰＤＸモデルは第５継代であった。
図１１は、ＰＤＸ １５０１０−Ｐ５の腫瘍成長曲線を示す図表である。
結果：このモデルでは、５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチンを除く全ての試験薬物において、生理食塩水対照と比較して中程度の阻害が示された（図１１）。オキサリプラチンの他方の用量１０ｍｇ／ｋｇでは活性が示され、３０日にわたり腫瘍成長を阻害したが、ｐ値０．０６３１で統計的有意性からわずかに外れた。もう１つの試験非リポソーム化学療法剤であるゲムシタビンは、両方の用量レベルにおいて対照と比較して腫瘍成長を阻害し（３５ｍｇ／ｋｇ＝２７日；１００ｍｇ／ｋｇ＝３７日）、１００ｍｇ／ｋｇ群のみがｐ値０．００８０で有意性に到達した。リポソーム群に関しては、５ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８では非リポソーム薬物に類似した腫瘍成長阻害（４０日、ｐ＝０．００３０）が示された。予想されたように、より高い１０ｍｇ／ｋｇ用量レベルのＭＭ−３９８では５ｍｇ／ｋｇで見られた結果を上回り、腫瘍再成長が７０日延長された（ｐ＜０．０００１）。興味深いことには、２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３処置では、１０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８用量レベルに比較的類似した活性が示され、再成長時間の延長はＭＭ−３９８の７０日に対し６５日であった（ｐ＜０．０００１）。しかし、最長の再成長時間をもたらした試験薬物は５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３コホート（１３２日、ｐ＜０．０００１）であり、１０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８や３５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３によってもたらされた再成長時間のほぼ２倍であった（図１２）。
薬物への最大腫瘍反応に関しては、オキサリプラチンの両方の処置用量において、生理食塩水対照に対する統計的有意差が示されなかった（図１３）。ゲムシタビン群では活性の徴候が示されたものの（３５ｍｇ／ｋｇ＝２７％、１００ｍｇ／ｋｇ＝３７％の腫瘍体積減少）、１００ｍｇ／ｋｇ群のみがｐ値０．０１０５で統計的有意性に達した。さらに腫瘍反応の観点からも、リポソーム配合物は従来型化学療法剤より優れていることが判明した。５ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８処置では腫瘍体積における７０％の最大減少（ｐ＜０．０００１）が示され、一方１０ｍｇ／ｋｇのＭＭ−３９８はこれを２１％上回った（生理食塩水対照と比較して９１％、ｐ＜０．０００１）。このモデルでは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の両方の用量レベルでほぼ同様の活性が示され、２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では腫瘍体積における９０％の最大減少（ｐ＜０．０００１）が示され、一方５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３処置群では腫瘍体積が１００％減少した（ｐ＜０．０００１）。５０ｍｇ／ｋｇにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、全ての他の試験化合物よりも強力な抗腫瘍活性（再成長時間によって測定可能）を有した。最大反応の観点では、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（９．６％の差、ｐ＝０．９８５９）及び１０ｍｇ／ｋｇ用量のＭＭ−３９８（８．６％の差、ｐ＝０．９９３０）と統計的に区別不能であった。
図１２は、ＰＤＸ １５０１０−Ｐ５の再成長時間を示す図表である。図１３は、ＰＤＸ １５０１０−Ｐ５の最大反応を示す図表である。
実施例２：４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びアブラキサン
この研究では、５つの別々の膵臓ＰＤＸモデルについて、異なるレベルのｎａｂ−パクリタキセル及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３両方に対するこれらのＰＤＸモデルの反応を試験した。全てのモデルにおいて、化学療法による処置は腫瘍成長を阻害した。予想されたように、薬物処理群において腫瘍成長阻害は用量依存的であり、全てのモデルの中で最も大きな腫瘍成長阻害は、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の最も高い投薬量である５０ｍｇ／ｋｇで見いだされた。
薬物への最大腫瘍反応の観点からは、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では、３０ｍｇ／ｋｇ用量レベルのｎａｂ−パクリタキセルと比較して、全ての試験モデルにおける優越性が示された。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では、最大反応及び／または再成長時間により測定された抗腫瘍効果の優越性が示された。このことは、５０ｍｐｋの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と３０ｍｐｋのｎａｂ−パクリタキセルとを比べた場合、または２５ｍｐｋの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と１５ｍｐｋのｎａｂ−パクリタキセルとを比べた場合、ほとんどの試験モデルに当てはまった。
実施例２Ａ：＃１４３１２ ＰＤＸ腫瘍モデル：
喫煙を止めてから１５年超になる６４歳のコーカサス人男性から＃１４３１２ ＰＤＸ腫瘍材料を採取した。腫瘍は膵臓の頭部に位置していた（ＩＣＤ−Ｏ−３組織学コード８５０３３）。腫瘍は、病期分類ｐＴ３、ｐＮ１ａ、ＭＸの浸潤性腺管癌として特徴づけられた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）による組織学的病期分類は２Ｂであった。当該患者は、初回手術後におよそ２ヵ月間ゲムシタビンの投与を受けた後に進行した。ＰＤＸモデル＃１４３１２をＺｈａｎｇ（２０１３）によって評価し、高いレベルのＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡを有することが見いだされた。＃１４３１２モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。本研究における移植時には、このＰＤＸモデルは第４継代であった。
図１４は、ＰＤＸ−１４３１２−４Ｐの腫瘍成長曲線を示す図表である。
３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル（ｎ＝８）で処置した腫瘍は、処置開始時の平均腫瘍体積が１６５±１５ｍｍ３であった。３０ｎｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルで処置した腫瘍は着実にサイズが増加し、再成長時には中程度の増加となった（生理食塩水対照と比較して２１日；ｐ＝０．０００４、腫瘍が初期腫瘍体積の４倍の体積に達するのにかかる時間として定義される）。このモデルでは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの両方の用量において、腫瘍再成長阻害における類似した有効性がそれぞれ６１±３日及び６７±５日で示された。３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルに比べると、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の両方の用量において統計的に有意な腫瘍再成長阻害が達成された（２５ｍｇ／ｋｇはｐ＝０．０１２７、５０ｍｇ／ｋｇはｐ＝０．０００３）（図１５）。
処置に対する最大反応の観点からは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は両方の用量レベルにおいてｎａｂ−パクリタキセルに対し優れていることが判明し、２５ｍｇ／ｋｇの投薬量ではｎａｂ−パクリタキセルと比較して腫瘍体積の３３％の減少が示され、５０ｍｇ／ｋｇでは５０％の減少が示された（図１６）。ＰＤＸモデル１４３１２−４において、最大反応及び／または再成長時間により測定された４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍活性は、ｎａｂ−パクリタキセルよりも強力であった。図１５は、ＰＤＸ １４３１２−４９の再成長時間を示す図表である。図１６は、ＰＤＸ １４３１２−４の最大反応を示す図表である。
実施例２Ｂ：＃１２４２４ ＰＤＸ腫瘍モデル：
＃１２４２４ ＰＤＸ腫瘍モデルはＨｙｌａｎｄｅｒ（２００５）に記載のものであった。生涯にわたり喫煙していない６４歳のコーカサス人男性から腫瘍材料を採取した。がん組織学的サブタイプはＣ２５．７（ＩＣＤ−Ｏ−３組織学コード８５０３３）であった。腫瘍は、病期分類ｐＴ３、ｐＮ１、及びＭ０で特定されない低分化、浸潤性腺管癌として特徴づけられた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）による組織学的病期分類は２Ｂであった。フォローアップ治療は利用できない。異種移植片モデルはＡＰＯ２Ｌ／Ｔｒａｉｌに対してもゲムシタビン治療に対しても抵抗性であった。当該モデルはＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡのレベルが高く、ドビチニブ（４０ｍｇ／ｋｇ）に対し感受性であった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。＃１２４２４モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。このＰＤＸモデルは、＃１２４２４−８Ｐ研究において第８継代であった。
図１７は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの腫瘍成長曲線を示す図表である。
結果：１５ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル（ｎ＝８）で処置した腫瘍は、処置開始時の平均腫瘍体積が１７９±２４ｍｍ３であった。１５ｎｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルで処置した腫瘍は着実にサイズが増加し、生理食塩水対照と比較して腫瘍成長阻害の有意な証拠は見られなかった（図１８及び図１９）。一方、３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルを投与した腫瘍は、初期腫瘍体積が１８０±２０ｍｍ３であったが、再成長時間の増加（ｐ＝．０００３）、ならびに１５ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルと比較してほぼ４５％の腫瘍体積減少を示した。
