CN115944740A - 靶向hif-1/cbs在三阴性乳腺癌中的应用 - Google Patents

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CN115944740A CN202310135759.XA CN202310135759A CN115944740A CN 115944740 A CN115944740 A CN 115944740A CN 202310135759 A CN202310135759 A CN 202310135759A CN 115944740 A CN115944740 A CN 115944740A
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Abstract

本发明提供本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向HIF‑1/CBS在三阴性乳腺癌中的应用。本发明证明了在缺氧条件下，TNBC细胞通过HIF‑1诱导的CBS上调，从而为谷胱甘肽的合成提供了另一种半胱氨酸来源，并保护细胞免受胱氨酸摄取抑制诱导的铁死亡。CBS在BCSCs中过表达，并介导BCSCs对铁死亡的抗性。CBS的遗传或药理抑制通过诱导铁死亡减少体外和体内的BCSC数量。HIF‑1的药理抑制降低CBS的表达，抑制肿瘤的起始，增加肿瘤复发的时间。上述结果表明靶向HIF‑1/CBS可能通过诱导铁死亡来减少BCSC数量，改善TNBC患者的临床预后。

Description

靶向HIF-1/CBS在三阴性乳腺癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向HIF-1/CBS在三阴性乳腺癌中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型，不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)。与其他亚型乳腺癌相比，TNBC更具侵袭性，例如复发、转移和患者死亡率的高风险。目前，TNBC的全身治疗选择仍局限于细胞毒性化疗，因为TNBC患者不能从内分泌或HER2靶向治疗中获益。然而，许多最初从化疗中获益的TNBC患者出现耐药性，并经历复发、转移和最终死亡。转移性TNBC患者的中位生存期只有13个月。因此，迫切需要新的TNBC治疗策略。
最近，有报道称TNBC对铁死亡敏感，它是一种通过铁依赖的机制以过度脂质过氧化为标志的可调节的细胞死亡形式。尽管在形态、生化和基因上与凋亡不同，但是铁死亡代表了另一种肿瘤抑制机制，它消除了暴露于代谢应激或营养剥夺的癌前细胞。铁死亡的核心机制涉及氧化损伤和抗氧化防御之间的平衡。三肽谷胱甘肽，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成，是最丰富的细胞抗氧化剂，作为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的还原底物，以减少磷脂氢过氧化物，保护细胞免受铁死亡。半胱氨酸被认为是谷胱甘肽合成的限速前体。对于大多数癌细胞，虽然半胱氨酸可以通过胱硫醚β-合酶(CBS基因编码)和胱硫醚γ-裂解酶(CTH基因编码)合成，但细胞内半胱氨酸主要以胱氨酸(半胱氨酸氧化二聚体形式)的形式通过膜胱氨酸/谷氨酸转运体系统xC -从胞外摄取，从而满足对抗氧化防御的高需求。铁死亡可通过抑制xC -的外部途径诱导，或通过抑制细胞内抗氧化酶GPX4的内在途径诱导。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC增加了xC -的底物特异性亚基xCT的表达，并增加了胱氨酸的消耗，使他们更容易受到胱氨酸剥夺或xC -抑制。因此，胱氨酸剥夺或xC -抑制诱导的铁死亡在开发新的TNBC治疗策略方面存在巨大的潜力。
抵抗细胞死亡是癌症的一个标志。作为一种复杂且高度异质性的疾病，TNBC还通过多种机制对铁死亡产生抗性，特别是通过增加抗氧化能力。乳腺癌干细胞(BCSCs)是一小群具有无限增殖潜能和肿瘤起始特性的癌细胞，在耐药性中发挥重要作用。BCSCs对铁死亡诱导剂的反应还存在争议，而且仍然难以捉摸。
肿瘤内缺氧是乳腺癌的共同特征并通过依赖于缺氧诱导因子(HIFs)的多种途径促进BCSC的维持和特性，并且HIFs是O2稳态的主要调节因子。HIFs是一种异二聚体转录因子，由一个O2调控的HIF-1α或HIF-2α亚基和一个组成性表达的HIF-1β亚基组成。缺氧微环境和HIFs在乳腺癌耐药过程中发挥重要作用，但是，发明人发现，缺氧是否以及如何影响乳腺癌的铁死亡在很大程度上仍然难以捉摸。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供靶向缺氧诱导因子1(HIF-1)/胱硫醚β-合酶(CBS)在三阴性乳腺癌中的应用。本发明通过研究发现，缺氧的TNBC通过HIF-1调节的CBS转录激活和半胱氨酸生物合成的增加绕过了胱氨酸剥夺或xC -抑制介导的铁死亡。由于CBS的高表达，BCSCs对铁死亡具有抗性。抑制CBS与铁死亡诱导剂联合使用，有效地降低了BCSC数量。因此，靶向HIF-1/CBS可能通过诱导铁死亡来减少BCSC数量，改善TNBC患者的临床预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a3)至少一种中的应用：
a1)诱导乳腺癌干细胞铁死亡以减少乳腺癌干细胞数量或制备诱导乳腺癌干细胞铁死亡以减少乳腺癌干细胞数量的产品；
a2)抑制乳腺癌干细胞介导的乳腺癌耐药性或制备抑制乳腺癌干细胞介导的乳腺癌耐药性的产品；
a3)乳腺癌治疗或制备乳腺癌治疗的产品。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。比如该产品可用于在体外诱导调控乳腺癌干细胞铁死亡，从而建立高效经济的乳腺癌干细胞铁死亡实验模型；从而用于进一步研究铁死亡形成及其相关机制与乳腺癌特别是三阴性乳腺癌的发生发展的关系。
其中，所述缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物均可为人源；其表达产物显然可以为相应蛋白。
