JP4651276B2 - リポソームを体内より排泄する抗体およびリポソームの血中クリアランス促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、血中に投与されたリポソームを速やかに体外へ排泄する能力を有する抗体およびそれを含有するリポソームの血中クリアランス促進剤に関する。

近年、親水性高分子等で表面修飾することにより、１０時間以上の長い血中半減期で血中を長時間にわたって安定に循環できる長期滞留型（長期循環型）のリポソームが開発されてきた（非特許文献１参照。）。このような長期滞留型のリポソームは、その中に癌、炎症組織等の血管の透過性が亢進しているような組織を診断しまたは治療するための薬剤を含有させたとき、透過性の亢進した血管からそのような組織に効率的に集積することで、診断または治療の手段として有用なものとなることが期待されている（非特許文献２参照。）。

しかしながら、例えば、リポソームに造影剤を含有させ、病巣の診断に応用する場合、病巣のリポソーム濃度を血管中のリポソーム濃度より高くすることで、病巣と血管のコントラストをつける必要があるが、リポソームが長期滞留型であると、血中濃度の減少速度が遅く、コントラストを得るまでに長時間を有するうえ、長時間の経過後には病巣および血中のいずれにおいても低い濃度になってしまうことが想定され、実用的な診断には不利な部分があった。

また、例えば、このような長期滞留型のリポソームに診断用または治療用の薬物を含有させ、診断または治療に用いる場合、これら薬物やリポソームにより予期せぬ副作用が発現したときに、副作用を長時間にわたり持続させてしまう可能性がある。

これらの場合において、随時必要なときに、リポソームを速やかに血中から体外に排泄させることができれば、即ち、血中クリアランスを促進させることができれば、造影剤を含有させる場合においては、病巣における濃度が高い状態で、血中の濃度を速やかに低下させてコントラストを得ることができ、また、副作用が発現したときにおいては、速やかに薬物またはリポソームを体内から除去することで、副作用の持続を防止することができる。

最近、一部の哺乳動物において、一度リポソームを投与された動物に、一定期間経過後に同一のまたは異なる種類のリポソームを投与した場合に、２回目に投与されたリポソームの血中クリアランスが促進され、リポソームの血中濃度が急激に低下することが報告されていたが（非特許文献３参照。）、この血中クリアランスが促進される現象（ＡＢＣ現象：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）が起こる原因は、明らかではなかった。

Ｗｏｏｄｌｅ ＭＣ，Ｌａｓｉｃ ＤＤ，Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９２ Ａｕｇ １４；１１１３（２）：１７１−９９ Ｍａｅｄａ Ｈ，Ｗｕ Ｊ，Ｓａｗａ Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｙ，Ｈｏｒｉ Ｋ．，Ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＥＰＲ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０００ Ｍａｒ １；６５（１−２）：２７１−８４ Ｄａｍｓ ＥＴ，Ｌａｖｅｒｍａｎ Ｐ，Ｏｙｅｎ ＷＪ，Ｓｔｏｒｍ Ｇ，Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ ＧＬ，ｖａｎ Ｄｅｒ Ｍｅｅｒ ＪＷ，Ｃｏｒｓｔｅｎｓ ＦＨ，Ｂｏｅｒｍａｎ ＯＣ．，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｍａｒ；２９２（３）：１０７１−９

本発明は、リポソームの血中クリアランスを促進する物質およびそれに用いられる抗体を提供することを課題とする。

本発明者は、上記ＡＢＣ現象を解明し、原因物質を特定し、単離する方法を開発すれば、長期滞留型のリポソームを随時必要なときに速やかに体外へ排泄させるための手段を得られる可能性があると考えた。
そして、本発明者は、鋭意研究の結果、ＡＢＣ現象の発現時にリポソーム表面に結合している蛋白質を単離し、その構造を決定することで、リポソームの血中クリアランスを促進する物質を開発し、本発明を完成するに至った。

具体的には、本発明者は、上記課題を解決するため、リポソームを哺乳動物に単回投与し、投与後一定期間経過後に、血清を採取し、得られた血清を別の個体の哺乳動物に投与したときに、その血清を投与された哺乳動物に、血中からリポソームを速やかに排泄する活性が誘導されるかを検討した。
更に、本発明者は、このような活性が最も高いときの血清を、体外においてリポソームとインキュベーションし、リポソームに結合してくる蛋白を単離して、その構造を電気泳動法と、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法（液体クロマトグラフで分離した成分を２段階の質量分析により分析する方法）とにより解析した。
本発明者は、その結果、血清中にリポソームに結合する抗体が産生されており、血中クリアランスが向上しているときには、その抗体がリポソーム表面に結合していることを見出し、本発明を完成させたのである。

即ち、本発明により、以下のようなリポソームの血中クリアランス促進剤等が、上記課題を解決するための手段として提供される。なお、以下の（１）〜（９）の発明において、リポソームは、ポリエチレングリコールで表面修飾されたリポソームである。

（１）リポソームに結合する抗体を有効成分として含有する、リポソームの血中クリアランス促進剤。

（２）前記抗体が、哺乳動物に前記リポソームを単回投与することにより、前記哺乳動物に産生される抗体であって、前記哺乳動物とは別の個体の哺乳動物に投与された場合に、前記別の個体の哺乳動物の血中に存在している前記リポソームが体外へ排泄されることを促進する能力を有する抗体である、上記（１）に記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。

（３）前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、上記（１）または（２）に記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。

（４）前記リポソームが診断用および／または治療用の薬物を担持する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。

（５）リポソームに結合する抗体を有効成分として含有する、血中に存在しているリポソームの体外排泄剤。

（６）哺乳動物にリポソームを単回投与することにより、前記哺乳動物に産生される抗体であって、前記哺乳動物とは別の個体の哺乳動物に投与された場合に、前記別の個体の哺乳動物の血中に存在している前記リポソームが体外へ排泄されることを促進する能力を有する抗体。

