JP2000510869A

JP2000510869A - 標的細胞への活性物質の移入に有用なグリセロ脂質

Info

Publication number: JP2000510869A
Application number: JP10533896A
Authority: JP
Inventors: ビショフ、レネール; エスレール、ドニ; ナージ、アブデスラーム
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-10
Publication date: 2000-08-22
Also published as: CA2251999A1; DE69800178D1; US6218370B1; GR3034317T3; EP0901463B1; DK0901463T3; US6743781B2; EP0901463A1; FR2759382A1; PT901463E; DE69800178T2; ES2149043T3; ATE193886T1; AU727204B2; US20010036927A1; WO1998034910A1; AU6626698A

Abstract

(57)【要約】本発明は、式(I) （上記式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ₆〜Ｃ₂₃の線状または分岐状のアルキルまたはアルケニル基、または基−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₃）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₃）アルケニルであり、Ｘは、酸素原子またはアミノ基-ＮＲ₃であり、Ｒ₃は水素原子であるかまたは１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル基であり、ｎは、１〜６の正の整数であり、ｍは、１〜６の正の整数であり、ｎ＞１であるときには、ｍは同一であるかまたは異なるものであることができる）の新規な化合物に関する。本発明は、上記化合物と、特に治療上では上記活性物質を細胞に挿入するための少なくとも１個の陰電荷を含んでなる活性物質の新規な組成物にも関する。本発明は、詳細には、活性物質が細胞トランスフェクションに有用な１〜数個の核酸からなる新規な複合体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】標的細胞への活性物質の移入に有用なグリセロ脂質本発明は、新規なグリセロ脂質化合物およびそれらを含む新規組成物に関する。更に具体的には、本発明は、活性物質、特に陰電荷、特にポリヌクレオチドを含んでなる治療活性物質を標的細胞、特に脊椎動物、更に具体的には哺乳類細胞に移入させるためのベクターの使用に関する。遺伝子の所定の細胞への移入は、遺伝子治療の正に基本である。この新規な技術は、その応用分野は広く、通常の治療法が余り有効でなくまたは治療法が存在しない重篤な疾患の治療を想定することができ、遺伝的原因（血友病、嚢胞性線維症、ミオパシーなど）または後天的原因（癌、ＡＩＤＳなど）のいずれの疾患にも適用される。この３０年間に、様々な異種遺伝子を細胞、特に哺乳類細胞に導入する多くの手段が開発されてきた。これらの様々な技術は、２つの範疇に分類することができる。第一の範疇は、マイクロインジェクション、電気穿孔、または粒子衝撃のような、有効ではあるが、ほとんどがイン・ビトロでの応用に限定されかつその実行が面倒でありしかも細心の注意を要する物理的手法に関するものである。第二の範疇は、移入される遺伝子を、生物学的または合成的性状のベクターであって、上記材料の導入を促進するものと組み合わせてなる分子および細胞生物学に関する手法を包含する。現在、最も効果的なベクターは、ウイルス、特にアデノウイルスまたはレトロウイルスベクターである。開発された手法は、これらのウイルスが、細胞膜を横切り、その遺伝子材料の分解を免れ、そのゲノムを核中に浸透させるために有する天然の特性に基づいている。これらのウイルスは、既に多くの研究の主題となっており、それら幾つかは既に、例えばワクチン接種、免疫治療、または遺伝子欠損を補うことを意図した治療の目的でヒトの遺伝子についてのベクターとして実験的に用いられている。しかしながら、このウイルス法には、特にウイルスゲノム中へのクローニング容量が限定されており、宿主生物および環境中での産生された感染性粒子が広がる危険性、レトロウイルスベクターの場合に宿主細胞中への挿入による人工的突然変異誘発の危険性、および治療処理の際のイン・ビボでの免疫および炎症応答の強く誘導され、想定され得る投与数がかなり限定されるので、多くの制限がある(McCoy et al.，1995，Human Gene Therapy，6，1553 -1560;Yang et al.，1996，Immunity，1，433-442)。特にヒトでの使用に関してこれら多くの不都合があるため、幾つかの研究チームはポリヌクレオチドにより移入するための代替系を開発している。幾つかの非ウイルス法が現在用いられている。例えば、リン酸カルシウムによる共沈、ウイルス系を模倣するレセプターの使用（総説については、Cotten and Wagner，1993，Current Opinion in Biotechnology，4,705-710）、ポリアミドアミンのようなポリマー（Haensler and Szoka，1993，Bioconjugate Chem.，4 ，372-379）、または樹枝状ポリマーの使用を記載しているＷＯ９５／２４２２１号公報、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミンの使用を記載しているＷＯ９６／０２６５５号公報、およびポリリシンの接合体の使用を記載しているＵＳ−Ａ−５，５９５，８９７号公報およびＦＲ２，７１９，３１６号公報に記載されているようなポリマーの使用を挙げることができる。他の非ウイルス的手法は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはある種の薬学活性物質のようなある種の生物学的高分子の細胞中に導入することができる薬剤としての重要性が文献に詳細に記載されているリポソームの使用に基づいている。この目的に対して、幾つかの研究チームは、細胞膜および／または核酸に高親和性を有するカチオン性脂質の使用を既に提案している。実際に、核酸の場合には、この種の高分子はイン・ビボである種の細胞の血漿膜を通過できることが示されているが（ＷＯ９０／１１０９２号公報）、特に核酸がポリアニオン性であるためそれ自身は真の明確な陰電荷を有する細胞膜を越えて核酸の通過が妨げられるため、観察されるトランスフェクション効率は未だ著しく制限されていることが問題である。１９８９年(Felgner et al.，Nature，337，387-388)以来、カチオン性脂質は核酸のような大きなアニオン性分子のある種の細胞への導入を促進するのに有利な分子として提供されてきた。これらのカチオン性脂質は、アニオン性分子と複合体形成することができ、これにより分子上の陰電荷が中和され、細胞へのそれらの接近が促進されやすくなる。多くの研究チームが、既に様々なカチオン性脂質を開発している。例えば、ＤＯＴＭＡ(Felgner et al.，1987，PNAS，84，741 3-7417)、ＤＯＧＳまたはTransfectam（商品名）(Behr et al.，1989，PNAS,86 ，6982-6986)、ＤＭＲＩＥおよびＤＯＲＩＥ(Felgner et al.，1993，Methods， 5，67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao et Huang，1991，BBRC，179，280-285)、ＤＯＴＡＰ（商品名）(McLachlan et al.，1995，Gene Therapy，2，674-622)、またはLipofectamine（商品名）、並びに特許出願ＷＯ９１１６０２４号またはＷＯ９５１４６５１号明細書に記載されているものが挙げられる。更に具体的には、出願ＷＯ９４０５６２４号公報には、（式中、Ｒ基は、特にオクタデセニル基であり、Ｚ基はＣ₁〜Ｃ₁₃アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₁〜Ｃ₁₃）アルキルまたはアシル基であり、ｑは１〜６の整数であり、Ｘは、特にスペルミン、スペルミジン、カルボキシスペルミンまたはポリリシンのような短鎖ポリアミンである）のカチオン性脂質が記載されている。出願ＥＰ６８５４５７号およびＥＰ６８５２３４号公報には、特に、式（式中、Ｒは、特に１０〜３０個の炭素原子を有する飽和または不飽和の炭化水素鎖であり、Ａは、特に群−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−および−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−から選択することができ、ｎは０〜４の範囲で変化し、Ｒ₁は第一アミンが２〜８個の炭素原子を有するアルキルで置換されているアルキルまたは短鎖アミノアルキルである）のカチオン性化合物が記載されている。これらの化合物は低溶血活性を有し、イン・ビトロでＨｅｌａＳ３細胞に成長阻害剤として作用することができる二本鎖ＲＮＡを導入することができる。出願ＤＥ１９５２１４１２号公報には、非極性部分と式（式中、ｐは１〜６の範囲で変化し、ｑは０〜２の範囲で変化し、Ｒは飽和または不飽和のＣ（＝Ｏ）−Ｃ１〜２３またはＣ１〜２３であり、Ｚはペプチド、アミノ酸または分岐アミノ構造である）の極性部分も含んでなる化合物が記載されている。これらのカチオン性化合物は、培養中の細胞のイン・ビトロでのトランスフェクションもできる。しかしながら、幾つかの研究（例えば、Mahato et al.，J．Pharm．Sci.,1995 ，84，1267-1271;Thierry et al.，1995，P.N.A.S.，92，9742-9746を参照されたい）では、アニオン性高分子の細胞中への移入効率は、特に複合体と細胞膜との相互作用、カチオン性化合物の脂質組成物、アニオン性分子で形成された複合体の大きさ、更に詳細には上記複合体の様々な成分についての陽電荷と陰電荷の比率によって変化することが示されている。特に、複合体と細胞膜とが相互作用、および複合体を細胞中へ移入できる機構は、未だほとんど理解されておらず、研究者らは極めて経験的な方法に基づいて研究を進めている。従って、恐らくは、改良された特性、または既に記載されているカチオン性脂質とは異なる特性を有する他のカチオン性脂質を提供することが望ましい。本出願人は、カチオン性形態で提供することができ、遺伝子治療に関して特にイン・ビボで用いることができると思われる、特に、陰電荷を含んでなる活性物質、特にポリヌクレオチドを標的細胞に移入するのに有用な新規なグリセロ脂質化合物を同定した。従って、本発明の主題は、まず第一に、下記式で表わされる化合物に関する。（上記式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であるかまたは異なるものであり、６〜２３個の炭素原子を有する（Ｃ₆〜Ｃ₂₃と表示）線状または分岐状のアルキルまたはアルケニル基、または基−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₃）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₃）アルケニル、または更に詳細には線状または分岐状の−Ｃ(=Ｏ)−（Ｃ₁₂−Ｃ₂₀）アルキルまたは−Ｃ(=Ｏ)−（Ｃ₁₂−Ｃ₂₀）アルケニル、場合によって繰返しを有する線状または分岐状の、場合によって置換したアリール基、シクロアルキル基、フルオロアルキル基、オキシエチレン、またはオキシメチレン基であり、Ｘは、酸素原子またはアミノ基−ＮＲ₃であり、Ｒ₃ は水素原子であるかまたは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは、１〜６、好ましくは２〜４の正の整数であり、ｍは、１〜６、好ましくは２〜４の正の整数であり、ｎ＞１であるときには、ｍはこのｎと同一であるかまたは異なるものであることができる）「アルケニル」という用語は、問題の炭素鎖が、この鎖に沿って１個以上の二重結合を含むことができることを表すことを意図するものである。本発明の具体的な例において、この化合物は、Ｒ₁およびＲ₂はフッ素化されており、すなわちポリカーボン鎖の少なくとも１個の炭素がフッ素化基によって置換されていることを特徴とする。このような分子の例は、実施例Ｎで提供される。この具体例には、それぞれの鎖Ｒ₁およびＲ₂上のフッ素化炭素原子の数は１〜１２、更に詳細には４〜８の間で変化することができ、好ましくは４である。有利な場合によれば、Ｒ₁および／またはＲ₂は１５個の炭素原子を有するアルキル基であり、フッ素化炭素原子の数は関連した鎖Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれについて４である。鎖Ｒ₁および／またはＲ₂上に存在するフッ素化基の数は、特に１〜２３の間で変化することができ、更に詳細には９〜１７であり、好ましくは９である。本発明による化合物は、更に置換されていてもよい。このような置換は、特に、例えば細胞標的分子または固定分子をイン・ビトロまたはイン・ビボで投与した後に、本発明の化合物またはそれらを含む複合体の分布を可視化することができる標識分子（例えば、米国特許第４，７１１，９５５号公報の標識分子を参照されたい）を含んでなることがある。従って、本発明は、少なくともａ）炭素原子の一つであって、特に基Ｒ₁、Ｒ₂および／またはＲ₃上に存在するものから選択されるもの、またはｂ）ポリアミン鎖の第二または第一窒素原子の一つの介在により１個以上の標的形成成分と接合した上記のような化合物に関する。このような成分は、特定の細胞の種類を標的とし、細胞中への浸透、エンドソームのリーシスあるいは細胞内輸送を促進することができ、文献に広汎に記載されている。それらは、例えば、糖、ペプチド（ＧＲＰペプチド、ガストリン放出ペプチドなど）、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜レセプターに特異的なリガンド、抗リガンドと反応することができるリガンド、フソゲニックペプチド(fusogenic peptides)、核局在化ペプチド、またはこのような化合物の組み合わせの全部または一部であることができる。更に詳細には、肝細胞の表面のアシアロ糖タンパク質レセプターを標的とすることができるガラクトシル残基、インフルエンザウイルス赤血球凝集素サブユニットから誘導されたフソゲニックペプチドＩＮＦ−７(Plank et al.，1994，J．Biol．Chem.，269，1291 8-12924)、またはＳＶ４０ウイルスＴ抗原から誘導された核局在化シグナル(Lan ford and Butel，1984，Cell，37，801-813)、またはEpstein BarrウイルスＥＢＮＡ−１タンパク質(Ambinder et al.，1991，J．Virol.，65，1466-1478)を挙げることができる。このような接合体は、文献に広汎に記載されている手法によって、更に詳細には、特にポリアミンに対するトリフルオロアセチル、ＦｍｏｃまたはＢｏｃのような保護基を用いる化学カップリングによって容易に得ることができる。次に、保護基の選択的脱保護により、標的形成成分をカップリングできるようにした後、グリセロ脂質を脱保護する。しかしながら、ＣＨまたはＣＨ₂基における炭素原子のような非反応性基の置換は、本発明の化合物の合成中に当業者に知られている方法によって行なわれ、一方、第一または第二アミンのような反応性基は、本発明の新たに合成されたグリセロ脂質での置換の主題となることがある。