DE69632068T2

DE69632068T2 - Transfektionsverfahren mit hilfe von liposomen

Info

Publication number: DE69632068T2
Application number: DE69632068T
Authority: DE
Inventors: Paavo Kai J Kinnunen; Tommi Paukku; Satu Lauraeus; Ilpo Huhtaniemi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-11-21
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2016-11-21
Also published as: AU7574996A; EP0871758A1; EP0871758B1; DE69632068D1; WO1997019184A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transfektion einer Zelle mit einer Nucleinsäure wie DNA unter Verwendung einer Liposomenzusammensetzung, umfassend ein Sphingosinderivat mit einer protonierten Aminogruppe in der Sphingosineinheit, als Transfektionsvektor. Die protonierte Aminogruppe sorgt für den erforderlichen kationischen Charakter des Liposoms für die Bildung eines Komplexes mit der negativ geladenen Nucleinsäure. Gemäß der Erfindung wurde gezeigt, daß die Sphingosin enthaltende Liposomenzusammensetzung, die mit einer Nucleinsäure wie DNA vorinkubiert worden war, die getesteten Zelllinien wirksam transfizierte.
Hintergrund der Erfindung
Liposomen werden häufig zur Arzneistofffreisetzung und zur Übertragung einer fremden DNA in Säugerzellen verwendet und weisen in dieser Hinsicht mehrere Vorteile auf. Solche Vorteile sind die einfache Herstellung, die kommerzielle Verfügbarkeit, die Fähigkeit, spezifische Zellen oder Gewebe zielgerecht anzugehen, und eine hohe Transfektionseffizienz. Kationische Liposomen, d. h. Liposomen, die mindestens einige positiv geladene Lipide umfassen, um eine positive Gesamtladung für die Liposomen zu erhalten, sind sowohl in vivo als auch in vitro für den Gentransfer, d. h. die Transfektion von DNA, in Säugerzellen verwendet worden. Aufgrund von Ladungswechselwirkungen bilden das positiv geladene Liposom bei einem einfachen Mischvorgang auf seiner Oberfläche einen Komplex mit der negativ geladenen DNA. Der Komplex wiederum bindet fest an die Zelloberfläche aufgrund der günstigen Ladungswechselwirkungen, gefolgt von der Internalisierung des Komplexes in die Zelle und der Expression des Gens (Singhal A. und Huang L., Gene Therapeutics (1994) (Hrsg.: Wolff J. A.), S. 118–142, Birkhauser, Boston).
Verschiedene kationische Lipide sind auf dem Fachgebiet zum Einbau in Liposomen vorgeschlagen worden, einschließlich quaternäre Ammoniumdetergenzien, z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), kationische Derivate von Cholesterin und Diacylglycerin, z. B. 1,2-Dioleyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerin (DOTB), und Lipopolyamine, z. B. Lipopoly-L-lysin (LPLL). Auch sind kommerzielle Zubereitungen erhältlich. Lipofectin^® ist eine häufig verwendete kommerzielle Zubereitung, welche N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) in Kombination mit Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) (Gibco) umfaßt. Die offensichtliche Toxizität einiger der im Handel erhältlichen Produkte ist auf die nicht natürliche, biologisch nicht abbaubare Natur von Verbindungen, welche darin enthalten sind, zurückgeführt worden (Singhal et al., ibid.).
Die als Transfektionsvektor verwendeten kationischen Liposomen enthalten gewöhnlich zusätzlich zu dem kationischen Lipid ein neutrales oder negativ geladenes Lipid, ein sogenanntes Helferlipid oder Co-Lipid, wobei das vorstehend erwähnte DOPE ein solches neutrales Helferlipid ist. Andere Helferlipide sind auch vorgeschlagen worden. Solche Helferlipide sind typischerweise Phospholipide, und neben DOPE sind z. B. Dioleylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleylphosphatidylserin (DOPS), die entsprechenden Dilauroyl-, Dimyristoyl- und Dipalmitoylverbindungen, Phosphatidsäure, Phosphatidylglycerin, Sterole wie Cholesterin und Mischungen davon vorgeschlagen worden. Die Mono-, Di- und Triglyceride können als weitere neutrale Helferlipide erwähnt werden. Eine Hauptfunktion des Helferlipids ist, mit der Liposomendoppelschichtstruktur zu verschmelzen und diese zu stabilisieren. Es ist auch bekannt, daß DOPE zusätzlich zu dem Liposomen stabilisierenden Effekt die cytoplasmatische Übertragung von DNA in die Zelle begünstigt.
