PT796240E - Lipopoliaminas como agentes de transfeccao e suas aplicacoes farmaceuticas - Google Patents
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Description
0, <c'f ffí EP 0 796 240/ΡΊ
DESCRICÃO "Lipopoliaminas como agentes de transfecção e suas aplicações farmacêuticas" O presente invento refere-se a novos compostos relacionados com a família das lipopoliaminas, composições farmacêuticas que os contêm e suas aplicações para a transfecção in vivo e/ou in vitro de ácidos nucleicos.
Numerosas doenças genéticas estão associadas a um defeito de expressão e/ou uma expressão anormal, isto é, deficiente ou excessiva, de um ou vários ácidos nucleicos. A terapia génica tem como principal objectivo corrigir este tipo de anomalias genéticas através da expressão celular in vivo ou in vitro de genes clonados.
Actualmente, são propostos vários métodos para a entrega intracelular deste tipo de informação genética. Um de entre estes, em particular, baseia-se no emprego de vectores químicos ou bioquímicos. Os vectores sintéticos têm duas funções principais, compactar o ADN a transfectar e promover a sua fixação celular bem como a sua passagem através da membrana plasmática e, se for caso disso, através das duas membranas nucleares.
Um progresso importante foi alcançado no modo de transfecção com o desenvolvimento de uma tecnologia baseada na utilização de um lípido catiónico. Ficou assim demonstrado que um lípido catiónico carregado positivamente, o cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), interferia, na forma de lipossomas ou de vesículas pequenas, espontaneamente com o ADN, o qual é carregado negativamente, para formar complexos lipídos-ADN, capazes de fundir com as membranas celulares e permitir assim a entrega intracelular do ADN. No entanto, mesmo esta molécula sendo eficaz ao nível da transfecção, apresenta a desvantagem de não ser biodegradável e de possuir um carácter tóxico relativamente às células.
Depois do DOTMA, foram desenvolvidos outros lípidos catiónicos a partir deste modelo de estrutura: grupo lipófilo associado a um grupo amino através de um braço dito "spacer". De entre estes, pode-se ainda citar particularmente os que compreendem como grupo lipófilo dois ácidos gordos ou um derivado do colesterol, e que possuem além disso, se for caso disso, como grupo amino, um
grupo de amónio quaternário. Os DOTAP, DOBT ou o ChOTB podem ser especificamente citados como representantes desta categoria de lípidos catiónicos. Outros compostos, como os DOSC e ChOSC, caracterizam-se pela presença de um grupo colina no lugar do grupo amónio quaternário. Em geral, a actividade transfectante destes compostos permanece no entanto muito fraca.
Uma outra categoria de lípidos catiónicos, as lipopoliaminas, foram igualmente descritos na patente EP 0394111. Neste tipo de compostos, o grupo catiónico é representado pelo radical L-5-carboxiespermina que contém quatro grupos amónio, dois primários e dois secundários. Os DOGS e DPPES fazem especificamente parte destes. Estas lipopoliaminas são muito particularmente eficazes para a transfecção de células endócrinas primárias.
De facto, um agente de transfecção sintético ideal deverá apresentar um alto nível de transfecção, e isto para um largo espectro de células, possuir uma toxicidade nula ou pelo menos uma toxicidade muito minimizada nas doses de utilização, e por fim, ser biodegradável para se evitar qualquer efeito secundário ao nível das células tratadas. O presente invento tem precisamente como objectivo proporcionar novos compostos susceptíveis de serem utilizados eficazmente na transfecção in vitro ou in vivo de células e especificamente para a vectorização de ácidos nucleicos.
Este tem como primeiro objectivo as lipopoliaminas, na forma D, L ou LD e seus sais, representados pela fórmula geral I: na qual - m é um número inteiro compreendido entre 2 e 6, inclusivamente, - n é um número inteiro compreendido entre 1 e 9, inclusivamente, e de preferência entre 1 e 5 com apenas um grupo R que não hidrogénio presente na fórmula geral e os valores de m variáveis ou idênticos ao seio dos diferentes grupos -(CH)m- e -(CH2)m-,
R
ff 05f hl· U 796 240/ΡΊ 3
-R representa um átomo de hidrogénio ou um radical de fórmula geral II:
R5
II na qual XeX' representam, independentemente um do outro, um átomo de oxigénio, um grupo metileno-(CH2)p- com q igual a 0, 1, 2 ou 3, ou um grupo amino -NH-ou -NR’- com R’ representando um grupo alquilo a C4, - Y e Y’ representam independentemente um do outro um grupo metileno, um grupo carbonilo ou um grupo C = S, - R3, R4 e R5 representam independentemente um do outro um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo, substituído ou não, C, a C4, com p podendo variar entre 0 e 5, - R6 representa um derivado do colesterol ou um grupo alquilamino -NR1R2 com R, e R2 representando, independentemente um do outro, um radical alifático, saturado ou não, linear ou ramificado C 12 a C22 >
De particular interesse são os compostos nos quais R é representado pela fórmula geral ΙΓ:
O
R5
II na qual R3, R4, R5, R6 e p são tal como anteriormente definidos e X representa um átomo de oxigénio ou um grupo -(CH2)q- com q igual a zero.
Ρ.Γ OFÇ EH O 7 Sb z4U/Ki 4
Esta família de compostos caracteriza-se particularmente pela presença de uma ligação éster interna, interessante no plano da biodegradabilidade.
Como lipopoliaminas preferidas de acordo com o invento, pode-se mencionar mais especificamente os compostos seguintes:
10-alfa-colesterilo
pr pçc bP 0 796 240/P'i 5 na forma D, L, DL ou um dos seus sais. O presente invento tem igualmente como objectivo qualquer aplicação terapêutica das lipopoliaminas de acordo com o invento, seja directamente, seja no seio de composições farmacêuticas.