本発明の有利な場合によれば、上記化合物はカチオン性形態、すなわちポリアミン鎖上に存在する１個以上の窒素原子にプロトンが結合することによってプロトン化された形態である。この場合には、上記のカチオン性グリセロ脂質を、例えばトリフルオロアセテート、ハロゲン化物、モノメチルスルフェート、アセテートまたはホスフェート、ヨウ化物、塩化物、または臭化物アニオンなどのような１個以上の生物学的に許容可能なアニオンと組み合わせる。カチオン性形態での化合物を、アミンを例えばメチルまたはエチル基などで置換することによって得ることも可能である。本発明による化合物は、２〜７の陽電荷、更に詳細には３〜５、好ましくは５の陽電荷を含んでなる。ＤＮＡに対するポリアミンの親和性は、特にこのポリアミン上に存在するアミン官能基の数によって変化することが示されている(Braul in，W.H.，Strick，T.Y.，and Record，M.T.，Jr．(1982)Biopolymers 21，1301 -1314)。更に、エンドサイトーシスによるそれらの細胞中への浸透の後、ＤＮＡとカチオン性脂質化合物との間に形成された複合体はエンドソームに位置し、ＤＮＡはｐＨ依存性のヌクレアーゼの作用によって分解されることがある。トランスフェクション効率に影響を与えるこの現象に逆らうため、例えばクロロキンであって、ｐＨ５．５におけるその緩衝容量によりトランスフェクションの改良を観察することができるようなリソソーム刺激化合物(lysosomotropic agents)を用いることが可能である。しかしながら、このような化合物の効率は体系的ではなく、負の例として、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、リポスペルミンまたはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）のデンドリマー(dendrimers)の場合を挙げることができる。更に、高投与量でのクロロキンを使用すると、毒性の危険性を示すことがある。本発明によれば、これらの化合物は、リソソーム刺激分子と同様な効果を得ることができるポリアミンヘッドを有する。従って、これらの化合物の明確な利点により、イン・ビボでの応用にクロロキンの使用が回避されることである。本発明の好ましい態様によれば、上記化合物は、下記の式からなる群から選択される。ｎ＝２ｐｃＴＧ、またはｎ＝４ｐｃＴＧ９０これらのカチオン性化合物は、例えば、式（上記式中、Ｒ₄およびＲ₅は、特に一緒になってイソプロピリデン基を形成する保護基であり、Ｘは、式Ｉにおけるものと同じ意味を有する）の化合物を、式（式中、ｍおよびｎは、式Ｉにおけるものと同じ意味を有し、Ｒ₆は、保護基、特に第三ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である）の酸と反応させることによって調製することができる。次に、官能基Ｏ−Ｒ₄および−Ｏ−Ｒ₅を脱保護して、基Ｒ₁およびＲ₂を既知の方法でエステル化またはエーテル化することによって結合させる。得られた化合物を、トリフルオロ酢酸の存在下で脱保護する。式VIIＫ酸を、既知の方法で調製する。ｍ＝３、ｎ＝２または３である本発明の化合物の場合には、下記の実施例を参照することにより、合成の実際の様式を知ることができる。公知の方法は、一般に当業者の能力の範囲内における修正をうけ、本発明による化合物の合成に応用可能である。しかしながら、本発明の化合物は、上記の製造の様式によって得られたものに限定されない。もう一つの態様によれば、本発明は、少なくとも１個の上記化合物と、場合によっては、上記化合物と活性物質との間の複合体の形成を増強またはこれらの複合体の細胞に対する機能を増強することができる少なくとも１個のアジュバントを含んでなる組成物にも関する。好ましくは、このようなアジュバントは、中性または双性イオン性脂質であって、例えばトリグリセリド、ジグリセリド、コレステロールであるかまたはこれらから誘導されるもの（例えば、米国特許第５，４３８，０４４号公報を参照）、特にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシドであるかまたはこれらから誘導される中性または双性イオン性脂質である。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を選択するのが有利である。本発明の化合物と中性または双性イオン性脂質との重量比は、通常は０．１〜１０であり、この比は考察した成分の性状によって変化することがあることが理解される。当業者は、これらの小さな修正を行なうための十分な知識を有している。中性および／または双性イオン性脂質の混合物を用いることも可能である。本発明は、更に上記の少なくとも１個の化合物または少なくとも１個の組成物と、少なくとも１個の陰電荷を含んでなる少なくとも１個の活性物質、特に治療活性物質を含んでなる複合体にも関する。本発明の変法によれば、上記複合体は、更に例を上記に挙げた文献記載のもののような１個以上のカチオン性の両性化合物を含むこともできる。一般に、治療活性物質であって、特に遺伝子治療に関して用いることができるものが用いられる。具体的態様によれば、上記活性物質は、核酸およびタンパク質から選択される。好ましくは、本発明による複合体の活性物質は、ポリヌクレオチドであり、上記化合物または上記組成物により、次に細胞のポリヌクレオチドのトランスフェクション力を増強することが可能となる。「ポリヌクレオチド」は、二本鎖または一本鎖の、線状または環状の、天然の単離されたまたは合成のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を示し、修飾されたまたはされていない（例えば、米国特許第５，５２５，７１１号公報を参照されたい）、標識されたまたはされていない（例えば、米国特許第４，７１１，９５５号公報または欧州特許第３０２１７５号公報を参照されたい）ヌクレオチドの正確な連続を表し、これにより大きさの制限なしに核酸の断片または領域を定義することができるものと理解される。ポリヌクレオチドは、特にｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボチーム、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、またはこのようなＲＮＡをコードするＤＮＡを表すことが理解される。「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本出願に関しては同義語である。本発明の特定の態様によれば、上記ポリヌクレオチドは、関心のある遺伝子とその関心のある遺伝子を発現することができる成分とを含んでなる。この態様では、上記ポリヌクレオチドは、プラスミドの形態であるのが有利である。発現を行なう成分は総て、上記ＤＮＡ断片をＲＮＡへの転写（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、およびｍＲＮＡをポリペプチドへの翻訳を行なう成分である。それらは、特に上記細胞で有効なプロモーター配列および／または制御配列であり、場合によっては標的細胞の表面で上記ポリペプチドの排出または発現を行なうのに要する配列である。例えば、ウイルスＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたはワクシニアウイルスの７．５ｋのプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子のプロモーター、アクチン、または肺界面活性剤のようなプロモーターを挙げることができる。更に、所定の細胞型に特異的なまたは定義された条件下で活性化することができるプロモーター配列を選択することができる。文献は、このようなプロモーター配列に関して多量の情報を提供している。更に、上記ポリヌクレオチドは、少なくとも２個の配列であって、同一であるかまたは異なるものであり、転写プロモーター活性を示すもの、および／または少なくとも２個のコードＤＮＡ配列であって、同一であるかまたは異なるものであり、互いに対して隣接して、転写プロモーターが機能するか、または上記配列の転写が影響されない限り同方向でまたは反対方向で離れて位置しているものを含んでなることがある。同様に、この種の核酸構築物に「中性」核配列またはイントロンであって、転写に影響せずかつ点遮断階の前にスプライシングされるものを導入することが可能である。このような配列およびそれらの使用は、文献に記載されている。上記ポリヌクレオチドは、細胞内輸送、複製および／または組込みに要する配列も含むことができる。このような配列は、当業者に周知である。更に、本発明によるポリヌクレオチドは、修飾されてそれらが標的細胞のゲノムに組込むことができなくなったポリヌクレオチド、または例えばスペルミンのような化合物によって安定化されたポリヌクレオチドであることもできる。本発明に関して、ポリヌクレオチドは標的細胞に対して同種であることも、異種であることもある。ポリペプチド、特に治療または予防活性を有するポリペプチド、更に詳細には細胞または体液型の免疫原活性の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを用いるのが有利なことがある。ポリヌクレオチドという用語は、その大きさまたはその修飾の程度（例えば、グリコシル化）については制限がないと考えられる。例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、膜レセプター、構造ポリペプチド、膜チャンネルを形成するポリペプチド、輸送ポリペプチド、接着分子、リガンド、転写、翻訳、複製または転写体の安定化の制御因子、または抗体をコードするいてて、例えばＣＦＴＲタンパク質、ジストロフィン、因子VIIIまたはIX、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７、ＭＵＣ１、ＢＲＡＣ１、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）２、ＩＬ−４、ＩＬ −６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α型、ＧＭ-ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）をコードする遺伝子、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ｔｋ遺伝子、網膜芽腫またはｐ５３、または免疫グロブリンの全部または一部、例えば断片Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、またはアンチイディオタイプに関連した遺伝子（米国特許第４，６９９，８８０号公報）が挙げられる。このリストは、制限的なものでないことは勿論であり、他の遺伝子も用いられる。好ましい態様によれば、本発明の複合体は、大きさが小さい（５００ｎｍ未満、有利には２００ｎｍ未満であり、好ましくは１００ｎｍ未満）。更に、行なったトランスフェクション実験は、本発明による脂質化合物対ポリヌクレオチドの重量比は０．０１〜１００であることを示している。最適比は０．０５〜１０である。本発明は、少なくとも１個の陰電荷を含んでなる複合体であるカチオン性化合物／活性物質の製造法であって、本発明による１個以上の化合物または組成物を少なくとも１個の陰電荷を含んでなる１個以上の活性物質と接触させ、上記複合体を、場合によっては精製段階の後に回収することを特徴とする方法にも関する。第一の変法による第一の場合には、１種類以上のカチオン性化合物を、水と混和性の溶媒または溶媒の混合物、特にエタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または好ましくは１：１（ｖ：ｖ）エタノール／ＤＭＳＯ混合物の適量で溶解し、特許出願ＷＯ−Ａ−９６０３９７７号明細書などに記載の既知の方法に従って脂質凝集体を形成させ、または第二の変法により、ｎ−オクチル−β− Ｄ−グルコピラノシドまたは６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−メチル− α−Ｄ−グルコピラノシドのようなオクチルグルコシドのような洗剤の溶液の適量で懸濁させる。次に、懸濁液を、陰電荷を含んでなる活性物質の溶液と混合することができる。最終複合体に中性または双性イオン性脂質が含まれていることがしょもうな場合には、フィルムを既知の方法で成形した後、水と混和性の溶媒または洗剤の溶液に溶解させ、混合物が上記カチオン性化合物および上記中性または双性イオン性脂質、例えばＤＯＰＥを含むようにする。この方法の重要な特徴の一つは、カチオン性脂質の陽電荷と活性物質の陰電荷との比の選択にある。特定の比に限定しようとするものではないが、様々な電荷の量を選択して、カチオン性化合物または組成物の陽電荷の数と、活性物質の陰電荷の数の比を０．０５〜２０、特に０．１〜１５、好ましくは５〜１０となるようにする。このような比に到達するための計算は、活性物質によって支持された陰電荷と上記の比を満足するのに要する化合物の量が調整されることを考慮している。他の化合物についての量および濃度は、それぞれのモル質量と陽電荷および／または陰電荷の数によって調整される。この電荷の比も、本発明による複合体の有利な特徴を構成する。第二の変法の場合に、場合によっては、次に透析を行なって洗剤を減少させ、複合体を回収することができる。このような方法の原理は、例えばHofland et a l．（1996，PNAS 93，7305-7309）および、Philippot et al.の文書(G．Gregori adis，81-89，CRC Press 1993)の第II章に記載されている。第一の変法では、得られた複合体の大きさに関して優れた結果が得られることが示されている。第三の変法によれば、１個以上のカチオン性組成物または化合物を緩衝液に懸濁した後、懸濁液を目視で均質になるまで超音波処理を行なう。次いで、脂質懸濁液を、適当な圧力下で２枚の微孔性膜を通して押し出す。次に、脂質懸濁液を、陰電荷を含んでなる活性物質の溶液と混合する。このいわゆる超音波処理−押出し法は、当該技術分野で周知である。ＤＯＰＥのような中性または双性イオン性脂質の使用は、大きさが小さい複合体（２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満）の生産に有利であることが示されることがある。形成した複合体の特徴を、例えば特に、物質が核酸である場合にはアガロースゲル電気泳動によって遊離核酸の同定によって活性物質との複合体形成の状態、光の擬似弾性散乱による粒子の大きさを決定することができる幾つかの手段によって評価することができる。本発明の目的は、上記の方法を用いて得た複合体でもある。本発明は、本発明による化合物、組成物または複合体の使用により、少なくとも１個の活性物質、具体的には治療活性物質、特に核酸をイン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボで、更に詳細にはイン・ビボで標的細胞中に移入することにも関する。本発明による「標的細胞」は、原核細胞、酵母細胞、および真核細胞、植物細胞、ヒトまたは動物細胞、特に哺乳類細胞を意味するものと理解される。更に、癌細胞も挙げられる。イン・ビボでは、本発明は、肺、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、胸腺、膀胱、リンパ、血液、すい臓、胃、腎臓、卵巣、畢丸、直腸、末梢または中枢神経系、目、リンパ様器官、軟骨、および内皮のような組織の間隙または管腔間隙のレベルで適用することができる。本発明の有利な選択によれば、標的細胞は、筋肉細胞、造血幹細胞あるいは気道の細胞であり、更に詳細には、気管または肺細胞であり、有利には呼吸上皮の細胞となる。