CN103784962A - 抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。所述组合物由提高序列表序列1所示蛋白（PTEN）表达的物质和抑制序列表序列3所示蛋白（B）表达的物质组成。实验证明，恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达与单独恢复蛋白PTEN的表达或单独抑制蛋白B的表达相比，重组胶质瘤细胞系的AKT磷酸化水平明显下调，细胞增殖、集落形成受到明显的抑制，细胞停在G0/G1时期的比例和细胞凋亡率显著提高；移植小鼠体内的胶质瘤在经恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达治疗的第20—48天肿瘤体积没有增长，且肿瘤重量在治疗的第48天几乎为0。本发明为神经胶质瘤提供了一种新的有效的联合治疗方案，具有广阔的应用前景。

Description

抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。

背景技术

神经胶质瘤，又称胶质细胞瘤，简称胶质瘤，是神经上皮或支持细胞所衍生。脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞，是成人中最常见的原发性脑肿瘤，占颅脑肿瘤比例的40-50%。脑部神经胶质细胞由星形细胞（astrocytoma）、室管腔细胞（ependymal）和寡树突神经胶质细胞共同组成。在脑胶质瘤中，起源于星形胶质细胞或星形胶质细胞祖细胞的星形细胞瘤具有最高发病率。根据世界卫生组织的规定标准和病人的存活情况，星形细胞瘤被分为四个等级：纤维性星形细胞瘤（I级），弥漫性星形细胞瘤（Ⅱ级），间变性星形细胞瘤（Ⅲ级），多形性胶质母细胞瘤（GBM，Ⅳ级）。其中，间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤属于恶性胶质瘤，而且预后不佳。尤其是多形性胶质母细胞瘤，尽管采取手术，放疗以及化疗的联合治疗，病人也只有不到12个月的生存期。

神经胶质瘤细胞的多药耐药性是化疗失败的最主要原因。研究发现在GBM型脑胶质瘤中，染色体7p的扩增和染色体10q上的等位基因丢失频繁地发生。更进一步研究表明染色体7p的扩增源于EGFR（epidermal growth factor receptor）蛋白的上调表达而染色体10q丢失的基因则是肿瘤抑制基因PTEN（phosphatase and tensinhomologue）。EGFR的扩增和PTEN的丢失，导致了PI3K/AKT信号通路的过度活跃，这可能是GBM高度恶性表型和化疗耐药性的重要原因。因此，PI3K/AKT信号通路的过度激活和脑胶质瘤的形成与发展之间的关系将成为很有吸引力的GBM基因治疗研究内容。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制神经胶质瘤生长的组合物及其应用。

所述组合物由如下A）和B）两种物质组成：

A）在离体细胞中表达PTEN蛋白的物质；

B）抑制神经胶质瘤细胞中pll0 β蛋白表达的物质。

所述A）物质可为PTEN蛋白、PTEN蛋白的编码基因或编码PTEN蛋白的载体；

所述A）物质和所述B)物质分别独立包装。

在上述组合物中，所述PTEN蛋白具体可为序列表序列1所示蛋白；所述pll0β蛋白具体可为序列表序列3所示蛋白。

PTEN蛋白是肿瘤抑制基因PTEN所表达的蛋白，pll0β蛋白是PIK3CB基因所表达的PI3K β亚型脂激酶的一个催化亚单位p110。

在上述组合物中，所述A）物质为含有所述PTEN蛋白编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组病毒；

所述B）物质为所述pll0β蛋白的抑制剂，该抑制剂可为抑制所述pll0β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞；也可为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂如LY294002或Wortmannin。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)为一种由调节亚单位p85或p101和催化亚单位p110组成的脂激酶，通过催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)而激活下游的Akt等从而对细胞的增殖、生存和代谢等起关键作用。

在上述组合物中，所述A）物质中的所述PTEN蛋白的编码基因为序列表序列2所示的DNA分子；

所述B）物质中的所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA；

所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列。

在上述组合物中，所述A）物质中的所述重组表达载体是将所述PTEN蛋白编码基因插入载体pRetro-on的BamH I和NotI位点间得到的重组载体；

所述B）物质中的所述由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA一条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示；

在上述组合物中，所述B）物质中的所述干扰RNA的编码基因为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。

