JP2017039695A - 新規なポリヌクレオチド及び癌細胞の抑制方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法、特にp53欠損癌のためのより有効かつ安全な癌治療の提供。【解決手段】対象中の癌細胞を抑制する方法であって、治療有効量のPuf−A抑制剤を前記癌細胞に接触させるステップを有する、方法。【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2015年6月12日に出願された米国仮出願第62/174,572号、及び2015年7月29日に出願された米国仮出願第62/198,290号の優先権を主張し、これらの出願の内容全体を本明細書に組み込んで参考として援用される。
本出願は、2015年6月12日に出願された米国仮出願第62/174,572号、及び2015年7月29日に出願された米国仮出願第62/198,290号の優先権を主張し、これらの出願の内容全体を本明細書に組み込んで参考として援用される。
Pufファミリーは、進化的に保存されたタンパク質ファミリーであり、Pumilio(ショウジョウバエ)及びFBF(Fem−3 mRNA−binding Factor,カエノラブディティスエレガンス)にちなんで名付けられている。Pufファミリーのメンバーは、通常、〜35−39アミノ酸の8回タンデムPufリピートの存在、及び前記リピートを標的mRNAの39非翻訳領域(UTR)における特定の配列に結合することで識別される。Puf−A遺伝子は、最初にJ.Yu氏等により報告されており、かつ眼の発達のみならず、始原生殖細胞の遊走にも、生殖細胞系譜の仕様にも重要な役割を果たしていることを見出した(非特許文献1)。
癌は、依然として全世界的に主要な公衆健康問題である。腫瘍タンパク質P53、いわゆる腫瘍抑制遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に突然変異するものであり、全てのヒト癌の半分以上は、この特定の遺伝子に突然変異を担持している。とりわけ、突然変異又は欠失したP53を持っている患者は、不良な予後診断及び/又はより高い薬剤耐性を有することになる。この数十年、癌治療法の進歩にもかかわらず、医学界はなお、多くの種類の癌、特にP53の突然変異又は欠失した癌を治療する課題に直面している。従って、特にp53欠損癌のためのより有効かつ安全な癌治療に対するニーズは依然として存在している。本発明は、このニーズ及びその他のニーズに対処するものである。
J Yu et al.,A Novel puf−A Gene Predicted Evolutionary Analysis Is Involved in the Development of Eyes and Primordial Germ−Cells,PLoS ONE 4(3):e4980.doi:10.1371/journal.pone.0004980
Feigner,et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413−7
Mackey,et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027−31
Ulmer,et al.(1993)Science 259:1745−8
Nature 475:106-109,2011年
HC Cho,et al.,Identification of Tumorigenic Cells in KrasG12D−Induced Lung Adenocarcinoma,Cancer Res.2011,71: 7250−7258
従って、本発明は、治療有効量のPuf−A抑制剤を癌細胞に接触させることにより、必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法を提供する。
本発明は、また、必要のある対象中の癌細胞を抑制又は死滅する方法を提供し、有効量の治療剤を投与することにより、Puf−Aの発現が減少又はノックダウンされ、及び/又はPufAの活性を低下させる。
本発明は、さらに、癌細胞中のPuf−Aの発現を抑制することにより、癌細胞を抑制する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Puf−Aの発現を減少するための短ヘアピンRNA(shRNA)分子をエンコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、本明細書で記述される前記Puf−Aの遺伝子の配列を含む。
その他の実施形態では、プロモーターと、shRNAをエンコードするポリヌクレオチドとを含むベクターも提供され、その中、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号:2又は配列番号:3と少なくとも90%相同である。
本発明は、また、本明細書で記述される前記ベクターと、医薬上許容される賦形剤又は担体とを含有する医薬組成物が開示される。
この特許において用いられている「発明(invention)」、「前記発明(the invention)」、「この発明(this invention)」及び「本発明(the present invention)」という用語は、広義には、この特許及び添付の特許請求の範囲の全ての主題事項を指すことを意図している。これらの用語を含んでいる記述は、本明細書に記載される主題事項又は添付の特許請求の範囲の意味もしくは範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。この特許によってカバーされる前記発明の実施形態は、この概要ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。この概要は、前記発明の種々の態様の高レベルの概要であり、後述の「発明を実施するための形態」のセクションでさらに記述される概念のいくつかを紹介する。この概要は、特許請求される主題事項の重要な特徴又は本質的特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題事項の範囲を定めるために単独で用いられることを意図するものでもない。前記主題事項は、明細書全体、任意の図面又は全ての図面及び各請求項の適切な部分を参照することにより理解されるべきである。
前記発明は、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明を読むと、明白になるであろう。
本特許又は特許出願は、カラーで作成された少なくとも1枚の図面を含んでいる。カラー図面を備えたこの特許又は特許出願の複写は、必要な手数料の支払いを伴って要請に基づいて特許庁により提供されるものである。
本発明の実施形態については、下記図面を参照しながら後に詳細説明する。
図1Aは、様々な癌におけるPuf−Aの発現を示す。図1Bは、より高いPuf−Aの発現が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌におけるより低い生存率に関連付けられることを示すグラフ群である。
図1Aは、様々な癌におけるPuf−Aの発現を示す。図1Bは、より高いPuf−Aの発現が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌におけるより低い生存率に関連付けられることを示すグラフ群である。
図2Aは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるPuf−Aの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図2Bは、カルチノイド腫瘍(COID)、肺の腺癌(ADC)、肺の扁平上皮癌(SCC)、小細胞肺癌(SCLC)及び正常肺サンプルにおけるPuf−A RNAレベル(左図)、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるPuf−A RNAレベル(右図)を示す一連のグラフである。図2Cは、Puf−A RNAの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
図2Aは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるPuf−Aの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図2Bは、カルチノイド腫瘍(COID)、肺の腺癌(ADC)、肺の扁平上皮癌(SCC)、小細胞肺癌(SCLC)及び正常肺サンプルにおけるPuf−A RNAレベル(左図)、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるPuf−A RNAレベル(右図)を示す一連のグラフである。図2Cは、Puf−A RNAの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
図2Aは、正常肺細胞、高分化肺腺癌細胞及び低分化肺腺癌細胞におけるPuf−Aの発現を示す免疫組織化学的画像群である。図2Bは、カルチノイド腫瘍(COID)、肺の腺癌(ADC)、肺の扁平上皮癌(SCC)、小細胞肺癌(SCLC)及び正常肺サンプルにおけるPuf−A RNAレベル(左図)、及び異なる段階のヒト肺腺癌におけるPuf−A RNAレベル(右図)を示す一連のグラフである。図2Cは、Puf−A RNAの発現と肺の腺癌患者の生存率との関係を示す一連のグラフである。