Eine große Auswahl an Patentliteratur ist verfügbar, die verschiedene kationische Lipide zur Verwendung für die Transfektion offenbart, vgl. z. B. US-5,264,618, WO 93/03709 und WO 95/17373, um nur einige wenige zu erwähnen. WO 87/07530 offenbart Liposome, die u. a. Sphingosin enthalten. WO 85/26356 offenbart die Verwendung von Phospholipiden zur Transfektion.
Obwohl eine Reihe von Vorteilen durch die Verwendung kationischer Liposome als Träger für DNA anstelle von neutralen oder anionischen Liposomen erhalten wird, bestehen immer noch viele Probleme bei sowohl in vivo- als auch in vitro-Anwendungen. Ein Hauptproblem bei vielen der kationischen Lipide ist, daß sie im allgemeinen für die Zellen toxisch sind, und ihre Verwendung folglich begrenzt ist. Dies trifft insbesondere für Lipofectin^® zu, dessen DOTMA-Komponente ein Diether ist und nicht ohne weiteres in vivo abgebaut wird und für Gewebezellen toxisch ist. Folglich ist DOTMA vom Gesichtspunkt der in vivo-Genübertragung nicht optimal.
Gemäß der Erfindung ist nun entdeckt worden, daß es unter Verwendung einer spezifischen Gruppe von kationischen Lipiden zum Einschluß in den Transfektionsvektor möglich ist, ein Verfahren zur Transfektion bereitzustellen, das eine deutlich bessere Transfektionseffizienz bei minimalen Toxizitätsproblemen für die transfizierten Zellen zeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich ein Verfahren zur Transfektion einer Zelle mit einer Nucleinsäure, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Transfektionszusammensetzung, umfassend die Nucleinsäure und Liposomen, wobei die Nucleinsäure an die Oberfläche der Liposomen komplexiert ist, und wobei die Liposomen umfassen

– Sphingosin oder ein Derivat davon mit einer protonierten Aminogruppe in der Sphingosineinheit, und
– ein Helferlipid.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Sphingosinderivate sind amphiphile Lipide, d. h. sie umfassen einen Aminoalkohol, der mit einer einzigen Fettsäurekette substituiert ist. Mehrere Sphingosinderivate kommen natürlicherweise in Säuger- und Nicht-Säugerzellen vor, und sie können in Verbindung mit dem normalen Zellstoffwechsel abgebaut werden. Die Rolle der Sphingosine bei der Beeinflussung der DNA-Synthese und der Genexpression ist jedoch größtenteils unbekannt. Es ist auch bekannt, daß Sphingosin und einige der kationischen Derivate davon in liposomaler Form stark an DNA binden (Koiv A. und Kinnunen P. K. J., Chem. Phys. Lipids 72 (1994), 77–86).
Ein anderes Merkmal des Sphingosins ist seine Fähigkeit, die Proteinkinase C (PKC) zu hemmen. Die Hemmung der PKC ist als ein entscheidender Faktor vorgeschlagen worden, der die Transfektionseffizienz und die Toxizität eines bestimmten Liposomenvektors bestimmt (Singhal et al., ibid., S. 125). Sphingosin enthaltende Liposomen sind nicht zur Verwendung in Transfektionsvektoren vorgeschlagen worden, offensichtlich aufgrund der Tatsache, daß erwartet wurde, daß Sphingosin als ein PKC-Hemmstoff der Transfektion entgegenwirken würde. Gemäß der Erfindung ist jedoch nun entdeckt worden, daß dies nicht der Fall ist, und daß wesentlich erhöhte Transfektionseffizienzen erhalten werden können, ohne eine offensichtlich Toxizität für die Zellen, verglichen mit der Verwendung von Lipofectin^®, indem in den Liposomenvektor mindestens ein positiv geladenes Sphingosinderivat eingeschlossen wird.