在上述组合物中，所述B）物质中的所述重组表达载体为将所述干扰RNA的编码基因插入载体pRNAT-U6.1/Neo的BamH I和HindⅢ位点间得到的重组载体。

本发明保护上述任一所述组合物在制备下述任一所述产品（或药物）中的应用：

1）降低神经胶质瘤细胞中的AKT磷酸化水平的产品（或药物）；

2）抑制神经胶质瘤细胞的增殖和/或集落形成的产品（或药物）；

3）抑制神经胶质瘤细胞周期进程（或提高神经胶质瘤细胞停在G0/G1时期的比例）的产品（或药物）；

4）促进神经胶质瘤细胞凋亡的产品（或药物）；

5）抑制动物体内神经胶质瘤生长的产品（或药物）。

本发明所述神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞为缺失序列表序列1所示蛋白的神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞，在本发明的实施例中，所述神经胶质瘤或神经胶质瘤细胞来源于人类U251胶质母细胞瘤细胞株或SHG-44胶质母细胞瘤细胞株。

本发明还保护抑制所述pll0β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞。

所述干扰RNA可为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA；

所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列；

所述小干扰RNA一条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示；

所述干扰RNA的编码基因具体可为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。

实验证明，恢复蛋白PTEN（序列表序列1所示蛋白）协同抑制pll0β蛋白（序列表序列3所示蛋白，简称蛋白B）的表达与单独恢复蛋白PTEN的表达或单独抑制蛋白B的表达相比，重组胶质瘤细胞系的AKT磷酸化水平明显下调，细胞增殖、集落形成受到明显的抑制，细胞停在G0/G1时期的比例和细胞凋亡率显著提高；移植小鼠体内的胶质瘤在经恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达治疗的第20—48天肿瘤容积没有增长，且肿瘤重量在治疗的第48天几乎为0。本发明为神经胶质瘤提供了一种新的有效的联合治疗方案，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为各重组胶质瘤细胞系中目的基因或蛋白的表达检测。其中，图A为Westernblot检测转染PTEN基因的重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系UP中PTEN表达，左侧泳道为对照U251，右侧泳道为UP；图B为实时荧光定量PCR检测转染PIK3CA基因的RNA干扰重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系UA中PIK3CA基因的相对表达量，UC为对照；图C为实时荧光定量PCR检测转染PIK3CB基因的RNA干扰重组表达载体后的重组胶质瘤细胞系U1和U2中PIK3CB基因的相对表达量，UC为对照。

图2为Western blot检测重组胶质瘤细胞系中AKT的磷酸化水平。其中，图A为Western blot结果，图B为各重组胶质瘤细胞系中的p-AKT/AKT值相对于对照UPC’中p-AKT/AKT值的百分比。

图3为培养1—6天时各重组胶质瘤细胞系的细胞存活率。

图4为各重组胶质瘤细胞系的集落形成分析。其中，图A为克隆形成的荧光照片，标尺代表500μm，图B为相对克隆数，**表示两组数据在P﹤0.01有极显著差异。

图5为各重组胶质瘤细胞系锚地依赖性的集落形成分析。其中，图A为克隆形成的结晶紫染色图，图B为相对克隆数，**表示两组数据在P﹤0.01有极显著差异。

图6为各重组胶质瘤细胞系的细胞周期检测。其中，图A为流式细胞图，图B为不同细胞周期所占比例的柱形统计图。

图7为各重组胶质瘤细胞系的细胞凋亡检测。其中，图A为经Annexin V-PE试剂处理的流式细胞图；图B为DAPI染色的细胞核形态图，标尺代表250μm；图C为细胞凋亡率的柱形统计图，**表示两组数据在P﹤0.01有极显著差异。

图8为各重组胶质瘤细胞系移植小鼠体内试验结果。其中，图A为移植第48天的小鼠外观；图B为移植第20—48天小鼠体内肿瘤体积变化线形图；图C为移植第48天小鼠体内肿瘤重量的柱形统计图；*表示与UPC’相比差异显著（P﹤0.05）；**表示与UPC’相比差异极显著（P﹤0.01）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1、RNA干扰重组表达载体构建