本発明は、治療活性物質を、標的細胞を本発明による複合体と接触させることによって、この細胞中にイン・ビトロで移入する方法にも関する。本発明による複合体は、治療、予防またはワクチン用の医薬として用いることができる。従って、本発明の主題は、治療、予防またはワクチン用の医薬としての本発明の複合体でもある。このような複合体は、少なくとも１個の治療活性物質、特にポリヌクレオチドを標的細胞、特に哺乳類細胞、更に正確には筋肉細胞、造血幹細胞、気道の細胞、更に詳細には気管または肺細胞、呼吸上皮の細胞に移入することからなる治療処理法に用いることができる。更に広汎には、本発明は、陰電荷を含んでなる活性物質を細胞に導入する方法であって、適当な培地上で培養した細胞をカチオン性化合物／陰電荷を含んでなる活性物質の複合体の懸濁液と接触させる。所定のインキュベーション時間の後、細胞を洗浄して、回収する。活性物質の導入は、（場合によっては、細胞のリーシスの後）任意の適当な手段によってチェックすることができる。導入の過程は、自体公知である。「導入」という用語は、陰電荷を含んでなる活性物質を細胞中に移入し、この過程の終了時に上記細胞の内部にまたはその膜のレベルで位置することを意味するものと理解される。活性物質が核酸の場合には、更に詳細には、「トランスフェクション」を参照する。この場合には、核酸のトランスフェクションは、適当な手段によって、例えば考察した遺伝子の発現または発現タンパク質の濃度を測定することによって確認することができる。本発明は、更に詳細には、ヒトまたは動物体の特に遺伝子治療による治療を目的とした治療、予防またはワクチン用の医薬の製造のための本発明による化合物、組成物または複合体の使用に関する。第一の可能性によれば、この医薬は、直接イン・ビボに投与することができる（例えば、筋肉内、エーロゾルによる肺など）。患者から細胞を収集し（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋肉細胞など）、それらのイン・ビトロで本発明により移入し、それらを患者に再投与することからなるエクス・ビボ法を採用することも可能である。本発明による複合体は、筋肉内、気管内、鼻内、脳内、胸膜腔、腫瘍内、心臓内、胃内、腹腔内、表皮、静脈内または動脈内経路により、注射によって投与することができ、または吸入、点滴またはエーロゾル化のような気道または粘膜の治療に公的な任意の他の同等な手段、系によって投与することもできる。クリームの塗布によるなどの局所経路、または経口投与または当業者には完全に知られておりかつ本発明に応用可能な任意の他の手段による投与方式を挙げることもできる。複合体の化合物または組成物／治療活性物質の比、見掛けの複合体の電荷を調整するように調製した本発明による複合体を投与、特に静脈内投与による特定の器官または組織を標的設定することも本発明の範囲内にある（特に、Liu et al. ，1997，Gene Therapy，4，517-523;Thierry et al.，1995，P.N.A.S.，92，974 2-9746を参照されたい）。本発明は、本発明による組成物の適量を患者に投与することからなる遺伝子治療法にも関する。本発明によれば、イン・ビボでの遺伝子治療に関しては、所定の患者で、投与した化合物の一つに対して誘導される任意の主要な免疫反応なしに提案される方法を数回繰返すことが可能である。投与は、単回投与または所定の時間間隔の後、１または数回繰返し行なうことができる。繰返し投与は、所定の用量について投与される治療活性物質、更に詳細には、ＤＮＡの量を減少することができる。適当な投与経路および投与量は、様々なパラメーター、例えば治療を行なう患者または疾患、あるいは移入されるポリヌクレオチドによって変化する。本発明は、更に詳細には、上記のような少なくとも１個の複合体を含んでなり、場合によっては更に例えば医薬製剤をその保管の目的で安定化しおよび／または上記複合体のトランスフェクション力を増強することができる少なくとも１個のアジュバントを含む医薬製剤に関する。このようなアジュバントは、例えばクロロキニン、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル−Ｌ−２−ピロリドンまたはその誘導体から選択されるプロトン性の極性化合物、または特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル、またはそれらの誘導体から選択される非プロトン性の極性化合物からなる群から選択することができる。同様に、上記製剤は、ヒトまたは動物への投与を行なう薬学上許容可能なキャリヤーを含むことができる。本発明によるイン・ビボでの治療法の使用に関しては、上記のような医薬製剤の投与の前に、移入速度を増強することができるマクロファージの一時的涸渇が観察されるようにデザインされた患者の治療を行なうこともできる。このような手法は、文献に記載されており、特にVan Rooijen et al.，1997，TibTech，15 ，178-184を参照されたい。本発明は、上記で定義した複合体、特に原核細胞、酵母細胞、または真核細胞、具体的には動物細胞、特に哺乳類細胞、更に詳細には癌細胞でトランスフェクションした細胞に関する。本発明の好ましい場合によれば、上記細胞は、気道の細胞、更に詳細には器官または肺細胞、有利には呼吸上皮の細胞である。最後に、本発明は、少なくとも１個の陰電荷を含む目的の分子、特に本発明により定義された核酸を単離する装置並びに方法に関する。「単離」とは、単離の特異的または非特異的方法によりアニオン性分子の画分の分離、検出、濃縮および精製を示すものと理解される。更に詳細には、本発明は、分散固体支持体、例えばポリマー（ポリスチレン、アクリルアミド、メタクリル酸アミド、またはそれらの誘導体の一つまたは多数の例が文献、特に診断用途に関する文献に記載されている粒子を形成することができる任意の他のポリマー）の粒子からなる、または例えばポリスチレン製のチューブ、ヒドロキシアパタイト製などのカラム、逆相カラムまたは同等なものであって、本発明による少なくとも一つの化合物または一つの組成物がそのカチオン性形態で結合しているような非分散性の固体支持体からなる上記構造体に関する。このような構造体の生産は、当業者の能力範囲内である。更に、本発明は、このような構造体を用いて、アニオン性分子、特に核酸を単離する方法に関する。このような単離は、特に非特異的または好ましくは特異的であることができる。この第二の場合には、上記化合物または上記カチオン性組成物を、単離段階の前に、特異的ハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイゼーション段階を行なった後、特異的配列が可能なオリゴヌクレオチドと接触させ、上記オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列の全部または一部を含む核酸画分を特異的な方法で単離する。このような方法の実行は、文献に広汎に記載されている。図面の説明第１図：Ａに記載した化合物の合成の様式を示す。第２図：本発明のグリセロ脂質と、上記のエタノール法によって調製した０．１ｍｇ／ｍｌのプラスミドｐＴＧ１１０３３（特許出願ＦＲ９７０８２６７号明細書）との間に形成された複合体の粒子の大きさの分析。結果は、様々な電荷比で表す。それぞれの測定について、３個の独立した製剤を試験し、再現性の測定をこれらの製剤の間の標準偏差によって評価する。粒子の大きさは、ＰＣＳ（ホトン相関分光分析法）によって測定する。梳き櫛カラム(hatched column)は、ＤＯＰＥの非存在下で得た複合体を示し、黒塗りカラムＤＯＰＥの等モル量の存在下で得た複合体を表す。沈澱が観察される複合体を尺度を越えて伸びているカラムで表す。Ａ）３個の陽電荷（Ｃ−１４＝ｐｃＴＧ１８，Ｃ−１６＝ｐｃＴＧ２１，Ｃ−１８＝ｐｃＴＧ１９，オレオイル＝ｐｃＴＧ２０）を含んでなるグリセロ脂質；Ｂ）４個の陽電荷（Ｃ−１４＝ｐｃＴＧ３３，Ｃ−１６＝ｐｃＴＧ３４，Ｃ−１８＝ｐｃＴＧ３６，オレオイル＝ｐｃＴＧ３５）を含んでなるグリセロ脂質；Ｃ）オレオイル鎖と３（ｐｃＴＧ２０）、４（ｐｃＴＧ３５）または５個の陽電荷（ｐｃＴＧ５６）を含んでなるグリセロ脂質。第３図：本発明による複合体の静脈内注射。ルシフェラーゼ活性は、ＲＬＵ／ｍｇタンパク質として表す。第４図：実施例Ｎの様々なフッ素化グリセロ脂質の合成の様式を示す。第５Ａ〜Ｇ図：本発明による様々なフッ素化グリセロ脂質を含む複合体の存在下でのＡ５４９細胞のイン・ビトロトランスフェクション。実施例下記の実施例により、明細書の開示の一部を形成している添付図面を参照しながら、本発明を説明するが、本発明はこれらにより制限されることはない。Ａ．ｍ＝３；ｎ＝２；Ｒ₆＝ＢＯＣ（酸７ａ）またはｍ＝３；ｎ＝３；Ｒ₆＝ＢＯＣ（酸７ｂ）である式VIIの酸の合成（第１図参照）アミノ酸４、６および１５アクリロニトリル（９．６ｍｌ，１４６ミリモル）を１，４−ジオキサン５０ｍｌに溶解したものを、グリシン（１０．０ｇ，１３２ミリモル）および１Ｎ水酸化ナトリウム（１３３ｍｌ）を水および１，４−ジオキサン（２００ｍｌ）の１：１混合物に氷冷溶解したものに滴加する。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、室温で更に４時間攪拌する。次に、ジ−第三ブチルジカーボネート（３５．０ｇ，１５９ミリモル）を１，４−ジオキサン（１００ｍｌ）に溶解したものを、室温で２時間攪拌する。エーテル（２×１００ｍｌ）で抽出した後、水相を１Ｎ塩酸で酸性（ｐＨ２〜３）にし、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出する。合わせた有機相を乾燥して、濃縮する。得られたシアノ酸１（２４．４ｇ，収率８１％）は、融点８７〜８９℃の白色固形生成物の形態で存在する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：δ３．８８および３．８７（２ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４８および３．４５（２ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．５８および２．５６（２ｔ，Ｊ＝６．３および６．４Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．３０および１．２４（２ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。酸１（１１．５ｇ，５０．４ミリモル）を水酸化ナトリウム４．０４ｇ（１００ミリモル）を含むエタノール１００ｍｌに溶解したものを、ラネ−ニッケル（３．２ｇ）の存在下、室温で１８時間水素化する。混合物をセライト上で濾過して、触媒をメタノール（２×３０ｍｌ）で洗浄する。濾液を１０％塩酸でｐＨ４〜５まで酸性にし、真空濃縮して、白色固形生成物を得て、これをクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解して、塩化ナトリウムのほとんどを沈澱させる。濾過の後、濾液を真空濃縮して、四塩化炭素から再結晶させ、アミノ酸２（１０．４ｇ，収率８９％）を得る。融点は２０１〜２０２℃である。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：δ３．５３（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂ Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ(ＢＯＣ)−），２．８３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．６９（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−），１．２６および１．２１（２ｓ，９Ｈ，ｔ− Ｂｕ−）。シアノ酸１の製造についての同じ手続きにより、アミノ酸２からシアノ酸３が生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．００〜３．８５（ｍ，２Ｈ， −ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．５５〜３．４３（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＮ），３．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．７８（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４７および１．４４（２ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸４を、アミノ酸２を得たのと同じ手続きに従ってシアノ酸３からシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した後（溶離剤：メタノール／ジクロロメタン３／７、次いで６／４）、収率８７％で得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：δ３．５７〜３．５４（２ｓ，２Ｈ，− ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．２〜３．０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．８０〜１．５０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．２７および１．２２（２ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ −）。シアノ酸１についてと同じ手法により、アミノ酸４からシアノ酸５を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ３．８５（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂ −ＣＮ），３．３５〜３．０５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．８５〜１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂− ），１．４６および１．４４（２ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸６を、アミノ酸２を得たのと同じ手法に従ってシアノ酸５からシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した後（溶離剤：メタノール／ジクロロメタン３／７、次いで６／４）、収率８３％で得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：δ３．７６〜３．７３（２ｓ，２Ｈ， −ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．２５〜３．７５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−および−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．８５〜１．５０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．２８および１．２３（２ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。