Tal como explicitado anteriormente, os compostos de fórmula geral I são particularmente interessantes para a transfecção in vitro e in vivo de ácidos nucleicos. Estes compactam eficazmente o ADN e apresentam vantajosamente uma toxicidade muito reduzida, quase nula, relativamente às células tratadas. Além disso, são biodegradáveis, particularmente através da hidrólise da sua ligação éster.
Para obter um efeito máximo das composições do invento, as proporções respectivas do composto de fórmula geral I e do ácido nucleico são de preferência determinadas de forma a que a razão R, entre as cargas positivas da lipopoliamina considerada e as cargas negativas do referido ácido nucleico, seja óptima. Esta razão óptima, variando em particular segundo o modo de utilização seja in vivo ou in vitro e segundo o tipo celular a transfectar, é optimizada caso a caso. Esta optimização é da competência do perito na arte.
Nas composições do presente invento, o polinucleótido pode ser tanto um ácido desoxirribonucleico como um ácido ribonucleico. Podem ser sequências de origem natural ou artificial, e particularmente ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, sequências híbridas ou sequências sintéticas ou semi-sintéticas. Estes ácidos nucleicos podem ser, por exemplo, de origem humana, animal, vegetal, bacteriana ou virai. Podem ser obtidos através de qualquer técnica conhecida de um perito na arte e particularmente através de pesquisa de bases de dados, através de síntese química ou ainda através de métodos mistos incluindo modificação química ou enzimática de sequências obtidas através da pesquisa de bases de dados. Estes podem por outro lado ser incorporados em vectores, tais como vectores plasmídicos.
Em relação mais especificamente aos ácidos desoxirribonucleicos, estes podem ser de cadeia simples ou dupla. Estes ácidos desoxirribonucleicos podem, por exemplo, possuir genes terapêuticos, sequências reguladoras da /ff é^-At·**** F,p rpr
EP 0 796 240/ΡΊ 6 transcrição ou da replicação, sequências anti-sentido modificadas ou não, ou regiões de ligação a outros componentes celulares.
De acordo com o invento, entende-se por gene terapêutico especificamente qualquer gene codificante para um produto proteico possuindo um efeito terapêutico. O produto proteico assim codificado pode ser uma proteína, um péptido, etc. Este produto proteico pode ser homólogo ao da célula alvo (isto é um produto que é normalmente expresso na célula alvo quando esta não apresenta nenhuma patologia). Neste caso, a expressão de uma proteína permite por exemplo paliar uma expressão insuficiente na célula ou a expressão de uma proteína inactiva ou fracamente activa devido a uma modificação, ou ainda sobre-expressar a referida proteína. O gene terapêutico pode assim codificar para um mutante de uma proteína celular possuindo por exemplo uma estabilidade aumentada ou uma actividade modificada. O produto proteico pode igualmente ser heterólogo ao da célula alvo. Neste caso, uma proteína expressa pode por exemplo completar ou possuir uma actividade deficiente na célula, permitindo-lhe lutar contra uma patologia, ou estimular uma resposta imunitária.
De entre os produtos terapêuticos de acordo com o presente invento, pode-se citar mais especificamente as enzimas, os derivados sanguíneos, as hormonas, as linfocinas: por exemplo as interleucinas, os interferões ou o TNF (FR 9203120), os factores de crescimento, os neurotransmissores ou seus percursores ou enzimas de síntese, os factores tróficos: por exemplo BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 ou HARP/pleiotrofina, a distrofina ou uma minidistrofina (FR 9111947), a proteína CFTR associada à mucoviscidose, os genes supressores de tumores: por exemplo p53, Rb, Rap1A, DCC ou k-rev (FR 9304745), os genes que codificam para factores implicados na coagulação: Factores VII, VIII, IX, os genes intervenientes na reparação do ADN, os genes suicidas (timidina-quinase, citosina-desaminase), os genes da hemoglobina ou outros transportadores proteicos, os genes que correspondem a proteínas implicadas no metabolismo dos lípidos, de tipo apolipoproteína escolhidas de entre as apolipoproteínas A-l, A-ll, A-IV, B, C-l, C-II, C-lll, D, E, F, G, H, J e apo(a), as enzimas do metabolismo como por exemplo a lipoproteína-lipase, a lipase hepática, a lecitina colesterol-aciltransferase, a 7-alfa-colesterol-hidroxilase, a fosfatase do ácido fosfatídico, ou ainda proteínas de transferência de lípidos como a proteína de transferência de ésteres de
ar na? EP 0 796 240/P'i 7 colesterol e a proteína de transferência de fosfolípidos, uma proteína de ligações de HDL ou ainda um receptor escolhido por exemplo de entre os receptores LDL, receptores de restos quilomicrónicos e os receptores "scavenger". O ácido nucleíco terapêutico pode igualmente ser um gene ou uma sequência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição de ARNm celulares. Tais sequências podem, por exemplo, ser transcritas na célula alvo para ARN complementares dos ARNm celulares e bloquear assim a sua tradução em proteína, segundo a técnica descrita na patente EP 140308. Os genes terapêuticos compreendem igualmente as sequências que codificam para ribozimas, as quais são capazes de destruir selectivamente ARN alvos (EP 321201).
Tal como indicado acima, o ácido nucleico pode igualmente compreender um ou mais genes que codifiquem para um péptido antigénico, capaz de gerar no homem ou num animal uma resposta imunitária. Neste modo particular de execução, o invento permite portanto a realização quer de vacinas quer de tratamentos imunoterapêuticos aplicados ao homem ou a animais, particularmente contra microorganismos, vírus ou cancros. Pode-se tratar especificamente de péptidos antigénicos específicos do vírus de Epstein-Barr, do vírus HIV, do vírus da hepatite B (EP 185573), do vírus da pseudo-raiva, do vírus formador de sincícios, de outros vírus ou ainda específicos de tumores (EP 259212).
