PT901463E - Compostos glicerolipidicos uteis para a transferencia de uma substancia activa para uma celula alvo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

COMPOSTOS GLICEROLIPÍDICOS ÚTEIS PARA A TRANSFERÊNCIA DE UMA SUBSTÂNCIA ACTIVA PARA UMA CÉLULA ALVO A presente invenção refere-se a novos compostos glicerolipídicos e a novas composições que os compreendem. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à utilização dos referidos compostos ou das referidas composições para preparar um vector de transferência de uma substância activa, especialmente terapeuticamente, comportando cargas negativas, especialmente um polinucleótido, para uma célula alvo, particularmente uma célula de vertebrado e, mais particularmente, de mamífero. A transferência de gene para uma dada célula é a própria base da terapia génica. Esta nova tecnologia cujo campo de aplicação é vasto, permite encarar o tratamento de doenças graves para as quais as alternativas terapêuticas clássicas são pouco eficazes, mesmo inexistentes, e refere-se tanto às doenças de origem genética (hemofilia, mucoviscidose, miopatia, ...) como às adquiridas (cancro, SIDA,...).

No decurso dos últimos 30 anos, desenvolveram-se numerosos utensílios que permitem a introdução de diversos genes heterólogos em células, especialmente células de mamífero. Estas diferentes técnicas podem ser divididas em duas categorias. A primeira categoria refere-se às técnicas físicas tais como a micro-injecção, a electroporação ou o bombardeamento de partículas que, ainda que eficazes, são largamente limitadas a aplicações in vitro e cuja realização é pesada e delicada. A segunda categoria faz apelo a técnicas relativas à biologia molecular e celular para as quais o gene a transferir está associado a um vector de natureza biológica ou sintética que favorece a introdução do referido material.

Actualmente, os vectores mais eficazes são vectores virais, em particular adenovirais ou retrovirais. As técnicas desenvolvidas baseiam-se nas propriedades naturais que esses vírus dispõem para atravessar as membranas celulares, escapar à degradação do seu material genético e fazer penetrar o seu genoma no núcleo. Estes vírus foram já objecto de diversos estudos e alguns de entre eles são desde já empregues a título experimental como vectores de genes no homem com vista, por exemplo, a uma vacinação, a uma imunoterapia ou a uma terapia que visa suplantar uma deficiência genética. Todavia, esta 1 abordagem virai apresenta numerosas limitações, especialmente devido à restrita capacidade de clonagem no genoma virai, aos riscos de disseminação no organismo hospedeiro e no ambiente das partículas virais infecciosas produzidas, ao risco de mutagénese artefactual por inserção na célula hospedeira no caso dos vectores retrovirais e à forte indução das respostas imunitária e inflamatória in vivo aquando do tratamento terapêutico, limitando consideravelmente o número de administrações que se podem considerar (Mc Coy et al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442). Estes numerosos inconvenientes, especialmente no âmbito de um uso no homem, conduziram diversas equipas a desenvolver sistemas alternativos de transferência de polinucleótidos.

Estão disponíveis actualmente diversos métodos não virais. Citemos por exemplo a coprecipitação com fosfato de cálcio, a utilização de receptores mimetizando os sistemas virais (para uma pesquisa, ver Cotten e Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705-710) ou a utilização de polímeros tais como a poliamidoamina (Haensler e Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379) ou polímeros tais como os apresentados em WO 95/24221 descrevendo a utilização de polímeros dendríticos, o documento WO 96/02655 descrevendo a utilização de polietilenoimina ou de polipropilenoimína e os documentos US-A-5 595 897 e FR 2 719 316 descrevendo a utilização de conjugados de polilisina. Outras técnicas não virais apoiam-se na utilização de lipossomas cujo interesse a título de agente que permite a introdução, no interior das células, de certas macromoléculas biológicas, tais como por exemplo o AND, o ARN, as proteínas ou certas substâncias farmaceuticamente activas, foram largamente descritas na literatura. Para este fim, numerosas equipas propuseram já a utilização de lípidos catiónicos que apresentam uma forte afinidade em relação às membranas celulares e/ou aos ácidos nucleicos. Com efeito, ainda que tenha sido demonstrado no caso dos ácidos nucleicos, que este tipo de macromoléculas é capaz de atravessar a membrana plasmática de certas células in vivo (WO 90/11092), permanece ainda que a eficácia da transfecção observada é ainda muito limitada, devido especialmente à natureza polianiónica dos ácidos nucleicos que previnem a sua passagem através da membrana celular, apresentando ela própria uma carga aparente claramente negativa. Desde 1989 (Felgner et al., Nature, 337, 387-388) que os lípidos catiónicos foram apresentados como moléculas interessantes para favorecer a introdução de grandes moléculas aniónicas, tais como os ácidos nucleicos, em certas células. Estes lípidos catiónicos são capazes de se complexar às moléculas aniónicas tendendo assim a neutralizar as cargas negativas das referidas moléculas e a favorecer a 2 sua aproximação em direcção às células. Numerosas equipas já desenvolveram diferentes lípidos catiónicos. A título de exemplos, pode citar-se o DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417), o DOGS ou O Transfectam™ (Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986), o DMRIE e o DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), o DC-CHOL (Gao e Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), o DOTAP™ (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622) ou a Lipofectamine™, assim como os descritos nos pedidos de patente W09116024 ou W09514651.

Mais particularmente, o pedido WO9405624 descreve lípidos catiónicos de fórmula CH2 - 0 - R

I

CH - 0 - R I z

I I

CH2 - N - (CH2)q - X

I z |na qual os radicais R são especialmente radicais octadecenilo, os radicais Z são radicais alquilo C1-C13 ou alquilo ou acilo -C(=0)-(CrCi3), q é um número inteiro de 1 a 6, X é especialmente uma cadeia curta poliamina, tal como a espermina, a espermidina, uma carboxiespermina ou uma polilisina.

Os pedidos EP 685457 e EP 685234 descrevem especialmente compostos catiónicos de fórmula:

CH2 - 0 - R

I

I

CH - 0 - R

I CH2 - A - (CH2)o - NH - Rt na qual R é em particular uma cadeia hidrocarbonada de 10 a 30 átomos de carbono, saturada ou não, A pode especialmente ser escolhido entre os grupos -0-(C=0) e -NH-(C=0)-, n varia de 0 a 4 e Ri é um alquilo ou uma cadeia curta aminoalquilo, na qual a amina primária está substituída por um alquilo de 2 a 8 átomos de carbono. Estes compostos apresentam uma fraca actividade hemolítica e permitem in vitro introduzir em 3 células HelaS3 um ARN de haste dupla podendo agir como agente de inibição do crescimento. O pedido DE 19521412 descreve compostos comportando também eles uma parte não polar e uma parte polar de fórmula:

CH2 - 0 - R

I

I

CH - 0 - R

I

CH2 - NH-[C-(CH2)p- NH]q - Z

II o na qual p varia de 1 a 6, q varia de 0 a 2, R é quer C(=0)-C1-23 quer C1-23, saturado ou não, e Z é um péptido, um aminoácido ou uma estrutura aminada ramificada. Estes compostos catiónicos permitem a transfecção in vitro de células em cultura.

Todavia, vários trabalhos (a título de exemplos, ver Mahato et al., J. Pharm. Sei., 1995, 84,1267-1271, Thierry et al., 1995, P.N.A.S., 92, 9742-9746) puseram em evidência que a eficácia da transferência para o interior das células da macromolécula aniónica podia variar em função especialmente da interaeção entre os complexos e as membranas celulares, da célula considerada, da composição lipídica dos compostos catiónicos, do tamanho dos complexos formados com as moléculas aniónicas e, mais particularmente, da relação de cargas positivas e negativas dos diferentes componentes do referido complexo. Os mecanismos que permitem em particular a interaeção dos complexos com as membranas celulares e a transferência dos complexos para o interior da célula são ainda largamente desconhecidos e os pesquisadores procedem nos seus trabalhos de acordo com uma abordagem fortemente empírica. É por consequência desejável propor outros lípidos catiónicos, tendo eventualmente propriedades melhoradas ou diferentes dos já descritos. O depositante identificou agora novos compostos glicerolipídicos que se podem apresentar sob forma catiónica, úteis especialmente para transferir uma substância activa comportando cargas negativas, especialmente um polinucleótido, para o interior de uma célula alvo, donde se pode considerar a utilização especialmente in vivo no quadro de uma terapia génica. 4

Assim, a presente invenção tem em primeiro lugar por objectivo um composto de fórmula: CH2-0-Ri

I CH -0-R2 CH2- X-C-CH2-(-N-(CH2)m-)a-NH2 r h na qual:

Ri, R2 idênticos ou diferentes são radicais de 6 a 23 átomos de carbono (referidos C6-C23) alquilo ou alcenilo, lineares ou ramificados, ou radicais alquilo -C(=0)-(C6-C23) ou alcenilo -C(=0)-(C6-C23), ou mais particularmente alquilo -C(=0)-(Ci2-C2o) ou alcenilo -C(=0)-(C12-C20), lineares ou ramificados, radicais arilo, radicais cicloalquilo, radicais fluoroalquilo, grupos oxietileno ou oximetileno eventualmente repetidos, lineares ou ramificados, eventualmente substituídos, X é um átomo de oxigénio ou um radical amino -NR3, sendo R3 um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, n é um número inteiro positivo de 1 a 6, de modo preferido de 2 a 4, m é um número inteiro positivo de 1 a 6 de modo preferido de 2 a 4, e quando n > 1, m pode ser idêntico ou diferente do referido n.

Pelo termo «alcenilo», entende-se indicar que a cadeia carbonada em questão pode compreender uma ou várias ligações duplas ao longo da referida cadeia.

De acordo com um caso particular da invenção, os referidos compostos são caracterizados por R1 ou/e R2 serem fluorados, isto é que pelo menos um carbono da cadeia policarbonada está substituído por um grupo fluorado. Exemplos dessas moléculas são propostos no exemplo N. Nesse caso particular, o número de átomos de carbono fluorados sobre cada cadeia R1 ou R2 pode variar de 1 a 12, e mais particularmente de 4 a 8, e é preferencialmente 4. De acordo com um caso vantajoso, R1 e/ou R2 são radicais alquilo de 15 átomos de carbono e o número de átomos de carbono fluorados é 4 para cada uma das cadeias Ri e R2 consideradas. O número de grupos fluorados presentes 5 sobre as cadeias Ri e/ou R2 pode especialmente variar de 1 a 23, mais particularmente de 9 a 17, e preferencialmente é 9.

Os compostos de acordo com a invenção podem além disso estarem substituídos. Tais substituições podem especialmente consistir numa molécula de marcação (ver moléculas de marcação em US 4711955) que permite por exemplo visualizar a distribuição dos compostos ou dos complexos que os contêm após administração in vitro ou in vivo, uma molécula de alvo celular, uma molécula de ancoragem. A invenção refere-se por consequência igualmente a um composto tal como apresentado acima conjugado com um ou mais elementos de alvo por intermédio de pelo menos a) um dos compostos de carbono, em particular escolhidos entre os presentes sobre os grupos Ri, R2 e/ou R3 ou b) um dos átomos de azoto secundário ou primário da cadeia poliamina. Tais elementos podem permitir o alvejamento na direcção de um tipo celular particular, facilitar a penetração no interior da célula, a lise dos endossomas ou ainda o transporte intracelular e são largamente descritos na literatura. Pode tratar-se por exemplo do todo ou de parte de açúcares, de péptidos (péptido GRP, Gastrin Releasing Peptide, por exemplo), de oligonucleótidos, de lípidos, de hormonas, de vitaminas, de antigenes, de anticorpos, de ligandos específicos de receptores membranares, de ligandos susceptíveis de reagir com um anti-ligando, de péptidos fusogénicos, de péptidos de localização nuclear ou de uma combinação desses compostos. Pode citar-se mais particularmente os resíduos galactosilo permitindo alvejar o receptor asialoglicoprotéico na superfície das células hepáticas, o péptido fusogénico INF-7 derivado da sub-unidade HA-2 da hemaglutinina de vírus influenza (Planck et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924) ou de um sinal de localização nuclear derivado do antigene T do vírus SV40 (Lanford e Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou da proteína EBNA-1 do vírus Epstein Barr (Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478).

Tais conjugados podem ser facilmente obtidos de acordo com as técnicas descritas na literatura e mais particularmente por acoplamento químico, especialmente utilizando grupos protectores tais como trifluoroacetilo ou Fmoc ou Boc sobre a poliamina. A desprotecção selectiva de um grupo protector permite então acoplar o elemento de alvejamento e desprotege-se em seguida o glicerolípido. Convém todavia indicar que a substituição dos grupos não reactivos tais como os átomos de carbono nos grupos CH ou CH2 realizar-se-á no decurso da síntese dos compostos da invenção segundo métodos conhecidos do profissional; enquanto que os grupos reactivos, tais como as aminas 6 primárias ou secundárias, podem ser objecto de substituições sobre os glicerolípidos da invenção neo-sintetizados.

