SK282601B6 - Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie Download PDF

Info

Publication number
SK282601B6
SK282601B6 SK701-97A SK70197A SK282601B6 SK 282601 B6 SK282601 B6 SK 282601B6 SK 70197 A SK70197 A SK 70197A SK 282601 B6 SK282601 B6 SK 282601B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
lipopolyamine
group
nucleic acid
composition according
Prior art date
Application number
SK701-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK70197A3 (en
Inventor
Gerardo Byk
Catherine Dubertret
Daniel Scherman
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of SK70197A3 publication Critical patent/SK70197A3/sk
Publication of SK282601B6 publication Critical patent/SK282601B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/04—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C233/05—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Opisujú sa katiónové lipidy všeobecného vzorca (I) a farmaceutické kompozície obsahujúce tieto lipidy, ich použitie na prípravu liečiva na transfekciu nukleových kyselín in vitro alebo in vivo do buniek.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových zlúčenín patriacich do skupiny lipopolyamínov, farmaceutických kompozícií, ktoré tieto zlúčeniny obsahujú, a ich aplikácie na transfekciu in vivo a/alebo in vitro nukleových kyselín.
Doterajší stav techniky
Početné genetické ochorenia sú spojené s chybnou a/alebo abnormálnou expresiou (t. j. deficitnou alebo nadmernou expresiou) jednej alebo niekoľkých nukleových kyselín. Základným cieľom génovej terapie je korigovať tento typ genetických anomálií nepriamo bunkovou expresiou in vivo alebo in vitro klonovaných génov.
V súčasnosti existuje niekoľko spôsobov navrhnutých na intracelulárne poskytnutie tohto typu genetickej informácie. Jeden z týchto spôsobov spočíva v použití chemických alebo biochemických vektorov. Syntetické vektory majú dve základné funkcie, a síce viazať DNA určenú na transfekciu a podporiť jej celulámu fixáciu, ako aj jej prechod plazmovou membránou a prípadne obidvoma jadrovými membránami.
Významný pokrok sa dosiahol v rámci tohto transfekčného spôsobu vývojom technológie založenej na použití katiónového lipidu. Takto sa preukázalo, že pozitívne nabitý katiónový lipid, ktorým je N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamóniumchlorid (DOTMA), spontánne interferuje vo forme lipozómov alebo vo forme malých vačkov s DNA, ktorá je nabitá záporne, pri vzniku komplexov lipidy-DNA, ktoré sú schopné zlúčenia s bunkovými membránami, a umožňuje tak intracelulárne uvoľnenie DNA. Hoci je však táto molekula účinná na úrovni transfekcie, má nevýhodu spočívajúcu v tom, že nie je biologicky odbúrateľná a má proti bunkám toxický charakter.
Po lipide DOTMA boli vyvinuté ďalšie katiónové lipidy na báze tohto štrukturálneho modelu: lipofilná skupina spojená s amino-skupinou prostredníctvom ramena, ktoré býva označované ako „dištančný člen“. Z týchto katiónových lipidov sa môžu zvlášť citovať lipidy obsahujúce ako lipofilnú skupinu dve mastné kyseliny alebo derivát cholesterolu a zahrnujú okrem toho prípadne ako aminoskupinu kvartému amóniovú skupinu. Ako reprezentatívny zástupcovia tejto kategórie katiónových lipidov môžu byť hlavne citovaný DOTAP, DOBT alebo ChOTB. Ďalšie zlúčeniny, ako napríklad DOSC a ChOSC, sú charakterizované prítomnosťou cholinovej skupiny namiesto kvartémej amóniovej skupiny. Všeobecne však zostáva transfekčná účinnosť týchto zlúčenín dosť nízka.
Rovnako bola opísaná ďalšia kategória katiónových lipidov, ktorými sú lipopolyamíny. V tomto type zlúčenín je katiónová skupina reprezentovaná L-5-karboxysperminovým radikálom, ktorý obsahuje štyri amóniové skupiny, z nich dve sú primárnymi skupinami a dve sekundárnymi skupinami. Súčasťou tejto skupiny sú hlavne DOGS a DPPES. Tieto lipopolyamíny sú hlavne účinné na transfekciu primárnych endokrinných buniek.
Katiónové lipidy DOGS a DPPES sú opísané v spise EP0394 111.
V skutočnosti by ideálne syntetické transfekčné činidlo malo mať vysokú mieru transfekcie a súčasne by malo mať pre široké spektrum buniek nulovú toxicitu alebo aspoň veľmi minimalizovanú toxicitu pri aplikačných dávkach, pričom takéto ideálne transfekčné činidlo by malo byť biologicky odbúrateľné na účely eliminácie všetkých sekundárnych účinkov na úrovni ošetrených buniek.
Cieľom vynálezu je navrhnúť nové zlúčeniny, ktoré by boli schopné účinného použitia pri transfekcii in vitro alebo in vivo buniek a hlavne na vektorizáciu nukleových kyselín.
Podstata vynálezu
Prvým predmetom vynálezu sú lipopolyamíny vo forme D, L alebo DL a ich solí, reprezentované všeobecným vzorcom (I)
H2N- ( (CH) „-NH) „-H
I
R (I), v ktorom m znamená celé číslo od 2 do 6, n znamená celé číslo od 1 do 9 a výhodnejšie od 1 do 5, pričom v prípade, že n znamená celé číslo od 2 do 9, potom vo všeobecnom vzorci je prítomná jediná skupina R odlišná od vodíka, a m má premenné alebo identické hodnoty v skupinách
-(CH).I
R alebo -(CH^,
R znamená atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorca (II) “Τ’ R (II), v ktorom
X a X' znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)q-, kde q znamená 0, 1,2 alebo 3, amino-skupinu -NH- alebo NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy,
Y a Y' znamenajú nezávisle jeden od druhého metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo C=S,
R3,R4,R5 znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo substituovanú, alebo nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, p znamená číslo od 0 do 5 a
R6 znamená cholesterolový derivát alebo alkylamino-skupinu -NR’R2, v ktorej R1 a R2 znamenajú nezávisle jeden od druhého nasýtenú alebo nenasýtenú, lineárnu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov.
Zvlášť zaujímavé sú zlúčeniny, v ktorých R znamená skupinu všeobecného vzorca (II')
v ktorom R3, R4, R5, R6 a p majú uvedené významy a X znamená atóm kyslíka alebo skupinu -(CH2)q-, v ktorej q znamená nulu.
Táto skupina zlúčenín je hlavne charakterizovaná prítomnosťou vnútornej esterovej väzby, ktorá je zaujímavá s ohľadom na biologickú odbúrateľnosť uvedených zlúčenín.
Ako výhodné lipopolyamíny sa môžu podľa vynálezu uviesť hlavne nasledujúce zlúčeniny:
l*H
alfa-cholesteryl vo forme D, L alebo DL, alebo vo forme niektorej z ich solí.
Predmetom vynálezu je rovnako terapeutické použitie lipopolyamínov podľa vynálezu a to buď priamo, alebo v rámci farmaceutických kompozícií.
Ako už bolo vysvetlené, ukázalo sa, že zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sú obzvlášť zaujímavé na transfekciu in vitro a in vivo nukleových kyselín. Tieto zlúčeniny pevne viažu DNA a výhodne majú veľmi nízku, ale aj nulovú toxicitu proti ošetreným bunkám. Okrem toho sú uvedené zlúčeniny biologicky odbúrateľné a to hlavne hydrolýzou ich esterovej väzby.
Na dosiahnutie maximálneho účinku kompozícií podľa vynálezu sa príslušné množstvá zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a nukleovej kyseliny výhodne určia tak, aby sa dosiahol optimálny pomer R, vyjadrený pozitívnymi nábojmi uvažovaného lipopolyamínu na negatívne náboje uvedenej nukleovej kyseliny. Tento optimálny pomer, ktorý sa mení hlavne podľa spôsobu použitia (in vivo alebo in vitro) a podľa transfekovaného bunkového typu, sa optimalizuje z prípadu na prípad. Táto optimalizácia je celkom v kompetencii príslušného odborného pracovníka.