２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇいずれかの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３で処置した動物は、処置開始時における平均腫瘍体積がそれぞれ１４３±１４ｍｍ３及び１９６±３２ｍｍ３であった。両方の投薬量群における腫瘍処置において、生理食塩水対照と比較して有意な腫瘍再成長阻害がもたらされた。腫瘍再成長における最も大きな遅延は４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の５０ｍｇ／ｋｇ群で観察され、腫瘍再成長の平均遅延は１０４日（ｐ＜．０００１）であり、一方２５ｍｇ／ｋｇ群の遅延はそのおよそ半分であった（図１８）。追加のチューキーＨＳＤ解析では、１５ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル／生理食塩水及び３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル／２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を除く全コホート間の平均再成長時間で統計的有意差が強調されている。
全体的に見て、生理食塩水対照と比較して処置に対する反応が１番目及び２番目に大きかったのは、高用量レベルのｎａｂ−パクリタキセル（３０ｍｇ／ｋｇ＝５３．４％の減少；ｐ＜．０００１）及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（５０ｍｇ／ｋｇ＝６９．５％の減少；ｐ＜．０００１）であった（図１９）。３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルと直接比べた場合、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の５０ｍｇ／ｋｇの処置では、薬物への最大反応の観点からは有意な優位性が示されなかった（図１９）。しかし、再成長阻害の観点からは、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は両方の用量レベルのｎａｂ−パクリタキセルよりも優れていた（１５ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルに対し９０日、ｐ＜０．０００１；３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルに対し５０日、ｐ＜０．０００１）（図１８）。ＰＤＸモデル＃１４２４２−８Ｐにおいて、最大反応及び／または再成長時間により測定された４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍活性は、ｎａｂ−パクリタキセルよりも強力であった（図１８）。
図１８は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの再成長時間を示す図表である。図１９は、ＰＤＸ １２４２４−８Ｐの最大反応を示す図表である。
実施例２Ｃ：１５０１０ ＰＤＸ腫瘍モデル：
膵臓ＰＤＸモデル＃１５０１０（本明細書ではＰＤＸ １５０１０−５Ｐと呼ぶ）の腫瘍組織を、生涯にわたり喫煙していない７４歳のコーカサス人女性から採取した。腫瘍は膵臓の頭部に位置していた（ＩＣＤ−Ｏ−３組織学コード８５０３３）。腫瘍は、病期分類ｐＴ３、ｐＮ１、及びＭ０で特定されない低分化、浸潤性腺管癌として特徴づけられた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）による組織学的病期分類は２Ｂであった（Ｈｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この患者は、さらなる療法を受けなかった。＃１５０１０モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。本研究における移植時には、このＰＤＸモデルは第５継代であった。
図２０は、Ｐａｎｃ １５０１０−Ｐ５の腫瘍成長曲線を示す図表である。
１５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルにおける初期腫瘍体積は、初回処置時にそれぞれ２１２±６ｍｍ３及び２２９±１１ｍｍ３であった。ｎａｂ−パクリタキセルの両方の用量レベル（１５ｍｇ／ｋｇ＝３９．５、ｐ＜０．０００１；３０ｍｇ／ｋｇ＝５１．８、ｐ＜０．０００１）及び２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３投薬量（６４．７、ｐ＜０．０００１）では、対照と比べた場合の類似した腫瘍成長阻害が示された（図２１）。しかし、腫瘍再成長阻害は５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３群で最も大きく、対照（１３１．６日、ｐ＜０．０００１）、２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（６６．９日、Ｐ＜０．０００１）、及び高用量レベルのｎａｂ−パクリタキセル（７９．８日、Ｐ＜０．０００１）よりも優れていることが判明した（図２１）。
薬物への腫瘍最大反応を比べた場合、両方の用量レベルの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（２５及び５０ｍｇ／ｋｇ）及び３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセルで、生理食塩水対照群と比べた場合の類似したレベルの反応（それぞれ９０．５％、１００％、及び８８．５％）が示された（図２２）。これは、３つの処置群全てが反応において統計的に有意な優位性を示している２５ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル群と対照的である（図２２）。ＰＤＸモデル１５０１０−Ｐ５において、最大反応により測定された５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍活性は、ｎａｂ−パクリタキセルよりも強力であった。５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の最大反応に注目すると、やはりｎａｂ−パクリタキセルよりも優れているが、１１．４％という軽微な優位性であり、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．２７５０）。
図２１は、Ｐａｎｃ １５０１０−Ｐ５の再成長時間を示す図表である。図２２は、Ｐａｎｃ １５０１０−Ｐ５の最大反応を示す図表である。
実施例２Ｄ：１４２４４ ＰＤＸ腫瘍モデル：
ファーター膨大部（肝膵管の別名でも知られる）で生じたＰＤＸモデル＃１４２４４は、膵臓癌を代表する組織像により、適切な膵臓モデルと考えられている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このモデルは、高いレベルのＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡを有することが示されており（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、またＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理に対し感受性であった（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。移植からの成長は３９日以内に生じ、肝臓転移は２１週時に見いだされた。＃１４２４４モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。このＰＤＸモデルは、＃１４２４４−９Ｐ研究において第９継代であった。
図２３は、ＰＤＣ １４２４４−９Ｐの腫瘍成長曲線を示す図表である。
両方のｎａｂ−パクリタキセル処置において（１５ｍｇ／ｋｇ、初期腫瘍体積＝２７１±５１；３０ｍｇ／ｋｇ、初期腫瘍体積＝２５０±５０）、生理食塩水対照と比較しての有意な腫瘍成長阻害が示されなかった（図２３）。これに対し、両方の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、２５ｍｇ／ｋｇ（１８．４日、ｐ＝０．００６２）及び５０ｍｇ／ｋｇ（４２．９日、ｐ＜０．０００１）では、生理食塩水と比較しての腫瘍成長阻害が示された。さらに、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の阻害は用量依存的に増加し、５０ｍｇ／ｋｇでは２５ｍｇ／ｋｇと比較して再成長時間における２４．５日の増加（ｐ＜０．０００１）がもたらされた。しかし、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の両方の用量レベルは、ｎａｂ−パクリタキセルの最も高い試験用量３０ｍｇ／ｋｇよりも優れていることが判明し、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は腫瘍再成長をさらに３７日阻害し（ｐ＜０．０００１）、３５ｍｇ／ｋｇは統計的有意性には到達しなかったがさらに１２日阻害した（ｐ＝０．１０１４）（図２４）。
処置への腫瘍応答に関しては、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のみが腫瘍成長に及ぼす有意な効果を示し、生理食塩水と比較して６８％（ｐ＜０．０００１）、３０ｍｇ．ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル群と比較して６６％（Ｐ＜０．０００１）腫瘍増殖が減少した（図２５）。他の全ての条件は、有意に腫瘍成長を妨害しないように思われた（図２４及び図２５）。ＰＤＸモデル１４２４４−９Ｐにおいて、最大反応及び／または再成長時間により測定された４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の抗腫瘍活性は、ｎａｂ−パクリタキセルよりも強力であった。
図２４は、ＰＤＸ １４２４４−９Ｐの再成長時間を示す図表である。図２５は、ＰＤＸ １４２４４−９Ｐの最大反応を示す図表である。
実施例３：ゲムシタビン／ｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン）及びゲムシタビン ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３
本研究では、単一の膵臓患者由来異種移植片モデルＰＤＸ１４２４４−１０Ｐと、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した３つの膀胱患者由来モデルとを使用して、ゲムシタビンと４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３との組合せが、各薬物単体と比較して有効性の増加をもたらすか、そして膵臓モデルでは現時点における最先端の膵臓用組合せ、ゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセルと比較して有効性の増加をもたらすかについて試験した。
腫瘍成長阻害及び薬物への最大腫瘍反応により測定された、ゲムシタビン及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の両方の単剤療法との比較において、ゲムシタビン及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せの方が優れていることが判明した。さらに、ゲムシタビン／ｎａｂ−パクリタキセル療法と比較して、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３では最大反応及び再成長時間の両方においても優越性が示された。
実施例３Ａ：＃１４２４４ ＰＤＸ腫瘍モデル：