所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
所述a2)中，所述耐药性具体表现为对铁死亡的抗性，具体表现为对铁死亡诱导剂的抗性，包括柳氮磺胺吡啶和埃拉斯汀。
所述a3)中，所述乳腺癌治疗具体表现为：抑制肿瘤的起始，延长肿瘤复发时间，从而改善乳腺癌患者的临床预后。
所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括但不限于针对缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA、shRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对其本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗缺氧诱导因子1抗体或抗胱硫醚β-合酶抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括地高辛和氨基氧乙酸。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质。
所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括但不限于针对缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA、shRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对其本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗缺氧诱导因子1抗体或抗胱硫醚β-合酶抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括地高辛和氨基氧乙酸。
所述组合物还可以包括铁死亡诱导剂，所述铁死亡诱导剂包括柳氮磺胺吡啶和埃拉斯汀。
具体的，所述组合物其活性成分为氨基氧乙酸和埃拉斯汀，二者质量比1:1-5，优选为1:2；氨基氧乙酸共同给药增加了埃拉斯汀对肿瘤生长的抑制作用，并完全消除了埃拉斯汀诱导的ALDH+细胞百分比和形成乳腺球的细胞的增加。即氨基氧乙酸与埃拉斯汀联合显著抑制肿瘤生长，降低了乳腺癌干细胞对铁死亡的抗性。
进一步的，所述组合物其活性成分为地高辛和埃拉斯汀，二者质量比为1:5-20，优选为1:10；地高辛联合给药完全消除(甚至进一步减少)埃拉斯汀诱导的乳腺癌干细胞富集，与地高辛共同治疗使肿瘤对埃拉斯汀治疗更加敏感，通过肿瘤根除时间的减少衡量，并通过肿瘤复发时间的增加来显著抑制肿瘤复发的增加。即HIF-1的药理抑制可降低CBS的表达，使BCSCs对铁死亡敏感，并抑制BCSC数量。
上述组合物在治疗乳腺癌特别是三阴性乳腺癌方面产生了协同作用，因此，本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
b1)提高乳腺癌干细胞对铁死亡敏感性，抑制乳腺癌干细胞数量或制备提高乳腺癌干细胞对铁死亡敏感性，抑制乳腺癌干细胞数量的产品；
b2)延缓乳腺癌复发或制备延缓乳腺癌复发的产品；
b3)治疗乳腺癌或制备治疗乳腺癌的产品。
其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
所述产品可以为药物或实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。
本发明所述辅料是指组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。本领域常用的辅料比如缓冲剂、稳定剂、防腐剂或赋型剂，常用的赋形剂例如粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂等。
作为示例，本发明的所述制剂中可选用的赋形剂包括但不限于：所述赋形剂选自磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精、淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐和聚乙烯吡咯烷酮。
发明所述药物载体可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂、囊泡、纳米材料等，用于将递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择，同时，蛋白和脂质体也是药物载体。以及，除本发明提到的以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，作者(英)R.C.罗(RaymondCRowe)(美)P.J.舍斯基(PaulJSheskey)。在此不再赘述。
本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
三阴性乳腺癌由于其侵袭性特征和缺乏靶向治疗，预后较差。TNBC对铁死亡敏感，这是一种铁依赖的程序性细胞死亡，使其成为治疗TNBC的潜在靶点。乳腺癌干细胞在对传统治疗的耐药性中起着关键作用，但BCSCs是否对铁死亡诱导药物有反应尚不清楚。上述技术方案证明了在缺氧条件下，TNBC细胞通过缺氧诱导因子1(HIF-1)诱导的胱硫醚β-合酶(CBS)上调，从而为谷胱甘肽的合成提供了另一种半胱氨酸来源，并保护细胞免受胱氨酸摄取抑制诱导的铁死亡。CBS在BCSCs中过表达，并介导BCSCs对铁死亡的抗性。CBS的遗传或药理抑制通过诱导铁死亡减少体外和体内的BCSC数量。HIF-1的药理抑制降低CBS的表达，抑制肿瘤的起始，增加肿瘤复发的时间。这些结果表明，靶向HIF-1/CBS可能通过诱导铁死亡来减少BCSC数量，改善TNBC患者的临床预后。