V kompozíciách podľa vynálezu môže byť polynukleotidom tak kyselina deoxyribonukleová, ako aj kyselina ri bonukleová. Môže ísť o sekvencie prírodného alebo umelého pôvodu a hlavne o genómovú DNA, DNAc, RNAm, RNAt, RNAr, o hybridné sekvencie alebo o syntetické alebo polosyntetické sekvencie. Tieto nukleové kyseliny môžu mať ľudský, zvierací, rastlinný, bakteriálny, virálny alebo iný pôvod. Sekvencie sa môžu získať ľubovoľnou známou technikou, hlavne vytriedením bánk, chemickou syntézou alebo tiež komplexnými metódami zahrnujúcimi chemickú alebo enzymatickú modifikáciu sekvencii získaných vytriedením bánk. Sekvencie sa môžu inak zabudovať do vektorov, akými sú plazmidové vektory.
Pokiaľ ide o deoxyribonukleové kyseliny, môžu mať tieto kyseliny jednoduchý alebo dvojitý reťazec. Uvedené desoxyribonukleové kyseliny môžu niesť terapeutické gény, regulačné sekvencie transkripcie alebo replikácie, modifikované alebo nemodifikované sekvencie, väzbové oblasti k ďalším bunkovým zložkám atď.
Terapeutickým génom sa v rámci vynálezu hlavne rozumie každý gén kódujúci proteínový produkt majúci terapeutický účinok. Takto kódovaným proteínovým produktom môže byť proteín, peptid atď. Tento proteínový produkt môže mať homológový charakter proti cieľovej bunke (t. j. produkt, ktorý je normálne exprimovaný v cieľovej bunke v prípade, že táto bunka nemá žiadnu patológiu). V tomto prípade uvedená expresia proteínu umožňuje liečiť nedostatočnú expresiu uvedeného proteínu v bunke alebo expresii neaktívneho proteínu alebo málo aktívneho proteínu alebo tiež exprimovať nadmernou tvorbou uvedeného proteínu. Uvedený terapeutický gén môže tiež kódovať mutant bunkového proteínu majúci zvýšenú stabilitu, modifikovanú aktivitu atď. Proteínový produkt môže mať tiež heterogénny charakter proti cieľovej bunke. V tomto prípade môže exprimovaný proteín napríklad doplňovať alebo poskytovať deficitnú aktivitu v bunke, v dôsledku čoho je bunka schopná bojovať proti patológii alebo je týmto mechanizmom stimulovaná jej imunitná odozva.
Z uvedených terapeutických produktov sa môžu hlavne uviesť enýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF atď. (FR 9203120), rastové faktory, neurotransmitory alebo ich prekurzory, alebo sytézne enzýmy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofín atď., dystrofín alebo minidistrofín (FR 9111947), proteín CFTR združený s muskoviscidázou, gény suprimujúce nádory: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev atď. (FR 93 04745), gény kódujúce faktory uplatňujúce sa pri koagulácii: faktory VII, VIII, IX, gény intervenujúce v reparácii DNA, samovražedné gény (tymidín-kináza, cytozín-deamináza), gény hemoglobínu a ďalšie proteínové transportéry, gény zodpovedajúce proteínom uplatňujúcim sa pri metabolizme lipidov apolipoproteínové typy zvolené z množiny zahrnujúcej apoliproteíny A-I, A-II, A-IV, B, C-1, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J, metabolické enzýmy, ako napríklad lipoproteín-lipáza, hepatická lipáza, lecitín-cholesterol-acyltransferáza, 7alfa-cholesterol-hydroxyláza, kyselina fosfatidová-fosfatáza alebo tiež transferové proteíny lipidov, ako transferový proteín esterov cholesterolu a transferový proteín fosfolipidov, väzbový proteín HDL alebo ešte receptor zvolený napríklad z množiny zahrnujúcej receptory LDL, receptory chylomikrons-remnantov, scavegerové receptory atď.
Terapeutickou nukleovou kyselinou môže byť rovnako gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorej expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo transkripciu bunkových RNAm. Takéto sekvencie sa môžu prepísať v cieľovej bunke na komplementárnej RNA od bunkových RNAm a blokovať takto ich transláciu na proteín technikou opísanou v európskom patentovom doku meňte EP 140 308. Uvedené terapeutické gény rovnako obsahujú sekvencie kódujúce ribozómy, ktoré sú schopné selektívne rozložiť RNA cieľových buniek (EP 321 201).
Ako už bolo uvedené, môže nukleová kyselina rovnako zahŕňať jeden alebo niekoľko génov kódujúcich antigénový peptid, ktorý je schopný generovať u človeka alebo zvieraťa imunitnú odozvu. V rámci tohto špecifického spôsobu uskutočnenia vynálezu sa teda umožňuje realizácia buď vakcín, alebo imunoterapeutického ošetrenia u človeka alebo zvieraťa, hlavne proti mikroorganizmom, vírusom alebo rakovinám. Môže hlavne ísť o špecifické antigénové peptidy Epstein-Barrovho vírusu, vírusu HIV, vírusu hepatidídy B (EP 185 573), vírusu pseudo-besnoty, synciatia-tvomého vírusu a ostatných vírusov alebo tiež špecifických nádorových vírusov (EP 259 212).
Nukleová kyselina rovnako výhodne obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénový peptid v bunke alebo požadovanom orgáne. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvažovaného génu v prípade, že sú tieto sekvencie schopné funkcie v infikovanej bunke. Môže rovnako ísť o sekvencie odlišného pôvodu (sekvencie zodpovedné za expresiu ďalších proteínov alebo dokonca syntetickej sekvencie). Hlavne môže ísť o promočné sekvencie eukaryotických alebo virálnych génov. Môže napríklad ísť o promočné sekvencie pochádzajúce z genómu bunky, ktorá má byť infikovaná. Rovnako tak môže ísť o promočné sekvencie pochádzajúce z genómu víru. V tomto ohľade sa môžu napríklad citovať promótory génov E1A, MPL, CMV, Rsv atď. Okrem toho sa môžu tieto expresné sekvencie modifikovať pridaním aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií atď. Môže tiež ísť o induktibilný alebo represibilný promótor.
Inak môže nukleová kyselina rovnako obsahovať, a to hlavne pre terapeutickým génom, signálnu sekvenciu riadiacu syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečných ciest cieľovej bunky. Touto signálnou sekvenciou môže byť prirodzená signálna sekvencia teraputického produktu, aj keď rovnako môže ísť o ľubovoľnú inú funkčnú signálnu sekvenciu alebo o umelú signálnu sekvenciu. Nukleová kyselina môže rovnako zahŕňať signálnu sekvenciu riadiacu syntetizovaný terapeutický produkt do špecifickej oblasti bunky.
V rámci ďalšej formy uskutočnenia sa vynález týka kompozícií obsahujúcich nukleovú kyselinu, lipopolyamín, ktorý jc nárokovaný a prísadu schopnú spojiť sa s komplexom lipopolyamin-nukleová kyselina a zlepšiť tak trasfekčnú potenciu uvedeného komplexu. Prihlasovateľ v skutočnosti preukázal, že transfekčná potencia lipopolyamínov sa môže očakávať zvýšená v prítomnosti niektorých prísad (napríklad v prítomnosti lipidov alebo proteínov), ktoré sú schopné pridružiť sa k uvedenému komplexu tvoreného lipopolyamínom a nukleovou kyselinou.
Výhodnejšie kompozície podľa vynálezu obsahujú ako prísady jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov. Takéto kompozície sú zvlášť výhodné hlavne v prípade, keď pomer R je nízky. Prihlasovateľ skutočne preukázal, že prídavok neutrálneho lipidu umožňuje zlepšiť tvorbu nukleolipidových častíc a prekvapivo priaznivo ovplyvniť preniknutie takejto častice do bunky po destabilizácii jej membrány.
Výhodne sú ako neutrálne lipidy použité v rámci vynálezu lipidy s dvoma mastnými reťazcami.
Zvlášť výhodne sa používajú prírodné alebo syntetické lipidy, majúce zwiterionový charakter alebo sú zbavené za fyziologických podmienok iónového náboja. Takýto lipid môže byť napríklad zvolený z množiny zahrnujúcej dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidyl etanolamín (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl alebo -mirystoylfosfatidyletanolamíny, ako aj ich 1 až 3-krát N-metylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy (hlavne galaktocerebrozidy), sfingolipidy (hlavne sfingomyelíny) alebo tiež asialogangliozidy (hlavne asialoGMl a GM2).