Puf−Aの発現に対するKrasの効果を示す画像群である。図3Aは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とKrasG12D導入群とにおけるPuf−Aレベルに対するKras活性化の効果を示す。図3Bは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とc−Myc導入群とにおけるc−Myc活性化の効果を示す。図3Cは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたKrasG12D又はc−Myc導入細胞におけるPuf−Aプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図3Dは、H1299及びHCT116細胞において、Puf−A遺伝子座のエクソン1とc−Mycタンパク質との結合を示す。図3Eは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析によって測定された2種のKras突然変異細胞株(H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D))におけるPuf−Aレベルに対するKras枯渇の効果を示す。図3Fは、H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D)癌細胞において、Puf−A、リン酸化ERK1/2、総ERK1/2及びβアクチンの発現に対するRaf抑制剤(Raf(i))、MEK1抑制剤(PD98059)及びMEK1/2抑制剤(UO126)の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
Puf−Aの発現に対するKrasの効果を示す画像群である。図3Aは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とKrasG12D導入群とにおけるPuf−Aレベルに対するKras活性化の効果を示す。図3Bは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とc−Myc導入群とにおけるc−Myc活性化の効果を示す。図3Cは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたKrasG12D又はc−Myc導入細胞におけるPuf−Aプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図3Dは、H1299及びHCT116細胞において、Puf−A遺伝子座のエクソン1とc−Mycタンパク質との結合を示す。図3Eは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析によって測定された2種のKras突然変異細胞株(H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D))におけるPuf−Aレベルに対するKras枯渇の効果を示す。図3Fは、H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D)癌細胞において、Puf−A、リン酸化ERK1/2、総ERK1/2及びβアクチンの発現に対するRaf抑制剤(Raf(i))、MEK1抑制剤(PD98059)及びMEK1/2抑制剤(UO126)の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
Puf−Aの発現に対するKrasの効果を示す画像群である。図3Aは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とKrasG12D導入群とにおけるPuf−Aレベルに対するKras活性化の効果を示す。図3Bは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析を用いて、対照群とc−Myc導入群とにおけるc−Myc活性化の効果を示す。図3Cは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたKrasG12D又はc−Myc導入細胞におけるPuf−Aプロモーターの活性を示す一連の棒グラフである。図3Dは、H1299及びHCT116細胞において、Puf−A遺伝子座のエクソン1とc−Mycタンパク質との結合を示す。図3Eは、ウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR分析によって測定された2種のKras突然変異細胞株(H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D))におけるPuf−Aレベルに対するKras枯渇の効果を示す。図3Fは、H460(KrasQ61H)及びHCT116(KrasG13D)癌細胞において、Puf−A、リン酸化ERK1/2、総ERK1/2及びβアクチンの発現に対するRaf抑制剤(Raf(i))、MEK1抑制剤(PD98059)及びMEK1/2抑制剤(UO126)の効果を示すウェスタンブロット画像群である。
図4Aは、KrasG12D活性化前(左側)、及びKrasG12D活性化12週後(右側)のマウスの細気管支及び肺胞細胞において、Puf−Aの免疫組織化学染色を示す画像群である。図4Bは、KrasG12D活性化とp53欠失2週後(左側)、及び8週後(右側)のマウスの細気管支及び肺胞細胞において、Puf−Aの免疫組織化学染色を示す画像群である。
図5Aは、Puf−AのノックダウンのためのPuf−A shRNAの投与の生体内研究デザインを模式的に示す。図5Bは、対照shRNA又はPuf−A shRNAを投与したマウスの腫瘍病巣の数を示す顕微鏡画像群である。図5Cは、対照又はPuf−A−2 shRNAの投与後、腺癌(左側の棒グラフ)及び腺腫(右側の棒グラフ)のあるマウスの腫瘍病巣(>250μm)の計数を示す一連の棒グラフである。
図5Aは、Puf−AのノックダウンのためのPuf−A shRNAの投与の生体内研究デザインを模式的に示す。図5Bは、対照shRNA又はPuf−A shRNAを投与したマウスの腫瘍病巣の数を示す顕微鏡画像群である。図5Cは、対照又はPuf−A−2 shRNAの投与後、腺癌(左側の棒グラフ)及び腺腫(右側の棒グラフ)のあるマウスの腫瘍病巣(>250μm)の計数を示す一連の棒グラフである。
図6Aは、ヒトPuf−A遺伝子(配列番号:1)のヌクレオチド配列を示す。図6Bは、shPuf−A−1(配列番号:2)及びshPuf−A−2(配列番号:3)をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。図6Cと図6Dは、RT−PCR及びQ−PCR分析によって測定された大腸癌細胞(HCT116)及び肺癌細胞(H1299)における対照shRNA、shPuf−A−1及びshPuf−A−2のPuf−Aのノックダウン効率を示す。
図6Aは、ヒトPuf−A遺伝子(配列番号:1)のヌクレオチド配列を示す。図6Bは、shPuf−A−1(配列番号:2)及びshPuf−A−2(配列番号:3)をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。図6Cと図6Dは、RT−PCR及びQ−PCR分析によって測定された大腸癌細胞(HCT116)及び肺癌細胞(H1299)における対照shRNA、shPuf−A−1及びshPuf−A−2のPuf−Aのノックダウン効率を示す。
図7Aは、対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2を下記のp53−欠損及びp53−熟達細胞株:A549、H460、U87、HCT116、H1299、CL1−5、MB231、LN229及びT98に導入することにより、Puf−Aの発現及びPARP1の切断型に対する対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2の効果を示す画像群である。図7Bは、Puf−A枯渇(shPuf−A導入)したp53熟達(p53野生型)及びp53欠損(p53欠陥)癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー(FACS)画像である。図7Cは、p53+/+HCT116、p53−/−HCT116及びp53−/−H1299癌細胞株において、Puf−A、LC3(オートファゴソーム用マーカー)、LAMP2(リソソーム用マーカー)及びp62(オートファジー基質)の発現に対するshPuf−A−1導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図7Dは、p53−熟達細胞(H460)におけるp53及びPuf−A阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図7Eは、p53熟達(p53+/+)HCT116、p53欠損(p53−/−)HCT116及びH1299癌細胞において、shPuf−A−1導入により、LC3(緑色)、Lamp1(赤色)及びDAPI(青色)の発現に対するPuf−Aサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図7Fは、対照shRNA導入に比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入後のp53−/−HCT116及びH1299細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