De acordo com um caso vantajoso da invenção, o referido composto está sob forma catiónica, isto é está sob forma protonada por fixação de um protão sobre um ou vários átomos de azoto presentes sobre a cadeia poliamina. Neste caso, o referido glicerolípido catiónico está associado a um ou vários aniões biologicamente aceitáveis, tais como por exemplo o anião trifluoroacetato, halogeneto, monometilsulfato, acetato ou fosfato, iodeto, cloreto, brometo... É igualmente possível obter compostos sob forma catiónica por substituição das aminas, por exemplo, com um radical metilo, etilo...

Os compostos de acordo com a presente invenção comportam de 2 a 7 cargas positivas, mais particularmente de 3 a 5, e preferencialmente 5. Mostrou-se que a afinidade de uma poliamina pelo ADN depende especialmente do número de funções amina presentes sobre a referida poliamina (Braulin, W. H., Strick, T. J. e Record, M.T., Jr. (1982) Biopolymers 21, 1301-1314). Além disso, a seguir à sua penetração na célula por endocitose, os complexos formados entre um ADN e um composto lipídico catiónico são localizados nos endossomas nos quais o ADN pode ser degradado sob a acção de nucleases dependentes do pH. Para contrariar este fenómeno que afecta a eficácia da transfecção, é possível utilizar agentes lisosomotrópicos, tais como por exemplo a cloroquina, cuja capacidade tampão a pH 5,5 permite observar uma melhoria da transfecção. Todavia, a eficácia de tais compostos não é sistemática, notemos a título de exemplos negativos os casos da polietiloimina (PEI), das liposperminas ou dos dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM). Além disso, a utilização da cloroquina em dose forte pode apresentar um risco tóxico. De acordo com a invenção, os compostos possuem uma extremidade poliamina que permite obter um efeito similar ao das moléculas lisosomotrópicas. Um interesse particular dos referidos compostos poderia ser, por consequência, evitar a utilização da cloroquina para as aplicações in vivo.

De acordo com um modo de realização preferido da invenção, o referido composto escolhido no grupo consistindo nas fórmulas seguintes: 7

C,jH

CtSH ο

n=2

n=2 pcTG19 ou n=3 pcTG36 o IV Cu HaJ Cu Haj

n=2 pcTG20 ou n=3 pcTG35 ou n=4‘pcTG56 v C18:1, (cis]-9

C, >H

-JL /i 35 γΓ'-Π Ct7HlS

MH

n=2 pcTG22 ou n=4 dcTG90 VI

Estes compostos catiónicos podem, por exemplo, ser preparados por reacção de um composto de fórmula: 8 CH2-O-R4

I CH-O-Rs

I

CHa-X-H na qual: R4, R5 são grupos protectores, formando especialmente em conjunto um radical isopropilideno, X tem o mesmo significado que na fórmula I, com um ácido de fórmula:

HOOC - CH2 - (- N - (CH2)m - )a - NHR6 VII

I

Re tendo m e n 0 mesmo significado que na fórmula I, sendo Re um grupo protector, especialmente 0 t-butoxicarbonilo (BOC).

As funções 0-R4, -0-R5 são em seguida desprotegidas para fixar por esterificação ou eterificação os radicais R1 e R2 de modo conhecido. O composto obtido é desprotegido na presença de ácido trifluoroacético. Prepara-se o ácido de fórmula VII de modo conhecido.

No caso dos compostos da invenção para os quais m = 3, n = 2 ou 3, referir-nos-emos aos exemplo indicados a seguir para conhecer as modalidades práticas de síntese. Os processos descritos são aplicáveis em geral às sínteses dos compostos de acordo com a invenção mediante adaptações ao dispor do profissional. Todavia, os compostos da invenção não se limitam aos obtidos pelos modos de preparação descritos anteriormente.

De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se iguaímente a uma composição compreendendo pelo menos um composto tal como descrito acima e, eventualmente, pelo 9 menos um adjuvante susceptível de melhorar a formação de complexo entre um dito composto e uma substância activa ou de melhorar o funcionamento destes complexos em relação à célula.

De modo preferido, esse adjuvante será um lípido neutro ou zwiteriónico que, por exemplo, é ou deriva de um triglicérido, um diglicérido, o colesterol (ver por exemplo, US 5 438 044), em particular, um lípido neutro ou zwiteriónico que é ou que deriva de uma fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina, fosfocolina, esfingomielina, ceramida ou cerebrósido. De modo vantajoso, escolher-se-á a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). A relação em massa entre o composto da invenção e o lípido neutro ou zwiteriónico está geralmente compreendido entre 0,1 e 10, entendendo-se que esta relação pode variar segundo a natureza dos compostos considerados. O profissional dispõe de conhecimentos suficientes para permitir estas adaptações menores. É igualmente possível utilizar uma mistura de lípidos neutros e/ou zwiteriónicos. A invenção refere-se além disso a um novo complexo compreendendo pelo menos um composto ou pelo menos uma composição tais como descritas anteriormente e pelo menos uma substância activa, especialmente, terapeuticamente, comportando pelo menos uma carga negativa. De acordo com uma variante da invenção, o referido complexo pode além disso conter um ou vários anfifilos catiónicos tais como os descritos na literatura cujos exemplos foram propostos acima. Em geral, utilizar-se-ão substâncias terapeuticamente activas que se podem realizar no quadro da terapia génica.

De acordo com um modo particular de realização, a referida substância activa é escolhida entre os ácido nucleicos e as proteínas. De preferência, a substância activa do complexo de acordo com a invenção é um polinucleótido, permitindo então o referido composto ou a referida composição melhorar o poder de transfecção do polinucleótido para uma célula.

Por «polinucleótido», entende-se designar um fragmento de ADN e/ou de ARN, de haste dupla ou de haste simples, linear ou circular, natural, isolado, ou de síntese, designando um encadeamento preciso de nucleótidos, modificados ou não (ver a título de exemplo, US 5525711), marcados ou não (ver por exemplo, US 4711955 ou EP 302175), permitindo definir um fragmento ou uma região de um ácido nucleico sem limitação de tamanho. Por polinucleótido entende-se designar especialmente um cADN, um ADN 10 genómico, um ADN plasmídico, um ARN mensageiro, um ARN antisens, um robózimo, um ARN de transferência, um ARN ribossómico ou um ADN codão para esses ARN. «Polinucleótido» ou «ácido nucleico» são termos sinónimos no quadro do presente pedido.

De acordo com um modo de realização particular da invenção, o referido polinucleótido compreende um gene de interesse e elementos que permitem a expressão do referido gene de interesse. Neste modo de realização, o referido polinucleótido está vantajosamente sob forma de plasmídeo. Os elementos que permitem a expressão são o conjunto de elementos que permitem a transcrição do referido fragmento de ADN em ARN (ARN antisens ou ARNm) e a tradução do ARNm em polipéptido. Trata-se especialmente de sequências promotoras e/ou de sequências de regulação eficazes na referida célula e, eventualmente, as sequências requeridas para permitir a excreção ou a expressão à superfície das células alvo do referido polipéptido. A título de exemplo, mencionar-se-ão os promotores tais como os promotores dos vírus RSV, MPSV, SV40, CMV ou 7,5 k, do vírus da vacina, os promotores do gene codão para a creatina quinase muscular, para a actina, para o surfactante pulmonar. É além disso possível escolher uma sequência promotora específica de um dado tipo celular ou capaz de ser activada em condições definidas. A literatura contém um grande número de informações relativas a essas sequências promotoras. Além disso, o referido polinucleótido pode compreender pelo menos duas sequências, idênticas ou diferentes, apresentando uma actividade de promotor transcripcional e/ou ao menos duas sequências codão de ADN, idênticas ou diferentes, situadas uma em relação à outra de modo contíguo, afastadas, no mesmo sentido ou em sentido inverso, de modo a que a função de promotor transcripcional ou a transcrição das referidas sequências não seja afectada. Do mesmo modo, neste tipo de construção do ácido nucleico, é possível introduzir sequências nucleicas «neutras» ou intrões que não afectam a transcrição e são torcidas antes da etapa de tradução. Essas sequências e suas utilizações estão descritas na literatura. O referido polinucleótido poderá igualmente conter sequências requeridas para o transporte intracelular, para a replicação e/ou para a integração. Essas sequências são bem conhecidas do perito. Além disso, os polinucleótidos de acordo com a invenção podem igualmente ser polinucleótidos modificados de modo a que não lhes seja possível integrarem-se no genoma da célula alvo ou polinucleótidos estabilizados com o auxílio de agentes, tais como por exemplo a espermina. 11

No quadro da presente invenção, o polinucleótido pode ser homólogo ou heterólogo à célula alvo. Pode ser vantajoso utilizar um polinucleótido que codifique em todo ou em parte um polipéptido, especialmente um polipéptido que apresente uma actividade terapêutica ou profiláctica e, mais particularmente, uma actividade imunogénea de tipo celular ou humoral. O termo polipéptido entende-se sem restrição quanto ao seu tamanho ou seu grau de modificação (por exemplo de glicosilação). Pode-se a título de exemplo citar os genes codão para uma enzima, uma hormona, uma citoquina, um receptor membranário, um polipéptido estrutural, um polipéptido que forma uma canal membranário, um polipéptido de transporte, uma molécula de adesão, um ligante, um factor de regulação da transcrição, da tradução, da replicação, da estabilização dos transcritos ou um anticorpo, tais como por exemplo o gene codão para a proteína CFRT, a distrofina, o factor VIII ou IX, E6/E7 de HPV, MUC1, BRAC1, o interferão β, o interferãoy, a interleucina (IL)2, a IL-4, a IL-6, a IL-7, a IL-12, o factor necrosante de tumor (TNF) de tipo alfa, o GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), gene tk do vírus Herpes Simplex de tipo 1 (HSV-1), o gene associado ao retinoblastoma ou p53 ou toda ou parte de imunoglobulinas, tais como os fragmentos F(ab)2, Fab’, Fab ou os anti-idiotipos (US 4.699.880). Claro que esta lista não é limitativa e podem utilizar-se outros genes.

De acordo com um modo de realização preferido, os complexos de acordo com a invenção são de pequena dimensão (inferior a 500 nm, com vantagem a 200 nm e de preferência a 100 nm).

Além disso, as experiência de transfecção realizadas mostram que com vantagem a relação em peso do composto lipídico de acordo com a invenção e do referido polinucleótido é de 0,01 a 100. A relação óptima situa-se de 0,05 a 10. A invenção refere-se igualmente a um processo de preparação dos complexos compostos catiónicos/substâncias activas comportando pelo menos uma carga negativa, sendo o referido processo caracterizado por se pôr em presença um ou vários compostos ou composições de acordo com a invenção com uma ou várias substâncias activas comportando pelo menos uma carga negativa e por se recuperar o referido complexo, eventualmente após uma etapa de purificação. 12

Num primeiro tempo, segundo uma primeira variante, um ou vários compostos catiónicos são colocados em solução com uma quantidade apropriada de solvente ou mistura de solventes miscíveis em água, especialmente o etanol, o dimetilsulfóxido (DMSO), ou de modo preferido uma mistura de etanol/DMSO 1:1 (v:v), de modo a formar agregados lipídicos segundo um método conhecido, descrito por exemplo no pedido de patente WO-A-9603977, ou segundo uma segunda variante, são colocados em suspensão com uma quantidade apropriada de uma solução de detergente como um octilglucósido tal como o n-octil-3-D-glucopiranósido ou o 6-0-(N-heptilcarbamoil)-metil-a-D-glucopiranósido. A suspensão pode em seguida ser misturada com uma solução de substância activa comportando cargas negativas.

No caso em que se deseja que um lípido neutro ou zwiteriónico esteja presente no complexo final, forma-se, de modo conhecido, antes da colocação em solução no solvente miscível com água ou na solução de detergente, uma película com uma mistura contendo um dito composto catiónico e um dito lípido neutro ou zwiteriónico, tal como por exemplo a DOPE.

Uma das características importantes do processo reside na escolha da relação entre as cargas positivas do lípido catiónico e as cargas negativas da substância activa.

