TW201710503A - 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種在個體中抑制或降低癌細胞生長的方法，其藉由施予治療上有效量的Puf-A抑制劑，以使個體中癌症的症狀及徵象降低。本發明亦提供一種多核苷酸及編碼靶向Puf-A表現的shRNAs的載體，以有利於治療的癌症。

Description

新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
相關申請案的交互參照
本申請案主張於申請於2015年6月12日的美國專利臨時申請案第62/174,572號及2015年7月29日的美國專利臨時申請案第62/198,290號之優先權效益，其全部內容於此併入作為參考。
Puf家族是繼Pumilio(果蠅屬(Drosophila))及FBF(Fem-3 mRNA結合因子，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))之後，命名的一種演化保留性蛋白質家族，Puf家族成員通常可藉由約35至39個胺基酸的重複八個連續的Puf且該重複結合至標的mRNA的3'非轉譯區(UTR)中的特異序列的呈現所辨識。Puf-A基因被J Yu等人首次報告，且發現其不僅在眼睛發展時扮演重要角色，其更參與了原生殖細胞(primordial germ-cell)遷移及生殖細胞系之特化(J Yu等人，《從演化分析預測的新穎puf-A基因係涉及眼部及原生殖細胞的發展》(A Novel puf-A Gene predict from Evolutionary Analysis Is involve in the Development of eye and Primordial germ-cell)PLoS ONE 4(3)：e4980.doi：10.1371/journal.pone.0004980)。
癌症仍然是全球主要的公眾健康問題，腫瘤蛋白P53，一種腫瘤抑制基因於人類癌症中為最常見的突變基因，所有人類癌症中超過半數皆在此特定基因帶有突變。值得注意的，具有P53突變或缺陷的患者會具有較差的預後及/或較高的藥物抗性。儘管癌症治療已於過去幾十年中有所進展，但醫學界仍面對治療多種形態癌症的挑戰，尤其是P53突變或缺陷的癌症。因此，仍然需一個更有效及安全的癌症治療方式，尤其是針對p53缺陷癌症，本發明即解決此種需求及其他的需求。
因此，本發明提供一種在需要的個體抑制或毒殺癌細胞的方法，其藉由使癌細胞接觸治療上有效量的Puf-A抑制劑。
本發明另提供一種在需要的個體抑制或毒殺癌細胞的方法，其藉由施予有效量的治療試劑降低或敲落(knock down)Puf-A的表現及/或降低Puf-A的活性。
本發明更提供一種抑制癌細胞的方法，其藉由抑制癌細胞中Puf-A表現。
在部分實施例中，係提供編碼小髮夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)分子的多核苷酸，以降低Puf-A表現。在部分實施例中，上述多核苷酸包含本文所述之Puf-A基因的序列。
在其他實施例中，亦提供載體(vector)，其包含啟動子及編碼shRNA的多核苷酸，其中該多核苷酸的核苷酸序列係為至少90%同源(homologous)於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
本發明另揭示醫藥組成物，其包含本文所述之載體以及醫藥上可接受的賦形劑或載體(carrier)。
用於本文中的用語「發明(invention)」、「該發明(the invention)」、「此發明(this invention)」及「本發明(the present invention)」意指廣義地涉及本專利及以下申請專利範圍的所有申請標的(subject matter)。包含此些用語的敘述應理解為並未限制本文所述的申請標的，或限制以下申請專利範圍的含義或範圍。由此專利涵蓋的本發明的實施方式係由以下的申請專利範圍所界定，而非此發明內容。此發明內容為本發明之各種態樣的上位概述，以及簡介將在後述實施方式中進一步描述的部分概念。本發明內容並非旨在識別主張的申請標的的關鍵或必要特徵，也非旨在用於獨立地界定主張的申請標的範疇。申請標的應當藉由參考整體說明書、任何或所有圖式以及各申請專利範圍中的適當部分來理解。
本發明將藉由閱讀以下的附圖及詳細地描述而更顯而易見。
本發明或本申請案包含至少一個彩圖呈現的圖式。本發明或本申請案中彩圖的拷貝版本將根據承辦單位的要求提供及支付必要的費用。
本發明的實施方式的說明將搭配下列圖式而詳細地敘述：
第1A圖描述在各種類型的癌症中Puf-A的表現。第1B圖係繪示在眼癌、直腸癌、皮膚癌及乳癌中，較高的Puf-A表現與較短的整體生存率(overall survival rate)具關聯性之組圖。
第2A圖為顯示在正常肺細胞、高分化肺腺癌(lung adenocarcinoma)細胞及低分化肺腺癌細胞中的Puf-A表現之免疫組織化學染色影像組圖。第2B圖為繪示在類癌腫瘤(carcinoid tumors，COID)、肺的腺癌(ADC)、肺的鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas，SCC)、小細胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)及正常肺樣本(左圖)的Puf-A RNA水平(level)，以及在不同的階段的人類肺腺癌中Puf-A RNA水平(右圖)之一系列圖表。第2C圖為繪示Puf-A RNA的表現與具有肺腺癌的患者的生存率之間的關聯性之一系列圖表。
第3圖為繪示Kras在Puf-A表現影響的一系列圖式。第3A圖顯示利用西方墨點轉漬法、RT-PCR及Q-PCR分析法在控制組及KrasG12D轉導(transduce)組中Kras活化對Puf-A水平的影響。第3B圖顯示利用西方墨點轉漬法、RT-PCR及Q-PCR分析法在控制組及c-Myc轉導組中c-Myc活化的影響。第3C圖是顯示藉由雙冷光報導分析(dual-luciferase reporter assay)測定在KrasG12D或c-Myc轉染細胞中Puf-A啟動子活性(promoter activity)之一系列長條圖。第3D圖繪示c-Myc蛋白結合至H1299及HCT116細胞中的Puf-A基因座的外顯子1(exon 1)。第3E圖顯示藉由西方墨點轉漬法、RT-PCR及Q-PCR分析兩個Kras突變細胞株H460(KrasQ61H)及HCT116(KrasG13D)中Kras消耗對Puf-A水平的影響。第3F圖係繪示在H460(KrasQ61H)及HCT116(KrasG13D)癌細胞中Raf抑制劑(Raf(i))、MEK1抑制劑(PD98059)及 MEK1/2抑制劑(UO126)對Puf-A、磷酸化ERK1/2、總ERK1/2及β肌動蛋白(β-actin)表現的影響之西方墨點轉漬影像組圖。