図7Aは、対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2を下記のp53−欠損及びp53−熟達細胞株:A549、H460、U87、HCT116、H1299、CL1−5、MB231、LN229及びT98に導入することにより、Puf−Aの発現及びPARP1の切断型に対する対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2の効果を示す画像群である。図7Bは、Puf−A枯渇(shPuf−A導入)したp53熟達(p53野生型)及びp53欠損(p53欠陥)癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー(FACS)画像である。図7Cは、p53+/+HCT116、p53−/−HCT116及びp53−/−H1299癌細胞株において、Puf−A、LC3(オートファゴソーム用マーカー)、LAMP2(リソソーム用マーカー)及びp62(オートファジー基質)の発現に対するshPuf−A−1導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図7Dは、p53−熟達細胞(H460)におけるp53及びPuf−A阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図7Eは、p53熟達(p53+/+)HCT116、p53欠損(p53−/−)HCT116及びH1299癌細胞において、shPuf−A−1導入により、LC3(緑色)、Lamp1(赤色)及びDAPI(青色)の発現に対するPuf−Aサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図7Fは、対照shRNA導入に比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入後のp53−/−HCT116及びH1299細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
図7Aは、対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2を下記のp53−欠損及びp53−熟達細胞株:A549、H460、U87、HCT116、H1299、CL1−5、MB231、LN229及びT98に導入することにより、Puf−Aの発現及びPARP1の切断型に対する対照shRNA、shPuf−A−1及びPuf−A−2の効果を示す画像群である。図7Bは、Puf−A枯渇(shPuf−A導入)したp53熟達(p53野生型)及びp53欠損(p53欠陥)癌細胞株の細胞周期を示す一連のフローサイトメトリー(FACS)画像である。図7Cは、p53+/+HCT116、p53−/−HCT116及びp53−/−H1299癌細胞株において、Puf−A、LC3(オートファゴソーム用マーカー)、LAMP2(リソソーム用マーカー)及びp62(オートファジー基質)の発現に対するshPuf−A−1導入の効果を示す一連のウェスタンブロット画像である。図7Dは、p53−熟達細胞(H460)におけるp53及びPuf−A阻害の効果を示すウェスタンブロット画像である。図7Eは、p53熟達(p53+/+)HCT116、p53欠損(p53−/−)HCT116及びH1299癌細胞において、shPuf−A−1導入により、LC3(緑色)、Lamp1(赤色)及びDAPI(青色)の発現に対するPuf−Aサイレンシングの効果を示す一連の免疫螢光画像である。図7Fは、対照shRNA導入に比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入後のp53−/−HCT116及びH1299細胞の増殖率の減少を示す一連のグラフである。
図8Aは、下記のp53−熟達(p53+/+)癌細胞株:A549、H460及びHCT116において、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入によるp53及びp21の発現の増加及びPUF−Aの転写物の減少を示す一連のウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR画像である。図8Bは、対照shRNA及びshPuf−A−1導入後のp53−熟達(p53+/+)癌細胞株であるA549、H460及びHCT116細胞、及びp53欠損(p53−/−)HCT116癌細胞において、p53(赤色)及びDAPI(青色、内部制御)の発現を示す一連の免疫染色画像である。図8Cは、FACSで分析した異なるp53遺伝子型のあるPuf−A枯渇癌細胞、A549、H460及びHCT116の細胞周期を示す一連の棒グラフである。図8Dは、Puf−Aの枯渇によるp53−熟達(p53+/+)A549及びH460細胞の増殖率の大幅な減少を示す2つのグラフである。
図8Aは、下記のp53−熟達(p53+/+)癌細胞株:A549、H460及びHCT116において、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入によるp53及びp21の発現の増加及びPUF−Aの転写物の減少を示す一連のウェスタンブロット、RT−PCR及びQ−PCR画像である。図8Bは、対照shRNA及びshPuf−A−1導入後のp53−熟達(p53+/+)癌細胞株であるA549、H460及びHCT116細胞、及びp53欠損(p53−/−)HCT116癌細胞において、p53(赤色)及びDAPI(青色、内部制御)の発現を示す一連の免疫染色画像である。図8Cは、FACSで分析した異なるp53遺伝子型のあるPuf−A枯渇癌細胞、A549、H460及びHCT116の細胞周期を示す一連の棒グラフである。図8Dは、Puf−Aの枯渇によるp53−熟達(p53+/+)A549及びH460細胞の増殖率の大幅な減少を示す2つのグラフである。
図9Aは、A549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞において、25及び50μMのレスベラトロールによるPuf−aの発現の減少を示すウェスタンブロット画像群である。図9Bは、25及び50μMのレスベラトロールによるA549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞の増殖の効果的な減少を示すグラフ群である。
(定義)
上文と公開全文中で使用される場合、下記の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有するものであると理解されるべきである。
上文と公開全文中で使用される場合、下記の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有するものであると理解されるべきである。
この特許において用いられている「発明(invention)」、「前記発明(the invention)」、「この発明(this invention)」及び「本発明(the present invention)」という用語は、広義には、この特許及び添付の特許請求の範囲の全ての主題事項を指すことを意図している。これらの用語を含んでいる記述は、本明細書に記載される主題事項又は添付の特許請求の範囲の意味もしくは範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。この特許によってカバーされる前記発明の実施形態は、この明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。この明細書は、特許請求される主題事項の本質的特徴を特定することを意図するものではなく、この明細書の任意の部分は、特許請求される主題事項の範囲を定めるために単独で用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題事項は、全文と、図面と、各請求項とを含む明細書全体の適切な部分を参照することにより理解されるべきである。
本明細書で用いられる場合、単数形である「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「前記(the)」とは、文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、複数の言及を含む。
本明細書で用いられる「有効量(effective amount)」は、癌の症状及び/又は徴候の減少に十分であるPuf−A抑制剤の投与量を含み、ここの症状や徴候とは、体重の減少、痛み、及び臨床的に触診可能な腫瘍量又は放射線学的に各種の撮像手段によって得られる腫瘍量を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「治療する(treating)」、「治療される(treated)」又は「治療(treatment)」という用語は、予防的(例えば、予防(prophylactic))、緩和的及び治癒的な使用又は結果を含む。
用語「抑制(inhibiting)」及び「減少(reducing)」は、成長の緩徐、防止又は停止を含む。
用語「対象(subject)」は、癌を有する脊椎動物又は癌治療の必要があると見なされる脊椎動物をいい得る。対象としては、温血動物(例えば、霊長類の動物より好ましくはヒトなどのような哺乳動物)を含む。非ヒト霊長類の動物は、同様に対象である。用語「対象」は、飼い慣らされた動物(例えば、ネコ、イヌなど)、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジやヤギなど)及び実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミやモルモットなど)を含む。このように、獣医学的使用と医療用製剤は、本明細書で企図される。
