FR3052361B1 - Diethers d’archaea lipides synthetiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne de nouveaux composés synthétiques, comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe sucre par l'intermédiaire d'un espaceur PEG, et de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés. En particulier la présente invention concerne de nouveaux composés synthétiques de formule générale (I) et de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés. L'invention concerne également ces nouveaux liposomes pour leur utilisation en tant que vecteurs et/ou en tant qu'adjuvants, notamment pour une utilisation vaccinale.
Description
DIÉTHERS D’ARCHAEA LIPIDES SYNTHÉTIQUES
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne le domaine des liposomes, de leurs composés lipidiques et de leurs utilisations pharmaceutiques. En particulier la présente invention concerne l’obtention de nouveaux composés synthétiques et la formulation de nouveaux liposomes comprenant au moins un de ces composés pour une utilisation vaccinale.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Le développement de nouveaux composés possédant des propriétés avantageuses pour la préparation de liposomes représente un enjeu majeur dans la recherche médicale. Les liposomes constituent un moyen très efficace pour faire parvenir une molécule d’intérêt à l’intérieur de cellules. Les liposomes représentent par exemple une alternative aux vecteurs viraux pour la délivrance d’acides nucléiques. Ils possèdent également un intérêt thérapeutique majeur en cancérologie. En plus d’être utilisés comme vecteurs de médicaments, des liposomes sont en effet développés pour une vaccination thérapeutique visant à induire une réponse immunitaire contre les cellules tumorales.
Les liposomes dits conventionnels sont principalement constitués de phospholipides similaires à ceux présents dans les membranes de bactéries ou de cellules eucaryotes. L’utilisation médicale de ces liposomes peut cependant être limitée par des problèmes de stabilité et des problèmes de ciblage. Pour pouvoir être administrés par voie orale ou par voie sanguine, les liposomes doivent en effet résister à un milieu acide et/ou aux interactions avec les protéines et lipoprotéines du sang. Par ailleurs les liposomes doivent être reconnus par les cellules auxquelles sont destinées les molécules qu’ils transportent. En particulier les liposomes utilisés comme vecteurs de vaccination doivent être reconnus et internalisés par les cellules présentatrices d’antigène afin que celles-ci puissent induire une réponse immunitaire spécifique à l’antigène délivré par les liposomes.
Le problème de stabilité des liposomes peut être résolu par Γutilisation de lipides appelés éthers de lipides ou archaeolipides. Ces lipides, naturellement présents dans les membranes des archaebactéries, sont caractérisés par la présence de liaisons éthers reliant les chaînes aliphatiques phytanyles qui les constituent à un glycérol. Les lipides présents dans les membranes des archaebactéries sont donc généralement des diéthers ou des tétraéthers de phytanols. La structure des éthers de lipides joue un rôle important dans la résistance des archaebactéries aux conditions extrêmes. De même les liposomes comprenant ces lipides, aussi appelés archaeosomes, possèdent généralement une stabilité accrue au stress oxydatif, aux hautes températures, aux conditions acides ou alcalines, à l’action des phospholipases, des sels biliaires et des protéines du sérum (Patel GB, Sprott GD. Archaeobacterial ether lipid liposomes (archeosomes) as novel vaccines and drug delivery Systems. Crit Rev Biotechnol 1999; 19: 317-357). W09308202 décrit ainsi des archaeosomes présentant une stabilité accrue obtenus à partir des lipides polaires totaux extraits d’archaebactéries. CA2269502 décrit des lipides dérivés de tétraéthers et des liposomes les comprenant. W02006061396 décrit des tétraéthers de lipides de synthèse analogues à ceux présents dans les membranes d’archaebactéries et des liposomes intégrant ces tétraéthers de lipides. Outre leur stabilité accrue, les archaeosomes possèdent également l’avantage d’avoir un effet adjuvant intrinsèque, indépendant de toute molécule qu’ils peuvent transporter. WO0126683 décrit ainsi l’activation in vitro and in vivo de macrophages et de cellules dendritiques de souris par des archaeosomes vides constitués des lipides polaires totaux extraits d’archaebactéries.
Le problème d’adressage des liposomes peut être résolu par Γutilisation de composés comportant un lipide lié à un groupe polaire pouvant être reconnu par des récepteurs exprimés à la surface des cellules ciblées. Ainsi les liposomes comprenant de tels composés possédant un groupe polaire sucre peuvent être reconnus par les récepteurs lectines des cellules présentatrices d’antigène (Benvegnu et al., Glycolipid-based nanosystems for the delivery of drugs, genes and vaccine adjuvant applications, Carbohydr. Chem., 2014, 40: 341-377). En particulier Espuelas et al. décrivent l’addition de un, deux ou quatre groupe(s) mannose via un espaceur PEG à un lipide de synthèse dioléylglycérol (DOG) possédant deux chaînes aliphatiques non phytanyles reliées à un glycérol par une liaison éther (Espuelas et al., Influence of ligand valency on the targeting of immature human dendritic cells by mannosylated liposomes, Bioconjugate Chem. 2008, 19 :2385-2393). Espeluas et al. montrent que des liposomes comprenant ces composés peuvent cibler et être fixés par des cellules dendritiques immatures humaines mais ne sont pas capables d’induire seuls l’expression des marqueurs de surface CD83, CD86 et HLA-DR de ces cellules. Les composés décrits par Espeluas et al. ne confèrent donc pas d’effet adjuvant intrinsèque aux liposomes qui les contiennent. W02007112567 décrit des diéthers ou tétraéthers de lipides hémisynthétiques comprenant uniquement des chaînes phytanyles obtenus à partir des extraits de lipides polaires totaux d’archaebactéries. Après isolement, ces lipides sont attachés à des groupes sucres et les composés obtenus sont utilisés dans la préparation d’archaeosomes. L’obtention de composés hémisynthétiques comportant un diéther de lipides extraits des archaebactéries nécessite la mise en place de cultures d’archaebactéries, de méthodes d’extraction et d’isolation difficiles à réaliser à grande échelle. Il est donc nécessaire de pouvoir obtenir des composés synthétiques comportant des diéthers de lipides attachés à un groupe sucre possédant les propriétés avantageuses des lipides d’archaebactéries.
La présente invention concerne ainsi des composés synthétiques comportant un diéther de lipides relié à un groupe sucre et des liposomes comprenant ces composés. Les composés de l’invention sont caractérisés par la présence d’une chaîne aliphatique ramifiée et d’une chaîne aliphatique linéaire non substituée et par la présence d’un groupe glycoside greffé au diéther de lipides par l’intermédiaire d’un espaceur PEG. De manière inédite, les composés synthétiques de l’invention confèrent aux liposomes qui les comprennent un effet adjuvant intrinsèque in vitro et in vivo. RÉSUMÉ
La présente invention concerne ainsi un composé de formue I :
dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :
dans lequel R2 et R2’ sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en
mannose, l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ; d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ; sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ;
dans lequel R2 et R2’ représentent le groupement :
sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
La présente invention concerne également un composé de formule II :
dans laquelle : c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ; d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2.
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé selon l’invention. Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé de l’invention dans des proportions comprises d’environ 1% à environ 15%, préférentiellement d’environ 2% à environ 10%, plus préférentiellement d’environ 5%.
La présente invention concerne également un liposome de l’invention comprenant en outre au moins une molécule d’intérêt.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’intérêt comprise dans le liposome de l’invention est capable d’induire une réaction immunitaire.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’intérêt comprise dans le liposome de l’invention est un acide nucléique.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’intérêt comprise dans le liposome de l’invention est un antigène associé au cancer ou un acide nucléique codant un antigène associé au cancer.
La présente invention concerne également un composé selon l’invention ou un liposome comprenant au moins un composé selon l’invention pour son utilisation en tant qu’adjuvant vaccinal.
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé de l’invention et comprenant en outre au moins une molécule d’intérêt capable d’induire une réaction immunitaire, pour son utilisation en tant que vaccin.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le composé selon l’invention ou le liposome de l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante : « Adjuvant » fait référence à une molécule qui stimule la réponse immunitaire à un antigène et/ou qui la module de telle sorte à obtenir la réponse attendue. En particulier, l’ajout d’adjuvants dans les formulations vaccinales a pour but d’améliorer, d’accélérer et de prolonger la réponse immunitaire spécifique dirigée contre le(s) antigène(s) compris dans ces formulations vaccinales. Les avantages des adjuvants incluent l’amélioration de l’immunogénicité des antigènes, la modification de la nature de la réponse immunitaire, la réduction de la quantité d’antigène(s) nécessaire pour induire une immunisation efficace, la réduction de la fréquence des immunisations de rappel, et l’amélioration de la réponse immunitaire chez les sujets âgés et les sujets immunodéprimés. « Antigène » fait référence à toute molécule qui peut initier chez un sujet une réponse immunitaire cellulaire et/ou humorale. « Cellules dendritiques » fait référence à des cellules du système immunitaire présentatrices d’antigène qui présentent dans certaines conditions des prolongements cytoplasmiques appelés dendrites. Les cellules dendritiques ont notamment pour fonction de déclencher la réponse immunitaire adaptative induite en réponse à un antigène. « Diéther de lipides » concerne dans la présente invention un glycérol sur lequel deux fonctions alcool sont engagées dans des liaisons éthers avec des lipides. « Environ » placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre. « Excipient pharmaceutiquement acceptable » concerne un véhicule ou un support inerte utilisé en tant que solvant ou diluant dans lequel l'agent pharmaceutiquement actif est formulé et/ou administré, et qui ne produit pas une réaction indésirable, allergique ou autre lorsqu'il est administré à un animal, de préférence un être humain. Cela comprend tous les solvants, milieux de dispersion, revêtements, agents antibactériens et antifongiques, agents isotoniques, retardants d'absorption et autres ingrédients similaires. Pour l'administration humaine, les préparations doivent répondre à des normes de stérilité, de sécurité générale et de pureté, telles que requises par les offices de régulation, tels que par exemple la LDA (Lood and Drug Administration) ou ΓΕΜΑ (European Medicines Agency). « Glycane » fait référence à un polymère composé de monosaccharides reliés entre eux par une liaison glycosidique. « Glycoside » fait référence à un groupe sucre attaché à une autre fonction non glucidique par une liaison glycosidique. Le groupe sucre, également appelé résidu sucre, peut être un sucre simple (un monosaccharide) ou comporter plusieurs sucres (un oligosaccharide ou un polysaccharide). « Immunogène » concerne une molécule induisant une réponse immunitaire chez le sujet à qui elle est administrée. « Lectine » concerne une protéine qui se lie spécifiquement et de manière réversible à certains glucides. Parmi les lectines, celles présentent à la surface de certaines cellules immunitaires sont des lectines de type C. « Lipide » concerne une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée, saturée, insaturée ou polyinsaturée. « Lipoplexe » concerne un complexe liposome - acide nucléique, en particulier un complexe liposome cationique - acide nucléique. « Lipopolyplexe » concerne un complexe ternaire liposome - polycation - acide nucléique. Lorsque l’acide nucléique est un ADN, le lipopolyplexe est appelé LPD (Lipid - Polycation - DNA). Lorsque l’acide nucléique est un ARN, le lipopolyplexe est appelé LPR (Lipid - Polycation - RNA). « Liposome » concerne une vésicule formée d’une bicouche de lipides amphiphiles renfermant un milieu aqueux. Les têtes polaires des lipides amphiphiles se regroupent entre elles et sont dirigées soit vers le milieu extérieur aqueux, soit vers le milieu intérieur aqueux. Les queues hydrophobes sont enfouies à l’intérieur de la bicouche de manière à minimiser leur interaction avec un milieu aqueux. « Réponse immunitaire adaptative » concerne, après l’administration d’un vaccin, le développement chez un sujet d’une réponse spécifique cellulaire et/ou humorale (médiée par des anticorps). La réponse immunitaire adaptative inclut généralement, de manière non exhaustive, un ou plusieurs des effet(s) suivant(s) : production d’anticorps, de lymphocytes B, de lymphocytes T auxiliaires et/ou de lymphocytes T cytotoxiques, dirigés de manière spécifique contre un ou plusieurs antigène(s) compris dans le vaccin. De manière préférentielle, le sujet vacciné développera une réponse immunitaire adaptative protectrice ou thérapeutique telle que sa résistance à une infection sera accrue et/ou la sévérité de la maladie sera réduite. « Sucre » dans la présente invention, peut faire référence à un sucre simple ou à un polymère de sucres simples. Les sucres simples, également appelé oses ou monosaccharides, sont des aldéhydes polyhydroxylées ou des cétones polyhydroxylées. Le glucose, le mannose, le ribulose et le fructose sont quelques exemples de sucres simples. Les polymères de sucres simples peuvent être distingués en oligosaccharides, comprenant de 2 à 20 résidus d’oses et en polysaccharides, comprenant plus de 20 résidus oses. « Sujet » fait référence à un animal, de préférence à un être humain. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie. « Vaccin » concerne toute préparation comprenant une substance ou un groupe de substances induisant chez un sujet une réponse immunitaire dirigée contre un agent infectieux, par exemple une bactérie ou un virus, ou contre une tumeur cancéreuse. Les vaccins prophylactiques sont administrés pour empêcher un sujet de contracter une maladie ou pour atténuer l’atteinte si la maladie est contractée. De tels vaccins comprennent généralement soit un agent infectieux (inactivé ou vivant et atténué), soit des fragments d’un agent infectieux obtenus par purification ou par génie génétique. Les vaccins thérapeutiques sont destinés au traitement de maladies spécifiques, telles que les cancers. De tels vaccins comprennent un ou plusieurs antigènes tumoraux et visent en particulier à induire une réponse immunitaire cellulaire, médiée par les lymphocytes T, dirigée contre la tumeur qui expriment ce ou ces antigène(s).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention concerne un composé comportant : deux chaînes aliphatiques linéaires et/ou ramifiées et de même longueur, chacune reliée à un glycérol par une liaison éther, caractérisées en ce que l’une des chaînes aliphatiques est une chaîne ramifiée dans laquelle le nombre de carbones de la chaîne linéaire est compris entre 12 et 20, préférentiellement entre 16 et 20, ce nombre n’incluant pas les carbones branchés, et l’autre chaîne aliphatique est une chaîne linéaire non substituée dans laquelle le nombre de carbones est compris entre 12 et 20, préférentiellement entre 16 et 20 ; un groupe hydrophile choisi dans la liste comprenant les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antennés comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose ; un espaceur [PEG]m séparant le groupe hydrophile des chaînes aliphatiques dans lequel m est compris entre 1 et 130, préférentiellement entre 5 et 20.
La présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :
dans lequel R2 et R2’ sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ; d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ; sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle :
a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3; c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel R2 et R2’ sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ; d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ;
sous réserve qu’au moins deux des groupements Ri, Ri’ et Ri” soient différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a est égal à 5 ; b est égal à 2 ; c est égal à 5 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel R2 et R2’ sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside),
l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ; d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ; sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ; dans lequel R2 et R2’ représentent le groupement :
sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a est égal à 5 ; b est égal à 2 ; c est égal à 5 ;
Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :
dans lequel d est égal à 2 ; dans lequel R2 et R2’ représentent le groupement :
sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un composé de formule I :
dans laquelle : a est égal à 5 ; b est égal à 2 ; c est égal à 5 ;
Ri, Ri’ et Ri” représentent le groupement :
dans lequel d est égal à 2 ; dans lequel R2 représente le groupement :
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne donc un composé tri-mannosylé de formule II :
dans laquelle : c représente un nombre entier de 1 à 130, préférentiellement de 5 à 20 ; d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2.
La présente invention concerne un composé de synthèse comportant un lipide présentant des caractéristiques structurales propres aux lipides naturellement présents dans les membranes des archaebactéries.
Les lipides naturellement présents dans les membranes des archaebactéries sont caractérisés par la présence de liaisons éthers reliant les chaînes aliphatiques qui les constituent à une molécule de glycérol. Ils sont également caractérisés par la présence de chaînes aliphatiques phytanyles possédant des branchements réguliers. Les éthers de lipides présents dans les membranes des archaebactéries sont ainsi généralement des diéthers de phytanols (tel que l’archaeol) ou des tétraéthers de phytanols (tel que le caldarchaeol). Les glycérolipides présents dans les membranes des bactéries et des cellules eucaryotes, dits conventionnels, possèdent eux des liaisons esters reliant les acides gras qui les constituent à une molécule de glycérol. Par ailleurs les acides gras de ces lipides conventionnels sont généralement des chaînes aliphatiques, saturées ou insaturées, ne comprenant pas de branchements. La structure des éthers de lipides présents dans les membranes des archaebactéries joue un rôle important dans la résistance des
archaebactéries aux conditions extrêmes telles que de hautes températures ou un milieu acide.
La présente invention concerne un composé de synthèse comportant deux liaisons éthers, reliant une chaîne aliphatique ramifiée et une chaîne aliphatique linéaire non substituée à un glycérol. La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides.
Selon un mode de réalisation, le diéther de lipides de l’invention comprend deux chaînes aliphatiques, dont les structures linéaires n’incluant pas les carbones branchés sont de même longueur, reliées à un glycérol par une liaison éther, l’une des chaînes aliphatiques étant une chaîne ramifiée et l’autre chaîne aliphatique étant une chaîne linéaire non substituée.
Dans un mode de réalisation, les chaînes aliphatiques du diéther de lipides de l’invention sont saturées. Dans un autre mode de réalisation, les chaînes aliphatiques du diéther de lipides de l’invention sont insaturées. Dans un autre mode de réalisation, la chaîne aliphatique ramifiée est saturée et la chaîne aliphatique linéaire non substituée est insaturée. Dans un autre mode de réalisation, la chaîne aliphatique ramifiée est insaturée et la chaîne aliphatique linéaire non substituée est saturée.
Dans un mode de réalisation, la structure linéaire de même longueur de la chaîne ramifiée et de la chaîne linéaire non substituée du diéther de lipides de l’invention comprend entre 12 et 20 carbones, préférentiellement entre 16 et 20 carbones, et plus préférentiellement 16 carbones.
Dans un mode de réalisation la structure linéaire de même longueur de la chaîne ramifiée et de la chaîne linéaire non substituée du diéther de lipides de l’invention comprend 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 carbones.
La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe hydrophile, ou groupe polaire.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un glycoside.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre reconnu par les lectines, des protéines capables de lier des résidus sucres, et préférentiellement par les lectines de type C.
Dans un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre reconnu par les lectines DC-SIGN (CD209), DEC205/CD205, langérine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, et/ou le récepteur au mannose (MR).
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre choisi parmi la liste comprenant les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antennés comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre choisi parmi la liste comprenant les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine (tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMô (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide a-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) et les sucres antennés comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisés en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant de 2 à 5 résidus sucres caractérisé en ce que les résidus sucres antennés sont attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 résidus sucres attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 3 résidus sucres attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2, les résidus sucres étant choisis de manière indépendante dans la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 mannoses attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 2, 3,4 ou 5 glucoses attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 fucoses attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
Selon un mode de réalisation, le groupe hydrophile greffé au diéther de lipides de l’invention est un sucre antenné comprenant 2, 3, 4 ou 5 oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose attachés par un espaceur oligo(propylène glycol)n dans lequel n est compris entre 1 et 5 et préférentiellement n = 2.
La présente invention concerne un composé comportant un diéther de lipides auquel est greffé un groupe hydrophile, ou groupe polaire, par l’intermédiaire d’un espaceur polyéthylène glycol (PEG).
Dans un mode de réalisation, l’espaceur PEG possède la structure suivante :
dans laquelle c est compris entre 1 et 130, préférentiellement entre 5 et 20.
Selon un mode de réalisation, c est égal à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50.
La synthèse du composé de l’invention pourra être réalisée par différentes voies connues de l’homme de l’art.
Dans un mode de réalisation (décrit dans Lainé et al., Folate-equippedpegylated archaeal lipid dérivatives : synthesis and transfection properties, Chem. Eur. J. 2008, 14, 83330-8340), un diéther de lipides selon l’invention peut être obtenu à partir d’un dérivé du
glycérol lui-même synthétisé à partir d’un phytol et d’un (7?)-solketal. La réaction de ce dérivé du glycérol avec le triflate d’hexadécyle en présence d’une éponge à protons permet d’obtenir le diéther correspondant. L’hydrogénolyse du groupe benzyloxy conduit à l’alcool qui peut ensuite être converti en acide carboxylique ou en amine. Les diéthers de lipides ainsi obtenus possédant une fonction acide carboxylique ou une fonction amine peuvent être utilisés pour la synthèse de composés selon l’invention.
Dans un mode de réalisation, la synthèse du composé tri-mannosylé de formule II est réalisée selon un schéma en quatre étapes à partir du ligand tri-mannosylé acide carboxylique et du l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol désigné par la suite par diéther de lipides possédant une fonction acide carboxylique (ou diéther acide carboxylique) : 1) le ligand tri-mannosylé acide carboxylique est préparé par benzylation du pentaérythritol triallyléther, suivie d’une séquence hydroboration-oxydation/allylation/hydroboration-oxydation, d’une trimannosylation des hydroxylés libres par un donneur de mannosyle trichloroacétimidate tétra-O-benzoylé, une déprotection de l’hydroxyle du pentaérythritol suivie d’une oxydation en acide carboxylique ; 2) le couplage peptidique entre le diéther acide carboxylique et la chaîne Poly(éthylène glycol) amino-azoture est réalisé par l’intermédiaire d’un ester activé par un noyau benzotriazole (TBTU) en présence de la Ν,Ν’-diisopropyléthylamine (DIEA), sous atmosphère inerte dans le dichlorométhane anhydre ; 3) après réduction de la fonction azoture dans des conditions de Staudinger, un second couplage peptidique en présence des réactifs TBTU et DIEA permet le greffage du ligand tri-mannosylé acide carboxylique ; 4) une déprotection des hydroxylés des motifs mannose dans des conditions de Zemplén (MeONa, CthCh/MeOH) conduit au composé tri-mannosylé final.
La présente invention concerne également un liposome comprenant au moins un composé de l’invention.
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé de l’invention dans des proportions d’environ 1% à environ 15%, préférentiellement d’environ 2% à environ 10%, plus préférentiellement d’environ 5%.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé de l’invention dans des proportions d’environ 1% à environ 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, ou 15%.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé de l’invention dans des proportions d’environ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, à environ 15%.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend environ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15% d’un composé de l’invention.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé selon l’invention seul ou en mélange avec un ou plusieurs lipide(s) synthétique(s), hémisynthétique(s) ou naturel(s).