第4圖的(A)部分是繪示在KrasG12D活化之前(左側)以及在KrasG12D活化12週後(右側)，在小鼠的支氣管細胞及肺泡細胞的Puf-A免疫組織化學染色之影像組圖。第4圖的(B)部分是顯示在KrasG12D活化及p53缺失2週(左側)及8週(右側)之後，在小鼠的支氣管細胞及肺泡細胞中的Puf-A免疫組織化學染色。
第5A圖係示意性繪示運送Puf-A shRNA以敲落Puf-A的體內(in vivo)研究設計。第5B圖係為繪示在施予控制shRNA或Puf-A shRNA之小鼠的腫瘤灶(tumor foci)個數之顯微影像的組圖。第5C圖是繪示在施予控制組或Puf-A-2shRNA後，在具有腺癌(左側長條圖)及腺瘤(adenoma)(右側長條圖)的小鼠中腫瘤灶(>250μm)的計算個數之一系列長條圖。
第6A圖顯示人類Puf-A基因(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。第6B圖顯示編碼shPuf-A-1(SEQ ID NO：2)及shPuf-A-2(SEQ ID NO：3)的多胜肽的核苷酸序列。第6C圖及第6D圖繪示藉由RT-PCR及Q-PCR分析法測定在直腸癌細胞(HCT116)及肺癌細胞(H1299)中，控制shRNA、shPuf-A-1及shPuf-A-2的Puf-A敲落效率。
第7A圖係為顯示藉由將控制shRNA、shPuf-A-1及Puf-A-2轉導進入下列p53缺陷(deficient)及p53功能正常(proficient)細胞株：A549、H460、U87、HCT116、H1299、CL1-5、MB231、LN229及T98的控制shRNA、shPuf-A-1及Puf-A-2對Puf-A表現及切割形式(cleaved form)的PARP1的影響之影像組圖。第7B圖是繪示Puf-A消耗(shPuf-A轉導)的p53功能正常(p53野生型)及p53缺陷(p53缺陷(p53 defective))癌細胞株的細胞週期之一系列的流式細胞圖(flow cytometry，FACS)。第7C圖是顯示在p53+/+HCT116、p53-/-HCT116及p53-/-H1299癌細胞株中，shPuf-A-1轉導對Puf-A、LC3(自噬體的標記)、LAMP2(溶酶體的標記)及p62(自噬受質)表現的影響之一系列西方墨點轉漬影像。第7D圖是繪示在p53功能正常細胞(H460)中抑制p53及Puf-A的影響之西方墨點轉漬影像。第7E圖是繪示在p53功能正常(p53+/+)HCT116、p53缺陷(p53-/-)HCT116及H1299癌細胞中，藉由轉導shPuf-A-1靜默Puf-A對LC3(綠色)、Lamp1(紅色)及DAPI(藍色)表現的影響之一系列免疫螢光影像。第7F圖是繪示相較於控制shRNA轉導，在shPuf-A-1及shPuf-A-2轉導之後降低p53-/- HCT116及H1299細胞的增生率(proliferation rate)之一系列圖表。
第8A圖是繪示在下列p53正常表現(p53+/+)癌細胞株：A549、H460及HCT116中，shPuf-A1及shPuf-A2轉導增加p53及p21的表現及降低PUF-A的轉錄之一系列西方墨點轉漬影像、RT-PCR影像及Q-PCR圖表。第8B圖是繪示在控制shRNA及shPuf-A-1轉導之後，在p53正常表現(p53+/+)癌細胞株：A549、H460及HCT116細胞、以及P53缺陷(p53-/-)HCT116癌細胞中，p53(紅色)及DAPI(藍色，內部控制組)的表現之一系列免疫染色影像。第8C圖是繪示具有不同的p53基因型的A549、H460及HCT116之Puf-A消耗癌細胞之FACS分析的細胞週期之一系列長條圖。第8D圖為顯示Puf-A的消耗顯著降低p53正常表現(p53+/+)A549及H460細胞的增生率之兩個圖表。
第9A圖係為繪示在A549肺癌細胞、HCT116大腸癌細胞、MB231乳癌細胞及T98神經膠質母細胞瘤(glioblatoma)細胞中，25uM及50uM的白藜蘆醇 (resveratrol)降低Puf-a的表現之西方墨點轉漬影像組圖。第9B圖是繪示25uM及50uM的白藜蘆醇有效地降低A549肺癌細胞、HCT116大腸癌細胞、MB231乳癌細胞及T98神經膠質母細胞瘤細胞的增生之組圖。
定義
如以上所述及本揭露全文之下列用語，除非另有說明，應理解為具有以下含義。
用於本文中的用語「發明(invention)」、「該發明(the invention)」、「此發明(this invention)」及「本發明(the present invention)」意指廣義地涉及本專利及以下申請專利範圍的所有申請標的(subject matter)。包含此些用語的敘述應理解為並未限制本文所述的申請標的，或限制以下申請專利範圍的含義或範圍。由此專利涵蓋的本發明的實施方式係由以下的申請專利範圍所界定，而非此說明書。該說明書並非旨在識別主張的申請標的的必要特徵，該說明書的任何部分也非旨在用於獨立地界定主張的申請標的範疇。主張的申請標的係藉由參考包含所有內容及圖式及各申請專利範圍之整體說明書的適當部分來理解。
如本文所用的單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」，除非上下文另有明確說明，亦包括複數的意思。
本文所用之「有效量(effective amount)」包含足以降低癌症的症狀及/或徵象(sign)的Puf-A抑制劑的劑量，癌症的症狀及/或徵象包括但不限於體 重減輕、疼痛及腫瘤塊，其為臨床上可觸知的腫塊或放射學上透過各種成像方式可偵測的腫瘤塊。
本文所用之用語「治療(treating)」、「治療的(treared)」或「治療(treatment)」包含用於預防(例如：預防性)、緩和及治療用途或結果。