（７）前記リポソームの、前記抗体を投与しない場合における血中半減期が１０時間以上である長期滞留型のリポソームである上記（６）に記載の抗体。

（８）上記（６）または（７）に記載の抗体を含有する医薬組成物。

（９）上記（６）または（７）に記載の抗体を製造する、抗体の製造方法であって、
哺乳動物にリポソームを単回投与する工程と、
投与後一定期間経過した後、前記哺乳動物から血清を採取する工程と、
前記血清を前記リポソームとインキュベーションする工程と、
インキュベーション後、前記リポソームに結合した蛋白質を精製して前記抗体を得る工程と
を具備する、抗体の製造方法。

本発明のリポソームの血中クリアランス促進剤は、リポソームの血中濃度の低下を促進させることができるので、特に、長期滞留型のリポソームの血中濃度を低下させる際に好適に用いられる。本発明の抗体は、本発明のリポソームの血中クリアランス促進剤に好適に用いられる。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のリポソームの血中クリアランス促進剤は、リポソームに結合する抗体を有効成分として含有する。
本発明において、「リポソーム」とは、脂質を膜の基本構成材料とする小球状の構造を有し、疾患の診断用および／または治療用の薬物を担持可能なものを意味する。リポソームは、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞である。リポソームの大きさは、特に限定されないが、球状またはそれに近い形態をとる場合には、粒子外径の直径が、０．０２〜２５０μｍであるのが好ましく、０．０３〜０．４μｍであるのがより好ましく、０．０５〜０．２μｍが更に好ましい。粒子外径の直径とは、光散乱法により測定されるリポソーム粒子の直径の平均値である。

リポソームを構成する他の成分は、そのような形態を安定的に形成できるものであれば特に限定されないが、生体内における安定性等を考慮すると、膜構成成分として、脂質、その誘導体および表面修飾剤からなる群から選ばれる少なくとも一つが含有されるのが好ましい。特に、膜の基本構成材料として、脂質を含むことが好ましい。脂質としては、例えば、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、これらの誘導体が挙げられる。

リン脂質としては、フォスファチジルコリン（＝レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに常法に従って水素添加したもの等を挙げることができる。

リン脂質以外の脂質は、特に限定されず、リン酸を含まない脂質が挙げられ、具体的には、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。
コレステロール類は、特に限定されないが、コレステロール、コレスタノール等を挙げることができる。

表面修飾剤は、リポソームの膜構成成分である脂質の構造や物性を変化させて、リポソームの膜に所望の特性を付与するために使用される。したがって、表面修飾剤はリポソームの膜構成成分の一つとして使用することができる。
表面修飾剤は、特に限定されないが、脂質と脂質に結合した化合物とからなる物質等が挙げられる。脂質に結合する化合物は、特に限定されないが、親水性高分子、水溶性多糖類の誘導体、塩基性官能基を有する化合物等が挙げられる。

親水性高分子は、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。
水溶性多糖類の誘導体としては、特に限定されないが、グルクロン酸、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン等が挙げられる。

表面修飾剤が親水性高分子または水溶性多糖を含む場合、親水性高分子または水溶性多糖が結合する脂質は、特に限定されないが、疎水性の領域を有する化合物（疎水性化合物）を使用することができる。
疎水性化合物は、特に限定されないが、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。具体的には、親水性高分子がポリエチレングリコールであり、疎水性化合物がジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンである場合、表面修飾剤はポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンとなる。

疎水性化合物を含む表面修飾剤を用いた場合、疎水性化合物の少なくとも疎水性領域が、リポソームの脂質二重層の膜の中に安定化される。その結果、脂質二重層の膜表面上（薬物担体の外表面上および／または内表面上）に、疎水性化合物に結合した親水性高分子または水溶性多糖を存在させることができる。そうすることによってリポソームの膜を修飾することが可能となり、その結果、リポソームの血中安定性を高めるなどの効果が得られる。

塩基性官能基は、特に限定されないが、アミノ基、アミジノ基、グアジニノ基等が挙げられる。塩基性官能基を有する化合物としては、ＤＯＴＭＡ（特許第６１１６１２４６号公報参照。）、ＤＯＴＡＰ（特許第５５０８６２６号公報参照。）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（特許第２２９２２４６号公報参照。）、ＴＭＡＧ（特許第４１０８３９１号公報参照。）、３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（国際公開第９７／４２１６６号パンフレット参照。）、ＤＯＳＰＡ、ＴｆｘＴＭ−５０、ＤＤＡＢ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、ＤＭＲＩＥ等の公知の化合物が挙げられる。

表面修飾剤が塩基性官能基を含む場合、即ち、表面修飾剤が脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、これをカチオン化脂質と呼ぶ。カチオン化脂質は、その脂質部分がリポソームの脂質二重層の膜の中に安定化され、塩基性官能基部分を該脂質二重層の膜表面上（担体の外表面上および／または内表面上）に存在させることができる。そうすることによってリポソームの膜を修飾することが可能となる。

リポソームは、疾患の診断用および／または治療用の薬物を担持して使用することができる。ここで、「担持」とは、リポソームの閉鎖空間内に薬物が封入された状態、例えば、脂質二重層内に薬物の一部もしくは全部が含まれている状態、または、薬物担体の外表面に薬物が付着した状態にあることを意味する。

本発明において、薬物担体に担持可能な診断用の薬物としては、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等が好適に挙げられる。
具体的には、Ｘ線造影剤の例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸等が挙げられる。
核磁気共鳴診断用診断薬としては、ガドペンテト酸メグルミン、ガドテリドール等のＧｄ錯体；フェルモキシデス等の鉄微粒子；クエン酸鉄アンモニウム等の鉄錯体等が挙げられる。

また、薬物担体に担持可能な治療用の薬物としては、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤，メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥs阻害剤、ラジカルスカベンチャー等の薬剤；タンパク質、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体等が好適に挙げられる。

具体的には、抗癌剤の例としては、シクロホスファミド、イホスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンＡ３、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ネオカルノスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、塩酸イリノテカン等が挙げられる。