Tieto jednotlivé lipidy sa môžu získať buď syntézou, alebo extrakciou z orgánov (napríklad z mozgu), alebo z vajec klasickými a odborníkovi dobre známymi metódami. Extrakcia lipidov sa môže hlavne uskutočniť pri použití organických rozpúšťadiel (pozri rovnako Lehninger, Biochcmistry).
Kompozícia podľa vynálezu výhodne obsahuje 0,1 až 20 ekvivalentov prísady na jeden ekvivalent zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a výhodne 1 až 5 ekvivalentov prísady na jeden ekvivalent zlúčeniny všeobecného vzorca (I).
Kompozície podľa vynálezu sa môžu formulovať spôsobom vhodným na topickú, kutánnu, perorálnu, rektálnu, vaginálnu, parenterálnu, intranasálnu, intravenóznu, intramuskulámu, subkutánnu, intraokulámu, transdermálnu a inú aplikáciu. Výhodne farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahujú nosič, ktorý je farmaceutický prijateľný na injikovateľnú formuláciu, hlavne na priamu injekciu na úrovni požadovaného orgánu alebo na podanie topickou cestou (na kožu a/alebo na sliznicu). Môže ísť hlavne o sterilné izotonické roztoky alebo o suché kompozície, hlavne o lyofilizované kompozície, ktoré po pridaní buď sterilizovanej vody, alebo fyziologického roztoku poskytujú injikovateľné roztoky. Dávky nukleovej kyseliny použité na takúto injekciu a počet podaní sa môžu zvoliť v závislosti od rôznych faktorov, hlavne od použitého spôsobu podania, od ošetreného patologického stavu, od génu, ktorý má byť exprimovaný alebo tiež od požadovanej dĺžky liečenia. Pokiaľ ide o spôsob podania, môže ísť o priamu injekciu do tkaniva alebo o ošetrenie buniek v kultúre a následnú reimplantáciu týchto buniek in vivo, injekciou alebo vrúbľom.
Vynález takto poskytuje zvlášť výhodný spôsob liečenia ochorení spočívajúci v podaní in vivo alebo in vitro nukleovej kyseliny schopnej korigovať uvedenú chorobu a združenej zo zlúčeninou všeobecného vzorca (I) pri uvedených podmienkach. Tento spôsob je hlavne použiteľný v súvislosti s ochoreniami, ku ktorým dochádza v dôsledku nedostatku proteínového alebo nukleového produkt pričom podaná nukleová kyselina kóduje uvedený proteínový produkt alebo obsahuje uvedený nukleový produkt.
Vynález sa vzťahuje na akékoľvek použitie lipopolyamínu podľa vynálezu na transfekciu in vivo alebo in vitro buniek.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie opísaný pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú len ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Skratky a symboly
AcOEt etylacetát
BOP benzotriazol-1 -yloxytris(dimetylamino)fosfóniumhexafluórfosfát
DCC dicyklohexylkarbodiimid
DCU dicyklohexylmočovina
DMAP 4-dimetylaminopyridín
DMF dimetylformamid
DMSO dimetylsulfoxid
DODÁ dioktadecylamín
EP petroléter
EtOH etanol
NEt3 trietylamín
Rf retečný koeficient
TFA tetrahydrofurán
TMS tetrametylsilan
Látky a metódy
A) Použité produkty
DODÁ, NEt3, TFA, omitín, tetrametylamónumhydroxid, Raneyov nikel a diglykolanhydrid pochádzajúci od firmy Fluka, BOP pochádzajúci od firmy Propeptide France, DMAP, izobutylchloroformiát a N-metylmorfolin pochádzajúci od firmy Aldrich, zatiaľčo THF pochádza od firmy Merck. Všetky ostatné použité rozpúšťadlá sú produkty firmy RP Prolabo. Roztoky chloridu sodného a hydrogenuhlčitanu sodného sú nasýtenými roztokmi, zatiaľ čo v prípade roztoku hydrogensíranu draselného ide o 0,5 M roztok.
B) Fyzikálne merania
Protónové nukleárne magnetické rezonančné spektrá ('H NMR) sa získali pri použití spektrometra Brucker. Chemické posuny sú vyjadrené v ppm vzhľadom na TMS.
C) Chromatografia na silikagéli
a) Chromatografia na tenkej vrstve (CCM) sa uskutočňuje na doskách silikagélu Merck s hrúbkou 0,2 mm.
Vyvolanie:
- v ultrafialovom svetle s použitím vlnovej dĺžky 254 nm,
- ninhydrínom: odparuje sa (ľahký sprej) etanolický roztok ninhydrínu (40 mg/100 ml EtOH) na účely vyvolania aminu alebo amidu pri zahrievaní na teplotu 150 °C,
- íluorescamínom: odparuje sa acetónový roztok (40 mg/100 ml acetónu) na účely vyvolania primárnych amínov,
- jódom: doska sa popráši práškovým jódom.
b) Chromatografia v kolóne sa uskutočňuje na silikagéli 60 Merck majúcim granulometriu 0,063 - 0,200 mm.
Príklad 1
Syntéza 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetátu
.a)Príprava tctrametylamónium-2,5-bis-(2-kyanoetylamino)-pentanoátu
Monohydrochlorid kyseliny 2,5-diaminopentánovej (L-omitín) (6,74 g, 40 mmólov) a pentahydrát tetrametyl amóniuhydroxidu (14,48 g, 80 mmólov) sa uvedú do roztoku v metanole (20 ml). Vytvorená voda a metanol sa odparia pri zníženom tlaku (pri použití olejového čerpadla) do tej miery, že sa získa suchý zvyšok.
K získaným soliam sa pridá N,N-dimetylformamid (30 ml). Získaná zmes sa odplyní pri použití dusíka, a na to sa intenzívne mieša počas 10 minút, čo má za následok rozpustenie tetrametylamónium-2,5-diaminopentanoátu (zatiaľ čo tetrametylamóniumchlorid zostane suspendovaný v DMF).
Potom sa pridá akrylonitril (6 ml, 85,6 mólu), pričom sa tento prídavok vykoná po kvapkách. Banka sa mierne zahreje. Reakčná zmes sa potom nechá počas jednej hodiny pod dusíkovou atmosférou pri teplote okolia. Zmes sa potom sfiltruje na odstránenie tetrametylamóniumchloridu. DMF sa potom odparí pri zníženom tlaku. Získaný zvyšok je tvorený olejovitou tekutinou, ktorá po odvedení z rotačnej odparky ztuhne. Pridá sa acetonitril (100 ml) a banka sa mierne zahrieva až sa získa priesvitný roztok. Potom sa pridá THF až sa získa zakalený roztok. Banka sa potom prechováva počas dvoch dní v mrazničke, a na to sa tetrametylamóniová soľ kyseliny L-2,5-bis-(2-kyanoetylamino)pentánovej izoluje filtráciou vo forme bieleho pevného produktu. Tento produkt sa na frite premyje THF a potom vysuší nad oxidom fosforečným. Získa sa 6,06 g produktu, čo predstavuje výťažok surového produktu 49 %.
l.b) Príprava tetrametylamóniovej soli kyseliny 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentánovej (1 .b))
Produkt získaný v stupni l.a) sa rozpustí v zmesi etanolu (18 ml), vody (2 ml) a 2M hydroxidu draselného (5 ml). Získaný roztok sa prepláchne argónom. Potom sa pridá Raneyov nikel (2 ml suspenzie od firmy Fluka). Hydrogenácia sa vykoná v autokláve vypláchnutím dusíkom pri teplote 26 °C. Po 3 hodinách klesne tlak z 5,06 na 4,47 MPa, a na to sa tlak stabilizuje v čase dlhšom ako 1 hodina. Autokláv má obsah 250 ml a objem reakčnej zmesi je 30 ml. Získaná suspenzia sa sfiltruje, premyje vodou a zavedie do rotačnej odparky. Získa sa žltý- olej. Test na fluorescamín je pozitívny.