总之，上述技术方案为三阴性乳腺癌的发生发展提供了新的机制研究，并为三阴性乳腺癌癌患者提供了有前景的治疗策略，因此具有良好的潜在实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：缺氧在TNBC中以HIF-1依赖的方式介导铁死亡抗性。(A，B)MDA-MB-231细胞在20％或1％的O2浓度下进行处理在培养48小时后，用MTT法检测细胞活力。(C)MDA-MB-231细胞在含(+)或不含(-)胱氨酸的培养基中培养，并在20％或1％的O2浓度下进行处理在培养48小时后，用MTT法检测细胞活力。(D，E)MDA-MB-231细胞在20％或1％的O2浓度下进行处理48小时后，进行C11-BODIPY染色，然后用流式细胞仪检测脂质过氧化反应。C11-BODIPY阳性细胞百分比。(F，G)MDA-MB-231亚克隆，稳定转染编码非靶向对照(NTC)短发夹RNA(shRNA)的表达载体，或编码抗HIF-1α、HIF-2α或两者同时编码的shRNA的载体(双敲除，DKD)，在1％O2下处理在培养48小时后，用MTT法检测细胞活力。(H，I)MDA-MB-231亚克隆在1％的O2浓度下进行处理48小时后，进行C11-BODIPY染色，然后用流式细胞仪检测脂质过氧化反应。C11-BODIPY阳性细胞百分比。数据显示为mean±SEM(n＝3)；***p<0.001；ns，不显著。
图2：缺氧在TNBC中以HIF-1依赖的方式上调CBS的表达。(A，B)MDA-MB-231细胞在20％或1％O2浓度下用erastin(Era)或sulfasalazine(SSA)处理48小时后，测定胱氨酸摄取率(A)和细胞内谷胱甘肽水平(B)。(C)在20％或1％O2下，MDA-MB-231细胞在含(+)或不含(-)胱氨酸的培养基中培养48小时后，测量细胞内谷胱甘肽水平。(D)是细胞内胱氨酸来源的一种方案。(E)MDA-MB-231亚克隆暴露于20％或1％O2 24小时后，分别进行RT-qPCR检测。(F)MDA-MB-231细胞暴露于20％或1％O2中在有溶媒(Veh)或digoxin(Dig)的情况下处理24小时，并进行RT-qPCR。(G)将MDA-MB-231细胞植入雌性SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，随机分配小鼠接受Veh或Dig治疗(每日2mg/kg，连续15天)。在第15天采集肿瘤进行RT-qPCR。(H)MMTV-PyMT转基因小鼠分别用Veh或Dig(每天2mg/kg，连续15天)处理，并在第15天采集肿瘤进行RT-qPCR。(I)采用皮尔逊相关检验，将TCGA数据库中1097例人类原发性乳腺癌的CBSmRNA水平与HIF特征基因进行比较。Pearson相关系数(R)和p值显示。(J)比较了TCGA数据库中1097例人原发性乳腺癌中4个分子亚型的CBS mRNA水平。数据分析采用单因素方差分析。(K，L)MDA-MB-231细胞暴露于20％或1％的O2中16小时后，用对照IgG或抗HIF-1α、HIF-2α或HIF-1β抗体和qPCR引物在CBS基因候选HIF结合位点两侧进行染色质免疫沉淀(ChIP)(K)。结果见(L)。(M)生成了以下报告质粒：pCBS-HRE，包含一个55bp的候选缺氧反应元件(HRE)，一个是野生型(WT)，一个是突变型(MUT)，上游的SV40启动子和萤火虫荧光素酶编码序列(上)；以及pSV-Renilla，一个包含SV40启动子下游的海肾荧光素酶编码序列的对照质粒(下)。(N)MDA-MB-231细胞与pCBS-HRE(WT或MUT)和pSV-Renilla共转染。转染24小时后，细胞暴露于20％或1％的O2持续24小时后，测定Firefly与Renilla的比率。数据显示为mean±SEM(A、B和C的n＝6；E、F、L和N的n＝3；G和H的n＝5)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著。
图3：CBS敲低逆转了TNBC中缺氧介导的铁死亡抗性。用编码NTC的载体或2种靶向CBS的shRNA中的任何一种转染(A)MDA-MB-231细胞，并进行RT-qPCR。(B)在1％的O2下，MDA-MB-231NTC或CBS敲除亚克隆条件下用erastin(Era)或sulfasalazine(SSA)处理48小时后，测量胱氨酸摄取率。(C，D)MDA-MB-231NTC或CBS敲除亚克隆，或CBS敲低亚克隆#1转染shRNA抗性CBS载体，在1％O2下用Era或SSA处理(C)，或在1％O2下用在含(+)或不含(-)胱氨酸的培养基中培养(D)，48小时，并测量细胞内谷胱甘肽水平。(E，F)MDA-MB-231NTC或CBS敲除亚克隆，或CBS敲低亚克隆#1转染shRNA抗性CBS载体，在1％的O2下用Era处理(E)，或在1％的O2下，用含(+)或不含(-)胱氨酸的培养基中培养(F)，持续48小时。C11-BODIPY染色后，流式细胞仪检测脂质过氧化情况。C11-BODIPY阳性细胞百分比。(G，H)MDA-MB-231NTC或CBS敲除亚克隆，或CBS敲低亚克隆#1转染shRNA抗性CBS载体，在1％的O2下用Era或SSA处理(G)，或在1％的O2下用含(+)或不含(-)胱氨酸的培养基中培养(H)，持续48小时。采用MTT法检测细胞活力。数据显示为mean±SEM(B、C、D的n＝6；A、G、H的n＝3)；***p<0.001；ns，不显著。
图4：CBS介导BCSCs的铁死亡抗性。(A)MDA-MB-231细胞经sulfasalazine(SSA)或erastin处理72小时后，测定ALDH+细胞的百分比。(B)TNBC细胞分别用vehicle、erastin或紫杉醇处理72小时。进行qPCR检测，log2(倍数变化)计算erastin或紫杉醇治疗vsvehicle，并绘制热图。(C)采用流式细胞术将MDA-MB-231细胞分为ALDH-阳性(-)和ALDH+阳性(+)群体,并进行RT-qPCR。(D)MDA-MB-231细胞在标准的聚苯乙烯组织培养板(贴壁)或超低粘附板(成球)上培养7天，并进行RT-qPCR。(E，F)MDA-MB-231细胞用Era处理72小时，并测定ALDH+细胞的百分比测定(E)和每1000个细胞的乳腺球数量(F)。(G，H)采用Pearson检验分析了TCGA数据库中人原发性乳腺癌中CBS mRNA表达与mRNAsi(G)和BCSC标记基因(H)的相关性。数据显示为mean±SEM(A、C、D、E为n＝3；F为n＝6)；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5：抑制CBS可促进BCSCs在体内的铁死亡。