用語「抑制(inhibit)」及「降低(reduce)」包括有減緩、預防或停止成長。
用語「個體(subject)」可意指具有癌症的脊椎動物或被認為需要進行癌症治療的脊椎動物。個體可包含有溫血動物，例如哺乳類，例如靈長類，以及較佳地為人類。非人類的靈長類亦可作為個體。用語「個體」包含馴養動物，例如：貓、狗等，例如家畜(舉例來說：牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，以及實驗動物(例如：小鼠、兔子、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。如此，本文涵蓋獸醫用途和醫藥製劑。
對於本發明中的特定核酸序列之同一性(identity)或同源性(homology)是如本文的候選序列中核酸殘基的百分比所界定，其在若需要時對齊序列並引入間隙(introducing gap)之後，同一或同源的特定殘基達到最高同源百分比。用於比較的核苷酸序列的對齊方法為所屬技術領域中所熟知。NCBI基礎局部對齊搜尋工具(NCBI Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403，1990)可來自多個來源，包含國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI，Bethesda,Md.)以及在網際網路上用於連線至序列分析程式，例如blastn。使用此程式如何界定序列同一性的描述可在NCBI網站上獲得。
用語「多核苷酸(polynucleotide)」意指包含單數核酸及複數個核酸，以及意旨分離的核酸分子或構築，例如訊息RNA(mRNA)、病毒衍生RNA(virally derived RNA)、或質體DNA(pDNA)。多核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵(phosphodiester bond)或非習知的鍵結(例如：如在肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)中發現的醯胺鍵(amide bond))。用語「核酸」意指存在於多核苷酸的任一個或多個核酸片段，例如，DNA或RNA片段。藉由「分離(isolated)」核酸或多核苷酸意指從自然的環境取出的核酸分子(DNA或RNA)。例如，在考量本發明的目的之下，考慮分離含有於載體的編碼治療性胜肽之重組多核苷酸。分離核苷酸的進一步示例包含保存在異源性(heterologous)宿主細胞或在溶液中(局部或實質上)純化的多核苷酸。分離的RNA分子包含本發明以及正股(strand)或負股形式、及雙股形式的體內(in vivo)或體外(in vitro)的RNA轉錄。根據本發明之分離的多核苷酸或核酸更包含合成生產的分子。此外，多核苷酸或核酸可是或可包含調控元件，例如啟動子、核糖體結合位或轉錄終止子。
除非本文另有說明，本文記載的數值範圍僅意指作為各自參考落入範圍中的各獨立數值之簡記法，且各獨立數值係如本文各自記載而併入說明書中。本文所有數字可理解為由「約」所修飾。在一實施例中，當參考可測量值，例如數量、時間周期等時，除非另有其他特定，用語「約」意指涵蓋特定數值的±10%的變異，較佳為±5%的變異、更佳為1%的變異，最佳為±0.1%的變異，例如，變異適用於同源的百分比(%)。
抑制(inhibit)或抑制(suppress)癌細胞成長的方法
本發明的部分實施例中係針對在個體中抑制癌細胞生長或毒殺癌細胞的方法，其包含施予治療上有效量的Puf-A抑制劑至需要的個體，藉此降低個體的癌症症狀及/或徵象。
Puf-A為高保存性Puf家族成員。SEQ ID NO：1為人類Puf-A基因的DNA序列，且SEQ ID NO：4為人類Puf-A基因的胺基酸序列。較高Puf-A表現與癌症的更進階性階段及較短生存率具關聯性，請見實例1及2。
在不受任何特定理論的約束下，其認為Kras及/或c-Myc活化增強Puf-A表現，隨著Kras活化Ras/Raf/ERK路徑，其促進c-Myc結合至Puf-A啟動子，以誘導Puf-A在癌細胞中表現，如實例3及第3D圖所示。
本組成物及方法可用以預防、治療或抑制癌細胞的生長。在部分實施例中，係提供藉由施予治療上有效量的Puf-A抑制劑預防或抑制癌細胞生長的方法。在一例示性實施例中，待治療的癌症或抑制的癌症生長為表現Puf-A的癌症，係選自直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、類癌、頭及頸癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤癌、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、皮膚癌、泌尿上皮癌、腎癌、胃癌、胰腺癌及肝癌。在另一例示性實施例，待治療癌症或抑制癌症生長的是p-53缺陷的癌症，係選自直腸癌、肺癌、乳癌及神經膠質母細胞瘤。
在其他實施例，提供用於具有腺瘤的個體中預防肺癌之方法，係藉由施予治療上有效量的Puf-A抑制劑，其中降低或停止個體中的腺瘤發展成腺癌。
在一實施例中，Puf-A抑制劑可單獨施予，或作為手術的佐劑，例如在手術之前降低腫瘤的尺寸及/或在手術之後例如，藉由抑制經由血流循環的腫瘤細胞的生長及遷移，以降低移轉(metastases)的可能性。在另一實施例中，Puf-A抑制劑可與抗癌劑在之前、之後或同時施予。在特定情況，上述治療包含抗癌劑的組合物以與Puf-A抑制劑一併施予。抗癌劑可包含習知的化療劑、靶向癌症治療或放射治療。
Puf-A抑制劑
Puf-A抑制劑可為降低或敲落Puf-A表現及/或降低Puf-A活性的任何試劑。
Puf-A基因表現可藉由施予Puf-A抑制劑而降低0.1至100%。例如，其表現量可被降低0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至99%。表現可被降低至上述間隔的任何數量(%)，例如2-4%、11-14%、16-19%、21-24%、26-29%、31-34%、36-39%、41-44%、46-49%、51-54%、56-59%、61-64%、66-69%、71-74%、76-79%、81-84%、86-89%、91-94%、96%、97%、98%或99%。基因表現可藉由所屬技術領域已知方法量測，例如基因表現連續性分析(serial analysis of gene expression，SAGE)。