De preferência, o ácido nucleico compreende igualmente sequências que permitem a expressão do gene terapêutico e/ou do gene que codifica para o péptido antigénico na célula ou no órgão desejado. Pode consistir em sequências que sejam naturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado desde que essas sequências sejam susceptíveis de funcionar na célula infectada. Pode igualmente consistir em sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas, ou mesmo sintéticas). Particularmente, pode consistir em sequências promotoras de genes eucarióticos ou virais. Por exemplo, pode consistir em sequências promotoras provenientes do genoma da célula que se deseja infectar. Do mesmo modo, pode consistir em sequências promotoras provenientes do genoma de um vírus. A este respeito, podem-se citar por exemplo os promotores dos genes E1A, MLP, CMV ou RSV. Além disso, essas sequências de expressão podem ser
PP 05Ç bb 0 7bb Ζ40/ΡΊ 8 modificadas através da adição por exemplo de sequências de activação ou de regulação. Podem também consistir num promotor, indutível ou repressível.
Por outro lado, o ácido nucleico pode igualmente comportar, em particular a montante do gene terapêutico, uma sequência sinal que dirija o produto terapêutico sintetizado para as vias de secreção da célula alvo. Esta sequência sinal pode ser a sequência sinal natural do produto terapêutico, mas pode igualmente consistir em qualquer outra sequência sinal funcional, ou numa sequência sinal artificial. 0 ácido nucleico pode igualmente comportar uma sequência sinal que dirija o produto terapêutico sintetizado para um determinado compartimento da célula.
Num outro modo de realização, o presente invento refere-se a composições compreendendo um ácido nucleico, uma lipopoliamina tal como reivindicada e um adjuvante capaz de se associar ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico e de melhorar o poder transfectante. A requerente mostrou de facto que o poder transfectante das lipopoliaminas pode ser aumentado de modo inesperado na presença de certos adjuvantes (lípidos ou proteínas, por exemplo), capazes de se associar ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico.
De preferência, as composições do invento compreendem, como adjuvante, um ou mais lípidos neutros. Tais composições são particularmente vantajosas, particularmente quando a razão R é fraca. A requerente mostrou de facto que a adição de um lípido neutro permite melhorar a formação de partículas nucleolipídicas e, de modo surpreendente, favorecer a penetração da partícula na célula destabilizando a sua membrana.
De preferência, os lípidos neutros utilizados no âmbito do presente invento são lípidos com 2 cadeias gordas.
De modo particularmente vantajoso, utilizam-se lípidos naturais ou sintéticos, zwiteriónicos ou desprovidos de carga iónica em condições fisiológicas. Estes podem ser escolhidos mais particularmente de entre a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), a oleoil-palmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), as di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolaminas assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilgliceróis, os bp U 79b 240/Kl 9 st diacilgliceróis, os glicosildiacilgliceróis, os cerebrósidos (tais como especificamente os galactocerebrósidos), os esfingolípidos (tais como especificamente as esfingomielinas) ou ainda os asialogangliósidos (tais como especificamente os asialoGMI e GM2).
Estes diferentes lípidos podem ser obtidos quer por síntese quer por extracção a partir de órgãos (exemplo: o cérebro) ou de ovos, por técnicas clássicas bem conhecidas do perito na arte. Em particular, a extracção de lípidos naturais pode ser realizada por meio de solventes orgânicos (ver igualmente Lehninger, Biochemistry).
De preferência, as composições do invento compreendem de 0,1 a 20 equivalentes de adjuvante por um equivalente de composto de fórmula geral I, sendo preferível de 1 a 5.
As composições de acordo com o invento podem ser formuladas tendo em vista administrações por via tópica, cutânea, oral, rectal, vaginal, parentérica, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-ocular ou transdérmica. De preferência, as composições farmacêuticas do invento contêm um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável, particularmente para uma injecção directa ao nível do órgão desejado, ou para uma administração por via tópica (sobre a pele e/ou mucosa). Estas podem consistir especificamente em soluções estéreis, isotónicas ou composições secas, particularmente liofilizadas, as quais, através de adição, conforme o caso, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de solutos injectáveis. As doses de ácido nucleico utilizadas para injecção assim como o número de administrações podem ser adaptados em função de diferentes parâmetros, e particularmente em função do modo de administração utilizado, da patologia em causa, do gene a expressar, ou ainda da duração do tratamento procurada. No que se refere mais particularmente ao modo de administração, este pode consistir quer numa injecção directa nos tecidos, quer num tratamento de células em cultura seguido da sua reimplantação in vivo, através de injecção ou enxerto. O presente invento proporciona assim um método particularmente vantajoso para o tratamento de doenças, compreendendo a administração in vivo ou in vitro de um ácido nucleico apto a corrigir a referida doença associado 10
Fr OFF bH O ?bb 24U/P i a um composto de fórmula geral I nas condições acima definidas. Mais particularmente, este método é aplicável às doenças resultantes de uma deficiência num produto proteico ou nucleico e o ácido nucleico administrado codifica para o referido produto proteico ou contém o referido produto nucleico.