.c) Príprava kyseliny 2,5-bis{terc.butoxykarbonyl-[3-(terc.butoxykarbonylamino)propyl]amino}pentánovej (1-c))
Produkt získaný v stupni l.b) sa rozpusti v dioxáne (30 ml). K získanému roztoku sa pridá di-terc.butyldikarbonát (17,46 g, 80 mmólov). Získaná zmes sa mieša cez noc. Dioxán sa potom odparí. Pridá sa hydrogensíran draselný. Produkt sa potom extrahuje CHC13 (3 x 100 ml). Organická fáza sa potom postupne premyje roztokom hydrogenuhličitanu sodného (pH = 7,5) a roztokom chloridu sodného, a na to sa vysuší nad síranom horečnatým a odparí pri zníženom tlaku. Získa sa 10 g produktu (15,4 mmólov), čo zodpovedá výťažku 39 %, vztiahnuté na omitín. Vysokotlaková stĺpcová chromatografia: MeCN/H2O: 0,3 min. 50 % MeCN, 3 - 20 min. 50 - 100 % MeCN, 20 - 40 min. 100 % MeCN, K'= 7,96 (kolóna RP-18, prietok = = 1 ml/min.), chromatografia na tenkej vrstve: Rf (CHC13: AcOEt = 95 : : 5 objemovo) = 0,28 ’H-NMR (ppm): 1,3 (m, 8H, N + CH2-CH2-CH2-CNH + + COO/2x N + CH2CH2-CH2N+), 2,7 - 3,0 (m. 10 H 5x N+ + CH2), 3,8 (t, 1H, N+CHCOO), hmotnostné spektrum: MH+ = 647 (m.hm.=646).
l.d) Príprava 2,5-bis-{terc.butoxykarbonyl-[3-(tercbutoxykarbonylamino)propyl]amino} pentán-1 -olu (1 ,d))
L-5-Karboxytetra-terc.butoxykarbonylspermín (1,94 g, 3 mmóly) sa rozpustí v 30 ml THF. Potom sa do získaného roztoku zavedie mikropipetou 370 ml (3,1 mmólu) N-metylmorfolínu. Reakčná zmes sa pod dusíkovou atmosférou ochladí na teplotu 15 °C (v kúpeli suchého ľadu a etylalkoholu). Potom sa pridá 390 ml (3,1 mmólu) izobutylchlorformiátu. Po troch minútach sa rekčná zmes naleje do kadičky obsahujúcej natriumbórohydrid (2 g) rozpustený vo 20 ml vody teplej 4 °C. THF sa potom odparí. Pridá sa roztok hydrogensíranu draselného(až do pH 7). Produkt sa extrahuje AcOEt, premyje roztokom hydrogenuhličitanu sodného a potom roztokom chloridu sodného, a na to sa vysuší nad síranom horečnatým, sfiltuje a odparí. Získa sa 1,15 g produktu, čo zodpovedá výťažku 61 %. Chromatografia na tenkej vrstve vedie k dvom škvrnám. Vykoná sa teda separácia na stĺpci silikagélu pri použití rovnakého elučného činidla, čím sa získa 0,97 g produktu (vo forme žltého oleja). Výťažok separácie je 84 %. Výťažok redukcie je 51 %.
Chromatografia na tenkej vrstve: Rf (EP : AcOEt =1:1 objemovo) = 0,24 ’H-NMR (ppm): 1,42 (s, 4 x Boe), 1,5-1,7 (m, 8H, N + + CH2-CH2-CH2-CHN/2x N + CH2-CH2-CH2N), 2,85 - 3,2 (m, 10H 5x NCH2), 3,4 (m, 1H, NCHCH2OH), 3,7 (d, 2H, CH2OH), 6,8 (m, 2H, NH), hmotnostné spektrum: MľT = 633 (m.hm. = 632).
l.e) Príprava kyseliny 2,5-bis-[3-(terc.butoxykarbonylamino)propyl]-(terc.butoxykarbonylamino)pentyloxykarbonylmetoxyoctovej (1 .e))
0,51 g (0,806 mmólov) produktu získaného v stupni
l.d) sa rozpustí v 10 ml CH2C12. K získanému roztoku sa pridajú dva ekvivalenty diglykolanhydridu (1,535 mmólov, 0,178 g), 2,2 ekvivalentu trietylamínu (1,687 mmólov, 235 μΐ) a 5 mg DMAP. Po jednej hodine chromatografie na tenkej vrstve reakčnej zmesi sa ukazuje, že alkohol zreagoval. K zmesi sa pridá CH2C12 a na to sa zmes premyje 3 x x 50 ml roztoku hydrogensíranu draselného, 3 x 50 ml roztoku chloridu sodného a vysuší sa nad síranom horečnatým a potom odparí. Získa sa 0,26 g pevného produktu, čo zodpovedá výťažku 43 %.
Chromatografia na tenkej vrstve: Rf (CHC13 : MeOH : : AcOH = 90 : 8 : 2 objemovo) = 0,75 hmotnostné spektrum: MH+ = 749 (m.hm. = 748).
l.f) Príprava 2,5-bis-{terc.butoxykarbonyl-[3-(terc.butoxykarbonylamino)propyl]amino} pentyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxýjacetátu
0,123 g produktu získaného v predchádzajúcom reakčnom stupni (0,164 mmólu), 1 ekvivalent (0,0856 g) dioktadecylamínu, 3-ekvivalenty trietylamínu (68,4), 1,1 ekvivalent (0,0798 g) BOP sa rozpustí v CHC13. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia. Po dvoch hodinách sa k reakčnej zmesi pridá 100 ml CH2C12 a zmes sa premyje 3 x x 100 ml roztoku hydrogensíranu draselného, roztoku hydrogenuhličitanu sodného a roztok chloridu sodného (až do pH 7), a na to sa vysuší a potom odparí. Získa sa 0,13 produktu, čo zodpovedá výťažku 63 %.
Chromatografia na tenkej vrstve: Rf (EP : AcOEt =1:1 objemovo) = 0,62, vyvolanie jódom, ninhydrínom a fluorescamínom.
’H-NMR (ppm): 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 6H : CH3), 1,20 - 1,75 (m, 108 H : CH2/C(CH3)3), 3,05 - 3,35 (m, 14 H : CH2N), 4,15 - 4,35 (m, 3H : NCHCH2OCO), 4,23 - 4,27 (2s, 2x 2H : OCH2CO), 4,5 - 5,5 (m, rozpr., 2H : NH), hmotnostné spektrum: MH+ = 1 252 (m.hm. = 1 251), elementárna analýza:
N(%) vypočítané
68,06 11,02
5,59 nájdené
67,14 11,93
5,86
l.g) Príprava 2,5-bis-(3-aminopropylamino)pentyldioktadecylkarbamoylmetoxy)acetátu ml TFA sa pridá do 0,025 g produktu získaného v stupni 1 í) (0,02 mmólu) v trubici „EppendorfíR s obsahom
1,5 ml a zmes sa tu ponechá počas jednej hodiny pri teplote okolia. TFA sa potom odparí. Potom sa pridá 500 μΐ etanolu tak, aby sa získalo 40 mM roztoku potrebného na biologické testy.
hmotnostné spektrum: MH+ = 852 (m.hm. = 851).
Príklad 2
Príprava 1,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propyl(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetátu (2.f))
2.a) Príprava l,3-bis-(2-kyanoetylamino)-2-propanolu (2.a))
3,6 g (40 mmólov) l,3-diamino-2-propanolu sa rozpustí v 75 ml etanolu. Potom sa k získanému roztoku pridá v priebehu 15 minút 5,76 ml (80 mmólov) akrylonitrilu. Skúška na fluorescamín je pozitívna. Reakčná zmes zostane bezfarebná. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia cez noc. Skúška na fluorescamín je potom negatívna. Metanol sa odparí. Izoluje sa 7,9 g produktu (100 % výťažok surového produktu).