(A-C)将2×106个MDA-MB-231NTC或CBS敲低的亚克隆细胞植入SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到110mm3时(第0天)，小鼠随机分组，每天用生理盐水(Veh)或20mg/kg erastin(Era)治疗，连续15天。(A).每2-3天测量一次肿瘤体积在第15天采集肿瘤样本，进行ALDH(B)和乳腺球(C)检测。(D)将2×106个MDA-MB-231NTC或CBS敲低的亚克隆细胞植入SCID小鼠体内。当肿瘤可触及时，小鼠每天接受20mg/kg的erastin治疗，直到肿瘤不再可触及。绘制了无肿瘤(左)、携带肿瘤(中心)和无复发(右)的Kaplan-Meier生存曲线，并显示了log-rank检验的P值。n＝8用于肿瘤形成；n＝7用于肿瘤根除和肿瘤复发(每组1只小鼠未达到肿瘤根除)。(E-G)将2×106个MDA-MB-231细胞植入SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到110mm时3(第0天)，小鼠随机分组，分别用生理盐水(Veh)、erastin(Era，20mg/kg每日)、AOAA(10mg/kg每日)或Era+AOAA治疗，持续15天。每2-3天测量一次肿瘤体积(E)。在第15天采集肿瘤样本进行ALDH(F)和乳腺球(G)检测。(H-J)MMTV-PyMT转基因小鼠分别用生理盐水(Veh)、erastin(Era，每日20mg/kg)、AOAA(每日10mg/kg)或Era+AOAA治疗15天，当肿瘤累积体积达到150mm3时.每2-3天测量一次肿瘤体积(H)。在第15天采集肿瘤样本进行ALDH(I)和乳腺球(J)检测。数据显示为mean±SEM(A-C、E-G和H-J为n＝5)；*p<0.05，**p<0.01；ns，不显著。
图6：digoxin通过诱导铁死亡来阻断BCSCs。(A-D)将2×106个MDA-MB-231细胞植入SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到110mm3时(第0天)，小鼠随机分组，用生理盐水(Veh)、erastin(Era，每日20mg/kg)、digoxin(Dig，每日2mg/kg)或Era+Dig治疗，持续15天。(A).每2-3天测量一次肿瘤体积在第15天采集肿瘤样本，用于qPCR(B)、ALDH(C)和乳腺球(D)检测(mean±SEM，n＝5)*p<0.05，**p<0.01。(E)用Veh、Era、Dig或Era+Dig预处理MDA-MB-231细胞48小时，计数活细胞并植入SCID小鼠(各1000或250个活细胞)。显示10周后发生肿瘤的小鼠数量，并进行Fisher精确检验以确定统计学意义。(F)将2×106个MDA-MB-231细胞植入SCID小鼠体内。当肿瘤可触及时，小鼠每天接受20mg/kg Era或20mg/kg Era+2mg/kg Dig治疗，直到肿瘤不再可触及。绘制了荷瘤(左)和无复发(右)的Kaplan-Meier生存曲线，并显示了log-rank检验的P值(n＝10)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
说明书中提及的相关缩写：
缩写
AOAA，氨基羟乙酸
BCSC，乳腺癌干细胞
CBS，胱硫醚β-合酶
CHIP，染色质免疫沉淀
DKD，双敲低
ER，雌激素受体
GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶4
HER2，人表皮生长因子受体2
HIF，缺氧诱导因子
HRE，缺氧反应元件
MFP，乳腺脂肪垫
mRNAsi，基于mRNA表达的茎干性指数
MTT，噻唑蓝
NTC，非目标控制
PR，孕酮受体
SCID，严重的联合免疫缺陷
shRNA,短发夹RNA
TCGA，癌症基因组图集
TNBC，三阴性乳腺癌
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
材料和方法
细胞培养
TNBC细胞系MDA-MB-231和Hs578T在DMEM中培养；SUM159细胞在DMEM/F12(50：50)中培养，这两种细胞均添加10％胎牛血清(vol/vol)和1％青霉素-链霉素(vol/vol)。细胞保持在37℃，5％的CO2，95％的空气培养箱中(20％O2).缺氧细胞在一个模块化的培养箱室(比卢普斯-罗森伯格)中保持在37℃，用含有1％O2、5％CO2和94％N2的气体混合物混匀整个培养室。
慢病毒转导
编码靶向HIF-1α和HIF-2α的shRNA的慢病毒载体之前已经描述过。28pLKO.1-puro编码靶向CBS的shRNA慢病毒载体购自Sigma-Aldrich，克隆ID#1：TRCN0000308284(靶向3’-UTR区域)，#2：TRCN0000045359(靶向CDS区域)。编码CBS的pLX304慢病毒穿梭载体购自DNASU质粒库，克隆ID：HsCD00437463。用PolyJet(SignaGen)共转染质粒pCMV-dR8.91和编码水泡性口炎病毒G蛋白的质粒，将慢病毒包装在293T细胞中。转染48小时后收集含有病毒颗粒的培养基，并通过0.45μM过滤器。用病毒上清液中添加8μg/mL Polybrene(Sigma-Aldrich)转导TNBC细胞。24小时后，细胞用含有嘌呤霉素的新鲜培养基补充(Sigma-Aldrich，针对基于pLKO.1的慢病毒)或杀稻瘟菌素(Sigma-Aldrich，针对基于pLX304的慢病毒)来选择稳定转染的细胞。
细胞活力测定
TNBC细胞在处理前1天接种于24孔板中。在指定的处理后，每个孔被含有50μL10mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)试剂(Sigma-Aldrich)的新鲜培养基取代。在37℃下孵育2小时后，用含有20％ SDS的二甲基甲酰胺/H2O的裂解缓冲液(500uL/孔)裂解细胞(1：1，v/v；pH 4.7)在37℃下，持续6小时。使用FLUOstar Omega酶标仪(BMG Labtech)在570nm波长下定量吸光度。
脂质过氧化试验
将TNBC细胞接种于60mm的培养皿中。在指定的处理后，每个培养皿被含有5μMBODIPY 581/591C11染料(Invitrogen)的新鲜培养基取代。在37℃下孵育30min后，胰蛋白酶处理细胞，并使用FACScalibur(BD生物科学公司)进行流式细胞术分析。