抗生物質の例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシリンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、ホスホマイシンナトリウム、ホスホマイシンカルシウム等が挙げられる。

酵素剤の例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメライン等が挙げられる。
抗酸化剤の例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸等が挙げられる。

抗炎症剤の例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾン等が挙げられる。

ステロイド剤の例としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン（リン酸エステル、酢酸塩）、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン（アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル）、メチルプレドニゾロン（アセテート）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（酢酸トリアムシノロン）、デキサメタゾン（リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル）、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン（リン酸塩、二ナトリウム塩）、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾン等が挙げられる。

血管拡張剤の例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビド等が挙げられる。

アンジオテンシン変換酵素阻害剤の例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル等が挙げられる。
平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸等が挙げられる。
血小板凝集阻害剤の例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモール等が挙げられる。

抗凝固剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバン等が挙げられる。
ケミカルメディエーター遊離抑制剤の例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナスト等が挙げられる。
免疫抑制剤の例としては、シクロスポリン等が挙げられる。
抗ウイルス剤の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビン等が挙げられる。

好ましい「リポソーム」としては、体内を安定に循環するようなリポソームであれば、どのようなものでもいいが、１モルのリン脂質（水素添加されていてもいなくてもよいが、水素添加されていることがより好ましい）に対して、０．５〜１モルの割合でコレステロールを含むリポソーム、脂質としてスフィンゴミエリンにより構成されるリポソーム、これら脂質に対して５〜１５モル％の割合でカチオン化脂質を含んで構成されるリポソーム、これらのリポソームの総脂質に対して０．１〜２０モル％程度の親水性高分子誘導体を含んでいるリポソーム等が例示される。しかし、これらに限定されるものではない。

より具体的には、後述する実施例で用いられたリポソームのほか、以下のリポソーム（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）が挙げられる。

リポソーム（Ａ）は、薬物または生理活性物質を担持させたリポソームであって、その膜構成成分として、（１）該リポソームの表面にのみポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質が結合し、（２）該ポリエチレングリコール結合リン脂質のリン脂質部分がリポソーム膜を構成する脂質層に固定してなり、（３）ポリエチレングリコール部分はリポソーム表面から外方向に伸びてなるリポソームである。ＰＥＧ結合リン脂質分子中のＰＥＧ鎖長は、平均重合度で５〜１０００モルの範囲が望ましく、より好ましくは４０〜２００モルである。
リポソーム（Ａ）においては、リポソーム形成脂質とＰＥＧ結合リン脂質の混合比は、主成分であるリン脂質に対して、モル比で０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜２０モル％、より好ましくは１〜５モル％であるのが好ましい態様の一つである。

リン脂質の反応活性な官能基とＰＥＧを共有結合させるには、塩化シアヌルを用いる方法、カルボジイミドを用いる方法、酸無水物を用いる方法、グルタルアミデヒドを用いる方法等がある。ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とＰＥＧを結合するには、塩化シアヌル（２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン）を用いる方法が好ましく利用される。例えば、モノメトキシポリエチレングリコールと塩化シアヌルを公知の反応操作で結合することにより、２−Ｏ−メトキシポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−ｓ−トリアジン（活性化ＰＥＧ１）または２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジン（活性化ＰＥＧ２）が得られる（Ｙ，Ｉｎａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，７，７７３−７７６（１９８０））。

これらとアミノ基を脱塩酸縮合反応により結合させることで、ホスファチジルエタノールアミンの極性頭部にＰＥＧを共有結合させたリン脂質が得られる。ここで、活性化ＰＥＧ１を用いた場合は一分子のリン脂質中に１本のＰＥＧ鎖を、活性化ＰＥＧ２を用いた場合は２本のＰＥＧ鎖を含有することになる。また、モノメトキシＰＥＧと無水コハク酸を反応させてＰＥＧ末端にカルボキシル基を導入し、これとホスファチジルエタノールアミンをカルボジイミド存在下で反応させることにより、アミド結合を介したＰＥＧ結合リン脂質が得られる。

ＰＥＧ結合リン脂質を脂質層に含有するリポソームを製造するには、ＰＥＧ結合リン脂質をリポソーム形成脂質とあらかじめ均一に混合して、得られた混合脂質を用いて常法によりリポソームを形成させればよい。

リポソーム（Ａ）については、特公平７−２０８５７号公報に詳細に記載されている。

リポソーム（Ｂ）は、治療学的有効量で静脈内投与でき、かつ、４時間未満の半減期で血流中に遊離形態でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも２４時間に延長するためのリポソーム組成物であって、（１）小嚢（小胞）形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１〜２０モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（２）約０．１〜約０．４ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポソームおよび、（３）かかる治療学的に有効量の少なくとも３倍である量のリポソーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポソーム包含形態の化合物からなるリポソーム組成物である。
親水性ポリマーは約１０００〜約５０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールであるものが好ましい態様の一つであり、親水性ポリマーはフォスフォリポイドに誘導するものが好ましい態様の一つである。親水性ポリマーはポリ乳酸およびポリグリシル酸からなる群から選択されるのが好ましい態様の一つである。
リポソーム（Ｂ）において、治療用化合物の有効血中濃度はピコグラム−ナノグラム／ｍｌの範囲であり、リポソーム組成物が該組成物の静脈内投与の後少なくとも５日の期間治療有効投与量で治療用化合物を放出するのが好ましい態様の一つである。

治療用化合物はペプチドホルモン（例えば、バソプレッシン）、スーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレプロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１）腫瘍壊死因子（アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ（マクロファージ）−ＣＳＦ、Ｇ（顆粒球）−ＣＳＦ、ＧＭ（顆粒球、マクロファージ）−ＣＳＦ）、ＴＰＡプロウロキナーゼ、ＴＰＡウロキナーゼ、ＨＩＶ−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＮＥＳＰ（改変ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子、骨成長因子、繊維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板―誘導成長因子、ソマトメジンＣからなる群から選択される少なくとも一つであるのが好ましい態様の一つである。

