JP2002541264A - 冨ｇオリゴヌクレオチドの抗増殖活性およびヌクレオリンに結合するためのその使用方法 - Google Patents
冨ｇオリゴヌクレオチドの抗増殖活性およびヌクレオリンに結合するためのその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、治療的有効量の冨グアノシンオリゴヌクレオチドを被験者に投与することによる被験者における悪性および／または過形成細胞の増殖の抑制方法を提供する。また本発明は、細胞、特に悪性および／または過形成細胞の増殖に関与するヌクレオリンおよび／または事実上ヌクレオリン様である特定の細胞タンパク質に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド、そしてそれらの選択方法を提供する。
Description
【０００１】 ［助成参照］ 本研究は、Department of Defense（CDMRP）Prostate Cancer Initiative Gra
nt #DAMD-17-98-1-8583により支持された。
nt #DAMD-17-98-1-8583により支持された。
【０００２】 ［発明の分野］ 本発明は、細胞増殖の抑制に関する。特に本発明は、細胞増殖に関連した特定
のタンパク質と結合することによる、新形成細胞および／または異形成細胞の増
殖を含めた細胞増殖を抑制する特定のオリゴヌクレオチドに関する。
のタンパク質と結合することによる、新形成細胞および／または異形成細胞の増
殖を含めた細胞増殖を抑制する特定のオリゴヌクレオチドに関する。
【０００３】 ［発明の背景］ オリゴヌクレオチドは、顕著な程度の特異性によりＤＮＡまたはＲＮＡの独特
の配列を認識する能力を有する。この理由のために、それらは、悪性、ウイルス
性および炎症性疾患の治療のための遺伝子特異的療法を実現する有望な候補であ
ると考えられてきた。オリゴヌクレオチド媒介性療法的介在の２つの主要戦略、
即ちアンチセンスおよび抗原アプローチが開発されてきた。アンチセンス戦略は
、特定のｍＲＮＡとのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより特定
の遺伝子の発現を下向き調節し、翻訳の抑制を生じることを目的としている（Ge
wirtz et al.（1998） Blood 92, 712-736; Crooke（1998） Antisense Nucleic
Acid Drug Dev. 8, 115-122; Branch（1998） Trends Biochem. Sci. 23, 45-5
0; Agrawal et al.（1998） Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135-139）
。抗原戦略は、オリゴヌクレオチドと二本鎖ゲノムＤＮＡ中の特定の配列との間
の三重らせん形成により標的遺伝子の転写を抑制することを提案する（Helene e
t al.（1997） Ciba Found. Symp. 209, 94-102）。アンチセンスアプローチに
基づいた臨床試験は、目下、オリゴヌクレオチドが臨床的関連方法で投与され、
副作用はほとんどない、ということを示している（Gewirtz et al.（1998）Bloo
d 92, 712-736; Agrawal et al.（1998）Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8,
135-139）。
の配列を認識する能力を有する。この理由のために、それらは、悪性、ウイルス
性および炎症性疾患の治療のための遺伝子特異的療法を実現する有望な候補であ
ると考えられてきた。オリゴヌクレオチド媒介性療法的介在の２つの主要戦略、
即ちアンチセンスおよび抗原アプローチが開発されてきた。アンチセンス戦略は
、特定のｍＲＮＡとのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより特定
の遺伝子の発現を下向き調節し、翻訳の抑制を生じることを目的としている（Ge
wirtz et al.（1998） Blood 92, 712-736; Crooke（1998） Antisense Nucleic
Acid Drug Dev. 8, 115-122; Branch（1998） Trends Biochem. Sci. 23, 45-5
0; Agrawal et al.（1998） Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135-139）
。抗原戦略は、オリゴヌクレオチドと二本鎖ゲノムＤＮＡ中の特定の配列との間
の三重らせん形成により標的遺伝子の転写を抑制することを提案する（Helene e
t al.（1997） Ciba Found. Symp. 209, 94-102）。アンチセンスアプローチに
基づいた臨床試験は、目下、オリゴヌクレオチドが臨床的関連方法で投与され、
副作用はほとんどない、ということを示している（Gewirtz et al.（1998）Bloo
d 92, 712-736; Agrawal et al.（1998）Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8,
135-139）。
【０００４】 アンチセンスおよび抗原戦略はともに何らかの成功を偶然見出したこともある
一方で、オリゴヌクレオチドと生体の構成成分との相互作用が標的核酸との配列
特異的ハイブリダイゼーションにはるかにまさる、ということが近年明らかにな
ってきた。初期アンチセンスデータの近年の研究および再検査は、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの観察された生物学的作用のいくつかが標的ｍＲＮＡとのワ
トソン−クリックハイブリダイゼーションに全く帰因しているというわけではな
いことを示唆している。いくつかの場合には、予測生物学的作用（例えば、細胞
成長の抑制またはアポトーシス）が達成されたが、しかしこれは標的タンパク質
の下向き調節を伴わず、したがって真のアンチセンス作用とは思われなかった（
White et al.（1996）Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 118-124; Dryden
et al.（1998）J. Endocrinol. 157, 169-175）。多くの場合、他の非配列特異
的オリゴヌクレオチドはアンチセンス配列に匹敵するかまたはそれを越える生物
学的作用を及ぼし得る、ということが実証された（Barton et al.（1995）Br. J
. Cancer 71, 429-437; Burgess et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
2:4051-4055; Benimetskaya et al.（1997）Nucleic Acids Res. 25, 2648-2656
）。適切な対照オリゴヌクレオチドの重要性および標的タンパク質産生の抑制を
実証することの必要性についてのアンチセンス研究者の間の高い意識が一般的に
認められる（Stein（1998）Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 129-132）が
、しかし非アンチセンス作用は十分には分かっていない。
一方で、オリゴヌクレオチドと生体の構成成分との相互作用が標的核酸との配列
特異的ハイブリダイゼーションにはるかにまさる、ということが近年明らかにな
ってきた。初期アンチセンスデータの近年の研究および再検査は、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの観察された生物学的作用のいくつかが標的ｍＲＮＡとのワ
トソン−クリックハイブリダイゼーションに全く帰因しているというわけではな
いことを示唆している。いくつかの場合には、予測生物学的作用（例えば、細胞
成長の抑制またはアポトーシス）が達成されたが、しかしこれは標的タンパク質
の下向き調節を伴わず、したがって真のアンチセンス作用とは思われなかった（
White et al.（1996）Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 118-124; Dryden
et al.（1998）J. Endocrinol. 157, 169-175）。多くの場合、他の非配列特異
的オリゴヌクレオチドはアンチセンス配列に匹敵するかまたはそれを越える生物
学的作用を及ぼし得る、ということが実証された（Barton et al.（1995）Br. J
. Cancer 71, 429-437; Burgess et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
2:4051-4055; Benimetskaya et al.（1997）Nucleic Acids Res. 25, 2648-2656
）。適切な対照オリゴヌクレオチドの重要性および標的タンパク質産生の抑制を
実証することの必要性についてのアンチセンス研究者の間の高い意識が一般的に
認められる（Stein（1998）Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 129-132）が
、しかし非アンチセンス作用は十分には分かっていない。
【０００５】 特に、連続グアノシン（Ｇ）を含有するホスホジエステルおよびホスホロチオ
エートオリゴデオキシヌクレオチドは、培養中の細胞の成長に及ぼす非アンチセ
ンス作用を有することが反復的に見出されている（Burgess et al.（1995）Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 92,4051-4055; Benimetskaya et al.（1997）Nucleic
Acids Res. 25, 2648-2656; Saijo et al.（1997）Jpn. J. Cancer Res. 88, 26
-33）。この活性は分子内または分子間Ｇ四重を包含する安定構造を形成するこ
れらのオリゴヌクレオチドの能力に関連する、という証拠がある（Burgess et a
l.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,4051-4055; Benimetskaya et al.（
1997）Nucleic Acids Res. 25, 2648-2656）。これらは、一価陽イオンにより安
定化される４つの水素結合グアニンの正方形平面配置である。このような構造は
、インビボで重要な役割を演じると考えられ、推定四重形成配列はテロメアＤＮ
Ａ（Sundquist et al.（1989）Nature 342, 825-829）、免疫グロブリンスイッ
チ領域配列（Sen et al.（1988）Nature 334, 364-366）、ＨＩＶ１ ＲＮＡ（Su
ndquist et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3393-3397）、脆弱Ｘ
反復配列（Fry et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4950-4954）お
よび網膜芽細胞腫遺伝子（Murchie et al.（1992）Nucleic Acids Res. 20, 49-
53）で同定されている。
エートオリゴデオキシヌクレオチドは、培養中の細胞の成長に及ぼす非アンチセ
ンス作用を有することが反復的に見出されている（Burgess et al.（1995）Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 92,4051-4055; Benimetskaya et al.（1997）Nucleic
Acids Res. 25, 2648-2656; Saijo et al.（1997）Jpn. J. Cancer Res. 88, 26
-33）。この活性は分子内または分子間Ｇ四重を包含する安定構造を形成するこ
れらのオリゴヌクレオチドの能力に関連する、という証拠がある（Burgess et a
l.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,4051-4055; Benimetskaya et al.（
1997）Nucleic Acids Res. 25, 2648-2656）。これらは、一価陽イオンにより安
定化される４つの水素結合グアニンの正方形平面配置である。このような構造は
、インビボで重要な役割を演じると考えられ、推定四重形成配列はテロメアＤＮ
Ａ（Sundquist et al.（1989）Nature 342, 825-829）、免疫グロブリンスイッ
チ領域配列（Sen et al.（1988）Nature 334, 364-366）、ＨＩＶ１ ＲＮＡ（Su
ndquist et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3393-3397）、脆弱Ｘ
反復配列（Fry et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4950-4954）お
よび網膜芽細胞腫遺伝子（Murchie et al.（1992）Nucleic Acids Res. 20, 49-
53）で同定されている。
【０００６】 非アンチセンス作用はオリゴヌクレオチドによる細胞内または表面タンパク質
の隔絶に帰因し得るということが示唆されている（Gold et al.（1995）Annu. R
ev. Biochem. 64, 763-797; Stein（1997）Ciba Found. Symp. 209, 79-89）。
折り畳まれたＧ四重含有構造を形成可能な冨Ｇオリゴヌクレオチドに関しては、
この結合は、オリゴヌクレオチドの一次配列の認識によるのでなく、むしろそれ
らの独特の三次元形状の認識により媒介されると考えられる。しかしながら、こ
れらのオリゴヌクレオチドのタンパク質標的は、十分に特性化されてはいない。
の隔絶に帰因し得るということが示唆されている（Gold et al.（1995）Annu. R
ev. Biochem. 64, 763-797; Stein（1997）Ciba Found. Symp. 209, 79-89）。
折り畳まれたＧ四重含有構造を形成可能な冨Ｇオリゴヌクレオチドに関しては、
この結合は、オリゴヌクレオチドの一次配列の認識によるのでなく、むしろそれ
らの独特の三次元形状の認識により媒介されると考えられる。しかしながら、こ
れらのオリゴヌクレオチドのタンパク質標的は、十分に特性化されてはいない。
【０００７】 オリゴヌクレオチドは、おそらくは受容体媒介性エンドサイトーシスにより細
胞中にインターナライズされるポリ陰イオン種である（Vlassov et al.（1994）
Biochim. Biophys. Acta 1197, 95-108）。それらは、それらの電荷およびそれ
らの形状の両方、ならびに配列特異的相互作用によって、細胞内で、および細胞
外膜においても多数の生体分子と相互作用すると思われる。オリゴヌクレオチド
と結合し、非アンチセンス作用を媒介するタンパク質は、まだ決定的には同定さ
れていない。
胞中にインターナライズされるポリ陰イオン種である（Vlassov et al.（1994）
Biochim. Biophys. Acta 1197, 95-108）。それらは、それらの電荷およびそれ
らの形状の両方、ならびに配列特異的相互作用によって、細胞内で、および細胞
外膜においても多数の生体分子と相互作用すると思われる。オリゴヌクレオチド
と結合し、非アンチセンス作用を媒介するタンパク質は、まだ決定的には同定さ
れていない。
【０００８】 本発明は、冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質を同定するが、このタンパ
ク質と結合する冨Ｇオリゴヌクレオチドの能力は、Ｇ四重を形成するその傾向と
、ならびに腫瘍細胞の成長を抑制するその能力と相関する。
ク質と結合する冨Ｇオリゴヌクレオチドの能力は、Ｇ四重を形成するその傾向と
、ならびに腫瘍細胞の成長を抑制するその能力と相関する。
【０００９】 いかなる予測アンチセンスまたは抗原活性とも関連しない強い成長抑制作用を
有する冨Ｇオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）を出願人等は記載した。これらの作用
のメカニズムはまだ特定的に記述されてはいないが、しかし、これらのオリゴヌ
クレオチドの抗増殖作用が特定細胞タンパク質と結合するそれらの能力に関連す
る、ということを出願人等は実証した。ＧＲＯ結合タンパク質は抗ヌクレオリン
抗体によっても認識されるため、このタンパク質はヌクレオリンそれ自体である
かまたはヌクレオリンとの免疫原的類似性を共有する同様サイズのタンパク質で
ある、と出願人等は結論づけた。
有する冨Ｇオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）を出願人等は記載した。これらの作用
のメカニズムはまだ特定的に記述されてはいないが、しかし、これらのオリゴヌ
クレオチドの抗増殖作用が特定細胞タンパク質と結合するそれらの能力に関連す
る、ということを出願人等は実証した。ＧＲＯ結合タンパク質は抗ヌクレオリン
抗体によっても認識されるため、このタンパク質はヌクレオリンそれ自体である
かまたはヌクレオリンとの免疫原的類似性を共有する同様サイズのタンパク質で
ある、と出願人等は結論づけた。
【００１０】 ヌクレオリンは、増殖中細胞の核小体中に主に局限されると考えられる豊富な
多機能性１１０ｋＤａリンタンパク質である（再検討のためには、Tuteja et al
.（1998）Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al.（199
9）J. Cell Sci. 112, 761-772を参照）。ヌクレオリンは、ｒＤＮＡ転写の制御
、前リボソームパッケージングおよび核小体クロマチンのオーガナイゼーション
を含めたリボソーム生合成の多数の局面に結びつけられてきた（Tuteja et al.
（1998）Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al.（1999
）J. Cell Sci. 112, 761-772; Ginisty et al.（1998）EMBO J. 17, 1476-1486
）。ヌクレオリンに関して出現する別の役割は、細胞質と細胞の核／核小体との
間のウイルスおよび細胞タンパク質を輸送するシャトルタンパク質としての役割
である（Kibbey et al.（1995）J. Neurosci. Res. 42, 314-322; Lee et al.（
1998）J. Biol. Chem. 273, 7650-7656; Waggoner et al.（1998）J. Virol. 72
, 6699-6709）。ヌクレオリンは、核マトリックス構造（Gotzmann et al.（1997
）Electrophoresis 18, 2645-2653）、細胞質分裂および核分裂（Leger-Silvest
re et al.（1997）Chromosoma 105, 542-52）ならびにＲＮＡおよびＤＮＡヘリ
カーゼ（Tuteja et al.（1995）Gene 160, 143-148）としての役割を含めた他の
役割にも直接または間接的に関連する。ヌクレオリンの多機能性は、ヒストン様
Ｎ末端、ＲＮＡ認識モチーフを含有する中心ドメイン、および冨グリシン／アル
ギニンＣ末端から成るその多ドメイン構造に反映される（Lapeyre et al.（1987
）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1472-1476）。ヌクレオリンのレベルは、細
胞増殖の速度に関連することが知られており（Derenzini et al.（1995）Lab. I
nvest. 73, 497-502; Roussel et al.（1994）Exp. Cell Res. 214, 465-472）
、急速増殖細胞、例えば悪性細胞中で上昇し、より遅く分裂する細胞中では下が
る。この理由のために、ヌクレオリンは興味をそそる治療標的である。
多機能性１１０ｋＤａリンタンパク質である（再検討のためには、Tuteja et al
.（1998）Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al.（199
9）J. Cell Sci. 112, 761-772を参照）。ヌクレオリンは、ｒＤＮＡ転写の制御
、前リボソームパッケージングおよび核小体クロマチンのオーガナイゼーション
を含めたリボソーム生合成の多数の局面に結びつけられてきた（Tuteja et al.
（1998）Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407-436; Ginisty et al.（1999
）J. Cell Sci. 112, 761-772; Ginisty et al.（1998）EMBO J. 17, 1476-1486
）。ヌクレオリンに関して出現する別の役割は、細胞質と細胞の核／核小体との
間のウイルスおよび細胞タンパク質を輸送するシャトルタンパク質としての役割
である（Kibbey et al.（1995）J. Neurosci. Res. 42, 314-322; Lee et al.（
1998）J. Biol. Chem. 273, 7650-7656; Waggoner et al.（1998）J. Virol. 72
, 6699-6709）。ヌクレオリンは、核マトリックス構造（Gotzmann et al.（1997
）Electrophoresis 18, 2645-2653）、細胞質分裂および核分裂（Leger-Silvest
re et al.（1997）Chromosoma 105, 542-52）ならびにＲＮＡおよびＤＮＡヘリ
カーゼ（Tuteja et al.（1995）Gene 160, 143-148）としての役割を含めた他の
役割にも直接または間接的に関連する。ヌクレオリンの多機能性は、ヒストン様
Ｎ末端、ＲＮＡ認識モチーフを含有する中心ドメイン、および冨グリシン／アル
ギニンＣ末端から成るその多ドメイン構造に反映される（Lapeyre et al.（1987
）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1472-1476）。ヌクレオリンのレベルは、細
胞増殖の速度に関連することが知られており（Derenzini et al.（1995）Lab. I
nvest. 73, 497-502; Roussel et al.（1994）Exp. Cell Res. 214, 465-472）
、急速増殖細胞、例えば悪性細胞中で上昇し、より遅く分裂する細胞中では下が
る。この理由のために、ヌクレオリンは興味をそそる治療標的である。
【００１１】 主要核小体タンパク質を考察したが、しかしヌクレオリンは形質膜中に存在し
たという知見は細胞表面ヌクレオリンを同定するいくつかの報告と一致し、細胞
表面受容体としてのその役割を示唆する（Larrucea et al.（1998）J. Biol. Ch
em. 273, 31718-31725; Callebout et al.（1998）J. Biol. Chem. 273, 21988-
21997; Semenkovich et al.（1990）Biochemistry 29, 9708; Jordan et al.（1
994）Biochemistry 33, 14696-14706）。
たという知見は細胞表面ヌクレオリンを同定するいくつかの報告と一致し、細胞
表面受容体としてのその役割を示唆する（Larrucea et al.（1998）J. Biol. Ch
em. 273, 31718-31725; Callebout et al.（1998）J. Biol. Chem. 273, 21988-
21997; Semenkovich et al.（1990）Biochemistry 29, 9708; Jordan et al.（1
994）Biochemistry 33, 14696-14706）。
【００１２】 オリゴヌクレオチドの非配列特異的作用を説明するために、過去にいくつかの
メカニズムが提唱された。これらには、細胞受容体との結合（Rockwell et al.