Sem querer ser limitado por nenhuma relação específica, escolher-se-ão quantidades das diferentes cargas de modo a que a relação entre o número de cargas positivas do composto ou da composição catiónica e o número de cargas negativas da substância activa esteja compreendido entre 0,05 e 20, especialmente entre 0,1 e 15 e, de preferência, entre 5 e 10. O cálculo para chegar a essa relação terá em consideração as cargas negativas transportadas pela substância activa e ajustar-se-á a quantidade de composto necessária para satisfazer a relação indicada acima. As quantidades e as concentrações para os outros componentes são ajustadas em função das suas massas molares respectivas e do seu número de cargas positivas e/ou negativas.

Esta relação de cargas constitui igualmente uma característica vantajosa do complexo de acordo com a invenção. 13

No caso da segunda variante e de modo óptimo, pode-se proceder a uma diálise subsequente para reduzir o detergente e recuperar os complexos. O princípio desse método é por exemplo descrito por Hofland et al. (1996, PNAS 93, p. 7305-7309) e no capítulo II do documento Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993).

Mostrou-se que a primeira variante conduz a excelentes resultados em termos de tamanho dos complexos obtidos.

Segundo uma terceira variante, um ou vários compostos ou composições catiónicas são colocados em suspensão num tampão, depois a suspensão é submetida a uma sonicação até homogeneidade visual. A suspensão lipídica é em seguida extrudida através de duas membranas microporosas sob pressão apropriada. A suspensão lipídica é então misturada com uma solução da substância activa comportando cargas negativas. Esta técnica dita de sonicação-extrusão é bem conhecida na técnica. A utilização de um lípido neutro ou zwiteriónico, tal como a DOPE, pode revelar-se vantajosa para a obtenção de complexos de pequena dimensão (inferior a 200 nm, de preferência inferior a 100 nm).

As características dos complexos formados podem ser avaliadas por diversos meios que permitem determinar, por exemplo: - o estado de complexação com a substância activa, especialmente por pesquisa dos ácidos nucleicos livres por electroforese sobre gel de agarose no caso em que as substâncias são ácidos nucleicos, - a dimensão das partículas por difusão quase elástica da luz, - a ausência de precipitação a longo termo. A presente invenção tem igualmente por objectivo os complexos obtidos pela realização dos processos enumerados acima. A invenção refere-se também à utilização de um composto, de uma composição ou de um complexo de acordo com a invenção para transferir pelo menos uma substância activa, especialmente terapeuticamente, em particular um ácido nucleico, para células alvo, in vitro, ex vivo ou in vivo, mais particularmente in vivo. 14

Por «células alvo» de acordo com a invenção, entende-se as células procariotas, as células de levedura e as células eucariotas, as células de plantas, as células humanas ou animais e, em particular, as células de mamífero. Convém além disso citar as células cancerosas. In vivo, a invenção pode ser aplicada ao nível do espaço intersticial ou luminal de tecidos tais como o pulmão, a traqueia, a pele, o músculo, o cérebro, o fígado, o coração, o baço, a medula óssea, o thimo, a bexiga, a linfa, o sangue, o pâncreas, o estômago, o rim, os ovários, os testículos, o recto, o sistema nervoso periférico ou central, os olhos, os órgãos linfóides, as cartilagens, o endotélio. Segundo uma escolha vantajosa da invenção, a célula alvo será uma célula muscular, uma célula estirpe hematopoiética ou ainda uma célula das vias aéreas, mais particularmente uma célula traqueal ou pulmonar e, com vantagem, uma célula do epitélio respiratório. A invenção refere-se igualmente a um processo de transferência in vitro de uma substância terapeuticamente activa para um célula alvo, segundo o qual se põe em contacto a referida célula com um complexo de acordo com a invenção.

Os complexos de acordo com a invenção são utilizáveis a título de medicamento, com fim curativo, preventivo ou vacinai. É por isso que a invenção tem igualmente por objectivo os complexos da invenção a título de medicamento com fim curativo, preventivo ou vacinai. Esses complexos podem ser utilizados num método de tratamento terapêutico consistindo em transferir pelo menos uma substância terapeuticamente activa, especialmente um polinucleótido, para células alvo, especialmente uma célula de mamífero e, mais precisamente, uma célula muscular, uma célula de estirpe hematopoiética, uma célula das vias aéreas, mais particularmente uma célula traqueal ou pulmonar, uma célula do epitélio respiratório.

Em termos mais latos, a presente invenção refere-se igualmente a um processo para introduzir uma substância activa comportando cargas negativas no interior de uma célula, caracterizado por se colocar em contacto células cultivadas sobre um meio apropriado com uma suspensão de complexos composto catiónico/substância activa comportando cargas negativas. Após um certo tempo de incubação as células são lavadas e recuperadas. A verificação da introdução da substância activa pode ser efectuada (eventualmente após lise da célula) por qualquer meio apropriado. 15 O processo de introdução é bem conhecido em si. Pelo termo «introdução» entende-se que a substância activa comportando cargas negativas é transferida para a célula e está localizada, no fim do processo, no interior da referida célula ou ao nível da membrana desta. No caso em que a substância activa é um ácido nucleico, falar-se-á mais particularmente de «transfecção». Nesse caso, a verificação da transfecção do ácido nucleico poderá efectuar-se por qualquer meio apropriado, por exemplo por medida da expressão de gene considerado ou da concentração da proteína expressa. A invenção refere-se mais particularmente à utilização de um composto, de uma composição ou de um complexo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento com fim curativo, preventivo ou vacinai, destinado ao tratamento do corpo humano ou animal, especialmente por terapia génica.

Segundo uma primeira possibilidade, o medicamento pode ser administrado directamente in vivo (por exemplo num músculo, nos pulmões por aerossol...). Pode igualmente adoptar-se a abordagem ex vivo que consiste em retirar as células do paciente (células estirpes da medula óssea, linfócitos do sangue periférico, células musculares...), em transfectar in vitro de acordo com a presente invenção e em readministrá-las ao paciente.

Os complexos de acordo com a invenção podem ser administrados por via intramuscular, intratraqueal, intranasal, intracerebral, intrapleural, intratumoral, intracardíaca, intragástrica, intraperitoneal, epidérmica, intravenosa, intra-arterial por seringa ou qualquer outro meio equivalente, os sistemas adaptados ao tratamento das vias aéreas ou das mucosas tais como a inalação, instilação ou aerossolisação. Podem igualmente citar-se os modos de administração por via tópica, tais como por exemplo por aplicação de um creme, por administração oral ou qualquer outro meio perfeitamente conhecido do perito e aplicável à presente invenção.

Está igualmente no âmbito da invenção tornar alvos órgãos ou tecidos particulares para administração, especialmente por via intravenosa, de um complexo de acordo com a invenção preparado de modo a ajustar a relação composto ou composição/substância terapeuticamente activa no referido complexo, a carga aparente do complexo (ver por exemplo Liu et al, 1997, Gene Terapy, 4, 517-523; Thierry et al., 1995, P.N.A.S., 92, 9742-9746). 16 A invenção refere-se igualmente a um processo de terapia génica consistindo em administrar a um paciente uma quantidade apropriada de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com a presente invenção e no quadro de uma terapia génica in vivo, é possível repetir diversas vezes, num dado paciente, o processo tal como proposto sem que se desencadeie nenhuma reacção imunitária importante contra um dos compostos administrados. A administração pode realizar-se em dose única ou repetida uma ou mais vezes após um certo intervalo de tempo. A administração repetida permitiria reduzir a quantidade de substância terapeuticamente activa, mais particularmente de AND, a administrar para uma dada dose. A via de administração e a dosagem apropriada variam em função de diversos parâmetros, por exemplo do indivíduo ou da doença a tratar ou ainda do polinucleótido a transferir. A invenção refere-se mais particularmente a uma preparação farmacêutica compreendendo pelo menos um complexo tal como descrito anteriormente, contendo eventualmente além disso pelo menos um adjuvante capaz de estabilizar a referida preparação farmacêutica, com vista ao seu armazenamento por exemplo, e/ou a melhorar o poder de transfecção do referido complexo. Esse adjuvante poderia por exemplo ser escolhido entre o grupo consistindo na cloroquina, um composto polar prótico especialmente escolhido entre o propilenoglicol, o polietilenoglicol, o glicerol, o etanol, a 1-metil-L-2-pirrolidona ou seus derivados, ou um composto polar aprótico especialmente escolhido entre o dimetilsulfóxido (DMSO), o dietilsulfóxido, o di-n-propilsulfóxido, a dimetilsulfona, o sulfolano, a dimetilformamida, a dimetilacetamida, a tetrametilureia, o acetonitrilo ou seus derivados. Do mesmo modo, a referida preparação pode conter um suporte aceitável de um ponto de vista farmacêutico permitindo a sua administração ao homem ou ao animal.

No quadro da realização de um processo de tratamento in vivo de acordo com a presente invenção, é além disso possível efectuar, antes da administração de uma preparação farmacêutica tal como descrita anteriormente, um tratamento do paciente visando observar uma depleção temporária dos macrófagos permitindo melhorar a taxa de transfecção. Essa técnica está descrita na literatura, ver especiaimente Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15,178-184. A invenção refere-se a uma célula transfectada por um complexo tal como definido anteriormente, particularmente uma célula procariota, uma célula de levedura ou 17 eucariota, especialmente uma célula animal, em particular uma célula de mamífero e mais particularmente uma célula cancerosa. De acordo com um caso preferido da invenção, a referida célula é uma célula das vias aéreas, mais particularmente uma célula traqueal ou pulmonar e, com vantagem, uma célula do epitélio respiratório.

Por fim, a invenção refere-se a um dispositivo bem como a um processo permitindo o isolamento de uma molécula de interesse contendo pelo menos uma carga negativa, especialmente ácidos nucleicos tais como definidos de acordo com a presente invenção. Por «isolamento», entende-se designar a separação, a detecção, o enriquecimento, a purificação de uma fracção de moléculas aniónicas, de acordo com um método específico ou não específico, de modo qualitativo e/ou quantitativo.

Mais particularmente, a invenção refere-se a um dito dispositivo consistindo num suporte sólido disperso, tal como por exemplo partículas de polímeros (de poliestireno, de acrilamida, de metacrilamida ou de um dos seus derivados ou qualquer outro polímero susceptível de formar partículas cujos numerosos exemplos estão descritos na literatura, especialmente na literatura relativa às aplicações diagnósticas), ou num suporte sólido não disperso tal como por exemplo um tubo, por exemplo de poliestireno, uma coluna, por exemplo de hidroxiapatite, uma coluna em fase reversa ou equivalente, sobre o qual é fixado pelo menos um composto ou uma composição de acordo com a invenção, sob a sua forma catiónica. A fixação ao referido suporte sólido pode realizar-se de modo directo (adsorção por exemplo) ou indirecto (por intermédio de uma ponte de tipo ligante-anti-ligante). A realização desses dispositivos está à disposição do perito.

Além disso, a invenção refere-se a um processo que realiza esse dispositivo a fim de permitir o isolamento de moléculas aniónicas, em particular ácidos nucleicos. Esse isolamento pode especialmente ser não específico ou preferencialmente específico. Neste segundo caso, o referido composto ou a referida composição catiónica é, antes da etapa de isolamento, posto em contacto com, por exemplo, um oligonucleótido cuja sequência específica permite, após uma etapa de hibridação, em condições permitindo uma hibridação específica, isolar de modo específico um fragmento de ácido nulceico contendo toda ou parte de uma sequência complementar à sequência do referido oligonucleótido. A realização de um tal processo está largamente descrita na literatura. LEGENDA DAS FIGURAS: 18

Figura 1: Esta figura ilustra o modo de síntese dos compostos descritos em A.

Figura 2: Análise da dimensão das partículas dos complexos formados entre os glicerolípidos da invenção e o plasmídeo pTG11033 (pedido de patente ne FR9708267) a 0,1 mg/ml preparados pela técnica com etanol descrita anteriormente. Os resultados são apresentados para diferentes relações de cargas. Para cada medida, testaram-se três preparações independentes e avaliou-se a medida da reprodutibilidade pelo desvio padrão entre estas preparações. Mede-se a dimensão das partículas por PCS (Photon Correlation Epectroscopy). As colunas tracejadas representam os complexos obtidos na ausência de DOPE e as colunas carregadas na presença de uma quantidade equimolar de DOPE. Os complexos para os quais se observa uma precipitação são representados por uma coluna que se prolonga para lá da escala. A) glicerolípidos comportando 3 cargas positivas (C-14 = pcTG 18, C-16 = pcTG21, C-18 = pcTG19, oleoílo = pcTG20); B) glicerolípidos comportando 4 cargas positivas (C-14 = pcTG 33, C-16 = pcTG34, C-18 = pcTG36, oleoílo = pcTG35); c) glicerolípidos comportando cadeias oleoílo e 3 (pcTG 20), 4 (pcTG 35) ou 5 cargas positivas (pcTG56).