在一實施例中，用語「敲落(knock-down」意指基因靜默(gene silence)的技術，其中在相較於shRNA或小干擾RNA(small interfere RNA，siRNA)的導入之前的基因表現，Puf-A基因的表現降低。例如，)，可涉及siRNA的使用之RNA干擾(RNA interference，RNAi)已成功應用於敲落植物、果蠅(D. melanogaster)、秀麗隱桿線蟲、錐蟲(trypanosomes)、渦蟲(planaria)、水螅(hydra)以及包括小鼠和斑馬魚的部分脊椎動物的特定基因的表現，例如可詳見，美國專利第7,416,849號。
在一實施例中，Puf-A抑制劑可為小分子，Puf-A抑制小分子的非限定例可包含Raf激酶(kinase)抑制劑，例如Raf(i)(購自Santa Cruz，美國)、抑制促分裂活化(mitogen-activated)蛋白激酶酵素的MEK抑制劑(例如：PD98059，可購自Cell signaling，美國；及UO126，可購自Cell signaling，美國)、及例如白藜蘆醇的二苯乙烯(stilbene)。在一實施例中，白藜蘆醇有效的抑制P53缺陷癌細胞，在另一實施例中，白藜蘆醇有效抑制P53功能正常癌細胞。
在部分實施例中，Puf-A抑制劑為靶向(targeting)Puf-A RNA轉錄的shRNA，以降低Puf-A的表現。在另一實施例中，Puf-A抑制劑為靶向Puf-A的小干擾RNA的生物合成前驅物。在又一實施例中，Puf-A抑制劑為任何RNA種類，例如但不限於微RNA(microRNA，miRNA)、核糖核酸內切酶製備的siRNA(endoribonuclease-prepared siRNA，esiRNA)、自然反義短干擾RNA(natural antisense short interfering RNA，natsiRNA)、小干擾RNA(siRNA)，其中該RNA種類靶向Puf-A RNA轉錄以降低RNA的表現。
在一例示性實施例，Puf-A抑制劑可為編碼具有同源於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核苷酸序列的shRNA之多核苷酸。在另一例示性實施例中，Puf-A抑制劑是本文揭露的載體。
Puf-A抑制劑可以任何有效量施予。在部分實施例中，施予的劑量範圍可為約0.01μg至約5g、約0.1μg至約1g、約1μg至約500mg、約10μg至約100mg、約50μg至約50mg、約100μg至約10mg、約0.5μg至約5μg、約15μg至約500μg、約3μg至約1mg、約7μg至約1mg、約10μg至約20μg、15μg至約1mg、約15μg至約300μg、約15μg至約200μg、約15μg至約100μg、約15μg至約60μg、約15μg至約45μg、約30μg至約60μg、或約50μg至約100μg。在特定實施例，Puf-A抑制劑施予的劑量範圍為約0.1μg/kg體重至約200mg/kg體重、約1μg/kg體重至約100mg/kg體重、約100μg/kg至約50mg/kg體重、約0.5mg/kg至約20mg/kg體重、約1mg/kg至約10mg/kg體重、約10μg/kg體重至約200μg/kg體重、至少約0.01μg/kg體重、約0.1μg/kg體重、或至少約0.5μg/kg體重。
施予用於抑制癌細胞的Puf-A抑制劑的劑量將依據治療狀況的嚴重性、特定配方以及其他臨床因子(例如受試者的體重及通常狀況、以及施予途徑)。
Puf-A抑制劑的使用劑量是藉由比對其體外活性以及在動物模型中的體內活性而定。針對在小鼠及其他動物中的有效劑量外推至人類的方法是所屬技術領域已知；舉例來說，參閱美國專利第4,938,949號，其全文內容於此併入作為參考。
根據本文提供的方法，Puf-A抑制劑藉由各種路徑的任一來遞送，該途徑包含但不限於注射(例如：皮下、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮內)；皮膚(cutaneous)；真皮(dermal)；經皮(transdermal)；經口(例如：藥片、藥丸、液體藥物、可食性膜條(edible film strip)；植入滲透泵；栓劑、噴霧劑(aerosol spray)、局部(topical)、關節內(intra-articular)、經眼(ocular)、鼻吸入、肺吸入、壓印至皮膚及陰道。
Puf-A抑制劑可在適合於治療狀況的時間週期之下以單一劑量治療或多次劑量治療來施予。Puf-A抑制劑可便於適當間隔施予，舉例來說，在至少3個月或直到解決狀況的病症及徵象的期間，一天一次、一天兩次、一天三次、每兩天一次、每三天一次或每周一次。
載體
本發明的部分實施例中係使用可遞送至癌細胞的載體。如本文所述，用語「載體」意指任何病毒或非病毒載體、以及在雙股或單股的線性或環狀形式的任何質體、黏質體(cosmid)、嗜菌體或二元載體，其可為或不可為自行轉移(self-transmissible)或可遷移(mobilizable)、以及可藉由融入細胞基因組或可存在於染色體外(例如，具有複製起點的自主複製質體)轉型原核宿主細胞或真核宿主細胞。所屬技術領域熟知的任何載體預想用於本發明的實施。
病毒載體的非限制例可包含腺相關病毒載體(adeno-associated viral vector)、慢病毒載體(lentivirus vector)、腺病毒載體(adenoviral vector)、脊髓灰質炎病毒載體(polioviral vector)、單純皰疹病毒載體(herpes simplex viral vector)、或鼠類病毒載體。非病毒載體的的非限制例包含DNA載體(編碼可藉由脂轉染(lipofection)引導至體內的期望序列)、合成陽離子脂類(用於編碼標記的基因的體內轉染的脂質體(參見Feigner等人，(1987年)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；Mackey等人(1988年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027-31；Ulmer等人(1993年)Science 259：1745-8))。用於轉移核酸的特定使用的脂類化合物及 組成物已揭露於國際專利公開案WO95/18863及WO96/17823、以及美國專利第5,459,127號的內容。脂類可化學性耦合至用於傳遞至用於靶向目的的其他分子。例如標靶胜肽(例如：荷爾蒙或神經傳遞質(neurotransmitter)、蛋白質(例如抗體)、或非胜肽分子可化學性耦合至脂質體。亦使用利於將核酸的轉染至體內的其他分子，例如陽離子寡肽(例如，國際專利公開案WO95/21931)、衍生自DNA結合蛋白的胜肽(例如，國際專利公開案WO96/25508)、或陽離子聚合物(例如，國際專利公開案WO95/21931)。