（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,6523-6528; Coulson et al.（1996）M
ol. Pharmacol. 50,314-325）、サイトカインまたは成長因子活性のモジュレー
ション（Hartmann et al.（1996）Mol. Med. 2, 429-438; Sonehara et al.（19
96）J. Interferon Cytokine Res. 16, 799-803; Fennewald et al.（1995）J.
Biol. Chem. 270, 21718-21721; Guvakova et al.（1995）J. Biol. Chem. 270,
2620-2627; Scaggiante et al.（1998）Eur. J. Biochem. 252, 207-215）、細
胞周期進行の抑制（Burgess et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,40
51-4055）、細胞接着の変化（Saijo et al.（1997）Jpn. J. Cancer Res. 88, 2
6-33）および非特性化４５ｋＤａタンパク質との結合（Ramanathan et al.（199
4）J. Biol. Chem. 269, 24564-24574）が含まれた。５’−ＣＧ−３’配列を含
有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激特性も記載されている（McCluskie et al.
（1998）J. Immunol. 161, 4463-4466）が、しかしそれらが出願人等が観察した
作用に関連するとは思われない。
メカニズムが提唱された。これらには、細胞受容体との結合（Rockwell et al.
（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,6523-6528; Coulson et al.（1996）M
ol. Pharmacol. 50,314-325）、サイトカインまたは成長因子活性のモジュレー
ション（Hartmann et al.（1996）Mol. Med. 2, 429-438; Sonehara et al.（19
96）J. Interferon Cytokine Res. 16, 799-803; Fennewald et al.（1995）J.
Biol. Chem. 270, 21718-21721; Guvakova et al.（1995）J. Biol. Chem. 270,
2620-2627; Scaggiante et al.（1998）Eur. J. Biochem. 252, 207-215）、細
胞周期進行の抑制（Burgess et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,40
51-4055）、細胞接着の変化（Saijo et al.（1997）Jpn. J. Cancer Res. 88, 2
6-33）および非特性化４５ｋＤａタンパク質との結合（Ramanathan et al.（199
4）J. Biol. Chem. 269, 24564-24574）が含まれた。５’−ＣＧ−３’配列を含
有するオリゴヌクレオチドの免疫刺激特性も記載されている（McCluskie et al.
（1998）J. Immunol. 161, 4463-4466）が、しかしそれらが出願人等が観察した
作用に関連するとは思われない。
【００１３】 本発明の出願において、出願人等はオリゴヌクレオチド結合タンパク質を同定
し、このタンパク質との結合と一連の冨Ｇオリゴヌクレオチドに関する抗増殖活
性との間の相関を示した。これらの知見は、細胞成長の非アンチセンスオリゴヌ
クレオチド媒介性抑制におけるこれらのタンパク質に関するメカニズム的役割を
強く示唆する。ヌクレオリンによるＧＲＯの認識のための基礎は試験したオリゴ
ヌクレオチドの配列からは明らかでないが、しかし特定のＧ四重構造を形成する
それらの傾向に関連し得る。
し、このタンパク質との結合と一連の冨Ｇオリゴヌクレオチドに関する抗増殖活
性との間の相関を示した。これらの知見は、細胞成長の非アンチセンスオリゴヌ
クレオチド媒介性抑制におけるこれらのタンパク質に関するメカニズム的役割を
強く示唆する。ヌクレオリンによるＧＲＯの認識のための基礎は試験したオリゴ
ヌクレオチドの配列からは明らかでないが、しかし特定のＧ四重構造を形成する
それらの傾向に関連し得る。
【００１４】 その他の非冨Ｇオリゴヌクレオチドに関するヌクレオリン結合および抗増殖活
性間の関係は、まだ十分に評価されていない。一混合配列オリゴヌクレオチド（
ＭＩＸ１）はヌクレオリンを結合することが見出されたが、しかしそれは成長抑
制作用を有さなかった。ヌクレオリンは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの特定配列
を認識し得るＲＮＡ結合ドメインを含有する（Dickinson et al.（1995）Mol. C
ell Biol. 15, 456-465; Ghisolfi et al.（1996）J. Mol. Biol. 260, 34-53）
。この特殊なオリゴヌクレオチドは、このような認識エレメントによく似た配列
または構造を含有することがあり得る。
性間の関係は、まだ十分に評価されていない。一混合配列オリゴヌクレオチド（
ＭＩＸ１）はヌクレオリンを結合することが見出されたが、しかしそれは成長抑
制作用を有さなかった。ヌクレオリンは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの特定配列
を認識し得るＲＮＡ結合ドメインを含有する（Dickinson et al.（1995）Mol. C
ell Biol. 15, 456-465; Ghisolfi et al.（1996）J. Mol. Biol. 260, 34-53）
。この特殊なオリゴヌクレオチドは、このような認識エレメントによく似た配列
または構造を含有することがあり得る。
【００１５】 ヌクレオリンが冨Ｇオリゴヌクレオチドと結合するという出願人等の知見を支
持して、ヌクレオリンが他のＧ四重形成配列、例えば免疫グロブリンスイッチ領
域およびリボソーム遺伝子配列と結合し得る、ということを最新の報告は実証し
ている（Dempsey et al.（1999）J. Biol. Chem. 274, 1066-1071およびHanakai
et al.（1999）J. Biol. Chem. 274, 15903-15912）。ヌクレオリンは一般に、
例えばリボソームＤＮＡスイッチ領域配列またはテロメアにおける冨Ｇ配列の認
識に依存しているインビボでの非限定機能を有し得る。
持して、ヌクレオリンが他のＧ四重形成配列、例えば免疫グロブリンスイッチ領
域およびリボソーム遺伝子配列と結合し得る、ということを最新の報告は実証し
ている（Dempsey et al.（1999）J. Biol. Chem. 274, 1066-1071およびHanakai
et al.（1999）J. Biol. Chem. 274, 15903-15912）。ヌクレオリンは一般に、
例えばリボソームＤＮＡスイッチ領域配列またはテロメアにおける冨Ｇ配列の認
識に依存しているインビボでの非限定機能を有し得る。
【００１６】 ヌクレオリンの合成は細胞分裂の速度増大と明確に相関し、したがって、ヌク
レオリンレベルは、ほとんどの正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞中でより高い
。実際、ヌクレオリンは、銀染色により測定した場合、そのレベルが細胞増殖の
マーカーおよび悪性疾患の指標として病理学者により査定される核オルガナイザ
ー領域（ＮＯＲ）タンパク質の１つである。したがって、ヌクレオリンは、治療
的介入のための腫瘍選択性標的であり、そして機能性ヌクレオリンのレベルを低
減するための戦略は腫瘍細胞増殖を抑制することが予期される。
レオリンレベルは、ほとんどの正常細胞と比較した場合、腫瘍細胞中でより高い
。実際、ヌクレオリンは、銀染色により測定した場合、そのレベルが細胞増殖の
マーカーおよび悪性疾患の指標として病理学者により査定される核オルガナイザ
ー領域（ＮＯＲ）タンパク質の１つである。したがって、ヌクレオリンは、治療
的介入のための腫瘍選択性標的であり、そして機能性ヌクレオリンのレベルを低
減するための戦略は腫瘍細胞増殖を抑制することが予期される。
【００１７】 細胞の成長におけるヌクレオリン抑制の結果は十分研究されてはいないが、し
かしその機能としてリボソーム産生、核輸送および細胞進入が挙げられるタンパ
ク質の抑制は、細胞の成長に顕著な作用を及ぼすはずである。
かしその機能としてリボソーム産生、核輸送および細胞進入が挙げられるタンパ
ク質の抑制は、細胞の成長に顕著な作用を及ぼすはずである。
【００１８】 ［発明の概要］ 本発明は、治療的有効量の冨グアノシンオリゴヌクレオチドを被験者に投与す
ることによる被験者における悪性、異形成および／または過増殖性細胞の増殖の
抑制方法を提供する。
ることによる被験者における悪性、異形成および／または過増殖性細胞の増殖の
抑制方法を提供する。
【００１９】 本発明は、細胞、特に悪性、異形成および／または過増殖性細胞の増殖に関与
する特定の細胞タンパク質に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドも提供する
。
する特定の細胞タンパク質に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドも提供する
。
【００２０】 本発明は、冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合可能な分子または化
合物に関するスクリーニング方法も提供する。 本発明の前記で引用した特徴、利点および目的、ならびに明らかになる他のも
のが得られ、詳細に理解され得るよう、添付の図面に説明するそのいくつかの実
施態様を参照することにより前記で簡単に要約した本発明のさらに詳細な説明が
示され得る。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付の
図面は本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、したがってそれらの範
囲に限定して考えられるべきではない、ということに留意すべきである。
合物に関するスクリーニング方法も提供する。 本発明の前記で引用した特徴、利点および目的、ならびに明らかになる他のも
のが得られ、詳細に理解され得るよう、添付の図面に説明するそのいくつかの実
施態様を参照することにより前記で簡単に要約した本発明のさらに詳細な説明が
示され得る。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付の
図面は本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、したがってそれらの範
囲に限定して考えられるべきではない、ということに留意すべきである。
【００２１】 ［発明の詳細な説明］ 本発明は、新規の冨グアニンオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）、ならびに被験者
における新形成性、異形成性、またはそうでなければ過増殖性細胞の成長を抑制
するための少なくとも１つのＧＲＯの使用方法を提供する。
における新形成性、異形成性、またはそうでなければ過増殖性細胞の成長を抑制
するための少なくとも１つのＧＲＯの使用方法を提供する。
【００２２】 本発明の新規オリゴヌクレオチドの例は、以下の核酸配列を有し、また表わさ
れる：ＧＲＯ１４Ａ（5’-GTTGTTTGGGGTGG-3’、配列番号１）、ＧＲＯ１５Ａ（
5’-GTTGTTTGGGGTGGT-3’、配列番号２）、ＧＲＯ２５Ａ（5’-GGTTGGGGTGGGTGG
GGTGGGTGGG-3’、配列番号３）、ＧＲＯ２８Ａ（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT
GGTG-3’、配列番号４）、ＧＲＯ２９Ａ（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-
3’、配列番号５）、ＧＲＯ２９−２（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3’
、配列番号６）、ＧＲＯ２９−３（5’-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’、
配列番号７）、ＧＲＯ２９−５（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3’、配
列番号８）、ＧＲＯ２９−１３（5’-TGGTGGTGGTGGT-3’、配列番号９）、ＧＲ
Ｏ１１Ａ（5’-GGTGGTGGTGG-3’、配列番号１０）、ＧＲＯ１４Ｃ（5’-GGTGGTT
GTGGTGG-3’、配列番号１１）、ＧＲＯ２６Ｂ（5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG
G-3’、配列番号１２）、ＧＲＯ５６Ａ（5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTG
GTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’、配列番号１３）、ＧＲＯ３２Ａ（5’-GGTGGTT
GTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3’、配列番号１４）、ＧＲＯ３２Ｂ（5’-TTTGGTG
GTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’、配列番号１５）、ＧＲＯ２９−６（5’-GGTGG
TGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’、配列番号１６）、ＧＲＯ２８Ｂ（5’-TTTGGTGG
TGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3’、配列番号１７）およびＧＲＯ１３Ａ（5’-TGGTGGTG
GT-3’、配列番号１８）。同一活性を有するその他のオリゴヌクレオチドも意図
される。
れる：ＧＲＯ１４Ａ（5’-GTTGTTTGGGGTGG-3’、配列番号１）、ＧＲＯ１５Ａ（
5’-GTTGTTTGGGGTGGT-3’、配列番号２）、ＧＲＯ２５Ａ（5’-GGTTGGGGTGGGTGG
GGTGGGTGGG-3’、配列番号３）、ＧＲＯ２８Ａ（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT
GGTG-3’、配列番号４）、ＧＲＯ２９Ａ（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-
3’、配列番号５）、ＧＲＯ２９−２（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3’
、配列番号６）、ＧＲＯ２９−３（5’-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’、
配列番号７）、ＧＲＯ２９−５（5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3’、配
列番号８）、ＧＲＯ２９−１３（5’-TGGTGGTGGTGGT-3’、配列番号９）、ＧＲ
Ｏ１１Ａ（5’-GGTGGTGGTGG-3’、配列番号１０）、ＧＲＯ１４Ｃ（5’-GGTGGTT
GTGGTGG-3’、配列番号１１）、ＧＲＯ２６Ｂ（5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG
G-3’、配列番号１２）、ＧＲＯ５６Ａ（5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTG
GTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’、配列番号１３）、ＧＲＯ３２Ａ（5’-GGTGGTT
GTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3’、配列番号１４）、ＧＲＯ３２Ｂ（5’-TTTGGTG
GTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’、配列番号１５）、ＧＲＯ２９−６（5’-GGTGG
TGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’、配列番号１６）、ＧＲＯ２８Ｂ（5’-TTTGGTGG
TGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3’、配列番号１７）およびＧＲＯ１３Ａ（5’-TGGTGGTG
GT-3’、配列番号１８）。同一活性を有するその他のオリゴヌクレオチドも意図
される。
【００２３】 オリゴヌクレオチドＧＲＯ２９−２、ＧＲＯ２９−３、ＧＲＯ２９−５、ＧＲ
Ｏ２９−１３、ＧＲＯ１５Ｃ、ＧＲＯ２８ＨおよびＧＲＯ２４Ｉは、電気泳動移
動度シフトアッセイにより示されているように、乳癌細胞の成長を抑制し、およ
び／または冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質との結合に関して競合するこ
とが示された（図６および７を参照）。本発明のＧＲＯの活性およびタンパク質
結合の実例としては図１および図６に示したＧＲＯ１５Ａ、２９Ａ；図７に示し
たＧＲＯ１４Ａ、２５Ａ、２８Ａ；図３に示したＧＲＯ１１Ａ、１４Ｃ、２６Ｂ
、３２Ａ、５６Ａが挙げられる。ＧＲＯ２９−２、２９−３、２９−５、２９−
６、２８Ｂも抗増殖活性およびタンパク質結合を有することが示された。
Ｏ２９−１３、ＧＲＯ１５Ｃ、ＧＲＯ２８ＨおよびＧＲＯ２４Ｉは、電気泳動移
動度シフトアッセイにより示されているように、乳癌細胞の成長を抑制し、およ
び／または冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質との結合に関して競合するこ
とが示された（図６および７を参照）。本発明のＧＲＯの活性およびタンパク質
結合の実例としては図１および図６に示したＧＲＯ１５Ａ、２９Ａ；図７に示し
たＧＲＯ１４Ａ、２５Ａ、２８Ａ；図３に示したＧＲＯ１１Ａ、１４Ｃ、２６Ｂ
、３２Ａ、５６Ａが挙げられる。ＧＲＯ２９−２、２９−３、２９−５、２９−
６、２８Ｂも抗増殖活性およびタンパク質結合を有することが示された。
【００２４】 冨Ｇオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）とは、オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、２’−Ｏ−メチル、ホスホロチオエートまたはその他の化学的類似主鎖を
有する４〜１００ヌクレオチド（好ましくは１０〜３０ヌクレオチド）から成る
いうことを意味する。それらの配列は、１つまたはそれ以上のＧＧＴモチーフを
含有する。オリゴヌクレオチドは、細胞に対する抗増殖活性を有し、ＧＲＯ結合
タンパク質および／またはヌクレオリンと結合する。これらの特性は、ＭＴＴア
ッセイおよび図６Ｂに示したＥＭＳＡ技法、あるいはその他の同様のアッセイを
用いて立証可能である。
ＮＡ、２’−Ｏ−メチル、ホスホロチオエートまたはその他の化学的類似主鎖を
有する４〜１００ヌクレオチド（好ましくは１０〜３０ヌクレオチド）から成る
いうことを意味する。それらの配列は、１つまたはそれ以上のＧＧＴモチーフを
含有する。オリゴヌクレオチドは、細胞に対する抗増殖活性を有し、ＧＲＯ結合
タンパク質および／またはヌクレオリンと結合する。これらの特性は、ＭＴＴア
ッセイおよび図６Ｂに示したＥＭＳＡ技法、あるいはその他の同様のアッセイを
用いて立証可能である。
【００２５】 本発明のオリゴヌクレオチドはグアノシンが豊富であり、Ｇ四重構造を形成可
能である。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、主としてチミジンおよびグア
ノシンで構成され、各オリゴヌクレオチドの配列中に少なくとも１つの連続グア
ノシン反復を有する。冨Ｇオリゴヌクレオチドは安定であり、長期間、血清中で
分解されないままでいることができ、少なくとも７日間の期間中、それらの成長
抑制作用を保持することが判明している。
能である。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、主としてチミジンおよびグア
ノシンで構成され、各オリゴヌクレオチドの配列中に少なくとも１つの連続グア
ノシン反復を有する。冨Ｇオリゴヌクレオチドは安定であり、長期間、血清中で
分解されないままでいることができ、少なくとも７日間の期間中、それらの成長
抑制作用を保持することが判明している。
【００２６】 本明細書中で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２またはそ
れ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子と定義さ
れる。的確なサイズは、標的リガンドに対する特異性および結合親和性を含めた
多数の因子によって決まる。「塩基」または「ヌクレオチド」に言及する場合、
その用語は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を含む。
れ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子と定義さ
れる。的確なサイズは、標的リガンドに対する特異性および結合親和性を含めた
多数の因子によって決まる。「塩基」または「ヌクレオチド」に言及する場合、
その用語は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を含む。
【００２７】 本発明の新規のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオリンおよびヌクレオリン様タ
ンパク質を含めた細胞増殖に関連する特定の細胞タンパク質と特異的に結合する
ことにより、悪性、異形成および／または過増殖性細胞の増殖を抑制するために
用いられ得る。
ンパク質を含めた細胞増殖に関連する特定の細胞タンパク質と特異的に結合する
ことにより、悪性、異形成および／または過増殖性細胞の増殖を抑制するために
用いられ得る。
【００２８】 「ヌクレオリン様」という用語は、ヌクレオリンそれ自体であるタンパク質、
またはヌクレオリンと免疫原的類似性および／または機能類似性を共有する同様
サイズのタンパク質を定義するために用いられる。
またはヌクレオリンと免疫原的類似性および／または機能類似性を共有する同様
サイズのタンパク質を定義するために用いられる。
【００２９】 オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの特異性を変えるために、それら
の３’末端で修飾可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端は、血清
ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を増大することが見出されて