Das wichtigste Kriterium für die Auswahl des erfindungsgemäß verwendbaren Sphingosins ist, daß die Aminogruppe in der Sphingosineinheit in einer protonierbaren Form vorliegt, um für den notwendigen kationischen Gesamtcharakter des Liposomenvektors zu sorgen, der durch die Sphingosinverbindung und das Helferlipid gebildet wird. Der kationische Charakter des Liposoms wiederum ist für die effiziente Bindung der negativ geladenen Nucleinsäure an die Oberfläche des Liposoms entscheidend. Zur erfindungsgemäßen Verwendung insbesondere in Betracht gezogen werden Sphingosin und die Sphingosinderivate mit der folgenden allgemeinen Formel
worin
X und Y jeweils unabhängig voneinander eine H- oder OH-Gruppe darstellen oder zusammen eine Doppelbindung bilden, und
R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine H- oder eine Niederalkylgruppe mit 1–3 Kohlenstoffatomen darstellen.
Eine Niederalkylgruppe wie R₁ und/oder R₂ ist eine Gruppe mit 1–3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Methylgruppe.
X ist vorzugsweise eine H-Gruppe oder bildet eine Doppelbindung mit Y.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung insbesondere in Betracht gezogen werden Sphingosin, Phytosphingosin, Dihydrosphingosin und Dimethylsphingosin.
Gemäß der Erfindung schließt der liposomale Transfektionsvektor auch mindestens ein Helferlipid ein, das kein Sphingosinderivat ist. Ein solches Lipid ist typischerweise ausgewählt aus der Gruppe der neutralen Phospholipide, wobei es typischerweise Phosphatidylethanolamin oder ein Diacylglycerin ist. Das Helferlipid weist fusogene Eigenschaften auf, was bedeutet, daß das Lipid die Eigenschaft besitzt, die Verschmelzung von Lipidmembranen zu erleichtern, vgl. z. B. Kinnunen P. K. J., Chem. Phys. Lipids 63 (1992), 251–258. Jedoch kann in Zusammenhang mit der Erfindung jedes Lipid, welches fusogene Eigenschaften besitzt und welches neutral ist oder welches den kationischen Charakter des gebildeten Liposoms nicht wesentlich verändert, in Frage kommen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Zusammensetzung ein erstes Helferlipid, welches aus fusogenen neutralen Phospholipiden, besonders Phosphatidylethanolaminen ausgewählt ist, und ein zweites Helferlipid, welches aus Diacylglycerinen ausgewählt ist.
Ein bevorzugtes Phospholipid ist Phosphatidylethanolamin, besonders Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), oder die entsprechenden Dilauroyl-, Dimyristoyl- und Dipalmitoylverbindungen. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Liposomenzusammensetzung enthält 10 bis 90 Gew.-% eines Helferlipids, wie ein Phospholipid, in Kombination mit 10 bis 90 Gew.-% eines Sphingosinderivats. Eine stärker bevorzugte Zusammensetzung umfaßt 30 bis 70 Gew.-% eines Helferlipids und 70 bis 30 Gew.-% eines Sphingosinderivats. Wie später gezeigt wird, sind unter Verwendung von DOPE und Sphingosin in einer Menge von 1 : 1 (Gew. : Gew.), was einem Molverhältnis zwischen den Verbindungen von etwa 1 : 2 entspricht, sehr gute Ergebnisse erhalten worden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die kationische Liposomenzusammensetzung ein Glycerid, vorzugsweise ein Diacylglycerin, als ein zweites Helferlipid ein. Im Einklang mit der Erfindung ist nämlich gezeigt worden, daß die Transfektionseffizienz im Hinblick auf eine Expression durch das Einbringen einer bestimmten Menge an Diacylglycerin in die Zusammensetzung erhöht werden kann. Für die Zwecke der Erfindung wird insbesondere ein Diacylglycerin, ausgewählt aus Dioleylglycerin und Dioctanoylglycerin, in Betracht gezogen. Das Diacylglycerin, falls als ein zweites Helferlipid eingeschlossen, ist in einer Menge von bis zu 25 Mol-%, berechnet ausgehend von der Lipidzusammensetzung des Liposoms, eingeschlossen. Optimale Ergebnisse sind unter Verwendung von etwa 5 bis 10 Mol-% solcher Diacylglycerine (berechnet ausgehend von den Gesamtlipiden) erhalten worden.