この発明の特定の核酸配列に対する同一性又は相同性は、最大割合の相同性を達成するために、必要に応じて配列の整列及び空隙の導入後、候補配列において、特定の残基と同一又は相同である核酸残基の割合として本明細書で定義される。ヌクレオチド配列のアラインメントの比較のための方法は、当該技術分野で周知である。NCBI基本的局所アラインメント検索ツール(BLAST(Altschul et al,J.Mol.Biol.215:403,1990)は、米国国立生物工学情報センター(NCBI,メリーランド州ベセスダ))と、インターネット上とを含む複数のソースから入手でき、blastnのような配列分析プログラムとの接続に用いられる。NCBIのウェブサイトで、このプログラムを用いて配列同一性をどのように決定するかの説明が公開されている。
用語「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」は、単一の核酸、並びに複数の核酸を含むことを意図するもので、かつ単離核酸分子又は構築物を指し、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来RNA又はプラスミドDNA(pDNA)が挙げられる。ポリヌクレオチドは、従来型ホスホジエステル結合又は非従来型結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見出されるようなアミド結合)を含んでもよい。用語「核酸(nucleic acid)」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の1つ又は複数の核酸セグメント、例えば、DNA又はRNA断片を指す。「単離された(isolated)」核酸又はポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出された核酸分子、DNA又はRNAを意図する。例えば、ベクターに含まれた治療用ポリペプチドをエンコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の(部分的に又は実質的に)精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたRNA分子は、本発明のインビボ又はインビトロRNA転写物の他、プラス鎖型及びマイナス鎖型、並びに二本鎖型を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位や転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、又はそれらを含んでもよい。
別段の定めがない限り、ここでの数値範囲の列挙は、単にその範囲内に収まるそれぞれ別個の数値を個別に言及する簡便な方法としての役割を果たすことを意図するものであり、それぞれ別個の数値は、あたかも個別にここに引用されているかのごとく、本明細書に組み込まれる。ここでの全ての数字は、「約(about)」で修飾されているものと理解されるべきである。一実施形態では、用語「約」は、分量や時の持続時間などの測定可能な数値を指すときは、指定された数値の±10%、好ましくは±5%、より好ましくは±1%、さらに好ましくは±0.1%のばらつきを含むものとし、別段の定めがない限り、これらのばらつきは、相同性の%に相応する。
(癌細胞成長の抑制又は阻害方法)
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞成長を抑制する方法、又は対象中の癌細胞を死滅させる方法に関し、それらは、治療有効量のPuf−A抑制剤を必要のある対象に投与することにより、前記対象中の癌の症状と徴候が減少される。
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞成長を抑制する方法、又は対象中の癌細胞を死滅させる方法に関し、それらは、治療有効量のPuf−A抑制剤を必要のある対象に投与することにより、前記対象中の癌の症状と徴候が減少される。
Puf−Aは、高度保存されたPufファミリーの一員である。配列番号:1は、ヒトPuf−A遺伝子のDNA配列であり、配列番号:4は、ヒトPuf−A遺伝子のアミノ酸配列である。より高いPuf−Aの発現が、より進行度の高い癌、及びより低い生存率に関連付けられることは、実施例1及び実施例2を参照されたい。
任意の特定の理論に拘束されず、Kras及び/又はc−Myc活性化が、Puf−Aの発現を増強させると考えられ、KrasによりRas/Raf/ERK経路を活性化してこの経路を介してc−MycとPuf−Aプロモーターとの結合を促進することにより、癌細胞におけるPuf−Aの発現が誘発されることは、実施例3及び図3Dを参照されたい。
本発明の組成物と方法は、癌細胞成長を予防、治療又は抑制するために用いられる。いくつかの実施形態では、治療有効量のPuf−A抑制剤を投与することにより、癌細胞成長を予防又は抑制する方法が提供される。例示的な実施形態では、治療しようとする癌又は抑制しようとする癌成長は、Puf−Aを発現する癌であり、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌及び肝癌から選択される。別の例示的な実施形態では、治療しようとする癌又は抑制しようとする癌成長は、p−53欠損癌であり、大腸癌、肺癌、乳癌及び膠芽腫から選択される。
別の実施形態では、治療有効量のPuf−A抑制剤を投与することにより、腺腫のある対象中の肺癌を防止する方法が提供され、そこで対象中で腺腫から腺癌への進行が減少または停止される。
一実施形態では、Puf−A抑制剤は、単独で投与してもよく、又は例えば、手術前に腫瘍サイズを減少させ、及び/又は手術後に転移の可能性(例えば、血流中の循環腫瘍細胞の成長及び転移の抑制により)を減少させために、手術の補助剤として投与してもよい。さらに別の実施形態では、Puf−A抑制剤は、抗癌剤の前、抗癌剤の前、後、又は同時に投与される。場合によっては、治療法としては、Puf−A抑制剤と共に投与される抗癌剤の併用を含む。抗癌剤は、従来型化学療法剤、標的癌治療、又は放射線治療を含む。
(Puf−A抑制剤)
Puf−A抑制剤は、Puf−Aの発現が減少又はノックダウンされ、及び/又はPufAの活性を低下させる任意の薬剤である。
Puf−A抑制剤は、Puf−Aの発現が減少又はノックダウンされ、及び/又はPufAの活性を低下させる任意の薬剤である。
Puf−A抑制剤を投与することにより、Puf−A遺伝子の発現は0.1−100%を減少することが可能になる。例えば、前記発現は、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或いは99%さえ減少することができる。前記発現は、例えば、2−4、11−14、16−19、21−24、26−29、31−34、36−39、41−44、46−49、51−54、56−59、61−64、66−69、71−74、76−79、81−84、86−89、91−94、96、97、98又は99のような間隔内の任意の量(%)を減少することができる。遺伝子の発現は、当該技術分野で周知である方法で測定され、例えば、遺伝子発現の逐次分析法(SAGE)が挙げられる。
一実施形態では、用語「ノックダウン(knock−down)」は、shRNA又は小干渉RNA(siRNA)の導入前の遺伝子の発現に比べて、Puf−A遺伝子の発現がその中で減少される、遺伝子サイレンシングの技術を指す。例えば、siRNAの使用に関連するRNA干渉(RNAi)は、植物、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティスエレガンス、トリパノソーマ、プラナリア、ヒドラ、及びマウス及びゼブラフィッシュを含む数種の脊椎動物種において特定の遺伝子の発現をノックダウンさせることに成功した。例えば、米国特許第7416849号を参照されたい。
一実施形態では、Puf−A抑制剤は、小分子である。Puf−A抑制小分子の非限定的な例としては、Rafキナーゼ抑制剤(例えば、Raf(i)(米国サンタクルーズから商業的に入手可能))、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ酵素を抑制するMEK抑制剤(例えば、米国Cell Signaling Technology社から商業的に入手可能なPD98059、及び米国Cell Signaling Technology社から商業的に入手可能なUO126)、レスベラトロールなどのスチルベンを含む。一実施形態では、レスベラトロールは、P53欠損癌細胞を効果的に抑制することができる。さらに別の実施形態では、レスベラトロールは、P53熟達癌細胞を効果的に抑制することができる。
いくつかの実施形態では、Puf−A抑制剤は、Puf−Aの発現を減らすために、Puf−A RNA転写を標的とするshRNAである。別の実施形態では、Puf−A抑制剤は、Puf−A標的化小干渉RNAの生合成前駆体である。他の実施形態では、Puf−A抑制剤は、マイクロRNA(miRNA)、エンドリボヌクレアーゼ調製siRNA(esiRNA)、天然アンチセンス短干渉RNA(natsiRNA)、小干渉RNA(siRNA)など任意のRNA種であってもよいが、それらに限定されないものであり、その中、前記RNA種は、NPMの発現を減らすために、Puf−A RNA転写を標的とする。