リポソーム（Ｂ）については、特表平５−５０５１７３号公報に詳細に記載されている。

リポソーム（Ｃ）は、充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、（１）小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モル％とから成るリポソームであって、（２）該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、および（３）リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む、リポソーム組成物である。
リポソーム（Ｃ）においては、親水性ポリマーは約１，０００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールであり、抗腫瘍剤の少なくとも約８０％がリポソームに取り込まれた形態であることが好ましい態様の一つである。また、抗腫瘍剤がアントラサイクリン抗生物質であり、アントラサイクリンはドキソルビシン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩および酸からなる群から選択されることができる。リポソーム（Ｃ）に取り込まれた前記抗腫瘍剤の濃度は５０μｇ（薬剤）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）を超えることが好ましい。リポソーム（Ｃ）は腫瘍診断および／または治療に使用することができる。

リポソーム（Ｃ）については、特許第２８８９５４９号公報に詳細に記載されている。

リポソーム（Ｄ）は、治療および／または診断の目的で使用されるリポソームであって、（１）２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル−ＰＥＧ誘導体をリポソームと反応させることにより得られうる外部表面上に共有結合的に結合したＰＥＧ部分を有するリポソーム類である。リポソーム（Ｄ）は、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル−モノメトキシ−ポリエチレングリコールをリポソームと反応させることにより得られうる外部表面上に共有結合的に結合したＰＥＧ部分を有するリポソームであるのが好ましい態様の一つであり、脂質二重層が７：３〜５：５のモル比のジオレイルホスフアチジルコリン（ＤＯＰＣ）対ジオレイルホスフアチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなるのがより好ましい態様の一つである。リポソーム（Ｄ）は、脂質二重層を崩壊させることなくリポソーム類の外部表面上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を共有結合的に結合させることができ、その結果、リポソームの生体内循環寿命を延ばすことが可能である。

リポソーム（Ｄ）については、特許第２９４８２４６号公報に詳細に記載されている。

リポソーム（Ｅ）は、薬物を担持するリポソームであって、その膜構成成分が、（１）生理的ｐＨ範囲で陽電荷を帯びる塩基性化合物、（２）親水性高分子の脂質誘導体、および（３）リポソームを構成する脂質からなり、これらの構成比が、（３）に対して（１）が１〜２０ｍｏｌ％、好ましくは５〜１５ｍｏｌ％であり、かつ、（１）と（３）の和に対して（２）が０．２〜５ｍｏｌ％であるリポソームである。
前記生理的ｐＨ範囲で陽電荷を帯びる塩基性化合物が、アミジノ基を有する塩基性化合物、アミノ基を２個以上有する塩基性化合物、ピペリジン環を有する塩基性化合物、４級アミンを有する塩基性化合物であることが好ましく、更には、下記式１〜４のいずれかであるのが好ましい態様の一つである。

（式１中、Ａは芳香環を表す。Ｒ¹およびＲ²は炭素数１０〜２５のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ¹およびＲ²は同一であっても異なっていてもよい。Ｘ¹およびＸ²は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−を表し、Ｘ¹およびＸ²は同一であっても異なっていてもよい。ｍは０または１、ｎは０または１〜６の整数を表す。）

（式２中、Ｒ³は水素または炭素数１〜８のアルキル基もしくはアルニケル基を表す。Ｒ⁴は水素または炭素数１〜８のアルキル基もしくはアルニケル基を表す。Ｒ⁵およびＲ⁶は水素または炭素数１〜２５のアルキル基もしくはアルニケル基を表し（ただし、Ｒ⁵およびＲ⁶が共に水素である場合を除く。）、Ｒ⁵およびＲ⁶は同一であっても異なっていてもよい。Ｘ³は−Ｏ−または−Ｓ−を表す。ｐは０または１、ｑは０〜１０の整数を表す。）

（式３中、Ｒ⁷およびＲ⁸は炭素数１〜８のアルキル基またはアルニケル基を表し、Ｒ⁷およびＲ⁸は同一であっても異なっていてもよい。Ｒ⁹は水素または炭素数１〜８のアルキル基もしくはアルニケル基を表す。Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は水素または炭素数１〜２５のアルキル基もしくはアルニケル基を表し（ただし、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹が共に水素である場合を除く。）、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は同一であっても異なっていてもよい。Ｘ⁴は−Ｏ−または−Ｓ−を表す。ｒは０または１、ｓは０〜１０の整数を表す。）

なお、式１の化合物は国際公開第９７／４２１６６号パンフレットに、式２および３の化合物は特開平９−２６３５７９号公報に、式４はＣｈｅｍ．Ｐａｐｅｒｓ，３９（１），１２５−１３４（１９８５）に記載の化合物である。

リポソーム（Ｅ）においては、前記親水性高分子の脂質誘導体がポリエチレングリコールの脂質誘導体であるのが好ましく、該ポリエチレングリコールの脂質誘導体がポリエチレングリコール鎖とジアシルグリセロールを１分子内に含む化合物であるのがより好ましい態様の一つである。
前記親水性高分子の分子量が１０００〜７０００であるのが好ましい態様の一つである。
リポソーム（Ｅ）は、その主要粒度範囲が９０〜２００ｎｍであることが好ましい態様の一つである。
リポソーム（Ｅ）に担持されている薬物が、腎疾患の診断および／または治療を目的とする薬物であるか、病変部の組織および／または臓器にプロテオグリカンの過剰産生を伴う疾患の診断および／または治療を目的とする薬物であるかが好ましい態様の一つである。
前記腎疾患の診断および／または治療を目的とする薬物が、副腎皮質ステロイドおよび／またはその誘導体であるのが好ましい態様の一つである。
リポソーム（Ｅ）は、炎症腎治療薬として使用するのが好ましく、これらのリポソームを使用して、炎症腎の治療用薬剤を製造するのが好ましい態様の一つである。