Figura 3: Injecção intravenosa de complexos de acordo com a invenção. A actividade luciferase é indicada em RLU/mg de proteína.

Figura 4: Esta figura ilustra o modo de síntese dos glicerolípidos fluorados do exemplo N.

Figura 5 A a G: Transfecção in vitro de células A549 na presença de complexos contendo diferentes glicerolípidos fluorados de acordo com a invenção. EXEMPLOS:

Os exemplos seguintes ilustram a invenção, sem a limitar de modo algum, em ligação com as figuras anexadas que fazem parte integrante da descrição. A. Síntese dos ácidos de fórmula VII com m = 3: n = 2: Rfi = BOC (ácido 7a) ou m = 3: n = 3: Rb = BOC (ácido 7b) (ver figura 1) 19

Aminoácidos 4. 6 e 15

Adiciona-se gota a gota uma solução de acrilonitrilo (9,6 ml, 146 mmoles) em 50 ml de 1,4-dioxano a uma solução gelada de glicina (10,0 g, 132 mmoles) e de soda 1 N (133 ml) numa mistura 1/1 de água e de 1,4-dioxano (200 ml). Agita-se o meio reaccional a 0aC durante 1 h e à temperatura ambiente durante 4 h suplementares. Adiciona-se em seguida gota a gota uma solução de dicarbonato de diterctiobutilo (35,0 g, 159 mmoles) no 1,4-dioxano (100 ml) e agita-se o meio reaccional duas horas à temperatura ambiente. Após extracção com éter (2 x 100 ml), acidifica-se a fase aquosa (pH 2-3) com ácido clorídrico 1N e extrai-se com acetato de etilo (2 x 100 ml). Secam-se e concentram-se as fases orgânicas combinadas. O cianoácido obtido 1 (24,4 g, Rdt 81%) apresenta-se sob a forma de um sólido branco de ponto de fusão 87-89sC. RMN-’H (200 MHz, D20): Ô 3,88 e 3,87 (2 s, 2 H, -CH2-C02H), 3,48 e 3,45 (21, J = 6,3 Hz, 2 H, -CH2-N-(BOC)-), 2,58 e 2,56 (2 t, J = 6,3 e 6,4 Hz, 2 H, -CH2-CN), 1,30 e 1,24 (2s, 9 H, t-Bu-).

Hidrogena-se uma solução de ácido 1 (11,5 g, 50,4 mmoles) em 100 ml de etanol contendo 4,04 g (100 mmoles) de soda na presença de níquel de Raney (3,2 g) durante 18 h à temperatura ambiente. Filtra-se a mistura sobre celite e lava-se o catalisador com metanol (2 x 30 ml). Acidifica-se o filtrado a pH 4-5 com ácido clorídrico a 10% e concentra-se sob vácuo para dar um sólido branco que se dissolve em clorofórmio (50 ml) para precipitar a maior parte do cloreto de sódio. Após filtração, concentração sob vácuo do filtrado e recristalização em tetracloreto de carbono, obtém-se o aminoácido 2 (10,4 g; Rdt 89%) cujo ponto de fusão é de 201 -2022C. RMN-1H (200 MHz, D20): δ 3,53 (s, 2 H, -CH2-C02H), 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, -CH2-N-(BOC)-), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, -CH2-NH2), 1,69 (quint, J = 7 Hz, 2 H, -CH2-), 1,26 e 1,21 (2s, 9 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para a obtenção do cianoácido 1 conduz à obtenção do cianoácido 3 a partir do aminoácido 2. 20 RMN-1H (200 MHz,CDCI3): δ 4,00-3,85 (m, 2 H, -CH2-C02H), 3,55-3,43 (m, 2 H, -CHp-CH,-CN), 3,31 (t, J = 7,2 Hz, 4 H, -CH2-N-(BOC)-), 2,61 (m, 2 H, -CH2-CN), 1,78 (quint, J = 7,2 Hz, 2 H, -CH2-), 1,47 e 1,44 (2s, 18 H, t-Bu-).

Obtém-se o aminoácido 4 com um rendimento de 87% após purificação por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: metanol/diclrorometano 3/7, depois 6/4) a partir de cianoácido 3 de acordo com o mesmo procedimento que conduziu ao aminoácido 2. O ponto de fusão é 189-190SC. RMN-1H (200 MHz, D20): δ 3,57 e 3,54 (2 s, 2 H, -CH2-C02H), 3,2-3,0 (m, 6 H, -CH2-N-(BOC)-), 2,80 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, -CH2-NH2), 1,80-1,50 (m, 4 H, -CH2-), 1,27 e 1,22 (2s, 18 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o cianoácido 1 permite a obtenção de cianoácido 5 a partir do aminoácido 4. RMN-’H (200 MHz, CDCI3): δ 3,85 (s larga, 2 H, -CH2-C02H), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, -CH2-CH2-CN), 3,35-3,05 (m, 8 H, -CH2-N (BOC)-), 2,60 (m, 2 H, -CH2-CN), 1,85-1,60 (m, 4 H, -CH2-), 1,46 e 1,44 (2 s, 27 H, t-Bu-).

Obtém-se 0 aminoácido 6 com um rendimento de 83% após purificação por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: metanol/diclrorometano 3/7, depois 6/4) a partir do cianoácido 5 de acordo com o mesmo procedimento que conduziu ao aminoácido 2. RMN-1H (200 MHz, D20): δ 3,76 e 3,73 (2 s, 2 H, -CH2-C02H), 3,25-2,75 (m, 12 H, -CH2-N-(BOC)- e -CH2-NH2), 1,85-1,50 (m, 6 H, -CH2-), 1,28 e 1,23 (2s, 27 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o cianoácido 1 permite a obtenção de cianoácido 14 a partir do aminoácido 6. RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 3,95 e 3,87 (2 s largas, 2 H, -CH,-COpH). 3,47 (t, J = 6,5 Hz, 2 H, -ÇH^-CHa-CN), 3,40-3,05 (m, 12 H, -QHg-N (BOC)-), 2,61 (m, 2 H, -CH2-CN), 1,90-1,60 (m, 6 H, -CH2-), 1,47, 1,45 e 1,44 (3 s, 36 H, t-Bu-). 21

Obtém-se o aminoácido 15 com um rendimento de 71% após purificação por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: metanol/diclrorometano 1/9, depois 3/7) a partir do cianoácido 14 de acordo com um procedimento idêntico ao que conduziu ao aminoácido 2. RMN-1H (200 MHz, D20 - CD3OD): δ 3,57 (m, 2 H, -CHp-COpH). 3,15-2,80 (m, 14 H, -CH?-N (BOC)-), 2,70 (t, J = -7,5 Hz, 2 H, -ÇHg-NHa), 1,75-1,35 (m, 8 H, -CH2-), 1,17 e 1,13 (2 s, 36 H, t-Bu-). Ácidos 7a. 7b e 7c

Adiciona-se uma solução de dicarbonato de diterctiobutilo (1,09 g, 5,01 mmoles) em tetra-hidrofurano (4 ml) a uma solução de aminoácido 4 (1,50 g, 3,85 mmoles) e de trietilamina (1,07 ml, 7,7 mmoles) numa mistura 1/1 de tetra-hidrofurano e de água (8 ml). Agita-se o meio reaccional durante 2 h à temperatura ambiente. Acidifica-se então a pH 3 com uma solução aquosa a 10% de ácido clorídrico e extrai-se com acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se para dar um óleo incolor que, após cromatografia sobre coluna de gel de sílica (eluente: acetato de etilo), dá o ácido 7a (1,79 g; Rdt: 95%). RMN-1H (200 MHz, CD3OD): δ 3,79 (s, 2 H, -CH2-C02H), 3,30-3,15 (m, 6 H, -CH2-N (BOC)-), 3,03 (t, J = 6,7 Hz, 2 H, -CH2-N (BOC)-), 1,85-1,60 (m, 4 H, -CH2-), 1,46 e 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o ácido 7a permite a obtenção do ácido 7b (7,31 g; Rdt: 95%) a partir do aminoácido 6 (6,50 g). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 3,93 e 3,86 (m, 2 H, -CH2-C02H), 3,40-3,05 (m, 12 H, -CH2-N (BOC)-), 1,85-1,60 (m, 6 H, -CH2-), 1,44 (s larga, 36 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o ácido 7a permite a obtenção do ácido 7c (3,37 g; Rdt: 92% após cromatografia sobre gel de sílica; eluente: metanol/diclorometano 5/95, depois 10/90) a partir do aminoácido 15 (3,20 g; 4,55 mmoles). 22 RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 3,85 (m, 2 H, -ÇH^-CC^H), 3,45-3,05 (m, 16 H, -CH?-N (BOC)-), 1,85-1,60 (m, 8 H, -CH2-), 1,45,1,44 e 1,43 (3 s, 45 H, t-Bu-). Síntese de alicerolípidos catiónicos Ésteres 8a. 8b e 8c

Adiciona-se uma solução de diciclo-hexilcarbodi-imida (0,60 g, 2,9 mmoles) em diclorometano seco (1 ml) a uma solução de ácido 7a (1,10 g , 2,25 mmoles), de (S)-(+)-2,2-dimetil-1,3-dioxalano-4-metanol (0,39 g, 2,9 mmoles) e de 4-(dimetilamino)piridina (27 mg, 0,23 mmoles) em diclorometano seco (3 ml). Agita-se a mistura reaccional durante 18 h à temperatura ambiente. Retira-se o precipitado de diciclo-hexilureia por filtração e concentra-se o filtrado sob vácuo, depois cromatografa-se sobre coluna de gel de sílica (eluente: éter/hexano 6/4) para dar o éster 8a (0,72 g; 53%). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,40-4,02 (m, 4 H, -CH2-0-), 3,98 e 3,90 (2 s largas, 2 H, -CH2-C02-), 3,73 (m, 1 H, -CH-O-), 3,35-3,00 (m, 8 H), 1,85-1,55 (m, 4 H, -CH2-), 1,45,1,43 e 1,42 (3 s, 30 H), 1,36 (s, 3 H, Me-). O mesmo procedimento usado para o éster 8a permite a obtenção do éster 8b (3,08 g; Rdt: 49%) a partir do ácido 7b (5,32 g; 8,22 mmoles). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,40-4,02 (m, 4 H, -CH2-0-), 3,99 e 3,91 (2 s largas, 2 H, -CH2-C02-), 3,73 (m, 1 H, -CH-O-), 3,32-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-), 1,45, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 39 H, t-Bu e Me-), 1,36 (2 s, 3 H, Me-). O mesmo procedimento usado para o éster 8a permite a obtenção do éster 8c (1,73 g; Rdt: 95%) a partir do ácido 7c (1,60 g; 1,99 mmoles). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,35-4,04 (m, 4 H, -CH3-Q-), 3,99 e 3,92 (2 s, 2 H, -CH2-C02-), 3,74 (m, 1 H, >CH-0-), 3,30-3,00 (m, 16 H, -CHp-N(BOC)-). 1,85-1,55 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,45,1,44 e 1,42 (4 s, 48 H, t-Bu e Me-), 1,36 (s, 3 H, Me-).

Di-hidroxiésteres 9a. 9b e 9c 23

Agita-se durante 16 h, à temperatura ambiente, uma solução de éster 8a (663 mg, 1,10 mmoles) e de ácido clorídrico 1 N (0,44 ml) em metanol (19 ml). Adiciona-se em seguida trietilamina (0,5 ml) até à neutralidade. A evaporação sob vácuo seguida da cromatografia sobre coluna de gel de sílica (eluente: éter, depois acetato de etilo) dá o di-hidroxiéster 9a (497 mg; Rdt: 80%) sob a forma de um óleo incolor. RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(=0)-), 4,00-3,50 (m, 5 H, CH-OH, -CHaOH e -CH2-C02-), 3,40-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 4 H, -CH2-), 1,45 e 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o di-hidroxiéster 9a permite a obtenção do di-hidroxiéster 9b (340 mg; Rdt: 71%) a partir do éster 8b (500 mg; 0,66 mmoles). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(=0)-), 4,00-3,40 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH e -CH2-C02-), 3,40-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-), 1,46, 1,45 e 1,43 (3 s, 36 H, t-Bu-). O mesmo procedimento usado para o di-hidroxiéster 9a permite a obtenção do di-hidroxiéster 9c (1,23 g; Rdt: 83%, após cromatografia sobre gel de sílica; eluente: metanol/diclorometano 5/95) a partir do éster 8c (1,55 g; 1,69 mmoles). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 4,25 (m, 2 H, -CH2-OC(=0)-), 4,00-3,40 (m, 5 H, ÇH-OH, -CH,OH e -ÇHg-COa-), 3,40-3,00 (m, 16 H, -ÇH2-N(BOC)-), 1,90-1,60 (m, 8 H, -CH2-), 1,46,1,45,1,44 e 1,42 (4 s, 45 H, t-Bu-).