2.b) Príprava l,3-bis-(3-aminopropylamino)-2-propanolu (2.b))
Hydrogenácia sa vykoná v autokláve prepláchnutom dusíkom pri teplote 27 °C. Produkt získaný v rekčnom stupni 2.a) sa rozpustí v zmesi 15 ml metanolu, 10 ml etanolu a 5 ml 2M roztoku hydroxidu draselného. Roztok sa prepláchne argónom a na to sa k nemu v autokláve pridajú 4 ml suspenzie Raneyovho niklu. V priebehu troch hodín klesne tlak v autokláve z pôvodnej hodnoty 5,16 MPa na hodnotu 3,76 MPa, a na to sa stabilizuje za čas dlhší ako jedna hodina. Obsah autoklávu je 250 ml, zatiaľ čo objem reakčnej zmesi je 30 ml. Získaná suspenzia sa sfiltruje, premyje vodou a zavedie do rotačnej odparky. Získa sa žltý olej. Skúška na fluorescamín je pozitívna.
2.c) Príprava l,3-bis-[3-terc.butoxykarbonylamino-(terc.butoxykarbonylaminopropyl]-2-propán-2-olu (2.c))
Produkt získaný v stupni 2.b) sa chráni rovnakým spôsobom ako v stupni l.c). Pridá sa 100 ml CH2C12. . 39,2 g (179 mmólov) di-terc.butyldikarbonátu vo forme roztoku v 100 ml dioxánu sa potom pridá po kvapkách k získanej zmesi. Roztok sa mieša počas 72 hodín. Rozpúšťadlo sa odparí a pridá sa roztok hydrogensiranu draselného. Produkt sa extrahuje pri použití AcOEt (3 x 100 ml). Jednotlivé frakcie sa zlúčia a premyjú roztokom hydrogensíranu draselného, hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, a na to sa vysušia nad síranom horečnatým a odparia. Získa sa 20 g produktu, čo zodpovedá výťažku 83 %, vztiahnuté na východiskový produkt.
Produkt sa rekryštalizuje z EP. Chromatografia na tenkej vrstve: Rf (EP : AcOEt =1:1 objemovo) = 0,23 Rf (EP : AcOEt =1:2 objemovo) = 0,63, 'H-NMR (ppm): 1,4 (2s, 36 H : 4 x (CH3)3), 1,65 (qt, 4 H: 2 x NCH2CH2CH2NH, 2,95 (q, 4H: 2 x NHCH2CH2), 3,1 (2d, 4H : NCH2CHCH2N), 3,2 (t, 4H : NCH2CH2), 3,85 (m, 1H:OH), 5,9 (s, 2H : NH), hmotnostné spektrum: MH+ = 605 (m.hm. = 604).
2.d) Príprava kyseliny l,3-bis-[3-terc.butoxykarbonylamino(terc.butoxykarbonylaminopropyl]-2-propyl-2-etoxykarbonylmetoxyoctovej
604 mg (1 mmól) produktu získaného v stupni 2.c) sa rozpustí v 20 ml CH2C12 a na to sa do získaného roztoku zavedú 2 ekvivalenty anhydridu (2 mmól, 0,232 g), 2,2 ekvivalentu NEt3 (370 μί, potom 100 μί), 6,5 g DMAP. Po 24 hodinovom miešaní pri teplote okolia sa k zmesi pridá CH2C12 a zmes sa premyje roztokom hydrogensiranu draselného a roztokom chloridu sodného, vysuší sa nad síranom horečnatým a potom odparí. Získa sa 0,156 g produktu (výťažok 22 %).
Chromatografia na tenkej vrstve:
Rf (CHClj: MeOH : AcOEt = 90 : 8 : 2 objemovo) = 0,71, 'H-NMR (ppm): 1,2 - 1,4 (2s, 36H : 4 x (CH3)3), 1,5 (m, 4H : 2 x NHCH2CH2CH2N), 2,85 (q, 4H : 2 x x NHCH2CH2), 3,1 (m, 8H : 4 x NCH2), 3,9 - 4,2 (2s, 4H : : 2 x OCH2COO), 5,25 (m, IH : CH2CHCH2), 6,7 (2H : •NH), hmotnostné spektrum: MH+ = 721 (m.hm. = 720).
2.e) Príprava l,3-bis-[3-terc.butoxykarbonylamino(terc.butoxykarbonylaminopropyl]-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetátu
0,216 mmólu kyseliny získanej v predchádzajúcom stupni 2.d) sa rozpusti v 3 ml CHC13. K získanému roztoku sa potom pridá 1 ekvivalent DODÁ (0,113 g), 3 ekvivalenty NEt3 (100 μί) a 1,1 ekvivalentu BOP (0,11 g). Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia počas 24 hodín. CHCI3 sa odparí a na to sa k zvyšku pridá AcOEt. Organická fáza sa premyje 0,5 M HC1, roztokom hydrogenuhličitanu sodného a roztokom chloridu sodného až sa dosiahne pH 7, na to sa vysuší nad síranom horečnatým a potom odparí. Získa sa 0,185 g produktu (výťažok 70 %). Vykoná sa chromatografia na stĺpci silikagélu. Izoluje sa 110 mg produktu (42 %).
Chromatografia na tenkej vrstve:
Rf (CHC13: MeOH : AcOEt = 90 : 8 : 2 objemovo) = 0,8+, Rf (EP : AcOEt =1:1 objemovo) = 0,67, ’H-NMR (ppm): 0,85 (t, 6 H:2 x CH3), 1,20 - 1,55 (m, 100H : CH2/C(CH3)3),
1,6 (m, 4 H : 2 x NHCH2CH2CH2N), 3,05 - 3,4 (m, 16H : : 2 x NHCH2CH2CH2N/NCH2CHCH2N)/2x CH2N), 4,1 (s, 2H : NCOCH2O), 4,15 (s, 2H : OCH2COO), 5,25 (m, IH : : CH2CHCH2), 6,15 (m, 2H : NH), hmotnostné spektrum: MH+ = 1 224 (m.hm. = 1223).
2.f) Príprava l,3-bis-[3-terc.butoxykarbonylamino-(terc.butoxykarbonylamino-(terc.butoxykarbonylaminopropyl]-2-propyl-(dioktadecylkarbamoylmetoxy)acetátu (2.f)) ml TFA sa pridá k 0,0247 g produktu získaného v stupni 2.e) (0,021 mmólov) v trubici „Eppendorf‘R s obsahom 1,5 ml, kde sa ponechá pri teplote okolia počas 1 hodiny. TFA sa potom odparí. Potom sa pridá 505 μί etanolu tak, aby sa získal 40 mM roztok potrebný na biologické testy.
Hmotnostné spektrum: MH+ = 824 (m.hm. = 823).
Príklad 3
Príprava 2-(3-aminopropylamino)-l-(3-aminopropylaminometyl)-etyl-(N,N-dioktadecyl)sukcinamátu
Táto zlúčenina sa pripraví podľa opísaného protokolu v príklade 2, keď sa kyselina diglykolová nahradí kyselinou jantárovou. Analýza vykonaná hmotnostnou spektrometriou takto získaného produktu indikuje fragment MH+ : : 808, čo je v súlade s očakávanou hmotnosťou.
Použitie lipopolyamínov podľa vynálezu na transfekciu in vitro genetického materiálu
A) Plazmidy použité na prenos génov in vitro
Použije sa plazmid pCMV-LUC. Ide o konštrukciu zahrnujúcu reportérový gén „luciferázu“ odvodenú buď od plazmidu pGL2-Basic Vector (Promega), alebo od plazmidu pGL2-Conrol Vector (Promega) inzerciou fragmentov Mlu I-Hind III obsahujúci promótor ľudského cytomegalovíru (CMV) extrahovaný z plazmidového vektora pcDNA3 (invitrogén).
B) Protokol prípravy roztokov použitých na transfekciu
Lipopolyamíny pripravené podľa predchádzajúcich príkladov sa rozpustia v etanole za vzniku 40 mM roztoku, a na to sa potom zriedia zmesou etanolu a vody, pričom sa udržuje koncentrácia etanolu nižšia ako 10 %. Roztoky kyseliny nukleovej určené na transfekciu sa zriedia fyziologickým roztokom (0,15 M NaCl) a nato sa pridajú k roztokom lipopolyamínov v pomere 1 : 1 objemovo. Po homogenizácii vírivým miešadlom a 15 minútovej inkubácii pri teplote okolia sa roztoky DNA/lipopolyamínov distribuujú (finálna kone. 9 obj. %) do jamiek titračnej platne, kde sú bunky premyté kultivačným prostredím bez proteínov (sérum).