リポソーム（Ｅ）については、国際公開第００／２５７４８号パンフレットに詳細に記載されている。

リポソーム（Ｆ）は、治療および／または診断を目的とする薬物を担持するリポソームであって、膜構成成分として、（１）塩基性化合物、（２）リン酸モノエステル誘導体およびカルボキシル基またはその塩を有する化合物から選択される酸性化合物、ならびに、（３）前記（１）および（２）以外のリポソーム膜構成成分からなるリポソームである。
中でも、炎症部位や腫瘍部位等の病巣部位でｐＨが５〜７の環境下において、能率的に集積するリポソームであるのが好ましい態様の一つである。
塩基性化合物のモル比が全リポソーム膜構成成分中１〜３０ｍｏｌ％であるのが好ましい態様の一つである。
リン酸モノエステル誘導体またはカルボン酸誘導体である酸性化合物のモル比が全リポソーム膜構成成分中０．５〜３０ｍｏｌ％であるのが好ましい態様の一つである。
前記塩基性化合物が、上記式１、２および４ならびに下記式５のいずれかに示される塩基性化合物であるのが好ましい態様の一つである。

前記塩基性化合物が、第四級アミンまたは第三級アミンを有する塩基性化合物であるのが好ましい態様の一つである。
前記塩基性化合物が、下記式６および７から選ばれるのが好ましい態様の一つである。

（式６中、Ｒ¹²およびＲ¹³は炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一であっても異なっていてもよい。Ｘ⁵およびＸ⁶は−Ｏ−または−ＯＣＯ−を表し、Ｘ⁵およびＸ⁶は同一であっても異なっていてもよい。Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は炭素数１０〜２０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は同一であっても異なっていてもよい。ｔは１〜６の整数を表す。）

（式７中、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｘ⁵、Ｘ⁶およびｔは、それぞれ式６中におけるのと同一の内容を表す。Ｒ¹⁶は、炭素数１〜８のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ¹²、Ｒ¹³およびＲ¹⁶は同一であっても異なっていてもよい。）

前記リン酸モノエステル誘導体が、リン酸プレドニゾロン、リン酸リボフラビン、ホスファチジン酸から選ばれるのが好ましい態様の一つである。
前記カルボキシル基またはその塩を有する化合物である酸性化合物が、脂肪酸であるのが好ましい態様の一つである。
前記脂肪酸が、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸であるのが好ましい態様の一つである。
前記他のリポソーム膜構成成分が、リン脂質もしくはその誘導体、および／または、ステロールもしくはその誘導体であるのが好ましい態様の一つである。

前記治療および／または診断を目的とする薬物が、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤，抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤，アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤またはラジカルスカベンチャーであるのが好ましい態様の一つである。
前記治療および／または診断を目的とする薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体であるのが好ましい態様の一つである。
前記治療および／または診断を目的とする薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体であるのが好ましい態様の一つである。
前記治療および／または診断を目的とする薬物が、オリゴおよび／または多糖、ならびに、それらの誘導体であるのが好ましい態様の一つである。
前記治療および／または診断を目的とする薬物が、蛋白質またはペプチドであるのが好ましい態様の一つである。
前記治療および／または診断を目的とする薬物が、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の各種体内診断薬であるのが好ましい態様の一つである。

リポソーム（Ｆ）については、国際公開第０１／００１７４号パンフレットに詳細に記載されている。

リポソーム（Ｇ）は、リポソームを構成する膜剤がリン脂質と炭素数１０〜２０の高級飽和脂肪酸の少なくとも１種とを含有し、該高級飽和脂肪酸の含有量がリポソーム構成成分中におけるモル比で３０〜５０ｍｏｌ％であるリポソーム製剤である。
前記リン脂質が飽和リン脂質或いは水素添加リン脂質であるのが好ましい態様の一つである。
前記膜剤として更にコレステロールを含むのが好ましい態様の一つである。
上記リポソーム表面に、更に、親水性高分子鎖部と疎水性部とを有する凝集抑制剤が結合され、該凝集抑制剤は疎水性部がリポソーム中の脂質層に固定されるとともに親水性高分子鎖部はリポソーム表面から外方向に伸びてなるものであるのが好ましい態様の一つである。
上記リポソームに担持された物質が生理活性物質であるのが好ましい態様の一つである。
前記生理活性物質がヘモグロビンであるのが好ましい態様の一つである。

リポソーム（Ｇ）については、国際公開第０３／０１５７５３号パンフレットに詳細に記載されている。

本発明において、リポソームに抗体が「結合する」とは、抗体が抗原を認識して結合することおよび物理的に吸着することを含む。抗原はリポソームであってもよいし、生体に投与されたリポソームに結合した蛋白質等であってもよい。また、抗体の可変領域ではなく、抗体の定常領域がリポソームに結合していてもよい。しかしながら、抗体がリポソームを抗原として認識して結合することが好ましい。

リポソームが結合する抗体は、リポソームの血中クリアランスを促進する抗体である。ここで、「血中クリアランス」とは、血液中から、薬物、リポソーム等が消失する速度をいう。血中から消失したリポソームは肝臓から体外へ排泄されるため、本発明に用いられる抗体は、最終的にはリポソームを速やかに体外へ排泄する能力を有する。ここで、「体外へ排泄する」とは、血液中の薬物、リポソーム等が肝臓、腎臓等の排泄器官を通して糞中や尿中へ排泄することをいう。
即ち、本発明は、リポソームに結合する抗体を有効成分として含有する、血中に存在しているリポソームの体外排泄剤も提供する。

また、本発明は、上述した抗体、好ましくは後述する本発明の抗体を含有する医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物の上述した抗体以外の成分は、特に限定されず、例えば、後述する「抗体を有効成分として含有する薬剤」の「製剤化」に使用される医薬的に許容される担体や添加物を含有することができる。