Triésteres 10a. 11a. 12a e 13a

Adiciona-se uma solução de diciclo-hexilcarbodi-imida (142 mg, 0,69 mmoles) em diclorometano seco (1 ml) a uma solução de di-hidroxiéster 9a (130 mg, 0,23 mmoles), de ácido oléico (195 mg, 0,69 mmoles; Fluka puriss.) e de 4-(dimetilamino)piridina (3 mg, 0,02 mmoles) em diclorometano seco (2 ml). Agita-se a mistura reaccional durante 16 h à temperatura ambiente. Retira-se o precipitado de diciclo-hexilureia por filtração e concentra-se o filtrado sob vácuo, cromatografa-se sobre coluna de gel de sílica (eluente: éter/hexano 3/7, depois 4/6) para dar o triéster 10a (142 mg; 57%) sob forma de um óleo incolor. 24 ΡΜΝ-’Η (200 ΜΗζ, CDCI3): δ 5,34 (m, 4 Η -CH=), 5,26 (m, 1Η, CH-0C(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-0C(=0)-), 3,95 e 3,88 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,01 (m, 8 H, -CH,-CH=), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 e 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,30 e 1,27 (2 s largas, 44 H, CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). O mesmo procedimento usado para o triéster 10a permite obter os triésteres 11a (Rdt: 65%), 12a (Rdt: 64%) e 13a (Rdt: 58%) a partir do di-hidroxiéster 9a e respectivamente do ácido mirístico, do ácido palmítico e do ácido esteárico. 11a RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,45-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,95 e 3,88 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 e 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 40 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 12a RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,95 e 3,88 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 e 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 13a RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,95 e 3,88 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 e 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).

Triésteres 10b. 11b. 12b e 13b O mesmo procedimento usado para o triéster 10a permite a obtenção do triéster 10b (137 mg; Rdt: 61%) a partir do di-hidroxiéster 9b (130 mg, 0,18 mmoles) e de ácido oléico (153 mg; 0,54 mmoles; Fluka puriss.). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,96 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,01 (m, 8 H, -CH9-CH=). 1,85-1,50 25 (m, 10 H, -CH2-), 1,46,1,45, 1,44 e 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-), 1,30 e 1,27 (2 s largas, 44 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). O mesmo procedimento usado para o triéster 10a permite obter os triésteres 11b (Rdt: 64%), 12b (Rdt: 58%) e 13b (Rdt: 63%) a partir do di-hidroxiéster 9b e, respectivamente, do ácido mirístico, do ácido palmítico e do ácido esteárico. 11b RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-0C(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-0C(=0)-), 3,97 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 e 1,41 (4 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 40 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 12b RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-0C(=0)-), 3,97 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 e 1,41 (4 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 13b RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,97 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2.31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 e 1,41 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). T riéster 10c O mesmo procedimento usado para o triéster 10a permite a obtenção do triéster 10c (0,75 g; Rdt: 47%) a partir do di-hidroxiéster 9c (1,00 g, 1,14 mmoles) e de ácido oléico (0,97 g; 3,42 mmoles; Fluka puriss.). RMN-1H (200 MHz, CDCI3): δ 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,95 e 3,89 (2 m, 2 H, -NÍBOCI-Ol-CO?-), 3,35-3,00 (m, 16 H, -ÇtU-NÍBOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,01 (m, 8 H, -CH,-CH=). 1,85-1,50 (m, 12 H, -CH2-), 1,46, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 45 H, t-Bu-), 1,30 e 1,27 (2 s largas, 44 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 26

Glicerolípidos pcTG20

Trata-se o triéster 10a (120 mg, 0,11 mmoles) em solução em diclorometano seco (1 ml) durante 3 h com uma mistura 1/1 de ácido trifluoroacético e de diclorometano seco (20 ml) a 0SC. Adiciona-se em seguida hexano (50 ml) e evapora-se a mistura sob vácuo e dá uma película que se coloca em suspensão (vórtice) em éter destilado (5 a 10 ml). A filtração dá um pó branco que se lava com éter e se seca sob vácuo para dar o glicerolípido pcTG20 (124 mg; 99%). Ponto de fusão: decompõe-se a 160SC. RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,34 (m, 5 H, -CH= e CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,99 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,20 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,50-2,20 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2-), 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=). 1,61 (m, 4 H, -CHs-CHs-CO,-). 1,30 e 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).

Análise elementar: Calculada para C53H92FgN3022 : C, 56,12%; H, 8,18%; N, 3,70%. Encontrado: C, 56,3%; H, 7,9%; N, 3,7%.

Glicerolípido pcTG35 O mesmo procedimento usado para o lípido catiónico pcTG20 permite a obtenção do lípido catiónico pcTG35 (101 mg; Rdt: 97%) a partir do triéster 10b (100 mg, 0,08 mmoles). Ponto de fusão: decompõe-se a 190SC. RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,35 (m, 5 H, -CH= e CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 4,00 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,45-2,20 (m, 6 H, -CH2-CH2-NH2-), 2,01 (m, 8 H, -CHp-CH=). 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2-C02-), 1,30 e 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).

Análise elementar: Calculada para CseHtooF^IVUO™ : C, 53,36%; H, 7,72%; N, 4,29%. Encontrado: C, 53,2%; H, 7,6%; N, 4,3%. A espectrometria de massa foi medida a 849,8 Da (calculada: 849,3 Da). 27

Glicerolípido pcTG56 O mesmo procedimento usado para o glicerolípido pcTG20 permite a obtenção do glicerolípido pcTG56 (0,51 g; Rdt: 93%) a partir do triéster 10c (0,52 g, 0,37 mmoles). Ponto de fusão: decompõe-se a 220gC. RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C02D): δ 5,36 (m, 5 H, -CH= e CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 4,00 (s larga, 2 H, -NHp-CHp-COp-1. 3,45-3,10 (m, 16 H, -CHp-NH2-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,28 (m, 8 H, -CHp-CHp-NHp-). 2,01 (m, 8 H, -CHp-CH=1. 1,61 (m, 4 H, -ÇH2-CH2-C02-), 1,30 e 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-).

Glicerolípidos pcTG18. pcTG21 e pcTG19 O mesmo procedimento usado para o glicerolípido pcTG20 permite obter os glicerolípidos pcTG18 (Rdt: 97%; sólido; decompõe-se a 1658C), pcTG21 (Rdt: 96%; sólido; decompõe-se a 170aC) e pcTG19 (Rdt: 92%; sólido; decompõe-se a 186SC), a partir, respectivamente, dos triésteres 11a, 12a e 13a. pcTG18 RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,35 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,97 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,15 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,38 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,45-2,20 (m, 4 H, -CHp-CHp-NHp-). 1,60 (m, 4 H, -CHp-CHg-CO?-), 1,25 (s, 40 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 684,1 Da; medida 684,5 Da.

PcTG21 RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CD3OD): δ 5,20 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,45-4,00 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,78 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,15-2,40 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,24 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,18-1,92 (m, 4 H, -CHp-CHp-NHp-1· 1,52 (m, 4 H, -ÇH2-CH2-C02-), 1,17 (s, 48 H, -CH2-), 0,79 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 740,2 Da; medida 740,6 Da. pcTG19 RMN-Ή (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,38 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 4,01 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,20 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,50-2,25 (m, 4 H, -ÇHg-CH2-NH2-), 1,61 (m, 4 H, - 28 CHg-CHg-CO?-)· 1,26 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-)· Espectrometria de massa: calculada 796,3 Da; medida 796,8 Da.

Glicerolípidos pcTG33. dcTG34 e dcTG36 O mesmo procedimento usado para o glicerolípido pcTG20 permite obter os glicerolípidos pcTG33 (Rdt: 97%; sólido; decompõe-se a 205°C), pcTG34 (Rdt: 94%; sólido; decompõe-se a 215aC) e pcTG36 (Rdt: 92%; sólido; decompõe-se a 220aC), a partir, respectivamente, dos triésteres 11b, 12b e 13b. pcTG33 RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,37 (m, 1 H, CH-0C(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-0C(=0)-), 4,00 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,15 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,45-2,17 (m, 6 H, -ÇHg-CH^NHg-), 1,60 (m, 4 H, -ÇHg-CH2-C02-), 1,25 (s, 40 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 741,2 Da; medida 741,6 Da. pcTG34 ΗΜΝ-'Η (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,37 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,98 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,45-2,15 (m, 6 H, -CHrÇHg-NHz-), 1,60 (m, 4 H, -CHo-CHr-COp-)· 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 797,3 Da; medida 797,8 Da. pcTG36 RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CF3C 02D): δ 5,35 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(=0)-), 3,98 (s larga, 2 H, -NH2-CH2-C02-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,45-2,15 (m, 6 H, -ÇHg-CHz-NHr), 1,59 (m, 4 H, -CHg-CHg-CQg-). 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 854,4 Da; medida 854,0 Da.

Glicerolípido pcTG22

Uma via um pouco diferente da descrita acima permitiu a obtenção do glicerolípido pcTG22 a partir do 3-amino-1,2-propanodiol. RMN-1H (200 MHz, CDCI3 - CD3OD): δ 5,04 (m, 1 H, CH-OC(=0)-), 4,27-3,92 (m, 2 H, -CH2-OC(=0)-), 3,63 (s larga, 2 H, CH2-C(=0)-NH-), 3,10-2,90 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,24 e 29 2,23 (2 t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,15-1,95 (m, 4 H, -ÇHg-CH2-NH2-), 1,51 (m, 4 H, -CHg-CHg-COo-l. 1,17 (s, 56 H, -CH2-), 0,79 (t, J = 6,7 Hz, 6 H, Me-). Espectrometria de massa: calculada 795,3 Da; medida 795,3 Da.

Glicerolípido pcTG90

Um procedimento análogo ao descrito para a síntese do lípido pcTG56 permite a obtenção do lípido pcTG90 utilizando o 3-amino-2,2-propanodiol em vez do glicerol. B: Preparação dos complexos alicerolípidos-ADN por colocação em solução em

etanol 1. Preparação dos complexos alicerolípidos pcTG20, eventualmente DOPE. -ADN

Calculam-se as quantidades de lípidos com base na concentração de ADN final (0,1 mg/ml para os ensaios em culturas celulares), na relação de carga desejada, na massa molar e no número de cargas positivas do lípido catiónico escolhido. Para obter um complexo entre pcTG20/DOPE e o ADN plasmídico numa relação de 10 entre as cargas positivas trazidas pelo lípido catiónico e cargas negativas trazidas pelo ADN a uma concentração de ADN final de 0,1 mg/ml, misturam-se os diferentes ingredientes segundo o cálculo seguinte: 0,1 mg de ADN/ml ou seja (0,1/330) mmoles de cargas negativas (330 Da é o peso molecular médio de um nucleótido) por ml correspondente a: 0,30 μιτιοΙβ/ιτιΙ de cargas negativas. Para obter 10 vezes mais de cargas positivas é preciso uma concentração de 3,0 μπΊοΙθ/ΓηΙ de cargas positivas trazidas pelo lípido catiónico. A massa molar de pcTG20 sob forma de trifluoroacetato é de 1134 g/mole e a molécula contem 3 cargas positivas. É preciso portanto 1,0 pmole/ml de pcTG20 o que corresponde a 1,13 mg/ml.

Para obter uma concentração equimolar em L-a-Dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE, 744 g/mol, Sigma; P0510) é preciso 0,74 mg/ml na preparação lipídica. As quantidades e as concentrações para os outros compostos são ajustadas em consequência das suas massas molares respectivas e do seu número de cargas positivas. 30

Evaporam-se os lípidos retomados em clorofórmio, depois solubilizam-se em clorofórmio:metanol (v:v) e evaporam-se de novo. Pesam-se os lípidos catiónicos e adiciona-se a quantidade de DOPE a partir de uma solução mãe de 10 a 20 mg/ml em clorofórmio num tubo em vidro esterilizado com álcool e com UV para obter uma concentração de 2 mM em lípido catiónico. Evaporam-se os solventes sob vácuo (2x104 Pa, 200 mbar) durante 45 min a 459C, utilizando um vórtice de 40 voltas por minuto (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Alemanha). Retoma-se a película lipídica em etanol para estar à concentração de 50 mg/ml em lípido catiónico. pcTG20/DOPE 1,13 mg + 0,74 mg = 1,87 mg em 23 μΙ de etanol. Completa-se esta solução para 230 μΙ com HEPES 20 mM pH 7,5 para preparar uma solução a 5 mg/ml final em lípido catiónico.

Prepara-se o ADN plasmídico num tubo plástico a partir de uma solução mãe a 1 mg/ml (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5).