Este estende-se a qualquer utilização de uma lipopoliamina de acordo com o invento para a transfecção in vivo ou in vitro de células. O presente invento será mais completamente descrito com o auxílio dos exemplos que se seguem, os quais devem ser considerados como ilustrativos e não limitantes.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcOEt: Acetato de etilo BOP: Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfónio DCC: Diciclo-hexilcarbodiimida DCU: Diciclo-hexilureia DMAP: 4-Dimetilaminopiridina DMF: Dimetilformamida DMSO: Dimetilsulfóxido DODA:Dioctadecilamina EP: Éter de petróleo
EtOH: Etanol NEt3: Trietilamina
Rf: Coeficiente de retenção frontal TFA: Ácido trifluoroacético THF: Tetra-hidrofurano TMS: Tetrametilsilano UV: Ultravioleta
MATERIAL E MÉTODOS A. Produtos utilizados
O DODA, o NEt3, o TFA, a L-ornitina, o hidróxido de tetrametilamónio, o níquel de Raney, o anidrido diglicólico provêm de Fluka; o BOP, de Propeptide France; o DMAP, o cloroformato de isobutilo e a N-metilmorfolina, de Aldrich. O THF provém de Merck; todos os outros solventes utilizados são produtos RP Μ Μ
ΡΡ Ρ5Γ· LH U ?yb Z4U/Ki 11
Prolabo. As soluções de NaCI, de NaHC03 são saturadas; a solução de KHS04 é a 0,5 M. B. Medições físicas
Os espectros de ressonância magnética nuclear do protão (RMN 1H) foram registados num espectrómetro Bruker.
Os deslocamentos químicos são expressos em ppm em relação a TMS. C. Cromatoqrafias em sílica
As cromatoqrafias em camada fina (CCF) foram efectuadas em placas de sílica-gel de Merck de 0,2 mm de espessura.
Revelações: - Com UV (254 nm) - Com ninidrina, vaporizando (pulverização ligeira) uma solução etanólica de ninidrina (40 mg/100 ml EtOH) para revelar as aminas ou as amidas aquecendo a 1 50°C. - Com fluorescamina, vaporizando uma solução (40 mg/100 ml de acetona) para revelar as aminas primárias. - Com iodo, cobrindo a placa de pó de iodo.
As cromatoqrafias em coluna foram efectuadas em sílica-gel 60 Merck de granulometria 0,063-0,200 mm. EXEMPLO 1. Síntese de (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 2-5-bis-(3-aminopropilamino)pentilo.
Ç!{? pAf LH U ?bb 24U/Ki 12 1 .a Preparação de 2,5-bis-(2-cianoetilamino)pentanoato de tetrametilamónio ILâl 0 monocloridrato do(s) ácido(s) 2,5-diaminopentanóico(s) (L-ornitina) (6,74 g; 40 mmol) e o hidróxido de tetrametilamónio penta-hidratado (14,48 g; 80 mmol) são colocados em solução em metanol (20 ml). A água formada e o metanol são evaporados sob pressão reduzida (com o auxílio de uma bomba de óleo) de modo a obter um resíduo seco.
Junta-se a N,N-dimetilformamida (30 ml) aos sais obtidos anteriormente. A mistura é desgaseificada com azoto, depois é agitada fortemente durante dez minutos, o que permite ao 2,5-diaminopentanoato de tetrametilamónio solubilizar-se (o cloreto de tetrametilamónio fica em suspensão em DMF).
Junta-se o acrilonitrilo (6 ml; 8,5 mol) gota a gota; reaquece-se ligeiramente o balão. A mistura reaccional é deixada 1 h à temperatura ambiente, sob azoto. Esta é em seguida filtrada para eliminar o cloreto de tetrametilamónio. 0 DMF é evaporado sob pressão reduzida. O resíduo obtido é um líquido oleoso; quando retirado do evaporador rotativo, este solidifica. Junta-se o acetonitrilo (100 ml) e o balão é ligeiramente aquecido até à obtenção de uma solução translúcida. Junta-se o THF até à obtenção de uma solução turva. 0 balão é guardado durante dois dias no congelador; o sal de tetrametilamónio do ácido L-2,5-bis-(2-cianoetilamino)pentanóico é recuperado por filtração sob a forma de sólido branco. É lavado com THF sobre frita, depois é seco sobre P205. São obtidos 6,06 g, ou seja, um rendimento de 49% (bruto). 1 .b Preparação do sal de tetrametilamónio do ácido 2,5-bis-(3-aminopropilamino)-pentanóico (1 .b) O produto 1 .a é solubilizado numa mistura de etanol (18 ml), água (2 ml) e hidróxido de potássio 2 M (5 ml). A solução é purgada com árgon. Junta-se o níquel de Raney (2 ml da suspensão Fluka). A hidrogenação é efectuada numa autoclave, purgada com azoto, a 26°C. Em 3 h, a pressão é passada de 50,6 bar para 44,7 bar, estabilizando-a depois mais de uma hora. A autoclave perfaz 250 ml e a mistura reaccional, 30 ml. A suspensão obtida é filtrada, enxaguada com água e passada para o evaporador rotativo. Obtém-se um óleo amarelo. 0 teste com fluorescamina é positivo. /r$ 13