根據本發明的病毒載體可在介於約104及約1014pfu的劑量形式進行通常配製及施予。在腺相關病毒(AAVs)及腺病毒的情況，具體使用約106至約1011pfu的劑量形式。用語「空斑形成單位(plaque-forming unit，pfu)」對應於懸浮液的病毒粒子(virion)的感染力，其藉由適當細胞培養的感染及量測形成的溶菌斑數量而定義。用於定義病毒溶液的pfu力價(titer)的技術為所屬技術領域已知。
本發明之載體包含編碼shRNA的多核苷酸，其具有同源於SEQ ID NO：2及ID NO：3的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核苷酸序列。多胜肽可操作地連結至一或多個啟動子。
在一實施例中，啟動子通常為上游(5')至其編碼序列的核苷酸序列，其藉由提供用於被RNA聚合酶及固有轉錄所需的其他因子所辯識，以引導及/或控制編碼序列的表現。在一例示性實施例，啟動子包含最小啟動子，意即短DNA序列包含TATA盒(TATA-box)及作為指向轉錄起始的其他序列，以加入用於控制表現的調控元件。在另一實施例中，啟動子可為包含最小啟動子以及 調控元件的核苷酸序列，意即其可控制編碼序列或功能性RNA的表現。此類型的啟動子序列由近端以及更遠端的上游元件所構成，而後者元件經常稱為強化子(enhancer)。在部分實施例中，強化子為促進啟動子活化的DNA序列，以及其可為啟動子的先天元件(innate element)或插入以增強啟動子水平或組織特異性的異源性元件。其可在兩個位向(有義(sense)或反義(antisense))進行操作，甚至當自啟動子的上游或下游移動時可進行運作。兩種強化子及其他上游啟動子元件結合至介導其效果的特定序列DNA結合蛋白。啟動子可自原生基因衍生成其整體形式、或為自自然界中發現的不同啟動子衍生的不同元件的組合，或甚至可包含合成DNA片段。啟動子亦可包含具有結合蛋白因子之DNA序列，其對應於生理或發育條件控制轉錄起始的有效性。所屬技術領域熟知的調控shRNA或RNA編碼序列的表現之任何啟動子可預想用於本發明的實施。
shRNA可藉由基因治療方法，利用shRNA可被直接地轉錄的DNA載體形式遞送進入哺乳類細胞，具體為人類細胞。此shRNAs產物可藉由以承載藉由少量的(例如：3、4、5、6、7、8、9)核苷酸所分離的短反向重覆序列的DNA載體轉染細胞或組織而容易地到達體內，該少量的核苷酸引導此小髮夾RNA的轉錄。此外，若在含有引導載體或載體片段整合(integration)進入宿主細胞基因組、或確保轉錄載體的穩定性的機制，則可製作穩定及可遺傳且由編碼的shRNA產生的RNAi。此技術不僅用於「敲落」哺乳類細胞中特定基因的表現，現亦可成功地使用於敲落外源性表現的轉殖基因以及活體小鼠的腦及肝臟中的內生性基因的表現。
醫藥組成物
本發明的部分實施例為針對醫藥組成物，其包含本文所述的載體(vector)以及醫藥上可接受的載體(carrier)。
本文中的用語「醫藥上可接受的載體(pharmaceutical acceptable carrier)」係為可與配方的其他成分相容且不會有害於受試者的載體。用於施予的活性成分可作為粉末或顆粒呈現；作為溶液、懸浮液、乳化劑或全文說明書其他部分所述的型態呈現。
在一實施例中，醫藥組成物可藉由將具有液態載體、固態載體或其兩者的醫藥組成物(例如：載體(vector))之活性成份均勻且緊密地結合而製備。液態載體可包含但不限於水性配方、非水性配方或其組合。固態載體可包含但不限於生物載體、化學載體或其組合。
醫藥組成物係以水性懸浮液、油性乳劑、油包水乳劑及水包油包水(water-in-oil-in-water)乳劑的方式施予，且在載體中可包含但不限於乳霜、凝膠、脂質體(中性、陰離子或陽離子)、脂奈米球(lipid nanosphere)或微球(microsphere)、中性、陰離子或陽離子聚合奈米粒子(nanoparticle)或微粒子(microparticle)、特定位乳劑(site-specific emulsion)、長駐留乳劑(long-residence emulsions)、黏性乳劑、微乳劑、奈米乳劑、微球、奈米球、奈米粒子及微量泵(minipumps)、以及具有可容許醫藥組成物持續釋出的各種天然或合成聚合物，其包含陰離子、中性或陽離子多醣、以及陰離子、中性、陽離子聚合物或共聚物，微量泵或聚合物可植入在需要遞送組成物的附近。此外，本文提供的醫藥組成物的活性成份可用於任一載體或載體的任意組合，其包含但不限於抗氧化劑、緩衝液及抑菌劑、以及可選擇性包含懸浮劑、增稠劑或防腐劑。
下列實例可進一步描述本發明。該些實例僅旨於本發明的說明，但不解釋為限制本發明。
實例1：在各種癌症中Puf-A的表現
Puf-A的表現使用免疫組織化學染色評估20種形態的癌症。Puf-A表現在直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、類癌、頭及頸癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤癌、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、皮膚癌、泌尿上皮癌、腎癌、胃癌、胰腺癌及肝癌中為中等至高度，如第1A圖所示。
第1B圖係為卡普蘭-梅爾(Kaplan-Meier)分析的患者整體生存率、以及眼癌、直腸癌、皮膚癌及乳癌中Puf-A表現之組圖。較高Puf-A表現(紅線)與眼癌、直腸癌、皮膚癌及乳癌的患者的較短整體生存率具關聯性。
實例2：在進階性人類肺腺癌中Puf-A的表現
Puf-A的表現是利用抗體針對正常肺組織、高分化及低分化的肺腺癌中的Puf-A進行檢測。其結果顯示，相較於正常肺組織，Puf-A表現在肺腺癌較高、且其與分化的程度相關(即，在低分化的腺癌中Puf-A最高)，如第2A圖所示。