Para uma solução de 0,5 ml final, retira-se 50 μΙ da solução mãe (50 μg AND) aos quais se juntam 335 μΙ de HEPES 20 mM, pH 7,5. Para complexar o ADN com preparações lipídicas, adicionam-se os lípidos sobre o AND. Mistura-se a suspensão por aspiração/compressão à pipeta (10 vezes). Conservam-se os complexos a + 4SC.

Adicionam-se 115 μΙ de pcTG20/DOPE aos 385 μΙ da solução de ADN para obter 0,5 ml de complexo a 0,1 mg/ml de ADN e a uma relação de cargas de 10.

Faz-se a preparação dos complexos numa hotte de fluxo laminar.

Obtêm-se os complexos cujas características se indicam na tabela I a seguir.

2. Preparação dos complexos alicerolípidos pcTG35. pcTG22 e pcTG18 eventualmente DOPE. -ADN

Segundo o mesmo protocolo, obtêm-se os complexos cujas características se indicam na tabela I a seguir. 31 C. Preparação dos complexos glicerolípidos-ADN por colocação em suspensão numa solução de detergente

1. Preparação dos complexos alicerolípidos pcTG20. eventualmente DOPE. -ADN

Calculam-se as quantidades de lípidos como descrito acima com base na concentração de ADN final (0,1 mg/ml para os ensaios in vitro), na relação de carga desejada, na massa molar e no número de cargas positivas do fípido catiónico escolhido. Faz-se a mistura dos lípidos num tubo em vidro, esterilizado com álcool e com UV, para obter uma solução 2 mM em lípido catiónico (ver acima). Evaporam-se os solventes e retoma-se a película lipídica numa solução de n-octil-3-D-glucopiranósido (octilglucósido, Sigma, O 9882) segundo uma relação lípido catiónico/detergente de 1:5 (mole:mole).

Retira-se 253 μΙ de uma solução de octilglucósido 20 mM em HEPES 20 mM, pH 7,5, com os quais se retoma a película de mistura lipídica pcTG20/DOPE. Prepara-se o ADN plasmídico a partir de uma solução mãe a 1 mg/ml em que 50 μΙ se colocam em 0,5 ml (0,1 mg/ml final) aos quais se adiciona 323, 5 μΙ de HEPES 20 mM, pH 7,5. Adicionam-se 126,5 μΙ da suspensão lipídica sobre o ADN aspirando e comprimindo 10 vezes à pipeta para obter a suspensão final a 0,1 mg/ml de ADN e uma relação de cargas +/- de 10. Para eliminar o detergente, empreende-se uma diálise de 3 vezes 4 horas à temperatura ambiente contra HEPES 20 mM, pH 7,5, em “microdedos” de diálise (limiar de exclusão de 13,2 kD; Sartorius, G^tingen, Alemanha). Conservam-se os complexos ADN/lípido dialisados a + 4°C. Faz-se a preparação numa hotte de fluxo laminar.

Obtêm-se os complexos cujas características se indicam na tabela I abaixo. 2. Preparação dos complexos alicerolípidos PCTG35 eventualmente DOPE. -ADN Aplica-se o mesmo protocolo que anteriormente. D. Preparação dos complexos lípidos-ADN por sonicacão/extrusão

Calculam-se as quantidades de lípidos como descrito acima com base na concentração de ADN final (0,1 mg/ml para os ensaios in vitro), na relação de carga desejada, na massa molar e no número de cargas positivas do lípido catiónico escolhido. Faz-se a mistura dos 32 lípidos num tubo em vidro, esterilizado com álcool e com UV, para obter uma solução 2 mM em lípido catiónico, como indicado acima. Evaporam-se os solventes e retoma-se a película lipídica em 900 μΙ de HEPES 20 mM, pH 7,5, a 4SC durante cerca de 16 h. Sonica-se a suspensão num banho de sonicação (Bransonic 221) até homogeneidade visual. Extrude-se a suspensão lipídica através de duas membranas de 0,2 pm de diâmetro de poros (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) e enxagua-se com HEPES 20 mM, pH 7,5 (Extruder de Lipex, Biomembranes, Vancouver, Canadá) a uma pressão máxima de 5x106 Pa (50 bar). Mantém-se a suspensão lipídica à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionam-se 450 μΙ da suspensão lipídica sobre 50 μΙ de uma solução mãe de ADN plasmídico (1 mg/ml) e misturam-se aspirando/comprimindo 10 vezes à pipeta. Conservam-se os complexos lípido/ADN a + 4°C. Fazem-se as preparações numa hotte de fluxo laminar. E. Protocolo de avaliação da complexacão do ADN pelos lípidos

Prepara-se um gel de agarose a 1% (m:v) num tampão TAE (TAE: Tris 4,8 g/l + acetato de sódio 0,68 g/l + EDTA 0,336 g/l pH 7,8). Se necessário dilui-se a amostra em TAE, depois adiciona-se o tampão de amostra (0,083% azul de bromofenol, 0,083% cianoxileno FF, 10% glicerol em água) de modo a se encontrar a 50 ngADN/μΙ. Homogeneíza-se brevemente a amostra em vórtice e deixa-se 30 min à temperatura ambiente. A título de testemunha, utiliza-se o plasmídeo não complexado preparado na mesma concentração. Depositam-se 10 μΙ (500 ng de ADN) sobre gel e efectua-se a migração a 60 mV durante 3 horas. Revela-se o gel em TAE contendo 0,006% (v/v) de brometo de etídio a 10 mg/ml durante pelo menos 30 min. Enxagua-se em seguida o gel em TAE e analisa-se sob UV. F. Protocolo de medida da dimensão das partículas por difusão quase elástica da luz

As análises são feitas sobre um Coulter N4Plus (Coultronics France S.A., Margency, França) a 25SC após equilíbrio da amostra durante 20 min. Aspira-se e comprime-se uma alíquota da amostra várias vezes antes de ser pipetada. Dilui-se a amostra na cuba de medida e homogeneiza-se. Faz-se a medida da luz difractada a 90e durante 180 s após 180 s de espera. A gama utilizada vai de 3 nm a 10 000 nm utilizando 31 bins. Para ser válida, a amostra deve dar entre 50 000 e 1 000 000 counts/s. G. Características físico-auímicas 33

Aplicam-se os três métodos de formulação “injecção de etanol”, “diálise de detergente” e «sonicação/extrusão» aos lípidos catiónicos de acordo com a invenção, com ou sem quantidades equimolares de DOPE, a relações de cargas de cerca de 10 ou 5. As formulações consideram-se como apropriadas quando o ADN está completamente complexado (nenhuma migração no gel de agarose) e os complexos apresentam um diâmetro determinado por deformação quase elástica da luz inferior a 500 nm. A tabela resume os resultados das análises. Todos os complexos ADN/lípidos indicados na tabela complexam o ADN completamente nas relações de cargas analisadas. 34

TABELA I

Glícerofípido catiónico Relação1 Dimensão (nm)2 Formulação pcTG20/DOPE 10 84 +/-20 etanol pcTG20/DOPE 10 212+/-141 detergente pcTG20/DOPE 5 96+/-17 etanol pcTG35/DOPE 10 67 +/-22 etanol pcTG35/DOPE 5 93 +/-39 etanol pcTG35 10 83 +/-11 etanol pcTG35 5 693 etanol pcTG33 10 223+/-138 sonicação pcTG33/DOPE 10 243+/-172 sonicação pcTG22 10 79 +/-59 etanol pcTG22 5 87 +/-52 etanol PCTG22/DOPE 10 261 +/-98 sonicação pcTG22/DOPE 10 89+/-146 etanol pcTG22/DOPE 5 72 +/-44 etanol pcTG18 10 68 +/-53 etanol pcTG18 5 72 +/-30 etanol PCTG18/DOPE 10 62 +/-43 etanol PCTG18/DOPE 5 109+/-64 etanol 1: Relação entre as cargas positivas do iípido catiónico e as cargas negativas do ADN. 2: determinada 24 a 48 horas após a preparação (+/- representa o desvio padrão da medida). 3: determinada 8 dias após a preparação.

Estas análises mostram que as formulações preenchem as exigências requeridas. O método “injecção de etanol” dá os melhores resultados para numerosas preparações que apresentam uma dimensão inferior a 100 nm. Os métodos por diálise de detergente e sonicação/detergente permitem igualmente obter complexos correspondendo aos objectivos da presente invenção. 35 Η.

Transfeccão in vitro de células satélites

Efectuam-se culturas de células de músculos de cão e de músculos de humanos num meio HamF (Life Technologies) suplementado com 10% de soro de vitela fetal (SVF, Hyclone, Logan, UT), 10 pg/ml de insulina (Sigma), 10 ng/ml de EGF (Sigma) e de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ) 2 mM de glutamina (bioMérieux) e 40 pg/ml de gentamicina (Schering Plouhg).

Enseminam-se as células 24 h a 48 h antes da transfecção, numa caixa de cultura de 96 cavidades com cerca de 5x103 a 104 células por cavidade, a cerca de 30% de confluência e mantidas a 37QC em atmosfera de 5% de C02 e 95% de ar.

Efectuam-se as transfecções com misturas de quantidades variáveis de lípidos e de ADN plasmídico para determinar as relações de cargas e as concentrações de ADN óptimas por cavidade.

Preparam-se os complexos utilizados 24 h a 48 h antes da transfecção e diluem-se em HamF 14 mais 40 pg/ml de gentamicina e glutamina 2 mM.

Após eliminação do meio de cultura, transferem-se 100 μΐ de misturas de transfecção com ou sem 10% de FCS para cada uma das cavidades e incubam-se as placas durante 4 h a 3730.

Ajustam-se então todos os meios de transfecção a 10% de SVF, 10 pg/ml de insulina (Sigma), 10 ng/ml de EGF (Sigma) e de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ), glutamina 2 mM (bioMérieux) e 40 pg/ml de gentamicina (Schering Plouhg) para um volume final de 250 μΙ. Incubam-se as culturas durante 48 h, depois recuperam-se as células e testam-se para a sua capacidade em exprimir o gene da luciferase. Determinam-se as concentrações de proteínas para o sistema de teste de quantidade de proteína (Promega). 36 I.

Transfeccão das células A549 com complexos lipídicos

Colocam-se em cultura as células A549 (células epíteliais derivadas de carcinoma pulmonar humano) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro de vitela fetal (Gibco BRL) 24 horas antes do início da transfecção em placas de 96 cavidade (2 x 104 células por cavidade) numa atmosfera húmida a 37SC e 5% 00^95% ar. Para a transfecção na ausência de soro, retira-se o meio e substitui-se por um meio sem soro. Numa outra microplaca, preparam-se as suspensões de complexos lípidos/ADN seguintes (complexos lípidos/ADN a 0,1 mg/ml de ADN e na relação de cargas indicada): 44 μΙ (4,4 μg de ADN), 22 μΙ (2,2 μg de ADN), 5,5 μΙ (0,55 μg de ADN) de solução armazenada nas três primeiras cavidade e 11 μΙ (0,11 μg de ADN) da solução armazenada diluída 10 vezes na cavidade seguinte. Completa-se o volume para 110 μΙ com DMEM e transferem-se 100 μΙ sobre as células A549. Faz-se a incubação com 4, 2, 0,5 e 0,1 μg de ADN por cavidade durante 4 horas. Em seguida, adicionam-se 50 μΐ de DMEM + 30% de soro de vitela fetal 4 horas após o início da transfecção, depois 100 μΙ de DMEM + 10% FCS 24 horas após o início da transfecção. As transfecções em presença de 10% de soro de vitela fetal realizam-se de um modo idêntico salvo que a transfecção ocorre num meio com soro. J. Análise da transfeccão

Quarenta e oito horas após a transfecção, elimina-se o meio e lavam-se as células com 100 μΙ de solução fosfato PBS e lisam-se com 50 μΙ de tampão de lise (Promega). Congelam-se os lisados a -80SC até à medida da actividade luciferase expressa. Esta faz-se sobre 20 μΙ de mistura durante um minuto utilizando o kit de determinação da “Luciferase” (Promega) (luminómetro LB96P Berthold) em placas a 96 cavidade em modo cinético. K. Tranfeccão in vitro

Avaliaram-se algumas destas preparações em transfecção in vitro utilizando as células A549 e as células satélites primárias de cão.

Os resultados estão na tabela II abaixo e mostram as unidade relativas de luz (RLU) por cavidade. Os valores dados são obtidos com 2 μg de ADN por cavidade. Todos os 37 complexos são preparados utilizando o método da injecção de etanol. A concentração total de proteína por cavidade determina-se pelas técnicas convencionais (teste BCA, Pierce). A título indicativo, uma cavidade contem cerca de 20 a 30 μο de proteína.