ファーター膨大部（肝膵管の別名でも知られる）で生じたＰＤＸモデル＃１４２４４は、膵臓癌を代表する組織像により、適切な膵臓モデルと考えられている（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このモデルは、高いレベルのＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡを有することが示されており（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、またＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理に対し感受性であった（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。移植からの成長は３９日以内に生じ、肝臓転移は２１週時に見いだされた。＃１４２４４モデルの維持は、免疫不全マウスで腫瘍断片を継代することによって行った。このＰＤＸモデルは、＃１４２４４−１０Ｐ研究において第１０継代であった。
図２６は、ＰＤＸ １４２４４−１０Ｐの腫瘍成長曲線を示す図表である。
結果：処置開始時における処置群全体の平均腫瘍体積は、ほぼ同等であった（範囲＝４１９〜４３７ｍｍ３）。全ての化学療法処置モデルにおいて、様々なレベルの腫瘍成長阻害が観察された（図２６）。再成長時間の定量化（腫瘍が０日時における初期腫瘍体積の４倍に到達するのにかかる時間量として定義される）では、対照、１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン（２１．９日）、５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（２７．８日）、及び３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル＋１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン（３３．５日）の組合せの間で、類似した成長阻害が示された（図２７）。これらの処置コホートを互いに比較すると、腫瘍阻害において統計的に有意な優位性が見られないのは、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の単剤療法間（５．９日、ｐ＝０．４８３４）、または５０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル＋１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンの組合せ療法と５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３との間（５．７日、ｐ＝０．５８４９）である。しかし、５０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル＋１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンと１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンとの間における再成長時間の比較では、１１．５日という軽微な差（ｐ＝０．０３９２）が示された。
全体的な腫瘍成長阻害は、１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン＋５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３で最も大きいことが見いだされた（図２７）。実際に、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せは、組合せを構成する要素の両方の単剤療法よりも優れていた（ゲムシタビンに対して４９．９６日、ｐ＜０．０００１、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３に対して４４日、ｐ＜０．０００１）。３０ｍｇ／ｋｇのｎａｂ−パクリタキセル＋１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンの組合せ療法に比べた場合、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３＋ゲムシタビンの組合せは明らかに優れており、腫瘍再成長をさらに３８．３８日阻害した（ｐ＜０．０００１）。
図２７は、ＰＤＸ １４２４４−１０Ｐの再成長時間を示す図表である。図２８は、ＰＤＸ １４２４４−１０Ｐの最大反応を示す図表である。
有効性の第２の測定基準である療法への最大反応を用いると、ゲムシタビン及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の単剤療法は、それぞれ４２．１１（ｐ＜０．０００１）及び３６．６６％（ｐ＝０．０００２）であり、類似した腫瘍反応を示すことが観察された（図２８）。両方の単剤療法の反応はいずれもｎａｂ−パクリタキセル／ゲムシタビン併用には及ばず、この組合せは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３単剤療法よりも優れ（２６．８％、ｐ＝０．０１４１）、ゲムシタビン単剤療法よりも優れている（２１．４％、ｐ＝０．０７２９）ことが判明したが、ただしゲムシタビンとの比較では統計的有意性には至らなかった。
薬物への全体的な腫瘍反応において最も大きかったのは１００ｍｇ／ｋｇ＋５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せであり、対照と比較して９０．３３％（ｐ＜０．０００１）の腫瘍体積減少が見られた。加えて、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せは、両方の単剤療法よりも優れ（１００ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンとの比較＝５３．６８、Ｐ＜０．０００１、及び５０ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３との比較＝４８．２２、ｐ＜０．０００１）、さらにｎａｂ−パクリタキセル／ゲムシタビンの組合せに対し２６．８４％（ｐ＝０．０１８１）の薬物への腫瘍反応の向上も見られた（図２８）。
実施例３Ｂ：膀胱ＰＤＸ腫瘍モデル
腫瘍モデルＢＬ−０３８２、ＢＬ−０２９３、及びＢＬ−０４４０を有する免疫不全マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、以下の実験群にランダムに割り付けた：生理食塩水、ゲムシタビン、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は２５ｍｇ／ｋｇのＤＴＸ当量で週１回４週間にわたり静脈内に処置し、ゲムシタビンはＢＬ−０２９３モデルに対し７５ｍｇ／ｋｇ、ＢＬ−０３８２及びＢＬ−０４４０モデルに対し１５０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３については、単剤療法群に使用する用量を合わせ、同じ日に投与した。
動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。腫瘍サイズは、週に１回または２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９７２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝［（長さ）×（幅）２］／２
以下の式（式中、ＴＶは腫瘍体積である）に従って、最大反応を計算した。
最大腫瘍退縮＝［（ＴＶ最小−ＴＶ０日目）／ＴＶ０日目］×１００
最大腫瘍退縮を、完全腫瘍退縮（検知可能な腫瘍なしの１００％の退縮）、部分腫瘍退縮（３０％を超える最大腫瘍退縮）、または腫瘍退縮なしに分類した。
３つ全てのモデルにおいて、ゲムシタビン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せは、より著明な腫瘍退縮の誘導（図３５Ａ〜Ｃ）及び／または生存率の延長（図３５Ｄ）による判定において、単剤療法群よりも優れていることが判明した。
実施例４：カルボプラチン／ドセタキセル及びカルボプラチン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３
免疫不全マウスにヒト卵巣患者由来モデルＯＶｘ−１３２を移植した。動物を以下の実験群にランダムに割り付けた：生理食塩水、５ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、２５ｍｇ／ｋｇの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、６０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン、カルボプラチン／ドセタキセル、及びカルボプラチン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３。カルボプラチン／ドセタキセル及びカルボプラチン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せ群については、単剤療法群に使用した用量を合わせ、投与は３日間隔で、最初にカルボプラチンを、次にドセタキセルまたは４６ｓｃＦ
ｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を投与した。
動物に４回の尾静脈注射を７日間隔で投与した。腫瘍サイズは、週に１回または２回監視した。腫瘍進行は週に２回、触診ならびに最長軸（長さ）及び最短軸（幅）に沿った腫瘍のカリパー測定値によって監視した。腫瘍サイズは週に２回、以下の式（Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９７２ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．３：１−８８）を用いてカリパー測定値から決定した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝［（長さ）×（幅）２］／２
以下の式（式中、ＴＶは腫瘍体積である）に従って、最大反応を計算した。
最大腫瘍退縮＝［（ＴＶ最小−ＴＶ０日目）／ＴＶ０日目］×１００
最大腫瘍退縮を、完全腫瘍退縮（検知可能な腫瘍なしの１００％の退縮）、部分腫瘍退縮（３０％を超える最大腫瘍退縮）、または腫瘍退縮なしに分類した。
腫瘍再成長まで、または監視期間（＞１２０日）終了まで、動物を監視した。再成長時間は、腫瘍が体積を倍増する時間として定義された。腫瘍体積が倍増する前に屠殺した動物を検閲で削除する。
下に示す成長曲線は、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３をカルボプラチンと組み合わせたときの処置効果を示している（図３６Ａ）。カルボプラチン、ならびに４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びドセタキセルでは最小限の成長抑止が示され、単剤療法として投与された場合は縮小退縮が示されなかった。カルボプラチン及びドセタキセルの組合せでは、単剤療法と比較して成長抑止が増加したが、いかなる腫瘍退縮も誘導されなかった。しかし、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びカルボプラチンの組合せでは、処置動物の１００％において退縮が誘導されたことに加えて、腫瘍倍増時間が有意に増加した。この研究では、２匹のマウスが残存腫瘍負荷なしの完全奏功を達成した（図３６Ｂ）。
組合せ部分の研究では、処置中断後、動物を広範な期間にわたって監視した（１６０日）。図３６Ｃは、全ての処置群の時間対腫瘍再成長（ＴＴＲ）を示している。ドセタキセル、カルボプラチン、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３単剤療法及びカルボプラチン／ドセタキセルの組合せでは、時間対再成長に軽微な遅延が誘発された。これは、ＴＴＲ中央値で顕著な遅延を誘発したカルボプラチン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３組合せ群で見られた顕著なＴＴＲ遅延とは対照的であった。注目すべきことに、カルボプラチン／４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３で処置した動物の５０％で、処置中断後３ヵ月にわたり腫瘍の再成長がないという持続的な反応が示された。