いるプロピルアミン基の付加により修飾可能である。当業界で周知のその他の修
飾としては、３’および５’修飾、例えばコレステロールの結合、ならびに主鎖
修飾、例えばホスホロチオエート置換および／または２’−Ｏ−メチルＲＮＡが
挙げられる。
の３’末端で修飾可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端は、血清
ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を増大することが見出されて
いるプロピルアミン基の付加により修飾可能である。当業界で周知のその他の修
飾としては、３’および５’修飾、例えばコレステロールの結合、ならびに主鎖
修飾、例えばホスホロチオエート置換および／または２’−Ｏ−メチルＲＮＡが
挙げられる。
【００３０】 「悪性、異形成および／または過形成細胞の増殖の抑制」という用語はあらゆ
る部分的または全体的成長抑制を含み、そして細胞の増殖または成長の速度の低
減を含む。
る部分的または全体的成長抑制を含み、そして細胞の増殖または成長の速度の低
減を含む。
【００３１】 本明細書中で用いる場合、「新形成性」という用語は、組織および／または細
胞の新規の異常成長、例えば癌または腫瘍、例えば乳癌、白血病または前立腺癌
を含む。「新形成性」という用語は、隣接構造を侵襲し、破壊し得る、および／
または転移する悪性細胞も含む。
胞の新規の異常成長、例えば癌または腫瘍、例えば乳癌、白血病または前立腺癌
を含む。「新形成性」という用語は、隣接構造を侵襲し、破壊し得る、および／
または転移する悪性細胞も含む。
【００３２】 本明細書中で用いる場合、「異形成性」という用語は、乾癬のような症状を含
めた細胞、組織または構造のあらゆる異常成長を含む。
めた細胞、組織または構造のあらゆる異常成長を含む。
【００３３】 「被験者」という用語は、ヒトを含めたあらゆる動物を意味する。被験者の例
としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジおよびブタが挙げられる。
としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジおよびブタが挙げられる。
【００３４】 当業者は、悪性、異形成性または過増殖性症状、例えばそれぞれ癌または乾癬
を有する患者、例えば乳癌、前立腺癌、頸部癌等のような癌を有する患者を容易
に同定し得る。
を有する患者、例えば乳癌、前立腺癌、頸部癌等のような癌を有する患者を容易
に同定し得る。
【００３５】 治療的有効量は、被験者に投与した場合に、例えば異形成性、過増殖性または
悪性細胞の増殖を抑制または低減することにより、疾患、障害または症状の徴候
を改善する本発明のオリゴヌクレオチドの量である。
悪性細胞の増殖を抑制または低減することにより、疾患、障害または症状の徴候
を改善する本発明のオリゴヌクレオチドの量である。
【００３６】 本発明のＧＲＯは、単独で、または製剤組成物の一部として、患者または被験
者に投与され得る。ＧＲＯは、経口的に、直腸的に、非経口的に（静脈内的に、
筋内的にまたは皮下的に）、槽内的に、膣内的に、腹腔内的に、嚢内的に、局所
的に（粉末、軟膏またはドロップ）、あるいは頬または鼻腔スプレーとして、患
者に投与され得る。
者に投与され得る。ＧＲＯは、経口的に、直腸的に、非経口的に（静脈内的に、
筋内的にまたは皮下的に）、槽内的に、膣内的に、腹腔内的に、嚢内的に、局所
的に（粉末、軟膏またはドロップ）、あるいは頬または鼻腔スプレーとして、患
者に投与され得る。
【００３７】 非経口的注入に適した本発明のＧＲＯの組成物は、生理学的に許容可能な滅菌
水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、および滅菌注射溶液また
は分散液に再形成するための滅菌粉末を包含し得る。適切な水性および非水性担
体、稀釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの
適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）ならびに注射可能有機エステル、例
えばエチルオレエートが挙げられる。適正流動率は、例えばレシチンのようなコ
ーティングの使用により、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持により
、そして界面活性剤の使用により保持され得る。
水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、および滅菌注射溶液また
は分散液に再形成するための滅菌粉末を包含し得る。適切な水性および非水性担
体、稀釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの
適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）ならびに注射可能有機エステル、例
えばエチルオレエートが挙げられる。適正流動率は、例えばレシチンのようなコ
ーティングの使用により、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持により
、そして界面活性剤の使用により保持され得る。
【００３８】 これらの組成物は、アジュバント、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分配
剤も含有し得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例え
ばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により保証され得る
。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい。注射可能製剤形
態の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばアルミニウムモノステアレー
トおよびゼラチンの使用により引き起こされ得る。
剤も含有し得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例え
ばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により保証され得る
。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい。注射可能製剤形
態の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばアルミニウムモノステアレー
トおよびゼラチンの使用により引き起こされ得る。
【００３９】 経口投与のための固体投与形態としては、カプセル、錠剤、ピル、粉末および
顆粒が挙げられる。このような固体投与形態では、活性化合物（ＧＲＯ）は、少
なくとも１つの不活性通例賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムま
たはリン酸二カルシウム、あるいは（ａ）充填剤または増量剤、例えばデンプン
、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）結
合材、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニ
ルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えばグリセロ
ール、（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ
デンプン、アルギン酸、ある種の錯ケイ酸塩および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液
遅延剤、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレー
ト、（ｈ）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）滑剤、
例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリ
エチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、あるいはそれらの混合物と混和
される。カプセル、錠剤およびピルの場合には、投与形態は緩衝剤も含み得る。
顆粒が挙げられる。このような固体投与形態では、活性化合物（ＧＲＯ）は、少
なくとも１つの不活性通例賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムま
たはリン酸二カルシウム、あるいは（ａ）充填剤または増量剤、例えばデンプン
、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）結
合材、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニ
ルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えばグリセロ
ール、（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ
デンプン、アルギン酸、ある種の錯ケイ酸塩および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液
遅延剤、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合
物、（ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレー
ト、（ｈ）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）滑剤、
例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリ
エチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、あるいはそれらの混合物と混和
される。カプセル、錠剤およびピルの場合には、投与形態は緩衝剤も含み得る。
【００４０】 同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、ならびに
高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカ
プセル中の充填剤としても用いられ得る。
高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカ
プセル中の充填剤としても用いられ得る。
【００４１】 固体投与形態、例えば錠剤、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒は、コーティ
ングおよびシェル、例えば腸溶性コーティングおよび当業界で周知のその他のも
のを用いて調製され得る。それらは不透明剤を含有し得るし、それらが単数また
は複数の活性化合物を遅延方式で腸管の所定の部分に放出するような組成物でも
あり得る。用いられ得る包埋組成物の例は、高分子物質および蝋である。活性化
合物は微小カプセル化の形態でもあり得るし、適切な場合には、１つまたはそれ
以上の上記の賦形剤を含有し得る。
ングおよびシェル、例えば腸溶性コーティングおよび当業界で周知のその他のも
のを用いて調製され得る。それらは不透明剤を含有し得るし、それらが単数また
は複数の活性化合物を遅延方式で腸管の所定の部分に放出するような組成物でも
あり得る。用いられ得る包埋組成物の例は、高分子物質および蝋である。活性化
合物は微小カプセル化の形態でもあり得るし、適切な場合には、１つまたはそれ
以上の上記の賦形剤を含有し得る。
【００４２】 経口投与のための液体投与形態としては、製薬上許容可能な乳濁液、溶液、懸
濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性化合物の他に、液体投与形
態は、当業界で一般に用いられる不活性稀釈剤、例えば水またはその他の溶媒、
可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エ
チルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエ
ート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムア
ミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ芽油、オリーブ油、ヒマシ油お
よびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレン
グリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、あるいはこれらの物質の混合物
等を含有し得る。
濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性化合物の他に、液体投与形
態は、当業界で一般に用いられる不活性稀釈剤、例えば水またはその他の溶媒、
可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エ
チルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエ
ート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムア
ミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ芽油、オリーブ油、ヒマシ油お
よびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレン
グリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、あるいはこれらの物質の混合物
等を含有し得る。
【００４３】 このような不活性希釈剤の他に、組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳
化剤および沈澱防止剤、甘味剤、風味剤および香料も含み得る。
化剤および沈澱防止剤、甘味剤、風味剤および香料も含み得る。
【００４４】 懸濁液は、活性化合物の他に、沈澱防止剤、例えばエトキシル化イソステアリ
ルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微
晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびト
ラガカントゴムまたはこれらの物質の混合物等を含有し得る。
ルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微
晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびト
ラガカントゴムまたはこれらの物質の混合物等を含有し得る。
【００４５】 直腸投与のための組成物は、好ましくは、本発明の化合物を、常温では固体で
あるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔中で溶融して、活性構
成成分を放出する適切な非刺激性賦形剤または担体、例えばココアバター、ポリ
エチレングリコールまたは座薬蝋と混合することにより調製され得る座薬である
。
あるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔中で溶融して、活性構
成成分を放出する適切な非刺激性賦形剤または担体、例えばココアバター、ポリ
エチレングリコールまたは座薬蝋と混合することにより調製され得る座薬である
。
【００４６】 本発明のＧＲＯの局所投与のための投与形態としては、軟膏、粉末、スプレー
および吸入剤が挙げられる。活性構成成分は、滅菌条件下で、生理学的に許容可
能な担体と、ならびに必要とされ得る場合には、如何なる防腐剤、緩衝剤または
噴射剤とも混和される。眼用処方物、眼用軟膏、粉末および溶液も、本発明の範
囲内である場合には、意図される。
および吸入剤が挙げられる。活性構成成分は、滅菌条件下で、生理学的に許容可
能な担体と、ならびに必要とされ得る場合には、如何なる防腐剤、緩衝剤または
噴射剤とも混和される。眼用処方物、眼用軟膏、粉末および溶液も、本発明の範
囲内である場合には、意図される。
【００４７】 さらに、本発明のＧＲＯは、水、エタノール等のような製薬上許容可能な溶媒
との非溶媒和化ならびに溶媒和化形態で存在し得る。概して、溶媒和化形態は、
本発明の目的に関しては非溶媒和化形態と等価であると考えられる。
との非溶媒和化ならびに溶媒和化形態で存在し得る。概して、溶媒和化形態は、
本発明の目的に関しては非溶媒和化形態と等価であると考えられる。
【００４８】 本発明のＧＲＯは、約１．５ｍｇ〜約１５０ｍｇ／日の範囲の投与レベルで患
者に投与され得る。約７０ｋｇの体重を有する正常ヒト成人に関しては、約０．
２ｍｇ〜約２．０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲の投与量が好ましい。しかしなが
ら、用いられる特定投与量は、変わり得る。例えば、投与量は、患者の要件、治
療される症状の重症度および用いられる化合物の薬理学的活性を含めた多数の因
子によって決めることができる。特定の患者のための最適投与量の決定は、当業
者には周知である。本発明のＧＲＯは、１回および／または多数回投与で投与さ
れ得る。
者に投与され得る。約７０ｋｇの体重を有する正常ヒト成人に関しては、約０．
２ｍｇ〜約２．０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲の投与量が好ましい。しかしなが
ら、用いられる特定投与量は、変わり得る。例えば、投与量は、患者の要件、治
療される症状の重症度および用いられる化合物の薬理学的活性を含めた多数の因
子によって決めることができる。特定の患者のための最適投与量の決定は、当業
者には周知である。本発明のＧＲＯは、１回および／または多数回投与で投与さ
れ得る。
【００４９】 さらに、本発明は、標準有機合成技法（組合せ化学を含む）を用いて、または
生物学的方法（例えば代謝を通して）により作られたＧＲＯを網羅する、という
ことが意図される。
生物学的方法（例えば代謝を通して）により作られたＧＲＯを網羅する、という
ことが意図される。
【００５０】 本発明の冨Ｇオリゴヌクレオチドは、他の化学療法薬と組合せて用いて、共力
的または増強化効力、あるいは新形成性細胞成長の抑制を提供し得る。例えば、
本発明の冨Ｇオリゴヌクレオチドは、化学療法薬、例えばシスプラチン、ミトキ
サントロン、エトポシド、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビンブラス
チン、パクリタキセル、ドセタキセル、ミトラマイシンＡ、デキサメタソン、カ
フェインおよび当業者に周知のその他の化学療法薬と組合せて投与され得る。出
願人等により実行された実験は、ＧＲＯ２９Ａが、インビボでのＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞成長を抑制するに際してシスプラチンと共力的に作用する、というこ
とを示した。ＧＲＯ２９Ａがそれ自体ほとんど作用を有さない（５％成長抑制）
条件下で、シスプラチン（０．５μｇ／ｍｌ）およびＧＲＯ２９Ａの組合せは、
細胞成長を共働的に抑制する（６３％抑制。これに対比して、シスプラチン単独
に関しては２９％抑制）ということを出願人等は見出した。
的または増強化効力、あるいは新形成性細胞成長の抑制を提供し得る。例えば、
本発明の冨Ｇオリゴヌクレオチドは、化学療法薬、例えばシスプラチン、ミトキ
サントロン、エトポシド、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビンブラス
チン、パクリタキセル、ドセタキセル、ミトラマイシンＡ、デキサメタソン、カ
フェインおよび当業者に周知のその他の化学療法薬と組合せて投与され得る。出
願人等により実行された実験は、ＧＲＯ２９Ａが、インビボでのＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞成長を抑制するに際してシスプラチンと共力的に作用する、というこ
とを示した。ＧＲＯ２９Ａがそれ自体ほとんど作用を有さない（５％成長抑制）
条件下で、シスプラチン（０．５μｇ／ｍｌ）およびＧＲＯ２９Ａの組合せは、
細胞成長を共働的に抑制する（６３％抑制。これに対比して、シスプラチン単独
に関しては２９％抑制）ということを出願人等は見出した。
【００５１】 さらに、本発明は、冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合するオリゴ
ヌクレオチドの選択方法を提供する。本方法は、以下に記載されているように、
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を利用して、特定タンパク質と強く
結合し、したがって、本発明により、抗増殖活性を有することが予期されるオリ
ゴヌクレオチドに関してスクリーニングする。潜在的な抗増殖薬としてスクリー
ニングされるべきオリゴヌクレオチドは標識され、次に、非標識化競合体オリゴ
ヌクレオチドの非存在下または存在下で核抽出物とともにインキュベートされ、
反応させられる。次に反応混合物は電気泳動処理されて、移動度シフトおよび／
または結合強度を用いて特定のタンパク質と結合したオリゴヌクレオチドを同定
し得る。
ヌクレオチドの選択方法を提供する。本方法は、以下に記載されているように、
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を利用して、特定タンパク質と強く
結合し、したがって、本発明により、抗増殖活性を有することが予期されるオリ
ゴヌクレオチドに関してスクリーニングする。潜在的な抗増殖薬としてスクリー
ニングされるべきオリゴヌクレオチドは標識され、次に、非標識化競合体オリゴ
ヌクレオチドの非存在下または存在下で核抽出物とともにインキュベートされ、
反応させられる。次に反応混合物は電気泳動処理されて、移動度シフトおよび／
または結合強度を用いて特定のタンパク質と結合したオリゴヌクレオチドを同定
し得る。
【００５２】 あるいは、スクリーニングされるべき非標識化化合物は、標識化オリゴヌクレ
オチド（例えば、5’-TTAGGGTTAGGG TTAGGG TTAGGG）の存在下で核抽出物ととも
にインキュベートされ、図６Ｂにおけると同様に、シフト帯域の強度の低減によ
り、結合が査定される。
オチド（例えば、5’-TTAGGGTTAGGG TTAGGG TTAGGG）の存在下で核抽出物ととも
にインキュベートされ、図６Ｂにおけると同様に、シフト帯域の強度の低減によ
り、結合が査定される。
【００５３】 あるいは、スクリーニングされるべき化合物は、培養中で成長しつつある細胞
に付加され得る。潜在的な抗増殖薬は、図１０に示されているように、免疫蛍光
顕微鏡により検出した場合、強度変更およびヌクレオリンの局在化を引き起こす
ものとして同定される。
に付加され得る。潜在的な抗増殖薬は、図１０に示されているように、免疫蛍光
顕微鏡により検出した場合、強度変更およびヌクレオリンの局在化を引き起こす
ものとして同定される。