例示的な一実施形態では、Puf−A抑制剤は、配列番号:2又は配列番号:3と少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%相同であるヌクレオチド配列を有する、shRNAをエンコードするポリヌクレオチドである。別の例示的な実施形態では、Puf−A抑制剤は、ここに開示される前記ベクターである。
Puf−A抑制剤は、任意の有効量で投与される。いくつかの実施形態では、約0.01μg〜約5g、約0.1μg〜約1g、約1μg〜約500mg、約10μg〜約100mg、約50μg〜約50mg、約100μg〜約10mg、約0.5μg〜約5μg、約15μg〜約500μg、約3μg〜約1mg、約7μg〜約1mg、約10μg〜約20μg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約300μg、約15μg〜約200μg、約15μg〜約100μg、約15μg〜約60μg、約15μg〜約45μg、約30μg〜約60μg、又は約50μg〜約100μgの範囲の用量で投与される。特定の実施形態では、Puf−A抑制剤は、体重1kgあたり約0.1μg〜体重1kgあたり約200mg、体重1kgあたり約1μg〜体重1kgあたり約100mg、体重1kgあたり約100μg〜体重1kgあたり約50mg、体重1kgあたり約0.5mg〜体重1kgあたり約20mg、体重1kgあたり約1mg〜体重1kgあたり約10mg、体重1kgあたり約10μg〜体重1kgあたり約200μg、体重1kgあたり少なくとも約0.01μg、体重1kgあたり少なくとも約0.1μg、又は体重1kgあたり少なくとも約0.5μgの範囲の用量で投与される。
癌細胞を抑制するために投与されるPuf−A抑制剤の投与量は、扱われる疾患状態の重篤度、特殊な製剤、及び受容者の体重、全身健康状態及び投与経路などの他の臨床要素によって決まる。
癌細胞を抑制するために投与されるPuf−A抑制剤の投与量は、扱われる疾患状態の重篤度、特殊な製剤、及び受容者の体重、全身健康状態及び投与経路などの他の臨床要素によって決まる。
Puf−A抑制剤の有用な投与量は、それらのインビトロ活性とインビボ活性とを動物モデルにおいて比較することで決定できる。マウス及び他の動物の有効な投与量のヒトへの外挿法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第4938949号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込んである。
本明細書で提供される方法によれば、Puf−A抑制剤は、注射(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内)、皮膚的、経皮的、経真皮的、経口(例えば、錠剤、丸薬、液剤、可食性フィルムストリップ)、植込式浸透圧ポンプ、坐剤、エアゾールスプレー、局所、関節内、眼、鼻腔吸入、肺吸入、皮膚と膣への圧入を含むが、これに限定されず、様々な経路のいずれかによって投与することができる。
Puf−A抑制剤は、扱われる疾患状態に適した期間にわたって、単剤療法又は多剤併用療法を行うように投与される。Puf−A抑制剤は、少なくとも3ヶ月、又は疾患状態の症状と徴候が解消されるまでの期間にわたって、例えば、1日1回、1日2回、1日3回、2日1回、3日1回又は1週1回などの適切な時間間隔を隔てて便宜的に投与される。
(ベクター)
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞に投与可能なベクターを利用する。この場合、用語「ベクター(vector)」は、任意のウイルス又は非ウイルスベクターを指し、並びに任意のプラスミド、コスミッド、ファージ、或いは二本鎖、一本直鎖又は環状型のバイナリーベクターを指し、それらは自己伝達可能であってもよいし、動員可能であってもよいし、かつ細胞ゲノムに整合することにより、原核又は真核宿主細胞を変換してもよく、染色体外(例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド)に存在してもよい。当該技術分野で周知である任意のベクターは、想定どおりにこの発明の実施に用いられる。
本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞に投与可能なベクターを利用する。この場合、用語「ベクター(vector)」は、任意のウイルス又は非ウイルスベクターを指し、並びに任意のプラスミド、コスミッド、ファージ、或いは二本鎖、一本直鎖又は環状型のバイナリーベクターを指し、それらは自己伝達可能であってもよいし、動員可能であってもよいし、かつ細胞ゲノムに整合することにより、原核又は真核宿主細胞を変換してもよく、染色体外(例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド)に存在してもよい。当該技術分野で周知である任意のベクターは、想定どおりにこの発明の実施に用いられる。
ウイルスベクターの制限しない例は、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はマウスベースウイルスベクターを含む。非ウイルスベクターの制限しない例は、DNAベクター(必要な配列をコードしてリポフェクションによりインビボに導入可能)、又は合成カチオン性脂質(マーカーをエンコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソーム(非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4参照)を含む。核酸移送に特に有用である脂質化合物及び組成物は、特許文献3、特許文献4及び特許文献5に記述されている。脂質は、標的を目的とするために他の分子に対して化学的に連結される。標的ペプチドは、例えば、ホルモン又は神経伝達物質であり、タンパク質は、例えば、抗体又は非ペプチド分子であり、リポソームに対して化学的に連結される。インビボの核酸のトランスフェクションの円滑化に有用である他の分子としては、例えば、カチオン性オリゴペプチド(特許文献6参照)、タンパク質に結合するDNA由来ペプチド(特許文献7参照)、又はカチオン重合体(特許文献6参照)が挙げられる。
本発明によるウイルスベクターは、一般的に、約104と約1014pfuの間の用量の剤形で処方及び投与される。AAV及びアデノウイルスの場合、約106〜約1011pfuの用量の剤形が特に使用される。用語pfu(「プラーク形成単位(plaque−forming unit)」)は、ウイルスの懸濁液の感染力に対応し、適切な細胞培養物に感染させ、形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定するための技術は、当該技術分野で明確に文書化されている。
本発明のベクターは、shRNAをエンコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号:2又は配列番号:3と少なくとも85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%相同であるヌクレオチド配列を有する。ポリペプチドは、1つ又は複数のプロモーターと操作可能に結合する。
一実施形態では、プロモーターがヌクレオチド配列であり、通常、上流(5’) からそのコード配列へ向かって、RNAポリメラーゼ及び適切な転写に要する他の要素を認識することで、コード配列の発現を指揮及び/又は制御する。例示的な一実施形態では、プロモーターは、最小プロモーターを含み、それは、TATAボックスと、転写開始点の部位を明示するための他の配列とを含む短いDNA配列であり、その中、発現の制御のために調節エレメントを追加した。さらに別の実施形態では、プロモーターは、最小プロモーターに加えて調節エレメントも含むヌクレオチド配列であり、コード配列又は機能性RNAの発現を制御することが可能である。この種のプロモーター配列は、近位と、より遠位の上流エレメントとを含め、後者のエレメントは、よくエンハンサーと称される。いくつかの実施形態では、エンハンサーDNA配列であり、プロモーター活性を刺激し、かつプロモーターの先天的エレメントであってよく、又はプロモーターのレベル又は組織特異性を高めるために挿入した異種エレメントであってよい。それを両向き(センス又はアンチセンス)に操作することができ、かつプロモーターから上流又は下流のいずれかに移動する場合でも、機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロモーターエレメントのいずれも、配列特定のDNA結合タンパク質に結合することで、その効果を調停する。プロモーターとしては、その全体が天然遺伝子由来であってよく、又は自然の中で見つかる異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてもよく、さらに合成DNAセグメントから構成されてもよい。プロモーターは、また生理的かつ発達上の状態に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するDNA配列を包含してもよい。当該技術分野で周知である任意のプロモーターは、shRNA又はRNAコード配列の発現を調節して想定どおりにこの発明の実施に用いられる。