本発明に用いられる抗体は、上記性質を有するものであれば特に限定されないが、哺乳動物にリポソームを単回投与することにより、前記哺乳動物に産生される抗体であって、前記哺乳動物とは別の個体の哺乳動物に投与された場合に、前記別の個体の哺乳動物の血中に存在している前記リポソームが体外へ排泄されることを促進する能力を有する抗体（以下「本発明の抗体」という。）であるのが好ましい態様の一つである。

図１は、リポソームを哺乳動物に投与してから血清を採取するまでの期間と、その血清を別の個体の哺乳動物に投与した場合におけるリポソームの血中濃度の経時的変化との関係を表すグラフである。
図１に示されているように、リポソーム投与後４日および５日の哺乳動物から採取した血清を、別の個体の哺乳動物に投与すると、リポソームが１時間以内に血中からほぼ消失することが認められる。即ち、本発明の抗体を含む血清を動物に投与すると、リポソームが血中から速やかに消失する。これに対して、そのような血清を投与されていない哺乳動物では、一定時間経過後も血中にリポソームの大部分が残存する。

このように、ポリエチレングリコール等の親水性高分子により修飾されており、前記抗体を投与しない場合における血中半減期が１０時間以上である長期滞留型のリポソームを、本発明の抗体の投与により、血中から速やかに排泄させることができる。本発明の抗体は、例えば、ポリエチレングリコール等の親水性高分子で表面修飾されているリポソームを哺乳動物に単回投与したときに得られることが分かっている。

本発明に用いられる抗体は、所望の薬理効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。例えば、所望の薬理効果を有するものであれば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のイムノグロブリンサブクラスのいずれであってもよいし、またその混合物であってもよい。

そのような抗体は、公知の手段を用いて得ることができるが、以下のようにして製造されるのが好ましい態様の一つである。
即ち、哺乳動物にリポソームを単回投与する工程と、投与後一定期間経過した後、前記哺乳動物から血清を採取する工程と、前記血清を前記リポソームとインキュベーションする工程と、インキュベーション後、前記リポソームに結合した蛋白質を精製して前記抗体を得る工程とを具備する、抗体の製造方法により得られるのが好ましい。

抗体は、このような方法により、ポリクローナル（抗血清）抗体またはモノクローナル抗体として得ることができるが、哺乳動物由来のモノクローナル抗体であるのが好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、以下のようにして作製することができる。即ち、リポソームを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製することができる。
抗体取得の感作抗原として使用されるリポソームを、後述の実施例に記載された方法によって得る。得られたリポソームを感作抗原として用いる。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯類の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、サル等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水等で適当量に希釈しまたは懸濁させたものに、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、更に、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日から数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得るほかに、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでリポソームに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、リポソームへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照。）。更に、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるリポソームを投与して抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からリポソームに対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット参照。）。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。

得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５′−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。更に、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。

本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。つぎに、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開第９４／１１５２３号パンフレット参照。）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼイン等）をコードする遺伝子に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。

本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、以下の方法を用いて製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９６／０２５７６号パンフレット参照。）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により増幅する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体を得ることができる（欧州特許第２３９４００号明細書、国際公開第９６／０２５７６号パンフレット参照。）。

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ＣＤＲとＦＲを含む可変領域や定常領域の活性を調節するために、それらの部位の糖鎖付加配列を変化させることができる。即ち、人工的に糖鎖を付加したり、糖鎖を持たないようにするための調節が可能である。
キメラ抗体およびヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば、Ｈ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の薬剤の有効成分として有用である。

本発明で使用される抗体は、所期の目的を達成するかぎり、抗体の断片またはその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。

ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば、アミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。

また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。

前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。

また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）等の哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えば、ｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。

複製起源としては、ＳＶ ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、更に、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。

本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば、真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば、樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞等の動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば、大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
つぎに、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外ろ過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。

本発明で使用される抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
本発明で使用される抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＢＩＡＣＯＲＥ法（表面プラズモン共鳴を利用する分析法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、リポソームをコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。

本発明において、「バルク」とは抗体を含む組成物であり、前記の方法を用いて発現・産生された抗体を、細胞・宿主動物から分離・精製した抗体組成物のことである。分離・精製されたバルクには、分離・精製時に用いた溶媒（緩衝液等）が含まれる。更には、精製された抗体溶液組成物に、等張化剤としてハロゲン化金属類等、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等、好ましくは、塩化ナトリウムを、本質的にヒトの血液とおなじ浸透圧になるように添加する。一般的には約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧が好ましい。
更に、酢酸、クエン酸、リン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の緩衝剤を、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ程度添加し、ｐＨを５〜８、好ましくは５．５〜７．０、最も好ましくは、約６．０に調整し、バルク用抗体溶液組成物を調製する。

本バルク用抗体溶液組成物は、製剤として調製されるまでの間、溶液状態あるいは凍結状態、好ましくは凍結状態で保存する。
この組成物には、約１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗体が含まれており、更には、凍結融解の際に抗体の微粒子形成を減少し得るクライオプロテクタントあるいは凍結乾燥時のリオプロテクタントとなる界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシル硫酸ナトリウム）、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリル−・リノレイル−・ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−・ミリスチル−・リノレイル−・ステアリル−サルコシン、ミリスチル−・リノレイル−・セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−・コカミドプロピル−・リノールアミドプロピル−・ミリスタミドプロピル−・パルミドプロピル−・イソステアラミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−・パルミドプロピル−・イソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル−・二ナトリウムメチルオレイル−タウレート、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールやプロピレングリコールのコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ等）や糖または糖アルコール（例えば、スクロース、トレハロース、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール等のポリオール等）、グルタミン酸やヒスチジンのようなアミノ酸等が含まれていてもよい。またこれらの濃度は、抗体濃度および調製する製剤の等張性に依存する。