【００５４】 以下に提示される実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するよう意図され
、いかなる点でも、特許請求の範囲を含めた本明細書の範囲を限定するものでは
ない。
、いかなる点でも、特許請求の範囲を含めた本明細書の範囲を限定するものでは
ない。
【００５５】 ［実施例］ 実験手法 オリゴヌクレオチド ３’−修飾化オリゴヌクレオチドは、Oligos Etc.（Wilsonville, OR）から購
入するか、または、Glen Research (Sterling, VA)から入手できる３’−Ｃ３−
アミンＣＰＧカラムを用いて、バーミンガムにあるアラバマ大学（Birmingham）
で合成した。非修飾化オリゴヌクレオチドは、Life Technologies Inc., Gaithe
rsburg, MDから入手した。オリゴヌクレオチドを水中に再懸濁し、ｎ−ブチルア
ルコール中で沈澱させて、７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、滅菌水または
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。次に、０．２μｍフィル
ターを通した濾過により、それらを滅菌した。５’−放射能標識とその後のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、完全性に関して各オリゴヌク
レオチドを点検した。本論文に報告した結果は再現可能であり、合成オリゴヌク
レオチドの供給源とは無関係である。
入するか、または、Glen Research (Sterling, VA)から入手できる３’−Ｃ３−
アミンＣＰＧカラムを用いて、バーミンガムにあるアラバマ大学（Birmingham）
で合成した。非修飾化オリゴヌクレオチドは、Life Technologies Inc., Gaithe
rsburg, MDから入手した。オリゴヌクレオチドを水中に再懸濁し、ｎ−ブチルア
ルコール中で沈澱させて、７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、滅菌水または
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。次に、０．２μｍフィル
ターを通した濾過により、それらを滅菌した。５’−放射能標識とその後のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、完全性に関して各オリゴヌク
レオチドを点検した。本論文に報告した結果は再現可能であり、合成オリゴヌク
レオチドの供給源とは無関係である。
【００５６】 細胞成長アッセイ ９６ウエルプレート（１プレート／ＭＴＴアッセイ時点）中の適切な血清添加
培地中で細胞を低密度（細胞株によって１０2〜１０3細胞／ウエル）でプレート
化し、細胞培養の標準条件下で成長させた。翌日（１日目）、オリゴヌクレオチ
ドまたは対照としての水を培地に付加して、最終濃度を１５μＭとした。２、３
および４日目に、初期用量の半分と等価のさらなるオリゴヌクレオチドを培地に
付加した。プレート化後１、３、５、７および９日目に、ＭＴＴアッセイ（Morg
an（1998）Methods, Mol. Biol. 79, 179-183）を用いて、細胞をアッセイした
。培地は、実験継続中（非処理細胞が成長して集密になるのに要する時間）は取
り換えなかった。実験は３回実施した。バーはデータの標準誤差を表す。図７Ａ
に示した実験に関しては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（５ｘ１０2細胞／ウ
エル）を９６ウエルプレート中に入れた。２４時間後、１回用量のオリゴヌクレ
オチドまたは対照として等容量のＰＢＳを培地に付加して、最終濃度を１０μＭ
とした。ＭＴＴアッセイを用いて、プレート化後７日目に成育可能細胞を査定し
た。３’−非修飾化オリゴヌクレオチドを用いた実験（図７Ｄ）に関しては、血
清補給培地を、オリゴヌクレオチドを含有する血清無含有培地（または対照ウエ
ル中には血清無含有培地単独）に取り換えた。３７℃で４時間インキュベーショ
ン後、ウシ胎仔血清（Life Technologies, Inc.）を培地に付加して、１０％ｖ
／ｖとした。これらの実験に用いたヘパリンは、Apothecon（Bristol-Myers Squ
ibb Co.）から購入したブタ小腸由来のＵＳＰ等級ナトリウム塩であった。滅菌
ＰＢＳ中のストック（１０００単位／ｍｌ）から作業溶液を稀釈した。
培地中で細胞を低密度（細胞株によって１０2〜１０3細胞／ウエル）でプレート
化し、細胞培養の標準条件下で成長させた。翌日（１日目）、オリゴヌクレオチ
ドまたは対照としての水を培地に付加して、最終濃度を１５μＭとした。２、３
および４日目に、初期用量の半分と等価のさらなるオリゴヌクレオチドを培地に
付加した。プレート化後１、３、５、７および９日目に、ＭＴＴアッセイ（Morg
an（1998）Methods, Mol. Biol. 79, 179-183）を用いて、細胞をアッセイした
。培地は、実験継続中（非処理細胞が成長して集密になるのに要する時間）は取
り換えなかった。実験は３回実施した。バーはデータの標準誤差を表す。図７Ａ
に示した実験に関しては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（５ｘ１０2細胞／ウ
エル）を９６ウエルプレート中に入れた。２４時間後、１回用量のオリゴヌクレ
オチドまたは対照として等容量のＰＢＳを培地に付加して、最終濃度を１０μＭ
とした。ＭＴＴアッセイを用いて、プレート化後７日目に成育可能細胞を査定し
た。３’−非修飾化オリゴヌクレオチドを用いた実験（図７Ｄ）に関しては、血
清補給培地を、オリゴヌクレオチドを含有する血清無含有培地（または対照ウエ
ル中には血清無含有培地単独）に取り換えた。３７℃で４時間インキュベーショ
ン後、ウシ胎仔血清（Life Technologies, Inc.）を培地に付加して、１０％ｖ
／ｖとした。これらの実験に用いたヘパリンは、Apothecon（Bristol-Myers Squ
ibb Co.）から購入したブタ小腸由来のＵＳＰ等級ナトリウム塩であった。滅菌
ＰＢＳ中のストック（１０００単位／ｍｌ）から作業溶液を稀釈した。
【００５７】 Ｕ．Ｖ．分光学によるＧ四重の検出 Ａ260＝０．６（モル濃度は２．０〜３．９μｍの範囲であった）となるよう
な濃度で、Ｔｍ緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＫ
Ｃｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2）中にオリゴヌクレオチドを再懸濁した。５分間
沸騰することにより試料をアニーリングし、徐々に室温に冷却させて、４℃で一
夜インキュベートした。Peltier作用加熱浅鉢ホルダーおよび温度制御器を装備
したAmersham Pharmacia Biotech Ultrospec 2000計器（Amersham Pharmacia Bi
otech）を用いて、熱変性／再生実験を実行した。０．５℃／分の加熱／冷却率
で、２５〜９５または２０〜９０℃の温度範囲に亘って、２９５ｎｍでの吸光度
をモニタリングした。
な濃度で、Ｔｍ緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＫ
Ｃｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2）中にオリゴヌクレオチドを再懸濁した。５分間
沸騰することにより試料をアニーリングし、徐々に室温に冷却させて、４℃で一
夜インキュベートした。Peltier作用加熱浅鉢ホルダーおよび温度制御器を装備
したAmersham Pharmacia Biotech Ultrospec 2000計器（Amersham Pharmacia Bi
otech）を用いて、熱変性／再生実験を実行した。０．５℃／分の加熱／冷却率
で、２５〜９５または２０〜９０℃の温度範囲に亘って、２９５ｎｍでの吸光度
をモニタリングした。
【００５８】 オリゴヌクレオチド取込み ５ｘ１０5細胞／ウエルの密度で、２４のウエルプレート中にＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞を植え付けた。２４時間後、オリゴヌクレオチド（５ｎｍｏｌの標識
化されていないオリゴヌクレオチドおよび５×１０6ｃｐｍ（約１ｐｍｏｌ）の
５’−32Ｐ標識化オリゴヌクレオチド）を培地に直接付加して、最終濃度を１０
μＭとした。３７℃で１０または２６時間、細胞をインキュベートし、次にＰＢ
Ｓで３回洗浄した。トリプシン処理により細胞をプレートから取り出し、洗浄し
、１００μｌのＰＢＳ中に収集した。シンチレーションカウンティングにより５
０μｌアリコートを計数して、細胞関連放射能を査定した。洗浄手法がすべての
余分なオリゴヌクレオチドを除去するのに十分であることを保証するために、最
終ＰＢＳ洗浄液を計数し、細胞関連放射能と比較して非常に低量であることが判
明した。残りの５０μｌアリコートを５分間沸騰させて、氷上に載せた。等容量
のフェノール／クロロホルムを付加し、オリゴヌクレオチドを水性相中に抽出し
、ｎ−ブチルアルコールで沈澱させて、１５％ゲル上での変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析した。
２３１細胞を植え付けた。２４時間後、オリゴヌクレオチド（５ｎｍｏｌの標識
化されていないオリゴヌクレオチドおよび５×１０6ｃｐｍ（約１ｐｍｏｌ）の
５’−32Ｐ標識化オリゴヌクレオチド）を培地に直接付加して、最終濃度を１０
μＭとした。３７℃で１０または２６時間、細胞をインキュベートし、次にＰＢ
Ｓで３回洗浄した。トリプシン処理により細胞をプレートから取り出し、洗浄し
、１００μｌのＰＢＳ中に収集した。シンチレーションカウンティングにより５
０μｌアリコートを計数して、細胞関連放射能を査定した。洗浄手法がすべての
余分なオリゴヌクレオチドを除去するのに十分であることを保証するために、最
終ＰＢＳ洗浄液を計数し、細胞関連放射能と比較して非常に低量であることが判
明した。残りの５０μｌアリコートを５分間沸騰させて、氷上に載せた。等容量
のフェノール／クロロホルムを付加し、オリゴヌクレオチドを水性相中に抽出し
、ｎ−ブチルアルコールで沈澱させて、１５％ゲル上での変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析した。
【００５９】 電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ） Ｔ４キナーゼを用いて32Ｐでオリゴヌクレオチドを５’標識した。標識化オリ
ゴヌクレオチド（最終濃度１ｎＭ、約５０，０００ｃｐｍ）を、単独で、または
非標識化競合体オリゴヌクレオチドの存在下で３７℃にて３０分間予備インキュ
ベートした。核抽出物を添加し、試料を３７℃でさらに３０分間インキュベート
した。予備インキュベーションおよび結合反応はともに、緩衝液Ａ（２０ｍＭの
トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１
ｍＭのジチオトレイトール、０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド
および８％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で実行した。ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭの
トリスボレート、２ｍＭのＥＤＴＡ）中の５％ポリアクリルアミドゲルを用いて
、電気泳動を実行した。
ゴヌクレオチド（最終濃度１ｎＭ、約５０，０００ｃｐｍ）を、単独で、または
非標識化競合体オリゴヌクレオチドの存在下で３７℃にて３０分間予備インキュ
ベートした。核抽出物を添加し、試料を３７℃でさらに３０分間インキュベート
した。予備インキュベーションおよび結合反応はともに、緩衝液Ａ（２０ｍＭの
トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１
ｍＭのジチオトレイトール、０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド
および８％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で実行した。ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭの
トリスボレート、２ｍＭのＥＤＴＡ）中の５％ポリアクリルアミドゲルを用いて
、電気泳動を実行した。
【００６０】 Ｕ．Ｖ．架橋 ＵＶ架橋実験のために、前記（ＥＭＳＡ）と同様に試料をインキュベートした
。次にそれらを氷上に載せて、ストラタジーンＵＶストラタリンカー(Stratagen
e UV Stratalinker)の「自動架橋」機能を用いて光源から５ｃｍで照射した。照
射後、標準トリスグリシン緩衝液を用いて８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル
上で変性条件下にて試料を電気泳動処理し、オートラジオグラフィーにより可視
化した。
。次にそれらを氷上に載せて、ストラタジーンＵＶストラタリンカー(Stratagen
e UV Stratalinker)の「自動架橋」機能を用いて光源から５ｃｍで照射した。照
射後、標準トリスグリシン緩衝液を用いて８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル
上で変性条件下にて試料を電気泳動処理し、オートラジオグラフィーにより可視
化した。
【００６１】 サウスウエスタンブロッティング 核抽出物を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動処理し、トリス
グリシン／メタノール（１０％ｖ／ｖ）緩衝液を用いたエレクトロブロッティン
グによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。固定化タンパ
ク質を変性させて、６Ｍグアニジンを用いて４℃で３０分間洗浄することにより
再生させた。ＨＣｌ、続いて、ＨＥＰＥＳ結合緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、
ｐＨ７．９、４ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2）中の６Ｍのグアニジンの１
：１、１：２および１：４稀釈液中で洗浄した。結合緩衝液中の脱脂粉乳（ＮＤ
Ｍ）の５％溶液中で１時間洗浄することにより、該膜をブロックした。標識化オ
リゴヌクレオチド（１〜４ｘ１０6ｃｐｍ）とのハイブリダイゼーションは、０
．２５％ＮＤＭ、０．０５％ノニデットＰ４０(NonidetＰ４０)、４００μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１００μｇ／ｍｌの非関連の混合配列３５量体オリゴ
ヌクレオチド（5’-TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA-3’、配列番号１９
）を補充したＨＥＰＥＳ結合緩衝液中で４℃にて２時間行った。膜を結合緩衝液
中で洗浄し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
グリシン／メタノール（１０％ｖ／ｖ）緩衝液を用いたエレクトロブロッティン
グによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。固定化タンパ
ク質を変性させて、６Ｍグアニジンを用いて４℃で３０分間洗浄することにより
再生させた。ＨＣｌ、続いて、ＨＥＰＥＳ結合緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、
ｐＨ７．９、４ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2）中の６Ｍのグアニジンの１
：１、１：２および１：４稀釈液中で洗浄した。結合緩衝液中の脱脂粉乳（ＮＤ
Ｍ）の５％溶液中で１時間洗浄することにより、該膜をブロックした。標識化オ
リゴヌクレオチド（１〜４ｘ１０6ｃｐｍ）とのハイブリダイゼーションは、０
．２５％ＮＤＭ、０．０５％ノニデットＰ４０(NonidetＰ４０)、４００μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１００μｇ／ｍｌの非関連の混合配列３５量体オリゴ
ヌクレオチド（5’-TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA-3’、配列番号１９
）を補充したＨＥＰＥＳ結合緩衝液中で４℃にて２時間行った。膜を結合緩衝液
中で洗浄し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００６２】 ウエスタンブロッティング ０．１％（ポリクローナル抗体）または０．０５％（モノクローナル抗体）で
ツイーン２０を含有するＰＢＳ緩衝液中で、室温にてウエスタンブロッティング
を実行した。５％ＮＤＭを含有するＰＢＳ−ツイーン２０で１時間、ＰＶＤＦ膜
をブッロクし、洗浄し、ＰＢＳ−ツイーン２０中のヌクレオリン抗血清またはヌ
クレオリンモノクローナル抗体（MBL Ltd., Japan、最終濃度１μｇ／ｍｌ）の
１：１０００稀釈液を用いて１時間インキュベートした。該膜をＰＢＳ／ツイー
ン２０中で各洗浄を５分間、３回洗浄し、ＰＢＳ／ツイーン２０中に稀釈した第
二抗体（１：１０００抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰまたは１：２０００抗マウスＩｇ
Ｇ−ＨＲＰ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、メーカーの使用説明
書にしたがってＥＣＬ試薬（アマルシャム ファルマシア バイオテック(Amersha
m Pharmacia Biotech）)を用いてブロットを可視化した。
ツイーン２０を含有するＰＢＳ緩衝液中で、室温にてウエスタンブロッティング
を実行した。５％ＮＤＭを含有するＰＢＳ−ツイーン２０で１時間、ＰＶＤＦ膜
をブッロクし、洗浄し、ＰＢＳ−ツイーン２０中のヌクレオリン抗血清またはヌ
クレオリンモノクローナル抗体（MBL Ltd., Japan、最終濃度１μｇ／ｍｌ）の
１：１０００稀釈液を用いて１時間インキュベートした。該膜をＰＢＳ／ツイー
ン２０中で各洗浄を５分間、３回洗浄し、ＰＢＳ／ツイーン２０中に稀釈した第
二抗体（１：１０００抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰまたは１：２０００抗マウスＩｇ
Ｇ−ＨＲＰ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、メーカーの使用説明
書にしたがってＥＣＬ試薬（アマルシャム ファルマシア バイオテック(Amersha
m Pharmacia Biotech）)を用いてブロットを可視化した。
【００６３】 ビオチン化オリゴヌクレオチド−タンパク質複合体の捕捉 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を９０ｍｍ皿中で５０％集密に成長させた。５’−
ビオチン化オリゴヌクレオチドを最終濃度５μＭで培地に付加した。３７℃で２
時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで広範囲に洗浄し、１ｍｌの溶解緩衝
液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフル
オリド、１％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール
酸ナトリウム、０．５ｍＭジチオトレイトール、１μｇ／ｍｌアプロチニン）の
添加により溶解させ、その後、−２０℃で１０分間インキュベートした。微小ゲ
ージ針による溶解物の反復注入により、ゲノムＤＮＡを剪断した。溶解物をスト
レプタビジン被覆磁気ビーズ（MagneSphere, Promega Inc.）に添加し、室温で
１０分間インキュベートした。ビーズを捕捉し、非結合試料を除去した。次にビ
ーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回、さらに１ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。最後に
、５０μｌのローディング緩衝液（１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノ
ールを含有）の添加および６５℃で１５分間のインキュベーションによりタンパ
ク質を溶離した。
ビオチン化オリゴヌクレオチドを最終濃度５μＭで培地に付加した。３７℃で２
時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで広範囲に洗浄し、１ｍｌの溶解緩衝
液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフル
オリド、１％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール
酸ナトリウム、０．５ｍＭジチオトレイトール、１μｇ／ｍｌアプロチニン）の
添加により溶解させ、その後、−２０℃で１０分間インキュベートした。微小ゲ
ージ針による溶解物の反復注入により、ゲノムＤＮＡを剪断した。溶解物をスト
レプタビジン被覆磁気ビーズ（MagneSphere, Promega Inc.）に添加し、室温で
１０分間インキュベートした。ビーズを捕捉し、非結合試料を除去した。次にビ
ーズを１ｍｌの溶解緩衝液で２回、さらに１ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。最後に
、５０μｌのローディング緩衝液（１％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノ
ールを含有）の添加および６５℃で１５分間のインキュベーションによりタンパ
ク質を溶離した。
【００６４】 核、細胞質および膜タンパク質抽出物の調製 ＥＭＳＡに用いたＨｅＬａ核抽出物を、Promega Inc.（バンドシフトグレード
）から購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの核および細胞質抽出物を、F.
M. Ausubel et al. Ausubel et al.（Eds.）（1996）Current Protocols in Mol
ecular Biology, Wiley, NY, Section 12.1に記載されたプロトコルを用いて調
製した。前に記載した方法を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から形質膜タン
パク質を調製した（Yao et al.（1996）Biochemical Pharmacology 51, 431-436
; Naito et al.（1988）J. Biol. Chem. 263, 11887-11891）。
）から購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの核および細胞質抽出物を、F.