Puf-A RNA表現係以126位具有肺癌的患者評估，其為基於取自自單一來源(http：//www.genome.wi.mit.edu/MPR/lung(PNAS，98：13790-137952001)的數據。在126患者中，10位具有類癌腫瘤(COID)、109位具有腺癌(ADC)、11位具有鱗狀細胞癌(SCC)、6位具有小細胞肺癌(SCLC)、以及13位非腫瘤性的肺樣本作為控制組(正常組織)。請參閱第2B圖(左側圖式)，所有的肺癌的Puf-A RNA表現高於正常組織，在ADC相較於正常組織表現最高水平的Puf-A RNA(7.8倍)。在具有第I階段ADC的55位患者、具有第II至III階段ADC的22位患者、以及15位非腫瘤性肺樣本(正常組織)中，分析在不同的階段ADC中Puf-A RNA的表現。第2B圖(右側圖式)顯示，相較於正常組織，在第I階段ADC及第II至第III階段ADC的Puf-A RNA的表現分別為5.9倍及12.0倍。
卡普蘭-梅爾分析顯示，相較於較低的Puf-A表現(藍線)，ADC中較高的Puf-A表現(紅線)與患者的較短生存率(整體生存率或無復發存活率)具關聯性(第2C圖)。
實例3：Kras活化對Puf-A表現的體外評估
Kras活化對Puf-A表現的影響的體外評估是利用轉導KrasG12D及轉導控制載體的H1299肺癌細胞上進行。Puf-A蛋白及RNA的表現水平將以西方墨點轉漬法及qPCR分析。
如第3A圖所示，相較於轉導控制載體的肺癌細胞，在轉導KrasG12D的肺癌細胞中Puf-A蛋白及RNA的表現水平係分別增加2倍及1.5倍。相較於轉導控制載體的細胞，在轉導KrasG12D的肺癌細胞中c-Myc蛋白及RNA的表現水平分別增加1.8倍及1.4倍。
由於Kras訊號涉及c-Myc表現的誘導，且可活化c-Myc表現(Nature 475：106-109，2011)，因此利用感染c-Myc或控制載體病毒的H1299肺癌細胞評估c-Myc活化對Puf-A表現的影響。相較於轉導控制載體的細胞，在轉 導c-Myc的細胞中Puf-A蛋白及RNA的表現水平係分別增加2.5倍及1.7倍(第3B圖)。
除此之外，Puf-A啟動子活性係在轉染KrasG12D或c-Myc表現質體的細胞中進行測定。相較於控制載體，可發現KrasG12D及c-Myc分別增加2.2倍以及3.2倍的Puf-A啟動子活性(第3C圖)，係表示c-Myc可能涉及Puf-A基因表現的轉錄控制。除此之外，相較於p53+/+HCT116癌細胞，在p53-/-HCT116癌細胞中有較多的內生性c-Myc蛋白(未顯示數據)。
為了確認c-Myc涉及Puf-A基因表現的轉錄控制，將c-Myc或控制載體慢病毒感染H1299細胞以及使用染色質免疫沉澱(chromatinimmuno-precipitation，CHIP)分析以用於測定Puf-A啟動子中c-Myc共有序列(consensuses sequence)的位置。結果顯示，外源性c-Myc蛋白結合在Puf-A基因座的外顯子1(exon 1)的c-Myc共有序列，且相較於p53+/+細胞，更多的c-Myc蛋白結合至在p53-/- HCT116細胞的Puf-A基因座的外顯子1，其代表誘導Puf-A基因表現的c-Myc是經由c-Myc結合至Puf-A啟動子來介導(第3D圖)。
第3A圖的數據顯示，Kras訊號為Puf-A基因表現所需，包含H460肺癌細胞及HCT116直腸癌細胞的含有致癌基因Kras的兩個癌細胞株用於檢測Kras消耗對Puf-A表現的影響。在使用shKras消耗Kras之後，相較於轉導控制shRNA的細胞，Puf-A蛋白及RNA係顯著地降低(第3E圖)。
於H460及HCT116癌細胞中評估阻斷Kras路徑的下游效應子(effectors)(諸如Rafs、MEK1及MEK2)的各種小分子(諸如Raf(i)、PD98059及 UO126)的影響。第3F圖顯示在施予小分子以阻斷Kras路徑的下游效應子之後，降低Puf-A的表現水平。
實例4：致癌基因Kras活化對Puf-A表現的影響
以具有KrasG12D誘導的肺腺癌的CCSP-rtTA/TetO-Cre/LSL-Kras G12D p53+/+小鼠評估Puf-A的表現。將支氣管克拉拉細胞(Clara cell)定義為肺臟中Kras誘導腫瘤形成的起原細胞(HC Cho等人，《在KrasG12D誘導的肺腺癌中致瘤性細胞的識別》(Identification of Tumorigenic cell in KrasG12D-Induced Lung Adenocarcinoma)，Cancer Res.2011，71：7250-7258)。
在KrasG12D活化之前的正常小鼠中，支氣管及肺泡上皮細胞皆微弱陽性的Puf-A染色(第4圖的(A)部分，左側圖式)。在KrasG12D活化的12週之後，小鼠(CCSP-rtTA/TetO-Cre/LSL-Kras G12D p53+/+)的肺癌組織顯示在Puf-A陽性的支氣管細胞顯著地增加，而只有少數Puf-A陽性的肺泡細胞(第4圖的(A)部分，右側圖式)。
第4圖的(B)部分(左側圖式)及第4圖的(B)部分(右側圖式)分別顯示在CCSP-rtTA/TetO-Cre/LSL-Kras G12D /p53flox小鼠中KrasG12D活化及p53缺失2週及8週的結果。在KrasG12D活化及p53缺失2週之後，相較於肺泡上皮細胞，在支氣管上皮細胞顯示較多的Puf-A陽性細胞(第4圖的(B)部分，左側圖式)。在KrasG12D活化及p53缺失8週之後，Puf-A染色的強度在支氣管及肺泡上皮細胞皆更進一步增加，且在支氣管上皮細胞顯示較多(第4圖的(B)部分，右側圖式)。該結果表示Puf-A表現與致癌基因Kras的活化及/或p53消耗具關聯性。
實例5：Puf-A抑制對腫瘤形成的影響
Puf-A抑制對腫瘤形成的體內評估係利用LSL-Kras G12D /p53 flox 小鼠進行。