Príklad 4
Vplyv pomeru nábojov (amíny/fosfáty) na účinnosť transfekcie
Vzorky obsahujúce 1.105 buniek NIH 3T3 v exponenciálnej fáze rastu na 2 cm sa spracujú roztokmi lipopolyamíny/pCMV-LUC, majúcimi premenné nábojové pomery, počas 4 hodín pri teplote 37 °C v atmosfére obsahujúcej 5 % CO2, pričom každá vzorka pojme 1 gg nukleovej kyseliny. Štúdium expresie reportérového génu sa uskutočňuje po pridaní fetálneho teľacieho séra (finálna koncentrácia 8 %) a po následnej 40 hodinovej kultivácii v sušiarni s atmosférou oxidu uhličitého. Aktivita luciferázy sa stanoví svetelnou emisiou (RLU = relative light unit) v prítomnosti luciferínu, koenzýmu A a ATP počas 20 sekúnd a vyjadrí sa v pg proteínu v supematante získanom po lyži buniek. Získané výsledky sú uvedené v ďalej uvedenej tabuľke I.
Tabuľka I
Lipopolyamín z pr.l Lipopolyamín z pr.2
Pomer luminiscencia koef. var. luminiscencia koef. var.
nábojov (%)
1 69 5 23 34
2 5 091 3 252 6
4 3 636 30 7 890 3
6 21 334 3 61 401 5
8 40 846 3 73 224 2
10 55 321 1 77 633 2
12 53 239 5 48 634 5
14 36 10 52 417 2
ADN samôt. 52 5
Každá hodnota zodpovedá priemeru z troch nezávislých pokusov. Tento pokus jednoznačne ukazuje, že lipopolyamíny podľa vynálezu umožňujú prenos génov pri podmienkach žiaducich pre ich expresiu.
Príklad 5
Vplyv koncentrácie kyseliny nukleovej v zmesiach DNA/lipopolyamíny.
Pri použití rovnakého protokolu, aký bol opísaný v predchádzajúcom príklade, sa bunky NIH 3T3 ošetria zmesami DNA/ lipopolyamíny pri podmienkach, v rámci ktorých sa použijú rôzne koncentrácie DNA pri rovnakom pomere nábojov. V tomto prípade sa aktivita luciferázy meria počas 20 sekúnd a vzťahuje na 2,5.103 ošetrených buniek. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách II a III.
Tabuľka II
Lipopolyamín z príkladu 1
Pomer nábojov |
μς DNA x4 x6 x3 xlO
0,25 27 (19) 25 120) 32 (31) 36 (15)
0,5 23 (5) 37 (54) 4 476 (4) 4 811 (19)
1,0 4 945 (12) 19 194 (14) 30 933 (21) 39 357 13)
2,0 93 937 (2) 105 533 (1) 111 167 (14) 8 315 (15)
3,0 10« 293 (11> 1OO 093 (8) 53 475 (12)
4,0 $6 (10) 69 863 (S)
Tabuľka III
Lipopolyamín z príkladu 2
Pomer nábojov 1
μ? DNA x4 x6 x8 xlO
0,25 40 (17) 52 (64) 122 (14) 51 (5)
0,5 28 (10) 204 (25) 36 533 (7) 44 473 (7)
1.0 3 427 (12) 48 167 (13) 49 363 (13) 50 Q83 (9)
2,0 33 377 (13) 44 697 (18) 30 670 (16) 9 544 (4)
3,0 9 686 (3) 31 357 (2) 9 157 (8)
4,0 4 321 (9) 40 105 110)
Každá hodnota zodpovedá priemeru z troch nezávislých pokusov. Hodnoty uvedené v zátvorkách zodpovedajú koeficientu variácie vyjadrenom v %.

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, alebo niektorá z jeho solí všeobecného vzorca (I)
    H2N- ((CH) „-NH) n-H v ktorom m znamená celé číslo od 2 do 6, n znamená celé číslo od 1 do 9 a výhodnejšie od 1 do 5, pričom v prípade, že n znamená celé číslo od 2 do 9, potom vo všeobecnom vzorci je prítomná jediná skupina R odlišná od vodíka, a m má premenné alebo identické hodnoty v skupinách
    I
    R alebo -(CH2)m_.
    R znamená atóm vodíka alebo skupinu všeobecného vzorca (II) v ktorom
    X a X' znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm kyslíka, metylénovú skupinu -(CH2)q-, kde q znamená 0, 1, 2 alebo 3, alebo amino-skupinu -NH- alebo NR'-, kde R' znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy,
    Y a Y' znamenajú nezávisle jeden od druhého metylénovú skupinu, karbonylovú skupinu alebo C=S,
    R3, R4, R5 znamenajú nezávisle jeden od druhého atóm vodíka alebo substituovanú, alebo nesubstituovanú alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, p znamená číslo od 0 do 5 a
    R6 znamená cholesterolový derivát alebo alkylamino-skupinu -NR1 R2, v ktorej R1 a R2 znamenajú nezávisle jeden od druhého nasýtenú alebo nenasýtenú, lineárnu alebo rozvetvenú alifatickú skupinu obsahujúcu 12 až 22 uhlíkových atómov.
  2. 2. Lipopolyamín podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom R výhodne znamená skupinu všeobecného vzorca (II')
    P (Π'), v ktorom R3, R4, R5, R6 a p majú významy uvedené v nároku 1 a X znamená atóm kyslíka alebo skupinu -(CH2)q-, v ktorej q znamená nulu.
  3. 3. Lipopolyamín podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca hh vo forme D, L alebo DL, alebo niektorá z ich solí.
  4. 4. Lipopolyamín podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca vo forme D, L alebo DL, alebo niektorá z ich solí.
  5. 5. Lipopolyamín podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca vo forme D, L alebo DL, alebo niektorá z ich solí.
  6. 6. Lipopolyamín podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca
    10 alfa-cholesteryl vo forme D, L alebo DL, alebo niektorá z ich solí.
  7. 7. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje aspoň jeden lipopolyamín podľa niektorého z nárokov 1 až 6 a aspoň jednu nukleovú kyselinu.
  8. 8. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, v y značujúca sa tým, že nukleovou kyselinou je kyselina deoxyribonukleová.
  9. 9. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, vyzná í u j ú c a sa tým, že nukleovou kyselinou je kyselina ribonukleová.
  10. 10. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7, 8 alebo 9, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina je chemicky modifikovaná.
  11. 11. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 7 až 10, vyznačujúca sa tým, že nukleovou kyselinou je antimediátorová sekvencia.
  12. 12. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 7 až 10, vyznačujúca sa tým, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gén.
  13. 13. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 12, v y značujúca sa tým, že terapeutický gén kóduje proteín uplatňujúci sa pri metabolizme lipidov, ako apoliprotein zvolený z množiny zahrnujúcej apoliproteíny A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo (a), enzým, ako lipoproteín-lipáza, hepatická lipáza alebo ďalšie lipázy, lecitín-cholesterol-acyltransferáza, 7alfa-cholesterol-hydroxyláza, kyselina fosfatidová-fosfatáza, prenosový proteín lipidov, ako prenosový proteín esterov cholesterolu a prenosový proteín fosfolipidov, väzbový proteín HDL, alebo tiež receptor zvolený napríklad z množiny zahrnujúcej receptory LDL, receptory chylomikronsremnantov a scavengerové receptory.
  14. 14. Farmaceutická kompozícia, vyznačuj úca sa t ý m , že obsahuje nukleovú kyselinu, lipopolyamín podľa niektorého z nárokov 1 až 6 a prísadu schopnú spojiť sa s komplexom lipopolyamín/kyselina nukleová a zlepšiť jeho transfekčnú potenciu.
  15. 15. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 14, v y značujúca sa tým, že prísadou je jeden alebo niekoľko neutrálnych lipidov.
  16. 16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, v y značujúca sa tým, že neutrálny lipid alebo neutrálne lipidy sú zvolené z množiny zahrnujúcej syntetické alebo prírodné lipidy majúce zwiterionový charakter alebo bez iónového náboja pri fyziologických podmienkach.