Ff frí hl· 0 ?yò 24U/Ki 1 .c Preparação do ácido 2,5-bis-{terc-butoxicarbonil-í3-(terc-butoxicarbn-nilamino)propillamino}pentanóico (1 .c) O produto 1.b é dissolvido em dioxano (30 ml). Junta-se ditercbutilcarbonato (17,46 g; 80 mmol) gota a gota. A mistura é agitada durante uma noite. 0 dioxano é evaporado. Junta-se KHS04. 0 produto é extraído com CHCI3 (3 x 100 ml). A fase orgânica é de seguida lavada sucessivamente com NaHC03 (pH = 7,5), NaCI, depois seca sobre MgS04 e evaporada sob pressão reduzida. São obtidos 10 g de produto (15,4 mmol, ou seja, um rendimento de 39% em relação à ornitina). HPLC: MeCN/H20: 0-3 min MeCN a 50%; 3-20 min MeCN a 50-100%, 20-40 min MeCN a 100 %, K' = 7,96 (Coluna RP-18, caudal = 1 ml/min) CCF: Rf (CHCI3:AcOEt; 95:5 (v:v)) = 0,28 RMN (ppm): 1,3 (m, 8H, N + CH2-CH2-CH2-CHN + COO/ 2x N + CH2CH2CH2N + ); 2,7-3,0 (m, 10H 5x N + CH2); 3,8 (t, 1H, N + CHCOO) EM: MH+ = 647, PM = 646 1 .d Preparação de 2.5-bis-(terc-butoxicarbonilí3-(terc-butoxicarbonilamino) propillaminolpentan-l-ol (l.d)
Dissolve-se a L-5-carboxitetra-terc-butoxicarbonilespermina (1,94 g; 3 mmol) em 30 ml de THF. São introduzidos 370 ml (3,1 mmol) de N-metilmorfolina na micropipeta. A mistura reaccional, misturada sob azoto, é arrefecida a -15°C (num banho de gelo seco e etilenoglicol); são então adicionados 390 ml (3,1 mmol) de cloroformato de isobutilo. Ao fim de três minutos, a mistura reaccional é vertida num copo contendo NaBH4 (2 g) dissolvido em 20 ml de água a 4°C. O THF é evaporado. Junta-se KHS04 (até pH = 7). O produto é extraído com AcOEt, lavado com NaHC03, NaCI, seco sobre MgS04, filtrado e depois evaporado. São obtidos 1,15 g, ou seja, um rendimento de 61 %. A CCF é conduzida em dois passos; uma separação sobre coluna de sílica, com o mesmo eluente, é então efectuada e conduz a 0,97 g de produto (óleo amarelo). O rendimento da separação é de 84%. O rendimento da redução é de 51 %. 14 ρρ npr tt- U '/ bO 44U/h i CCF: Rf (EP:AcOEt; 1:1 (v:v)) = 0,24 RMN (ppm): 1,42 (s, 4x Boc); 1,5-1,7 (m, 8H, N + CH2-CH2-CH2-CHN/ 2x N + CH2CH2CH2N); 2,85-3,2 (m, 10H 5x NCH2>; 3,4 (m, 1H, NCHCH2OH); 3,7 (d, 2H, CH2OH); 6,8 (m, 2H; NH) EM: MH+ = 633, PM = 632 1 .e Preparação de ácido 2.5-bis-[3-(terc-butoxicarbonilamino)propill{terc-butoxicarbonilannino}pentiloxicarbonilmetoxiacético (1 ,e) São dissolvidos 0,51 g (0,806 mmol) do produto 1 .d em 10 ml de CH2CI2; são adicionados 2 equivalentes de anidrido diglicólico (1,535 mmol; 0,178 g), 2,2 equivalentes de trietilamina (1,687 mmol; 235 μΙ) assim como 5 mg de DMAP. Ao fim de uma hora, quando a CCF mostra que o álcool reagiu, a mistura é adicionada a CH2CI2, depois lavada com 3 x 50 ml de KHS04, 3 x 50 ml de NaCI, seca sobre MgS04, filtrada e depois evaporada. São obtidos 0,26 g de sólido, ou seja, um rendimento de 43%. CCF: Rf (CHCI3:MeOH:AcOH; 90:8:2 (v:v:v)) = 0,75 EM: MH+ = 749, PM = 748 1 .f Preparação do (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 2-5-bis-fterc-butoxicarbonilf3-(terc-butoxicarbonilamino)propinamino}pentilo (1 ,f) São dissolvidos 0,123 g do produto anterior (0,164 mmol), 1 equivalente (0,0856 g) de dioctadecilamina, 3 equivalentes de trietilamina (68,4 ml) e 1,1 equivalentes (0,0798 g) de BOP, em CHCI3. A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente. Ao fim de duas horas, a mistura é adicionada a 100 ml de CH2CI2, depois lavada com 3 x 100 ml de KHS04, de NaHC03, de NaCI (até pH = 7), seca e depois evaporada. São obtidos 0,13 g de produto, ou seja, um rendimento de 63%. CCF: Rf (EP:AcOEt; 1:1 (v:v)) = 0,62; revelação com iodo, com ninidrina e com fluorescamina. RMN (ppm): 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 6H: CH3, 1,20-1,75 (m, 108H: CH2/C(CH3)3); 3,05-3,35 (m, 14H: CH2N); 4,15-4,35 (m, 3H: NCHCH2OCO), 4,23-4,27 (2s, 2 x 2H: OCH2CO), 4,5-5,5 (m, desdobrado, 2H: NH) EM: MH+ = 1252, PM = 1251 <q6 Of-f
N 5,59 N 5,86 hH 0 7bb k4U/Ki 15
Análise elementar: Fórmula bruta: C7lHl37N5012 % teóricas: C 68,06 H 11,02 % obtidas: C 67,14 H 11,93 1 .g Preparação do (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 2,5-bis-(3-aminopropilamino)pentilo (l.g)
Junta-se 1 ml de TFA a 0,025 g de produto 1 .f (0,02 mmol) num tubo "Eppendorf"® de 1,5 ml e deixa-se uma hora à temperatura ambiente. O TFA é evaporado.
Juntam-se 500 μΙ de etanol de modo a obter uma solução a 40 mM, necessária para os testes biológicos. EM: MH + = 852, PM = 851 EXEMPLO 2.