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Liposomen ist einem Fachmann hinreichend bekannt, vgl. zum Beispiel Kinnunen P. K. J. et al., Chem. Phys. Lipids 66 (1993), 75–85, welche die Herstellung von multilamellaren Liposomen beschreiben. Kurz zusammengefaßt, werden das Sphingosin und irgendwelche weiteren Lipide, die verwendet werden sollen, in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. in Chloroform, gemischt und unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockene eingedampft. Zur Herstellung der Liposomen wird das auf diese Weise getrocknete Lipidgemisch unter kurzem wiederholtem Mischen mit Hilfe eines Vortexgeräts in einem Puffer hydratisiert und am Ende des Hydratisierungszeitraums mit Ultraschall behandelt, um multilamellare Liposomen zu bilden.
Die Nucleinsäure schließt in diesem Zusammenhang DNA und RNA sowie Oligonucleotide von DNA und RNA ein.
Zur Herstellung des Nucleinsäure-Lipid-Komplexes werden die Nucleinsäure und die Lipide jeweils in einem geeigneten Medium, zum Beispiel in serumfreiem DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), verdünnt, gemischt und für einen geeigneten Zeitraum vorinkubiert. Die Menge der Nucleinsäure im Verhältnis zu dem Lipid kann variieren, jedoch ist festgestellt worden, daß ein Gewichtsverhältnis zwischen der Nucleinsäure und dem Lipid im Bereich von 0,25 : 15 bis 4 : 5 ausreichend ist. Aufgrund von Ladungswechselwirkungen bildet die Nucleinsäure einen starken Komplex mit der kationischen Liposomenoberfläche nach dem einfachen Mischen der Komponenten. Gute Transfektionsergebnisse sind in Tests unter Verwendung von 1 μg bzw. 2 μg DNA zu 10 μg Gesamtlipid erhalten worden. Die Konzentration der Nucleinsäure in dem Transfektionsmedium wird geeigneterweise auf 1 bis 2 μg/ml eingestellt.
Der Begriff "Zelle" bedeutet in diesem Zusammenhang eine tierische Zelle oder eine pflanzliche Zelle. Einzellige Organismen sowie mehrzellige Organismen oder Systeme, wie Zellkulturen, sind erfindungsgemäß eingeschlossen.
Verfahren zur Transfektion sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, und solche bekannten Verfahren können in Zusammenhang mit den vorliegenden Liposomenzusammensetzungen auch angewendet werden. Die Erfindung betrifft folglich ein verbessertes Verfahren zur Transfektion, wobei die Verbesserung die Verwendung eines Liposoms, umfassend eine Nucleinsäure und ein Sphingosinderivat, als Transfektionsvektor und vorzugsweise eines Helferphospholipids umfaßt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird.
1 zeigt den Effekt von verschiedenen Liposomenkombinationen auf die Transfektionseffizienz von pCMV-luci in KK-1-Zellen. KK-1-Zellen wurden mit 10 μg Lipid und 1 μg CMV-luci-Plasmid transfiziert. Nach dem Ernten wurde die Luciferaseaktivität der Zelllysate gemessen. Buff = Zellen nicht transformiert; 0 = Zellen transfiziert mit 1 μg DNA allein, ohne Liposomen; sph-PC = Sphingosylphosphorylcholin; sph = Sphingosin; phsph = Phytosphingosin; DE = DOPE; DG = DOG; DOPE und Sphingosin wurden 1 : 1 (Gew. : Gew.) gemischt, und 10 Mol-% DOG wurden zugesetzt, falls angegeben.