1、RNA干扰靶序列的选择

1）针对序列表序列3所示蛋白（简称为蛋白B）的全长cDNA序列（如序列表序列4所示，即PIK3CB基因），选择如下两段DNA序列为RNA干扰抑制序列表序列3所示蛋白表达的靶序列：

sh-1：序列表序列4的第1166-1184位（即5’-CCACTGGAATTTGATATTA-3’）；

sh-2：序列表序列4的第439-457位（即5’-GGATCCTGAAGTAAATGAA-3’）；

序列表序列4中第17位至第3229位为开放阅读框，编码序列表序列3所示的蛋白，该蛋白为PI3K β亚型脂激酶的一个催化亚单位p110。

2）针对PI3K α亚型脂激酶的一个催化亚单位p110（简称为蛋白A）的全长cDNA序列（NCBI号：NM_002645，即PIK3CA基因），选择如下一段DNA序列为RNA干扰抑制该蛋白表达的靶序列：

sh-A：5’-CCACTGGAATTTGATATTA-3’。

3）对照：不针对任何人类基因，选择如下一段DNA序列为RNA干扰的对照靶序列：

sh-C：5’-GTGGACTCTTGAAAGTACTAT-3’。

2、小干扰RNA（siRNA）

根据步骤1的靶序列，抑制蛋白B表达的两种siRNA（siRNA-1和siRNA-2）的序列如下：

1）siRNA-1

siRNA-1-F：5’-CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3’；

siRNA-1-R：5’-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3’；

2）siRNA-2

siRNA-2-F：5’-GGAUCCUGAAGUAAAUGAA-3’（序列表序列5所示）；

siRNA-2-R：5’-UUCAUUUACUUCAGGAUCC-3’（序列表序列6所示）。

根据步骤1的靶序列，抑制蛋白A表达的siRNA（siRNA-A）的序列如下：

3）siRNA-A

siRNA-A-F：5’-CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3’；

siRNA-A-R：5’-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3’；

根据步骤1的靶序列，对照的siRNA（siRNA-C）的序列如下：

4）siRNA-C

siRNA-C-F：5’-GUGGACUCUUGAAAGUACUAU-3’；

siRNA-C-R：5’-AUAGUACUUUCAAGAGUCCAC-3’。

3、短发夹RNA（shRNA）

衍生步骤2所示siRNA的shRNA的序列分别如下（小写字母表示茎环序列，大写字母表示两个短的反向重复序列）：

1）shRNA-1（衍生siRNA-1）：

5’-CCACUGGAAUUUGAUAUUAaactcgagttUAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3’；

2）shRNA-2（衍生siRNA-2）：

5’-GGAUCCUGAAGUAAAUGAAaactcgagttUUCAUUUACUUCAGGAUCC-3’；

3）shRNA-A（衍生siRNA-A）：

5’-CCACUGGAAUUUGAUAUUAaactcgagttUAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3’；

4）shRNA-C（衍生siRNA-C）：

5’-GUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCAC-3’。

4、编码siRNA及shRNA的DNA分子的设计与合成

1）以sh-1为靶点的表达shRNA-1的双链DNA分子（DNA-1）的两条单链DNA序列如下：

DNA-1-F：

5'-gatccCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa-3'

DNA-1-R：

5'-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGg-3’

2）以sh-2为靶点的表达shRNA-2的双链DNA分子（DNA-2）的两条单链DNA序列如下：

DNA-2-F：

5'-gatccGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCCttttttggaaa-3'（序列表序列7所示）；

DNA-2-R：

5'-agcttttccaaaaaaGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCCg-3’（序列表序列8所示）；

3）以sh-A为靶点的表达shRNA-A的双链DNA分子（DNA-A）的两条单链DNA序列如下：

DNA-A-F：

5'-gatccGCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa-3

DNA-A-R：

5'-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttUAAUAUCAAATTCCAGTGGg-3’

4）以sh-C为靶点的表达shRNA-C的双链DNA分子(DNA-C)的两条单链DNA序列如下：

DNA-C-F：

5'-gatccGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCACttttttggaa a-3';