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé selon l’invention et le lipide KLN25 (O,O-dioléyl-N-[3N-(Nméthylimidazoliumbromure)propylène] phosphoramidate) de formule :
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé selon l’invention et le lipide MM27 (0,0-dioléyl (-N-(histamine)phosphoramidate) de formule :
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé selon l’invention, le lipide KLN25 et le lipide MM27.
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un composé selon l’invention et un lipide cationique. Dans un mode de réalisation, le lipide cationique est un lipide possédant une tête polaire constituée d’un groupe imidazolium. Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention est un liposome cationique.
La préparation du liposome de l’invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l’homme de l’art. Par exemple, le liposome de l’invention peut être préparé selon la méthode d’hydratation d’un film lipidique sec (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Methods Mol Biol. 969:247-74).
Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins une molécule d’intérêt. Selon un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins une molécule d’intérêt à délivrer in vitro ou in vivo à une cellule.
Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est comprise au sein de la bicouche lipidique du liposome de l’invention. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d’intérêt est comprise au sein du compartiment hydrophile du liposome de l’invention.
Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est un acide nucléique, par exemple et de façon non exhaustive, la molécule d’intérêt est un ADN, un ARN, un ARNm, un siARN, ou un microARN. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d’intérêt est une protéine ou un peptide. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d’intérêt est un agent thérapeutique. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d’intérêt est un agent colorant ou un marqueur.
Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est une molécule immunogène. Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est capable d’induire une réaction immunitaire.
Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est un antigène associé au cancer ou un acide nucléique codant un antigène associé au cancer.
Dans un mode de réalisation préféré, la molécule immunogène comprise dans le liposome de l’invention est un antigène tumoral ou un acide nucléique codant un antigène tumoral. Selon un mode de réalisation, l’antigène tumoral peut être choisi parmi la liste non exhaustive comprenant: CDK4 (cyclin-dependent kinase 4), plS1 143, p53, AFP, β-caténine, caspase 8, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-IMUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLI, NY-ESO-I, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antigen) MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-IO, MAGE-12, BAGE, DAM-6, DAM-IO, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGEA, GAGEA, GAGE-6, GAGE-7B, GAGEA, NA-88A, CAG-3, l’antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MART-1/Melan-A, tyrosinase, TRP-I et TPR-2 (tyrosinase-related protein), PSA, PSM, MC1R, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, et WT1. Selon un mode de réalisation, l’antigène tumoral est choisi parmi la liste comprenant les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), MART-l/Melan-A. Selon un autre mode de réalisation, l’antigène tumoral est l’oncoprotéine E7 dérivée du HPV (human papilloma virus).
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention forme un lipoplexe comprenant au moins un composé de l’invention. En d’autres termes, dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un acide nucléique.
La préparation du lipoplexe de l’invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l’homme de l’art. Par exemple, le lipoplexe de l’invention peut être obtenu en ajoutant une solution d’acide nucléique à une préparation de liposomes selon l’invention.
Dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention forme un lipopolyplexe comprenant au moins un composé de l’invention. En d’autres termes, dans un mode de réalisation, le liposome de l’invention comprend au moins un acide nucléique complexé à un polycation.
La préparation du lipopolyplexe de l’invention pourra être effectuée par différentes méthodes bien connues de l’homme de l’art. Par exemple, le lipopolyplexe de l’invention peut être obtenu en mélangeant un acide nucléique complexé (polymère cationique) à une préparation de liposomes selon l’invention.
Selon un mode de réalisation, les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention sont dispersés dans une solution aqueuse. Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention sont dispersés dans du sérum physiologique ou dans du PBS.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également une solution aqueuse ou une dispersion comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également une émulsion comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention.
Dans un mode de réalisation, l’émulsion comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention est une émulsion huile dans eau, une émulsion eau dans huile ou une émulsion eau dans huile dans eau.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique de l’invention peut être formulée pour une administration orale, une administration topique ou une injection. La composition pharmaceutique de l’invention peut être, par exemple et de manière non exhaustive, une émulsion, un gel, une pommade ou des gouttes ophtalmiques.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également un adjuvant vaccinal comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne également un vaccin comprenant les liposomes, lipoplexes ou lipopolyplexes de l’invention comprenant eux-mêmes au moins une molécule immunogène, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l’invention peut être formulé sous différentes formes, incluant par exemple une solution, une dispersion ou une émulsion.
Dans le mode de réalisation selon lequel le vaccin de l’invention est formulé sous la forme d’émulsion, le vaccin comprend préférentiellement un ou plusieurs agent(s) surfactants.
Selon un mode de réalisation et pour améliorer sa conservation, le vaccin de l’invention peut être lyophilisé. Le vaccin de l’invention peut ainsi se présenter sous une forme lyophilisée. Dans ce mode de réalisation, le vaccin comprend un ou plusieurs agent(s) aidant à la lyophilisation. Les agents aidant à la lyophilisation sont bien connus de l’homme du métier. Ces agents aidant à la lyophilisation comprennent notamment des sucres comme le lactose et le mannitol.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l’invention peut comprendre un ou plusieurs agent(s) stabilisant(s), par exemple pour prolonger la durée de conservation du vaccin ou pour améliorer l’efficacité de la lyophilisation. Des exemples d’agents stabilisants incluent, de façon non exhaustive, SPGA (Sucrose-Phosphate-Glutamate-Albumin), des sucres comme le sorbitol, le mannitol, le tréhalose, l’amidon, le sucrose, le dextrane ou le glucose, des protéines comme l’albumine ou la caséine ou leurs produits de dégradation, des mélanges d’acides aminés tels que la lysine ou la glycine, et des tampons comme les phosphates de métal alcalin.
Dans un mode de réalisation, le vaccin de l’invention est administré au sujet par l’une des méthodes conventionnelles de vaccination incluant une injection, par exemple intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, ou sous-cutanée ; une administration topique, par exemple une application transdermique ou une application par pulvérisation intranasale ; ou une administration orale. Le vaccin de l’invention peut être administré en une dose unique ou en plusieurs doses.
Dans le mode de réalisation selon lequel le vaccin est injecté, la formulation à injecter peut se présenter sous la forme d’une solution ou dispersion stérile, ou d’une poudre lyophilisée stérile permettant la préparation extemporanée d’une solution ou dispersion injectable stérile. Pour prévenir toute contamination par des microorganismes, un ou plusieurs agent(s) préservateur(s) peuvent être ajoutés au vaccin comme par exemple des agents antibactériens et antifongiques tels que les parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l’acide sorbique, le thiomersal et d’autres agents similaires. H peut également être préférable d’ajouter au vaccin un ou plusieurs agent(s) isotonique(s) tels que des sucre ou du chlorure de sodium pour réduire la douleur provoquée par l’injection. Pour prolonger l’absorption d’un vaccin de l’invention injecté, un ou plusieurs agent(s) retardant l’absorption peuvent être ajoutés au vaccin comme par exemple le monostéarate d’aluminium ou la gélatine.
La présente invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la vectorisation, c’est-à-dire le transfert transmembranaire d’une molécule d’intérêt. La présente invention concerne donc également l’utilisation du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour la vectorisation, c’est-à-dire le transfert membranaire d’une molécule d’intérêt.
Selon un mode de réalisation la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de cellules.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la délivrance de prodrogues, de sensibilisateurs ou d’agent de visualisation.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la thérapie génique, les traitements topiques (dermatologie, ophtalmologie) ou cosmétiques ou des activités bactéricides. L’invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la vectorisation ciblée. La présente invention concerne donc également Γutilisation du liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour la vectorisation ciblée.
Selon un mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par un type de cellules particulier.
Dans un mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface une lectine. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface une lectine de type C. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les cellules exprimant à leur surface les lectines DC-SIGN (CD209), DEC205/CD205, langérine (CD207), CLEC9A, CLEC4D, CD40, et/ou le récepteur au mannose (MR).
Dans un mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les cellules présentatrices d’antigène. Dans un autre mode de réalisation, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les macrophages, les cellules dendritiques et/ou les cellules de Langerhans. Dans un mode de réalisation préféré, le composé de l’invention compris dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est reconnu et fixé par les cellules dendritiques.
Selon un mode de réalisation la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de cellules présentatrices d’antigène. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de macrophage, de cellules dendritiques et/ou de cellules de Langerhans. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de cellules dendritiques. L’invention concerne également un composé de l’invention, un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation en tant qu’adjuvant.
Dans un mode de réalisation, le composé de l’invention, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention a un effet adjuvant in vitro. Dans un mode de réalisation, le composé de l’invention, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention a un effet adjuvant in vivo. L’invention concerne également un composé de l’invention, un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation en tant qu’adjuvant vaccinal.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention administré à un sujet induit une réponse immunitaire chez le sujet. Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention administré à un sujet induit une réponse immunitaire chez le sujet qui ne dépend pas de la présence dans le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention d’une molécule d’intérêt immunogène. L’invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention pour son utilisation pour la vaccination. L’invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention comprenant au moins une molécule d’intérêt capable d’induire une réaction immunitaire pour son utilisation pour la vaccination. L’invention concerne également un liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe selon l’invention comprenant au moins une molécule d’intérêt capable d’induire une réaction immunitaire pour son utilisation en tant que vaccin.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est utilisé pour une vaccination préventive. Dans un autre mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est utilisé pour une vaccination thérapeutique.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est utilisé en tant que vaccin anti-cancer. Dans un mode de réalisation préféré, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention est utilisé pour une vaccination thérapeutique dans le traitement du cancer.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention utilisé en tant que vaccin anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique encodant un antigène tumoral. Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique encodant un antigène tumoral.
Dans un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique codant un antigène tumoral choisi dans la liste non exhaustive comprenant: CDK4 (cyclin-dependent kinase 4), plS1 143, AFP, β-caténine, caspase 8, p53, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLI, NY-ESO-I, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antigen) MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-IO, MAGE-12, BAGE, DAM-6, DAM-IO, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGEA, GAGEA, GAGE-6, GAGE-7B, GAGEA, NA-88A, CAG-3, l’antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MART-l/Melan-A, tyrosinase, TRP-I et TPR-2 (tyrosinase-related protein), PSA, PSM, MC1R, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, et WT1. Selon un mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins un antigène tumoral ou au moins un acide nucléique codant un antigène tumoral choisi parmi la liste comprenant les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), MART-l/Melan-A. Selon un autre mode de réalisation, le liposome, lipoplexe ou lipopolyplexe de l’invention utilisé pour une vaccination thérapeutique anti-cancer comprend au moins l’oncoprotéine E7 dérivée du HPV (human papilloma virus) ou au moins un acide nucléique codant l’oncoprotéine E7 ou un peptide de l’oncoprotéine E7.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 est un ensemble de graphiques montrant la fixation des lipopolyplexes LPR nus, LPR-MN ou LPR-triMN à des cellules exprimant des récepteurs de types lectines : (A) cellules 293T exprimant ou non le récepteur DC-SIGN ; (B) cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MoDCs) ; (C) cellules mononuclées humaines du sang (PBMCs) ; (D) cellules dendritiques humaines isolées du sang (panDCs).
Figure 2 est un ensemble de graphiques montrant la fixation des lipopolyplexes LPR-MN, LPR-MN diéther ou LPR-triMN à des cellules exprimant des récepteurs de types lectines : (A) cellules dendritiques murines DC 2.4 ; (B) splénocytes murins ; (C) cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MoDCs).