ShRNAを、shRNAに由来する直接転写可能なDNAベクターを用いる遺伝子治療法により、特にヒト細胞のような哺乳動物細胞に送達することができる。このようなshRNAの生産は、短い逆方向リピートを持つDNAベクターを細胞又は組織に導入することにより、生体内で容易に達成され、その短い逆方向リピートは、小さい数(例えば、3、4、5,6、7、8、9)のヌクレオチドで区切られており、短ヘアピンRNAの転写を指揮する。その上、もしメカニズムは、ベクター又はベクターセグメントから宿主細胞ゲノムへの整合を指揮すること、又は転写ベクターの安定性を確保することを含むならば、エンコードしたshRNAによるRNAiは、安定かつ遺伝可能に作ることができる。このような技術は、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を「ノックダウン」するために用いられるだけでなく、これらの技術は、現在、外因的に発現した導入遺伝子の発現、並びに生きているマウスの脳及び肝臓における内在性遺伝子の発現をノックダウンすることに成功した。
(医薬組成物)
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で記述される前記ベクターと、医薬上許容される担体とを含有する医薬組成物に関する。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書で記述される前記ベクターと、医薬上許容される担体とを含有する医薬組成物に関する。
用語「医薬上許容される担体(pharmaceutically acceptable carrier)」は、製剤の他の成分と互換性があり、その受容者に対して有害ではないという意味で許容されなければならない。投与用有効成分は、粉末、細粒、溶液、懸濁液、乳剤にした状態であってもよく、又は本明細書の他のところにも記述されている状態であってもよい。
一実施形態では、医薬組成物は、医薬組成物(例えば、ベクター)の活性成分を液体担体、化学担体又はこの両者と均一かつ緊密に混合するころにより調製される。液体担体は、水性製剤、非水性製剤又はこの両者を含むが、これらに限定されない。固体担体は、生物担体、化学担体又はこの両者を含むが、これらに限定されない。
医薬組成物は、水相懸濁液、乳化油、油中水型乳剤と水中油中水型乳剤にして投与され、かつクリーム剤、ゲル、リポソーム(中性、アニオン性又はカチオン性)、脂質ナノ球体又は微小球、中性の、アニオン性又はカチオン性重合体ナノ粒子又は微粒子、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョン、ナノエマルジョン、微小球、ナノ球体、ナノ粒子とミニポンプを含むが、この限りではない担体にして投与され、及びアニオン性、中性の又はカチオン性多糖と、アニオン性、中性の又はカチオン性重合体又は共重合体とを含む医薬組成物の持続性放出を許容し得る様々な天然又は合成重合体と一緒に投与され、組成物送達の必要な部位付近に植え込まれるミニポンプ又は重合体を介して投与される。さらに、本明細書で提供される医薬組成物の活性成分は、任意の担体、又は担体の任意の組み合わせに有効である。これらは、抗酸化物質、緩衝剤、及び制菌剤を含むが、この限りではなく、かつ懸濁化剤、増ちょう剤又は防腐剤を選択的に含むことが可能である。
以下、さらに実施例を挙げて本発明について説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものに過ぎず、これらの実施例に限定されるものと解釈してはならない。
実施例1
(様々な癌におけるPuf−Aの発現)
20種類の癌において、Puf−Aの発現は免疫組織化学染色を用いて評価した。大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌及び肝癌において、Puf−Aの発現は中等度乃至高度である。図1Aを参照されたい。
(様々な癌におけるPuf−Aの発現)
20種類の癌において、Puf−Aの発現は免疫組織化学染色を用いて評価した。大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌及び肝癌において、Puf−Aの発現は中等度乃至高度である。図1Aを参照されたい。
図1Bは、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌において、患者の全生存率及びPuf−Aの発現のKaplan−Meier分析アセンブリを示す。より高いPuf−Aの発現(赤線)が、眼癌、大腸癌、皮膚癌及び乳癌患者のより低い全生存率に関連付けられる。
実施例2
(進行ヒト肺腺癌におけるPuf−Aの発現)
Puf−Aの発現は、正常肺組織、高分化及び低分化肺腺癌において、Puf−Aに対する抗体を用いて観察した。図2Aに示すように、この結果は、正常肺組織に比べて、肺腺癌におけるPuf−Aの発現がより高く、かつ差別化の度合いに関連する(即ち、低分化肺腺癌におけるPuf−Aが最高)ということを示している。
(進行ヒト肺腺癌におけるPuf−Aの発現)
Puf−Aの発現は、正常肺組織、高分化及び低分化肺腺癌において、Puf−Aに対する抗体を用いて観察した。図2Aに示すように、この結果は、正常肺組織に比べて、肺腺癌におけるPuf−Aの発現がより高く、かつ差別化の度合いに関連する(即ち、低分化肺腺癌におけるPuf−Aが最高)ということを示している。
Puf−A RNA発現の発現は、肺癌のある126名患者に対し、独立のソース(http://www.genome.wi.mit.edu/MPR/lung(PNAS,98: 13790−13795 2001))から得たデータに基づいて評価した。126名患者のうち、10名がカルチノイド(COID)腫瘍に罹患、109名が腺癌(ADC)に罹患、11名が扁平上皮細胞癌(SCC)に罹患、及び6名が小細胞肺癌(SCLC)に罹患、かつ13個の非腫瘍性肺サンプルを対照群(正常群)として用いる。図2B(左側)を参照して、正常群に比べて、全ての肺癌にはより多くPuf−A RNAを発現し、かつ正常群に比べて、ADCには最高レベルのPuf−A RNA(7.8倍)を発現する。55名のI期ADC患者及び22名のII期〜III期ADC患者、並びに15個の非腫瘍性肺サンプル(正常群)について、異なるADC段階でのPuf−A RNAの発現を分析した。図2B(右側)は、正常群に比べて、I期及びII−III期ADでのPuf−A RNAの発現は、それぞれ5.9倍及び12.0倍増加することを示す。
Kaplan−Meier分析によると、より低いPuf−Aの発現(青線)に比べて、ADCのより高いPuf−Aの発現(赤線)は、患者のより低い生存率(全生存率又は無再発生存率)に関連付けられるを示している(図2C)。
実施例3
(Puf−Aの発現に対するKras活性化のインビトロ評価)
Puf−Aの発現に対するKras活性化の効果のインビトロ評価は、KrasG12D導入及び対照ベクター導入したH1299肺癌細胞を用いて行った。Puf−Aタンパク質及びRNAの発現レベルは、ウェスタンブロット及びqPCRによって分析した。
(Puf−Aの発現に対するKras活性化のインビトロ評価)
Puf−Aの発現に対するKras活性化の効果のインビトロ評価は、KrasG12D導入及び対照ベクター導入したH1299肺癌細胞を用いて行った。Puf−Aタンパク質及びRNAの発現レベルは、ウェスタンブロット及びqPCRによって分析した。
図3Aに示すように、対照ベクター導入した肺癌細胞に比べて、KrasG12D導入した肺癌細胞におけるPuf−Aタンパク質及びRNAの発現レベルは、それぞれ2倍及び1.5倍増加した。対照ベクター導入した細胞に比べて、KrasG12D導入した肺癌細胞におけるc−Mycタンパク質及びRNAの発現レベルは、それぞれ1.8倍及び1.4倍増加した。
Kras信号伝達は、c−Myc発現の誘発及び活性化可能なc−Myc発現(非特許文献5)に関わるので、Puf−Aの発現に対するc−Myc活性化の効果は、c−Myc又はベクター制御ウイルスで感染されたH1299肺癌細胞を用いて評価した。ベクター制御導入した細胞に比べて、c−Myc導入した細胞におけるPuf−Aタンパク質及びRNAの発現レベルは、それぞれ2.5倍及び1.7倍増加した(図3B)。
加えて、KrasG12D又はc−Myc発現プラスミドが導入された細胞において、Puf−Aプロモーター活性を観察した。この結果から、対照ベクターに比べて、KrasG12D及びc−Mycにより、Puf−Aプロモーター活性は、それぞれ2.2倍及び3.2倍増加したということが分かり(図3C)、c−Mycは、Puf−A遺伝子の発現の転写制御に関わるかもしれないことを示している。加えて、p53+/+HCT116癌細胞に比べて、p53−/−HCT116癌細胞における内在性c−Mycタンパク質がもっと多い(データ未表示)。
c−MycがPuf−A遺伝子の発現の転写制御に関わるかどうかを確認するために、H1299細胞をc−Myc又はベクター制御レンチウイルスで感染し、クロマチン免疫沈降(CHIP)アッセイは、Puf−Aプロモーターにおけるc−Mycコンセンサス配列の位置を観察するために用いられる。その結果によると、外因性c−Mycタンパク質をc−Mycコンセンサス配列上でPuf−A遺伝子座のエクソン1に結合し、かつp53+/+細胞に比べて、p53−/−HCT116細胞においてより多くc−Mycタンパク質をPuf−A遺伝子座のエクソン1に結合することが分かり、c−Mycは、c−MycをPuf−Aプロモーターに結合することによって媒介されるPuf−A遺伝子の発現を誘発することを示している(図3D)。
図3Aのデータによれば、Kras信号伝達は、Puf−A遺伝子の発現の本質であり、H460肺癌及びHCT116大腸癌細胞を含む2種類の発癌性Krasを含有する癌細胞株を用いて、Puf−Aの発現でのKras枯渇の効果を観察した。Kras枯渇後にはshKrasを用いて、対照shRNA導入した細胞に比べて、Puf−Aタンパク質及びRNAが著しく減少(図3E)。