2 zeigt die Transfektionseffizienz von DOPE-Phytosphingosin-Liposomen, die zusammen mit 5 Mol-% von entweder Dioctanoylglycerin (DOcG) oder Dioleylglycerin (DOG) zugegeben und mit HeLa- und KK-1-Zellen getestet wurden. 10 μg Lipid und 2 μg (HeLa-Zellen) oder 1 μg (KK-1-Zellen) DNA wurden bei der Transfektion verwendet. Die Expression wurde mit derjenigen in Zellen verglichen, die mit Lipofectin^® transfiziert wurden.
3a zeigt den Effekt der Zugabe von DOG in unterschiedlichen Molprozenten zu den DOPE-Phytosphingosin-Liposomen. 10 μg Gesamtlipid und 1 μg DNA wurden verwendet, um KK-1-Zellen zu transfizieren.
3b zeigt den Effekt der Kombination von DOcG in unterschiedlichen Molprozenten mit DOPE-Phytosphingosin-Liposomen. 10 μg Gesamtlipid und 1 μg DNA wurden verwendet, um KK-1-Zellen zu transfizieren.
4 zeigt die Transfektionseffizienz unter Verwendung verschiedener DNA/Gesamtlipid-Verhältnisse bei KK-1-Zellen. Die Liposomenzusammensetzung umfaßte DOPE : Phytosphingosin in einem Verhältnis von 1 : 1 (Gew. : Gew.) und 5 Mol-% DOG.
5 zeigt die Ergebnisse von Lagerversuchen mit Liposomen, ausgeführt mit KK-1-Zellen. Die schwarze Säule stellt die Lagerung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Zusammensetzung wie in 4, außer daß DocG anstelle von DOG verwendet wurde) bei der Lagerung bei +4°C dar, und die graue Säule stellt die Lagerung derselben Zusammensetzung, gelagert bei –20°C, dar. Die schraffierte Säule stellt die Lagerungsergebnisse für Lipofectin^®, gelagert bei +4°C gemäß den Anweisungen des Herstellers, dar.
Beispiele
Herstellung eines Transfektionsliposoms
Die Liposomen wurden unter Verwendung von Lipidstammlösungen von DOPE und einem geeigneten Sphingosinderivat, ausgewählt aus Sphingosin, Phytosphingosin und Phosphorylcholinsphingosin, hergestellt. Die ausgewählten Lipide wurden in Chloroform in einem Verhältnis von 1 : 1 (bezogen auf das Gewicht) gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurde entweder Dioleoylglycerin (DOG) oder Dioctanoylglycerin (DOcG) in den angegebenen Mengen, bis zu 30 Mol-%, zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom abgedampft, und die Trocknung wurde in einem Gefriertrockenapparat für mindestens 2 Stunden oder über Nacht fortgesetzt. Im Anschluß daran wurde das trockene Lipidgemisch in einem Puffer, enthaltend 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 EDTA, pH 7,4, für 30 Minuten bei 40°C in einem Wasserbad hydratisiert und alle 5 Minuten unter Verwendung eines Vortexgeräts kurz gemischt. Nach Beendigung der Hydratisierung wurden die erhaltenen Liposomen für etwa 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die Gesamtlipidkonzentration der Liposomen betrug üblicherweise 100 μg/ml Puffer. Die hergestellten Liposomen wurden in einem Kühlschrank in verschlossenen Teströhrchen aufbewahrt.
Lipofectin^® wurde als Referenz-Liposomenvektor gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Herstellung von DNA-Lipid-Komplexen
Das in den Experimenten verwendete pCMV-Luciferase-Konstrukt wurde so konstruiert, daß es den Promotorbereich des Cytomegalievirus vor der codierenden Sequenz der Leuchtkäfer-Luciferase in einem Expressionsvektor, PUHC13-1 (Gossen M. und Bujard H., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 5547–5551), enthält. Die DNA-Präparation wurde mittels CsC1-Gradientenzentrifugation zweimal gereinigt und für die Transfektionen in sterilem Wasser gelöst. Die Identität des CMV-Luciferase-Konstrukts wurde unter Verwendung der spezifischen Restriktionsendonucleasespaltung überprüft.