Figure 3A est un ensemble de graphiques montrant l’expression du marqueur d’activation CD80 par des cellules dendritiques MoDCs FITC- ou FITC+ après incubation en présence de concentrations croissantes de lipopolyplexes LPR-MN ou LPR-triMN. Les cellules LITC- n’ont pas capté les lipopolyplexes, les cellules LITC+ ont capté les lipopolyplexes.
Figure 3B est un histogramme montrant l’expression des marqueurs d’activation HLA-DR et CD83 par des cellules MoDCs ayant été incubées en présence de 2,5 pg/ml de LPR-MN ou LPR-triMN.
Figure 4A est un graphique montrant l’expression de la GFP par des cellules dendritiques MoDCs incubées à tO avec des lipopolyplexes LPR-MN contenant l’ARNm de la GFP puis à t6h avec des LPS (contrôle positif) ou des lipopolyplexes LPR-MN ou LPR-triMN contenant l’ARN contrôle PolyU simple brin (ssPolyU).
Figure 4B est un graphique montrant l’expression du marqueur d’activation CD80 par des cellules dendritiques MoDCs incubées à tO avec des LPR-MN contenant l’ARNm de la GFP puis à t6h avec des LPS (contrôle positif) ou des LPR-MN ou LPR-triMN contenant l’ARN contrôle PolyU simple brin (ssPolyU).
Figure 4C est un histogramme montrant l’expression des marqueurs d’activation CD80, CD83 et HLA-DR par des cellules dendritiques MoDCs incubées dans un premier temps avec des LPR-MN contenant l’ARNm de la GFP pendant 6h puis dans un second temps avec des LPS (contrôle positif) ou des LPR-MN ou LPR-triMN contenant l’ARN contrôle PolyU simple brin (ssPolyU) pendant 12h heures.
Figure 5A est un ensemble de photographies montrant les deux sites d’injection (indiqués par des flèches) au niveau du dos de souris ayant reçu 24h (1) et 48h (2) auparavant une injection de PBS, de lipopolyplexes LPR-MN ou de lipopolyplexes LPR-triMN.
Figure 5B est un ensemble de photographies montrant l’analyse microscopique après marquage hématoxyline-éosine d’une coupe de 10 pm de peau au niveau du site d’injection (point 48h) et du ganglion inguinal drainant les sites d’injection de souris ayant reçu 24h (1) et 48h (2) auparavant une injection de PBS, de LPR-MN ou de LPR-triMN.
Figure 6 est un ensemble de photographies montrant l’analyse par microscopie à fluorescence de ganglions poplités prélevés chez des souris ayant reçu 6h auparavant une injection de PBS, de LPR-MN ou de LPR-triMN marqués à la rhodamine. Le marqueur CD169 (anti-CD 169-APC) permet de visualiser les macrophages résidants du sinus sous-capsulaire ganglionnaire. Les LPR sont visualisés grâce à un marquage à la rhodamine. Le signal rhodamine colocalisé avec le signal CD 169 est indiqué par des astérisques (*). Le signal rhodamine localisé au niveau de cellules aux ramifications étendues n’exprimant pas CD169 (probablement des cellules dendritiques) est indiqué par des flèches.
Figure 7 est un ensemble de graphiques montrant : (A) la valeur absolue (nombre) et (B) le pourcentage relatif de cellules dendritiques ; et au sein de ces cellules dendritiques totales, (C) le pourcentage de cellules dendritiques activées (cellules Ly6C+) et (D) de cellules dendritiques inflammatoires (cellules LY6G+) présentes dans les ganglions drainants le site d’injection prélevés chez des souris ayant reçu 24h auparavant une injection de PBS, de LPR nus, de LPR nus diéther, de LPR-MN, ou de LPR-triMN.
Figure 8 est un ensemble d’histogrammes montrant le pourcentage de lymphocytes CD4+ (A) et CD8+ (B) exprimant l’interféron-y après une sensibilisation par des cellules dendritiques ayant incorporé les lipopolyplexes indiqués contenant l’ARNm de l’oncoprotéine E7 (LPR nus, LPR-MN ou LPR-triMN) suivie d’une stimulation par des cellules dendritiques préalablement chargées avec des peptides E7. En contrôle, l’ARNm est remplacé par un ARN PolyU simple brin (ssPolyU).
Figure 9 est un ensemble de graphiques montrant : (A) la sécrétion d’interféron-γ par des lymphocytes isolés de la rate de souris vaccinées par des LPR-triMN-E7/E7-DC-LAMP administrés par différentes voies (IV : intraveineuse, SC : sous-cutanée, ID : intradermique) ; (B) la sécrétion d’interféron-γ par des lymphocytes isolés de la rate de souris vaccinées à jour 0 et jour 2 avec une injection de PBS, ou de différents LPR (LPR nu, LPR nu diéther, LPR-MN, LPR-triMN) contenant l’ARNm de l’oncoprotéine E7.
Figure 10A est un ensemble de graphiques montrant le volume de la tumeur développée par des souris auxquelles ont été injectées 50000 cellules de la lignée tumorale syngénique TC-1 et qui ont ensuite été vaccinées par du PBS, des LPR-MN-ssPolyU, des LPR-MN-E7/E7-DC-LAMP, des LPR-triMN-ssPolyU ou des LPR-triMN-E7/E7-DC-LAMP. Chaque courbe correspond au volume de la tumeur développée par une souris. Les flèches indiquent les jours auxquels les souris ont été vaccinées (J7 et J9).
Figure 10B est un graphique représentant le taux de survie de ces souris.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Exemple 1 : Synthèse d’un lipide de l’invention tri-mannosylé
Matériels et Méthodes Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Spectromètres à transformée de Fourier BRUKER ARX 400 et BRUKER Avance 400 (400.13 MHz pour le proton, 100.61 MHz pour le carbone, ENSCR).
Les déplacements chimiques sont exprimés en partie par million (ppm) par rapport au déplacement chimique du solvant deutéré utilisé comme référence. La multiplicité des signaux est explicitée en utilisant les abréviations suivantes : s, singulet; d, doublet; t, triplet; q, quadruplet; m, multiplet ou massif non analysable. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz). Les données spectrométriques 13C ont été déterminées à partir de spectres entièrement découplés et de spectres corrélés 2D hétéronucléaires.
Spectrométrie de masse
Spectromètre de masse haute résolution MS/MS ZabSpec TOF Micromass (Centre Régional de Mesures Physiques de l'Ouest, Université de Rennes 1).
Le mode d'ionisation utilisé est l'Electrospray positif (SM-ESI+). La tension d'accélération des ions est de 4kV et la température de la source est égale à 60°C (mode d'introduction par infusion). Les composés sont dissous au préalable dans du méthanol ou dans du diméthylsulfoxide.
Abréviations
AcOEt : acétate d'éthyle DIEA : N,N’-diisopropyléthylamine
Eb : température d'ébullition EP : éther de pétrole
Et : éthyle
EtOH : éthanol HRMS : spectrométrie de masse haute résolution
Me : méthyle
MeOH : méthanol ppm : partie par million RMN : résonance magnétique nucléaire TBTU : tétrafluoroborate de O-(benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium TEMPO : 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-l-oxyle THF : tétrahydrofurane
Synthèse du ligand tri-mannosylé acide carboxylique (comportant un espaceur oligo(propylène glycol)n où n=2)
Etape 1 : Benzylation du pentaérythritol triallyl éther A une suspension d’hydrure de sodium NaH (2.6 g, 90 mmol) dans le DMF anhydre (100 mL), est ajouté goutte à goutte le pentaérythritol allyl éther (7.70 g ; 300 mmol) commercial préalablement purifié par colonne de chromatographie sur gel de silice (éluant cyclohexane/acétate d’éthyle : 9/1, v/v). Le milieu est agité 2 heures à 0°C puis du bromure de benzyle (7.7 g, 450 mmol) est ajouté goutte à goutte à cette température. Le milieu est laissé sous agitation à température ambiante pendant 17 heures puis du MeOH (6 mL) est ajouté goutte à goutte à 0°C. Les solvants sont évaporés sous vide à l’évaporateur rotatif puis à la pompe à palettes. Le résidu jaunâtre est repris dans du dichlorométhane puis est lavé à l’eau et par une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique est séchée sur MgSO4 et concentrée sous vide. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : EP/AcOEt) : 9/1, v/v) pour fournir le dérivé benzylé (10.45 g) sous la forme d’une huile incolore avec un rendement quantitatif.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 3.50 (6H, s, H3), 3.56 (2H, s, H2), 3.95 (6H, dt, J = 5.3, 1.5 Hz, H4), 4.65 (2H, s, Hl), 5.12 (3H, dq, J = 10.4, 1.7 Hz, H6a), 5.24 (3H, dq, J = 17.2, 1.7 Hz, H6b), 5.87 (3H, m, H5), 7.24-7.35 (7H, m, Har).
Etape 2 : Hydroboration-oxydation
Le composé triallyle (10 g, 28.8 mmol) est dissous dans 50 mL de dioxane anhydre. Le 9-BBN (0.5 M dans THF) (519 mL, 0.259 mol) est ajouté au milieu réactionnel préalablement refroidi à 0°C et le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. La soude 3 M (577 mL, 75 éq.) et le peroxyde d’hydrogène 10 Μ (115 mL 1.15 mol) sont ajoutés à 0°C au milieu réactionnel et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Le mélange est extrait 3 fois à Γ AcOEt puis la phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée, concentrée sous pression réduite et purifiée par chromatographie sur gel de silice (éluant AcOEt/EP/MeOH : 10/5/1) pour donner 9.57 g de triol sous la forme d’une huile incolore avec un rendement de 83%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 1.75 (6H, p, J = 5.5, 5.3 Hz, H5), 3.28 (3H, s.large, OH), 3.42 (6H, s, H3), 3.44 (2H, s, H2), 3.56 (6H, t, J = 5.5 Hz, H4), 3.70 (6H, t, J = 5.3 Hz, H6), 4.62 (2H, s, Hl), 7.24-7.35 (7H, m, Har).
Etape 3 : Allylation du triol
Le triol (7.8 g, 19.4 mmol) est dissous dans 100 mL de DMF anhydre et est ajouté goutte à goutte au milieu réactionnel contenant l’hydrure de potassium (3.9 g, 97 mmol) dans le
DMF préalablement refroidi à 0°C. Le mélange est agité 10 minutes à 0°C avant d’introduire goutte à goutte le bromure d’allyle (8.35 mL, 97 mmol). L’agitation est prolongée 24 heures à température ambiante et l’excès d’hydrure de potassium est hydrolysé avec 100 mL d’eau distillée. Le milieu réactionnel est extrait 3 fois à l’éther diéthylique puis la phase organique est lavée avec une solution saturée aqueuse de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée, concentrée sous pression réduite et purifiée par chromatographie sur gel de silice (éluant EP/AcOEt : 85/15) pour donner 8.63 g du produit triallyle sous la forme d’une huile incolore avec un rendement de 78 %.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 1.81 (6H, q, J = 6.4 Hz, H5), 3.40 (6H, s, H3), 3.44-3.50 (14H, m, H2, H4, H6), 3.95 (6H, ddd, J = 5.7, 1.5, H7), 4.48 (2H, s, Hl), 5.15 (3H, ddd, J = 10.3, 3.3, 1.5 Hz, H9b), 5.26 (3H, ddd, J = 17.3, 3.5, 1.5 Hz, H9a), 5.90 (3H, ddt, J = 10.3, 6,8, 5.7 Hz, H8), 7.24-7.35 (7H, m, Har).