DNA-C-R：

5'-agcttttccaaaaaaGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCACg-3’。

5、RNA干扰重组表达载体构建

1）分别取步骤4中合成的互补的单链DNA混合，退火获得四种双链DNA分子，分别取这四种双链DNA进行磷酸化处理，获得四种双链DNA反应体；

2）取载体pRNAT-U6.1/Neo（南京金斯瑞生物科技有限公司）先用BamH I和HindⅢ酶切后，回收pRNAT-U6.1/Neo的载体骨架片段；

3）将步骤2）获得的pRNAT-U6.1/Neo的载体骨架片段与步骤1）获得的四种双链DNA反应体分别连接，得到四种RNA干扰重组表达载体pRNAi-sh-1、pRNAi-sh-2、pRNAi-sh-A和pRNAi-sh-C；经测序证实，载体pRNAi-sh-1为载体pRNAT-U6.1/Neo的BamH I和HindⅢ位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-1获得的重组载体；载体pRNAi-sh-2为载体pRNAT-U6.1/Neo的BamH I和HindⅢ位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-2获得的重组载体；载体pRNAi-sh-A为载体pRNAT-U6.1/Neo的BamHI和HindⅢ位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-A获得的重组载体；载体pRNAi-sh-C为载体pRNAT-U6.1/Neo的BamH I和HindⅢ位点间插入了步骤4的双链DNA分子DNA-C获得的重组载体。

实施例2、蛋白PTEN的重组表达载体构建

将蛋白PTEN（如序列表序列1所示）的编码基因（如序列表序列2所示）插入到多西环素诱导的逆转录病毒表达载体pRetro-on（BD Clontech公司）的BamH I和NotI位点间，获得重组表达载体PTEN/pRetro-on,经测序证实，载体PTEN/pRetro-on是在pRetro-on的BamH I和NotI位点间插入了序列表序列2所示的DNA分子。

实施例3、恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达对重组胶质瘤细胞中AKT磷酸化水平的影响

人类U251胶质母细胞瘤细胞株（U251）：在中国典型培养物保藏中心细胞库的编号为3115CNCB00312；

人类SHG-44胶质母细胞瘤细胞株（SHG-44）：中国科学院细胞库，目录编号为TCHu48；

U251和SHG-44均为PTEN缺失的神经胶质瘤细胞株；

实施例3—5的重组胶质瘤细胞除特别说明外的培养条件如下：

培养基：DMEM培养基（Gibco,货号12800-017），辅以10％热灭活胎牛血清（FBS），4mM谷氨酰胺，50units/ml青霉素和50μg/ml链霉素；

培养条件：37℃,5%CO₂培养箱培养。

1、稳定重组胶质瘤细胞系的构建

将实施例2获得的载体PTEN/pRetro-on用Pheonix细胞（Orbingen）包装，取病毒上清液在MOI=1（即感染时病毒与细胞数量的比值为1）下感染U251细胞；感染的细胞在添加1μg/ml嘌呤霉素的培养基中筛选直到未转染的细胞完全消失，获得了含有载体PTEN/pRetro-on的U251重组胶质瘤细胞系（命名为UP）。

按lipofectamine 2000（Invitrogen）试剂说明书将实施例1步骤5获得的四种RNA干扰重组表达载体pRNAi-sh-1、pRNAi-sh-2、pRNAi-sh-A和pRNAi-sh-C分别按照2μg:1×106个细胞的比例转染至U251细胞或含有载体PTEN/pRetro-on的U251重组胶质瘤细胞，用添加了600μg/ml G418的培养基筛选稳定表达的转染细胞，获得表1所示的重组胶质瘤细胞系。

表1.重组胶质瘤细胞系中所含有的载体

注：“√”表示U251的重组胶质瘤细胞中含有该载体。

2、Western blot检测重组胶质瘤细胞系中PTEN蛋白的表达

对表1所示的在含有1μg/ml的多西环素下培养用以表达PTEN蛋白的转染48小时的重组胶质瘤细胞系UP提取总蛋白，以β-actin为内参，进行Western blot检测，以U251为空白对照，检测PTEN蛋白的抗体为PTEN抗体(购自Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录编号为sc-7974)，检测内参β-actin的抗体为Actin抗体(购自碧云天生物技术研究所，产品目录号为AA128)。结果如图1的A所示，结果表明，转化PTEN/pRetro-on的重组胶质瘤细胞系UP可表达PTEN蛋白，而U251中无PTEN蛋白的表达。

3、实时荧光定量PCR检测重组胶质瘤细胞系中目的基因的表达

在载体pRNAi-sh-1、pRNAi-sh-2、pRNAi-sh-A和pRNAi-sh-C分别转染U251细胞的48小时后，对重组胶质瘤细胞系U1、U2、UA和UC分别进行实时荧光定量PCR检测，结果如图1（B和C）所示。结果表明，载体pRNAi-sh-A可明显降低胶质瘤细胞中PIK3CA基因的表达；载体pRNAi-sh-2与载体pRNAi-sh-1相比可以明显降低胶质瘤细胞中PIK3CB基因的表达。