胱氨酸摄取试验
经过指定的处理后，TNBC细胞被胰蛋白酶消化后，离心收集，用0.5mL不含胱氨酸且含有0.2μCi/mL 14C标记的胱氨酸(Perkin Elmer)的培养基在Eppendorf管中重悬，在37℃下孵育30min。孵育后，将细胞旋转下来，用冰冷的PBS洗涤三次，然后用200μL 0.2％SDS/0.2N氢氧化钠溶液裂解细胞，孵育1小时，用40μL 1N盐酸中和，用贝克曼LS6500闪烁计数器(贝克曼)分析。
谷胱甘肽测定
经过指定的处理后，TNBC细胞被胰蛋白酶消化，离心收集，在5％(wt/vol)5-磺基水杨酸中重悬，进行3次冻融循环，离心去除碎片。上清液使用谷胱甘肽检测试剂盒(Sigma-Aldrich)进行分析。使用FLUOstar Omega酶标仪(BMG Labtech)在405nm波长下定量吸光度。
逆转录和qPCR
总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取，用异丙醇沉淀，用DNase I(Ambion)处理。使用高容量RNA-cDNA试剂盒(应用生物系统公司)进行cDNA合成。qPCR分析采用SYBR Green和CFX96实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad)进行。根据周期阈值(Ct)为E＝2-Δ(ΔCt)，计算每个靶标mRNA相对于18S rRNA的表达量(E)，其中ΔCt＝Ct(靶基因)-Ct(18SrRNA)和Δ(ΔCt)＝ΔCt(检测样本)-ΔCt(对照样本)。RT-qPCR引物序列(5’到3’)如下：CBS(人类)正向：GGCCAAGTGTGAGTTCTTCAA,反向：GGCTCGATAATCGTGTCCCC；CBS(鼠)正向:GGAAAATTGGGAACACCCCTAT，反向：CCACCCGCATTGAAGAACTCA。
CHIP分析
TNBC细胞在3.7％的甲醛中交联15分钟，在0.125M甘氨酸中终止交联5分钟，然后用SDS裂解缓冲液裂解。用超声波剪切染色质，用salmon sperm DNA/蛋白A -琼脂糖浆(Millipore)预先清除裂解物1小时，并在琼脂糖珠存在下与抗HIF-1α(Novus,NB100-479)、HIF-1β(Novus,NB100-110)或HIF-2α(Bethyl,A700-003)的抗体或IgG孵育过夜。用低盐、高盐、氯化锂和Tris-EDTA缓冲液依次清洗琼脂糖珠后，用1％ SDS和0.1M NaHCO3洗脱DNA，加入0.2M氯化钠可逆转交联。用苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀法纯化DNA，用qPCR分析候选结合位点。qPCR的引物序列(5’到3’)为：正向：CATCTCCACATGGCCTTTTT，反向：GGGACAGGGATGGAGTTACA。
HRE荧光素酶报告基因分析
为了构建CBS-HRE报告基因，将pGL2-启动子的BamHI和SalI位点之间插入55bp的野生型或突变型双链寡核苷酸，该位点包含萤火虫荧光素酶编码序列上游的基础SV40启动子。用于pGL2-HRE质粒构建的双链寡核苷酸序列为：野生型：5‘-GATCATAAGAAGAGAGACGTGGACACAGACACGCGGAGAGAAAAAGG CCATGTGGAGAT-3’，5‘-TCGAatctccacatggcctttttctctccgcgtgtctgtgtccacgtctctcttcttat-3’；突变体：5‘-GATCATAAGAAGAGAGACGTGGACACAGACTTTCGGAGAGAAAAAGGCCA TGTGGAGAT-3’，5’-TCGAATCTCCACATGGCCTTTTTCTCTCCGAAAGTCTGTGTCCACGTCTC TCTTCTTAT-3’。将TNBC细胞接种到48孔板上，并用重组pGL2-Promoter质粒共转染，该质粒包含HRE野生型或HRE突变型序列和pSV-Renilla。转染后的细胞暴露于20％或1％的O2中24小时。使用双荧光素酶检测系统(Promega)和发光板阅读器(PerkinElmer)测定细胞裂解液中的萤Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。
ALDEFLUOR分析
ALDEFLUOR分析(干细胞技术)按照制造商的说明进行。经胰蛋白酶处理后，用1×106法计数TNBC细胞将活细胞悬浮于含有1μM BODIPY-氨基乙醛的检测缓冲液中，在37℃下孵育45分钟。每个样本的全部细胞用50mM diethylaminobenzaldehyde处理，作为门控的阴性对照。使用FACSCalibur(BD BioScinence)采用流式细胞仪分析样本。
乳腺球试验
胰蛋白酶处理后计数TNBC细胞，将单细胞悬液以5000个完全培养液的密度接种于6孔超低附着培养基(干细胞技术)。7天后用相衬显微镜(奥林巴斯)拍摄乳腺球培养物，用Image J软件(NIH)计数直径为≥50μm的乳腺球。
动物研究
动物方案由山东大学机构动物护理和使用委员会和四川大学华西医院批准，并符合《国家卫生研究所实验室动物护理和使用指南》。对于SCID小鼠的检测，将约2×106个MDA-MB-231亲本或敲除亚克隆细胞用1:1的Matrigel(BD Biosciences)悬液注入5-7周龄雌性小鼠的乳腺脂肪垫(MFP)。小鼠按需要给予药物治疗。为了进行致瘤性试验，将1000或250个预处理的MDA-MB-231注射到5-7周龄雌性小鼠的MFP中，并在注射后70天记录发生可触及肿瘤的小鼠数量。对于MMTV-PyMT转基因小鼠的检测，当每只小鼠的乳腺肿瘤累积体积达到150mm3时，用药物治疗小鼠.测量原发肿瘤的长度(L)和宽度(W)，肿瘤体积(V)计算为V＝L×W2×0.524.腹腔注射生理盐水、erastin、AOAA和digoxin。
生物信息学
CBS的表达数据，10个HIF标志基因和20个乳腺癌干细胞基因均来自1247例患者的TCGA乳腺浸润性癌(BRCA)数据集，并进行皮尔逊相关检验。TCGA BRCA数据集中患者样本的mRNAsi来自于以前的出版物。
统计分析