Die DNA und das Lipid wurden jeweils in 100 μl serumfreiem DMEM (DMEM-SF) verdünnt und dann gemischt. 1 μg bzw. 2 μg DNA und 10 μg Gesamtlipid wurden für 15 Minuten vorinkubiert. Anschließend wurde das Gesamtvolumen des Gemisches mit DMEM-SF auf 1 ml eingestellt. Die DNA-Lipid-Komplexe bildeten sich schnell nach dem Mischen und wiesen ein stabiles Transfektionsvermögen für mindestens eine Stunde bei der verwendeten Konzentration auf.
Transfektion
Als Zellkulturen wurden die Zelllinie KK-1 und HeLa-Zellen verwendet. Die KK-1-Zellen wurden aus transgenen murinen Ovartumorzellen abgeleitet, welche durch die Expression des Simian-Virus 40 und der kleinen Tumor (T)-Antigene unter der Kontrolle eines Inhibin-α-Untereinheit-Promotors immortalisiert wurden (Kananen K. et al., Mol. Endocrinol. 9 (1995), 616–627). Die HeLa-Zellen wurden aus einem menschlichen Gebärmutterhalskarzinom abgeleitet (vgl. z. B. Gossen M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547–5551). Die Zellen wurden auf Kunststoffgewebekulturplatten in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (DMEM-10) in einem Brutschrank in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft bei 37°C gezüchtet.
Zellkulturplatten mit sechs Vertiefungen mit einer Konfluenz von mindestens 80% wurden mit DMEM-SF gewaschen, und die DNA-Lipid-Komplexe wurden auf die Zellen überschichtet. Für jede Vertiefung wurden 1 μg DNA/10 μg Liposomen für KK-1-Zellen und 2 μg/10 μg Liposomen für HeLa-Zellen verwendet. Für jeden Test wurden 2–3 nebeneinander liegende Vertiefungen verwendet. Nach einem Inkubationszeitraum von 10 Stunden bei 37°C wurde das DNA-Lipid-Gemisch durch 2 ml DMEM-10 ersetzt. Drei Tage nach Beginn der Transfektion wurden die Zellen geerntet, indem sie von den Kulturplatten abgeschabt wurden. Die Zellextrakte wurden hergestellt, und ein luminometrischer Test auf eine Luciferaseaktivität wurde durchgeführt, indem die Aktivität des durch die Zellen hergestellten Proteins (des ATP-Luciferaseenzyms) durch Messen des ATP-Abbaus durch das Luciferaseenzym gemessen wurde (vgl. z. B. Gould S. et al., Anal. Biochem. 7 (1988), 5–13; Nguyen V., Anal. Biochem. 171 (1988), 404–408). Kurz zusammengefaßt, wurden 50 μl des Gesamtvolumens von 100 μl der Zellextrakte mit 360 μl Testpuffer durch kurzes Mischen mit Hilfe eines Vortexgeräts in einer Einmalküvette gemischt. Die Küvetten wurden anschließend in ein Bio-Orbit Luminometer 1252 (Bio-Orbit Ltd., Turku, Finnland) eingebracht, und die Lumineszenz wurde nach Zugabe von 200 μl Luciferinlösung gemessen. Wenn die Luciferaseaktivität einer Probe den Meßbereich überstieg, wurde eine kleinere Menge (10 oder 20 μl) des Zellextrakts bei einer erneuten Messung verwendet.
Zur Messung der PKC-Stimulierung wurde Phorbolmyristinsäure (PMA) (1% der Mole an Lipiden) zu den Liposomenlösungen zugegeben. Die Transfektion und die Expressionsanalyse wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
Ergebnisse
Wie aus 1 ersichtlich ist, zeigten die Phytosphingosin und Sphingosin enthaltenden Liposomen eine hohe Transfektionseffizienz in KK-1-Zellen, welche mit derjenigen von Lipofectin^® vergleichbar war oder diese überstieg. Die Transfektionseffizienz ist bei Zusammensetzungen unzureichend, welche kein DOPE enthalten. Die Transfektionseffizienz bei HeLa-Zellen war etwas geringer als diejenige in KK-1-Zellen, vgl. 2.