Etape 4 : Hydroboration-oxydation A une solution du triallyle (7.9 g, 15 mmol) dissous dans 50 mL de dioxane anhydre est ajouté à 0°C le 9-BBN (0.5M dans THF) (272 mL, 0.136 mol) et le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. La soude 3M (500 mL, 1.5 mol) et le péroxyde d’hydrogène 35% aqueux (60 mL, 0,6 mol) sont ajoutés à 0°C au milieu réactionnel et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Le mélange est extrait 3 fois à l’AcOEt, séché sur MgSO4, filtré, concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant AcOEt/EP/MeOH : 10/5/1) pour donner 8.51 g de triol sous la forme d’une huile incolore avec un rendement de 99%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 1.79 (12H, p, J = 5.7 Hz, H8, H5), 2.62 (3H, s.large, OH), 3.42 (6H, s, H3), 3.49-3.43 (14H, m, H2, H4, H6), 3.55 (6H, t, J = 5.7 Hz, H7), 3.73 (6H, t, J = 5.4 Hz, H9), 4.64 (2H, s, Hl), 7.24-7.35 (7H, m, Har).
Etape 5 : Glycosylation du triol A une solution de trichloroacétimidate (10 g, 13.4 mmol) et de triol (1.03 g, 1.79 mmol) solubilisés dans 125 mL de CH2CI2 anhydre est ajoutée la solution à 5% dans le CH2C12 de TMSOTf (640 pL, 0.179 mmol) et le mélange est agité 12 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 2 g de bicarbonate de sodium à la réaction, le milieu réactionnel est filtré, le précipité est rincé plusieurs fois au CH2CI2 et le filtrat est concentré sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant EP/AcOEt : 6/4) pour donner 3.44 g de produit tri-mannosylé sous la forme d’une poudre jaune clair avec un rendement de 82%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : l. 77-1.84 (6H, m, J = 6.4 Hz, H5) , 1.91-2.00 (6H, m, H8), 3.41-3.57 (26H, m, H2, H3, H4, H6, H7), 3.57-3.68 (3H, m, H9b), 3.90-3.96 (3H, m, H9a), 4.40-4.50 (3H, m, H5’), 4.46-4.50 (5H, m, Hl, H6b’), 5.08 (3H, d, J=2.0 Hz, Hl’), 5.70 (3H, dd, J=3.2, 1.8 Hz, H2’), 5.91 (3H, dd, J=10.1, 3.3 Hz, H3’), 6.11 (3H, t, J+10.1 Hz, H4’), 7.24-8.11 (65H, m, Har).
Etage 6 : Débenzylation - oxydation A une solution de benzyl éther (3.44 g, 1.49 mmol) dissous dans 30 mL d’un mélange CH2Ch/MeOH (4/1) est ajoutée à température ambiante le Pd/C (340 mg, 10% en masse). Le milieu réactionnel est agité sous atmosphère d’hydrogène une nuit à température ambiante. Le milieu est dilué avec du CH2CI2, filtré sur celite puis concentré sous vide.
Le composé est ensuite purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant Cyclohexane/AcOEt: 6/4) pour donner 2.61 g d’alcool sous la forme d’une poudre blanche avec un rendement de 79%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 1.81 (6H, p, J = 6.4 Hz, H5), 1.93 (6H, p, J = 6.4 Hz, H8), 3.04 (1H, t, J = 6.1 Hz, OH), 3.43 (6H, s, H3), 3.47 (6H, t, J = 6.3 Hz, H6), 3.50 (6H, t, J = 6.5 Hz, H4), 3.55 (6H, m, H7), 3.68 (5H, m, H9a, H2), 3.91 (3H, dt, J = 9.7, 6.4 Hz, H9b), 4.39-4.43 (3H, m, H5’), 4.47 (3H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz, H6a’), 4.68 (3H, dd, J = 12.0, 2.4 Hz, H6b’), 5.07 (3H, d, J = 1.7 Hz, Hl’), 5.69 (3H, dd, J = 3.3, 1.7 Hz, H2’), 5.91 (3H, dd, J = 10.1, 3.3 Hz, H3’), 6.11 (3H, t, J = 10.1 Hz, H4’), 7.23-7.41 (20H, m, Har méta), 7.41-7.58 ( 20H, m, Har para), 7.82-8.08 (20H, m, Har ortho). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) : 29.69 (C8), 29.95 (C5), 44.81 (C3a), 62.84 (C6’), 65.56 (C9), 66.05 (C2), 66.94 (C4’), 67.37 (C7), 68.11 (C4), 68.67 (C6), 68.78 (C5’), 70.14 (C3’), 70.53 (C2’), 71.46 (C3), 97.61 (Cl’), 128.28 (CHar méta), 128.42 (CHar méta), 128.56 (CHar méta), 128.99 (Cqar), 129.09 (Cqar), 129.35 (Cqar), 129.72 (CHar ortho), 129.78 (CHar ortho), 129.83 (CHar ortho), 129.87 (Cqar), 133.03 (CHar para), 133.14 (CHar para), 133.41 (CHar para), 165.39 (ÇOPh), 165.44 (ÇOPh), 165.49 (ÇOPh), 166.13 (ÇOPh). A une solution de l’alcool (614 mg, 0.275 mmol) dissous dans 10 mL d’AcOEt, sont ajoutés 56 pL d’une solution aqueuse de KBr 0.5 M (0.028 mmol), le TEMPO (15 mg, 0.096 mmol), puis à 0°C, 1.2 mL de NaOCl (0.84 mmol). Après 3 heures à température ambiante, la réaction est arrêtée et acidifiée avec une solution aqueuse d’HCl à 5% (jusqu’à pH= 3), puis 560 pL de NaO2Cl (1.68 mmol) sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante (coloration jaune) puis il est extrait trois fois avec l’AcOEt. La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaCl,
séchée sur MgS04, filtrée puis concentrée sous vide pour donner 614 mg d’acide carboxylique sous la forme d’une poudre blanche avec un rendement de 99%.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 1.83 (6H, p, J = 6.3 Hz, H5), 1.96 (6H, p, J = 6.2 Hz, H8), 3.51 (6H, t, J = 6.3 Hz, H6), 3.53 (6H, t, J = 6.1 Hz, H4), 3,56 (6H, m, H7), 3.64 (6H, s, H3), 3,66 (3H, td, J = 9.7, 6.4 Hz, H9b), 3,94 (3H, td, J = 9.7, 6.4 Hz, H9a), 4,47-4,41 (3H, m, H5'), 4.49 (3H. dd. J = 12.0. 4.2 Hz, H6b), 4,71 (3H, dd, J = 12,0, 2.4 Hz. H6a), 5,10 (3H, d, J = 1.7 Hz, Hl'), 5,70 (3H, dd, J = 3.3, 1.7 Hz, H2'), 5,92 (3H, dd, J = 10.1, 3.3 Hz, H3'), 6,13 (3H, t, J = 10.0 Hz, H4'), 7,59-7,24 (36H, m, Har), 8,11-7,82 (24H, m, Har). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) : 29.60 (C8), 29.77 (C5), 52.86 (C3a), 60.34 (C2) 62.79 (C6'), 65.46 (C9), 66.85 (C4'), 67.31 (C7), 67.87 (C6), 68.59 (C4), , 68.73 (C5'), 69.07 (C3), 70.13 (C3'), 70.49 (C2'), 97.55 (Cl'), 128.24 (CHar), 128.38 (CHar), 128.52 (CHar), 128.92 (Cqar), 129.00 (Cqar), 129.27 (Cqar), 129.68 (CHar), 129.73 (CHar), 129.78 (CHar), 133.02 (CHar), 133.12 (CHar), 133.37 (CHar), 133.39 (CHar), 165.39 (ÇOPh), 165.42 (ÇOPh), 165.50 (ÇOPh), 166.15 (ÇOPh), 173.45 (ÇOOH).
Synthèse du lipide tri-mannosylé à partir du diéther acide carboxylique et du ligand tri-mannosylé acide carboxylique (espaceur oligo(propylène glycol)n où n=2 et un espaceur polyéthylène glycol (PEG)m où m=5)
Etage 7 : Introduction de la chaîne PEG sur le diéther de lipides acide carboxylique A un mélange du diéther de lipides acide carboxylique (291 mg, 0.831 mmol) et du TBTU (347 mg, 1.08 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (15 mL), est additionnée sous atmosphère d'argon la DIEA (188 pL, 1.08 mmol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes sous atmosphère d'azote. Une solution du N3-PEG350-NH2 (291 mg, 0.831 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (5 mL) est ajoutée sous atmosphère d'azote. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures sous atmosphère d'azote. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique IN est ajoutée et la phase organique (pH = 1) est lavée par de l'eau. Les phases organiques sont regroupées, séchées (MgSOfi, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur
colonne de silice (éluant CH2Cl2/MeOH : 98/2) pour isoler le produit de couplage azoture (700 mg, 89 %) sous la forme d’une huile incolore.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 0.83-0.87 (m, 18H, 6 CH3), 1.04-1.78 (m, 52H, 24 CH2, 4 CH), 3.37-3.40 (m, 2H, H-f), 3.41-3.50 (m, 4H, H-a, H-4), 3.53-3.57 (m, 4H, H-b, H-5), 3.58-3.69 (m, 23H, PEG, H-e, H-3a), 3.75-3.78 (m, 1H, Η-3β), 3.88-3.90 (dd, J = 2.51, 5.92 Hz, 1H, H-2), 7.02-7.05 (m, 1H, NHCO). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) : 14.10 (CH3), 19.58, 19.65, 19.72 (3 CH3), 22.60, 22.69 (2 CH3), 22.66, 24.36, 24.47, 24.78, 26.03 (5 CH2), 27.94, 29.84, 32.76, 32.78 (4 CH), 29.34, 29.46, 29.52, 29.63, 29.68, 31.89, 37.26, 37.36, 37.39, 37.45, 37.50, 39.32 (19 CH2), 38.67 (C-a), 50.63 (C-f), 69.72 (C-5), 69.83 (C-b), 70,3-70,7 (C-PEG, C-e), 71.47 (C-3), 71.68 (C-4), 80.48 (C-2), 170.57 (C-l).
Etape 8 : Réduction de la fonction azoture A une solution d'azoture (212 mg, 0.224 mmol) dans un mélange THF/H2O (25 mL, 1/1) est ajouté la triphénylphosphine (88 mg, 0.337 mmol) par portion. Le mélange est agité à température ambiante pendant 18 h. Après concentration sous pression réduite, le résidu est purifié sur chromatographie de gel de silice (CH2Cl2/MeOH : 9/1) pour isoler l'amine (164 mg, 80 %) sous la forme d’une huile jaune clair.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 0.82-0.88 (m, 18H, 6 CH3), 0.99-1.69 (m, 52H, 24 CH2, 4 CH), 3.16-3.18 (m, 2H, H-f), 3.39-3.49 (m, 4H, H-a, H-4), 3.54-3.57 (m, 4H, H-b, H-5), 3.59-3.70 (m, 18H, PEG),
3.72-3.75 (m, 3H, H-c, Η-3α), 3.76-3.77 (m, 1H, Η-3β), 3.87-3.90 (m, 3H, H-2, H-e), 7.04-7.06 (m, 1H, NHCO). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) : 14.10 (CH3), 19.58, 19.65, 19.72 (3 CH3), 22.61, 22.71 (2 CH3), 22.66, 24.34, 24.45, 24.76, 26.00 (5 CH2), 27.95, 29.77, 29.85, 32.79 (4 CH), 29.32, 29.45, 29.54, 20.61, 29.66, 31.88, 37.23, 37.34, 37.37, 37.43, 39.31 (19 CH2), 38.70 (C-a), 40.45 (C-f), 66.89 (C-e), 69.72-70.53 (C-PEG, C-5, C-b), 71.45 (C-3), 71.70 (C-4), 80.47 (C-2), 170.63 (C-1).