シアノ酸１についてと同じ手法により、アミノ酸６からシアノ酸１４を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ３．９５および３．８７（２×ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＯ₂Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＮ），３．４０〜３．０５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．９０〜１．６０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４７および１．４５および１．４４（３ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸１５を、アミノ酸２を得たのと同じ手続きに従ってシアノ酸１４からシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した後（溶離剤：メタノール／ジクロロメタン１／９、次いで３／７）、収率７１％で得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ−ＣＤ₃ＯＤ）：δ３．５７（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＯ₂Ｈ），３．１５〜２．８０（ｍ，１４Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ） −），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＮＨ₂），１．７５〜１．３５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．１７および１．１３（２ｓ，３６Ｈ，ｔ −Ｂｕ−）。酸７ａ，７ｂおよび７ｃジ−第三−ブチルジカーボネート（１．０９ｇ，５．０１ミリモル）をテトラヒドロフラン（４ｍｌ）に溶解したものを、アミノ酸４（１．５０ｇ，３．８５ミリモル）およびトリエチルアミン（１．０７ｍｌ，７．７ミリモル）をテトラヒドロフランと水の１／１混合物（８ｍｌ）に溶解したものに加える。反応混合物を室温で２時間攪拌する。次に、これを１０％塩酸水溶液でｐＨ３間で酸性にして、酢酸エチルで抽出する。有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮して、無色油状生成物を得て、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（溶離剤：酢酸エチル）を行なった後、酸７ａ（１．７９ｇ，収率９５％）を得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）：δ３．７９（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂− ＣＯ₂Ｈ），３．３０〜３．１５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），３．０３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６および１．４３（２ｓ，２７Ｈ，ｔ −Ｂｕ−）。酸７ａについてと同じ手法により、アミノ酸６（６．５０ｇ）から酸７ｂ（７．３１ｇ，収率：９５％）を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ３．９３および３．８６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４０〜３．０５（ｍ，Ｊ＝１２Ｈｚ，−ＣＨ₂− ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．６０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４４（ｂｒｏａｄｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸７ａについてと同じ手法に従って、アミノ酸１５（３．２０ｇ，４．５５ミリモル）から、酸７ｃ（３．３７ｇ，収率：９２％シリカゲルクロマトグラフィーの後；溶離剤：メタノール／ジクロロメタン５／９５、次いで１０／９０）を得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ３．８５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ − ＣＯ₂Ｈ），３．４５〜３．０５（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．６０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４および１．４３（３ｓ，４５Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。カチオン性グリセロ脂質エステル８ａ，８ｂおよび８ｃの合成ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．６０ｇ，２．９ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、酸７ａ（１．１０ｇ，２．２５ミリモル）、（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（０．３９ｇ，２．９ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２７ｍｇ，０．２３ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶解したものに加える。反応混合物を室温で１８時間攪拌する。ジシクロヘキシル尿素沈殿物を濾別し、濾液を真空濃縮した後、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（溶離剤：エーテル／ヘキサン６／４）を行ない、エステル８ａ（０．７２ｇ，５３％）を得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．４０〜４．０２（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−Ｏ−），３．９８および３．９０（２×ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．７３（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−Ｏ−），１．８５〜１．５５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４３および１．４２（３ｓ，３０Ｈ），１．３６（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ−）。エステル８ａについてと同じ手法により、酸７ｂ（５．３２ｇ，８．２２ミリモル）からエステル８ｂ（３．０８ｇ，収率：４９％）を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．４０〜４．０２（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−Ｏ−），３．９９および３．９１（２×ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂Ｃ−Ｏ₂−），３．７３（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ−Ｏ−），３．３２〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．５５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，３９Ｈ，ｔ− Ｂｕ−およびＭｅ），１．３６（２ｓ，３Ｈ，Ｍｅ−）。エステル８ａについてと同じ手法により、酸７ｃ（１．６０ｇ，１．９９ミリモル）からエステル８ｃ（１．７３ｇ，収率：９５％）を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．３５〜４．０４（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂ −Ｏ−），３．９９および３．９２（２ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂Ｃ−Ｏ₂−），３．７４（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−Ｏ−），３．３０〜３．００（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．５５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４２（４ｓ，４８Ｈ，ｔ−Ｂｕ−およびＭｅ），１．３６（２ｓ，３Ｈ，Ｍｅ−）。ジヒドロキシエステル９ａ，９ｂおよび９ｃエステル８ａ（６６３ｍｇ，１．１０ミリモル）と１Ｎ塩酸（０．４４ｍｌ）をメタノール（１９ｍｌ）に溶解したものを、室温で1６時間攪拌する。次に、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）を中性になるまで加える。真空蒸発した後、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（溶離剤：エーテル、次いで酢酸エチル）を行ない、ジヒドロキシエステル９ａ（４９７ｍｇ，収率：８０％）を無色油状生成物の形態で得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．２６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ − ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００〜３．５０（Ｍ，５Ｈ，ＣＨ−ＯＨ，−ＣＨ₂ＯＨおよび−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．４０〜３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．５５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５および１．４３（２ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。ジヒドロキシエステル９ａについてと同じ手法により、エステル８ｂ（５００ｍｇ，０．６６ミリモル）からジヒドロキシエステル９ｂ（３４０ｍｇ，収率：７１％）を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．２６（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ − ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００〜３．４０（ｍ，５Ｈ，ＣＨ−ＯＨ，−ＣＨ₂ＯＨおよび−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．４０〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．５５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５および１．４３（３ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。ジヒドロキシエステル９ａについてと同じ手法により、エステル８ｃ（１．５５ｇ，１．６９ミリモル）からジヒドロキシエステル９ｃ（１．２３ｇ，収率：８３％シリカゲルクロマトグラフィーの後；溶離剤：メタノール／ジクロロメタン５／９５）を生成する。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ４．２５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ − ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００〜３．４０（ｍ，５Ｈ，ＣＨ−ＯＨ，−ＣＨ₂ ＯＨおよび−ＣＨ₂ −ＣＯ₂−），３．４０〜３．００（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），１．９０〜１．６０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４２（４ｓ，４５Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。トリエステル１０ａ，１１ａ，１２ａおよび１３ａジシクロヘキシルカルボジイミド（１４２ｍｇ，０．６９ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、ジヒドロキシエステル９ａ（１３０ｍｇ，０．２３ミリモル）、オレイン酸（１９５ｍｇ，０．６９ミリモル；Fluk a puriss.）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（３ｍｇ，０．０２ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解したものに加えた。反応媒質を、室温で１６時間攪拌する。ジシクロヘキシル尿素沈殿物を濾別し、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行ない（溶離剤:エーテル／ヘキサン３／７、次いで４／６）、無色油状生成物の形態でトリエステル１０ａ（１４２ｍｇ，５７％）を得る。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝），５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９５および３．８８（２ｍ，２Ｈ，Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ＝），１．８５〜１．５０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４および１．４２（３ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．３０および１．２７（２×ｂｒｏａｄｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。トリエステル１０ａについてと同じ手法により、ジヒドロキシエステル９ａと、それぞれミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸からトリエステル１１ａ（収率：６５％）、１２ａ（収率：６４％）および１３ａ（収率：５８％）を得る。１１ａ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４５〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９５および３．８８（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂ −ＣＯ₂ −），３．