上述实时荧光定量PCR的具体方法如下：

分别提取转染48小时的重组胶质瘤细胞系U1、U2、UA和UC总RNA，反转录后获得cDNA；以U1或U2的cDNA为模板用PIK3CB基因的特异引物FB和RB进行实时荧光定量PCR扩增；以UA的cDNA为模板用PIK3CA基因的特异引物FA和RA进行实时荧光定量PCR扩增；同时以UC的cDNA为模板进行扩增为对照。

以GAPDH为内参，引物为FC和RC。实时荧光定量PCR在7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.Actin）_Time x－（C_T.Target－C_T.Actin）_Time0

Time x表示任意时间点，Time ₀表示经GAPDH校正后1倍量的目标基因表达。

上述特异引物的序列如下：

PIK3CB基因的特异引物序列如下（靶序列为PIK3CB基因cDNA上的序列）：

FB：5'-CCCTTCTGAACTGGCTTAAAGA-3'；

RB:5'-GGACAGTGTAAATTCCTCAATGG-3'；

PIK3CA基因的特异引物序列如下（靶序列为PIK3CA基因cDNA上的序列）：

FA：5'-TCAAAGGATTGGGCACTTTT-3'；

RA:5'-GCCTCGACTTGCCTATTCAG-3'。

内参基因GAPDH的特异引物序列如下：

FC:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；

RC:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

4、Western blot检测重组胶质瘤细胞系中AKT的磷酸化水平

为了评估PTEN的恢复协同PIK3CA或者PIK3CB的静默是否可以抑制PI3K/AKT的信号转导，对表1所示的在含有1μg/ml的多西环素下培养用以表达PTEN的转染48小时的重组胶质瘤细胞系UP2、UPA和UPC分别提取总蛋白，以不含多西环素进行培养的转染48小时的重组胶质瘤细胞系UP2’、UPA’和UPC’为对照，以β-actin为内参，进行Western blot检测（图2A），检测AKT蛋白的抗体为anti-AKT（购自Cell Signaling Technology，产品目录号为#9272），检测p-AKT蛋白的抗体为anti-phospho-AKT(购自Abcam，产品目录号为ab18206)，检测内参β-actin的抗体为Actin抗体(购自碧云天生物技术研究所，产品目录号为AA128)。将杂交图片扫描保存为电脑文件，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。目的蛋白的灰度值除以图片内的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。结果如图2B所示。

结果表明：UP2（恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达）与UPA（恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白A的表达）及其他细胞系相比明显下调了AKT的磷酸化水平。

另外，将本实施例中上述重组胶质瘤细胞系的出发胶质瘤细胞U251换为SHG-44的实验结果与本实施例上述步骤1—4的实验结果相同。

实施例4、恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达对重组胶质瘤细胞系增殖和集落形成的影响

由于过度活跃的PI3K/AKT信号是细胞增殖失控，胶质母细胞瘤高锚地依赖性，和非锚地独立性增长的重要标志，所以有必要通过实验验证恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B或蛋白A的表达是否能有效地抑制这些恶性表型。

1、取实施例3中表1所示的重组胶质瘤细胞系UP2、UPA和UPC接种于96孔板，在存在1μg/ml的多西环素下进行培养（分别记为UP2、UPA和UPC），以不存在多西环素的培养为对照（分别记为UP2’、UPA’和UPC’），用四甲基偶氮唑盐实验方法(MTT)测定步骤1中培养1天、2天、3天、4天、5天和6天时各细胞系的增殖情况，具体的方法如下:加入MTT溶液（每孔20μl），37℃培养4h，弃上清，加入DMSO（每孔150μl）并震荡反应10min，然后于492nm测吸光度（OD₄₉₂），结果如图3和表2所示。

2、取实施例3中表1所示的重组胶质瘤细胞系UP2、UPA和UPC制备成细胞悬液（细胞密度为0.5×10³/ml）接种至6孔板上层[6孔板的每个孔中，上层为1ml含0.6g/100ml软琼脂同时含有1μg/ml多西环素的DMEM培养基（分别记为UP2、UPA和UPC）或者不含有多西环素的DMEM培养基（分别记为UP2’、UPA’和UPC’），下层为含1.2g/100ml软琼脂的DMEM培养基]，37℃培养2周后，在荧光显微镜下拍照观测(结果如图4A所示)，并对细胞相对克隆数（以相对于UPC’克隆数的百分数表示，%）进行统计分析(结果如图4B所示)。