第5A圖係示意性繪示研究設計。LSL-Kras G12D /p53 flox 小鼠係於KrasG12D活化及p53缺失2週後生成腺瘤。將表現shPuf-A-2(Puf-A shRNA)或控制shRNA的慢病毒載體以一週兩次持續兩週鼻內遞送至承受腺瘤的LSL-Kras G12D /p53 flox 小鼠。小鼠係於KrasG12D活化及p53缺失6週之後進行犧牲。肺組織進行檢驗且顯示相較於控制載體，在以shPuf-A-2慢病毒載體處理的小鼠的肺支氣管及肺泡區域有較少腺癌灶，如第5B圖所示。相較於轉染控制shRNA載體的小鼠，以shPuf-A-2慢病毒載體處理的小鼠的腺癌或腺瘤灶(>250μm)的數量顯著地減少(分別減少15.4倍及2.6倍)(第5C圖)。該結果表示Puf-A在抑制肺腫瘤生成上是有效的，以及預防肺腺瘤進展成肺腺癌。
實例6：新穎的shPuf-A對Puf-A表現的影響
第6B圖顯示多胜肽的核苷酸序列，其編碼兩個新穎短髮夾RNAs：shPuf-A-1(SEQ ID NO：2)及shPuf-A-2(SEQ ID NO：3)。
第6B圖中的shRNA構築對Puf-A表現的影響係使用p53功能正常(p53+/+HCT116)及p53缺陷(p53-/-HCT116及p53-/-H1299)進行評估。細胞係轉導控制shRNA、shPuf-A-1及shPuf-A-2慢病毒載體，而Puf-A表現係由即時定量PCR及Q-PCR定義。第6C圖及第6D圖顯示，相較於控制shRNA，轉染shPuf-A-1及shPuf-A-2慢病毒載體的p53功能正常癌細胞及p53缺陷癌細胞的Puf-A RNA的表 現水平顯著地降低(GAPDH作為內部控制組)。相較於控制shRNA，shPuf-A-1及shPuf-A-2在Puf-A表現的敲落效果分別為約90%及75%(第6D圖)。
實例7：在癌細胞上靜默Puf-A的影響
使用肺癌細胞(A549、H460、H1299及CL1-5)；直腸癌細胞(HCT116)；乳癌細胞(MB231)及神經膠質母細胞瘤細胞(U87、LN229及T98)評估癌細胞上Puf-A的生物功能。在實例6中，相較於控制shRNA，轉染Puf-A-1及Puf-A-2病毒載體的癌細胞株在Puf-A蛋白的表現水平顯著地降低。除此之外，相較於控制shRNA的轉導，在p53缺陷細胞(p53-/- HCT116、p53-/- H1299、p53R248W CL1-5及p53R280K MB231)中，shPuf-A的轉導顯著地增加聚合ADP-核糖聚合酶1(Poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1)的切割形式。在p53功能正常癌細胞(p53+/+ A549、H460及HCT116)中，Puf-A消耗並未影響切割的PARP1的水平(第7A圖)。
請參閱第7B圖，在第7A圖中的癌細胞株係轉導shPuf-A病毒載體之後，與碘化丙啶(propidium iodide，PI)培養，以使用FACS評估基於DNA的細胞週期分布。相較於控制shRNA組，在p53缺陷癌細胞(p53-/-H1299及HCT116)以病毒載體轉導shPuf-A之後的亞G1(sub-G1)細胞群(藍色)顯著地增加。此結果與在p53缺陷癌細胞中消耗Puf-A之後，切割的PARP1的水平增加的結果(如第7A圖所示)一致，其表示在p53缺陷癌細胞中消耗Puf-A導致細胞死亡。
已有文獻報告，相應於各種刺激而耗損p53增加自噬潮(autophagic flux)以及LC3聚積、以及導致細胞死亡(PNAS，107：18511-18516，2010年)。第7C圖的西方墨點轉漬圖顯示在轉導shPuf-A之後的p53缺陷癌細胞 (p53-/- HCT116及H1299細胞)中顯著地增加LC3-II(自噬體的組成物)及LAMP2(溶酶體的組成物)的表現水平，而在相同的靜默Puf-A的p53缺陷癌細胞中的p62(在細胞中隨著自噬溶酶體(autolysosomes)的形成而酶解的受質)被降解且其表現水平顯著地降低。該結果表示p53缺陷癌細胞在shPuf-A載體的轉導後，走向自噬細胞死亡。
相較於p53缺陷細胞，在轉導shPuf-A-1及shPuf-A-2之後在p53功能正常細胞(p53+/+ HCT116)中Puf-A的消耗導致LC3-II表現的水平稍微增加(第7C圖)。然而，相較於只有Puf-A消耗(第7C圖及第7D圖)，在p53功能正常細胞(p53+/+ H460)中同時消耗p53及Puf-A導致在LC3-II及LAMP2的表現顯著地增加(第7D圖)。
如第7E圖之免疫螢光染色圖所示，相較於在p53功能正常癌細胞的細胞核的周圍的LAMP1稍微增加，在轉導shPuf-A-1載體之後的p53缺陷癌細胞中的LC3-II(綠色)以及LAMP1(紅色)的表現及共定位(co-localization)增加。此表示隨著Puf-A的消耗導致自噬潮的增加、異常的LC3-II聚積及自噬細胞死亡，而使異常自噬溶酶體形成於p53缺陷癌細胞中。
相較於轉導控制shRNA病毒的相同癌細胞，在轉導shPuf-A-1及shPuf-A-2之後降低p53缺陷癌細胞及p53功能正常癌細胞的增生率(第7F圖)。該結果表示Puf-A的抑制誘導癌細胞的自噬細胞死亡，且在p53缺陷細胞中更顯著。
實例8：在p53功能正常癌細胞中Puf-A抑制的影響
將shPuf-A-1、shPuf-A-2或控制shRNA病毒載體感染A549、H460或HCT116癌細胞，以檢測在p53功能正常癌細胞中Puf-A抑制對p53及p21的蛋白質或RNA的表現水平的影響。第8A圖顯示相較於感染控制shRNA的癌細胞，在p53功能正常癌細胞中的p53及p21的蛋白質或RNA的表現水平顯著地增加。在免疫螢光染色亦有類似的發現，在消耗Puf-A之後的p53功能正常細胞，其p53核染色(紅色)增加(第8B圖)。相同癌細胞株的細胞週期進展係藉由FACS進行分析，如第8C圖所示，在轉導shPuf-A之後的p53功能正常癌細胞中，S-期的細胞群顯著地降低，而G0/G1期的細胞群增加。第8D圖繪示在消耗Puf-A之後的p53功能正常A549及H460癌細胞的生長率顯著地降低。該結果表示藉由在p53功能正常癌細胞中靜默Puf-A的表現，增加p53及p21的表現，會導致在p53功能正常細胞中延遲細胞循環。
實例9：Puf-A抑制對肝癌細胞的影響
Puf-A抑制對肝癌細胞的影響進行評估。將P53功能正常(p53+/+ HepG2)及p53缺陷(p53-/- Hep3B及p53Y220C Huh-7)肝癌細胞感染Puf-A shRNA或控制shRNA。
相較於控制組，在感染Puf-A shRNA的p53功能正常及p53缺陷肝癌細胞中，Puf-A的表現降低且細胞死亡增加。
實例10：白藜蘆醇對Puf-A表現及癌細胞影響的體外評估