実施例５：ゲムシタビンまたはカルボプラチンとの４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３耐容性試験
この短期間の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンまたはカルボプラチンの耐容性試験は、毒性を最小化する目的で耐容量及び最適な用量スケジューリングを決定するためである。ゲムシタビン及びカルボプラチンは、診療所で４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３と組み合わされる可能性のある化学療法剤である。ゲムシタビン単体ではマウスにおける耐容性が良好であり、ほとんどのプロトコルがＭＴＤを３日ごと（ｑ３ｄ）２４０ｍｐｋ前後の腹腔内投薬として収載している。２９１．６ｍｇ／ｋｇという高用量での静脈内投与を１０日間行った後、（体重損失または対照マウスと異なる触媒酵素プロファイリングとして観察したところでは）毒性は見いだされなかった。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のストック濃度は１１．０９ｍｇ／ｍｌとした。カルボプラチンはＨｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃから購入し、１０ｍｇ／ｍｌのストック濃度で使用した。ゲムシタビンはＳｕｎ Ｐｈａｒａｍから購入し、３８ｍｇ／ｍｌのストック濃度で使用した。
ＣＤ−１雌マウス（７〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。処置フェーズの間、マウスの体重を毎日監視した。薬物スケジューリングが耐容性に及ぼす影響を評価するため、動物を単回用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３で処置し、次に、ある用量のカルボプラチンまたはゲムシタビンいずれかでの処置を、様々な用量レベルにおいて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３処置後の異なる時点から開始した（表３）。加えて、カルボプラチンまたはゲムシタビンで処置した単剤処置群を追加した。
研究終了時（最後の薬物投与から１０日後、すなわち、８時間の組合せは１０日目、２４時間の組合せは１１日目、７２時間の組合せは１３日目）、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。心臓穿刺によって血液を採取した。触媒解析では、追加的な個々のＡＬＴアッセイを加えたＥＱＵＩＮＥ−１５ ｃｌｉｐ（Ｉｄｅｘｘ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＡ）を使用した。採取した組織には、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、骨格筋（皮膚の付着あり）が含まれた。組織を１０％の中性緩衝ホルマリン中で約２４時間固定し、次に７０％のエタノール中で保管した。最も高用量の群のマウス（全時点）ならびに非処置対照及び単剤対照からの組織を、組織切片の処理及びＨ＆Ｅ染色のためＭａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）に発送した。受け取ったスライドを、ａｐｅｒｉｏ明視野スキャナーで２０倍にてスキャンした。
実施例５Ａ：カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３
図２９：６３ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン、図３０：７２ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン、図３１：８４ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンにおいて、各測定に対する個々の点が、ＳＥＭの平均及び誤差のバーにおける線と共に示されている。データは、０日目が４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を投与した日として示されているが、添付された追加のプリズムファイルでは、０日目がカルボプラチンの最初の投与日として設定されている。
実施例５Ｂ：ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３
図３２：１６２ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、図３３：２１４ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、図３４：２９２ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンにおいて、各測定に対する個々の点が、ＳＥＭの平均及び誤差のバーにおける線と共に示されている。データは、０日目が４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を投与した日として示されているが、添付された追加のプリズムファイルでは、０日目がゲムシタビンの最初の投与日として設定されている。
対照マウス及び、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３について、触媒プロファイリングを実施した。
処置に関連した影響には、以下のものが含まれる。カルボプラチン（併用及び単剤）処置群及びゲムシタビン（併用）処置群における個々の幹細胞ネクローシスの出現率増加（最小限〜軽度）。これは最小限であり、おそらくは可逆的である。また、カルボプラチン処置群の肝臓では、有糸分裂率の増加も見られた。これは、おそらくは再生的（修復的）であり可逆的である。処置に関連するカルボプラチン（単剤及び併用）及びゲムシタビン（併用）の脾臓における髄外造血（ＥＭＨ）の増加。これは、おそらくは骨髄に及ぶ影響に対する反応であり、本来再生的である。ただし、これは、骨髄またはＣＢＣデータなしでは確認することができない。処置に関連しないと思われる顕著な病理学：Ｃ１０／Ｍ３ ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のみ及びＣ２３／Ｍ２ ゲムシタビン単剤における肉芽腫性肝炎及び脾臓内の組織球性浸潤物、この肉芽腫性／組織球性炎症は不明であるが、処置に関連しないと思われる。ネクローシスの病巣は肝臓（全処置群で見られる単一または個々の細胞ネクローシスを上回る）であり、Ｃ７／Ｍ３ ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３／カルボプラチン対照で見られる。この病変は、処置に関連しないと思われる。
本研究から得られた主要な知見は以下の通りであった。
● 本研究では２０％を超えて体重を損失したマウスはいなかった（急性毒性研究、０日目における４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の単回投与、単回フォローアップ用量、最終薬物から１０日後に終了）。
● ８時間、２４時間時に投与したカルボプラチン８４ｍｇ／ｋｇ群では、６日目に個々のマウスにおいて最大１０％の体重損失が示されたが、これらのマウスは１０〜１１日目までに体重を回復した。
● ほとんどのマウスの触媒プロファイルは、処置されていない週齢がマッチした非処置対照に類似しているように思われ、カルボプラチン単体に対し、カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３についての異常な酵素活性の明らかな傾向は見られない。
● ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の７２時間後のゲムシタビン２９２ｍｇ／ｋｇ群では、２９２ｍｇ／ｋｇ群の中で最も少ない成長と、研究終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの上昇とが示されている。
● 最も高度に処置された群及び対照に関する病理学者のレビューからは、処置に関連する最小限の影響と、処置に関連しないと思われるいくつかの顕著な病理学とが見いだされた。
実施例６：ドセタキセルプロドラッグの合成
式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグは、図２Ａに示す反応スキームを含めた様々な反応法によって調製することができる。２つの化合物の代表的な合成例を以下に示す。これらまたは他のドセタキセルプロドラッグ、及びその医薬的に許容される塩は、様々な好適な合成方法によって調製することができる。図２Ｂの表は、ある特定のドセタキセルプロドラッグの例についての代表的リストを示している。
実施例６Ａ：２’−Ｏ−（４−ジエチルアミノブタノイル）ＤＴＸ塩酸塩（化合物３）の合成
ドセタキセル（ＤＴＸ）（０．２５ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、４−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．１２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（０．１２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．０８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を全て秤量しＡｒ下で１５ｍＬバイアルに入れた。これに無水ＤＣＭ ６ｍＬを室温、Ａｒ下で添加し、室温で１８時間攪拌した。１８時間攪拌後のＨＰＬＣは４３％の生成物を示し、５７％のＤＴＸは未反応のままであった。追加量の４−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．１５ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌をさらに２４時間継続した。ＨＰＬＣは９１％の生成物を示し、８％のＤＴＸは未反応のままであった。反応を停止させ、１２ｇのカートリッジに直接装填し、３〜１２％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いてＦＣＣを実施した。画分３０〜４９を一緒にプールし、２−プロパノール中０．０５ＮのＨＣｌ ０．５ｍＬを添加し、３０℃で蒸発させて０．１９ｇの白色の固体（６３％の収率）を得た。
ＨＮＭＲ：δ ＝ ８．１１ （ｄ， ２Ｈ）， ７．６５−７．５７ （ｍ， １Ｈ）， ７．５６−７．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５−７．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ６．２９−６．１２ （ｍ， １Ｈ）， ５．９９ （ｄ， １Ｈ）， ５．６８ （ｄ， １Ｈ）， ５．５８−５．４０ （ｍ， １Ｈ）， ５．３１ （ｄ， １Ｈ）， ５．２４ （ｓ， １Ｈ）， ４．９６ （ｄ， １Ｈ）， ４．３８−４．０８ （ｍ， ５Ｈ）， ３．９１ （ｄ， １Ｈ）， ３．２０−２．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．７０−２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５０−２．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２５−２．０５ （ｍ， ３Ｈ）， １．９４ （ｓ， ３Ｈ）， １．９２−１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．７５ （ｓ， ３Ｈ）， １．５０−１．３５ （ｍ， ９Ｈ）， １．３２ （ｓ， ９Ｈ）， １．３０−１．２０ （ｍ， ６Ｈ）， １．１２ （ｓ， ３Ｈ） ｐｐｍ． ｐｐｍ．ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ９４９．４ ［Ｍ］＋