3、取实施例3中表1所示的重组胶质瘤细胞系UP2、UPA和UPC制备成细胞悬液（细胞密度为0.5×10³/ml）接种至6孔板,然后加入含有1μg/ml多西环素的含2.5%FBS的DMEM培养基(分别记为UP2、UPA和UPC)或者不含有多西环素的含2.5%FBS的DMEM培养基（分别记为UP2’、UPA’和UPC’），37℃培养2周，每三天换液一次,然后用结晶紫染色后,拍照观察(结果如图5A所示),并对细胞相对克隆数（以相对于UPC’克隆数的百分数表示，%）进行统计分析(结果如图5B所示)。

表2.培养1—6天时各重组胶质瘤细胞系的细胞存活率(0D₄₉₂)

图3—5和表2的结果表明，UP2（恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达）与UPA（恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白A的表达）及UPC和对照相比细胞增殖最低；荧光结果显示锚地依赖性和非锚地独立性的集落形成在UP2（恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达）中的抑制效果最明显。

另外，将本实施例中上述重组胶质瘤细胞系的出发胶质瘤细胞U251换为SHG-44的实验结果与本实施例上述步骤1—3实验结果相同。

实施例5、恢复蛋白PTEN协同抑制蛋白B的表达对重组胶质瘤细胞系细胞周期和细胞凋亡的影响

1、对细胞周期的影响

取实施例3中表1所示的重组胶质瘤细胞系UP2和UPC接种于96孔板，分别用不含血清的细胞培养基中培养36小时（使其进入G0/G1期），随后加入10%FBS刺激重新进入细胞周期，同时加入或不加1μg/mL多西环素诱导PTEN的表达。刺激18小时后，用流式细胞仪检测细胞周期，结果如图6（A和B）所示，UP2表示重组胶质瘤细胞系中恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达；UP2’表示重组胶质瘤细胞系中只抑制蛋白B的表达；UPC表示重组胶质瘤细胞系中只恢复蛋白PTEN的表达；UPC’（对照）表示重组胶质瘤细胞系中既不恢复蛋白PTEN的表达也不抑制蛋白B的表达。

结果表明：UP2组的细胞停在G0/G1期的比例最高（P<0.05，与UPC或UP2’相比），UPC和UP2’组的细胞停在G0/G1期的比例明显高于UPC’（P<0.01）；即恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达抑制细胞周期进程的效果最明显。

上述流式细胞仪检测细胞周期的方法如下：

将不同处理的细胞用胰酶消化后，收集对数生长期的1×106个细胞，用1ml PBS缓冲液重悬，滴加至4mL预冷70%乙醇水溶液中，4℃固定过夜，离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤2次，用1ml PBS缓冲液重悬并加入RNaseA（使其浓度为20μg/mL），37℃孵育30min，离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤1次，用500μL PBS缓冲液重悬并加入1μL PI染色液，室温避光染色30min，用300目尼龙网过滤后进行流式细胞仪分析。

2、对细胞凋亡的影响

将pRNAi-sh-2和pRNAi-sh-C按照实施例3中步骤1的方法分别转染实施例3获得的重组胶质瘤细胞系UP，然后分别在含1μg/mL多西环素或不含多西环素的培养基中培养。转染24小时后，使用Annexin V-PE试剂用流式细胞仪检测各细胞系在不同培养条件下早期的凋亡细胞，结果如图7中的A所示。转染48小时后，用DAPI核染色剂在荧光显微镜下观察细胞核形态（如图7中的B所示），统计细胞凋亡率（如图7中的C所示），图7中UP2表示重组胶质瘤细胞系中恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达；UP2’表示重组胶质瘤细胞系中只抑制蛋白B的表达；UPC表示重组胶质瘤细胞系中只恢复蛋白PTEN的表达；UPC’（对照）表示重组胶质瘤细胞系中既不恢复蛋白PTEN的表达也不抑制蛋白B的表达。

结果表明：UP2组的早期细胞凋亡率最高（P<0.01，与UPC和UP2’相比），其次是UPC和UP2’（P<0.01，与UPC’相比）；即重组胶质瘤细胞系中恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达促进细胞凋亡的效果最明显。