白藜蘆醇在各種癌細胞對Puf-a蛋白的表現水平及細胞增生率的影響的體外評估進行檢測。下列癌細胞係以0.25uM或50uM的白藜蘆醇(購自 Sigma，美國)進行處理：A549肺癌細胞(p53功能正常)、HCT116大腸癌細胞(p53功能正常)、MB231乳癌細胞(p53缺陷)及T98神經膠質母細胞瘤細胞(p53缺陷)。該癌細胞中Puf-A蛋白的表現係藉由西方墨點轉漬法進行分析，且細胞增生率係以xCELLigenece RTCA系統(ACEA Biosciences Inc，美國)進行細胞增生分析來測定。第9A圖係繪示在A549肺癌細胞、HCT116大腸癌細胞、MB231乳癌細胞及T98神經膠質母細胞瘤細胞中，25uM及50uM的白藜蘆醇降低Puf-A的表現之西方墨點轉漬組圖。第9B圖係繪示相較於控制組(未處理白藜蘆醇)，25uM及50uM的白藜蘆醇降低A549肺癌細胞、HCT116大腸癌細胞、MB231乳癌細胞及T98神經膠質母細胞瘤細胞的增生之圖表組。
<110> 長庚紀念醫院，林口
<120> 新穎核甘酸多核苷酸、載體、醫藥組成物以及Puf-A抑制劑的其用途
<130> CGMH-LK-15001-TWI
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<150> US 62/174,572
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<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1947
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> Puf A基因的shRNA(shRNA for the Puf A gene)
<400> 2
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Puf A基因的shRNA
<400> 3
<210> 4
<211> 648
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4

Claims (19)

  1. 一種Puf-A抑制劑在製備於個體內抑制癌細胞的醫藥組成物的用途，其包含使癌細胞接觸治療上有效量的Puf-A抑制劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該癌細胞為P-53缺陷癌細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該P-53缺陷癌細胞係選自由直腸癌、肺癌、乳癌及神經膠質母細胞瘤所構成的群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該癌細胞表現Puf-A。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中表現Puf-A的該癌細胞係選自由直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、類癌、頭及頸癌、甲狀腺癌、神經膠質瘤、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、皮膚癌、泌尿上皮癌、腎癌、胃癌、胰腺癌以及肝癌所構成的群組。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途、其中該Puf-A抑制劑係為小髮夾RNA(shRNA)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中編碼該shRNA的多核苷酸具有至少90%與SEQ ID NO：2同源之核苷酸序列。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中編碼該shRNA的多核苷酸具有至少90%與SEQ ID NO：3同源之核苷酸序列。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中編碼該shRNA的多核苷酸併入至一載體中。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該載體係為病毒載體。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該載體係為非病毒載體。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該Puf-A抑制劑係選自Raf(i)、PD98059、UO126或白藜蘆醇。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該Puf-A抑制劑係為白藜蘆醇。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該Puf-A抑制劑係在一抗癌劑之前或之後施予、或與該抗癌劑同時施予。
  15. 一種多核苷酸，其包含至少90%與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3同源的核苷酸序列。
  16. 一種載體，其包含：(a)一啟動子；以及(b)一多核苷酸，其具有至少90%與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3同源的核苷酸序列。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之載體，其中該多核苷酸編碼一shRNA。
  18. 一種醫藥組成物，其包含：(a)一載體(vector)，其包含一啟動子；以及一多核苷酸，其中該多核苷酸具有至少90%與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3同源的核苷酸序列；以及(b)一醫藥上可接受的載體(carrier)。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之醫藥組成物，其中該多核苷酸 編碼一shRNA。
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