実施例６Ｂ：２’−Ｏ−［４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブタノイル］ＤＴＸ塩酸塩（化合物４）の合成
ドセタキセル（ＤＴＸ）（０．２８ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ酪酸塩酸塩（０．０７ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（０．１３ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を全て秤量しアルゴン下で１５ｍＬバイアルに入れた。これに無水ＤＣＭ ７ｍＬを添加し、この混合物を室温で１８時間攪拌した。１８時間後のＨＰＬＣは９４％の生成物を示し、３％の副生成物及び３％のＤＴＸが残存していた。反応残渣を１２ｇのカートリッジに直接装填し、５〜５０％の２−プロパノール／ＣＨＣｌ３を用いてＦＣＣを実施した。画分２１〜４１を一緒にプールし、２−プロパノール中０．０５ＮのＨＣｌ ０．５ｍＬを添加し、４０℃で蒸発させて重量０．１６ｇの白色の固体（４８％の収率）を得た。ＤＴＸから生成物への良好な転換にもかかわらず収率が比較的低いのは、おそらくは生成物の２−プロパノールに対する可溶性が不十分であることに起因するものであった。
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３＋ （ＣＤ３）２ＳＯ）： δ ＝ ８．０２ （ｄ， ２Ｈ）， ７．６０−７．４２ （ｍ， ６Ｈ）， ７．３８−７．２５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．２４−７．１２ （ｍ， １Ｈ）， ６．９２ （ｄ， １Ｈ）， ６．４０−５．８８ （ｍ， １Ｈ）， ５．５３ （ｄ， １Ｈ）， ５．３５−５．２１ （ｍ， １Ｈ）， ５．２０−５．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．８５ （ｄ， １Ｈ）， ４．７４ （ｄ， １Ｈ）， ４．２６ （ｓ， １Ｈ）， ４．１３ （ｄｄ， ３Ｈ）， ３．７４ （ｄ， １Ｈ）， ３．５６ （ｓ， １Ｈ）， ３．１６−２．７４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．６４−２．４８ （ｍ， ７Ｈ）， ２．４９−２．００ （ｍ， ５Ｈ）， １．８４−１．６８ （ｍ， ４Ｈ）， １．６２ （ｍ， ３Ｈ）， １．３０ （ｓ， ９Ｈ）， １．０７ （ｓ， ３Ｈ）， １．０２ （ｓ， ３Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ９２１．４ ［Ｍ］＋
実施例７：緩衝液における加水分解の手順
必要に応じて所望の濃度を提供するための、あるボリュームのＤＭＳＯ中薬物の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（典型的には、８０μｇ／ｍＬ溶液をもたらすには１６μＬ）（表１参照）をガラスの試験管または４ｍＬバイアルに入れる。追加のＤＭＳＯ（例えば、薬物溶液１６μＬを使用する場合は６４μＬ）を添加して、４％の最終総ＤＭＳＯ濃度を得ることもできる。ＤＭＳＯ溶液を短時間のボルテックスにより混合し、次にｐＨ７．５用に２ｍＬ（２０ｍＭ）のＨＥＰＥＳ緩衝液、そしてｐＨ２．５用に２ｍＬ（２０ｍＭ）のリン酸緩衝液を添加し、混合物を再びボルテックスする。初期ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって調整することができる。２０ｍＭの緩衝液の使用は、より良好なｐＨ制御をもたらし、インキュベート中のｐＨドリフトを回避することが見いだされた。
次に、薬物の緩衝溶液の１００μＬアリコートをＨＰＬＣバイアルに移し、３７℃の水浴でインキュベートする。残りの溶液も、ｐＨ監視のために４ｍＬバイアル中３７℃でインキュベートする。
各時点において、アセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９００μＬをＨＰＬＣバイアルに添加し、内容物をボルテックスする。次に、ＨＰＬＣ解析のためにバイアルを４℃のオートサンプラーラックに入れる。
ゼロ時間のデータポイントは、典型的には０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮ（８μｇ／ｍＬ）５ｍＬ中ＤＭＳＯストック４μＬの溶液から得る。
ＳＹＮＥＲＧＩ ４ミクロンＰｏｌａｒ ＲＰ−８０Ａ、２５０×４．６ｍｍカラムで、１ｍＬ／分の流量、５０μＬの注入体積、２５℃のカラム温度、及び２２７ｎｍにおけるＵＶ検出を用いてＨＰＬＣ解析を実施する。ほとんどの化合物は、０．１％の水性ＴＦＡ中３０から６６％のアセトニトリルの勾配を１３分（方法Ａ）、次に３０％に戻しながらの勾配を１分、そして３０％での保持を６分間行うことによって解析する。この方法をとるには保持時間が長すぎる場合、３０から９０％のアセトニトリルの勾配を２０分（方法Ｂ）、次に３０％への戻しを１分、そして３０％での９分間保持を用いる。
加水分解の程度を、相対ピーク面積に基づいた％ＰＴＸまたはＤＴＸ形成として下の表４に報告する。
実施例８：緩衝血漿における加水分解の手順
ヒト血漿（ＨＰ１０５５（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）；クエン酸Ｎａで保存した貯留ヒト血漿）を遠心処理して沈殿物を除去する。１．５ｍＬ遠心処理チューブに、血漿０．９ｍＬ及びｐＨ７．５、０．９ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液４０〜５０μＬを添加する（４０〜５０ｍＭの最終濃度及び７．５のｐＨ）。これを反転によって混合し、次にチューブを３７℃に温める。次に、薬物の１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ溶液７．２μＬを添加し（８０μｇ／ｍＬの最終濃度）、内容物を反転によって混合する。次に、血漿中の溶液を１．５ｍＬ遠心処理チューブに分取し、３７℃浴に置く。各時点において、アセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９００μＬをチューブに添加する。内容物をボルテックス混合し、次に１３，０００ｒｐｍで５分間遠心処理する。緩衝液における加水分解の手順に記載のようにして、上清をＨＰＬＣによって解析する。ゼロ時間のデータポイントは、０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮ（８μｇ／ｍＬ）５ｍＬ中ＤＭＳＯストック４μＬの溶液から得る。結果の比較は、典型的には、緩衝液における加水分解の手順を使用して４％のＤＭＳＯを用いた５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中８０μｇ／ｍＬについて得られたものに対して行う。
実施例９：ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームの調製
実施例９Ａ スクロースオクタサルフェートジエチルアミン塩（ＤＥＡ−ＳＯＳ）の調製
ステップ１ パッキング及びコンディショニング：Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８−２００カラム。３５０ｇのＤｏｗｅｘ ５０ＷＸ８−２００アニオン交換樹脂を大型カラム（５０ｍｍ×３００ｍｍ）に装填し、樹脂を１Ｍの水酸化ナトリウム１２００ｍｌ、脱イオン水１６００ｍｌ、３Ｍの塩酸１２００ｍｌ、脱イオン水１６００ｍｌで連続的に洗浄する。
ステップ２ スクロースオクタサルフェート（ＳＯＳ）溶液：３０．０ｇのスクロースオクタサルフェートナトリウムを、セ氏５０度で激しくボルテックスしながら５０ｍｌの遠心管中の脱イオン水１５ｍｌに溶解する。０．２μｍの膜を通じて溶液をシリンジ濾過する。
ステップ３ ステップ１で用意したＤｏｗｅｘカラムにＳＯＳ溶液を装填する。脱イオン水でカラムを溶離させる。伝導率が５０〜１００ｍＳ／ｃｍの画分をプールＡとして収集し、１００ｍＳ／ｃｍより大きい画分をプールＢとして収集する。直ちに、ジエチルアミンを用いてプールＢ内のＳＯＳを６．７〜７．１の最終ｐＨまで滴定する。プールＢのｐＨがｐＨ７．１を過ぎた場合、プールＡからの酸性ＳＯＳを用いてｐＨを低下させる。ＳＯＳ濃度は、サルフェートアッセイにより決定し、滴定データにより検証する。
実施例９Ｂ ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅの調製
ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅは、リポソームに曝露した加水分解条件に対する不安定性が少ないように設計されたエーテル脂質及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の新規の結合体である。カルバメートリンカー及びエーテル脂質を使用することにより、ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅは穏やかな酸性条件下で安定性が高く、加水分解により生じるＰＥＧ損失を防止する。
材料：１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール：ＣＡＳ：８２１８８−６１−２（ＢＡＣＨＥＭ）；メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２：カタログ番号１２ ２０００−２（ＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）；Ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート：ＣＡＳ：７６９３−４６−１（Ａｌｄｒｉｃｈ）
合成手順：ＰＥＧ−ＤＳＧ−Ｅを図１Ｂに示す経路に従って合成する。詳細な手順を以下のように記載する。
ステップ１：１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５８２ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロール（１．６４２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４０２．５μｌ、２．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン３５ｍｌ溶液に添加する。反応混合物を室温で終夜攪拌する。粗製混合物（ＲＨ１：７９）をＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル、３／１）によって解析する。ＴＬＣからは、出発材料１，２−ジオクタデシル−ｓｎ−グリセロールの大部分が活性化エステルＲＨ１：７９に転換されることが示される。