  17. 17. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 16, v y značujúca sa tým, že neutrálnym lipidom alebo neutrálnymi lipidmi sú lipidy s dvoma mastnými reťazcami.
  18. 18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku ^vyznačujúca sa tým, že neutrálny lipid alebo neutrálne lipidy sú zvolené z množiny zahrnujúcej dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidyletanolamín (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl alebo -mirystoylfosfatidyletanolamín, ako aj ich 1 až 3-krát N-metylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykozyldiacylglyceroly, cerebrozidy, hlavne galaktocerebrozidy, sfingolipidy, hlavne sfíngomyeliny, alebo tiež asialogangliozidy, hlavne asialoGMl a GM2.
  19. 19. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 14 až 18, v y z n a č u j ú c a sa t ý m , že obsahuje 0,1 až 20 ekvivalentov prísady na jeden ekvivalent lipopolyamínu, výhodnejšie 1 až 5 ekvivalentov prísady na jeden ekvivalent lipopolyamínu.
  20. 20. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 7až 19, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič na injikovateľnú formuláciu.
  21. 21. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 7až 19, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič na použitie na pokožku a/alebo na sliznicu.
  22. 22. Lipopopylamín podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na použitie na liečenie.
  23. 23. Použitie lipopolyamínu podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na prípravu liečiva na transfekciu in vivo alebo in vitro buniek.
SK701-97A 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie SK282601B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9414596A FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1994-12-05 Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
PCT/FR1995/001595 WO1996017823A1 (fr) 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK70197A3 SK70197A3 (en) 1997-11-05
SK282601B6 true SK282601B6 (sk) 2002-10-08

Family

ID=9469480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK701-97A SK282601B6 (sk) 1994-12-05 1995-12-04 Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6107286A (sk)
EP (1) EP0796240B1 (sk)
JP (1) JPH10509958A (sk)
KR (1) KR100447517B1 (sk)
AT (1) ATE200662T1 (sk)
AU (1) AU713662B2 (sk)
BR (1) BR9510080A (sk)
CA (1) CA2208184A1 (sk)
CZ (1) CZ289513B6 (sk)
DE (1) DE69520748T2 (sk)
DK (1) DK0796240T3 (sk)
ES (1) ES2157351T3 (sk)
FI (1) FI972366A (sk)
FR (1) FR2727679B1 (sk)
GR (1) GR3035759T3 (sk)
HU (1) HUT77171A (sk)
IL (1) IL116251A (sk)
NO (1) NO972566L (sk)
PT (1) PT796240E (sk)
SK (1) SK282601B6 (sk)
WO (1) WO1996017823A1 (sk)
ZA (1) ZA9510326B (sk)

Families Citing this family (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939401A (en) * 1994-12-09 1999-08-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6383814B1 (en) 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) * 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US6331524B1 (en) 1994-12-09 2001-12-18 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
AUPN741696A0 (en) * 1996-01-05 1996-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of nucleic acids ii
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
DE19637043A1 (de) * 1996-09-12 1998-03-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue Aminoalkoholderivate, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Reagenzien
US7097854B2 (en) 1996-09-12 2006-08-29 Medigene Oncology Gmbh Amino alcohol derivatives, process for their production and pharmaceutical preparations and reagents containing these compounds
FR2754272B1 (fr) * 1996-10-08 1998-11-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de compositions pour le transfert d'acides nucleiques
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US6884430B1 (en) * 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
JP2001523103A (ja) 1997-04-28 2001-11-20 ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー 腫瘍治療用血管形成アンタゴニストのアデノウイルスによる腫瘍内送達
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
DE69927669T2 (de) 1998-01-30 2006-07-20 Aventis Pharma S.A. Für reduzierende bedingungen empfindliche transfektions-verbindungen, pharmazeutische zusammensezungen die diese enthalten und deren verwendung.
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
JP2002513543A (ja) * 1998-04-02 2002-05-14 アバンテイス・フアルマ・エス・アー 新規核酸移入剤とそれらを含む組成物及びそれらの使用
US6583301B1 (en) 1998-04-08 2003-06-24 Celltech R & D Limited Lipids
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
US6441156B1 (en) 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
WO2000064858A1 (en) * 1999-04-26 2000-11-02 Celltech R&D Limited Bipolar lipids and their use for the delivery of bioactive substances
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
WO2001040254A1 (fr) * 1999-12-02 2001-06-07 Tomohiko Ohwada Reactifs pour transfert de genes
EP1276500B1 (en) 2000-03-13 2011-06-08 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99/hec2
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
WO2001079299A1 (en) 2000-04-13 2001-10-25 The Rockefeller University Enhancement of antibody-mediated immune responses
KR100373845B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
KR100373844B1 (ko) * 2000-09-21 2003-02-26 굿젠 주식회사 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 제조방법
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
MXPA03005386A (es) 2000-12-28 2004-04-20 Wyeth Corp Proteina protectora recombinante de streptococcus pneumoniae.
PT1456346E (pt) 2001-02-20 2012-05-02 Intrexon Corp Novo sistema de expressão de genes induzido baseado no recetor de ecdisona / recetor x retinoide invertebrado
CA2438133C (en) 2001-02-20 2015-01-27 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
JP4328094B2 (ja) 2001-02-20 2009-09-09 イントレクソン・コーポレイション 新規置換突然変異体受容体および核受容体−ベースの誘導性遺伝子発現システムにおけるその使用
MXPA03007492A (es) 2001-02-20 2004-10-15 Rheogene Holdings Inc Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso.
EP1499349B1 (en) 2001-03-02 2009-11-18 The Rockefeller University Recombinant hybrid allergen constructs with reduced allergenicity that retain immunogenicity of the natural allergen
MXPA04002808A (es) 2001-09-26 2005-06-06 Rheogene Holdings Inc Acidos nucleicos receptores de ecdisona de mosca blanca, polipeptidos, y sus usos.
CA2459827C (en) 2001-09-26 2013-09-03 Subba Reddy Palli Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
EP1466133B1 (en) 2002-01-17 2007-01-03 York Refrigeration APS Submerged evaporator with integrated heat exchanger
PL210412B1 (pl) 2002-05-24 2012-01-31 Schering Corp Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
ATE483981T1 (de) 2004-04-20 2010-10-15 Galapagos Nv Verfahren, zusammensetzungen und verbindungstests zur hemmung der amyloid-beta-proteinproduktion
EP2214018B1 (en) 2004-04-27 2013-06-26 Galapagos N.V. Methods, agents, and compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP2256198A1 (en) 2004-06-14 2010-12-01 Galapagos N.V. Methods for identification, and compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2005124342A2 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
JP4772045B2 (ja) 2004-07-16 2011-09-14 アメリカ合衆国 Ｃｍｖ／ｒ核酸コンストラクトを含むａｉｄｓに対するワクチン
US7485468B2 (en) 2004-10-15 2009-02-03 Galapagos Bv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of joint degenerative and inflammatory diseases
US9034650B2 (en) 2005-02-02 2015-05-19 Intrexon Corporation Site-specific serine recombinases and methods of their use
US20060211004A1 (en) 2005-02-15 2006-09-21 Ilsley Diane D Methods and compositions for determining non-specific cytotoxicity of a transfection agent
CN101437539B (zh) 2005-07-05 2013-10-02 康奈尔研究基金会（有限公司） 通过干扰cd99l2阻断白细胞迁出和炎症
WO2007028147A2 (en) 2005-09-01 2007-03-08 Philadelphia Health & Education Corporation D.B.A. Drexel University College Of Medicin Identification of a prostatic intraepithelial neoplasia (pin)-specific gene and protein (pin-1) useful as a diagnostic treatment for prostate cancer
SG173414A1 (en) 2006-07-28 2011-08-29 Sanofi Aventis Fr Composition and method for treatment of tumors
JP5238710B2 (ja) 2006-10-19 2013-07-17 シーエスエル、リミテッド インターロイキン−１３レセプターアルファ１の高親和性抗体アンタゴニスト
EP2530090A3 (en) 2006-10-19 2013-01-23 CSL Limited Anti-IL-13R alpha 1 antibodies and their uses thereof
WO2008078102A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Imuthes Limited Lipids and their use as non-viral delivery vehicle
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
MX363066B (es) 2007-05-29 2019-03-07 Intrexon Corp Ligandos quirales de diacilhidrazina para modular la expresion de genes exogenos por medio de un complejo receptor de ecdisona.