TABELA II Lípido rela ção1 Ã5492 A549 + soro mioblastos mioblastos + soro pcTG20/DOPE 10 3,6x10* 6,1 x10“ 8,9x10* 2,3x10' pcTG20/DOPE 5 8,25x10“ 2,8x10' 8,8x10* 1,3x10“ pcTG35/DOPE 10 4x10“ 1,0x10' 7,1 x 10a 6,5x10' pcTG35/DOPE 5 3,3x10' 6,8x10' 4,3x10“ 1,0x10“ pcTG35 10 1,2x10“ 7,6x10“ 1,8x10' 6,2x10“ pcTG35 5 1,6 x10a 6,6x10' 3,4 x10a 1,7x10“ 1: Relação entre as cargas positivas do lípido catiónico e as cargas negativas do ADN. 2: ADN livre entre 0 e 270 unidade de luz relativa. A expressão da luciferase (RLU/min) referida em mg de proteínas dá os valores seguintes: pcTG35 R +/-10 (A549) 3,4 x 1013 RLU/min/mg proteína pcTG35 R +/- 5 (A549) 2,8 x 101° RLU/min/mg proteína pcTG35/DOPEv R +/- 5 (A549 + soro) 1,0 x 1013 RLU/min/mg proteína

Os compostos pcTG20 e pcTG35 são capazes de transfectar eficazmente os dois tipos de células testadas quando estão complexados ao ADN plasmídico. Notar-se-á que certas formulações dão resultados superiores na presença de soro e que o soro não tem efeito inibidor sobre este tipo de preparação.

Do mesmo modo, análises de transfecção in vitro realizadas sobre células A549 permitiram pôr em evidência a) que o composto pcTG90 complexado a um plasmídeo 38 pTG11033 permite observar uma transfecção eficaz em condições similares às descritas anteriormente na ausência ou na presença de DOPE, na ausência ou na presença de soro e b) de verificar que a DOPE podia ser substituída por um outro adjuvante tal como por exemplo a 1,2-di-estearoil sn glicerofosfoetanolamina (Avanti 850715), a 1,2-di-fitanoil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850402), a 1,2-di-mitistoil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850745), a 1,2-di-lauroil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850702), a 1,2-di-palmitoil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850705), a 1,2-di-elaidoil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850725), a 1,2-di-palmitoleil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850706) ou a 1,2-di-linoleoil sn glicero-3-fosfoetanolamina (Avanti 850755). L. Análise da dimensão das partículas (seaundo o protocolo descrito em B.

As análises conduzidas por PCS mostram que a dimensão das partículas e a sua agregação dependem fortemente da relação de carga, da estrutura do lípido bem como da presença ou ausência de DOPE.

Os complexos estáveis de 100 a 200 nm foram obtidos de modo reprodutível para uma relação de carga de 10, quando o glicerolípido catiónico está em excesso em relação ao ADN (ver Figuras 2). Os resultados mostram que só os complexos contendo um glicerolípido C18 (pcTG19, pcTG36) apresentam um problema de suspensão, dando lugar a grandes complexos cuja dimensão é variável. Pelo contrário, os lípidos de tipo oleoilo contendo 4 ou 5 cargas (pcTG35, pcTG56) permitem obter complexos de cerca de 200 nm para uma relação de carga de 5. Além disso, mostrámos que uma quantidade equimolar de DOPE aumenta ligeiramente a dimensão das partículas e diminui a tendência que os complexos têm de se agregar num fraca relação de carga (ver Figuras 2A e 2B). A DOPE permite além disso obter um efeito estabilizante para os complexos contendo glicerolípidos C-14 ou C-16 com três grupos amina (Figura 2A); este efeito não é observado para os compostos homólogos contendo quatro funções amina (Figura 2B). A tendência dos complexos para se agregar aumenta consideravelmente para uma relação de carga de 5, sugerindo que as repulsões de cargas é um factor determinante para evitar o fenómeno de agregação. A comparação dos complexos contendo glicerolípidos com ácido gordos de comprimento crescente apresentam diferenças menores entre os derivados C-14, C-16 e oleoilo para uma relação de carga de 10, em particular no caso dos glicerolípidos contendo 4 grupos amina. O número de grupos amina ao nível da 39 extremidade polar dos glicerolípidos contendo oleoilos apresenta um ligeiro efeito sobre a dimensão dos complexos (figura 2C).

Convém além disso notar que os resultados observados para esta técnica de medida da dimensão dos complexos foram confirmados por microscopia electrónica. M. Inieccão intravenosa de complexos de acordo com a invenção

Resumem-se os resultados na figura 3. Sintetizaram-se complexos de acordo com a invenção segundo os métodos descritos anteriormente a partir dos glicerolípidos pcTG35, pcTG56 e pcTG90, na presença de uma quantidade equimolar de DOPE, numa razão de carga fixa de 5, utilizando um plasmídeo contendo o gene da luciferase pcTG11033 (pedido de patente francesa ns 97/08267).

Os ratos utilizados são ratos fêmeas C57BL/6 de 9 a 11 semanas. Efectuam-se as injecções intravenosas na cauda após desinfecção da pele com etanol a 70%. O volume injectado é 200 μΙ e a concentração de ADN é 0,24 mg/ml (concentração em lípidos: 10 mg/ml).

Dois dias após as injecções, os ratos são sacrificados. Após extracção, os tecidos são congelados em azoto líquido e conservados a -80eC. Afim de medir a actividade luciferase, os tecidos são triturados mecanicamente com o auxílio de um pilão num almofariz colocado sobre o vidro de carbono. Adicionam-se 500 μΙ ou 200 μΙ de um tampão de lise (Promega) aos restos de tecidos obtidos a partir dos pulmões e da traqueia, respectivamente, e submetem-se a três etapas de congelação/descongelação. Os restos celulares são eliminados por centrifugação e mede-se a actividade luciferase (em RLU/min, Unidade de luz relativa por minuto) sobre 20 μΙ de sobrenadante conforme as instruções do fornecedor (Promega), adicionando 100 μΙ de reagente e medindo a actividade por luminescência. A actividade luciferase medida é padronizada em relação à quantidade proteica com o auxílio de uma gama padrão realizada a partir de luciferase disponível no comércio (Promega). A quantidade de proteína total é, além disso, determinada pelo método colorimétrico de ácido bicinconínico BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) a partir de uma alíquota de sobrenadante. Isto permite exprimir a actividade luciferase em RLU por miligrama de proteína extraída dos tecidos. 40

Os resultados mostram que a expressão do gene transferidor luciferase nos pulmões, após injecção Intravenosa de complexos contendo um dos três glicerolípidos indicados anteriormente em presença de DOPE, é claramente melhorada em relação à injecção do ADN apenas de um factor de cerca de 15 a 30 vezes. Os valores indicados são valores médios obtidos a partir de 2 a 6 ratos injectados. N. Síntese de glicerolípidos fluorados pcTG69 a pcTG72 1. Síntese de triésteres (ver Figura 4)

Triéster6: Adicionam-se 232 mg (1,12 mmoles) de diciclo-hexilcarbodi-imida em 1 ml de diclorometano a uma solução de di-hidroxiéster 5 (270 mg, 0,37 mmoles), de ácido fluorado 1 (454 mg, 112 mmoles) e de 4-(dimetilamino)piridina (5 mg, 0,038 mmoles) em 4 ml de diclorometano. Realiza-se a reacção sob agitação durante 16 horas à temperatura ambiente. Elimina-se o precipitado por filtração e concentra-se o filtrado sob vácuo e submete-se a uma cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica (eluente: éterrhexano, 4:6, v:v) afim de obter o triéster 6 (275 mg, 48%) sob a forma de um líquido viscoso. 1H RMN (200 MHz, CDCI3): δ 5,25 (m, 1 H, >CH-OC(0)-), 4,40-4,08 (m, 4 H, -CH2-OC(0)-), 3,95 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,55-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,20-1,88 (m, 4 H, -CH2-CF2-), 1,82-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,45, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-), 1,29 (s larga, 28 H, -CH2-). 19F RMN (376 MHz, CDCIa): d -81,6, -115,1, -125,0, -126,5.

Triéster 7: Segundo um protocolo idêntico ao descrito para o triéster 6, obtém-se o triéster 7 (220 mg, 49%) a partir do di-hidroxiéster 5 (170 mg, 0,236 mmoles) e do ácido fluorado 2 (426 mg, 0,707 mmoles). 1H RMN (200 MHz, CDCI3): δ 6,40 (dtt, J = 15,6, 6,9, 2,2 Hz, 2 H, =CH-CF2-), 5,59 (dt, J = 15,6, 12,3 Hz, 2 H, =CH-CH2-), 5,25 (m, 1 H, >CH-OC(0)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,96 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,2 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,20 (m, 4 Η, H alílico), 1,80-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,45, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-), 1,30 (s larga, 20 H, -CH2-). 19F RMN (376 MHz, CDCI3): d -81,3, -111,6, -121,9, -122,4, -123,2, -123,9, -126,6. 41

Triéster 8: Segundo um protocolo idêntico ao descrito para o triéster 6, obtém-se o triéster 8 (230 mg, 47%) a partir do di-hidroxiéster 5 (210 mg, 0,291 mmoles) e do ácido fluorado 3 (441 mg, 0,874 mmoles). 1H RMN (200 MHz, CDCI3): δ 5,25 (m, 1 H, >CH-OC(0)-), 4,40-4,10 (m, 4 H, -CH2-OC(0)-), 3,95 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-C02-), 2,20-1,90 (m, 4 H,-CH2-CF2-), 1,82-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,45, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-), 1,29 (s larga, 28 H, -CH2-). 19F RMN (376 MHz, CDCIs): d -81,3, -114,9, -122,4, -123,2, -124,0, -126,6.

Triéster 9: Segundo um protocolo idêntico ao descrito para o triéster 6, obtém-se o triéster 9 (165 mg, 49%) a partir do di-hidroxiéster 5 (160 mg, 0,222 mmoles) e do ácido fluorado 4 (280 mg, 0,666 mmoles). 1H RMN (200 MHz, CDCI3): δ 5,25 (m, 1 H, >CH-OC(0)-), 4,45-4,08 (m, 4 H, -CH2-OC(0)-), 3,95 e 3,89 (2 m, 2 H, -N(B0C)-CH2-C02-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,37 (m, 4 H, -CH2-C02-), 2,26-1,95 (m, 4 H, -CH2-CF2-), 1,85-1,55 (m, 14 H, -CH2-) 1,45, 1,44, 1,43 e 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-). 19F RMN (376 MHz, CDCI3): d -81,3, -114,9, -122,4, -123,4, -124,1,-126,7. 2. Síntese do pcTG69

Trata-se o triéster 6 (120 mg, 0,079) em 1 ml de diclorometano 3 horas com 16 ml de uma solução de ácido trifluoroacético e diclorometano (1:1, v:v) a 0SC. Adicionam-se 100 ml de hexano e evapora-se a mistura sob vácuo afim de obter uma película que se retoma em éter destilado. Após filtração, obtém-se uma pó branco que se lava com éter e se seca sob vácuo para obter o composto pcTG69 (115 mg, 94%). Pf=205sC. 3. Síntese do pcTG70 O glicerolípido pcTG70 (185 mg, 86%) obtém-se sob a forma de um pó branco a partir do triéster 7 (210 mg, 0,111 mmoles) segundo um processo idêntico ao descrito para o pcTG69. Pf=210eC. 42 4. Síntese do pcTG71 O glicerolípido pcTG71 (141 mg, 90%) obtém-se sob a forma de um pó branco a partir do triéster 8 (150 mg, 0,089 mmoles) segundo um processo idêntico ao descrito para o pcTG69. Pf=2209C. 5. Síntese do dcTG72 O glicerolípido pcTG72 (87 mg, 92%) obtém-se sob a forma de um pó branco a partir do triéster 9 (90 mg, 0,06 mmoles) segundo um processo idêntico ao descrito para o pcTG69. Pf=220sC.