バルク用抗体溶液組成物は、少なくとも２〜８℃で２年間で安定であることが好ましい。
バルク用溶液組成物は、長期保存性や、輸送時の物理的ストレスに対して安定であることを要求されるのと同時に、ある実施形態において、この組成物を用いて治療される患者に適した投与方法（例えば、皮下投与）の製剤に調製するために、できるだけ安定化剤等の添加物を添加しないことが好ましい。
したがって、バルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤、界面活性剤、糖または糖アルコール以外の安定化剤を含んでいないことが好ましい。更にバルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤、界面活性剤以外の安定化剤を含んでいないことが好ましい。最も好ましくは、バルク用溶液組成物は、緩衝剤、ハロゲン化金属類等の等張化剤以外の安定化剤を含んでいない組成物である。

抗体は、造影剤のコントラストの改善、リポソーム入り治療薬の副作用の除去等の目的で投与される、リポソームの血中クリアランス促進剤や血中に存在しているリポソームの体外排泄剤等の有効成分として使用することができる。抗体は、上記の用途のいずれか一つまたは複数を目的として、投与することができる。

抗体を有効成分として含有する薬剤は、経口投与および非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺剤型（例えば、ネフライザー等の器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば、軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身または局部的に投与することができる。
特に、注射製剤の場合は、緩衝剤として酢酸および／またはその塩を使用することが好ましい。緩衝剤として酢酸および／またはその塩を使用した場合には、注射製剤投与時の疼痛が少ないものとなる。

また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは０．１〜１００００ｍｇ／ｂｏｄｙ、更に好ましくは０．５〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、更に好ましくは１〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、抗体を含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
また、投与時期としては、所望の効果を期待する時期の前後を問わず投与することができ、または所望の効果を発揮すべき事象が予測される時に投与してもよい。

このような抗体を有効成分として含有する薬剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、アミノ酸、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。

実際の添加物は、本発明の薬剤の剤型に応じて上記の中から単独でまたは適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

抗体の安定化製剤を提供するためには、ｐＨが５〜８の範囲となるように、抗体を緩衝液に溶解するとよい。緩衝液は、酸（好ましくは、酢酸、クエン酸、リン酸等の弱酸）とその塩（好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ塩）の混合溶液であるとよい。製剤中の緩衝剤（例えば、酸およびその塩）の総濃度は、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等は一般的な方法で調製される（Ｄ．Ｄ．ペリン、Ｂ．デンプシー著、「緩衝液の選択と応用」講談社サイエンティフィック）。

以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限られるものではない。

実験１ リポソームの調製
ＨＳＰＣ（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｏｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）またはＨＥＰＣ（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＣＨＯＬ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびＰＥＧ₂₀₀₀−ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（Ｍ_ｗ＝２０００））をそれぞれクロロホルムに溶解させ、それぞれの溶液をＨＳＰＣまたはＨＥＰＣとして４０μｍｏｌ、ＨＳＰＣまたはＨＥＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧ₂₀₀₀−ＤＳＰＥ＝１．８５：１：０．１５になるようにナス型フラスコに加え混合した。その後、クロロホルムをエバポレーターにより除去して、脂質薄膜を調製した。これにＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液２ｍＬを加え、６５℃に加温しながらボルテックスミキサーでかくはんしてリポソーム分散液を調製した。得られたリポソーム分散液を、Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社のエクストルーダーを用いて、孔径０．４μｍの膜を３回、孔径０．２μｍの膜を３回、孔径０．１μｍの膜を１０回通して、粒子径が１００ｎｍとなるように整粒した。粒径はＰａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社のＮＩＣＯＭＰ３７０を用いて動的光散乱法により確認した。

実験２ ^３Ｈ標識リポソームの調製
ＨＳＰＣまたはＨＥＰＣに、^３Ｈ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｅｔｈｅｒ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）をＨＳＰＣまたはＨＥＰＣの１μｍｏｌに対して４μＣｉの放射活性で添加した以外は、実験１と同様の方法で操作して、^３Ｈ標識リポソームを調製した。

実験３ ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ標識リポソームの調製
ＨＳＰＣまたはＨＥＰＣに、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＤＨＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）をＨＳＰＣまたはＨＥＰＣに対して０．００１５μｍｏｌ添加した以外は、実験１と同様の方法で操作して、ＲｈｏｄａｍｉｎＢ標識リポソームを調製した。

実験４ 抗リポソーム血清の産生
ＨＥＰＣを用いて実験１の方法で調製したリポソームを９週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットにＨＳＰＣまたはＨＥＰＣとして０．００１μｍｏｌ／ｋｇの割合で静脈投与し、投与１〜５日後頚動脈にカニュレーションを施し、血液を血清分離剤入りチューブ（栄研）に採取した。このチューブをそのまま３０分間室温で放置した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清のみを遠心チューブにとり、血清を得た。血清は使用するまで−８０℃にて保存した。

実験５ リポソーム認識血清の投与によるリポソームの排泄促進効果の確認
実験４においてリポソーム投与後１〜５日経過したラットから得られた血清と、リポソームを投与していないラットの血清を、それぞれ、リポソームをまだ投与していない別の個体のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットに投与し、その直後に、それぞれのラットにＨＥＰＣを用いて実験２で得られた^３Ｈ標識リポソームを投与し、リポソームの血中動態を血漿中の放射活性により評価した。
その結果、リポソーム投与後４日および５日経過後のラットの血清をあらかじめ投与されていたラットにおいて、投与された^３Ｈ標識リポソームが速やかに血中から消失することが確認された（図１参照。）。したがって、リポソーム投与後、４日および５日経過後のラットの血清中にリポソームを認識する物質があることが示唆された。

実験６ リポソーム認識血清からのリポソーム認識蛋白質の分離
採取した血清中に存在するリポソームを認識する物質を分離するため、ＨＥＰＣを用いて実験３で得られたＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ標識リポソームの分散液（リン脂質として、１４μｍｏｌ／ｍＬ）と、リポソーム未投与のラット血清または実験４で得られた投与後５日目の血清とをそれぞれリポソーム分散液：血清＝１：４となるように混合し、水浴槽中で、３７℃、１５ｍｉｎの条件でインキュベーションした。
この液１．２ｍＬを、あらかじめＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化しておいた、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^(R)４ ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１．５ｃｍ×３０ｃｍ）にアプライし、１．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、上記緩衝液を用いてゲルろ過した。