Kras経路の下流エフェクター(例えば、Rafs、MEK1及びMEK2)を阻止する様々な小分子(例えば、Raf(i)、PD98059及びUO126)の効果は、H460及びHCT116癌細胞に評価された。図3Fは、小分子の投与によってKras経路の下流エフェクターを阻止した後、Puf−Aの発現レベルが減少することを示す。
実施例4
(Puf−Aの発現に対する内因性Kras活性化の効果)
KrasG12D誘発肺腺癌のあるCCSP−rtTA/TetO−Cre/LSL−KrasG12Dp53+/+マウスを用いてPuf−Aの発現を評価した。細気管支クララ細胞は、Krasが誘発した肺上皮内腫瘍の細胞起点であると指摘された(非特許文献6)。
(Puf−Aの発現に対する内因性Kras活性化の効果)
KrasG12D誘発肺腺癌のあるCCSP−rtTA/TetO−Cre/LSL−KrasG12Dp53+/+マウスを用いてPuf−Aの発現を評価した。細気管支クララ細胞は、Krasが誘発した肺上皮内腫瘍の細胞起点であると指摘された(非特許文献6)。
KrasG12D活性化前の正常マウスに、細気管支上皮と肺胞上皮の両方とも、Puf−A染色では弱陽性を示した(図4A、左側)。12週間のKrasG12D活性化を経て、マウス(CCSP−rtTA/TetO−Cre/LSL−KrasG12Dp53+/+)の肺癌組織には、Puf−A陽性細気管支細胞が顕著な増加を示し、一方、Puf−A陽性肺胞細胞が少ししかないのを示した(図4A、右側)。
図4B(左側)及び図4B(右側)は、それぞれ2週間及び8週間のKrasG12D活性化及び p53欠失を経たCCSP−rtTA/TetO−Cre/LSL−KrasG12D/p53flox マウスを示す。2週間のKrasG12D活性化及び p53欠失を経た後、肺胞上皮に比べて、より多くPuf−A陽性細胞が細気管支上皮に見られた(図4B、左側)。8週間のKrasG12D活性化及びp53欠失を経た後、細気管支上皮と肺胞上皮の両方とも、Puf−A染色の強度がさらに増大し、細気管支上皮の方がより強い(図4B、右側)。これらの結果は、Puf−Aの発現は、内因性Kras活性化及び/又はp53枯渇に関連付けられるのを示唆している。
実施例5
(腫瘍形成におけるPuf−A抑制の効果)
腫瘍形成におけるPuf−A抑制のインビボ評価は、LSL−KrasG12D/p53floxマウスを用いて行った。
(腫瘍形成におけるPuf−A抑制の効果)
腫瘍形成におけるPuf−A抑制のインビボ評価は、LSL−KrasG12D/p53floxマウスを用いて行った。
図5Aは、研究デザインを模式的に示す。LSL−KrasG12D/p53floxマウスは、2週間のKrasG12D活性化及びp53欠失を経て腺腫を発達させた。shPuf−A−2(Puf−A shRNA)又は対照shRNAを表現するレンチウイルスベクターを、2週間にわたって腺腫に罹患したLSL−KrasG12D/p53floxマウスに1週2回、鼻腔内投与した。6週間のKrasG12D活性化及びp53欠失を経たマウスを犠牲にした。図5Bに示すように、その肺組織を観察すると、対照ベクターに比べて、shPuf−A−2レンチウイルスベクターで治療したマウスの肺の細気管支及び肺胞領域内の腺癌病巣が少ない。shPuf−A−2レンチウイルスベクターで治療したマウス内の腺癌又は腺腫病巣の数(>250μm)は、対照shRNAベクターを導入したマウス(図5C)よりも激減(それぞれ15.4倍及び2.6倍減)した(図5C)。これらの結果は、Puf−Aは、肺腫瘍形成への阻害、及び肺腺腫から肺腺癌への進行の予防には有効であるのを示唆している。
実施例6
(Puf−Aの発現に対する新規なshPuf−Aの効果)
図6Bは、2種の新規な短ヘアピンRNAs(shPuf−A−1(配列番号:2)及びshPuf−A2_( 配列番号:3))をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列示す。
(Puf−Aの発現に対する新規なshPuf−Aの効果)
図6Bは、2種の新規な短ヘアピンRNAs(shPuf−A−1(配列番号:2)及びshPuf−A2_( 配列番号:3))をエンコードするポリペプチドのヌクレオチド配列示す。
Puf−Aの発現に対する図6B中のshRNAs構築物の効果は、p53−熟達(p53+/+HCT116)及びp53−欠損(p53−/−HCT116及びp53−/−H1299)を用いて評価した。対照shRNA、shPuf−A−1及びshPuf−A−2レンチウイルスベクターを細胞に導入して、Puf−Aの発現は、リアルタイム定量PCR及びQ−PCRによって測定された。図6C及び図6Dは、対照shRNAに比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2レンチウイルスベクターが導入されたp53−熟達及びp53−欠損癌細胞のいずれかにおいても、Puf−A RNAの発現レベルが著しく減少することを示す(GAPDH、内部制御として使用)。Puf−Aの発現に対するshPuf−A−1及びshPuf−A−2のノックダウン効率は、対照shRNAに比べて、それぞれ約90%及び75%となる(図6D)。
実施例7
(癌細胞に対するPuf−Aサイレンシングの効果)
肺癌細胞(A549、H460、H1299及びCL1−5)、大腸癌細胞(HCT116)、乳癌細胞(MB231)及び膠芽腫細胞(U87、LN229及びT98)を用いて、癌細胞に対するPuf−Aの生体機能を評価した。対照shRNAに比べて、実施例6のPuf−A−1及びPuf−A−2ウイルスベクターが導入されたこれらの癌細胞株において、Puf−Aタンパク質の発現レベルが著しく減少する。加えて、対照shRNA導入に比べて、shPuf−A導入により、p53欠損細胞(p53−/−HCT116、p53−/−H1299、p53R248WCL1−5及びp53R280KMB231)において、ポリADP−リボースポリメラーゼ1(PARP1)の切断型が著しく増加する。p53−熟達癌細胞(p53+/+A549、H460及びHCT116)において、Puf−A枯渇では、切断PARP1のレベルに影響を与えなかった(図7A)。
(癌細胞に対するPuf−Aサイレンシングの効果)
肺癌細胞(A549、H460、H1299及びCL1−5)、大腸癌細胞(HCT116)、乳癌細胞(MB231)及び膠芽腫細胞(U87、LN229及びT98)を用いて、癌細胞に対するPuf−Aの生体機能を評価した。対照shRNAに比べて、実施例6のPuf−A−1及びPuf−A−2ウイルスベクターが導入されたこれらの癌細胞株において、Puf−Aタンパク質の発現レベルが著しく減少する。加えて、対照shRNA導入に比べて、shPuf−A導入により、p53欠損細胞(p53−/−HCT116、p53−/−H1299、p53R248WCL1−5及びp53R280KMB231)において、ポリADP−リボースポリメラーゼ1(PARP1)の切断型が著しく増加する。p53−熟達癌細胞(p53+/+A549、H460及びHCT116)において、Puf−A枯渇では、切断PARP1のレベルに影響を与えなかった(図7A)。
図7Bを参照して、shPuf−Aウイルスベクターが導入された図7Aの前記癌細胞株は、続いてヨウ化プロピジウム(PI)で培養し、DNAに基づく細胞周期分布をFACSで評価する。対照shRNA群に比べて、shPuf−Aにウイルスベクターが導入された後、p53−欠損癌細胞(p53−/−H1299及びHCT116)におけるサブG1細胞集団(青色)が著しく増加する。これは、p53−欠損癌細胞におけるPuf−Aの枯渇後、切断PARP1の増加レベルと一致する(図7A参照)。従って、p53−欠損癌細胞におけるPuf−Aの枯渇では、細胞死に繋がるのを示している。
様々な刺激によるp53の損失により、自己貪食フラックス及びLC3蓄積が増加して細胞死を引き起こすことが報告されている(PNAS,107:18511−18516,2010)。図7Cのウェスタンブロット画像は、p53−欠損癌細胞(p53−/−HCT116及びH1299細胞)において、shPuf−A導入後、LC3−II(オートファゴソーム成分)及びLAMP2(リソソーム成分)の発現レベルが著しく増加し、一方、p62(細胞中、オートリソソームの形成を持つ酵素消化の基質)が低くなり、また同じPuf−Aがサイレンシングしたp53−欠損癌細胞において、その発現レベルが著しく減少することを示す。これらの結果は、shPuf−Aベクター導入後、p53−欠損癌細胞は、オートファジー細胞死を受けることになっているのを示唆している。
p53−欠損細胞に比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入後、p53−熟達細胞(p53+/+HCT116)におけるPuf−A枯渇によってLC3−II発現のレベルがやや増加する(図7C)。しかし、Puf−A枯渇のみ(図7Cと7D)に比べて、p53−熟達細胞(p53+/+H460)において、p53とPuf−Aの同時枯渇により、LC3−II及びLAMP2発現が大幅に増大することになる(図7D)。
図7E中の免疫螢光染色は、p53−熟達癌細胞において、核の周りに存在するLAMP1がやや増加するのに比べて、shPuf−A−1ベクター導入後、p53−欠損癌細胞において、LC3−II(緑色)及びLAMP1(赤色)の発現及び同時局在が増加することを示す。これは、p53欠損癌細胞における変型のオートリソソーム形成は、Puf−A枯渇により、自己貪食フラックスが増加して変型のLC3−II蓄積及びオートファジー性細胞死を引き起こすのを示している。
対照shRNAウイルスが導入された同じ癌細胞に比べて、shPuf−A−1及びshPuf−A−2導入後、p53−欠損及びP53−熟達癌細胞の増殖速度が減少した(図7F)。この結果から、Puf−A抑制により、癌細胞中のオートファジー性細胞死を誘発することが示唆され、p53−欠損細胞中ではより一層顕著になる。