ステップ２：ＰＥＧの結合。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２（５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１０ｍｌ溶液を、室温でＲＨ１：７９の反応混合物中に注ぐ。Ａｒで混合物をパージし、混合物を室温で終夜攪拌する。反応混合物を約１０ｍｌに濃縮する。激しく攪拌しながら無水ジエチルエーテル８０ｍｌを添加することにより、粗生成物を沈殿させる。混合物をセ氏−２０度で１時間置き、次に濾過し、濾過ケークを収集する。濾過ケークをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、無水ジエチルエーテル８０ｍｌからセ氏−２０度で再び生成物を沈殿させる。濾過ケークをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、溶液を８０ｇのシリカゲルカラムに装填する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。移動相Ａ：クロロホルム、Ｂ：メタノール。溶離セグメント：ステップ１：０％のＢ〜１０％のＢ、６ＣＶ；ステップ２：１０％〜１５％のＢ、２ＣＶ。ＵＶ及びＥＬＳＤによって検出された全てのピークを収集する。画分１８〜２２をＲＨ１：８１Ａとしてプールし、画分２４〜４０をＲＨ１：８１Ｂとしてプールする。収量、ＲＨ１：８１Ａ、２．５ｇ、ＲＨ１：８１Ｂ、１．８ｇ。
反応混合物のＴＬＣ分析を展開溶媒：クロロホルム／メタノール、９／１、ｖ／ｖを用いて実施した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＲＨ１：８１Ａが所望の結合体であることを示している。
実施例９Ｃ リポソームの調製
リポソームをエタノール注入−押出法によって調製する。スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームの脂質は、３：２のモル比のスフィンゴミエリン、コレステロールと、スフィンゴミエリンの６〜８ｍｏｌ％の量のＰＥＧ−ＤＳＧから構成されている。簡潔に述べると、リポソーム３０ｍｌを調製するために、脂質を、５０ｍｌ丸底フラスコ中のエタノール３ｍｌにセ氏７０度で溶解する。ＤＥＡ−ＳＯＳ（２７ｍｌ、０．６５〜１．１Ｎ）をセ氏７０度の水浴でセ氏６５度超に温め、激しい攪拌下で脂質溶液と混合して、５０〜１００ｍＭのリン脂質を有する懸濁液を得る。次に、得られた乳白色の混合物を、例えばｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ Ｌｉｐｅｘエクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、０．２μｍ及び０．１μｍのポリカーボネート膜を通じて６５〜７０℃で繰り返し押出する。リン脂質濃度をホスフェートアッセイによって測定する。粒子直径を動的光散乱法によって解析する。この方法によって調製したリポソームのサイズは約９５〜１１５ｎｍである。
実施例９Ｄ 水溶性薬物の装填方法
ステップ１：脱イオン水で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４ＢカラムにＤＥＡ−ＳＯＳリポソームを装填する（カラムボリュームの５％未満）。リポソームの完全な吸収を待ち、次に脱イオン水でカラムを溶離させ、フロースルーの伝導率を監視する。
ステップ２：フロースルーの混濁度に従ってリポソーム画分を収集する。リポソームの多くは伝導率０で出てくる。伝導率が４０μＳ／ｃｍより高いテーリング画分を廃棄する。
ステップ３：リポソーム体積を測定し、リポソームに５０ｗｔ％のデキストロースを添加することによって直ちにオスモル濃度を平衡させて、リポソーム内のＤＥＡ−ＳＯＳ濃度に応じて最終濃度７．５〜１７ｗｔ％のデキストロースを得る。緩衝液は、緩衝ｐＨ範囲及び能力から選択する。薬物装填ｐＨは６を超えるべきではない。
ステップ４：濃縮バッファー、ＨＣｌ、及びＮａＯＨを用いてリポソームのｐＨを調整する。最終緩衝液強度は５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。
ステップ５：ホスフェートアッセイによって脂質濃度を解析し、所与の入力薬物／脂質比に必要な脂質の量を計算する。
ステップ６：リポソーム溶液で使用したものと同じ緩衝液を用いて、７．５〜１７ｗｔ％のデキストロース中薬物溶液を調製する。異なるプロドラッグ間の比較を可能にするため、添加する薬物の量は、変換係数を用いてプロドラッグ塩形態の測定量から補正し、ドセタキセル重量当量に基づいた（表Ｄ）。
ステップ７：薬物及びリポソーム溶液を混合して所望の薬物／リン脂質比（例えば、リン脂質１モル当たり１５０、２００、３００、４５０、または６００ｇドセタキセル当量）を達成し、次にセ氏７０度（または所望の温度で）１５〜３０分間、絶えず振とうしながらインキュベートする。
ステップ８：装填混合物を氷水浴で１５分間冷やす。
ステップ９：リポソームの一部を、ＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＢＳ）ｐＨ５．５、またはクエン酸緩衝生理食塩水ｐＨ５．５、またはＨＢＳ ｐＨ６．５で平衡化したＰＤ−１０カラムに装填し、同じ緩衝液で溶離し、リポソームを収集する。精製されたリポソームも精製されていないリポソームも次のステップの解析用に確保する。
ステップ１０：カラムサンプルの前後両方で、ホスフェートアッセイによってリン酸脂質濃度を測定する。
ステップ１１：カラムサンプルの前後両方で、ＨＰＬＣによって薬物濃度を解析する。
ステップ１２：カプセル化効率を［薬物／リン脂質（カラム後）］／［薬物／リン脂質（カラム前）］＊１００として計算し、薬物／ｍｏｌリン脂質のグラムとして説明する。
リポソームに装填した薬物の量を、リポソームにおけるリン脂質１ｍｏｌ当たりのドセタキセル当量として表現する。所与量のアミノドセタキセル塩酸塩のドセタキセル当量数を計算するため、下の表５の変換係数を塩の測定量に掛ける。例えば、１ｇの化合物１は、１ｇ×０．７８６＝０．７８６ｇのドセタキセルに相当する。同様に、２ｇの化合物２は、２ｇ×０．８１９＝１．６３８ｇのドセタキセルに相当する。
所与量のアミノドセタキセル塩酸塩のドセタキセル当量数を計算するため、表５の変換係数を塩の測定量に掛ける。例えば、１ｇのＴＳＫ−Ｉ−６６は、１ｇ×０．７８６＝０．７８６ｇのドセタキセルに相当する。同様に、２ｇのＴＳＫ−Ｉ−４７は、２ｇ×０．８１９＝１．６３８ｇのドセタキセルに相当する。
実施例９Ｅ 短鎖ポリエチレングリコールの使用により、水への可溶性が乏しい（１ｍｇ／ｍｌ未満）薬物を装填する方法
この方法では、非常に水溶性の低い（１ｍｇ／ｍｌ未満）薬物を溶解し装填する一例として、ヘキサ（エチレングリコール）（ＰＥＧ６）を使用する。分子量２００〜５００ダルトンの他の短鎖ＰＥＧも、同じ目的で機能し得ると考えられる。薬物を、脱イオン水中８０％のＰＥＧ６（体積による）に４０ｍｇ／ｍｌで溶解する。リポソームをセ氏７０度に予め温め、薬物装填の前に溶液を絶えず攪拌する。次に、薬物のＰＥＧ６溶液を少量ずつ１分間隔で８回、８分かけてリポソームに添加する。装填混合物をセ氏７０度でさらに２２分間インキュベートし、氷浴で１５分間冷却する。ＰＤ−１０カラムでｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝生理食塩水またはｐＨ５．５のクエン酸緩衝生理食塩水を溶離溶液として使用することにより、リポソームから遊離薬物を分離する。ホスフェートアッセイ及びＨＰＬＣ解析によってカラムの前後の薬物／脂質比を決定する。カプセル化効率を［薬物／リン脂質（カラム後）］／［薬物／リン脂質（カラム前）］＊１００として計算する。
実施例９Ｆ ＰＥＧ４００の使用によって薬物を装填する方法
この例では、タキサンプロドラッグ用の可溶化剤として、より高価なＰＥＧ６の代わりとするためにＰＥＧ４００を使用する。この方法は、化合物２リポソームを調製するプロトコルによって例示する。
パート１：薬物溶液の調製
１．２５０ｍｌのガラス瓶において３９５ｍｇの化合物４を秤量する。
２．８０％のＰＥＧ４００ ｐＨ２．８溶液１０ｍｌを添加し、次に３ＭのＨＣｌ溶液１３４μｌを添加する。
３．上記混合物を５０℃の水浴で約１０分間、断続的に振とうしながら温める。透明な化合物２の溶液が得られる。
４．５ｍＭのＭＥＳ ５％デキストロースｐＨ３．８溶液９０ｍｌを添加することによって、溶液を１０倍に希釈する。最終溶液のｐＨは４．５である。
５．希釈溶液を６５℃に温め、１μｍのＰＥＳ膜を通じて溶液を濾過する。
パート２：ＳＯＳリポソームの調製
１．リポソーム配合：ＳＭ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＳＧ＝３／２／０．２４ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ、１．１ＭのＤＥＡ−ＳＯＳ、サイズ：９９．７ｎｍ。
２．外部ＳＯＳを、ＣＬ−４Ｂで残留伝導率４０μＳ／ｃｍ以下で除去する。
３．４５ｗｔ％のデキストロースをリポソームに添加して、最終の１２％のデキストロースを得る。
４．１ＭのｐＨ５．４クエン酸溶液をリポソームに添加して、最終的に２０ｍＭにする。
５．ホスフェートアッセイによってホスフェート濃度を決定する。
パート３：化合物２の装填
１．化合物４溶液及びパート２で調製したリポソームを、６００ｇ／ｍｏｌの薬物／脂質比において室温で混合する。
２．混合物を、７０℃のテフロン（登録商標）の薄肉管で作られた熱交換器に送り、混合物が２分以内に６５℃超に加温されていることを確認する。
３．装填混合物を７０℃で３０分間攪拌しながらインキュベートする。
４．装填したリポソームを氷水に浸した熱交換器に送ることにより、急速冷却する。
パート４：精製及び濃縮
１．タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって遊離化合物２を除去し、緩衝液をクエン酸緩衝生理食塩水ｐＨ５．５に交換する。
２．リポソームをＴＦＦにより濃縮し、次に順次１μｍ、０．４５μｍ、及び０．２μｍのＰＥＳ膜を通じてリポソームを濾過する。
実施例９Ｇ 抗体−脂質結合体の調製
抗体−ＰＥＧ−脂質結合体を使用して、抗体に連結したリポソームを調製する。このリポソームは、好都合な系（例えば、哺乳類細胞）で発現したｓｃＦｖタンパク質から開始して調製することができ、精製は、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたは他の任意の好適な方法によって行うことができる。結合をもたらすために、システイン残基を含有するＣ末端配列を用いてｓｃＦｖタンパク質を設計する。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−脂質結合体、例えばｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの調製については、文献で説明されている（Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００５，ｖｏｌ．２１，ｐ．２０５−２２０；Ｎｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００５，ｖｏｌ．２１，ｐ．２２１−２３２；ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２１０，７０７）。例えば、以下のプロトコルを使用することができる。
ステップ１：タンパク質ストック溶液を、ｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１４４ｍＭの塩化ナトリウム）に対し４℃で２時間透析する。
ステップ２：抗体の還元処理をｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液中で２０ｍＭの２−メルカプトエタンアミンの存在下、３７℃で１時間行う。
ステップ３：還元処理した抗体をＧ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製する。
ステップ４：還元処理した抗体のインキュベートを、４モルの過剰なマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥと共に、ｐＨ６．０のＣＥＳ緩衝液中、室温で２時間行う。システインの添加によって反応をクエンチし、０．５ｍＭの最終濃度にする。