Etape 9 : Couplage entre le ligand tri-mannosylé acide carboxylique et le lipide amine A un mélange du le ligand tri-mannosylé acide carboxylique (575 mg, 0.257 mmol) et du TBTU (124 mg, 0.386 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (70 mL), est additionnée sous atmosphère d'argon la DIEA (112 pL, 0.643 mmol). Le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes sous atmosphère d'azote. Une solution du lipide amine (335 mg, 0.365 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (50 mL) est ajoutée sous atmosphère d'azote. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures sous atmosphère d'azote. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique IN est ajoutée (pH = 1) et la phase organique est lavée par de l'eau. Les phases organiques sont regroupées, séchées (MgSO4), filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant Cyclohexane/AcOEt :1:1+ 2% MeOH) pour isoler le produit de couplage azoture (500 mg, 62 %) sous la forme d’un solide translucide.
RMN Ή (CDC13, 400 MHz) δ (ppm) : 0.83-0.89 (m, 21H, CH3), 1-1.59 (m, 68H, chaînes alkyles), 1.79-1.86 (6H, q, H5), 1.93-1.99 (6H, q, H8), 3.40-3.68 (65H, m, H3, H4, H6, H7, H9b, Hia, Hj, Hl, HPEG), 3.75-
3.78 (m, 1H, Ch)3.88-3.95(4H, m, H9a, Hib), 4.40-4.44 (3H, m, H5’), 4.48 (3H, dd, J= 4.1, 12.0Hz, H6b’), 4.69 (3H, dd, J= 2.1, 12.1 Hz, H6a’), 5.09 (3H, d, J= 1.8 Hz, Hl’ ), 5.69 (3H, dd, J= 1.6, 3.4Hz, H2’), 5.91 (3H, dd, J= 3.2, 10.3Hz, H3’), 6.11 (3H, t, J= 10.3Hz, H4’), 7.24-8.11 (60H, m, Har). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ (ppm) : 14.12, 19.62 ,19.68, 19.75, 22.63, 22.69 (CH3), 22.72-29.56 (CH2), 29.65 (C8), 29.70 (C5), 29.74, 29.84( C5), 29.91 , 31.10, 31.43, 31.63, 31.92, 32.80, 53.03 (C3a), 60.40 (C2), 62.85 (C6’), 65.53 (C9), 66.91 (C4’), 67.36 (C7), 67.92 (C6), 68.61 (C4), 68.78 (C5’), 68.95 (C3), 70.15 (C3’), 70.55 (C2’), 80.53 (Ch), 97.64 (Cl’), 128.30 (CHar), 128.44 (CHar), 128.57 (CHar), 129.00 (Cqar), 129.10 (Cqar), 129.35 (Cqar), 129.73 (CHar), 129.79 (CHar), 129.84 (CHar), 129.88 (CHar), 133.05 (CHar), 133.16 (CHar), 133.43 (COPh),165.4 (COPh), 165.50 (COPh), 166.14 (COPh), 170.69 (CONH).
Etape 10 : Synthèse du lipide tri-mannosylé par déprotection des hydroxylés des motifs mannose A une solution du lipide tri-mannosylé sous forme benzoylé (435 mg, 0.139 mmol) dans un mélange CH2Ch/MeOH (100 mL, 1/1) est ajoutée une solution de MeONa dans le méthanol (5.3M, 48.8 pL, 0.258 mmol) fraîchement préparée. Le milieu réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Le mélange est neutralisé grâce à l’ajout de résine Amberlite IR-120 H+ et la résine est filtrée sur coton. Après évaporation des solvants sous pression réduite, un produit jaunâtre gris- pâle visqueux est isolé (255 mg, 97%) correspondant au lipide tri-mannosylé cible.
RMN Ή (MeOD+CDC13, 70/30, 400 MHz) δ (ppm) : 0.84-0.89 (m, 21H, CH3), 1.04-1.56 (m, 68H, chaînes alkyles), 1.79-1.84 (12H, m, H5, H8), 3.31-3.88 (88H, m, H3, H4, H6, H7, H9, Hi, Hj, Hl, Ch, H3’, H4’, H5’, H6’, HPEG), 4.74 (3H, s, ΗΓ), 7.55 (NH, s).
RMN 13C (MeOD+CDC13, 70/30, 100 MHz) δ (ppm) : 13.66, 19.26, 19.30, 19.33, 19.37, 19.40, 19.44, 22.22, 22.31, 22.50, 24.24, 24.31, 24.65, 25.92, 27.83, 29.21, 29.32, 29.39; 29.48, 29.50, 29.53, 29.64, 29.68, 29.72, 31.27, 31.78, 32.62, 32.64, 32.67, 36.59, 36.65, 36.72, 37.13, 37.23, 37.25, 37.30, 37.36, 37.39, 38.67, 38.95, 39.25, 52.25, 61.45, 64.22, 67.06, 67.52, 67.69, 68.41, 69.43, 69.48, 69.53, 69.61, 70.09, 70.11, 70.23, 70.33, 70.35, 70.37, 70.70, 71.11, 71.15, 71.33, 71.65, 72.56, 80.34, 80.29, 100.08 (Cl’), 171.49 (CONH), 173.69 (CONH). HRMS C194HH82N2O34 : [M+Na]+: m/z théorique = 1906.24662, mesuré = 1906.2448
Exemple 2 : Préparation de liposomes et de lipopolyplexes (LPR) selon l’invention comprenant des lipides tri-mannosylés (LPR-triMN)
Lipides utilisés pour la préparation des différents liposomes le lipide KLN25 (O,O-dioléyl-N-[3N-(Nméthylimidazoliumbromure)propylène] phosphoramidate) de formule :
décrit par Mével et al. (Mével et al. (2008) Synthesis and Transfection Activity of New Cationic Phosphoramidate Lipids: High efficiency of an Imidazolium dérivative. ChemBioChem. 9, 1462-1471) ; le lipide MM27 (0,0-dioléyl (-N-(histamine)phosphoramidate) de formule :
décrit par Mével et al. (Mével et al. (2008) Novel neutral imidazole-lipophosphoramides for transfection assays. Chem. Comm. 21:3124-3126) ; le l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5u-glycérol (diéther de lipides possédant une fonction acide carboxylique) de formule :
le lipide mono-mannosylé (β-D-mannopyranosyl-N-dodecylhexadecanamide) de formule :
décrit par Perche et al. (Perche et al. (2011) Sélective gene delivery in dendritic cells with Mannosylated and Histidylated Lipopolyplexes. J Drug Targeting. 19: 315-325) ; le lipide marqué avec la fluorescéine (Lip-Flu) de formule :
décrit par Berchel et al. (Berchel et al. (2011) Modular Construction of Fluorescent Lipophosphoramidates by Click Chemistry. Eur. J. Org. Chem 31: 6294-6303) ; le lipide marqué avec la rhodamine (Lip-Rho) de formule :
décrit par Berchel et al. (Berchel et al. (2011) Modular Construction of Fluorescent Lipophosphoramidates by Click Chemistry. Eur. J. Org. Chem 31: 6294-6303).
Liposomes
Les liposomes sont préparés selon la méthode d’hydratation d’un film lipidique sec et dialysés contre un tampon HEPES 10 mM, pH 7,4 (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Methods Mol Biol. 969:247-74).
Les compositions des liposomes utilisés sont : liposomes nus : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25 et MM27 à 50%-50% ; liposomes diéther ou liposomes nus diéther: liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27 et de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol (diéther de lipides) à 47,5% - 47,5% - 5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés (MN) : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27 et lipide mono-mannosylé (β-D-mannopyranosyl-N-dodecylhexadecanamide) à 47,5% - 47,5% - 5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés diéther : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé et de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol (diéther de lipides) à 45% - 45% - 5% - 5% respectivement ; liposomes tri-mannosylés (triMN) : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27 et lipides tri-mannosylé de l’invention (dont la synthèse est décrite dans l’exemple 1) à 47,5% - 47,5% - 5% respectivement.
Les compositions des liposomes fluorescents utilisés sont : liposomes nu-Flu : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27 et Lip-Flu à 49,75% - 49,75% - 0,5% respectivement ; liposomes nu-Rho : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27 et Lip-Rho à 49,75% - 49,75% - 0,5% respectivement ; liposomes diéther-Flu : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol et Lip-Flu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes diéther-Rho : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol et Lip-Rho à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés Flu : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé (β-D-mannopyranosyl-N-dodecylhexadecanamide) et Lip-Flu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés Rho: liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé et Lip-Rho à 47,25% - 47,25% - 5% -0,5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés diéther Flu: liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol et Lip-Flu à 44,75% - 44,75% - 5% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes mono-mannosylés diéther Rho: liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipide mono-mannosylé, de l-O-carboxyl-2-O-Phytanyl-3-O-hexadecane-5n-glycérol et Lip-Rho à 44,75% - 44,75% - 5% - 5% - 0,5% respectivement ; liposomes tri-mannosylés Flu : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipides tri-mannosylé de l’invention (dont la synthèse est décrite dans l’exemple 1) et Lip-Flu à 47,25% - 47,25% - 5% - 0.5% respectivement ; liposomes tri-mannosylés Rho : liposomes constitués d’un mélange de lipides KLN25, MM27, lipides tri-mannosylé de l’invention et Lip-Rho à 47,25% -47,25% - 5% - 0.5% respectivement.
Polymère cationique L’ARNm a été complexé avec la polylysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa (PEG-HpK) dont la synthèse est décrite dans (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Methods Mol Biol. 969:247-74).
Lipopolyplexes (LPR)
Les différents LPR sont préparés selon la méthode décrite dans (Pichon C, Midoux P. (2013) Mannosylated and Histidylated LPR Technology for Vaccination with Tumor Antigen mRNA. Methods Mol Biol. 969:247-74).
En particulier, pour une transfection in vitro, les LPR sont obtenus de la manière suivante. Brièvement, 15 pg de PEG-HpK (dans 10 pL de tampon 10 mM HEPES pH 7,4) sont d’abord ajoutés à l’ARNm (5 pg dans 25 pL de tampon 10 mM HEPES pH 7,4). L’ensemble est vortexé pendant 4 sec puis laissé au repos pendant 30 min à 20°C. Les LPR sont ensuite formés en ajoutant 10 pg de liposomes (5 pL à 5,4 mM dans 10 mM HEPES buffer, pH 7,4) en agitant la solution par pipetage aller-retour. La solution est laissée au repos pendant 15 minutes at 20°C avant usage. Pour la transfection in vitro, le volume de solution est ajusté à 1 ml avec du milieu sans sérum.