实施例6、重组胶质瘤细胞系移植小鼠的体内试验

取6周龄的BALB/C裸鼠（广州医学实验动物中心），先随机分为4组(每组5只)，在皮下部位分别接种实施例3的重组胶质瘤细胞系UP2或UPC（每只1.5×10⁶个细胞），PTEN诱导组饲喂含多西环素（Doxycyclineg）2g/L的水,非诱导组饲喂不含多西环素的水，其它饲养条件正常。

移植重组胶质瘤细胞系UP2或UPC的第48天，从各处理组中取4—5只有代表性的小鼠拍照，结果如图8中的A所示；在接种重组胶质瘤细胞系后的第20、23、26、29、35、41和48天，分别用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，然后根据公式：肿瘤体积=肿瘤长度×(肿瘤宽度²)/2计算每只小鼠肿瘤体积，结果如图8中的B和表3所示；最后处死小鼠,剥取肿瘤称重，获得各处理组肿瘤重量，结果如8中的C和表4所示。

图8、表3和表4中，UPC代表移植重组胶质瘤细胞系UPC并饲喂多西环素组小鼠；UPC’代表移植重组胶质瘤细胞系UPC不饲喂多西环素组小鼠；UP2代表移植重组胶质瘤细胞系UP2并饲喂多西环素组小鼠；UP2’代表移植重组胶质瘤细胞系UPC不饲喂多西环素组小鼠。

表3.肿瘤体积（mm³）统计结果

表4.肿瘤重量（g）统计结果

图8、表3和表4的结果表明：重组胶质瘤细胞系中恢复蛋白PTEN的表达联合抑制蛋白B的表达与其它三组相比明显地抑制了小鼠体内肿瘤或胶质瘤的生长。

Claims (10)

1.一种抑制神经胶质瘤生长的组合物，由如下A）和B）两种物质组成：

A）在离体细胞中表达PTEN蛋白的物质；

B）抑制神经胶质瘤细胞中pll0β蛋白表达的物质。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述PTEN蛋白为序列表序列1所示蛋白；所述pll0β蛋白为序列表序列3所示蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：

所述A）物质为含有所述PTEN蛋白编码基因的表达盒、重组表达载体、重组细胞或重组病毒；

所述B）物质为抑制所述pll0β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：

所述A）物质中的所述PTEN蛋白的编码基因为序列表序列2所示的DNA分子；

所述B）物质中的所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA；

所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列。

5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于：

所述A）物质中的所述重组表达载体是将所述PTEN蛋白编码基因插入载体pRetro-on的BamH I和NotI位点间得到的重组载体；

所述B）物质中的所述由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA一条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示。

6.根据权利要求3-5中任一所述的组合物，其特征在于：

所述B）物质中的所述干扰RNA的编码基因为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。

7.根据权利要求3-6中任一所述的组合物，其特征在于：

所述B）物质中的所述重组表达载体为将所述干扰RNA的编码基因插入载体pRNAT-U6.1/Neo的BamH I和HindⅢ位点间得到的重组载体。

8.权利要求1-7中任一所述组合物在制备下述任一所述产品中的应用：

1）降低神经胶质瘤细胞中的AKT磷酸化水平的产品；

2）抑制神经胶质瘤细胞的增殖和/或集落形成的产品；

3）抑制神经胶质瘤细胞周期进程的产品；

4）促进神经胶质瘤细胞凋亡的产品；

5）抑制动物体内神经胶质瘤细胞生长的产品。

9.抑制pll0β蛋白表达的干扰RNA、所述干扰RNA的编码基因或含有所述干扰RNA的编码基因的表达盒、重组表达载体或重组细胞；

所述pll0β蛋白具体可为序列表序列3所示蛋白。

10.根据权利要求9所述的干扰RNA，其特征在于：所述干扰RNA为短发夹RNA或由所述短发夹RNA衍生的小干扰RNA；

所述短发夹RNA的核苷酸序列由一个茎环序列及两个分别位于所述茎环序列两侧的反向重复序列组成，所述两个反向重复序列分别为序列表序列5和序列表序列6所示序列；

所述小干扰RNA一条链的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一条链的核苷酸序列如序列表序列6所示；

所述干扰RNA的编码基因具体可为由序列表序列7和序列表序列8的单链DNA组成的双链DNA分子。

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