３５〜３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４および１．４２（３ｓ，２７Ｈ，ｔ− Ｂｕ−），１．２６（ｓ，４０Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。１２ａ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９５および３．８８（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），３．３５〜３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４および１．４２（３ｓ，２７Ｈ，ｔ− Ｂｕ−），１．２５（ｓ，４８Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。１３ａ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９５および３．８８（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂− ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４および１．４２（３ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２６（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。トリエステル１０ｂ，１１ｂ，１２ｂおよび１３ｂトリエステル１０ａについてと同じ手法により、ジヒドロキシエステル９ｂ（１３０ｍｇ，０．１８ミリモル）と、オレイン酸（１５３ｍｇ，０．５４ミリモル；Fluka puriss.）からトリエステル１０ｂ（１３７ｍｇ，収率：６１％）を生成する。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝），５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９６および３．８９（２ｍ，２Ｈ，− Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂− ），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ＝），１．８５〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４１（４ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．３０および１．２７（２×ｂｒｏａｄｓ，４４Ｈ，− ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。トリエステル１０ａについてと同じ手法により、ジヒドロキシエステル９ａと、それぞれミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸からトリエステル１１ｂ（収率：６４％）、１２ｂ（収率：５８％）および１３ｂ（収率：６３％ )を得る。１１ｂ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９７および３．８９（２ｍ，２Ｈ，-Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４１（４ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２６（ｓ，４０Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。１２ｂ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃)：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−)，３．９７および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４１（４ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２５（ｓ，４８Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。１３ｂ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃)：δ５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９７および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．８５〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４１（３ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２５（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。トリエステル１０ｃトリエステル１０ａについてと同じ手法により、ジヒドロキシエステル９ｃ（１．００ｇ，１．１４ミリモル）と、オレイン酸（０．９７ｇ，３．４２ミリモル；Fluka puriss.）からトリエステル１０ｃ（０．７５ｇ，収率:４７％)を生成する。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝），５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９５および３．８９（２ｍ，２Ｈ，− Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ ₂ −Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂− ），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ＝），１．８５〜１．５０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，４５Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．３０および１．２７（２×ｂｒｏａｄｓ，４４Ｈ，− ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０トリエステル１０ａ（１２０ｍｇ，０．１１ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、トリフルオロ酢酸と乾燥ジクロロメタン（２０ｍｌ）の１／１混合物で０℃で３時間処理する。次に、ヘキサン（５０ｍｌ）を加え、混合物を真空蒸発させ、フィルム状生成物を得て、これを蒸留水（５〜１０ｍｌ）に懸濁する（渦流攪拌）。濾過により白色粉末を得て、これをエーテルで洗浄し、真空乾燥して、グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０（１２４ｍｇ；９９％）を得る。融点：１６０℃で分解。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３４（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ＝およびＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９９（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺− ＣＨ ₂−ＣＯ₂−），３．４５〜３．２０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．５０〜２．２０〜２２０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ＝），１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），１．３０および１．２７（２ｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。元素分析：Ｃ₅₃Ｈ₉₂Ｆ₉Ｎ₃Ｏ₁₂に対する計算値：Ｃ，５６．１２％；Ｈ，８．１８％；Ｎ，３．７０％。実測値：Ｃ，５６．３％；Ｈ，７．９％；Ｎ，３．７％。グリセロ脂質ｐｃＴＧ３５カチオン性脂質ｐｃＴＧ２０についてと同じ手法により、トリエステル１０ｃ（１００ｍｇ，０．０８ミリモル）からカチオン性脂質ｐｃＴＧ３５（１０１ｍｇ;収率:９７％）を生成する。融点:１９０℃で分解。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３５（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ＝およびＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００（ｂｒｏａｄs，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．１０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＮＨ₂ ⁺−），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．４５〜２．２０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ＝），１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．３０および１２７（２ｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ −）。元素分析：Ｃ₅₈Ｈ₁₀₀F₁₂Ｎ₄Ｏ₁₄に対する計算値：Ｃ，５３．３６％；Ｈ，７．７２％；Ｎ，４．２９％。実測値：Ｃ，５３．２％；Ｈ，７．６％；Ｎ，４．３％。グリセロ脂質ｐｃＴＧ５６グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０についてと同じ手法により、トリエステル１０ｃ（０．５２ｇ，０．３７ミリモル）からグリセロ脂質ｐｃＴＧ５６（０．５１ｇ；収率：９３％）を生成する。融点：２２０℃で分解。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３６（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ＝およびＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．１０（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．２８（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．０１（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ＝），１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．３０および１．２７（２ｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。グリセロ脂質ｐｃＴＧ１８，ｐｃＴＧ２１およびｐｃＴＧ１９グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０についてと同じ手法により、それぞれトリエステル１１ａ，１２ａおよび１３ａからグリセロ脂質ｐｃＴＧ１８（収率：９７％；固形生成物；１６５℃で分解）、ｐｃＴＧ２１（収率：９６％；固形生成物；１７０℃で分解）およびｐｃＴＧ１９（収率：９２％；固形生成物；１８６℃で分解）を生成する。ｐｃＴＧ１８ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９７（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂ −ＣＯ₂−）,３．４５〜３．１５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−)，２．３８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．４５〜２．２０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．２５（２ｓ，４０Ｈ，−ＣＨ₂− ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値６８４．１Ｄａ；測定値６８４．５Ｄａ。ｐｃＴＧ２１ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＤ₃ＯＤ）：δ５．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．４５〜４．００（ｍ，４Ｈ，− ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．７８（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂− ＣＯ₂−），３．１５〜２．４０（ｍ，Ｈ８，−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．１８〜１．９２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．５２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂ −），１．１７（ｓ，４８Ｈ，−ＣＨ₂−），０．７９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値７４０．２Ｄａ；測定値７４０．６Ｄａ。ｐｃＴＧ１９ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．０１（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．２０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ ₂−ＮＨ₂ ⁺-），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．５０〜２．２５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．２６（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値７９６．３Ｄａ；測定値７９６．８Ｄａ。グリセロ脂質ｐｃＴＧ３３，ｐｃＴＧ３４およびｐｃＴＧ３６グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０についてと同じ手法により、それぞれトリエステル１１ｂ，１２ｂおよび１３ｂからグリセロ脂質ｐｃＴＧ３３（収率：９７％；固形生成物；２０５℃で分解）、ｐｃＴＧ３４（収率：９４％；固形生成物；２１５℃で分解）およびｐｃＴＧ３６（収率：９２％；固形生成物；２２０℃で分解）を生成する。ｐｃＴＧ３３ ¹Ｈ-ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．００（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．