Preparação do (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 1,3-bis-{3-aminopropilamino)-2-propilo (2.f):
2.a Preparação de 1.3-bis-(2-cianoetilamino)propan-2-ol (2.a) São dissolvidos 3,6 g (40 mmol) de 1,3-diaminopropan-2-ol em 75 ml de metanol. Juntam-se 5,76 ml (80 mmol) de acrilonitrilo em 15 minutos. O teste com fluorescamina é positivo. A mistura reaccional permanece incolor. Esta é deixada sob agitação, à temperatura ambiente, durante a noite. O teste com fluorescamina é então negativo. O metanol é evaporado. São recolhidos 7,9 g de produto (rendimento de 100% para o produto bruto). 16 pp pp.ç tl· U '/bb z4U/h i 2.b Preparação de 1,3-bis-(3-aminopropilamino)propan-2-ol (2.b) A hidrogenação é efectuada numa autoclave, purgada com azoto, a 27°C. O produto 2.a é solubilizado numa mistura de 15 ml de metanol, 10 ml de etanol, 5 ml de KOH (2 Μ). A solução é purgada com árgon e juntam-se 4 ml da suspensão de níquel de Raney na autoclave.
Ao fim de 3h30 a pressão é passada de 51,6 bar para 37,6 bar, e depois estabilizada mais de uma hora. A autoclave perfaz 250 ml e a mistura reaccional, 30 ml. A suspensão obtida é filtrada, lavada com água e passada para o evaporador rotativo. É obtido um óleo amarelo. O teste com a fluorescamina é positivo. 2.c Preparação de 1,3-bis-{3-terc-butoxicarbonilamino(terc-butoxicarbonilami-nopropil}-2-propan-2-ol (2.c) 0 produto 2.b é protegido do mesmo modo que 1.c. Juntam-se 100 ml de CH2CI2. Juntam-se gota a gota 39,2 g (179 mmol) de di-terc-butildicarbonato dissolvido em 100 ml de dioxano. A solução é deixada sob agitação durante 72 h. O solvente é evaporado, junta-se KHS04. 0 produto é extraído com AcOEt (3 x 100 ml); as fases são reunidas e lavadas com KHS04, NaHC03, NaCI, secas sobre MgS04 e evaporadas. São obtidos 20 g (rendimento de 83% em relação ao produto inicial). O produto é cristalizado em EP. CCF: Rf (EP:AcOEt; 1:1 (v:v)) = 0,23 Rf (EP:AcOEt; 1:2 (v:v)) = 0,63 RMN (ppm): 1,4 (2s, 36H : 4 x (CH3)3)); 1,65 (qt, 4H : 2 χ NCH2CH2CH2NH); 2,95 (q, 4H : 2 χ NHCH2CH2); 3,1 (2d, 4H : NCH2CHCH2N); 3,2 (t, 4H : NCH2CH2); 3,85 (m, 1 H : OH); 5,9 (s, 2H : NH) EM: MH+ = 605, PM = 604 2.d Preparação de ácido 1.3-bis-{3-terc-butoxicarbonilamino(terc-butoxicarbonil-aminopropil)-2-propil-2-etoxicarbonilmetoxiacético (2.d) São dissolvidos 604 mg (1 mmol) de produto 2.c em 20 ml de CH2CI2. São introduzidos 2 equivalentes de anidrido (2 mmol; 0,232 g), 2,2 f 17 Β0 059 bb 0 7b6 240/hl equivalentes de NEt3 (307 μΙ, depois 100 μΙ) e 6,5 g de DMAP. Após 24 h de agitação à temperatura ambiente, adiciona-se à mistura CH2CI2, lava-se com KHS04, NaCI, seca-se sobre MgS04, filtra-se e depois evapora-se. São obtidos 0,156 g de produto (rendimento de 22%). CCF: Rf (CHCI3:MeOH:AcOH; 90:8:2 (v:v:v)) = 0,71 RMN (ppm): 1,2-1,4 (2s, 36H : 4 x (CH3)3); 1,5 (m, 4H : 2 χ NHCH2CH2CH2N); 2,85 (q, 4H : 2 x NHCH2CH2); 3,1 (m, 8H : 4 χ NCH2); 3,9-4,2 (2s, 4H : 2 x OCH2COO); 5,25 (m, 1 H : CH2CHCH2); 6,7 (2H : NH) EM: MH+ = 721, PM = 720 2.e Preparação do (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 1,3-bis-{3-terc-butoxicarbonilamino(terc-butoxicarbonilaminopropill-2-propilo (2.e) São dissolvidas 0,216 mmol do ácido 2.d em 3 ml de CHCI3. Junta-se 1 equivalente de DODA (0,113 g), 3 equivalentes de NEt3 (100 μΙ) e 1,1 equivalentes de BOP (0,11 g). A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 24 h. O CHCI3 é evaporado. Juntam-se 100 ml de AcOEt. A fase orgânica é lavada com HCI (0,5 M), com NaHC03, com NaCI até pH = 7, seca sobre MgS04 e depois evaporada. São obtidos 0,185 g (rendimento de 70%). É efectuada uma coluna de sílica. São recolhidos 110 mg de produto (rendimento de 42%). CCF: Rf (CHCI3:MeOH:AcOH; 90:8:2 (v:v:v)) = 0,81 Rf (EP:AcOEt; 1:1 (v:v)) = 0,67 RMN (ppm): 0,85 (t, 6H : 2 x CH3); 1,20-1,55 (m, 100H : CH2/C(CH3)3); 1,6 (m, 4H : 2 x NHCH2CH2CH2N); 3,05-3,4 (m, 16H : 2 x NHCH2CH2CH2N/NCH2CHCH2N/2 x CH2N); 4,1 (s, 2H : NC0CH20); 4,15 (s, 2H : OCH2COO); 5,25 (m, 1H : CH2CHCH2); 6,15 (m, 2H : NH) EM: MH+ = 1224, PM = 1223 2.f Preparação do (dioctadecilcarbamoilmetoxi)acetato de 1,3-bis-{3-terc-butoxicarbonilamino(terc-butoxicarbonilaminopropil)-2-propilo (2.f)
Junta-se 1 ml de TFA a 0,0247 g de produto 2.e (0,021 mmol) num tubo "Eppendorf"® de 1,5 ml e deixa-se uma hora à temperatura ambiente. O TFA é evaporado. 86 05Γ th ú ? bó Z4Ú/rΊ
18
Juntam-se 505 μΙ de etanol de modo a obter uma solução a 40 mM, necessária para os testes biológicos. EM: MH+ = 824, PM = 823 EXEMPLO 3
Preparação de (N,N-dioctadecil)succinamato de 2-(3-aminopropilamino)-1-(3-aminopropilaminometil)etilo H i
Este composto é preparado de acordo com o protocolo descrito anteriormente no exemplo 2, substituindo o ácido diglicólico pelo ácido succínico. A análise por espectrometria de massa do produto assim obtido indica um fragmento MH + de 808, o que está em conformidade com a massa esperada.