Estes compostos fluorilados correspondem à armadura do pcTG35 (4 grupos aminados) com uma cadeia policabonada de dimensão variável (C11, C15, C17 ou C19 insaturada). Eles foram sintetizados segundo o método de injecção com etanol. O. Transfeccão in vitro dos complexos contendo compostos fluorilados

Estudou-se a eficácia dos complexos formados segundo o método anteriormente descrito com os compostos fluorados (ver exemplo N) sobre uma cultura de células A549 segundo a técnica descrita no exemplo I. As relações de cargas testadas são escolhidas entre as relações 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,8 (ver figuras 5A a G). Os ensaios foram igualmente realizados na ausência ou na presença (indicado nas figuras por sor.) de soro ou de DOPE e para diferentes quantidades de ADN (0,1, 0,5 2 ou 4 pg). Os resultados (figuras 5 A a G) mostram que: - o pcTG69 (Figura 5C) permite observar, nas condições testadas, taxas de expressão da luciferase comparáveis às obtidas com os compostos análogos não fluorados de C14 ou C16. Além disso, outros resultados não mostrados na figura 5, mostraram que os melhores resultados eram obtidos com o pcTG69 com uma relação de cargas de 2,5, na presença ou na ausência de DOPE ou de soro, - o pcTG72 (Figuras 5A e B) permite obter taxas de transfecção satisfatórias para uma relação de carga de 10, na presença ou na ausência de DOPE ou de soro; pelo contrário, para uma relação de cargas de 1,25 ou 0,8, constata-se que a presença de DOPE é um 43 factor que permite melhorar a taxa de transfecção, especialmente na presença de quantidade de ADN superiores a 0,1 μς, - o pcTG71 (Figuras 5D e E) só permite obter taxas de transfecção convenientes na ausência de DOPE, para relações de carga de 1,25, 0,8 ou 10, em particular para quantidades de ADN superiores a 0,5 μg. Nas condições testadas, as transfecções na presença de DOPE não parecem afectadas pela presença de soro no meio, - o pcTG70 (Figuras 5F e G): para as relações de cargas de 10 ou 5, as taxas de transfecção observadas são eficazes, na presença ou na ausência de DOPE ou de soro. Pelo contrários, para relações de cargas mais fracas (1,25 ou 0,8), a presença de DOPE parece necessária.

Lisboa, 13 SET. ?000 Por TRANSGENE S.A.

eng? manuel pyigmmk Agente Oficial da Propriedade Industrial Arco de Conceição, 3,11- 1100 LISBOA.

Claims (47)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I: ÇHz-O-Rt (JH-ORj CHz-X-C-CHz-C-N-CCHOm-VNHz O H na qual: R1t R2l idênticos ou diferentes, são radicais alquilo ou alcenilo C6-C23, lineares ou ramificados, ou radicais alquilo -C(=0)-(C6-C23) ou alcenilo -C(=0)-(C6-C23), lineares ou ramificados, X é um átomo de oxigénio ou um radical amino -NR3) sendo R3 um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, n é um número inteiro positivo de 1 a 6, m é um número inteiro positivo de 1 a 6 e quando n > 1, m pode ser idêntico ou diferente.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1t R2, idênticos ou diferentes, serem radicais alquilo -C(=0) lineares ou alcenilo -C(=0)- lineares.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por R1t R2, idênticos ou diferentes, serem radicais alquilo -C(=0) ou alcenilo -C(=0)-compreendendo de 12 a 20 átomos de carbono.
4. 4. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por n ser um número inteiro escolhido entre os números 2, 3 ou 4.
5. 5. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por m ser um número inteiro escolhido entre os números 2, 3 ou 4. 1
6. 6. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser além disso conjugado com um ou vários elementos de alvejamento por intermédio de pelo menos a) um dos átomos de carbono, em particular escolhidos entre os presentes nos grupos Ri, R2 e/ou R3 ou b) um dos átomos de azoto secundário ou primário da cadeia poliamina.
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido elemento de alvejamento ser escolhido entre o grupo consistindo no todo ou em parte de açúcares, de péptidos, de oligonucleótidos, de lípidos, de hormonas, de vitaminas, de antigenes, de anticorpos, de ligandos específicos de receptores membranários, de iigandos susceptíveis de reagir com um anti-ligando, de péptidos fusogénicos, de péptidos de localização nuclear ou de uma combinação desses compostos.
8. 8. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por estar sob forma catiónica.
9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8 sob forma catiónica, caracterizado por uma ou várias aminas serem substituídas por um do(s) radical(ais) metilo ou etilo.
10. 10. Composto de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado por comportar de 2 a 7 cargas positivas, mais particularmente de 3 a 5, e preferencialmente 5.
11. 11. Composto de acordo com uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por ser escolhido no grupo consistindo pelos compostos de fórmula seguinte:

    II n=2 pcTG18 ou n=3 pcTG33 2

    n=2 pcTG19 ou η=3 pcTG36 IV

    n=2 pcTG20 ou n=3 pcTG35 ou n=4 pcTG56 V C18:lf[tis]-9 o

    VI n=2 pcTG22 ou n=4 pcTG90 3
12. 12. Composição caracterizada por compreender pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações precedentes e eventualmente pelo menos um adjuvante capaz especialmente de melhorar a formação de complexo entre o referido composto e uma substância activa.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o referido adjuvante ser um lípido neutro ou zwiteriónico.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o referido lípido neutro ou zwiteriónico ser ou derivar de um triglicérido, de um diglicérido, do colesterol, de uma fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina, fosfocolina, esfingomielina, ceramida ou cerebrósido.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o referido lípido neutro ou zwiteriónico ser a dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE).
16. 16. Composição de acordo com as reivindicações 12 a 15, caracterizada por a relação em peso composto/adjuvante estar compreendida entre 0,1 e 10.
17. 17. Complexo compreendendo pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 8 a 11 ou pelo menos uma das composições de acordo com as reivindicações 12 a 16 e pelo menos uma substância activa, especialmente terapeuticamente, comportando pelo menos uma carga negativa.
18. 18. Complexo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida substância activa ser escolhida entre os ácido nucleicos e as proteínas.
19. 19. Complexo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida substância terapeuticamente activa ser um ácido nucleico escolhido entre o grupo consistindo num cADN, um ADN genómico, um ADN plasmídico, um polinucleótido antisens, um ARN mensageiro, um ARN ribossómico, um ribózimo, um ARN de transferência ou um ADN codão para esses ARN. 4
20. 20. Complexo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o referido ácido nucleico compreender um gene de interesse e elementos que permitem a expressão do referido gene de interesse.
21. 21. Complexo de acordo com uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado por apresentar uma dimensão inferior a 500 nm, vantajosamente inferior a 200 nm.
22. 22. Complexo de acordo com uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado por apresentar uma dimensão inferior a 100 nm.
23. 23. Complexo de acordo com uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado por a relação entre o número de cargas positivas do ou dos compostos e/ou composições catiónicas e o número de cargas negativas da referida substância activa variar de 0,5 a 20, mais particularmente de 0,1 a 15 e de preferência de 5 a 10.
24. 24. Processo de preparação de um complexo de acordo com as reivindicações 17 a 23, caracterizado por ser colocado em presença de um ou vários compostos de acordo com uma das reivindicações 8 a 11 e/ou pelo menos uma composição de acordo com uma das reivindicações 12 a 16 com uma ou várias substâncias activas, comportando pelo menos uma carga negativa, e por se recuperar o referido complexo, eventualmente após uma etapa de purificação.
25. 25. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por os referidos compostos e/ou composições serem anteriormente colocados em solução num solvente miscível com água, especialmente o etanol ou o dimetilsulfóxido ou uma mistura dos dois.
26. 26. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por os referidos compostos e/ou composições serem anteriormente colocados em suspensão numa solução de detergente.
27. 27. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se proceder além disso a uma etapa de purificação do referido complexo por diálise. 5
28. 28. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por os referidos compostos e/ou composições serem anteriormente submetidos a uma etapa de sonicação/extrusão.
29. 29. Complexo caracterizado por ser susceptível de ser obtido por um processo de acordo com uma das reivindicações 25 a 28.
30. 30. Utilização de um composto de acordo uma qualquer das reivindicações 1 a 11, de uma composição de acordo uma qualquer das reivindicações 12 a 16, de um complexo de acordo uma qualquer das reivindicações 17 a 23, para a preparação de uma composição para transferir pelo menos uma substância activa, especialmente terapeuticamente, em particular um ácido nucleico, para células alvo in vitro, ex vivo ou in vivo, mais particularmente in vivo.
31. 31. Utilização de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por a referida célula alvo ser uma célula de mamífero.
32. 32. Utilização de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por a referida célula alvo ser seleccionada entre uma célula muscular, uma célula de estirpe hematopoiética, uma célula das vias aéreas, mais particularmente uma célula traqueal ou pulmonar.
33. 33. Processo de transferência in vitro de uma substância terapeuticamente activa para uma célula alvo, caracterizado por se pôr em contacto a referida célula com um complexo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 23.
34. 34. Complexo de acordo com uma das reivindicações 17 a 23 ou 29, a título de medicamento, com fim curativo, preventivo ou vacinai.
35. 35. Complexo de acordo com a reivindicação 34 para a realização de um método de tratamento terapêutico consistindo em transferir pelo menos uma substância terapeuticamente activa, especialmente um ácido nucleico, para células alvo.
36. 36. Complexo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por a referida célula alvo ser uma célula de mamífero. 6
37. 37. Complexo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a referida célula alvo ser seleccionada entre uma célula muscular, uma célula de estirpe hematopoiética, uma célula das vias aéreas, mais particularmente uma célula traqueal ou pulmonar, uma célula do epitélio respiratório.
38. 38. Utilização de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, de uma composição de acordo uma qualquer das reivindicações 12 a 16, de um complexo de acordo uma qualquer das reivindicações 17 a 23, para a preparação de um medicamento com fim curativo, preventivo ou vacinai destinado ao tratamento do corpo humano ou animal, especialmente por terapia génica.
39. 39. Utilização de acordo com a reivindicação 38, caracterizada por o medicamento ser destinado a ser administrado por injecção intramuscular, por inalação, por injecção intraqueal, por instilação, por aerossolização, por via tópica ou por via oral
40. 40. Preparação farmacêutica caracterizada por compreender pelo menos um complexo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 23 ou 29.
41. 41. Preparação de acordo com a reivindicação 40, caracterizada por compreender além disso pelo menos um adjuvante capaz de melhorar o poder de transfecção do referido complexo.
42. 42. Preparação de acordo com a reivindicação 41, caracterizada por o referido adjuvante ser escolhido entre o grupo consistindo na cloroquina, num composto polar prótico especialmente escolhido entre o propilenoglicol, o polietilenoglicol, o glicerol, o etanol, o 1-metil-L-2-pirrolidona ou seus derivados, ou num composto polar aprótico especialmente escolhido entre o dimetilsulfóxido (DMSO), o dietilsulfóxido, o di-n-propilsulfóxido, a dimetilsulfona, o sulfolano, a dimetilformamida, a dimetilacetamida, a tetrametilureia, o acetonitrilo ou seus derivados.
43. 43. Preparação de acordo com uma das reivindicações 40 a 42, caracterizada por compreender além disso um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico permitindo a sua administração ao homem ou ao animal. 7
44. 44. Célula transfectada por um complexo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 23 ou 29 e 35.
45. 45. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, composição de acordo uma das reivindicações 12 a 16, complexo de acordo uma das reivindicações 17 a 23 ou 29, caracterizado por Ri e/ou R2 ser fluorado.
46. 46. Composto, composição ou complexo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por o número de átomos de carbono fluorados sobre Ri e/ou R2 poder variar de 1 a 12, mais particularmente de 4 a 8.
47. 47. Composto, composição ou complexo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por R-ι e/ou R2 serem radicais alquilo de 15 carbonos e por o número de átomos de carbono fluorados sobre as cadeias Ri e/ou R2 ser 4. Lisboa, 13 SET, 2000

    Agente Oficial da Propriedade Industrial Arco da Conceição. 3« 1! - 1100 LISBOA Γ 8 RESUMO COMPOSTOS GLICEROLIPÍDICOS ÚTEIS PARA A TRANSFERÊNCIA DE UMA SUBSTÂNCIA ACTIVA PARA UMA CÉLULA ALVO CH2-0-R, I CH- 0-R2 I CH2-X- Ç-CH2-(-N-(CH2)m-) n-NH2 A invenção refere-se a novos compostos de fórmula (I) na qual: R! e R2, idênticos ou diferentes, são radicais alquilo ou alcenilo C6-C23, lineares ou ramificados, ou radicais alquilo -C(=0)-(C6-C23) ou alcenilo -C(=0)-(C6-C23), lineares ou ramificados. X é um átomo de oxigénio ou um radical amino -NR3, sendo R3 um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo inferior de 1 a 4 átomos de carbono; n é um número inteiro positivo de 1 a 6; m é um número inteiro positivo de 1 a 6; e quando n > 1, m pode ser idêntico ou diferente. Ela refere-se igualmente a novos complexos de compostos de acordo com a invenção e a substância activas, especialmente terapeuticamente, comportando pelo menos uma carga negativa que permite a introdução das referidas substâncias activas nas células. Ela refere-se especialmente a novos complexos cuja substância activa consiste num ou mais ácidos nucleicos para transfecção das células.