Nach Inkubation der KK-1-Zellen mit den Liposomen für 16 h oder länger waren die mit Lipofectin^® transfizierten Zellen praktisch alle abgestorben, während die Sphingosin-Liposomen keinen merklichen Zelltod verursachten. Die HeLa-Zellen tolerierten Lipofectin^® besser und zeigten eine geringe Schädigung nach Inkubationszeiträumen von über 10 Stunden.
Die Zugabe von Diacylglycerin zu der Sphingosin-Lipidzusammensetzung beeinflußte die vorübergehende Luciferase-Expression in einer zweiphasischen, dosisabhängigen Weise (3). Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß Diacylglycerin die Transfektion bei der optimalen Konzentration von 5 Mol-% verdoppelte, und daß Dioctanoylglycerin in Konzentrationen von 5 bis 10 Mol-% am wirksamsten war. Konzentrationen von mehr als etwa 25 Mol-% ergaben keine Verbesserung, sondern riefen vielmehr eine geringere Expression hervor. In durch PMA stimulierten Vertiefungen entsprach die Expression nur einem Viertel der nicht stimulierten Vertiefungen.
Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das DNA/Lipid-Verhältnis nicht sehr entscheidend ist, und daß Bereiche von 0,25 μg/15 μg bis 4 μg/5 μg zufriedenstellende Ergebnisse ergaben. Die Lagerversuchsergebnisse von 5 zeigen, daß die Zusammensetzungen zur erfindungsgemäßen Verwendung mindestens vergleichbare Lagerungseigenschaften im Vergleich zu Lipofectin^® besitzen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Toxizität der Liposomen, enthaltend das Sphingosinderivat, gegenüber von Zellen, wie KK-1-Zellen, offensichtlich geringer als diejenige der häufig verwendeten Transfektionsliposomenzubereitung Lipofectin^® ist. Es wird in Betracht gezogen, daß das in Lipofectin^® eingeschlossene nicht-bioabbaubare DOTMA als Grund für diesen Unterschied angesehen werden kann. Folglich könnten besonders empfindliche Zelllinien mit weniger toxischen Vektoren einfacher manipuliert werden. Einige bestimmte Zellfunktionen können in absterbenden Zellen auch beeinträchtig sein, z. B. könnten Experimente zur Promotorfunktion aufgrund toxischer Effekte abweichende Ergebnisse liefern. Die PKC-Aktivatoren können die Transfektionseffizienz durch die Calciumphosphat-Methode erhöhen (Reston J. et al., Biochem. Biophys. Acta 1088 (1991), 270–278). Doch gemäß der Erfindung verminderte die Zugabe von PMA zu der Liposomenlösung die Expression des Luciferase-Gens. Die PKC-Aktivität scheint folglich die Sphingolipid-Liposomen vermittelte Transfektion in entgegengesetzter Weise zu beeinflussen, verglichen mit der Calciumphosphat-Transfektion.
Die Verfügbarkeit und die geringen Kosten der erfindungsgemäß verwendeten Komponenten sind hinreichend anerkannte Vorteile in der Praxis. Die Liposomen sind einfach herzustellen, und der Zeitaufwand ist gering. Daher stellen die auf einem Sphingosinderivat basierenden Liposomen eine wirksame Alternative mit geringer Toxizität zur DNA-Transfektion von Zellen in vitro dar. Sie können auch bei der Transfektion von anderen Materialien und bei der in vivo-Transfektion nützlich sein.