UTILIZAÇÃO DE LIPOPOLIAMINAS DE ACORDO COM O INVENTO PARA A TRANSFECÇÃO !N VITRO DE MATERIAL GENÉTICO A Plasmídeos utilizados para a transferência de genes in vitro
Utiliza-se o plasmídeo pCMV-LUC. Este consiste numa construção possuindo o gene repórter "luciferase", derivado quer do plasmídeo pGL2-Basic Vector® (Promega) quer do plasmídeo pGL2-Control Vector® (Promega) através de inserção de um fragmento M!u\-Hind\\\ contendo o promotor do Citomegalovírus humano (CMV), extraído do vector plasmídico pcDNA3® (Invitrogen). 19 86 056 ir.r 0 790 240/Ki B Protocolo de preparação das solução utilizadas para a transfeccão
As lipopoliaminas preparadas de acordo com os exemplos anteriores são colocadas em solução a 40 mM em etanol e depois diluídas numa mistura etanol/água mantendo uma concentração etanólica inferior a 10%.
As soluções de ácido nucleico a transfectar são diluídas em soro fisiológico (NaCI 0,15 M) e depois adicionadas às soluções de lipopoliamina, numa proporção de 1/1 (v/v). Após homogeneização no vórtex e incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, as soluções de ADN/lipopoliamina são distribuídas a 9% (v/v) final pelos poços onde as células foram lavadas com meio de cultura desprovido de proteínas (soro). EXEMPLO 4
Influência da proporção de cargas (aminas/fosfatos) sobre a eficácia da transfeccão.
As amostras de 1χ105 células NIH 3T3 em fase exponencial de crescimento sobre 2 cm2 são tratadas com soluções de lipopoliaminas/pCMV-LUC, apresentando proporções de cargas variáveis, durante 4 horas a 37°C sob C02 a 5%; cada amostra recebeu 1 pg de ácido nucleico. A pesquisa da expressão do gene repórter é efectuada após adição de soro fetal de vitelo a 8% final seguido de uma incubação de 40 horas na estufa com C02. A actividade da luciferase é doseada através da emissão de luz [RLU = unidade de luz relativa] na presença de luciferina, coenzima A e ATP durante 20 segundos e em relação aos pg de proteína no sobrenadante obtidos após lise das células. Os resultados obtidos são apresentados na tabela I abaixo. 20 p.f 05Γ
EH 0 796 24CI/PI
Lipopoliamina do exemplo 1 Lipopoliamina do exemplo 2 Proporção de cargas Luminescênci a coef. de var. (%) luminescência coef. de var. (%) 1 69 5 23 34 2 5091 3 252 6 4 3636 30 7890 3 6 21334 3 61401 5 8 40846 3 73224 2 10 55321 1 77633 2 12 53239 5 48634 5 14 36 10 52417 2 ADN sozinho 52 5
TABELA I
Cada valor corresponde à média de três ensaios independentes.
Esta experiência mostra claramente que as lipopoliaminas de acordo com o invento permitem a transferência de genes nas condições requeridas para a sua expressão. EXEMPLO 5
Influência da concentração de ácido nucleico nas misturas ADN/lipopoliamina.
De acordo com o mesmo protocolo que é descrito no exemplo anterior as células NIH 3T3 são tratadas com misturas ADN/lipopoliaminas nas condições em que diferentes concentrações de ADN são utilizadas para uma mesma proporção de cargas.
Neste caso, a actividade da luciferase é medida durante 20 segundos e referida a 2,5x103 células tratadas. Os resultados são apresentados nas tabelas II e III abaixo. 21 PT 05ί- ΕΡ ϋ 796 240/ΡΊ
Lipopoliamina do exemplo 1
Proporção de cargas pg de ADN x 4 x 6 x 8 x 10 0,25 27 (19) 25 (20) 32 (31) 36 (15) 0,5 23 (5) 37 (54) 4476 (4) 4811 (19) 1,0 4945 (12) 19194 (14) 30933 (21) 39357 (3) 2,0 93937 (2) 105533 (1) 111167 (14) 8315 (15) 3,0 106293 (11) 100093 (8) 53475 (12) 4,0 98553 (10) 69863 (8)
TABELA II
Lipopoliamina do exemplo 2
Proporção de cargas pg de ADN x 4 x 6 x 8 x 10 0,25 40 (17) 52 (64) 122 (14) 51 (5) 0,5 28 (10) 204 (25) 36533 (7) 44473 (7) 1,0 3427 (12) 48167 (13) 49363 (13) 50083 (9) 2,0 33377 (13) 44697 (18) 30670 (16) 9544 (4) 3,0 9686 (3) 31557 (2) 9157 (8) 4,0 4321 (9) 40105 (10)
TABELA III
Cada valor corresponde à média de três ensaios independentes.
Os valores dentro de parêntesis correspondem ao coeficiente de variação expresso em %.