１５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺-），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．４５〜２．１７（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂− ＣＯ₂−），１．２５（ｓ，４０Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値７４１．２Ｄａ；測定値７４１．６Ｄａ。ｐｃＴＧ３４ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９８（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．１０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．４５〜２．１５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．６０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．２５（ｓ，４８Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値７９７．３Ｄａ；測定値７９７．８Ｄａ。ｐｃＴＧ３６ ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：δ５．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．９８（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ ₂ −ＣＯ₂−），３．４５〜３．１０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺-），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．４５〜２．１５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），１．５９（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．２５（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値８５４．４Ｄａ；測定値８５４．０Ｄａ。グリセロ脂質ｐｃＴＧ２２上記のものと若干異なる経路により、３−アミノ−１，２−プロパンジオールからグリセロ脂質ｐｃＴＧ２２が生成する。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＤ₃ＯＤ）：δ５．０４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣ（＝Ｏ）−），４．２７〜３．９２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（＝Ｏ）−），３．６３（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ，−ＣＨ ₂−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ −），３．１０〜２．９０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−)，２．２４および２．２３（２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−)，２．１５〜１．９５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺），１．５１（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），１．１７（ｓ，５６Ｈ，−ＣＨ₂−），０．７９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。質量スペクトル：計算値７９５．３Ｄａ；測定値７９５．３Ｄａ。グリセロ脂質ｐｃＴＧ９０脂質ｐｃＴＧ５６の合成について記載したのと同様の手続きにより、グリセロールの代わりに３−アミノ−１，２−プロパンジオールを用いて脂質ｐｃＴＧ９０を生成する。Ｂ：エタノールに溶解することによるグリセロ脂質−ＤＮＡ複合体の調製１．グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０、場合によってはＤＯＰＥ，−ＤＮＡの複合体の調製脂質の量は、最終的ＤＮＡ（細胞培養物中での試験について０．１ｍｇ／ｍｌ）所望な電荷比、モル質量、および選択されたカチオン性脂質の陽電荷の数に基づいて計算される。ｐｃＴＧ２０／ＤＯＰＥの複合体、およびカチオン性脂質によって提供される陽電荷と最終的ＤＮＡ濃度が０．１ｍｇ／ｍｌでＤＮＡによって提供される陰電荷との比率が１０のプラスミドＤＮＡを得るため、様々な成分を下記の計算に従って混合する。ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌ、すなわち１ｍｌ当たりの（０．１／３３０）ミリモルの陰電荷（３３０Ｄａはヌクレオチドの平均分子量である）は、陰電荷：０．３０マイクロモル／ｍｌに相当する。１０倍の陽電荷を得るには、カチオン性脂質によって提供される陽電荷３．０マイクロモル／ｍｌの濃度が必要である。トリフルオロアセテート形態でのｐｃＴＧ２０のモル質量は、１１３４ｇ／モルであり、分子含量は３の陽電荷である。従って、１．１３ｍｇ／ｍｌに相当するｐｃＴＧ２０の１．０マイクロモル／ｍｌが必要である。Ｌ−α−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，７４４ｇ／モル，Sigma;P0510）の等量濃度を得るには、脂質製剤に０．７４ｍｇ／ｍｌが必要である。他の化合物についての量および濃度は、それぞれのモル質量およびそれらの陽電荷の数によって調整される。クロロホルムに吸収される脂質を蒸発させた後、クロロホルム：メタノール（ｖ：ｖ）で可溶化し、再度蒸発させる。カチオン性脂質を秤量し、ＤＯＰＥの量をクロロホルム中１０または２０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から、アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管に加えて、２ｍＭのカチオン性脂質濃度を得る。溶媒を真空（２００ミリバール）で４５分間４５℃で４０回転数／分の渦流攪拌装置（ Labconco，Rapidvap，Uniequip，martinsried,ドイツ国）を用いて蒸発させる。脂質フィルムをエタノールに吸収させ、カチオン性脂質濃度を５０ｍｇ／ｍｌとなるようにする。ｐｃＴＧ２０／ＤＯＰＥ１．１３ｍｇ＋０．７４ｍｇ＝１．８７ｍｇ／２３μｌエタノール。この溶液を２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５で２３０μｌに調整し、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌのカチオン性脂質溶液を調製する。プラスミドＤＮＡを、プラスチック管で１ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）の保存溶液から調製する。０．５ｍｌの最終濃度の溶液に対して、保存溶液（５０μｇＤＮＡ）５０μｌを収集し、これに２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５３３５μｌを加える。ＤＮＡを脂質製剤と複合体形成するため、脂質をＤＮＡに加える。懸濁液を、ピペットを用いて吸引／排出によって混合する（１０回）。複合体を＋４℃で保管する。ｐｃＴＧ２０／ＤＯＰＥ１１５μｌをＤＮＡ溶液３８５μｌに加えて、０．１ｍｇ／ｍｌＤＮＡおよび電荷比１０の複合体０．５ｍｌを得る。複合体の調製は、薄層流動キャビネット下で行なう。特性を下記の第Ｉ表に示す複合体が得られる。２．複合体、グリセロ脂質ｐｃＴ３５、ｐｃＴＧ２２およびｐｃＴＧ１８、場合によってはＤＯＰＥ，−ＤＮＡの調製同じプロトコールに基づいて、特性を下記の第Ｉ表に示す複合体が得られる。Ｃ．洗剤溶液での懸濁によるグリセロ脂質−ＤＮＡ複合体の調製１．複合体、グリセロ脂質ｐｃＴＧ２０、場合によってはＤＯＰＥ，−ＤＮＡの調製脂質の量を、最終的ＤＮＡの濃度（イン・ビトロでの試験について０．１ｍｇ／ｍｌ）、所望な電荷比、モル質量および選択したカチオン性脂質の陽電荷の数に基づいて上記と同様にして計算する。脂質を、アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管で混合し、２ｍＭのカチオン性脂質溶液（上記参照）を得る。溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを、カチオン性脂質／洗剤比１：５（モル：モル）に従って、ｎ−オクチル，β−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド、Sigma, 0 9882）の溶液に吸収させる。２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５中の２０ｍＭオクチルグルコシド溶液２５３μｌを収集し、ｐｃＴＧ２０／ＤＯＰＥ脂質混合物のフィルムを吸収させるのに用いる。プラスミドＤＮＡを、１ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡの保存溶液であって、その５０μｌを０．５ｍｌとし（最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）、これに２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５３２３．５μｌを加えたものから調製する。脂質懸濁液１２６．５μｌを、ピペットを用いて１０回吸引および排出を行なうことによってＤＮＡに加え、ＤＮＡが０．１ｍｇ／ｍｌおよび＋／−電荷比１０の最終懸濁液を得る。洗剤を除去するため、透析マイクロバッグ（カットオフ値１３．２ｋＤ，Sartorius，Goettingen，ドイツ国）中で２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５に対して室温で４時間３回透析を行なう。透析したＤＮＡ／脂質複合体を＋４℃で保存する。調製は、薄層流動キャビネットで行なう。下記の第Ｉ表に特性を示した複合体が得られる。２．複合体、グリセロ脂質ｐｃＴＧ３５，場合によってはＤＯＰＥ，−ＤＮＡの調製同一のプロトコールが上記と同様に適用される。Ｄ．超音波押出しによる脂質−ＤＮＡ複合体の調製脂質の量を、最終的ＤＮＡの濃度（イン・ビトロでの試験について０．１ｍｇ／ｍｌ）、所望な電荷比、モル質量および選択したカチオン性脂質の陽電荷の数に基づいて上記と同様にして計算する。脂質を、アルコールおよびＵＶで滅菌したガラス管で混合し、２ｍＭのカチオン性脂質溶液を上記のようにして得る。溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５９００μ ｌに４℃で約１６時間吸収させる。懸濁液を超音波槽(Bransoni 221)中で超音波処理し、目視で均質にする。脂質懸濁液を、細孔径我０．２μｍの２枚の膜を介して押出し（Nuclepore，Costar，ケンブリッジ，マサチューセッツ，米国）、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５で（Lipex Biomembranes，バンクーバー，カナダ国）最大圧力５０バールで濯ぐ。脂質懸濁液を室温に１時間保持する。脂質懸濁液４５０μｌを、プラスミドＤＮＡの保存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌに加え、ピペットを用いて吸引／排出を１０回行なうことによって混合する。脂質／ＤＮＡ複合体を、＋４℃で保存する。調製は、薄層流動キャビネットで行なう。Ｅ．ＤＮＡの脂質による複合体形成の評価のためのプロトコール１％（ｗ：ｖ）アガロースゲルを、ＴＡＥ緩衝液（ＴＡＥ：Ｔｒｉｓ４．８ｇ／リットル＋酢酸ナトリウム０．６８ｇ／リットル＋ＥＤＴＡ０．３３６ｇ／リットル，ｐＨ７．８）中で調製する。必要ならば、試料をＴＡＥで希釈した後、試料緩衝液（０．０８３％ブロモフェノールブルー、０．０８３％シアノールキシレンＦＦ、１０％グリセロール／水）を加えて、ＤＮＡを５０ｎｇ／μｌとする。試料を渦流攪拌装置で短時間均質化して、室温で３０分間放置する。コントロールとして、同じ濃度で調製した複合体形成していないプラスミドを用いる。１０μｌ（ＤＮＡ５００ｎｇ）をゲル上に付着させ、６０ｍＶで３時間移動を行なう。ゲルを、臭化エチジウム０．００６％（ｖ：ｖ）を含むＴＡＥ中で１０ｍｇ／ｍｌで少なくとも３０分間展開する。次に、ゲルをＴＡＥで濯ぎ、ＵＶ下で分析する。Ｆ．光の擬似弾性散乱による粒子の大きさの測定法分析は、Coulter N4Plus（Coultronics France S.A.，マージェンシー，フランス国）上で、試料を２０分間平衡にした後、２５℃で行なう。試料の一部を吸引および排出を数回行なった後、ピペットで採取する。試料を、測定タンクで希釈して、均質化する。９０°で回折した光の測定は、１８０秒待機した後、１８０秒間行なう。用いた範囲は、３１ビンズ(bins)を用いて３ｎｍ〜１０，０００ｎｍである。有効であるためには、試料は、５０，０００〜１，０００，０００カウント数／秒となるべきである。Ｇ．物理化学的特徴３つの処方の方法である「エタノールの注入」、「洗剤の透析」および「超音波処理／押出し」を、等量のＤＯＰＥを含むまたは含まない本発明によるカチオン性脂質に約１０または５の電荷比で適用する。処方は、ＤＮＡが完全に複合体形成するとき（アガロースゲルでの移動なし）、および光の擬似弾性散乱によって測定した複合体の直径が５００ｎｍ未満であるときには、適当であると考えられる。表には、これらの分析の結果をまとめてある。表に示したＤＮＡ／脂質複合体は総て、分析を行なった電荷比で完全にＤＮＡと複合体形成している。第Ｉ表１：カチオン性脂質の陽電荷とＤＮＡの陰電荷との比。２：調製後２４〜４８時間で測定（＋／−は、測定値の標準偏差を表す。３：調製後８日目に測定。これらの分析は、処方が必要な要件を満たしていることを示す。「エタノールの注入」法は、多くの製剤について最良の結果が得られ、粒度は１００ｎｍ未満である。洗剤および超音波処理／洗剤の透析による方法も、本発明の目的に見合う複合体を得ることができる。Ｈ．外とう細胞のイン・ビトロトランスフェクションイヌの筋肉およびヒトの筋肉細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清（FCS，Hyclo ne，ローガン，ユタ）、インシュリン(Sigma)１０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Sigma)およびＦＧＦ（Pepro Tech Inc.，ロッキー・ヒル，ニュー・ジャージー）１０ｎｇ／ｍｌ、グルタミン(bioMerieux)２ｍＭ、およびゲンタマイシン(Schering Pl ough)４０μｇ／ｍｌを補足したＨａｍＦ１４培地(Life Technologies)中で行なう。細胞を接種してから２４時間〜４８時間後に、９６穴培養プレートに約５×１０³〜１０⁴個／ウェルを約３０％のコンフルエンスでトランスフェクションし、５％ＣＯ₂および９５％空気の雰囲気下で３７℃に保持した。