M. Ausubel et al. Ausubel et al.（Eds.）（1996）Current Protocols in Mol
ecular Biology, Wiley, NY, Section 12.1に記載されたプロトコルを用いて調
製した。前に記載した方法を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から形質膜タン
パク質を調製した（Yao et al.（1996）Biochemical Pharmacology 51, 431-436
; Naito et al.（1988）J. Biol. Chem. 263, 11887-11891）。
【００６５】 墨汁染色 ３滴のヒギンス墨汁４４１５(Higgins India Ink- 4415)を含有するＰＢＳ−
ツイーン２０中で室温で１５分間、膜をインキュベートし、蒸留水で洗浄した。
ツイーン２０中で室温で１５分間、膜をインキュベートし、蒸留水で洗浄した。
【００６６】 ヌクレオリン結合アッセイ 非オリゴヌクレオチドベースの分子または化合物がヌクレオリンと結合し得る
か否かを確定するために、下記のようにＥＭＳＡを実施した。その結果を図１４
に示す。このアッセイでは、いくつかの異なる分子または化合物のヌクレオリン
に関する結合能力を検査した。この種のアッセイは、ヌクレオリンを結合し得る
分子または化合物に関してスクリーニングするために利用され得る。
か否かを確定するために、下記のようにＥＭＳＡを実施した。その結果を図１４
に示す。このアッセイでは、いくつかの異なる分子または化合物のヌクレオリン
に関する結合能力を検査した。この種のアッセイは、ヌクレオリンを結合し得る
分子または化合物に関してスクリーニングするために利用され得る。
【００６７】 核タンパク質（２．５μｇ、この場合はＨｅＬａ細胞）を５’−32Ｐ標識化Ｔ
ＥＬオリゴヌクレオチド（5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号２０、最終
濃度２ｎＭ）に添加した。非標識化競合体オリゴヌクレオチドまたは化合物を添
加して、最終濃度を５０ｎＭオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ２９Ａに関しては約０
．５μｇ／ｍｌと等価）または０．５μｇ／ｍｌ（レーン３〜１２）とした。２
０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、８％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦを
含有する緩衝液中で３７℃で、３０分間結合反応を行った。ＴＢＥ緩衝液を用い
て５％ポリアクリルアミドゲル上で、試料を分析した。
ＥＬオリゴヌクレオチド（5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号２０、最終
濃度２ｎＭ）に添加した。非標識化競合体オリゴヌクレオチドまたは化合物を添
加して、最終濃度を５０ｎＭオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ２９Ａに関しては約０
．５μｇ／ｍｌと等価）または０．５μｇ／ｍｌ（レーン３〜１２）とした。２
０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、８％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦを
含有する緩衝液中で３７℃で、３０分間結合反応を行った。ＴＢＥ緩衝液を用い
て５％ポリアクリルアミドゲル上で、試料を分析した。
【００６８】 化学療法薬およびＧＲＯ実験プロトコル シスプラチン（１％ＤＭＳＯ溶液中で、最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を、培養
で成長するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の培地に添加した。２時間後、ＧＲＯ
２９Ａ（ＰＢＳ溶液中、最終濃度８μＭ）を該培地に添加した。６日後、ＭＴＴ
アッセイを用いて、成育可能細胞の相対数を確定した。ＧＲＯ２９Ａ単独で処理
した細胞は、シスプラチンの代わりに適切な容量の１％ＤＭＳＯを摂取した。シ
スプラチン単独で処理した細胞は、ＧＲＯ２９Ａの代わりに適切な容量のＰＢＳ
を摂取した。
で成長するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の培地に添加した。２時間後、ＧＲＯ
２９Ａ（ＰＢＳ溶液中、最終濃度８μＭ）を該培地に添加した。６日後、ＭＴＴ
アッセイを用いて、成育可能細胞の相対数を確定した。ＧＲＯ２９Ａ単独で処理
した細胞は、シスプラチンの代わりに適切な容量の１％ＤＭＳＯを摂取した。シ
スプラチン単独で処理した細胞は、ＧＲＯ２９Ａの代わりに適切な容量のＰＢＳ
を摂取した。
【００６９】 癌に対するＧＲＯのインビボでの効力 第一の目的は、前立腺癌に対するＧＲＯのインビボでの効力を立証することで
あり、これらの研究における成功がＧＲＯの臨床試験へと導き得る。第二の目的
は、前立腺細胞中のヌクレオリンレベルおよび特徴を検査することである。細胞
成長の多局面に関与する核小体タンパク質であるヌクレオリンは、ＧＲＯ作用に
関する推定標的として同定されている。ＧＲＯがヌクレオリンと結合し、不活性
化する、というのが出願人等の仮説である。ヌクレオリンのレベル（核中）は細
胞増殖の速度と正の相関を示し、したがって、ヌクレオリンを抑制するという戦
略は有意の治療的可能性を有するということが知られている。出願人等は、ヌク
レオリンは前立腺癌細胞の表面にも存在し、これはＧＲＯ作用のメカニズムに関
連するということを示した。さらに、細胞表面ヌクレオリンのレベルは、正常細
胞と比較して悪性細胞中で増大され得る。これは、腫瘍細胞マーカーとしてのヌ
クレオリンの点で関連する。別の目的は、例えばＧＲＯおよび化学療法薬、なら
びにヌクレオリンの小分子抑制剤の組合せ療法のような前立腺癌のための新規の
療法を探査することである。
あり、これらの研究における成功がＧＲＯの臨床試験へと導き得る。第二の目的
は、前立腺細胞中のヌクレオリンレベルおよび特徴を検査することである。細胞
成長の多局面に関与する核小体タンパク質であるヌクレオリンは、ＧＲＯ作用に
関する推定標的として同定されている。ＧＲＯがヌクレオリンと結合し、不活性
化する、というのが出願人等の仮説である。ヌクレオリンのレベル（核中）は細
胞増殖の速度と正の相関を示し、したがって、ヌクレオリンを抑制するという戦
略は有意の治療的可能性を有するということが知られている。出願人等は、ヌク
レオリンは前立腺癌細胞の表面にも存在し、これはＧＲＯ作用のメカニズムに関
連するということを示した。さらに、細胞表面ヌクレオリンのレベルは、正常細
胞と比較して悪性細胞中で増大され得る。これは、腫瘍細胞マーカーとしてのヌ
クレオリンの点で関連する。別の目的は、例えばＧＲＯおよび化学療法薬、なら
びにヌクレオリンの小分子抑制剤の組合せ療法のような前立腺癌のための新規の
療法を探査することである。
【００７０】 正常および悪性前立腺組織から得られる一連の細胞系中のＧＲＯの活性を確定
する。これらの細胞の核、細胞質および形質膜中のヌクレオリンレベルを、ブロ
ッティング技法および免疫蛍光顕微鏡を用いて検査するであろう。ＧＲＯの送達
を最適化するために、多数の異なる方法により培養細胞に導入されるＧＲＯの取
込みおよび活性を試験し得る。さらに、前立腺癌のマウスおよびラットモデルに
おいて異なる方法により送達されるＧＲＯの腫瘍取込みを試験するであろう。イ
ンビボでの効力を調べるために、皮下または正常位移植腫瘍異種移植片を有する
ヌードマウスおよび前立腺癌のDunningラットモデルを用いる。予備データは、
ＧＲＯがいくつかの化学療法薬と共力的であることを示唆する。したがって、培
養細胞における種々の細胞毒性およびその他の薬剤とのＧＲＯの組合せの作用を
検査し、動物モデルにおけるいずれの共力的組合せに関して試験し得る。最後に
、多数の同様のタンパク質について報告された構造を基礎にしたヌクレオリンの
相同モデルを構築し、「仮想スクリーニング」法によりヌクレオリンの潜在的な
小分子阻害剤を同定するために用い得る。
する。これらの細胞の核、細胞質および形質膜中のヌクレオリンレベルを、ブロ
ッティング技法および免疫蛍光顕微鏡を用いて検査するであろう。ＧＲＯの送達
を最適化するために、多数の異なる方法により培養細胞に導入されるＧＲＯの取
込みおよび活性を試験し得る。さらに、前立腺癌のマウスおよびラットモデルに
おいて異なる方法により送達されるＧＲＯの腫瘍取込みを試験するであろう。イ
ンビボでの効力を調べるために、皮下または正常位移植腫瘍異種移植片を有する
ヌードマウスおよび前立腺癌のDunningラットモデルを用いる。予備データは、
ＧＲＯがいくつかの化学療法薬と共力的であることを示唆する。したがって、培
養細胞における種々の細胞毒性およびその他の薬剤とのＧＲＯの組合せの作用を
検査し、動物モデルにおけるいずれの共力的組合せに関して試験し得る。最後に
、多数の同様のタンパク質について報告された構造を基礎にしたヌクレオリンの
相同モデルを構築し、「仮想スクリーニング」法によりヌクレオリンの潜在的な
小分子阻害剤を同定するために用い得る。
【００７１】 慣用的化学療法薬は、ホルモン抗療性前立腺癌を有する患者の無作為試験にお
ける生存率延長には無効であり、新規の療法的アプローチが緊急に必要とされて
いる。本発明のＧＲＯは、潜在的に、前立腺癌細胞に対して非常に活性な腫瘍特
異的作用物質である。それらは、前立腺癌に対する戦いにおける新規の作用メカ
ニズムおよび厖大な療法的可能性を有する。また、出願人等は、前立腺癌におけ
る療法的介入のための新規の標的としてヌクレオリンを同定した。このタンパク
質の理解の進展は、前立腺癌のための診断または予後技法の改良、あるいはヌク
レオリンを抑制する新しい種類の薬剤をもたらし得る。
ける生存率延長には無効であり、新規の療法的アプローチが緊急に必要とされて
いる。本発明のＧＲＯは、潜在的に、前立腺癌細胞に対して非常に活性な腫瘍特
異的作用物質である。それらは、前立腺癌に対する戦いにおける新規の作用メカ
ニズムおよび厖大な療法的可能性を有する。また、出願人等は、前立腺癌におけ
る療法的介入のための新規の標的としてヌクレオリンを同定した。このタンパク
質の理解の進展は、前立腺癌のための診断または予後技法の改良、あるいはヌク
レオリンを抑制する新しい種類の薬剤をもたらし得る。
【００７２】 以下に記載する方法は、オリゴヌクレオチドＧＲＯ２９Ａの試験を説明する。
しかしながら、別のＧＲＯが優れた活性および同様の安定性を有する場合には、
それがＧＲＯ２９Ａの代わりに用いられ得る。
しかしながら、別のＧＲＯが優れた活性および同様の安定性を有する場合には、
それがＧＲＯ２９Ａの代わりに用いられ得る。
【００７３】 種々の悪性および形質転換化前立腺細胞系の感受性ならびに感受性およびヌク
レオリン／ＧＲＯ結合タンパク質レベル間の相関 ＭＴＴアッセイを用いたヒトおよびラット前立腺から得られた種々の細胞株に
対するＧＲＯ２９Ａに関するＧＩ50値を算定する。これらは、ホルモン依存性（
ＬＮＣａＰ）および非依存性（ＤＵ１４５、ＰＣ−３）、非悪性（ＰＺ−ＨＰＶ
−７およびラットＹＰＥＮ−１）ならびに多剤耐性（ラットＡＴ３ Ｂ１および
ＭＬＬＢ−２）細胞系を含むであろう。細胞系は、ＡＴＣＣから購入し得る。標
準法により、ヌクレオリンレベルを確定するために、各細胞系から、核、細胞質
および形質膜抽出物を調製する（Bates et al.（1999）J. Biol. Chem. 274（37
）:26369-77）。抽出物を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動処
理し、ＰＶＤＦ膜に転写する。サウスウエスタンブロッティング（放射能標識化
ＧＲＯを用いて）およびウエスタンブロッティング（ヌクレオリンモノクローナ
ル抗体（Santa Cruz）を用いて）によりそれらを検査して、ＧＲＯ結合タンパク
質／ヌクレオリンのレベルを確定する。また、細胞内または細胞表面タンパク質
を染色するのに適切な条件下でヌクレオリン抗体を用いて、免疫蛍光染色によっ
て細胞を検査する。
レオリン／ＧＲＯ結合タンパク質レベル間の相関 ＭＴＴアッセイを用いたヒトおよびラット前立腺から得られた種々の細胞株に
対するＧＲＯ２９Ａに関するＧＩ50値を算定する。これらは、ホルモン依存性（
ＬＮＣａＰ）および非依存性（ＤＵ１４５、ＰＣ−３）、非悪性（ＰＺ−ＨＰＶ
−７およびラットＹＰＥＮ−１）ならびに多剤耐性（ラットＡＴ３ Ｂ１および
ＭＬＬＢ−２）細胞系を含むであろう。細胞系は、ＡＴＣＣから購入し得る。標
準法により、ヌクレオリンレベルを確定するために、各細胞系から、核、細胞質
および形質膜抽出物を調製する（Bates et al.（1999）J. Biol. Chem. 274（37
）:26369-77）。抽出物を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で電気泳動処
理し、ＰＶＤＦ膜に転写する。サウスウエスタンブロッティング（放射能標識化
ＧＲＯを用いて）およびウエスタンブロッティング（ヌクレオリンモノクローナ
ル抗体（Santa Cruz）を用いて）によりそれらを検査して、ＧＲＯ結合タンパク
質／ヌクレオリンのレベルを確定する。また、細胞内または細胞表面タンパク質
を染色するのに適切な条件下でヌクレオリン抗体を用いて、免疫蛍光染色によっ
て細胞を検査する。
【００７４】 培養中およびインビボでの腫瘍細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の最適化 培養細胞中のＧＲＯ２９Ａの取込みを調べるために、ＧＲＯ２９Ａの５’−Ｆ
ＩＴＣ標識化類縁体を用いる。細胞（最初にＤＵ１４５およびＰＣ−３）を、種
々の異なる方法により送達されるこのオリゴヌクレオチドで処理する。これらの
方法としては、電気穿孔、陽イオン性脂質（１μｇＧＲＯ２９Ａ：４μｇＤＯＴ
ＡＰ−ＤＯＰＥ［１：１］）、ポリミキシンＢスルフェート（シグマ）、乳酸ナ
ノ粒子（簡単な合成はBerton et al.（1999） Eur. J. Pharm. Biopharm.47（2
）:119-23に記載されている）およびストレプトリシンＯ透過化（Giles et al.
（1998）Nucleic Acids Res. 26（7）:1567-75）が挙げられる。オリゴヌクレオ
チド取込みおよび細胞内局在化を、蛍光顕微鏡により査定する。ＧＲＯ２９Ａの
抗増殖活性に及ぼす異なる送達方法の影響を、ＭＴＴアッセイにより確定する。
ＧＲＯ２９Ａの取込み特徴が非冨Ｇオリゴヌクレオチドと有意に異なるか否かを
確定するために、冨Ｃおよび混合配列ＦＩＴＣ標識化オリゴヌクレオチドを伴う
ＧＲＯ２９Ａの独力の取込みを比較する。取込みが有意に異なる場合には、非標
識化競合体オリゴヌクレオチドの存在下でＦＩＴＣ標識化オリゴヌクレオチドを
細胞とともにインキュベートする実験で、異なる受容体が利用される可能性の検
査を実行する。これらの実験は、概してオリゴヌクレオチドの取込みならびに細
胞表面でのヌクレオリンとのＧＲＯ相互作用の重要性に関する重要な情報を提供
する。
ＩＴＣ標識化類縁体を用いる。細胞（最初にＤＵ１４５およびＰＣ−３）を、種
々の異なる方法により送達されるこのオリゴヌクレオチドで処理する。これらの
方法としては、電気穿孔、陽イオン性脂質（１μｇＧＲＯ２９Ａ：４μｇＤＯＴ
ＡＰ−ＤＯＰＥ［１：１］）、ポリミキシンＢスルフェート（シグマ）、乳酸ナ
ノ粒子（簡単な合成はBerton et al.（1999） Eur. J. Pharm. Biopharm.47（2
）:119-23に記載されている）およびストレプトリシンＯ透過化（Giles et al.