所有数据均以mean±SEM表示。对于致瘤性试验，采用了Fisher精确试验。对于所有其他的检测方法，两组之间的差异采用双尾t检验，而多组之间的差异采用事后检验的方差分析。对于所有的测试，P值小于0.05被认为是存在显著差异的。数据分析使用GraphPadPrism 8.3.0进行。
结果
缺氧在TNBC中以HIF-1依赖的方式介导铁死亡抗性
为了研究缺氧对铁死亡的影响，我们用xCT抑制剂柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(图1A)或埃拉斯汀(erastin)(图1B)处理了在20％或1％氧气浓度下TNBC细胞系MDA-MB-231、SUM159和Hs578T持续48小时。在20％的氧条件下，sulfasalazine和erastin使三种TNBC细胞系的细胞活力均降低50％，而铁死亡抑制剂Fer-1(ferrostatin-1)或去铁胺(deferoxamine)共同处理则消除了这一情况(图1A，B)。凋亡抑制剂Z-VAD或坏死性凋亡抑制剂Nec-1S(necrostatin-1s)对sulfasalazine和erastin诱导的细胞死亡影响不大(图1A，B)，表明xCT抑制剂主要通过铁死亡诱导TNBC细胞死亡。相反，在1％氧气培养条件下sulfasalazine和erastin不能诱导细胞死亡(图1A、B)。同样，在20％氧气下，细胞培养基去除半胱氨酸也能诱导细胞铁死亡，但在1％氧气下不能诱导细胞铁死亡(图1C)。使用荧光探针C11-BODIPY，我们测量了脂质过氧化，这是铁死亡的一个标志，在MDA-MB-231细胞中对erastin处理和半胱氨酸去除的反应。我们观察到，在20％的氧气下，erastin处理或细胞培养基中半胱氨酸去除增加了脂质过氧化；而在1％的氧气浓度下，两种处理都未增加脂质过氧化(图1D，E)。
为了阐明缺氧介导TNBC铁死亡的机制，我们用编码非靶向对照(NTC)短发夹RNA(shRNA)的表达载体，或编码靶向HIF-1α、HIF-2α或HIF-1α和HIF-2α的shRNA载体(双重敲除，DKD)稳定转导TNBC细胞系。在1％的氧气浓度下，HIF-1α敲低或DKD，而不是HIF-2α敲低，使TNBC细胞系对sulfasalazine或erastin处理(图1F)和半胱氨酸去除(图1G)重新敏感。在1％的氧气条件下，Erastin处理(图1H)或半胱氨酸去除(图1I)增加了MDA-MB-231细胞的HIF-1α敲低亚克隆的脂质过氧化。综上所述，这些数据表明，缺氧在TNBC中以HIF-1依赖的方式介导了铁死亡抗性。
缺氧诱导HIF-1介导的CBS表达
谷胱甘肽是保护细胞免受脂质氧化和抑制铁死亡的主要抗氧化剂。为了了解缺氧介导的铁死亡抗性的机制，我们用sulfasalazine或erastin处理TNBC细胞系，发现这些xCT抑制剂在20％或1％的氧气条件下以相似的水平降低了胱氨酸摄取(图2A)。然而，在1％的氧气条件下，xCT抑制剂介导的细胞内谷胱甘肽水平的下降在很大程度上被阻断(图2B)。同样，在1％的氧气条件下，细胞培养基中半胱氨酸去除会降低细胞内谷胱甘肽水平，这也被阻断(图2C)。这些数据表明，当胱氨酸摄取被阻断时，TNBC细胞可能采用另一种机制为谷胱甘肽的合成提供半胱氨酸。
半胱氨酸除了通过xCT转运体以胱氨酸的形式摄取外，半胱氨酸也可以在细胞中由胱硫醚转化，胱硫醚由CBS酶催化的同型半胱氨酸和丝氨酸结合形成(图2D)。我们发现，缺氧诱导了TNBC细胞系中CBS的表达，但可以通过HIF-1α敲低或DKD来消除，而HIF-2α敲低则没有消除(图2E)。Digoxin对HIF-1α的药理抑制也阻断了缺氧诱导的TNBC细胞系中CBSmRNA的表达(图2F)。
在一个异种移植模型中，我们将MDA-MB-231细胞植入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的MFP中，发现每天使用2mg/kg digoxin可降低CBS mRNA的表达(图2G)。在一个基因工程，自然发生乳腺癌模型中，每天用2mg/kg digoxin治疗MMTV-PyMT转基因小鼠也能降低其乳腺肿瘤中的CBS mRNA水平(图2H)。
我们分析了来自The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中1097个人类乳腺癌标本的基因表达数据，发现CBS mRNA水平与由9个HIF标志基因组成集(ANGPTL4，LDHA PGK1，CA9，CXCR3，L1CAM，BNIP3、PLOD1和P4HA1)存在显著相关性(r＝0.34，p<0.0001)(图2I)。我们还比较了基于50-mRNA(PAM50)特征的不同乳腺癌亚型(Basal-like,Luminal A,LuminalB,HER2-enriched)中CBS的表达发现Basal-like乳腺癌中CBS mRNA水平显著升高(图2J)，并且Basal-like乳腺癌与TNBC高度重叠并高表达HIF-靶基因。39所有这些数据表明，CBS的表达是受到HIF-1的调控的。
为了研究HIF-1是否直接结合CBS基因并调节其转录，我们搜索CBS基因序列匹配共识HIF-binding位点序列5’-(A/G)CGTG-3’并在MDA-MB-231(图2L)，SUM159和Hs578T细胞中进行染色质免疫沉淀(ChIP)，然后使用候选结合位点两侧进行qPCR。缺氧诱导HIF-1α和HIF-1β(而不是HIF-2α)结合到CBS基因5’侧翼区域，与转录起始位点相距1.3kb(图2K)。接下来，我们研究了包含这个HIF-1结合位点的DNA片段是否为一个功能性缺氧反应元件(HRE)。我们将一个跨越HIF-1结合位点的55bp寡核苷酸插入pGL2启动子报告质粒中，生成了一个报告质粒，其中一个基础SV40启动子驱动萤火虫萤光素酶的表达(图2M)。我们将pGL2/CBS-HRE和pSV-Renilla共转染TNBC细胞，其中基础SV40启动子驱动海肾萤光素酶的表达(图2M)，并将细胞暴露于20％或1％的O2中24小时。缺氧暴露显著增加了MDA-MB-231(图2N)、SUM159和Hs578T细胞中firefly与renilla的比值。而CBS HRE的HIF-1结合位点的5’-GCGTG-3’到5’-GAAAG-3’的突变消除了缺氧诱导的萤光素酶活性(图2N)，表明55-bp的寡核苷酸作为HRE发挥作用。综上所述，这些数据表明，缺氧诱导了HIF-1依赖的CBS转录激活。