Pour une injection in vivo, les LPR sont obtenus en ajoutant préalablement 50 pl (50 pg) d’ARNm dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 160 pl de tampon HEPES 10 mM àpH 7,4 stérile préparé dans de l'eau sans endonucléase. 100 pl (150 pg) de la solution de PEG-HpK sont ensuite ajoutés et mélangés 4 secondes. Après 30 min à 20°C, 50 pL de liposomes (100 pg dans tampon HEPES 10 mM à pH 7,4 stérile préparé dans de l'eau sans endonucléase) sont ajoutés au complexe polymère/ARNm et mélangés doucement par pipetage. La solution est laissée au repos pendant 15 min à 20°C. Pour l’injection in vivo, la solution est ajustée à une concentration finale en saccharose de 5% en ajoutant 40 pl d'une solution de saccharose à 50% préparée dans de l’eau sans endonucléase. Les souris sont injectées avec 100 pl de solution.
Sauf indication contraire, les lipopolyplexes (appelés LPR) utilisés dans les expériences décrites contiennent l’ARN contrôle PolyU simple brin (ssPolyU).
Les différents LPR (LPR nus, LPR diéther ou LPR nus diéther, LPR-MN, LPR-MN diéther, LPR-triMN) sont obtenus en mélangeant les liposomes correspondants (liposomes nus, liposomes diéther ou liposomes nus diéther, liposomes MN, liposomes MN diéther, liposomes triMN) avec un polymère cationique (ARN complexé avec la polylysine partiellement histidinylée et comportant une molécule de PEG 5kDa).
Exemple 3 : Utilisation biologique des liposomes de l’invention
Matériel et Méthodes
Lignées cellulaires
La lignée cellulaire 293T est une lignée cellulaire dérivant de cellules embryonnaires humaines rénales transformées.
La lignée cellulaire 293T DC-SIGN correspond à des cellules 293T génétiquement modifiées pour exprimer DC-SIGN, une lectine de type C.
Les cellules MoDCs sont des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes.
Les cellules PBMCs sont des cellules mononuclées du sang.
Les cellules panDCs sont des cellules dendritiques humaines identifiées au sein des autres cellules du sang périphérique (PBMCs). ELISpot Interféron-γ
La sécrétion d’interféron-γ par les lymphocytes T provenant de la rate (splénocytes) est analysée à l’aide du kit IFN-γ ELISpotPLUS (Mabtech, Suède). Brièvement les splénocytes à analyser sont incubés dans une plaque ELISpot en présence de l’antigène E749-57 ou de concanavaline A (contrôle positif) ou de milieu de culture (contrôle négatif). L’interféron-γ secrété est capturé par des anticorps fixés à la plaque. Après une incubation de 36h à 37°C, la plaque est lavée et les cellules sont retirées. La plaque est ensuite incubée avec un anticorps biotinylé dirigé contre 1’interféron-γ puis avec de la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline. La présence de spots correspondant à une sécrétion d’interféron-γ est révélée après incubation avec le tampon de réaction BCIP/NBT. Les spots sont analysés par un lecteur de plaque ELISpot.
Les LPR-triMN ciblent les cellules exprimant des récepteurs de type lectines
Dans une première expérience, différentes lignées cellulaires ont été incubées avec différentes concentrations de lipopolyplexes nus (LPR), de lipopolyplexes mono- mannosylés (LPR-MN) ou de lipopolyplexes tri-mannosylés (LPR-triMN). Les lipopolyplexes comprennent tous un lipide fluorescent couplé à la fluorescéine. Les lignées cellulaires testées expriment à leur surface des lectines de type C, capables de fixer des résidus sucrés mannose, galactose ou fucose. La fixation des lipopolyplexes sur ces récepteurs est analysée par cytométrie de flux. Les lipopolyplexes tri-mannosylés ciblent les cellules 293T DCSign (figure IA), les cellules MoDCs (figure IB), les cellules PBMCs (figure IC) et les cellules panDCs parmi les PBMCs (figure 1D). Dans une moindre mesure, les lipopolyplexes mono-mannosylés (LPR-MN) sont également capables de se fixer sur ces cellules (figure 1). Les lipopolyplexes nus ne comprennent pas de lipides possédant un groupe mannose et ne ciblent aucune de ces cellules quelle que soit la concentration de lipopolyplexes testée (figure 1).
Dans une deuxième expérience, trois lignées cellulaires différentes ont été incubées avec des concentrations croissantes de lipopolyplexes mono-mannosylés (LPR-MN), de lipopolyplexes mono-mannosylés diéther (LPR-MN diéther) et de lipopolyplexes tri-mannosylés (LPR-triMN). La figure 2 montre que les LPR-MN et LPR-MN diéther ciblent de manière identique les cellules dendritiques d’une lignée murine, les splénocytes murins et les cellules MoDCs. Les LPR-triMN se fixent à ces trois types de cellules de manière significativement plus importante, même à une faible concentration (1,25 pg/ml).
La présence de lipides tri-mannosylés de l’invention confère donc aux lipopolyplexes LPR-triMN la capacité de se fixer aux cellules exprimant des récepteurs de type lectines. Cette propriété est spécifique aux lipopolyplexes tri-mannosylés de l’invention, et des lipopolyplexes comprenant des lipides mono-mannosylés (LPR-MN) ou des lipides mono-mannosylés et des lipides diéther (LPR-MN diéther) possèdent une capacité de fixation réduite.
Les LPR-triMN activent les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques MoDCs sont mises en culture en présence de LPS ou de doses croissantes de LPR-MN ou LPR-triMN comprenant des lipides marqués à la fluorescéine pendant 6h. L’analyse par cytométrie permet d’identifier les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR. Par ailleurs l’expression des marqueurs d’activation HLA-DR, CD80 et CD83 est également mesurée.
Les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR-MN n’expriment pas de marqueurs d’activation de manière significative par rapport au contrôle d’activation LPS (figures 3A et 3B). Les cellules MoDCs fluorescentes ayant capté les LPR-triMN expriment les marqueurs d’activation HLA-DR, CD80 et CD83 de manière dose dépendante (figure 3A) et significative par rapport au contrôle d’activation LPS (figure 3B).
La présence de lipides tri-mannosylés de l’invention confère donc aux LPR-triMN la propriété intrinsèque d’activer les cellules dendritiques auxquelles ils se fixent. Les cellules dendritiques activées exprimant des molécules de co-stimulation telles que CD80 permettent à leur tour l’activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+. Les LPR-triMN sont donc capables de stimuler une réponse immunitaire alors mêmes qu’ils ne contiennent pas de molécule d’intérêt immunogène.
Les LPR-triMN ont un effet adjuvant
Dans un premier temps, les cellules dendritiques MoDCs sont mises en culture en présence de LPR-MN contenant de l’ARNm GFP pendant 6h. Au bout de ces 6h, les cellules MoDCs sont mises en contact 12h supplémentaires avec soit des LPS (contrôle positif d’activation des MoDCs), soit des LPR-MN ou des LPR-triMN. Les lipopolyplexes utilisés pour cette seconde stimulation ne contiennent pas d’ARN codant mais contiennent de l’ARN PolyU simple brin (ssPolyU). L’expression de la GFP et des marqueurs d’activation HLA-DR, CD80 et CD83 est mesurée par cytométrie au bout de 18h de culture au total.
La figure 4 montre que la première incubation des cellules MoDCs avec des LPR-MN induit l’expression de GFP. L’incubation secondaire des mêmes cellules avec des LPS ou des LPR-triMN ssPolyU fait chuter le niveau d’expression de la GFP (figure 4A) et induit l’expression des marqueurs d’activation CD80 (figure 4B), CD83 et HLA-DR (figure 4C). L’ addition de LPR-MN n’induit pas d’activation des cellules dendritiques, ces dernières continuent à exprimer la GFP de manière prolongée. L’incubation de cellules dendritiques avec des LPR-triMN ssPolyU permet d’induire l’activation de ces cellules. Cette expérience confirme que les LPR-triMN possèdent un effet adjuvant conféré par la présence des lipides tri-mannosylés.
Les LPR-triMN ont un effet adjuvant in vivo
Dans une première expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique avec du PBS, des LPR-MN ou des LPR-triMN. La figure 5A montre que l’injection de LPR-triMN induit une réaction inflammatoire locale au niveau du site de l’injection. L’analyse microscopique du site de l’injection (figure 5B) montre que l’injection de LPR-triMN induit une augmentation de volume des ganglions lymphatiques drainants inguinaux.
Dans une seconde expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique au niveau de la voûte plantaire avec du PBS, des LPR-MN ou des LPR-triMN comprenant un lipide marqué à la rhodamine. Les ganglions drainants poplités des souris ont été prélevés 6h après l’injection puis marqués par un anticorps anti-CD169 (siglec-1). L’analyse par microscopie à fluorescence permet ainsi de visualiser la localisation des LPR (signal rhodamine) et des macrophages du sinus sous-capsulaire (signal CD169+). La figure 6 montre que les LPR nus, LPR-MN et LPR-triMN, sont détectables dans les ganglions poplités, au niveau de la zone corticale où se situent également des cellules dendritiques (non marquées). Une partie des LPR-triMN est également détectable dans des zones non marquées par CD 169 ce qui indique que d’autres cellules peuvent capter les LPR-triMN. H est à noter que les cellules dendritiques sont retrouvées dans toutes les zones ganglionnaires.
Enfin dans une troisième expérience, des souris ont été injectées par voie intradermique au niveau de la voûte plantaire avec du PBS, des LPR nus, des LPR nus diéther, des LPR-MN ou des LPR-triMN. Les ganglions poplités des souris ont été prélevés 24h après l’injection. La présence dans les ganglions drainants poplités de cellules dendritiques (DCs), et plus particulièrement de cellules dendritiques activées exprimant le marqueur
Ly6C (cellules Ly6C+) ou Ly6G (cellules Ly6G+), a été analysée par cytométrie de flux. La figure 7 montre que l’injection de LPR-triMN induit non seulement une augmentation significative du nombre et du pourcentage de cellules dendritiques (figures 7A et 7B) mais également du pourcentage de cellules dendritiques activées (figure 7C) et inflammatoires (figure 7D) parmi les cellules dendritiques contenues dans les ganglions drainants des souris injectées. Le nombre de cellules dendritiques, activées ou non, n’est pas significativement modifié après l’injection de LPR nus, de LPR nus diéther ou de LPR-MN par rapport au contrôle (PBS). L’ensemble de ces expériences montre que les LPR-triMN comprenant le lipide tri-mannosylé de l’invention peuvent induire une réaction immunitaire (recrutement et activation des cellules dendritiques dans les ganglions drainants le site d’injection) quand ils sont injectés à des souris. Dans ces expériences, les LPR-triMN contiennent de l’ARN PolyU simple brin (ssPolyU) et ne servent pas de vecteur pour l’introduction de molécules d’intérêt immunogènes. Ces expériences démontrent que les lipopolyplexes triMN possèdent un effet adjuvant intrinsèque in vivo.
Les LPR-triMN induisent une meilleure réponse T spécifique in vitro chez l’Homme
Des cellules dendritiques MoDCs issues de donneurs HLA-A2 ont été incubées pendant 24h avec des LPR nus, des LPR-MN ou des LPR-triMN contenant l’ARNm de l’oncoprotéine E7 du virus HPV16 (ARNm E7) ou l’ARN non-codant PolyU simple brin (ssPolyU). Les cellules MoDCs ont ensuite été utilisées pour sensibiliser des lymphocytes T CD3+ autologues en co-culture pendant 3 jours. Après 3 jours de co-culture les lymphocytes T ont été placés dans un milieu enrichi en IL-7 et IL-15. A J7, les lymphocytes T sensibilisés ont été remis en présence de MoDCs préalablement chargées avec des peptides E7 restreints à HLA-A2 (allèle HLA2) pendant 16h. Linalement l’exocytose a été inhibée pendant 4h avant la réalisation d’un marquage intracellulaire de l’interféron-γ (INF-γ) analysé par cytométrie. Une détection de l’expression des marqueurs membranaires CD3, CD4 et CD8 a également été réalisée.