（1998）Nucleic Acids Res. 26（7）:1567-75）が挙げられる。オリゴヌクレオ
チド取込みおよび細胞内局在化を、蛍光顕微鏡により査定する。ＧＲＯ２９Ａの
抗増殖活性に及ぼす異なる送達方法の影響を、ＭＴＴアッセイにより確定する。
ＧＲＯ２９Ａの取込み特徴が非冨Ｇオリゴヌクレオチドと有意に異なるか否かを
確定するために、冨Ｃおよび混合配列ＦＩＴＣ標識化オリゴヌクレオチドを伴う
ＧＲＯ２９Ａの独力の取込みを比較する。取込みが有意に異なる場合には、非標
識化競合体オリゴヌクレオチドの存在下でＦＩＴＣ標識化オリゴヌクレオチドを
細胞とともにインキュベートする実験で、異なる受容体が利用される可能性の検
査を実行する。これらの実験は、概してオリゴヌクレオチドの取込みならびに細
胞表面でのヌクレオリンとのＧＲＯ相互作用の重要性に関する重要な情報を提供
する。
【００７５】 薬物動態を調べるために、抗ＨＩＶ剤として評価されている冨Ｇホスホジエス
テルオリゴヌクレオチドに関して以前報告されたものと同様の安定性および腫瘍
送達インビボでの方法を用いる（Wallace et al.（1997）J. Pharmacol. Exp. T
her. 280（3）:1480-8）。最初に、32Ｐで内部標識されるＧＲＯ２９Ａの類縁体
を合成する。この手法は、以前に記載されており（Bishop et al.（1996）J. Bi
ol. Chem. 271（10）:5698-703）、２つの短いオリゴヌクレオチド断片の合成、
Ｔ４キナーゼを用いた一つの断片の５’標識と続くＴ４リガーゼによる２つの断
片の鋳型特異的結紮を包含する。次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）により、該標識化オリゴヌクレオチドを精製する。軽い麻酔下で、雄ヌー
ドマウス（全部で９匹）の後脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射でＤＵ１４５前立腺癌
細胞を接種する。腫瘍が定着したら（直径約０．５ｃｍ）、腫瘍内、腹腔内また
は静脈内（尾静脈）注射により、２５μｌの容量で１回５ｍｇ／ｋｇ用量のＧＲ
Ｏ２９Ａ（標識化および非標識化オリゴヌクレオチドの混合物）でマウスを処置
する。急性毒性および体重損失の徴候に関して動物を観察する。ＧＲＯ注射後２
、４および７日目に、ＣＯ2吸入によりマウスを安楽死させて、腫瘍を切除し、
血液および器官を収集する。腫瘍、血清、肝臓、腎臓、脾臓および前立腺中の放
射能のレベルを検査する。血清試料の変性ＰＡＧＥにより安定性を確定する。Du
nning前立腺癌モデルを用いても、同様の実験を実行する（Isaacs et al.（1978
）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9; Zaccheo et al.（1998）Prostate 35（4
）:237-42）。培養細胞で試験した送達技法のいずれかが有意の取込み改良を生
じた（そしてインビボでの送達に適している）場合には、それらも試験する。こ
れらの実験はラットおよびマウスにおける最適投与経路を決定し、最適投与計画
の指標を提供する。動物実験はすべて、動物管理および使用に関する制定指針に
厳密に従う。
テルオリゴヌクレオチドに関して以前報告されたものと同様の安定性および腫瘍
送達インビボでの方法を用いる（Wallace et al.（1997）J. Pharmacol. Exp. T
her. 280（3）:1480-8）。最初に、32Ｐで内部標識されるＧＲＯ２９Ａの類縁体
を合成する。この手法は、以前に記載されており（Bishop et al.（1996）J. Bi
ol. Chem. 271（10）:5698-703）、２つの短いオリゴヌクレオチド断片の合成、
Ｔ４キナーゼを用いた一つの断片の５’標識と続くＴ４リガーゼによる２つの断
片の鋳型特異的結紮を包含する。次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）により、該標識化オリゴヌクレオチドを精製する。軽い麻酔下で、雄ヌー
ドマウス（全部で９匹）の後脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射でＤＵ１４５前立腺癌
細胞を接種する。腫瘍が定着したら（直径約０．５ｃｍ）、腫瘍内、腹腔内また
は静脈内（尾静脈）注射により、２５μｌの容量で１回５ｍｇ／ｋｇ用量のＧＲ
Ｏ２９Ａ（標識化および非標識化オリゴヌクレオチドの混合物）でマウスを処置
する。急性毒性および体重損失の徴候に関して動物を観察する。ＧＲＯ注射後２
、４および７日目に、ＣＯ2吸入によりマウスを安楽死させて、腫瘍を切除し、
血液および器官を収集する。腫瘍、血清、肝臓、腎臓、脾臓および前立腺中の放
射能のレベルを検査する。血清試料の変性ＰＡＧＥにより安定性を確定する。Du
nning前立腺癌モデルを用いても、同様の実験を実行する（Isaacs et al.（1978
）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9; Zaccheo et al.（1998）Prostate 35（4
）:237-42）。培養細胞で試験した送達技法のいずれかが有意の取込み改良を生
じた（そしてインビボでの送達に適している）場合には、それらも試験する。こ
れらの実験はラットおよびマウスにおける最適投与経路を決定し、最適投与計画
の指標を提供する。動物実験はすべて、動物管理および使用に関する制定指針に
厳密に従う。
【００７６】 インビボでの前立腺癌成長および転移の抑制におけるＧＲＯの効力の評価 ヌードマウスモデルにおける効力を先ず試験した。軽い麻酔下で、マウスに皮
下（ｓ．ｃ．）注射でＤＵ１４５細胞を接種する。触知可能異種移植片の定着後
、前記の最適投与経路を用いて、ＧＲＯ２９Ａ、対照オリゴヌクレオチド（5’-
GACTGTACCGAGGTGCAAGTACTCTA、３’アミノ修飾を有する）またはＰＢＳでマウス
を処理する（６匹／群）。３つの処理群は、０．５、５または５０ｍｇ／ｋｇ用
量を週に２回、２週間摂取する。体重および腫瘍サイズ（カリパスで測定）をモ
ニタリングする。適時に、ＣＯ2の吸入によりマウスを安楽死させて、腫瘍を摘
出する。アポトーシスに関するヌクレオリン、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＴＵＮ
ＥＬ分析を含む形態学的分析および免疫染色により、腫瘍の切片を検査する。最
適（または経済的に実行可能）用量を用いて同様の実験を実行して、ＰＣ−３お
よびＬＮＣａＰ異種移植片を抑制する場合のＧＲＯ２９Ａの効力を確定する。次
に、転移前立腺癌のモデルを実行する。ヌードマウスの前立腺へのＰＣ−３腫瘍
の外科的正常位移植が近年報告されており（An et al.（1998）Prostate 34（3
）:169-74）、移植後１２週までにリンパ節（マウス１３／１９匹）および肺転
移（５／１９匹）を生じる。前立腺癌のDunningラットモデルがIsaacs et al.（
（1998）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9）により開発され、腫瘍成長および
転移を研究するために広く用いられている。これは、腫瘍組織の皮下注射を包含
し、リンパ節、肺および骨転移を生じる。以前記載された（Isaacs et al.（197
8）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9; Zaccheo et al.（1998）Prostate 35（
4）:237-42）ように、動物（１５匹／群）に腫瘍を移植し、移植後６週間目に（
またはラットモデルにおいて触知可能腫瘍の最初の出現時に）ＧＲＯ２９Ａによ
る処理を開始し、さらに６週間、週に連続２回処理する。この時点で（または、
動物が瀕死または仮死状態にあるように見える場合にはその前に）、動物を安楽
死させて、剖検を施し、原発性腫瘍サイズおよび転移を検査する。腫瘍および転
移は、前記と同様に組織学的に検査する。
下（ｓ．ｃ．）注射でＤＵ１４５細胞を接種する。触知可能異種移植片の定着後
、前記の最適投与経路を用いて、ＧＲＯ２９Ａ、対照オリゴヌクレオチド（5’-
GACTGTACCGAGGTGCAAGTACTCTA、３’アミノ修飾を有する）またはＰＢＳでマウス
を処理する（６匹／群）。３つの処理群は、０．５、５または５０ｍｇ／ｋｇ用
量を週に２回、２週間摂取する。体重および腫瘍サイズ（カリパスで測定）をモ
ニタリングする。適時に、ＣＯ2の吸入によりマウスを安楽死させて、腫瘍を摘
出する。アポトーシスに関するヌクレオリン、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＴＵＮ
ＥＬ分析を含む形態学的分析および免疫染色により、腫瘍の切片を検査する。最
適（または経済的に実行可能）用量を用いて同様の実験を実行して、ＰＣ−３お
よびＬＮＣａＰ異種移植片を抑制する場合のＧＲＯ２９Ａの効力を確定する。次
に、転移前立腺癌のモデルを実行する。ヌードマウスの前立腺へのＰＣ−３腫瘍
の外科的正常位移植が近年報告されており（An et al.（1998）Prostate 34（3
）:169-74）、移植後１２週までにリンパ節（マウス１３／１９匹）および肺転
移（５／１９匹）を生じる。前立腺癌のDunningラットモデルがIsaacs et al.（
（1998）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9）により開発され、腫瘍成長および
転移を研究するために広く用いられている。これは、腫瘍組織の皮下注射を包含
し、リンパ節、肺および骨転移を生じる。以前記載された（Isaacs et al.（197
8）Cancer Res. 38（11 Pt 2）:4353-9; Zaccheo et al.（1998）Prostate 35（
4）:237-42）ように、動物（１５匹／群）に腫瘍を移植し、移植後６週間目に（
またはラットモデルにおいて触知可能腫瘍の最初の出現時に）ＧＲＯ２９Ａによ
る処理を開始し、さらに６週間、週に連続２回処理する。この時点で（または、
動物が瀕死または仮死状態にあるように見える場合にはその前に）、動物を安楽
死させて、剖検を施し、原発性腫瘍サイズおよび転移を検査する。腫瘍および転
移は、前記と同様に組織学的に検査する。
【００７７】 前立腺癌に関する組合せＧＲＯ−細胞毒性薬療法の評価 化学療法薬および細胞の成長停止に影響を及ぼすと予期されるその他の作用物
質とのＧＲＯ２９Ａの組合せ治療の効能を確定する。これらは、ミトキサントロ
ン、エトポシド、シスプラチン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビン
ブラスチン、ミトラマイシンＡ、デキサメタソンおよびカフェイン（Ｓ期細胞周
期チェックポイントを通過する進行を促す）を含む。この群は、種々の作用メカ
ニズムを有する作用物質、例えばトポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤、有糸分
裂阻害剤およびＤＮＡ損害剤を包含する。これらの活性をＭＴＴアッセイを用い
て培養細胞にて試験して、細胞数を確定する。培地への薬剤（ＧＩ30用量で）の
添加と、続いて２４時間後のＧＲＯ２９Ａの添加、または逆の順序により細胞を
処理する。共力的活性が認められる組合せに関しては、細胞周期摂動（フローサ
イトメトリーにより）およびアポトーシス（アネキシンＶ染色細胞のフローサイ
トメトリー）に関して細胞を検査する。また共力的組合せを、前記と同様にin v
ivoで試験する。
質とのＧＲＯ２９Ａの組合せ治療の効能を確定する。これらは、ミトキサントロ
ン、エトポシド、シスプラチン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビン
ブラスチン、ミトラマイシンＡ、デキサメタソンおよびカフェイン（Ｓ期細胞周
期チェックポイントを通過する進行を促す）を含む。この群は、種々の作用メカ
ニズムを有する作用物質、例えばトポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤、有糸分
裂阻害剤およびＤＮＡ損害剤を包含する。これらの活性をＭＴＴアッセイを用い
て培養細胞にて試験して、細胞数を確定する。培地への薬剤（ＧＩ30用量で）の
添加と、続いて２４時間後のＧＲＯ２９Ａの添加、または逆の順序により細胞を
処理する。共力的活性が認められる組合せに関しては、細胞周期摂動（フローサ
イトメトリーにより）およびアポトーシス（アネキシンＶ染色細胞のフローサイ
トメトリー）に関して細胞を検査する。また共力的組合せを、前記と同様にin v
ivoで試験する。
【００７８】 ヌクレオリンの相同モデルの開発ならびに潜在的ヌクレオリン阻害剤を同定す
るための小分子のライブラリーの「仮想スクリーン」の実行 ヌクレオリンの小分子阻害剤は、オリゴヌクレオチドのより現実的代替物であ
り得る。相同モデリング（ＭＳＩ モデラーおよびホモロジー（MSI Modeller a
nd Homology）プログラムを使用）を用いて、関連タンパク質の既知の構造を有
するその配列アラインメントからヌクレオリンの３Ｄモデルを構築する（１６が
同定されている）。主鎖構築、ループモデリング、構造的重複および結果的に生
じるモデルの統計的分析の標準技法を用いる。分子力学を用いて、相同モデルを
精練する。
るための小分子のライブラリーの「仮想スクリーン」の実行 ヌクレオリンの小分子阻害剤は、オリゴヌクレオチドのより現実的代替物であ
り得る。相同モデリング（ＭＳＩ モデラーおよびホモロジー（MSI Modeller a
nd Homology）プログラムを使用）を用いて、関連タンパク質の既知の構造を有
するその配列アラインメントからヌクレオリンの３Ｄモデルを構築する（１６が
同定されている）。主鎖構築、ループモデリング、構造的重複および結果的に生
じるモデルの統計的分析の標準技法を用いる。分子力学を用いて、相同モデルを
精練する。
【００７９】 仮想スクリーンは、ＡＣＤデータベースと組合せたMSI Ludiソフトウェアを用
いる。Ｌｕｄｉは、相補的極性および疎水性基を適合することによりヌクレオリ
ンの活性部位に分子を合わせる。経験的スコアリング機能を用いて、ヒットを順
位づける。また、Ｌｕｄｉは、活性オリゴヌクレオチドおよびヌクレオリン間の
結合親和性を増大、活性オリゴヌクレオチドの結合からの推定によりヌクレオリ
ンの相同モデルを改良もし得る修飾を示唆する。ＡＣＤ構造データベースは、さ
らなる開発のためにすぐに獲得し得る商業的および合成的に入手可能な６５，８
００の化学物質を含有する。培養細胞およびインビボでのタンパク質結合および
抗増殖活性に関して、最も有望な化合物の選択を試験する。
いる。Ｌｕｄｉは、相補的極性および疎水性基を適合することによりヌクレオリ
ンの活性部位に分子を合わせる。経験的スコアリング機能を用いて、ヒットを順
位づける。また、Ｌｕｄｉは、活性オリゴヌクレオチドおよびヌクレオリン間の
結合親和性を増大、活性オリゴヌクレオチドの結合からの推定によりヌクレオリ
ンの相同モデルを改良もし得る修飾を示唆する。ＡＣＤ構造データベースは、さ
らなる開発のためにすぐに獲得し得る商業的および合成的に入手可能な６５，８
００の化学物質を含有する。培養細胞およびインビボでのタンパク質結合および
抗増殖活性に関して、最も有望な化合物の選択を試験する。
【００８０】 冨Ｇオリゴヌクレオチドの成長抑制作用 培養中の腫瘍細胞の成長に及ぼす４つの冨Ｇホスホジエステルオリゴヌクレオ
チド（ＧＲＯ）の作用を試験した。これらのオリゴヌクレオチドは、もっぱらデ
オキシグアノシンおよびチミジンで構成され、少なくとも２つの連続グアノシン
を含有した。血清ヌクレアーゼに対する安定性を増大するために、プロピルアミ
ノ基を用いて３’末端でオリゴヌクレオチドを修飾した。この修飾は、少なくと
も２４時間、血清含有培地中での分解からオリゴヌクレオチドを保護する。
チド（ＧＲＯ）の作用を試験した。これらのオリゴヌクレオチドは、もっぱらデ
オキシグアノシンおよびチミジンで構成され、少なくとも２つの連続グアノシン
を含有した。血清ヌクレアーゼに対する安定性を増大するために、プロピルアミ
ノ基を用いて３’末端でオリゴヌクレオチドを修飾した。この修飾は、少なくと
も２４時間、血清含有培地中での分解からオリゴヌクレオチドを保護する。
【００８１】 図１Ａ〜図１Ｄは、前立腺癌（ＤＵ１４５）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、
ＭＣＦ−７）または頸部癌（ＨｅＬａ）由来の処置細胞株における成育可能細胞
の相対数を確定するためのＭＴＴアッセイの結果を示す。
ＭＣＦ−７）または頸部癌（ＨｅＬａ）由来の処置細胞株における成育可能細胞
の相対数を確定するためのＭＴＴアッセイの結果を示す。
【００８２】 ２つのオリゴヌクレオチドＧＲＯ２９ＡおよびＧＲＯ１５Ａは、試験したすべ
ての細胞株において一貫して増殖を抑制した。細胞株のうちの３つに関しては、
ＧＲＯ２９ＡはＧＲＯ１５Ａより強力な抑制作用を有した（ＭＣＦ−７細胞に関
しては、オリゴヌクレオチドは同様の作用を有した）。２つのその他のオリゴヌ
クレオチドＧＲＯ１５ＢおよびＧＲＯ２６Ａで処理した細胞の成長は、対照水処
理細胞の場合と同様であった（ＧＲＯ２６Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨ
ｅＬａ細胞において弱い成長抑制作用を示した）。
ての細胞株において一貫して増殖を抑制した。細胞株のうちの３つに関しては、
ＧＲＯ２９ＡはＧＲＯ１５Ａより強力な抑制作用を有した（ＭＣＦ−７細胞に関
しては、オリゴヌクレオチドは同様の作用を有した）。２つのその他のオリゴヌ
クレオチドＧＲＯ１５ＢおよびＧＲＯ２６Ａで処理した細胞の成長は、対照水処
理細胞の場合と同様であった（ＧＲＯ２６Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨ
ｅＬａ細胞において弱い成長抑制作用を示した）。
【００８３】 図２Ａ〜図２Ｃで例証した結果は、最も悪性の細胞株、例えばＤＵ１４５、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−２３１と比較して、ＧＲＯ２９Ａが非悪性細胞株（ＨＳ２７）に及
ぼす成長抑制作用がより小さいことを示す。さらに、ＧＲＯ２９Ａは、図３に示