CBS的表达是缺氧条件下铁死亡抗性所必需
为了研究CBS在缺氧介导的抗铁死亡过程中的作用，我们在MDA-MB-231(图3A)、SUM159和Hs578T细胞中生成了shRNA介导的CBS敲低亚克隆。在1％O2下，CBS敲除不影响sulfasalazine介导的胱氨酸摄取抑制(图3B)。在NTC亚克隆中，当TNBC细胞在1％O2下培养时，erastin或sulfasalazine抑制xCT，或从细胞培养基中去除半胱氨酸，并不能降低细胞内谷胱甘肽水平；而在CBS敲除亚克隆中，xCT抑制和半胱氨酸去除均显著降低了1％O2下的谷胱甘肽水平(图3C、D。通过过表达一种耐shRNA的CBS载体，可以挽救谷胱甘肽水平的下降(图3C，D)，这表明当胱氨酸摄取被抑制时，CBS在维持细胞内谷胱甘肽水平方面发挥了重要作用。
我们还通过C11-BODIPY检测了MDA-MB-231亚克隆细胞的脂质过氧化，发现当细胞在1％O2下培养时，CBS敲低增加了erastin处理或半胱氨酸去除诱导的脂质过氧化，并通过过表达一个抗shRNA的CBS载体来挽救(图3E，F)。在1％O2下培养时，CBS敲除也使TNBC细胞对xCT抑制剂介导的(图3G)和半胱氨酸去除介导的(图3H)的细胞死亡敏感，并且通过对抗shRNA的CBS载体的过表达来挽救(图3G，H)。综上所述，这些数据表明了CBS在缺氧条件下抵抗铁死亡中的关键作用。
CBS介导BCSCs中的铁死亡抗性
接下来，我们研究了CBS介导的铁死亡抗性在乳腺癌治疗中的生物学后果。BCSCs对药物治疗有耐药性并且主要位于缺氧的生态位中。我们发现，在20％O2下用erastin或sulfasalazine，成功诱导了细胞铁死亡(图1A，B)，增加了具有BCSC特征的ALDH+细胞的百分比(图4A)。与化疗药物紫杉醇相比，它通过主动诱导多能性因子的表达来诱导BCSC的富集(图4B)，erastin治疗不能增加(甚至在某些情况下减少)多能性因子的表达，而这是非BCSCs主动转化为BCSCs所必需的，这表明BCSC对xCT抑制剂介导的铁死亡的抗性是erastin诱导BCSC富集的主要原因。因此，我们假设CBS有助于BCSCs的铁死亡抗性。
为了验证这一假设，我们首先检测了BCSCs中CBS mRNA的表达，并与整体细胞进行了比较。我们将TNBC细胞分选为ALDH+细胞群和ALDH-细胞群，ALDH+细胞群富含BCSCs，而ALDH-细胞群缺乏BCSCs,并且发现，与ALDH-细胞比较，ALDH+细胞中CBS mRNA水平高出10-20倍(图4C)。我们还将TNBC细胞培养为乳腺球来富集BCSCs，发现非粘附乳腺球培养中CBSmRNA水平是单层培养的4-6倍(图4D)，表明CBS表达与BCSC表型之间存在相关性。
为了研究CBS在BCSCs铁死亡抗性中的作用，我们在20％O2浓度下用erastin处理NTC或CBS敲除亚克隆，成功地诱导了细胞铁死亡。在NTC亚克隆中，erastin处理增加了ALDH+细胞的百分比(图4E)，增加了具有乳腺球形成能力的细胞数量(图4F)，在CBS敲除亚克隆中完全消失(图4E，F)，表明CBS敲除使BCSCs对erastin介导的细胞铁死亡敏感。
为了检验我们的发现的临床相关性，我们分析了来自TCGA数据库的人类原发性乳腺癌的基因表达数据，并发现CBS mRNA水平与乳腺癌干性相关，通过机器学习生成的基于mRNA表达的干性指数(mRNASi)所测量的(图4G)，和20个BCSC标记基因的表达(图4H)。综上所述，这些数据表明CBS介导了BCSCs的铁死亡抗性。
CBS介导体内BCSC抵抗铁死亡
为了研究CBS在体内调节BCSCs的铁死亡抗性中的作用，我们注射了2×106个MDA-MB-231NTC或CBS敲低的亚克隆细胞进入SCID小鼠的MFP。当肿瘤体积达到120mm3时，我们每天用vehicle或20mg/kg的erastin治疗小鼠，持续15天，并在最后一次剂量后收集肿瘤进行ALDH和乳腺球检测。CBS敲低不影响肿瘤的生长速率，但使肿瘤对erastin治疗敏感(图5A)。erastin治疗增加了ALDH+细胞的百分比和具有乳腺球形成能力的细胞数量，这些现象在CBS敲除后完全消除(图5B，C)。
为了确定在体内治疗后CBS对BCSC群体的影响，我们注射了2×106个MDA-MB-231NTC或CBS敲低的亚克隆细胞进入SCID小鼠的MFP中，当肿瘤可触及时，每天用20mg/kg的erastin治疗小鼠。erastin通过治疗几周后，能够根除这些小肿瘤。当肿瘤不再可触及时，我们终止了erastin治疗，并监测肿瘤复发。CBS敲低并没有改变肿瘤形成的时间(图5D，左图)，但减少了肿瘤根除的时间(图5D，中间图)，这与CBS敲低没有改变肿瘤生长速率，但使肿瘤对erastin治疗敏感的研究结果一致(图5A)。最重要的是，在erastin治疗终止后，CBS敲除显著延长了肿瘤复发的时间(图5D，右图)，表明在体内，与NTC相比，erastin降低了CBS敲除亚克隆的BCSC数量。
接下来，我们研究了CBS的药理抑制是否能逆转BCSCs的铁死亡抗性，并阻断erastin诱导的BCSC。我们在20％和1％O2条件下用erastin单独或与CBS抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)联合处理MDA-MB-231细胞，并发现共同给予AOAA逆转了缺氧诱导的铁死亡抗性并且在1％O2浓度下，脂质过氧化反应增加。我们注射了2×106个MDA-MB-231细胞进入SCID小鼠的MFP中，用生理盐水、erastin(20mg/kg每日，15天)、AOAA(10mg/kg每日，15天)或erastin和AOAA联合处理小鼠。AOAA共同给药增加了erastin对肿瘤生长的抑制作用(图5E)，并完全消除了erastin诱导的ALDH+细胞百分比(图5F)和形成乳腺球的细胞(图5G)的增加。我们在基因工程MMTV-PyMT小鼠中观察到类似的结果，AOAA与erastin联合显著抑制肿瘤生长(图5H)，并完全阻断了erastin诱导的ALDH+细胞百分比的增加(图5I)和乳腺球形成细胞的数量(图5J)。综上所述，这些数据表明，在体内CBS的遗传或药理抑制降低了BCSCs对铁死亡的抗性.