実施例8
(p53熟達癌細胞に対するPuf−A抑制の効果)
A549、H460又はHCT116癌細胞をshPuf−A−1、shPuf−A−2又は対照shRNA ウイルスベクターで感染することにより、p53熟達癌細胞において、p53及びp21タンパク質/RNAの発現レベルに対するPuf−A抑制の効果が検証された。図8Aは、対照shRNAで感染された癌細胞に比べて、p53−熟達癌細胞において、p53及びp21タンパク質又はRNAの発現レベルの著しく増加を示す。免疫螢光染色も同様に、Puf−A枯渇後、p53−熟達細胞のp53核染色(赤色)が増加したことが分かった(図8B)。同じ癌細胞株の細胞周期進行をFACSで分析した。図8Cに示すように、shPuf−A導入後、p53−熟達癌細胞において、S期細胞集団が著しく減少する一方、G0/G1期細胞集団が増加した。図8Dは、Puf−A枯渇後、p53−熟達A549及びH460癌細胞の成長率の著しく低下を示す。これらの結果は、p53熟達癌細胞において、Puf−Aの発現をサイレンシングすることにより、p53及びp21の発現が増加して、p53−熟達細胞の細胞周期を阻止することに繋がるのを示唆している。
(p53熟達癌細胞に対するPuf−A抑制の効果)
A549、H460又はHCT116癌細胞をshPuf−A−1、shPuf−A−2又は対照shRNA ウイルスベクターで感染することにより、p53熟達癌細胞において、p53及びp21タンパク質/RNAの発現レベルに対するPuf−A抑制の効果が検証された。図8Aは、対照shRNAで感染された癌細胞に比べて、p53−熟達癌細胞において、p53及びp21タンパク質又はRNAの発現レベルの著しく増加を示す。免疫螢光染色も同様に、Puf−A枯渇後、p53−熟達細胞のp53核染色(赤色)が増加したことが分かった(図8B)。同じ癌細胞株の細胞周期進行をFACSで分析した。図8Cに示すように、shPuf−A導入後、p53−熟達癌細胞において、S期細胞集団が著しく減少する一方、G0/G1期細胞集団が増加した。図8Dは、Puf−A枯渇後、p53−熟達A549及びH460癌細胞の成長率の著しく低下を示す。これらの結果は、p53熟達癌細胞において、Puf−Aの発現をサイレンシングすることにより、p53及びp21の発現が増加して、p53−熟達細胞の細胞周期を阻止することに繋がるのを示唆している。
実施例9
(肝細胞癌細胞に対するPuf−A抑制の効果)
肝細胞癌細胞に対するPuf−A抑制の効果を評価した。P53熟達(p53+/+HepG2)及びp53欠損(p53−/−Hep3B及びp53Y220CHuh−7)肝細胞癌細胞は、Puf−A shRNA又は対照shRNAに感染している。
(肝細胞癌細胞に対するPuf−A抑制の効果)
肝細胞癌細胞に対するPuf−A抑制の効果を評価した。P53熟達(p53+/+HepG2)及びp53欠損(p53−/−Hep3B及びp53Y220CHuh−7)肝細胞癌細胞は、Puf−A shRNA又は対照shRNAに感染している。
対照群に比べて、p53熟達及びp53欠損肝細胞癌細胞にPuf−A shRNAが感染される場合、Puf−Aの発現が減少され、かつ細胞死が増加する。
実施例10
(Puf−Aの発現及び癌細胞に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価)
Puf−aタンパク質の発現レベル及び様々な癌細胞における細胞増殖に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価が検証された。下記の癌細胞は、0.25又は50μMのレスベラトロール(米国Sigma社から商業的に入手可能)で治療を受けた:A549肺癌細胞(p53熟達)、HCT116結腸癌細胞(p53熟達)、MB231乳癌細胞(p53欠損)及びT98膠芽腫細胞(p53欠損)。これらの癌細胞におけるPuf−Aタンパク質の発現は、ウェスタンブロットにより分析し、及び細胞増殖は、xCELLigenece RTCAシステム(米国ACEA Biosciences Inc.)に実行される細胞増殖アッセイで測定された。図9Aは、A549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞において、25及び50μMのレスベラトロールによるPuf−aの発現の減少を示すウェスタンブロット画像群である。図9Bは、25及び50μMのレスベラトロールによるA549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞の増殖と対照群(レスベラトロール未投与)との比較を示すグラフ群である。
(Puf−Aの発現及び癌細胞に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価)
Puf−aタンパク質の発現レベル及び様々な癌細胞における細胞増殖に対するレスベラトロールの効果のインビトロ評価が検証された。下記の癌細胞は、0.25又は50μMのレスベラトロール(米国Sigma社から商業的に入手可能)で治療を受けた:A549肺癌細胞(p53熟達)、HCT116結腸癌細胞(p53熟達)、MB231乳癌細胞(p53欠損)及びT98膠芽腫細胞(p53欠損)。これらの癌細胞におけるPuf−Aタンパク質の発現は、ウェスタンブロットにより分析し、及び細胞増殖は、xCELLigenece RTCAシステム(米国ACEA Biosciences Inc.)に実行される細胞増殖アッセイで測定された。図9Aは、A549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞において、25及び50μMのレスベラトロールによるPuf−aの発現の減少を示すウェスタンブロット画像群である。図9Bは、25及び50μMのレスベラトロールによるA549肺癌細胞、HCT116結腸癌細胞、MB231乳癌細胞及びT98膠芽腫細胞の増殖と対照群(レスベラトロール未投与)との比較を示すグラフ群である。
Claims (19)
- 対象中の癌細胞を抑制する方法であって、治療有効量のPuf−A抑制剤を前記癌細胞に接触させるステップを有する、方法。
- 前記癌細胞は、P−53欠損である、請求項1に記載の方法。
- 前記P−53欠損である癌細胞は、大腸癌、肺癌、乳癌および膠芽腫からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記癌細胞がPuf−Aを発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記Puf−Aを発現する癌細胞は、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、カルチノイド、頭頸部癌、甲状腺癌、神経膠腫、リンパ腫、肺癌、メラノーマ、皮膚癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、膵癌および肝癌からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記Puf−A抑制剤は、短ヘアピンRNA(shRNA)である、請求項1に記載の方法。
- 前記shRNAをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号:2と少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記shRNAをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号:3と少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記shRNAをエンコードするポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれている、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項9に記載の方法。
- 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項9に記載の方法。
- 前記Puf−A抑制剤は、Raf(i)、PD98059、UO126、またはレスベラトロールから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記Puf−A抑制剤がレスベラトロールである、請求項1に記載の方法。
- 前記Puf−A抑制剤は、抗癌剤の前、同時、または後に投与される、請求項1に記載の方法。
- 配列番号:2または配列番号:3と少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド。
- a)プロモーター;および
b)配列番号:2または配列番号:3と少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を含む、ベクター。 - 前記ポリヌクレオチドがshRNAをエンコードする、請求項16に記載のベクター。
- (a)プロモーター;および配列番号:2または配列番号:3と少なくとも90%相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター;ならびに
(b)医薬上許容される担体
を含有する、医薬組成物。 - 前記ポリヌクレオチドがshRNAをエンコードする、請求項18に記載の医薬組成物。
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