すように、白血病細胞株、例えばＫ５６２およびＵ９３７に対する抗増殖作用を
有する。それは、非悪性造血性幹細胞株（ＡＴＣＣ２０３７）に対するより小さ
い成長抑制作用を有する。
ＤＡ−ＭＢ−２３１と比較して、ＧＲＯ２９Ａが非悪性細胞株（ＨＳ２７）に及
ぼす成長抑制作用がより小さいことを示す。さらに、ＧＲＯ２９Ａは、図３に示
すように、白血病細胞株、例えばＫ５６２およびＵ９３７に対する抗増殖作用を
有する。それは、非悪性造血性幹細胞株（ＡＴＣＣ２０３７）に対するより小さ
い成長抑制作用を有する。
【００８４】 冨ＧオリゴヌクレオチドによるＧ四重形成 冨ＧオリゴヌクレオチドによるＧ四重組構造の形成を調べるために、Mergny e
t al.（1998）FEBS Lett. 435, 74-78により記載されたＵＶ融解技法を用いた。
この方法は、Ｇ四重の解離が２９５ｎｍでの吸光度の低減をもたらすという事実
によっており、２６０ｎｍでの測定より信頼できる分子内Ｇ四重組形成の指標を
生じると報告されている。Ｇ四重形成のための対照として、一本鎖オリゴヌクレ
オチドＴＥＬを我々は用いた。このオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメア配列5
’-TTAGGG４つの反復を含有し、in vitroでＧ四重構造を形成することが知られ
ている（Wang et al.（1993）Structure 1, 263-282）。図４Ａは、この配列に
関するアニーリング曲線を示す。四重形成は、６６℃の融解温度を用いた明白な
転移により指示される。転移は可逆的であり、０．５℃／分で加熱および冷却曲
線（図示せず）間でわずかなヒステリシスが観察されたが、これは、明らかに遅
い転移を示す。最も活性なオリゴヌクレオチドであるＧＲＯ２９Ａ（図４Ｂ）は
、同様のプロフィールを示したが、これは明らかに、Ｇ四重の存在を示す。わず
かに低活性オリゴヌクレオチドであるＧＲＯ１５Ａ（図４Ｃ）は、２０〜５０℃
の吸光度の低減を示した。これはＧ四重形成を示唆するが、しかし、融解温度が
ＴＥＬ（図４Ａ）またはＧＲＯ１５Ａ（図４Ｃ）よりも低いために、明らかな転
移は観察されない。２つの不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５Ｂ（図４Ｂ）お
よびＧＲＯ２６Ａ（図４Ｅ）に関する曲線は、これらの条件下での分子内Ｇ四重
形成の転移特徴を示さなかった。
t al.（1998）FEBS Lett. 435, 74-78により記載されたＵＶ融解技法を用いた。
この方法は、Ｇ四重の解離が２９５ｎｍでの吸光度の低減をもたらすという事実
によっており、２６０ｎｍでの測定より信頼できる分子内Ｇ四重組形成の指標を
生じると報告されている。Ｇ四重形成のための対照として、一本鎖オリゴヌクレ
オチドＴＥＬを我々は用いた。このオリゴヌクレオチドは、ヒトテロメア配列5
’-TTAGGG４つの反復を含有し、in vitroでＧ四重構造を形成することが知られ
ている（Wang et al.（1993）Structure 1, 263-282）。図４Ａは、この配列に
関するアニーリング曲線を示す。四重形成は、６６℃の融解温度を用いた明白な
転移により指示される。転移は可逆的であり、０．５℃／分で加熱および冷却曲
線（図示せず）間でわずかなヒステリシスが観察されたが、これは、明らかに遅
い転移を示す。最も活性なオリゴヌクレオチドであるＧＲＯ２９Ａ（図４Ｂ）は
、同様のプロフィールを示したが、これは明らかに、Ｇ四重の存在を示す。わず
かに低活性オリゴヌクレオチドであるＧＲＯ１５Ａ（図４Ｃ）は、２０〜５０℃
の吸光度の低減を示した。これはＧ四重形成を示唆するが、しかし、融解温度が
ＴＥＬ（図４Ａ）またはＧＲＯ１５Ａ（図４Ｃ）よりも低いために、明らかな転
移は観察されない。２つの不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５Ｂ（図４Ｂ）お
よびＧＲＯ２６Ａ（図４Ｅ）に関する曲線は、これらの条件下での分子内Ｇ四重
形成の転移特徴を示さなかった。
【００８５】 オリゴヌクレオチドの相対的取込み 冨Ｇオリゴヌクレオチドの抗増殖活性が細胞中へのそれらの示差的取込みによ
り説明され得るか否かを確定するために、５’−放射能標識オリゴヌクレオチド
の細胞取込みを査定した。この方法は、５’−標識を除去する場合のホスホモノ
エステラーゼの作用によりオリゴヌクレオチドの絶対細胞取込みを低く見積もる
可能性があるが、しかしそれは、相対取込みと比較して、有用な情報を提供し得
る（Scaggiante et al.（1998）Eur. J. Biochem. 252, 207-215; Capaccioli e
t al.（1993）Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 818-825）。図５は、細胞
関連放射能により測定した場合の、１０時間後の細胞中へのオリゴヌクレオチド
の相対取込みを示す。取込み順序（即ち、ＧＲＯ１５Ａ＞ＧＲＯ２９Ａ〜ＣＲＯ
＞ＧＲＯ１５Ｂ＞ＧＲＯ２６Ａ＞ＭＩＸ１）は、２６時間で同一であった。細胞
内部の無傷オリゴヌクレオチドの存在を、細胞溶解物のポリアクリルアミド電気
泳動により立証した。
り説明され得るか否かを確定するために、５’−放射能標識オリゴヌクレオチド
の細胞取込みを査定した。この方法は、５’−標識を除去する場合のホスホモノ
エステラーゼの作用によりオリゴヌクレオチドの絶対細胞取込みを低く見積もる
可能性があるが、しかしそれは、相対取込みと比較して、有用な情報を提供し得
る（Scaggiante et al.（1998）Eur. J. Biochem. 252, 207-215; Capaccioli e
t al.（1993）Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 818-825）。図５は、細胞
関連放射能により測定した場合の、１０時間後の細胞中へのオリゴヌクレオチド
の相対取込みを示す。取込み順序（即ち、ＧＲＯ１５Ａ＞ＧＲＯ２９Ａ〜ＣＲＯ
＞ＧＲＯ１５Ｂ＞ＧＲＯ２６Ａ＞ＭＩＸ１）は、２６時間で同一であった。細胞
内部の無傷オリゴヌクレオチドの存在を、細胞溶解物のポリアクリルアミド電気
泳動により立証した。
【００８６】 図５は、配列によってオリゴヌクレオチド取込みの程度に差が認められたこと
を示すが、しかしこれらは抗増殖活性と相関しなかった。例えば、不活性オリゴ
ヌクレオチドＣＲＯ（図６Ｃ参照）は、最も活性なオリゴヌクレオチドであるＧ
ＲＯ２９Ａと同様の効率で取り込まれた。それゆえ、オリゴヌクレオチドの示差
的成長抑制特性は、細胞取込みの差によっては説明できない。相対取込みは配列
中のチミジンの割合（数ではない）とよく相関するように見えることが注目され
たが、しかしこの観察の意味は目下明らかでない。
を示すが、しかしこれらは抗増殖活性と相関しなかった。例えば、不活性オリゴ
ヌクレオチドＣＲＯ（図６Ｃ参照）は、最も活性なオリゴヌクレオチドであるＧ
ＲＯ２９Ａと同様の効率で取り込まれた。それゆえ、オリゴヌクレオチドの示差
的成長抑制特性は、細胞取込みの差によっては説明できない。相対取込みは配列
中のチミジンの割合（数ではない）とよく相関するように見えることが注目され
たが、しかしこの観察の意味は目下明らかでない。
【００８７】 活性冨Ｇオリゴヌクレオチドは特定の細胞タンパク質と結合する 成長抑制作用のメカニズムをさらに調べるために、細胞タンパク質とのオリゴ
ヌクレオチドの結合を検査した。５’−放射能標識化オリゴヌクレオチドをＨｅ
Ｌａ核抽出物を用いて、単独で、または非標識化競合体オリゴヌクレオチドの存
在下で、インキュベートし、電気泳動移動度シフトアッセイにより検査した。こ
の実験では、競合体としてＧ四重形成テロメア配列オリゴヌクレオチドＴＥＬを
含めた。一本鎖オリゴヌクレオチドＴＥＬも、本実験における競合体として含ま
れた。ＴＥＬは、ヒトテロメア配列5’-TTAGGG-3’の４つの反復を含有し、in v
itroでＧ四重構造を形成することが知られている（Wang et al.（1993）Structu
re 1, 263-282）。図６Ａは、安定タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体（「
＊」印）の形成を示す。この帯域は、標識化オリゴヌクレオチドが成長抑制オリ
ゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＡまたはＧＲＯ２９Ａ（レーン１および５）のうちの
１つである場合には強かったが、しかし不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ２６Ａ
は弱い複合体（レーン９）のみを形成した。この実験は、複合体は非標識化抗増
殖性オリゴヌクレオチドまたはＴＥＬにより有効に競合され得るが、しかし不活
性ＧＲＯ２６Ａによっては有効に競合し得ないということも示した。
ヌクレオチドの結合を検査した。５’−放射能標識化オリゴヌクレオチドをＨｅ
Ｌａ核抽出物を用いて、単独で、または非標識化競合体オリゴヌクレオチドの存
在下で、インキュベートし、電気泳動移動度シフトアッセイにより検査した。こ
の実験では、競合体としてＧ四重形成テロメア配列オリゴヌクレオチドＴＥＬを
含めた。一本鎖オリゴヌクレオチドＴＥＬも、本実験における競合体として含ま
れた。ＴＥＬは、ヒトテロメア配列5’-TTAGGG-3’の４つの反復を含有し、in v
itroでＧ四重構造を形成することが知られている（Wang et al.（1993）Structu
re 1, 263-282）。図６Ａは、安定タンパク質−オリゴヌクレオチド複合体（「
＊」印）の形成を示す。この帯域は、標識化オリゴヌクレオチドが成長抑制オリ
ゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＡまたはＧＲＯ２９Ａ（レーン１および５）のうちの
１つである場合には強かったが、しかし不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ２６Ａ
は弱い複合体（レーン９）のみを形成した。この実験は、複合体は非標識化抗増
殖性オリゴヌクレオチドまたはＴＥＬにより有効に競合され得るが、しかし不活
性ＧＲＯ２６Ａによっては有効に競合し得ないということも示した。
【００８８】 同一タンパク質がＴＥＬとそして成長抑制オリゴヌクレオチドと結合している
ことをさらに確証するために、ＴＥＬが標識される同様の実験を実行した。標識
化ＴＥＬは、競合体オリゴヌクレオチドの非存在下で、核抽出物を用いて、２つ
の複合体を形成した（帯域ＡおよびＢ。図６Ｂ）。ゆっくり移動するＴＥＬ−タ
ンパク質複合体（帯域Ａ）は、非標識化成長抑制オリゴヌクレオチド（ＧＲＯ１
５Ａ、ＧＲＯ２９Ａ）により競合されたが、しかし不活性オリゴヌクレオチド（
ＧＲＯ２６Ａ、ＧＲＯ１５Ｂ）によっては競合されなかった。より速く移動する
複合体（帯域Ｂ）はＴＥＬに特異的で、冨Ｇオリゴヌクレオチドにより競合され
なかった。それゆえ競合体ＧＲＯの結合は、帯域Ａの強度の低減および帯域Ｂの
強度の増大により特性化された（帯域Ａ複合体からの標識化ＴＥＬの放出のため
）。このアッセイは、ネイティブＧＲＯ（５’−ホスホリル化なし）の結合親和
性の比較を可能にし、その後の実験におけるタンパク質結合の査定に用いた。競
合が複合体Ａのタンパク質構成成分とのＧＲＯの結合によるものであり、ＧＲＯ
およびＴＥＬオリゴヌクレオチド間の相互作用の結果ではないことを保証するた
めに、１５％ポリアクリルアミドゲル上での移動度シフトを実行した。シフト化
帯域は、タンパク質の非存在下で標識化ＴＥＬをＧＲＯとともにインキュベート
した場合には、観察されなかった（データは図示せず）。
ことをさらに確証するために、ＴＥＬが標識される同様の実験を実行した。標識
化ＴＥＬは、競合体オリゴヌクレオチドの非存在下で、核抽出物を用いて、２つ
の複合体を形成した（帯域ＡおよびＢ。図６Ｂ）。ゆっくり移動するＴＥＬ−タ
ンパク質複合体（帯域Ａ）は、非標識化成長抑制オリゴヌクレオチド（ＧＲＯ１
５Ａ、ＧＲＯ２９Ａ）により競合されたが、しかし不活性オリゴヌクレオチド（
ＧＲＯ２６Ａ、ＧＲＯ１５Ｂ）によっては競合されなかった。より速く移動する
複合体（帯域Ｂ）はＴＥＬに特異的で、冨Ｇオリゴヌクレオチドにより競合され
なかった。それゆえ競合体ＧＲＯの結合は、帯域Ａの強度の低減および帯域Ｂの
強度の増大により特性化された（帯域Ａ複合体からの標識化ＴＥＬの放出のため
）。このアッセイは、ネイティブＧＲＯ（５’−ホスホリル化なし）の結合親和
性の比較を可能にし、その後の実験におけるタンパク質結合の査定に用いた。競
合が複合体Ａのタンパク質構成成分とのＧＲＯの結合によるものであり、ＧＲＯ
およびＴＥＬオリゴヌクレオチド間の相互作用の結果ではないことを保証するた
めに、１５％ポリアクリルアミドゲル上での移動度シフトを実行した。シフト化
帯域は、タンパク質の非存在下で標識化ＴＥＬをＧＲＯとともにインキュベート
した場合には、観察されなかった（データは図示せず）。
【００８９】 複合体Ａに関与するタンパク質のおよその分子量を決定するために、そしてこ
の複合体に関する競合がオリゴヌクレオチドとのタンパク質の直接結合に起因す
ることを確証するために、ＵＶ架橋試験を実行した。５’−標識化オリゴヌクレ
オチドおよびＨｅＬａ核抽出物を、単独でまたは非標識化競合体オリゴヌクレオ
チドの存在下でインキュベートした。次に試料をＵＶ光で照射して、タンパク質
残基およびオリゴヌクレオチド中のチミジン間に架橋形成を生じた。このように
タンパク質を放射能標識し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で検出し得た。
図６Ｃは、この実験の結果を示す。ＴＥＬおよびＧＲＯ１５Ａはともに、抗増殖
性オリゴヌクレオチドおよびＴＥＬにより競合されるが、しかし不活性ＧＲＯ２
６Ａによっては競合されないタンパク質（「＊」印）と架橋した。最も活性なオ
リゴヌクレオチドＧＲＯ２９Ａもこの約１００ｋＤａ複合体およびさらに高分子
量の別の複合体を形成した（図示せず）。不活性ＧＲＯ２６Ａは、約１００ｋＤ
ａでかろうじて可視性の帯域を生じた（図示せず）。
の複合体に関する競合がオリゴヌクレオチドとのタンパク質の直接結合に起因す
ることを確証するために、ＵＶ架橋試験を実行した。５’−標識化オリゴヌクレ
オチドおよびＨｅＬａ核抽出物を、単独でまたは非標識化競合体オリゴヌクレオ
チドの存在下でインキュベートした。次に試料をＵＶ光で照射して、タンパク質
残基およびオリゴヌクレオチド中のチミジン間に架橋形成を生じた。このように
タンパク質を放射能標識し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で検出し得た。
図６Ｃは、この実験の結果を示す。ＴＥＬおよびＧＲＯ１５Ａはともに、抗増殖
性オリゴヌクレオチドおよびＴＥＬにより競合されるが、しかし不活性ＧＲＯ２
６Ａによっては競合されないタンパク質（「＊」印）と架橋した。最も活性なオ
リゴヌクレオチドＧＲＯ２９Ａもこの約１００ｋＤａ複合体およびさらに高分子
量の別の複合体を形成した（図示せず）。不活性ＧＲＯ２６Ａは、約１００ｋＤ
ａでかろうじて可視性の帯域を生じた（図示せず）。
【００９０】 サウスウエスタンブロッティングにより、核タンパク質の分子量をより正確に
決定した。ＨｅＬａ核抽出物を核抽出物を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル
上で電気泳動処理し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロックし、ストリップに切
断した。各ストリップを、非関連非標識化二本鎖および一本鎖ＤＮＡの存在下で 32 Ｐ−標識化冨Ｇオリゴヌクレオチドとともに４℃でインキュベートして、非特
異的結合を遮断した。図６Ｄは、１０６ｋＤａで単一タンパク質帯域にハイブリ
ダイズした活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＡおよびＧＲＯ２９Ａを示す（帯
域は、１０６ｋＤａ分子質量マーカーにちょうど隣接したが、示されてはいない
）。不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＢおよびＧＲＯ２６Ａは、このタンパ
ク質と弱くハイブリダイズしただけであった。図６に提示したデータは、検査し
た少なくとも４つのオリゴヌクレオチドに関して、活性およびタンパク質結合間
の相関を示唆する。これらの実験は、単一タンパク質帯域だけが高親和性で認識
された（図６Ｄ参照）ため、ｐ１０６とのＧＲＯの結合が非常に特異的である、
ということも立証する。これは、固定化核抽出物の墨汁染色が、１０６ｋＤａで
の帯域と等しいかそれより強い多数のその他のタンパク質帯域の存在を示した（
データは図示せず）ように、単に豊富なタンパク質とのハイブリダイゼーション
の結果ではなかった。
決定した。ＨｅＬａ核抽出物を核抽出物を８％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル
上で電気泳動処理し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロックし、ストリップに切
断した。各ストリップを、非関連非標識化二本鎖および一本鎖ＤＮＡの存在下で 32 Ｐ−標識化冨Ｇオリゴヌクレオチドとともに４℃でインキュベートして、非特
異的結合を遮断した。図６Ｄは、１０６ｋＤａで単一タンパク質帯域にハイブリ
ダイズした活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＡおよびＧＲＯ２９Ａを示す（帯
域は、１０６ｋＤａ分子質量マーカーにちょうど隣接したが、示されてはいない
）。不活性オリゴヌクレオチドＧＲＯ１５ＢおよびＧＲＯ２６Ａは、このタンパ
ク質と弱くハイブリダイズしただけであった。図６に提示したデータは、検査し
た少なくとも４つのオリゴヌクレオチドに関して、活性およびタンパク質結合間
の相関を示唆する。これらの実験は、単一タンパク質帯域だけが高親和性で認識
された（図６Ｄ参照）ため、ｐ１０６とのＧＲＯの結合が非常に特異的である、
ということも立証する。これは、固定化核抽出物の墨汁染色が、１０６ｋＤａで
の帯域と等しいかそれより強い多数のその他のタンパク質帯域の存在を示した（
データは図示せず）ように、単に豊富なタンパク質とのハイブリダイゼーション
の結果ではなかった。