ステップ５：結合混合物をＡｍｉｃｏｎ攪拌式細胞濃縮器で濃縮する。
ステップ６：Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４カラムで遊離抗体から結合体を分離する。
ステップ７：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって結合体を解析する。
実施例９Ｈ 標的リポソームの調製
抗体標的リポソームは、抗体−ＰＥＧ−脂質結合体（実施例１Ｇ）をリポソームと共に水性バッファー中、抗体の熱安定性に応じて３７℃で１２時間または６０℃で３０分間インキュベートすることにより、調製することができる。ミセル結合体の脂質部分は、自らを自発的にリポソーム二重膜に挿入する。例えば、参照により援用される米国特許第６，２１０，７０７号を参照。リガンドが挿入されたリポソームを、例えばサイズ排除クロマトグラフィーによってＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、ホスフェートアッセイによって脂質濃度を解析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体の定量化を行う。
実施例９Ｉ トリチウム標識リポソームの調製
非交換型トリチウムで標識した脂質、３Ｈ−コレステリルヘキサデシルエーテル（３Ｈ−ＣＨＤＥ）を脂質二重膜内に有する薬物装填リポソーム（トリチウム標識リポソーム）により、薬物及び脂質の両方の薬物動態を同時に監視することが可能になる。様々な捕捉試薬を有する種々の配合のトリチウム標識リポソームを押出法によって調製する。トリチウムで標識された「空の」リポソーム（すなわち、薬物を含有しないリポソーム）を調製するための一般的プロトコルは、例えば以下の通りであり得る。
１．１２ｍＬのガラスバイアルをクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）で洗浄し、次にアセトンで洗浄し、ヒートガンでバイアルを乾燥する。
２．トルエン中の市販品３Ｈ−ＣＨＤＥ溶液１ｍＬをガラスバイアルに移す。溶液をアルゴン流を用いて室温で３０分間乾燥し、バイアルをオイルポンプ真空下で終夜放置する。
３．配合に従って脂質を秤量し、３Ｈ−ＣＨＤＥを含有するバイアルに脂質を添加する。
４．２００プルーフエタノール１ｍＬを脂質バイアルに添加し、７０℃に加熱して脂質を溶解し、最終的に透明な溶液を得る。
５．この温かい脂質溶液を、予め温めた捕捉試薬溶液１０ｍＬに添加する。混合物を７０℃で１５分間攪拌し続けて、多重層の小胞（ＭＬＶ）を生成する。
６．適切な孔径（例えば、０．２μｍ、０．１μｍ、及び０．０８μｍ）を有するポリカーボネートトラックエッチド膜フィルターを通じて７０℃でＭＬＶを繰り返し通過させ、最終的に所望のリポソームサイズ（例えば、約１１０ｎｍ）を達成する。押出を行ったリポソームを４℃に保つ。
薬物の特性に応じて実施例８Ｄ〜Ｆに記載の方法に従って、ドセタキセルプロドラッグをトリチウム標識リポソームに装填する。実施例８Ｈに記載の方法により、標的化抗体を薬物装填リポソームに挿入する。
実施例１０：膵臓患者由来モデルにおける、単剤療法としての、及びゲムシタビンとの組合せでの、ＥｐｈＡ２標的ドセタキセルナノリポソームの活性
膵臓癌は依然として、生存期間が月数や週数で説明される致命的ながんの１つである。近年の膵臓癌治療の進歩により、最近、リポソームイリノテカン（ＯＮＩＶＹＤＥ（商標）（イリノテカンリポソーム注射剤）、旧称ＭＭ−３９８）が承認されるに至った。膵臓癌におけるタキサンの活性及びナノリポソームの薬物送達能力を考慮して、発明者らは新規のＥｐｈＡ２標的ナノリポソームドセタキセル（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３）を開発し、膵臓癌の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の活性を、単剤療法として、そしてゲムシタビンとの組合せにおいて評価した。加えて、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の作用機構に関連する主要なバイオマーカーの潜在的予測能力を試験することを目標にした。Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発されたいくつかのＰＤＸモデルに対し、ＥｐｈＡ２（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３標的）、ＣＤ３１（血管）、マッソントリクローム（線維症）、ＣＡ ＸＩ（低酸素症）、及びＥ−カドヘリン（標的の結びつきを潜在的に阻害し得る接着分子）の発現をスクリーニングした。８つのＥｐｈＡ２＋ ＰＤＸモデルを使用して、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の活性を評価し、これをｎａｂ−パクリタキセル、リポソームイリノテカン、オキサリプラチン、及びゲムシタビンを含めた臨床上意義の高い薬剤と比較した。また、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンの組合せの治療潜在能力も試験した。
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３による腫瘍成長制御は全ての試験モデルにおいて統計的に有意であり、８５％を超える試験モデルで腫瘍退縮が観察された。腫瘍モデルにおいて標準的治療剤と比べた場合、等毒性投与では、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、ｎａｂ−パクリタキセルに対しモデルの８０％（４／５）、ゲムシタビンに対し１００％（５／５）、オキサリプラチンに対し１００％（５／５）、そしてリポソームイリノテカンに対し８０％（４／５）大きい活性を示した。ゲムシタビンは、現時点ではｎａｂ−パクリタキセルとの組合せで膵臓癌における標準的治療とみなされている。そのため、ゲムシタビン及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せの潜在的利点を評価する研究を行った。準最適用量の４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンの組合せにより、いずれかの群単体の場合よりも大きい顕著な腫瘍成長制御がもたらされた。加えて、各薬剤について５０％の最大耐容量で投与した場合、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３＋ゲムシタビンではｎａｂ−パクリタキセル（注射懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合粒子）＋ゲムシタビンよりも大きな効果が示された。発明者らはこれらの研究からＥｐｈＡ２陰性モデルを除外したが、バイオマーカー解析からは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の効果がＥｐｈＡ２発現レベルに相関しないことが示されており、このことから、活性の媒介には低レベルのＥｐｈＡ２で十分であり得ることや、リポソーム送達が律速ステップであり得ることが示唆される。追加のバイオマーカー解析を今後行うことになる。
結論として、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、膵臓癌のいくつかの患者由来モデルにおいて高い活性を有し、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の活性はほとんどの標準的治療剤と同等またはそれ以上であった。今後の研究は、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（ＥｐｈＡ２標的ナノリポソームドセタキセル）及びＯＮＩＶＹＤＥ（商標）（イリノテカンリポソーム注射剤）への反応を区別するマーカーの特定を目標にすることになる。
発明者らは、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３が、膵臓患者に由来する腫瘍モデルにおいて高い活性を有することを見いだした。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、膵臓ＰＤＸモデルにおける２つの用量レベルの試験で、標準的なケア単剤療法と比較して優れた活性を示している。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３及びゲムシタビンの組合せは、膵臓ＰＤＸモデルにおいて、各薬剤単体よりも強力であり、またゲムシタビン／ｎａｂ−パクリタキセルよりも強力であった。
実施例１１：４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の組合せの臨床試験
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の臨床研究は、ゲムシタビンまたはカルボプラチンと組み合わせたＭＭ−３１０の活性を評価するために行われる。パート１において、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、最大耐容量（ＭＴＤ）が確立するまでは単剤療法として評価する。ひとたび単剤療法としての４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３のＭＴＤが確立したら、本研究はパート２ａ及び２ｂを進める。本研究のパート２ａでは、ゲムシタビンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を、尿路上皮癌、膵管腺癌、または軟組織肉腫サブタイプ（ＧＩＳＴを除外）を有する患者において評価する。本研究のパート２ｂでは、カルボプラチンと組み合わせた４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を、２つ以上の事前治療を受けたことのある転移性白金感受性卵巣癌患者において評価する。
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３＋ゲムシタビン（パート２ａ）
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、各３週間サイクルの１日目に９０分にわたり静脈内投与する。ゲムシタビンは、各サイクルの１日目に４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３投与の直後に３０分にわたり静脈内投与する。２回目用量のゲムシタビンは、各３週間サイクルの８日目に３０分にわたり投与する。
４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３＋カルボプラチン（パート２ｂ）
カルボプラチンは、各３週間サイクルの１日目に３０分にわたり静脈内投与する。４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３は、各３週間サイクルの８日目に９０分にわたり静脈内投与する。
選択基準：
パート２ａ
本研究のパート２Ａの選択に適格であるためには、患者は、抵抗性を有する、または標準的治療に対する耐容性がない、または利用可能な標準的ケア治療が存在しない、以下のがんのうちの１つを有しなければならない。
● 尿路上皮癌
● 膵管腺癌（ＰＤＡＣ）
● ＧＩＳＴ、デスモイド腫瘍、及び多形性横紋筋肉腫以外の軟組織肉腫サブタイプ
パート２ｂ
本研究のパート２Ｂの選択に適格であるためには、患者は、転移性再発性白金感受性卵巣癌を有しなければならない。患者は２つ以上の事前治療を受けた経験を有しなければならない。そして事前治療のうちの１つは白金ベース二重化学療法であるべきものとし、患者はさらなる白金ベース化学療法に耐容性を有することができなければならない。疾患は、直近の白金ベース化学療法から＞６ヵ月で再発していなければならない。