ゲルろ過においては、フラクションコレクターに、０．５ｍｉｎ毎のフラクションを回収し、各フラクションの蛍光強度を測定した。具体的には、各フラクションの１０μＬをブラックの９６ｗｅｌｌプレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）のｗｅｌｌに加え、ｗｅｌｌにメタノールを２００μＬ分注し、十分に振とうした後、Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、蛍光強度（Ｅｘ＝５３０ｎｍ，Ｅｍ＝５９０ｎｍ）を測定した。
測定した蛍光強度より、リポソーム画分を集め、回収した。この画分を濃縮装置（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に入れ、超遠心機（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ^(R) Ｒ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｒｔｅｒ）を用いて、１４０００ｇ、８０ｍｉｎの条件で遠心した。
濃縮後、濃縮装置を取り外し上下逆さにして、別のエッペンドルフチューブに装着して２５００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心して、サンプルを採取した。なお、濃縮の程度は濃縮前後の試料の量を測定することで推定した。

実験７ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による結合蛋白の分離
リポソーム投与前のラット血清と、リポソーム投与後５日経過後のラット血清とからそれぞれ、実験６の方法で得られた溶液のリポソーム画分を、リン脂質として３μｍｏｌ／ｍＬとなるように希釈し、その０．０２５ｍＬを０．０７５ｍＬのサンプル緩衝液（組成：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸，２５．２％ グリセロール，２％ ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ），０．００６％ ＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ），２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ），１％ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）；ｐＨ６．８）と混合し、９５℃で５分間処理した後、還元条件下、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ電気泳動により分画した。
電気泳動の結果を図２に示す。

実験８ 結合蛋白質の同定
上記実験７の電気泳動上で、リポソーム未投与ラットの血清に比べて、リポソーム投与後のラットで明らかな増大が見られる７本のバンド（図２中のｂａｎｄ１〜７）を切り出し、これらのゲル片にＴｒｙｐｓｉｎを含むＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３５℃、２０時間の処理にて消化した。酵素消化で得られたペプチドにつき、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＨＰＬＣ装置：ＭＡＧＩＣ ２００２（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；カラム：Ｍａｇｉｃ Ｃ１８（０．１×５０ｍｍ，Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）；質量分析装置：Ｑ−Ｔｏｆ２（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＵＫ）を用いて分析し、ＭＳ／ＭＳにより得られたイオンシグナルデータをＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈにより、ＮＣＢＩｎｒデータベースを用いて検索し、統計学的に有意なスコアを示すペプチドを含む蛋白質を同定した。

その結果、ｂａｎｄ１（分子量８０ｋＤ付近）およびｂａｎｄ３（分子量５５ｋＤ）には、免疫グロブリンの重鎖由来のペプチド（Ｉｇ重鎖ＶＤＪｈ２領域、Ｉｇμ鎖Ｃ領域、免疫グロブリン重鎖ｖａｒｉａｂｌｅ領域、Ｉｇγ−２Ｃ鎖Ｃ領域、Ｉｇε重鎖）を含む蛋白質が泳動されており、分子量との同一性からも、これらが、免疫グロブリン重鎖由来のｂａｎｄと同定された。一方、ｂａｎｄ５および６（分子量約２５ｋＤ付近）に免疫グロブリンの軽鎖由来のペプチド（Ｉｇκｃｈａｉｎ、同ＶＪ２鎖、同Ｖｋ−Ｊｋ２領域、κ軽鎖ｖａｒｉａｂｌｅ領域、Ｉｇ２Ｃ２．Ｃ１２軽鎖）を含む蛋白質が泳動されており、これらのｂａｎｄは免疫グロブリン軽鎖であることが確認された。

リポソームを哺乳動物に投与してから血清を採取するまでの期間と、その血清を別の個体の哺乳動物に投与した場合におけるリポソームの血中濃度の経時的変化との関係を示すグラフである。 実施例で得られたリポソーム投与後５日経過後の血清およびリポソーム未投与の血清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す蛋白質染色像である。

Claims (9)

1. ポリエチレングリコールで表面修飾されたリポソームに結合する抗体を有効成分として含有する、リポソームの血中クリアランス促進剤。
2. 前記抗体が、哺乳動物に前記リポソームを単回投与することにより、前記哺乳動物に産生される抗体であって、前記哺乳動物とは別の個体の哺乳動物に投与された場合に、前記別の個体の哺乳動物の血中に存在している前記リポソームが体外へ排泄されることを促進する能力を有する抗体である、請求項１に記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。
3. 前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。
4. 前記リポソームが診断用および／または治療用の薬物を担持する、請求項１〜３のいずれかに記載のリポソームの血中クリアランス促進剤。
5. ポリエチレングリコールで表面修飾されたリポソームに結合する抗体を有効成分として含有する、血中に存在しているリポソームの体外排泄剤。
6. 哺乳動物にポリエチレングリコールで表面修飾されたリポソームを単回投与することにより、前記哺乳動物に産生される抗体であって、前記哺乳動物とは別の個体の哺乳動物に投与された場合に、前記別の個体の哺乳動物の血中に存在している前記リポソームが体外へ排泄されることを促進する能力を有する抗体。
7. 前記リポソームの、前記抗体を投与しない場合における血中半減期が１０時間以上である長期滞留型のリポソームである請求項６に記載の抗体。
8. 請求項６または７に記載の抗体を含有する医薬組成物。
9. 請求項６または７に記載の抗体を製造する、抗体の製造方法であって、
   哺乳動物にポリエチレングリコールで表面修飾されたリポソームを単回投与する工程と、
   投与後一定期間経過した後、前記哺乳動物から血清を採取する工程と、
   前記血清を前記リポソームとインキュベーションする工程と、
   インキュベーション後、前記リポソームに結合した蛋白質を精製して前記抗体を得る工程と
   を具備する、抗体の製造方法。

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