トランスフェクションは、様々な量の脂質およびプラスミドＤＮＡの混合物で行ない、ウェル当たりの電荷比および最適ＤＮＡ濃度を決定する。用いた複合体を調製してから２４時間〜４８時間後にトランスフェクションを行ない、ゲンタマイシン４０μｇ／ｍｌと２ｍＭグルタミンを加えたＨａｍＦ１４で希釈する。培地を除去した後、１０％ＦＣＳを含むまたは含まないトランスフェクション混合物１００μｌをウェルのそれぞれにトランスフェクションし、プレートを３７℃で４時間インキュベーションする。次に、総てのトランスフェクション培地を調整して、２５０μｌの最終容積に対して１０％ＦＣＳ、インシュリン(Sigma)１０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Sigma)およびＦＧＦ（Pepro Tech Inc.，ロッキー・ヒル，ニュー・ジャージー）１０ｎｇ／ｍｌ、グルタミン(bioMerieux)２ｍＭ、およびゲンタマイシン４０μｇ／ｍｌ (Schering Plough)とする。培養物を４８時間インキュベーションした後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するそれらの能力を試験する。タンパク質濃度を、タンパク質の量を試験する系により測定する(Promega)。Ｉ．脂質複合体を用いるＡ５４９細胞のトランスフェクションＡ５４９細胞（ヒト肺癌から誘導される上皮細胞）を、１０％ウシ胎児血清(G ibco BRL)を含むダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２４時間培養した後、３７℃および５％ＣＯ₂／９５％空気の湿潤雰囲気で９６穴プレートでトランスフェクションを開始する（２×１０⁴細胞数／ウェル）。血清の非存在下でのトランスフェクションのため、培地を除き、無血清培地に変える。もう一つのマイクロプレートで、下記の脂質／ＤＮＡ複合体の懸濁液を調製する（ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌおよび所定の電荷比での脂質／ＤＮＡ複合体）：最初の３個のウェルでは、保存溶液４４μｌ（４．４μｇＤＮＡ）、２２μｌ（２．２μｇＤＮＡ）、５．５μｌ（０．５５μｇＤＮＡ）、次のウェルでは１０倍に希釈した保存溶液１１μｌ（０．１１μｇＤＮＡ）。容積をＤＭＥＭで１１０μｌに調製し、１００μｌをＡ５４９細胞上に移す。インキュベーションは、ウェル当たりＤＮＡ４、２、０．５および０．１μｇを用いて行なう。次に、ＤＭＥＭ＋５０ μｌ＋３０％ウシ胎児血清５０μｌを、トランスフェクションの開始から４時間後に加えた後、トランスフェクションの開始から２４時間後にＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ１００μｌを加える。１０％ウシ胎児血清の存在下でのトランスフェクションは、トランスフェクションが血清を含む培地で起こることを除き、同一のやり方で行う。Ｊ．トランスフェクションの分析トランスフェクションの４８時間後に、培地を除き、細胞をＰＢＳリン酸溶液１００μｌで洗浄し、リーシス緩衝液(Promega)５０μｌでリーシスを行なう。溶解物を、発現したルシフェラーゼ活性を測定するまで、−８０℃に凍結する。後者は、９６穴プレートで動的モードで「ルシフェラーゼ」定量キット(Promega )(LB96P Bertholdルミノメーター）を用いて、混合物２０μｌで１分間行なう。Ｋ．イン・ビトロトランスフェクションこれらの製剤の幾つかを、Ａ５４９細胞およびイヌ一次外とう細胞を用いて、イン・ビトロでトランスフェクションで評価した。結果は、下記の第II表にまとめてあり、ウェル当たりの相対的光単位（ＲＬＵ）を示す。ウェル当たりＤＮＡ２μｇで所定の値が得られる。総ての複合体は、エタノールの注射法を用いて調製する。ウェル当たりの総タンパク質濃度を、通常の手法（ＢＣＡ試験、Pierce）によって測定する。参考として、ウェルは、タンパク質約２０〜３０μｇを含む。第II表１．カチオン性脂質の陽電荷とＤＮＡの陰電荷との比。２．相対光単位が０〜２７０の遊離ＤＮＡ。タンパク質のｍｇで報告されたルシフェラーゼ（ＲＬＵ／分）の発現は、下記の値を示す。ｐｃＴＧ３５Ｒ＋／−１０（Ａ５４９）３．４×１０¹⁰ＲＬＵ／分／ｍｇタンパク質ｐｃＴＧ３５Ｒ＋／−５（Ａ５４９）２．８×１０¹⁰ＲＬＵ／分／ｍｇタンパク質ｐｃＴＧ３５／ＤＯＰＥV Ｒ＋／−５（Ａ５４９＋血清）１．０×１０¹⁰ＲＬＵ／分／ｍｇタンパク質化合物ｐｃＴＧ２０およびｐｃＴＧ３５は、それらをプラスミドＤＮＡと複合体形成するとき、試験した細胞の２つの型を効率的にトランスフェクションすることができる。幾つかのトランスフェクションは血清の存在下では高値生じ、血清はこの型の製剤には阻害効果を持たないことが分かるであろう。同様に、Ａ５４９細胞で行なったイン・ビトロでのトランスフェクションの分析では、ａ）プラスミドｐＴＧ１１０３３と複合体形成した化合物ｐｃＴＧ９０は、ＤＯＰＥの非存在下または存在下で、血清の非存在下または存在下で上記と同様な条件下で効率的なトランスフェクションを観察することができ、ｂ）ＤＯＰＥは、例えば１，２−ジ−ステアロイル−ｓｎ−グリセロホスファチジルエタノールアミン(Avanti 850715)、１，２−ジ−フィタノイル−ｓｎ−グリセロ− ３−ホスホエタノールアミン(Avanti 850402)、１，２−ジ−ラウロイル−ｓｎ −グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(Avanti 850702)、１，２−ジ−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(Avanti 850725)、１，２−ジ−パルミトオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(A vanti 850706)または１，２−ジ−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(Avanti850755)のような別のアジュバントによって置換することができることを確認することができた。Ｌ．（Ｆに記載のプロトコールによる）粒子の大きさの分析ＰＣＳによって行なった分析は、粒子の大きさおよびそれらの凝集は、電荷比、脂質の構造並びにＤＯＰＥの存在または非存在によって大きく変わる。１００〜２００ｎｍの安定な複合体が、カチオン性グリセロ脂質がＤＮＡに対して過剰であるときには、１０の電荷比に対して再現性よく得られた（第２図を参照）。これらの結果は、Ｃ１８グリセロ脂質（ｐｃＴＧ１９，ｐｃＴＧ３６）を含む複合体だけが懸濁液の問題を有し、大きさが可変である大きな複合体を生じることを示している。対照的に、４または５個の電荷を含むオレオイル型脂質（ｐｃＴＧ３５，ｐｃＴＧ５６）は、電荷比５について約２００ｎｍの複合体を得ることができる。更に、本発明者らは、等モル量ＤＯＰＥが粒子の大きさを若干増加し、低電荷比で凝集する複合体が有する傾向を減少する（第２Ａ図および２Ｂ図参照）。更に、ＤＯＰＥは、３個のアミン基を有するＣ−１４またはＣ− １６グリセロ脂質を含む複合体の安定化効果を得ることができ（第２Ａ図）、この効果は、４個のアミン官能基を含む同種化合物では観察されない（第２Ｂ図）。複合体が凝集する傾向は、電荷比が５ではかなり増加し、電荷の反発が凝集現象を回避するための重要な因子であることを示している。増加長の脂肪酸を有するグリセロ脂質を含む複合体の比較により、電荷比が１０のＣ−１４、Ｃ−１６およびオレオイル誘導体の間には、特に４個のアミン基を含むグリセロ脂質の場合にはごく僅かの差しかないことを示している。オレオイルを含むグリセロ脂質の極性ヘッドのレベルでのアミン基の数は、複合体の大きさに対して若干の効果を示す（第２Ｃ図）。更に、複合体の大きさを測定するためのこの手法によって観察される結果は、電子顕微鏡法によって確認されたことにも留意すべきである。Ｍ本発明による複合体の静脈内注射結果を、第３図に示す。本発明による複合体は、等モル量のＤＯＰＥの存在下で、一定電荷比５で、ルシフェラーゼｐＴＧ１１０３３を含むプラスミドを用いて、グリセロ脂質ｐｃＴＧ３５、ｐｃＴＧ５６およびｐｃＴＧ９０から上記の方法に従って合成した（フランス国特許出願第９７／０８２６７号明細書）。用いたマウスは、９〜１１週令の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスである。静脈内注射は、皮膚を７０％エタノールで消毒した後、尾で行なう。注入容積は２００μｌであり、ＤＮＡ濃度は０．２４ｍｇ／ｍｌである（脂質濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）。注射から２日後に、マウスを屠殺する。抽出の後、組織を液体窒素で凍結し、 −８０℃で保存する。ルシフェラーゼ活性を測定するため、ドライアイス上に置いた乳鉢中で乳棒により組織を機械的に粉砕する。リーシス緩衝液５００μｌまたは２００μｌを、それぞれ肺または気管から得た組織屑に加え、３回の凍結／融解段階に付す。細胞破片を遠心分離によって除去し、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／分、相対的光単位／分）を、上清２０μｌについて、製造業者の指示に従って(Promega)、試薬１００μｌを加え、発光によって活性を測定することによって、測定する。測定したルシフェラーゼ活性を、市販のルシフェラーゼ(Prome ga)から調製した検量線によってタンパク質量に対して標準化する。総タンパク質量を、更に上清の一部を用いて、比色のビシンコニン酸ＢＣＡ法(Smith et al ．，1985，Anal．Biochem.，150，76-85 Pierce)によって測定する。これにより、組織から抽出されたタンパク質１ｍｇ当たりＲＬＵでのルシフェラーゼ活性を発現することができる。この結果は、ＤＯＰＥの存在下で上記の３種類のグリセロ脂質の一つを含む複合体を静脈内注射した後、肺におけるルシフェラーゼリポーター遺伝子の発現がＤＮＡだけを注射した場合と比較して、約１５〜３０倍まで顕著に増加することを示している。これらの値は、注射を行なった２〜６匹のマウスから得た平均値である。Ｎフッ素化グリセロ脂質ｐｃＴＧ６９〜ｐｃＴＧ７２の合成１．トリエステルの合成（第４図参照）トリエステル６：ジシクロヘキシルカルボジイミド２３２ｍｇ（１．１２ミリモル）をジクロロメタン１ｍｌに溶解したものを、ジヒドロキシエステル５（２７０ｍｇ，０．３７ミリモル）、フッ素化酸１（４５４ｍｇ，１．１２ミリモル）、および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（５ｍｇ，０．０３８ミリモル）をジクロロメタン４ｍｌに溶解したものに加える。反応を、室温で１６時間攪拌しながら行なう。ジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾別して、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行ない（溶離剤：エーテル：ヘキサン，４：６，ｖ：ｖ）、トリエステル６（２７５ｍｇ，４８％）を粘稠な液体の形態で得る。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２５（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ− ＯＣ（Ｏ）−），４．４０〜４．０８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（Ｏ）−），３．９５および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．２０〜１．８８（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＣＦ₂−），１．８２〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４，１．４３および１．４２（４ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２９（ｂｒｓ，２８Ｈ，−ＣＨ₂−），¹⁹ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ）：ｄ−８１．６，−１１５．１，−１２５．０，−１２６．５。トリエステル７：トリエステル６について記載したのと同じ方法に従って、トリエステル７（２２０ｍｇ，４９％）を、ジヒドロキシエステル５（１７０ｍｇ，０．２３６ミリモル）およびフッ素化酸２（４２６ｍｇ，０．７０７ミリモル）から得る。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨＺ，ＣＤＣｌ₃）：δ６．４０（ｄｔｔ，Ｊ＝１５．６，６．９，２．２Ｈｚ，２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＦ₂−），５．５９（ｄｔ，Ｊ＝１５．６，１２．３Ｈｚ，２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＨ₂−），５．２５（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ−ＯＣ（Ｏ）−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（Ｏ）− ），３．９６および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．２０（ｍ，４Ｈ，アリルＨ），１．８０〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．３０（ｂｒｓ，２０Ｈ，−ＣＨ₂−），¹⁹ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ−８１．３， −１１１．６，−１２１．９，−１２２．４，−１２３．２，−１２３．９，− １２６．６。トリエステル８：トリエステル６について記載したのと同じ方法に従って、トリエステル８（２３０ｍｇ，４７％）を、ジヒドロキシエステル５（２１０ｍｇ，０．２９１ミリモル）およびフッ素化酸３（４４１ｍｇ，０．８７４ミリモル）から得る。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２５（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ− ＯＣ（Ｏ）−），４．４０〜４．１０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（Ｏ）−），３．９５および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂-），２．２０〜１．９０（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂−ＣＦ₂−），１．８２〜１．５０（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．２９（ｂｒｓ，２８Ｈ，−ＣＨ₂−），¹⁹ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ）：ｄ−８１．３，−１１４．９，−１２２．４，−１２３．２，−１２４．０，−１２６．６。トリエステル９：トリエステル６について記載したのと同じ方法に従って、トリエステル９（１６５ｍｇ，４９％）を、ジヒドロキシエステル５（１６０ｍｇ，０．２２２ミリモル）およびフッ素化酸４（２８０ｍｇ，０．６６６ミリモル）から得る。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ５．