研究の全パート
● インフォームドコンセントを提供できる、またはインフォームドコンセントが可能でありその意向がある法定代理人を有する
● １８歳以上
● 生検に適用できるがん性病変が利用可能であり、治療前の生検を受ける意向がある
● ０または１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス
● 以下によって証明される十分な骨髄予備能：
○ ＡＮＣ＞１，５００／μｌ（成長因子によってサポートされていない）
○ 血小板数＞１００，０００／μｌ
○ ヘモグロビン＞９ｇ／ｄＬ
● 患者は、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、及び正常な施設限界値内の国際標準比（ＩＮＲ）によって証明される十分な凝血機能を有しなければならない
● 以下によって証明される十分な肝機能：
○ 血清総ビリルビン≦ＵＬＮ
○ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）≦２．５×ＵＬＮ
○ アルカリホスファターゼ≦２．５×ＵＬＮ（骨転移によってアルカリホスファターゼが高い場合を除く）
○ アルカリホスファターゼ＞２．５×ＵＬＮの場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）≦１．５×ＵＬＮの患者であれば選択に適格である。
● 血清／血漿／クレアチニン＜１．５×ＵＬＮによって証明される十分な腎機能
● 任意の事前の手術、放射線療法、または他の抗悪性腫瘍療法の影響からＣＴＣＡＥ ｖ４．０３のグレード１、ベースライン以下（脱毛を除く）に回復している
● 妊娠可能な女性または生殖機能を有する男性及びそのパートナーは、研究中及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の最終投与後６ヵ月間、性交渉を絶つまたは有効な避妊形態を使用する意向を有しなければならない真の禁断以外で許容される有効な避妊方法としては、以下のものが挙げられる：１）経口、注射、または移植によるホルモン性避妊方法の確立された使用、２）子宮内デバイス（ＩＵＤ）または子宮内システム（ＩＵＳ）の設置、コンドームまたは殺精子性発泡剤／ゲル／クリーム／座薬を有する閉塞性キャップを含めたバリア避妊方法、３）射精時の精子不在についての適切な精管切除後の文書化を伴う男性不妊化（本研究における女性患者に関しては、精管切除した男性パートナーが当該対象の唯一のパートナーであるべきものとする）
除外基準
パート２Ａ
● 研究登録から６ヵ月以内のドセタキセルによる事前の治療
● 研究登録から６ヵ月以内のゲムシタビンによる事前の治療
● ゲムシタビンに対する既知の過敏性
パート２Ｂ
● ドセタキセルベース化学療法による事前の治療
● 白金ベース化学療法による事前の治療
研究の全パート
● 妊娠中または授乳中
● 全身性抗凝固剤（アスピリンを除く）による治療（例えば、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗Ｘａ阻害剤など）
● 吐血、メレナ、血便、グレード２以上の喀血、または肉眼的血尿の任意の証拠
● 遺伝性出血系障害の任意の病歴
● スクリーニング来診中または最初の投与スケジュール日に活動性感染が存在するか３８．５℃を超える不明な熱があり、研究者の意見において、患者の試験参加に支障を来すか研究結果に影響を及ぼす可能性が考えられる場合研究者の自由裁量により、腫瘍熱を有する患者も登録され得る
● 既知のＣＮＳ転移
● ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の成分、またはドセタキセルに対する既知の過敏性
● ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３による既知の治療
● 最初の投与スケジュール日からさかのぼって２８日以内または５半減期以内（いずれか短い方）に、いかなる適用または疾患状態についても規制上の承認を受けていない任意の治験薬による治療を受け、全ての事前の臨床的に顕著な治療関連毒性がグレード１またはベースラインに消散している
● ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の最初の投与スケジュールからさかのぼって１４日以内に（または、直近の療法の任意の実際の毒性からまだ回復していない）任意の標準的な化学療法または放射線照射を含めた他の新しい抗腫瘍療法を受けた
● 抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ活性を有することが知られている任意の抗がん薬物を、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の最初の投与スケジュールからさかのぼって当該薬物の５半減期期間以内（例えば、ベバシズマブは１００日、ラムシルマブは７５日）に受けた
● 最初の投与予定から６ヵ月以内における、ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶうっ血性心不全、不安定狭心症、急性心筋梗塞を含めた臨床的に顕著な心臓疾患、療法を必要とする不整脈（多形性心室頻拍を含み、期外収縮、軽微な伝導異常、またはコントロールされ良好に治療された慢性心房細動を除く）
● 研究者により、他の任意の理由から本臨床研究の参加候補者に適切ではないとみなされる患者
● 臓器移植または同種骨髄移植または末梢血液幹細胞移植を受けた患者
● ４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３の開始予定前の４週間の間に１日１０ｍｇのプレドニゾン相当を超えるコルチコステロイドを長期使用
● ＣＹＰ３Ａの強力な阻害剤の同時使用
● グレード２以上の末梢性神経障害を有する患者

Claims (25)

  1. がんを治療する方法であって、１つ以上の脂質を含む脂質小胞内にカプセル化されたドセタキセルプロドラッグと、ＰＥＧ誘導体と、前記脂質小胞の外側にあるＥｐｈＡ２結合部分とを含む、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームを投与することを含む、前記方法。
  2. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをゲムシタビンと組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームをカルボプラチンと組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３または４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記がんが膀胱癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記がんが肉腫癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  9. ヒト患者におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ３またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ６を前記ヒト患者に投与することを含む、前記方法。
  10. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームがゲムシタビンと組み合わせて投与される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３である、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６である、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記リポソームが、３：２のモル比のスフィンゴミエリン及びコレステロールと、５〜７ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧとを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ヒト患者における肉腫癌または膀胱癌を治療するための、前記ヒト患者に対するＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ３またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ６の使用であって、治療有効量の前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームＩＬｓ−ＤＴＸｐ１またはＩＬｓ−ＤＴＸｐ３を前記ヒト患者に投与することを含む、前記使用。
  15. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームがゲムシタビンと組み合わせて投与される、請求項１３に記載の使用。
  16. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３である、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の使用。
  17. 前記ＥｐｈＡ２標的ドセタキセル産生リポソームが４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ６である、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の使用。
  18. 前記がんが、平均で１細胞当たり少なくとも３０００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法または使用。
  19. 前記がんが、平均で１細胞当たり少なくとも１７５００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法または使用。
  20. 前記がんが、平均で１細胞当たり少なくとも１００，０００個のＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法または使用。
  21. 前記リポソームが、スフィンゴミエリン、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＳＧを３：２：０．０３のモル比で含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法または使用。
  22. 前記リポソームが、化合物３、化合物４、または化合物６のドセタキセルプロドラッグをカプセル化する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法または使用。
  23. 前記リポソームが、化合物３、化合物４、または化合物６のスクロースオクタサルフェート塩をカプセル化する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法または使用。
  24. 前記がんがＥｐｈＡ２過剰発現がんである、請求項１に記載の方法。
  25. 前記がんが、肉腫、膀胱癌または尿路上皮癌、胃癌、胃食道接合部癌、または食道癌（Ｇ／ＧＥＪ／Ｅ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、卵巣癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、前立腺癌（ＰＡＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、子宮内膜癌、及び軟組織肉腫からなる群から選択される、請求項１または９に記載の方法。
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