La figure 8 montre que les LPR-triMN ne contenant pas d’ARN codant induisent une sécrétion d’INF-γ chez les lymphocytes CD4+ (figure 8A) et les lymphocytes CD8+ (figure 8B) légèrement supérieure à celle induite par les LPR nus. Cette observation confirme l’effet adjuvant intrinsèque des LPR-triMN. Les LPR-triMN contenant l’ARNm E7 sont capables d’induire une sécrétion d’INL-γ chez les lymphocytes CD4+ (figure 8A) et les lymphocytes CD8+ (figure 8B) significativement supérieure à celle induite par les LPR nus ou les LPR-MN. Les LPR-MN n’induisent qu’une faible sécrétion d’INF-γ, qu’ils contiennent l’ARN ssPolyU ou l’ARNm E7.
Cette expérience montre donc que les LPR-triMN, utilisés en tant que vecteur pour la vaccination « anti-E7 », sont capables d’induire une réaction spécifique « anti-T7 ».
Les LPR-triMN induisent une meilleure réponse immunitaire in vivo
Des expériences de vaccination de souris ont été réalisées avec des lipopolyplexes contenant l’ARNm codant l’oncoprotéine E7 du virus HPV16. Ces souris ont été vaccinées par un mélange équimolaire de LPR-E7 et de LPR-E7-DC-LAMP ce qui permet d’obtenir une meilleure réponse à la vaccination (Mockey et al. (2007) mRNA-based cancer vaccine: Prévention of B16 melanoma progression and metastasis by systemic injection of MARTI mRNA histidylated lipopolyplexes. Cancer Gene Therapy 14, 802-814). En effet DC-LAMP est une glycoprotéine de la membrane des lysosomes et des endosomes tardifs, qui joue un rôle dans le chargement des peptides sur le CMH-II, permettant d’induire activement des réponses Thl. L’utilisation d’une séquence d’acide nucléique chimérique (par fusion de la séquence codant E7 et de la séquence codant DC-LAMP) permet d’orienter E7 vers la voie du CMH-II et d’améliorer la réponse immunitaire.
Des LPR contenant de l’ARN non-codant polyU simple brin (ssPolyU) ont été utilisés comme contrôle. Les injections ont été réalisées à JO, J7 et J15. A J21 les souris ont été sacrifiées et leurs rates prélevées. Les splénocytes ainsi isolés ont été incubés en présence de peptides E7 et leur sécrétion d’INF-γ a été analysée par ELISpot. Différents modes de vaccination ont été comparés. Des groupes de 5 souris ont ainsi été vaccinés avec 21 pg de LPR-triMN-ssPolyU (contrôle) par voie intraveineuse ou avec LPR-triMN-E7/E7-DC-LAMP : 21 pg en intraveineuse, 7 pg en intradermique ou 7 pg en sous-cutanée. La figure 9A montre que les vaccinations par voie intraveineuse ou intradermique induisent une réponse immunitaire spécifique à l’antigène E7 significative chez les souris vaccinées. La voie intradermique semble cependant plus efficace et plus avantageuse car elle induit une réponse immunitaire d’intensité équivalente à celle induite par voie intraveineuse, mais après injection de 7 pg de LPR contre 21 pg en voie intraveineuse. Des expériences similaires ont été réalisées pour comparer l’effet induit par l’injection de différents LPR. Des souris ont été vaccinées à JO et J2 avec du PBS (contrôle) ou différents LPR (LPR nu, LPR nu diéther, LPR-MN diéther, LPR-triMN) contenant l’ARNm E7. A J14 les souris ont été sacrifiées et leurs rates prélevées. Les splénocytes ainsi isolés ont été incubés en présence de peptides E7 et leur sécrétion d’INF-γ a été analysée par ELISpot. La figure 9B montre que les LPR-triMN induisent une réponse T spécifique significativement supérieure à celle induite par les LPR-MN diéther. L’injection de LPR nus ou de LPR diéther (LPR nus diéther) n’induit pas de réponse T spécifique significative par rapport au contrôle (PBS).
Les LPR-triMN sont donc des vecteurs de vaccination efficaces pour l’induction d’une réponse T spécifique à un antigène d’intérêt chez les sujets vaccinés.
Les LPR-triMN ont un effet vaccinal thérapeutique dans un modèle murin de cancer HPV-induit L’effet thérapeutique d’une vaccination avec des LPR-E7 a été évalué chez des groupes de 5 souris auxquelles ont été administrées 50000 cellules de la lignée tumorale syngénique TC-1 par injection intradermique en position ectopique (flanc gauche). Ces cellules tumorales expriment l’oncoprotéine E7.
Les souris ont ensuite reçu deux injections intradermiques (7 jours et 9 jours après l’inoculation des cellules tumorales) de PBS (contrôle négatif) ou de 7 pg de : LPR-MN-ssPolyU, LPR-MN-E7/E7-DC-LAMP, LPR-triMN-ssPolyU ou de LPR-triMN-E7/ E7-DC-LAMP.
La croissance tumorale a été évaluée tous les 2 jours par mesure au pied à coulisse, selon la formule (Lxl2)/2. Les animaux dont le volume tumoral devient critique (>2000 mm2) ont été sacrifiés.
La figure 10A montre qu’après 4 mois, 5 des 9 souris vaccinées avec LPR-triMN-E7/ E7-DC-LAMP sont toujours en vie sans avoir développé de tumeur. Après 4 mois, 3 des 10 souris vaccinées avec LPR-triMN-ssPolyU, ne contenant pas d’ARNm codant, sont également toujours en vie sans avoir développé de tumeur. Leur survie est vraisemblablement attribuable à l’effet adjuvant des LPR-triMN qui peuvent en effet stimuler la réponse immunitaire des souris vaccinées. Après 4 mois, 3 des 9 souris vaccinées avec LPR-MN-E7/ E7-DC-LAMP sont toujours en vie sans avoir développé de tumeur. L’injection de PBS ou de LPR-MN-ssPolyU n’a pas d’effet thérapeutique. La figure 10B permet de comparer la survie des souris vaccinées avec différents LPR. L’utilisation de LPR-triMN pour la vaccination contre un antigène exprimé par les cellules tumorales a un effet thérapeutique significatif et prévient la formation de tumeurs chez plus de la moitié des souris vaccinées.
Claims (14)
- REVENDICATIONS1. Un composé de formule I :dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 5 à 20 ; Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :dans lequel R2 et R2’ sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose, les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose, les glycanes terminés par un mannose, les glycanes terminés par un fucose, le trisaccharide 3’-sulfo-Lewis a, le trisaccharide Lewis b (Leb), le trisaccharide Lewis x (Lex), le tri N-acétylglucosamine(tri-GlcNAc), les PIMs (phosphatidylinositol mannosides), en particulier les PIMi à PIMe (phosphatidylinositol mono- à hexa-mannoside), l’oligosaccharide Man9GlcNAc2, les oligosaccharides N-liés riches en mannose, l’oligosaccharide ct-fucose-l-4GlcNAc, l’oligosaccharide lacto-N-fucopentaose III contenant le trisaccharide Lex, l’oligosaccharide GlcNAc2 Man 3, les oligosaccharides Man 4, l’oligosaccharide Manal-3(Manal-6)Manal, les lipoarabinomannanes (LAMs), les lipoarabinomannanes mannosylés (ManLAMs) ; d représente un nombre entier de 0 à 5 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ; sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
- 2. Le composé selon la revendication 1 de formule I :dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 5 à 20 ; Ri, Ri’ et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H, ou un groupement du type :dans lequel R2 et R? sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou un résidu sucre choisi parmi la liste comprenant le mannose, le glucose, le fucose et les oligomannoses comprenant de 2 à 10 unités mannose ; sous réserve que le nombre total de résidus sucre dans les groupements Ri, Ri’ et Ri” soit compris entre 2 et 5 ; d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2 ; sous réserve qu’au moins un des groupements R2 et R2’ soit différent de H et que R2 soit différent de H lorsque R2’ est absent ; sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
- 3. Le composé selon la revendication 1 de formule I :dans laquelle : a représente un nombre entier de 1 à 9 ; b représente un nombre entier de 1 à 3 ; c représente un nombre entier de 5 à 20 ; Ri, Ri* et Ri” sont identiques ou différents, représentent chacun indépendamment un H ou le groupement :dans lequel d représente un nombre entier de 0 à 5 ; dans lequel R2 et R2’ représentent le groupement :sous réserve qu’au moins un des groupements Ri, Ri’ et Ri” soit différent de H.
- 4. Le composé selon la revendication 1 de formule II :dans laquelle : c représente un nombre entier de 5 à 20 ; d représente un nombre entier de 1 à 5, préférentiellement 2.
- 5. Le composé selon la revendication 4 de formule II :dans laquelle : c représente 5 ; d représente 2.
- 6. Un liposome comprenant le composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans des proportions comprises d’environ 1% à environ 15%, préférentiellement d’environ 2% à environ 10%, plus préférentiellement d’environ 5%.
- 7. Le liposome selon la revendication 6 comprenant en outre au moins une molécule d’intérêt.
- 8. Le liposome selon la revendication 7, dans lequel ladite molécule d’intérêt est capable d’induire une réaction immunitaire.
- 9. Le liposome selon les revendications 7 ou 8, dans lequel ladite molécule d’intérêt est un acide nucléique.
- 10. Le liposome selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ladite molécule d’intérêt est un antigène associé au cancer sélectionné dans le groupe comprenant : CDK4 (cyclin-dependent kinase 4), plSl"l'4'3, p53, AFP, β-caténine, caspase 8, versions mutées de p21Ras, chimère Bcr-abl, MUM-I, MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, myosin/m, 707-AP, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RARaTEL/AMLI, NY-ESO-I, les membres de la famille MAGE (Melanoma-associated antigen)•MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-10, MAGE-
- 12, B AGE, DAM-6, DAM-10, les membres de la famille GAGE (G antigen) GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, NA-88A, CAG-3, l’antigène associé à RCC G250, les oncoprotéines E6 et E7 dérivées du HPV (human papilloma virus), les antigènes EBNA2-6 du virus Epstein Barr, LMP-I, LMP-2, gp77, gplOO, MART-l/Melan-A, tyrosinase, TRP-I et TPR-2 (tyrosinase-related protein), PSA, PSM, MC1R, ART4, CAMEL, CEA, CypB, HER2/neu, hTERT, hTRT, iCE, Mucl, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-I, SART-2, SART-3, et WT1 ou un acide nucléique codant ledit antigène associé au cancer.11. Le composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour son utilisation en tant qu’adjuvant vaccinal.12. Le liposome selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 pour son utilisation en tant qu’adjuvant vaccinal.
- 13. Le liposome selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 pour son utilisation en tant que vaccin, de préférence en tant que vaccin anti-cancer.
- 14. Une composition pharmaceutique comprenant le composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
- 15. Une composition pharmaceutique comprenant le liposome selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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