Lisboa, 28. M 200Í
Por AVENTIS PHARMA S.A. - O AGENTE OFICIAL -
Claims (19)
- Pf Pf fEP 0 796 240/P1 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Lipopoliamina na forma D, L ou DL ou um dos seus sais caracterizada por ser representada pela fórmula geral I I R na qual - m é um número inteiro compreendido entre 2 e 6 inclusivamente, - n é um número inteiro compreendido entre 1 e 9 inclusivamente, necessariamente com um só grupo R que não hidrogénio presente na fórmula geral e os valores de m variáveis ou idênticos no seio dos diferentes grupos -(CH2)m- ou -(CH)m-, R - R representa um átomo de hidrogénio ou um radical de fórmula geral II:R4Y—R6 na qual - X e X' representam, independentemente um do outro, um átomo de oxigénio, um grupo metileno-(CH2)q- com q igual a 0, 1, 2 ou 3, ou um grupo amino -NH-ou -NR’- com R' representando um grupo alquilo em C-, a C4, - Y e Y" representam, independentemente um dos outro, um grupo metileno, um grupo carbonilo ou um grupo C = S, - R3, R4 e R5 representam, independentemente uns dos outros, um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo, substituído ou não, em C, a C4, com p podendo variar entre 0 e 5, - R6 representa um grupo colesterol ou um grupo alquilamino -NR.,R2 com R., e R2 representando independentemente um do outro, um radical alifático, saturado ou não, linear ou ramificado C12 a C22. tP 0 ?9b 240/ΡΊ 2/6
- 2. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por n ser escolhido de preferência entre 1 e 5.
- 3. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por R ser representado de preferência pela fórmula geral ΙΓ OR5 II na qual R3, R4, R5, R6 e p correspondem às definições propostas na reivindicação 1 e X representa um átomo de oxigénio ou um grupo -(CH2)q- com q igual a zero.
- 4. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 ou 3 caracterizada por ser tf N-H Bna forma D, L, DL ou um dos seus sais. 86 05f LP 0 796 240/Pi 3/65. ser Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 ou 3 caracterizada porna forma6. ser D, L, DL ou um dos seus sais. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 ou 3 caracterizada por H N-Hna forma 7. ser D, L, DL ou um dos seus sais. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1 ou 3 caracterizada por H N-H / o y. N-H 10-alfa-colesterilo * pr (ir.( EP 0 796 240/P7 4/6 nf* na forma D, L, DL ou um dos seus sais.
- 8. Composição farmacêutica caracterizada por conter pelo menos uma lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7 e pelo menos um ácido nucleico.
- 9. Composição de acordo com a reivindicação 8 caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido desoxirribonucleico.
- 10. Composição de acordo com a reivindicação 8 caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido ribonucleico.
- 11. Composição de acordo com a reivindicação 8, 9 ou 10 caracterizada por o ácido nucleico ser modificado quimicamente.
- 12. Composição de acordo com uma das reivindicações de 8 a 11 caracterizada por o ácido nucleico ser anti-sentido.
- 13. Composição de acordo com uma das reivindicações de 8 a 11 caracterizada por o ácido nucleico possuir um gene terapêutico.
- 14. Composição de acordo com a reivindicação 13 caracterizada por o gene terapêutico codificar para uma proteína implicada no metabolismo dos lípidos tal como uma apolipoproteína escolhida de entre as apolipoproteínas A-l, A-ll, A-IV, B, C-l, C-ll, C-lll, D, E, F, G, H, J e apo(a), uma enzima tal como a lipoproteína lipase, a lipase hepática ou outras lipases, a lecitina-colesterol-aciltransferase, a 7-alfa-colesterol-hidroxilase, a fosfatase do ácido fosfatidíco, uma proteína de transferência de lípidos tal como a proteína de transferência de ésteres de colesterol e a proteína de transferência de fosfolípidos, uma proteína de ligações de HDL ou ainda um receptor escolhido por exemplo de entre os receptores LDL, receptores de restos quilomicrónicos e os receptores "scavenger".
- 15. Composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico, uma lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7 e um adjuvantePC ΓΓίEP Ο 796 240/ΡΊ 5/6 capaz de se associar ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico e de melhorar o seu poder transfectante. 6. Composição de acordo com a reivindicação 15 caracterizada por o adjuvante ser um ou vários lípidos neutros.
- 17. Composição de acordo com a reivindicação 16 caracterizada por o lípido ou os lípidos neutros serem escolhidos de entre os lípidos sintéticos ou naturais, zwiteriónicos ou desprovidos de carga iónica em condições fisiológicas.
- 18. Composição de acordo com a reivindicação 17 caracterizada por o lípido ou os lípidos neutros serem lípidos de 2 cadeias gordas.
- 19. Composição de acordo com a reivindicação 18 caracterizada por o lípido ou os lípidos neutros serem escolhidos de entre a dioleoilfosfatidiletanolamina {DOPE), a oleoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), a di-estearoil, -palmitoil, -miristoilfosfatidiletanolamina assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilgliceróis, os diacilgliceróis, os glicosildiacilgliceróis, os cerebrósidos (tais como especificamente os galactocerebrósidos), os esfíngolípidos (tais como especificamente as esfingomielinas) e os asialogangliósidos (tais como especificamente os asialoGMI e GM2).
- 20. Composição de acordo com uma das reivindicações de 15 a 19 caracterizada por compreender de 0,1 a 20 equivalentes de adjuvante para 1 equivalente de lipopoliamina, e, de preferência , de 1 a 5.
- 21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 20 caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável.
- 22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 20 caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma aplicação sobre a pele e/ou as mucosas. PP ppc EP 0 796 240/ ΡΪ 6/6
- 23. Utilização de uma lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7 para preparar uma composição para a transfecção in vivo ou in vitro de células. Lisboa, 23. JUN. 2001 Por AVENTIS PHARMA S.A.Ag. Of. Pr. Ind· Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA
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