Claims

Verfahren zur in vitro-Transfektion einer Zelle mit einer Nucleinsäure, umfassend Inkontaktbringen der Zelle mit einer Transfektionszusammensetzung, umfassend die Nucleinsäure und Liposomen, wobei die Nucleinsäure an die Oberfläche der Liposome komplexiert ist, wobei die Liposome umfassen – Sphingosin oder ein Derivat davon, mit einer protonierten Aminogruppe in der Sphingosineinheit, und mit der folgenden Formel
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander eine H- oder OH-Gruppe darstellen oder zusammen eine Doppelbindung bilden, R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine H- oder eine Niederalkylgruppe mit 1–3 Kohlenstoffatomen darstellen, und – ein Helferlipid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Helferlipid ein neutrales Phospholipid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Phospholipid ein Phosphatidylethanolamin ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung ein Diacylglycerin als ein weiteres Helferlipid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Sphingosin, Phytosphingosin, Dihydrosphingosin oder Dimethylsphingosin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Phospholipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Phospholipid ein Phosphatidylethanolamin ist und die Zusammensetzung außerdem ein weiteres Helferlipid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dioleoyl- oder Dioctanoylglycerin, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung außerdem eine Verbindung umfasst, die ausgewählt ist aus Cholesterin und Sterol und ihren Derivaten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Dioleoylphosphatidylethanolamin und ein Diacylglycerin ausgewählt aus Dioleoylglycerin und Dioctanoylglycerin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung Sphingosin oder ein Derivat davon in einer Menge von 10 bis 90 Gew.-% und ein Helferlipid in einer Menge von 10 bis 90 Gew.-%, berechnet ausgehend vom gemeinsamen Gewicht von Sphingosin oder seinem Derivat und dem Helferlipid, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung Sphingosin oder ein Derivat davon in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-% und ein Helferlipid in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-%, berechnet ausgehend vom gemeinsamen Gewicht von Sphingosin oder seinem Derivat und dem Helferlipid, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verhältnis zwischen Sphingosin oder einem Derivat davon und dem Helferlipid ungefähr 1 : 1 (wt/wt) ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung Sphingosin oder ein Derivat davon in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-% und Phospholipid in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-%, berechnet ausgehend vom gemeinsamen Gewicht von Sphingosin oder seinem Derivat und Phospholipid, und ein Diacylglycerin als weiteres Helferlipid in einer Menge von bis zu 25 Mol-%, gerechnet ausgehend vom Lipidgesamtgewicht, enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung Sphingosin oder ein Derivat davon in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-% und Phospholipid in einer Menge von 30 bis 70 Gew.-%, berechnet ausgehend vom gemeinsamen Gewicht von Sphingosin oder seinem Derivat und Phospholipid, und ein Diacylglycerin als weiteres Helferlipid in einer Menge von 5 bis 10 Mol-% eines Diacylglycerin, berechnet ausgehend vom Lipidgesamtgewicht, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis zwischen der Nucleinsäure und der Gesamtheit der Lipide 0,25 : 15 bis 4 : 5 (Gew./Gew.) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lipidzusammensetzung enthält – 30 bis 70 Gew.-% einer Verbindung ausgewählt aus Sphingosin und Phytosphingosin – 30 bis 70 Gew.-% Dioleoylphosphatidylethanolamin, wobei das Gew.-% berechnet wird ausgehend vom Gesamtgewicht von Sphingosin und Phosphatidylethanolamin-Verbindungen, und zusätzlich – 5 bis 15 Mol-%, berechnet ausgehend von der Lipidgesamtmenge, von einer Verbindung ausgewählt aus Dioleoylglycerin und Dioctanoylglycerin.
Verfahren für die Herstellung einer liposomalen Transfektionszusammensetzung zur Transfektion einer Zelle mit einer Nucleinsäure, umfassend die Komplexierung der Nucleinsäure an die Oberfläche der Liposomen, wobei die Liposomen Sphingosin oder ein Derivat davon umfassen, mit einer protonierten Aminogruppe in der Sphingosineinheit und mit der Formel
wobei X und Y jeweils unabhängig voneinander eine H- oder OH-Gruppe darstellen oder gemeinsam eine Doppelbindung bilden, R₁ und R₂ unabhängig eine H- oder eine Niederalkylgruppe mit 1–3 Kohlenstoffatomen darstellen, und – ein Helferlipid.