２５（ｍ，１Ｈ，＞ＣＨ− ＯＣ（Ｏ）−），４．４５〜４．０８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣ（Ｏ）−），３．９５および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）−ＣＨ₂−ＣＯ₂-），３．３５〜３．００（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．３７（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．２６〜１．９５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＦ₂− ），１．８５〜１．５５（ｍ，１４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。¹⁹ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ−８１．３，−１１４．９，−１２２．４，−１２３．４，−１２４．１，−１２６．７。２．ｐｃＴＧ６９の合成トリエステル６（１２０ｍｇ，０．０７９ミリモル）をジクロロメタン１ｍｌに溶解したものを、トリフルオロ酢酸およびジクロロメタン（１：１，ｖ：ｖ）の溶液１６ｍｌで、０℃で処理する。ヘキサン１００ｍｌを加え、混合物を真空で蒸発させてフィルム状生成物を得て、これを蒸留エーテルに吸収する。濾過の後、白色粉末を得て、エーテルで洗浄し、真空乾燥して、化合物ｐｃＴＧ６９（１１５ｍｇ，９４％）を得る。融点＝２０５℃。３．ｐｃＴＧ７０の合成ｐｃＴＧ６９について記載したのと同一の方法に従って、トリエステル７（２１０ｍｇ，０１１１ミリモル）から白色粉末の形態で、グリセロ脂質ｐｃＴＧ７０（１８５ｍｇ，８６％）を得る。融点＝２１０℃。４．ｐｃＴＧ７１の合成グリセロ脂質ｐｃＴＧ７１（１４１ｍｇ，９０％）を、ｐｃＴＧ６９について記載したのと同一の方法に従ってトリエステル８（１５０ｍｇ，０．０８９ミリモル）から白色粉末の形態で得る。融点＝２２０℃。５．ｐｃＴＧ７２の合成グリセロ脂質ｐｃＴＧ７２（８７ｍｇ，９２％）を、ｐｃＴＧ６９について記載したのと同一の方法に従ってトリエステル９（９０ｍｇ，０．０６ミリモル）から白色粉末の形態で得る。融点＝２２０℃。これらのフッ素化化合物は、様々な大きさのポリカーボン鎖（Ｃ１１，Ｃ１５，Ｃ１７またはＣ１９不飽和）を有するｐｃＴＧ３５（４アミノ基）の主鎖に相当する。それらを、エタノール注入法に従って合成した。Ｏ．フッ素化化合物を含む複合体のイン・ビトロトランスフェクションフッ素化化合物（実施例Ｎを参照されたい）で記載した上記の方法に従って形成した複合体の効率を、実施例Ｉに記載の手法に従ってＡ５４９細胞の培養物について検討した。試験した電荷比は、１０，５，２．５，１．２５および０．８の中から選択される（第５Ａ〜Ｇ図を参照）。試験は、血清またはＤＯＰＥの非存在下または存在下（図では、ｓｅｒ．によって示す）で、および様々な量のＤＮＡ（０．１，０．５，２または４μｇ）についても行なった、結果は、下記のものを示す（第５Ａ〜Ｇ図）。ｐｃＴＧ６９（第５Ｃ図）では、試験した条件下では、非フッ素化類似Ｃ１４またはＣ１６化合物で得られたものに匹敵するルシフェラーゼ発現水準を観察することができる。更に、第５図には示されていない他の結果は、最良の結果が、電荷比２．５のｐｃＴＧ６９で、ＤＯＰＥまたは血清の存在下または非存在下で得られたことを示していた。ｐｃＴＧ７２（第５ＡおよびＢ図）では、電荷費１０について、満足なトランスフェクション速度をＤＯＰＥまたは血清の存在下または非存在下で得ることができるが、一方、電荷比１．２５または０．８については、ＤＯＰＥの存在は、特にＤＮＡが０．１μｇより多い量の存在下では、トランスフェクション速度を増大することができる因子であることが観察される。ｐｃＴＧ７１（第５ＤおよびＥ図）では、電荷比１．２５，０．８または１０についてＤＯＰＥの存在下だけで、特にＤＮＡが０．５μｇより多い量で、好適なトランスフェクション速度が得られる。試験条件かでは、ＤＯＰＥの存在下でのトランスフェクションは、培地中の血清の存在によって影響されないと思われる。ｐｃＴＧ７０（第５ＦおよびＧ図）：電荷比１０または５について、観察されたトランスフェクション速度は、ＤＯＰＥまたは血清の存在下または非存在下で有効である。一方、低電荷比（１．２５または０．８）については、ＤＯＰＥの存在が必要であると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３ＡＡ６１Ｋ 31/221 ６４３Ｂ 38/00 31/22 ６０１ 47/18 47/18 48/00 48/00 Ｃ０７Ｃ 237/08 Ｃ０７Ｃ 237/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＳＧ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記式Ｉで表される化合物：（上記式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であるかまたは異なるものであり、Ｃ₆〜Ｃ₂₃の線状または分岐状のアルキルまたはアルケニル基、または線状または分岐状の基−Ｃ（＝Ｏ）−(Ｃ₆〜Ｃ₂₃)アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ₆〜Ｃ₂₃）アルケニルであり、Ｘは、酸素原子またはアミノ基−ＮＲ₃であり、Ｒ₃は水素原子であるかまたは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは、１〜６の正の整数であり、ｍは、１〜６の正の整数であり、ｎ＞１であるときには、ｍはこのｎと同一であるかまたは異なるものであることができる）。２．Ｒ₁およびＲ₂ は、同一であるかまたは異なるものであり、線状の−Ｃ（＝Ｏ）アルキルまたは線状の−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル基である、請求項１に記載の化合物。３．Ｒ₁およびＲ₂は、同一であるかまたは異なるものであり、１２〜２０個の炭素原子を含んでなる−Ｃ（＝Ｏ）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル基である、請求項１に記載の化合物。４．ｎが、数２、３または４から選択される整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。５．ｍが、数２、３または４から選択される整数である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。６．更に、少なくともａ）炭素原子の一つであって、特に基Ｒ₁、Ｒ₂および／またはＲ₃上に存在するものから選択されるもの、またはｂ）ポリアミン鎖の第二または第一窒素原子の一つの介在により、１個以上の標的形成成分と接合してなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。７．上記標的形成成分が、糖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜レセプターに特異的なリガンド、抗リガンドと反応することができるリガンド、フソゲニックペプチド(fusogenic peptides)、核局在化ペプチド、またはこのような化合物の組み合わせの全部または一部からなる群から選択される、請求項６に記載の化合物。８．カチオン性の形態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。９．２〜７の陽電荷、更に詳細には３〜５、好ましくは５の陽電荷を含んでなる、請求項８に記載の化合物。１０．下記の式の化合物からなる群から選択される、請求項８または９に記載の化合物。１１．請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１個の化合物と、場合によって、特に上記化合物と活性物質との間の複合体の形成を増強することができる少なくとも１個のアジュバントを含んでなる、組成物。１２．上記アジュバントが、中性または双性イオン性脂質である、請求項１１に記載の組成物。１３．上記中性または双性イオン性脂質が、トリグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、スフィンゴミエリン、セラミドまたはセレブロシドであるか、またはそれらから誘導される、請求項１２に記載の組成物。１４．上記中性または双性イオン性脂質が、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１３に記載の組成物。１５．化合物／アジュバント重量比が０．１〜１０である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。１６．請求項８〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１個の化合物または請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１個の組成物と、少なくとも１個の活性物質、特に少なくとも１個の陰電荷を含んでなる治療活性物質とを含んでなる、複合体。１７．上記活性物質が、核酸およびタンパク質から選択される、請求項１６に記載の複合体。１８．上記治療活性物質が、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボチーム、トランスファーＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡをコードするＤＮＡからなる群から選択される核酸である、請求項１７に記載の複合体。１９．上記核酸が、目的とする遺伝子と、目的とする上記遺伝子を発現させる成分とを含んでなる、請求項１８に記載の複合体。２０．大きさが５００ｎｍ未満であり、好ましくは２００ｎｍ未満である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の複合体。２１．大きさが１００ｎｍ未満である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の複合体。２２．（複数の）カチオン性化合物および／または（複数の）組成物の陽電荷の数と上記活性物質の陰電荷の数の比が０．０５〜２０の間で変化し、更に詳細には０．１〜１５であり、好ましくは５〜１０の間で変化する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の複合体。２３．請求項８〜１０のいずれか１項に記載の１個以上の化合物、および／または請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１個の組成物を、少なくとも１個の陰電荷を含んでなる１種類以上の活性物質と接触させ、上記複合体を、場合によっては精製段階の後に回収する、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の複合体の製造法。２４．上記化合物および／または組成物を、水と混和性の溶媒、特にエタノールまたはジメチルホルムアミドまたはそれらの混合物に予め溶解させる、請求項２３に記載の製造法。２５．上記化合物および／または組成物を、洗剤溶液に予め懸濁させる、請求項２３に記載の製造法。２６．更に、透析による上記複合体の精製段階を行なう、請求項２５に記載の製造法。２７．上記化合物および／または組成物を、超音波処理／押出し段階に予め付する、請求項２３に記載の製造法。２８．請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法によって得ることができることを特徴とする、複合体。２９．少なくとも１種類の活性物質、特に治療活性物質、詳細には核酸を、イン・ビトロ、エクス・ビボまたはイン・ビボで、特にイン・ビボで標的細胞に移入するための、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の複合体の請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物の請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。３０．上記標的細胞が哺乳類細胞である、請求項２９に記載の使用。３１．上記標的細胞が、筋肉細胞、造血幹細胞、気道の細胞、更に詳細には気管または肺細胞から選択される、請求項３０に記載の使用。３２．治療活性物質を標的細胞中にイン・ビトロで移入する方法であって、上記細胞を請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の複合体と接触させることを特徴とする、方法。３３．治療、予防またはワクチン用の医薬としての、請求項１６〜２２または２８のいずれか１項に記載の複合体。３４．少なくとも１個の治療活性物質、特に核酸を標的細胞中に移入することからなる治療処置の方法を行なうための、請求項３３に記載の複合体。３５．上記標的細胞が哺乳類細胞である、請求項３４に記載の複合体。３６．上記標的細胞が、筋肉細胞、造血幹細胞、気道の細胞、更に詳細には気管または肺細胞、気道上皮の細胞から選択される、請求項３５に記載の複合体。３７．特に遺伝子治療によるヒトまたは動物体の治療を目的とした、治療、予防またはワクチン用の医薬の製造のための、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の複合体の請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物の請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。３８．医薬が、筋肉内注射、吸入、気管内注射、点滴注入、エーロゾル投与、局所経路または経口による投与を目的とする、請求項３７に記載の使用。３９．請求項１６〜２３または２８のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の複合体を含んでなる、医薬製剤。４０．更に、上記複合体の移入用粉末を増強することができる少なくとも１種類のアジュバントを含んでなる、請求項３９に記載の製剤。４１．クロロキン、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル−Ｌ−２−ピロリドンまたはその誘導体から選択されるプロトン性の極性化合物、または特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたはそれらの誘導体から選択される非プロトン性の極性化合物からなる群から選択される、請求項４０に記載の製剤。４２．更に、ヒトまたは動物に投与する薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の製剤。４３．請求項１６〜２２または２８および４４のいずれか１項に記載の複合体を用いてトランスフェクションした細胞。４４．Ｒ₁および／またはＲ₂がフッ素化されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物、請求項１６〜２２または２８のいずれか１項に記載の複合体。４５．Ｒ₁および／またはＲ₂上のフッ素化炭素原子の数が１〜１２、更に詳細には４〜８の間で変化することがある、請求項４４に記載の化合物、組成物または複合体。４６．Ｒ₁および／またはＲ₂が１５の炭素を有するアルキル基であり、鎖Ｒ₁ および／またはＲ₂上のフッ素化炭素原子の数が₄である、請求項４４に記載の化合物、組成物または複合体。