MX2009013766A (es) 2007-06-20 2010-02-01 Galapagos Nv Objetivos moleculares y compuestos, y metodos para identificar los mismos, utiles en el tratamiento de enfermedades degenerativas de los huesos y las articulaciones.
US20090069266A1 (en) 2007-06-27 2009-03-12 Northwestern University Methods and compositions for nucleic acid transfer into cells
CA2698212A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Intrexon Corporation Methods and compositions for diagnosing disease
CN101848990B (zh) * 2007-09-17 2013-07-31 罗门哈斯公司 改变植物生理学反应的组合物和方法
BRPI0817233A2 (pt) 2007-09-28 2012-11-06 Intrexon Corp construções terapêuticas de gene de trca e bireatores para a expressão de moléculas bioterapêuticas, e usos das mesmas
BRPI0818287A2 (pt) 2007-10-08 2015-11-03 Intrexon Corp células dendríticas manipuladas e usos para o tratamento do câncer.
WO2010026537A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
WO2010029118A1 (en) 2008-09-11 2010-03-18 Biofocus Dpi B.V. Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of cf-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
EP2356135B1 (en) 2008-11-05 2017-10-25 Wyeth LLC Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (bhs) disease
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
WO2010094733A2 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP2398479A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Galapagos N.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
JP2012518181A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
WO2010115825A2 (en) 2009-03-31 2010-10-14 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP3043179B1 (en) 2009-04-01 2020-05-06 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
AU2010237046B2 (en) 2009-04-17 2015-06-04 New York University Peptides targeting TNF family receptors and antagonizing TNF action, compositions, methods and uses thereof
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
EP2547368A4 (en) 2010-03-19 2014-08-06 Univ South Alabama METHOD AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT
EP3284821B1 (en) 2010-03-23 2022-01-05 Precigen, Inc. Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
PT3246044T (pt) 2010-08-23 2021-02-15 Wyeth Llc Formulações estáveis de antigénios de rlp2086 de neisseria meningitidis
MX362802B (es) 2010-09-10 2019-02-13 Wyeth Llc Star Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis.
CN103476928B (zh) 2010-12-09 2017-03-29 巴斯德研究所 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
EP2681327B1 (en) 2011-03-04 2018-11-21 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012135696A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 University Of South Alabama Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer
EP2546358A1 (en) 2011-07-15 2013-01-16 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and reagents for efficient control of HIV progression
EP2760463B1 (en) 2011-09-20 2018-11-21 The University of North Carolina At Chapel Hill Regulation of sodium channels by plunc proteins
WO2013053765A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
WO2013083847A2 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Institut Pasteur Multiplex immuno screening assay
US9464291B2 (en) 2012-01-06 2016-10-11 University Of South Alabama Methods and compositions for the treatment of cancer
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
CA2865745C (en) 2012-03-09 2018-01-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
JP6446377B2 (ja) 2013-03-08 2018-12-26 ファイザー・インク 免疫原性融合ポリペプチド
AU2014249045A1 (en) 2013-03-11 2015-10-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of CARD protein as therapy for occular inflammation
US9952202B2 (en) 2013-03-14 2018-04-24 Galapagos Nv Methods of identifying compounds for the treatment of fibrosis by using S1PR5
EP2972322B1 (en) 2013-03-14 2019-03-06 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
JP2016522675A (ja) 2013-03-14 2016-08-04 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップＧａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ． 上皮間葉移行に関連した疾患の治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター
US9127024B2 (en) 2013-03-15 2015-09-08 Intrexon Corporation Boron-containing diacylhydrazines
WO2014193800A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 The Johns Hopkins University Aptamers for the treatment of sickle cell disease
MX369534B (es) 2013-09-08 2019-11-11 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos.
US11053291B2 (en) 2014-02-19 2021-07-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of Nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
CA3179824A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3194359B1 (en) 2014-09-17 2020-04-08 Intrexon Corporation Boron-containing diacylhydrazine compounds
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
TW201710503A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 新穎多核苷酸、載體、醫藥組成物以及其用途
CA2990202A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US20190062394A1 (en) 2015-10-10 2019-02-28 Intrexon Corporation Improved Therapeutic Control of Proteolytically Sensitive, Destabilized Forms of Interleukin-12
IL307179A (en) 2015-10-28 2023-11-01 Acuitas Therapeutics Inc Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
MX2019005235A (es) 2016-11-09 2019-12-05 Intrexon Corp Constructos de expresion de frataxina.
US10183070B2 (en) 2017-01-31 2019-01-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US11524932B2 (en) 2017-08-17 2022-12-13 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP3539975A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
EP3835320A4 (en) 2018-08-10 2022-06-01 Eutilex Co., Ltd. BINDING OF CHEMERA ANTIGEN RECEPTOR TO HLA-DR, AND CAR-T CELL
CA3125485A1 (en) 2019-01-11 2020-07-16 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3132817A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Obsidian Therapeutics, Inc. Cd40l compositions and methods for tunable regulation
MX2022007916A (es) * 2020-01-03 2022-07-21 Ascendis Pharma As Conjugados que experimentan rearreglos intramoleculares.
BR112022013355A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-20 Obsidian Therapeutics Inc Célula modificada, molécula de ácido nucleico, vetor, primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo, método de produção de uma célula modificada, métodos para tratar ou prevenir uma doença em um sujeito em necessidade, para introduzir uma célula modificada, para modificar geneticamente uma ou mais células, e, sistema para a expressão sintonizável
EP3885440A1 (en) 2020-03-26 2021-09-29 Splicebio, S.L. Split inteins and their uses

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4014933A (en) * 1969-10-23 1977-03-29 Basf Aktiengesellschaft Production of amines from alcohols
BE757840A (fr) * 1969-10-23 1971-04-22 Basf Ag Procede de preparation d'amines a partir d'alcools
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production

Also Published As

Publication number Publication date
DE69520748D1 (de) 2001-05-23
PT796240E (pt) 2001-09-28
AU713662B2 (en) 1999-12-09
CZ171197A3 (cs) 1998-03-18
EP0796240B1 (fr) 2001-04-18
NO972566D0 (no) 1997-06-05
HUT77171A (hu) 1998-03-02
WO1996017823A1 (fr) 1996-06-13
US6107286A (en) 2000-08-22
DK0796240T3 (da) 2001-05-07
KR100447517B1 (ko) 2004-11-20
ATE200662T1 (de) 2001-05-15
FI972366A0 (fi) 1997-06-04
CA2208184A1 (fr) 1996-06-13
ES2157351T3 (es) 2001-08-16
NO972566L (no) 1997-06-05
AU4307296A (en) 1996-06-26
IL116251A0 (en) 1996-03-31
FR2727679B1 (fr) 1997-01-03
GR3035759T3 (en) 2001-07-31
FR2727679A1 (fr) 1996-06-07
JPH10509958A (ja) 1998-09-29
CZ289513B6 (cs) 2002-02-13
MX9703928A (es) 1998-05-31
SK70197A3 (en) 1997-11-05
ZA9510326B (en) 1996-06-11
DE69520748T2 (de) 2001-09-13
FI972366A (fi) 1997-06-04
EP0796240A1 (fr) 1997-09-24
IL116251A (en) 2000-11-21
BR9510080A (pt) 1997-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282601B6 (sk) Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie
EP0861228B1 (fr) Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
AU2010249881A1 (en) Compositions comprising cationic amphiphiles and colipids for delivering therapeutics molecules
SK283575B6 (sk) Zlúčeniny amidíniového typu, farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú, a ich použitie
AU759197B2 (en) Transfecting compounds which are sensitive to reducing conditions, pharmaceutical compositions containing them and their applications
US6812218B2 (en) Lipid derivatives of polythiourea
JP4629333B2 (ja) アミノグリコシドの脂質誘導体
MXPA97003928A (en) New transfection agents and their pharmaceutical applications
JP4276439B2 (ja) ポリチオ尿素の脂質誘導体
CZ418599A3 (cs) Sloučeniny, způsob jejich přípravy a jejich použití pro přenos nukleových kyselin do buněk