HIF抑制剂使BCSCs对铁死亡敏感
为了探索我们的发现的意义，我们研究了HIF-1抑制剂地高辛(digoxin)，该药物正在进行乳腺癌治疗的临床试验(NCT03928210，NCT01763931)，是否通过CBS抑制靶向BCSCs。我们注入了2×106个MDA-MB-231细胞进入SCID小鼠的MFP中，分别用生理盐水、erastin(20mg/kg每日，15天)、digoxin(2mg/kg每日，15天)或erastin和digoxin联合治疗小鼠。digoxin与erastin共同给药显著抑制了肿瘤生长(图6A)，降低了CBS mRNA水平(图6B)，并完全消除了erastin诱导的ALDH+细胞百分比(图6C)和乳腺球形成细胞的数量(图6D)的增加，表明HIF-1的药理抑制不仅在主体细胞中诱导铁死亡，而且在BCSCs中也诱导铁死亡。
为了研究HIF-1抑制剂在BCSCs中特异性诱导铁死亡中的作用，我们进行了体内致瘤性试验来测量治疗后BCSCs的数量。我们用erastin单独或联合digoxin处理MDA-MB-231细胞，计数活细胞的数量，并将1000或250个活细胞注射到SCID小鼠的MFP中，从而使BCSCs限制肿瘤的形成(图6E)。注射1000个vehicle或erastin处理的细胞，15只小鼠全部形成肿瘤，而注射1000个erastin和digoxin处理的细胞，15只小鼠中只有5只形成肿瘤，这表明erastin和digoxin联合使用可以显著降低BCSC的数量。在250个细胞的注射中，注射vehicle处理的细胞15只小鼠中有4只形成肿瘤，而注射erastin处理的细胞15只小鼠中有8只形成肿瘤，因此erastin处理提高了BCSCs的百分比。在注射250个erastin和digoxin处理过的细胞后，15只小鼠中只有1只形成肿瘤，这表明digoxin联合给药完全消除(甚至进一步减少)erastin诱导的BCSC富集(图6E)。
我们还通过肿瘤根除实验检测了HIF-1抑制剂对体内BCSCs的影响。我们注入了2×106个MDA-MB-231细胞进入SCID小鼠的MFP中，当肿瘤可触及时，我们每天用20mg/kg的erastin或20mg/kg的erastin加2mg/kg的digoxin治疗小鼠。当肿瘤不再可触及时，治疗终止，并监测小鼠的肿瘤复发。与digoxin共同治疗使肿瘤对erastin治疗更加敏感，通过肿瘤根除时间的减少衡量(图6F，左图)，并通过肿瘤复发时间的增加来显著抑制肿瘤复发的增加(图6F，右图)。综上所述，这些数据表明，HIF-1的药理抑制可降低CBS的表达，使BCSCs对铁死亡敏感，并抑制BCSC数量。
综上所述，缺氧的TNBC细胞通过HIF-1诱导的CBS上调产生铁死亡抗性，这为谷胱甘肽的合成提供了另一种半胱氨酸来源，并保护细胞免受胱氨酸摄取抑制诱导的铁死亡。CBS在BCSCs中过表达，并介导BCSCs对铁死亡的抗性。CBS的遗传或药理抑制通过诱导铁死亡减少体外和体内的BCSC数量。HIF-1的药理抑制降低CBS的表达，损害肿瘤的起始，增加肿瘤复发的时间。我们的研究结果表明，靶向HIF-1/CBS可能通过诱导铁死亡来减少BCSC数量，并改善TNBC患者的临床预后。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a3)至少一种中的应用：
a1)诱导乳腺癌干细胞铁死亡以减少乳腺癌干细胞数量或制备诱导乳腺癌干细胞铁死亡以减少乳腺癌干细胞数量的产品；
a2)抑制乳腺癌干细胞介导的乳腺癌耐药性或制备抑制乳腺癌干细胞介导的乳腺癌耐药性的产品；
a3)乳腺癌治疗或制备乳腺癌治疗的产品。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a2)中，所述耐药性具体表现为对铁死亡的抗性，具体表现为对铁死亡诱导剂的抗性，所述铁死亡诱导剂包括柳氮磺胺吡啶和埃拉斯汀；
所述a3)中，所述乳腺癌治疗具体表现为：抑制肿瘤的起始，延长肿瘤复发时间，从而改善乳腺癌患者的临床预后。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括但不限于针对缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA、shRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对其本身或其上下游分子的特异性抗体，如抗缺氧诱导因子1抗体或抗胱硫醚β-合酶抗体；
进一步的，所述抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质包括地高辛和氨基氧乙酸。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分至少包括抑制缺氧诱导因子1和/或胱硫醚β-合酶的编码基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质；
所述组合物还包括铁死亡诱导剂。
7.如权利要求6所述组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分为氨基氧乙酸和埃拉斯汀，二者质量比1:1-5，进一步为1:2。
8.如权利要求6所述组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分为地高辛和埃拉斯汀，二者质量比为1:5-20，进一步为1:10。
9.权利要求6-8任一项所述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
b1)提高乳腺癌干细胞对铁死亡敏感性，抑制乳腺癌干细胞数量或制备提高乳腺癌干细胞对铁死亡敏感性，抑制乳腺癌干细胞数量的产品；
b2)延缓乳腺癌复发或制备延缓乳腺癌复发的产品；
b3)治疗乳腺癌或制备治疗乳腺癌的产品。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
所述产品为药物或实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
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