【００９１】 抗増殖活性はタンパク質結合と相関する 活性および１０６ｋＤａタンパク質との結合間の関係をさらに確証するために
、４つのより冨Ｇなオリゴヌクレオチドを合成し、それらの作用を活性（ＧＲＯ
２９Ａ）および不活性（ＧＲＯ１５Ｂ）オリゴヌクレオチドと比較した。図７Ａ
および図７Ｂは、オリゴヌクレオチドの成長抑制作用がＴＥＬ結合タンパク質に
関して競合するそれらの能力と相関した、ということを示す。新規のオリゴヌク
レオチドのうちの３つ（ＧＲＯ１４Ａ、ＧＲＯ２５Ａ、ＧＲＯ２８Ａ）は中等度
の抗増殖活性を示したが、しかしＧＲＯ２９Ａと同等には強力ではなかった。オ
リゴヌクレオチドＧＲＯ１４Ｂは、抗増殖活性を示さなかった。同様に、中等度
活性オリゴヌクレオチドは、核タンパク質との結合に関してＴＥＬと競合するこ
とができたが、 ＧＲＯ２９Ａと同等に有効ではなかった。非抑制オリゴヌクレ
オチドＧＲＯ１４Ｂは、タンパク質結合に関して競合できなかった。
、４つのより冨Ｇなオリゴヌクレオチドを合成し、それらの作用を活性（ＧＲＯ
２９Ａ）および不活性（ＧＲＯ１５Ｂ）オリゴヌクレオチドと比較した。図７Ａ
および図７Ｂは、オリゴヌクレオチドの成長抑制作用がＴＥＬ結合タンパク質に
関して競合するそれらの能力と相関した、ということを示す。新規のオリゴヌク
レオチドのうちの３つ（ＧＲＯ１４Ａ、ＧＲＯ２５Ａ、ＧＲＯ２８Ａ）は中等度
の抗増殖活性を示したが、しかしＧＲＯ２９Ａと同等には強力ではなかった。オ
リゴヌクレオチドＧＲＯ１４Ｂは、抗増殖活性を示さなかった。同様に、中等度
活性オリゴヌクレオチドは、核タンパク質との結合に関してＴＥＬと競合するこ
とができたが、 ＧＲＯ２９Ａと同等に有効ではなかった。非抑制オリゴヌクレ
オチドＧＲＯ１４Ｂは、タンパク質結合に関して競合できなかった。
【００９２】 図８に示したように、ＧＲＯ誘導性抗増殖作用に対する種々の細胞株の感受性
とこれらの細胞株からの核および細胞質抽出物中のこのタンパク質のレベルとの
間の相関により、ＧＲＯ作用における約１０６ｋＤａタンパク質の重要性をさら
に立証した。
とこれらの細胞株からの核および細胞質抽出物中のこのタンパク質のレベルとの
間の相関により、ＧＲＯ作用における約１０６ｋＤａタンパク質の重要性をさら
に立証した。
【００９３】 非冨Ｇオリゴヌクレオチドの作用 抗増殖作用の特異性を調べるために、非冨Ｇオリゴヌクレオチドおよびポリ陰
イオン性多糖であるヘパリンの成長抑制作用を試験した。図７Ｃは、１０μＭの
濃度（ＧＲＯ２９Ａに関しては約０．１ｍｇ／ｍｌと等価）では、３’−修飾化
冨Ｃオリゴヌクレオチド（ＣＲＯ）も３’−修飾化混合塩基オリゴヌクレオチド
（ＭＩＸ１）も、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の成長を抑制できなかった、と
いうことを示す。この結果は、ＧＲＯ１５ＡおよびＧＲＯ２９Ａの成長抑制活性
が単に３’−修飾化オリゴヌクレオチドの存在に起因する非特異的作用ではなく
、むしろこれらの配列の何らかの独特の特徴によることを示した。ヘパリンも、
２０単位／ｍｌ（約０．１２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で培地に付加された場合、細胞
成長に影響を及ぼさず、活性オリゴヌクレオチドの抗増殖作用は単にそれらのポ
リ陰イオン性特徴の結果ではないということをさらに実証した。非３’−保護化
オリゴヌクレオチドの抗増殖特性を試験するために、オリゴヌクレオチドが無血
清培地中の細胞に付加される、わずかに修飾された処置プロトコールを用いた（
「実験手法」参照）。図７Ｄは、同様の作用が、これらの条件下で非修飾化オリ
ゴヌクレオチドを用いても観察され得たことを示す。２９Ａ−ＯＨ（ＧＲＯ２９
Ａの３’−非修飾化類似体）およびＴＥＬは細胞の成長を抑制したが、一方、２
つの混合配列オリゴヌクレオチドは成長抑制作用を有さなかった。
イオン性多糖であるヘパリンの成長抑制作用を試験した。図７Ｃは、１０μＭの
濃度（ＧＲＯ２９Ａに関しては約０．１ｍｇ／ｍｌと等価）では、３’−修飾化
冨Ｃオリゴヌクレオチド（ＣＲＯ）も３’−修飾化混合塩基オリゴヌクレオチド
（ＭＩＸ１）も、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の成長を抑制できなかった、と
いうことを示す。この結果は、ＧＲＯ１５ＡおよびＧＲＯ２９Ａの成長抑制活性
が単に３’−修飾化オリゴヌクレオチドの存在に起因する非特異的作用ではなく
、むしろこれらの配列の何らかの独特の特徴によることを示した。ヘパリンも、
２０単位／ｍｌ（約０．１２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で培地に付加された場合、細胞
成長に影響を及ぼさず、活性オリゴヌクレオチドの抗増殖作用は単にそれらのポ
リ陰イオン性特徴の結果ではないということをさらに実証した。非３’−保護化
オリゴヌクレオチドの抗増殖特性を試験するために、オリゴヌクレオチドが無血
清培地中の細胞に付加される、わずかに修飾された処置プロトコールを用いた（
「実験手法」参照）。図７Ｄは、同様の作用が、これらの条件下で非修飾化オリ
ゴヌクレオチドを用いても観察され得たことを示す。２９Ａ−ＯＨ（ＧＲＯ２９
Ａの３’−非修飾化類似体）およびＴＥＬは細胞の成長を抑制したが、一方、２
つの混合配列オリゴヌクレオチドは成長抑制作用を有さなかった。
【００９４】 これらの非冨Ｇオリゴヌクレオチドおよびヘパリンのタンパク質結合特性（示
されていない）も比較した。予測通り、非標識化成長抑制オリゴヌクレオチドＧ
ＲＯ２９Ａ、２９Ａ−ＯＨおよびＴＥＬは、１０ｎＭ濃度（ＧＲＯ２９Ａに関し
て約０．１μｇ／ｍｌ）で、競合的電気泳動移動度シフトアッセイ（標識化ＴＥ
ＬオリゴヌクレオチドおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１核抽出物使用）において、タ
ンパク質結合に関して強く競合した。そのより低い抗増殖活性と一致して、ＴＥ
Ｌは２９Ａ−ＯＨまたはＧＲＯ２９Ａよりわずかに低有効的に競合した。１０ｎ
Ｍ非標識化ＣＲＯ、ＭＩＸ２またはＭＩＸ３を用いて、あるいは０．０２単位／
ｍｌヘパリン（約０．１２μｇ／ｍｌ）の存在下で、競合は観察されなかった。
しかしながら、混合配列オリゴヌクレオチドＭＩＸ１は、例外的であった。この
オリゴヌクレオチドは細胞の成長に影響を及ぼさなかったが、しかしそれは競合
的ＥＭＳＡにおけるタンパク質結合に関して競合すると思われた。
されていない）も比較した。予測通り、非標識化成長抑制オリゴヌクレオチドＧ
ＲＯ２９Ａ、２９Ａ−ＯＨおよびＴＥＬは、１０ｎＭ濃度（ＧＲＯ２９Ａに関し
て約０．１μｇ／ｍｌ）で、競合的電気泳動移動度シフトアッセイ（標識化ＴＥ
ＬオリゴヌクレオチドおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１核抽出物使用）において、タ
ンパク質結合に関して強く競合した。そのより低い抗増殖活性と一致して、ＴＥ
Ｌは２９Ａ−ＯＨまたはＧＲＯ２９Ａよりわずかに低有効的に競合した。１０ｎ
Ｍ非標識化ＣＲＯ、ＭＩＸ２またはＭＩＸ３を用いて、あるいは０．０２単位／
ｍｌヘパリン（約０．１２μｇ／ｍｌ）の存在下で、競合は観察されなかった。
しかしながら、混合配列オリゴヌクレオチドＭＩＸ１は、例外的であった。この
オリゴヌクレオチドは細胞の成長に影響を及ぼさなかったが、しかしそれは競合
的ＥＭＳＡにおけるタンパク質結合に関して競合すると思われた。
【００９５】 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質はヌクレオリンであるという証拠 ２つの以前の報告は、冨Ｇテロメア配列との核タンパク質ヌクレオリンの結合
を記載している。Ishikawa et al.（（1993）Mol. Cell. Biol. 13, 4301-4310
）は、5’-（TTAGGG）4-3’と結合したＨｅＬａ抽出物から５０ｋＤａタンパク
質を同定した。微小配列決定は、これがヌクレオリンのタンパク質分解性断片で
あることを示唆した。全長精製１０６ｋＤａヌクレオリンタンパク質の結合は、
DickinsonとKohwi-Shigematsuにより別々に立証された（Dickinson et al.（199
5）Mol. Cell. Biol. 15, 456-465）。本発明のタンパク質は的確な分子量を有
するものであり、5’-（TTAGGG）4-3’（ＴＥＬ）に結合されたため、冨Ｇオリ
ゴヌクレオチド結合タンパク質はヌクレオリンであるという仮説を試験した。Ｈ
ｅＬａ細胞（Promegaから購入）またはＭＤＡ−ＭＧ−２３１乳癌細胞（標準手
法により出願人等の実験室で得られた）からの核抽出物を電気泳動処理し、ＰＶ
ＤＦ膜に転写した。前記のサウスウエスタン手法を用いて、32Ｐ−標識化ＧＲＯ
１５Ａとの結合に関して固定化タンパク質をプローブし、オートラジオグラフィ
ーフィルムに一夜曝露することにより可視化した。前記の変性／再生過程（実験
手法、「サウスウエスタンブロッティング」参照）により同一膜からオリゴヌク
レオチドをはぎとり、一次抗体としてのヌクレオリン抗血清およびホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化抗ウサギ二次抗体を用いて、ウエスタ
ン−ブロット処理した。化学発光検出試薬を用いたインキュベーションとその後
のオートラジオグラフィーフィルムへの２０秒間曝露により、ブロットを可視化
した。結果を図９Ａに示す。核抽出物のサウスウエスタンブロットは、ハイブリ
ダイゼーション時の強い帯域および１０６ｋＤａ（ＨｅＬａ）または約１１６ｋ
Ｄａ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）での放射能標識化ＧＲＯ１５Ａを示した。ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１核タンパク質のウエスタンブロットは、約１１６ｋＤａで１つの
強い帯域と約５０ｋＤａで弱い帯域を示す。ＨｅＬａ抽出物では、ヌクレオリン
抗体は、約５０、７５、１０６および１２０ｋＤａで多数の帯域を認識する。最
も重要なのは、両細胞株において、ＧＲＯ１５Ａにより認識された帯域が、膜が
はぎとられ、ヌクレオリン抗体でウエスタンブロッティングされた場合に認識さ
れた帯域に正確に対応したことである。ヌクレオリンは、多数のキナーゼにより
細胞中でリン酸化され得る、そして自己タンパク質分解も受けやすいタンパク質
である（Zhou et al.（1997）J. Biol. Chem. 272, 31130-31137; Schwab et al
.（1997）Eur. J. Cell Biol. 73, 287-297; Li et al.（1996）J. Biol. Chem.
271, 15662-15668; Peter et al.（1990）Cell 60, 791-801; Belenguer et al
.（1990）Mol. Cell Biol. 10, 3607-3618; Fang et al.（1993）Exp. Cell Res
. 208, 48-53; Chen et al.（1991）J. Biol. Chem. 266, 7754-7758）。これら
のブロットで検出されたタンパク質の分子量の差は、核抽出物の調製の異なる方
法から生じ、優勢種である別様のリン酸化または分解形態のヌクレオリンをもた
らし得るということが考えられている。図９Ａのサウスウエスタンブロットに示
された帯域の強度の差は、他を上回るヌクレオリンの一形態（明らかに１０６ｋ
Ｄａ種）とのＧＲＯ１５Ａの優先的結合のためであり得る。
を記載している。Ishikawa et al.（（1993）Mol. Cell. Biol. 13, 4301-4310
）は、5’-（TTAGGG）4-3’と結合したＨｅＬａ抽出物から５０ｋＤａタンパク
質を同定した。微小配列決定は、これがヌクレオリンのタンパク質分解性断片で
あることを示唆した。全長精製１０６ｋＤａヌクレオリンタンパク質の結合は、
DickinsonとKohwi-Shigematsuにより別々に立証された（Dickinson et al.（199
5）Mol. Cell. Biol. 15, 456-465）。本発明のタンパク質は的確な分子量を有
するものであり、5’-（TTAGGG）4-3’（ＴＥＬ）に結合されたため、冨Ｇオリ
ゴヌクレオチド結合タンパク質はヌクレオリンであるという仮説を試験した。Ｈ
ｅＬａ細胞（Promegaから購入）またはＭＤＡ−ＭＧ−２３１乳癌細胞（標準手
法により出願人等の実験室で得られた）からの核抽出物を電気泳動処理し、ＰＶ
ＤＦ膜に転写した。前記のサウスウエスタン手法を用いて、32Ｐ−標識化ＧＲＯ
１５Ａとの結合に関して固定化タンパク質をプローブし、オートラジオグラフィ
ーフィルムに一夜曝露することにより可視化した。前記の変性／再生過程（実験
手法、「サウスウエスタンブロッティング」参照）により同一膜からオリゴヌク
レオチドをはぎとり、一次抗体としてのヌクレオリン抗血清およびホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化抗ウサギ二次抗体を用いて、ウエスタ
ン−ブロット処理した。化学発光検出試薬を用いたインキュベーションとその後
のオートラジオグラフィーフィルムへの２０秒間曝露により、ブロットを可視化
した。結果を図９Ａに示す。核抽出物のサウスウエスタンブロットは、ハイブリ
ダイゼーション時の強い帯域および１０６ｋＤａ（ＨｅＬａ）または約１１６ｋ
Ｄａ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）での放射能標識化ＧＲＯ１５Ａを示した。ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１核タンパク質のウエスタンブロットは、約１１６ｋＤａで１つの
強い帯域と約５０ｋＤａで弱い帯域を示す。ＨｅＬａ抽出物では、ヌクレオリン
抗体は、約５０、７５、１０６および１２０ｋＤａで多数の帯域を認識する。最
も重要なのは、両細胞株において、ＧＲＯ１５Ａにより認識された帯域が、膜が
はぎとられ、ヌクレオリン抗体でウエスタンブロッティングされた場合に認識さ
れた帯域に正確に対応したことである。ヌクレオリンは、多数のキナーゼにより
細胞中でリン酸化され得る、そして自己タンパク質分解も受けやすいタンパク質
である（Zhou et al.（1997）J. Biol. Chem. 272, 31130-31137; Schwab et al
.（1997）Eur. J. Cell Biol. 73, 287-297; Li et al.（1996）J. Biol. Chem.
271, 15662-15668; Peter et al.（1990）Cell 60, 791-801; Belenguer et al
.（1990）Mol. Cell Biol. 10, 3607-3618; Fang et al.（1993）Exp. Cell Res
. 208, 48-53; Chen et al.（1991）J. Biol. Chem. 266, 7754-7758）。これら
のブロットで検出されたタンパク質の分子量の差は、核抽出物の調製の異なる方
法から生じ、優勢種である別様のリン酸化または分解形態のヌクレオリンをもた
らし得るということが考えられている。図９Ａのサウスウエスタンブロットに示
された帯域の強度の差は、他を上回るヌクレオリンの一形態（明らかに１０６ｋ
Ｄａ種）とのＧＲＯ１５Ａの優先的結合のためであり得る。
【００９６】 特定タンパク質の結合が細胞環境内で起こったか否かを確定するために、ビオ
チン化冨Ｇオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を処置
した。次に、ストレプタビジン被覆磁気ビーズを用いて、免疫沈降型緩衝液によ
る細胞の溶解後に、オリゴヌクレオチド−タンパク質複合体を捕捉した（「実験
手法」参照）。活性オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＧＲＯ１５Ａ）また
は不活性オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＧＲＯ１５Ｂ）で処置された細
胞、ならびに対照としての非処置細胞に関して、この手法を実行した。等容量の
各試料を電気泳動処理し、ＰＶＤＦ膜に転写した。これを、墨汁染色、放射能標
識化ＧＲＯ１５Ａを用いたサウスウエスタンブロッティングおよびヌクレオリン
モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。膜の墨
汁染色は、約１１６ｋＤａで主タンパク質帯域を示し、これはビオチニル化ＧＲ
Ｏ１５Ａで処理した細胞中に存在したが、未処理細胞中には存在せず、不活性ビ
オチン化ＧＲＯ１５Ｂで処理した細胞中では非常に低い強度を示した（データは
示していない）。サウスウエスタンおよびウエスタンブロット（図９Ｂ）は、こ
の捕捉タンパク質がＧＲＯ１５Ａおよびヌクレオリン抗体の両方と結合すること
を確証する。
チン化冨Ｇオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を処置
した。次に、ストレプタビジン被覆磁気ビーズを用いて、免疫沈降型緩衝液によ
る細胞の溶解後に、オリゴヌクレオチド−タンパク質複合体を捕捉した（「実験
手法」参照）。活性オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＧＲＯ１５Ａ）また
は不活性オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＧＲＯ１５Ｂ）で処置された細
胞、ならびに対照としての非処置細胞に関して、この手法を実行した。等容量の
各試料を電気泳動処理し、ＰＶＤＦ膜に転写した。これを、墨汁染色、放射能標
識化ＧＲＯ１５Ａを用いたサウスウエスタンブロッティングおよびヌクレオリン
モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。膜の墨
汁染色は、約１１６ｋＤａで主タンパク質帯域を示し、これはビオチニル化ＧＲ
Ｏ１５Ａで処理した細胞中に存在したが、未処理細胞中には存在せず、不活性ビ
オチン化ＧＲＯ１５Ｂで処理した細胞中では非常に低い強度を示した（データは
示していない）。サウスウエスタンおよびウエスタンブロット（図９Ｂ）は、こ
の捕捉タンパク質がＧＲＯ１５Ａおよびヌクレオリン抗体の両方と結合すること
を確証する。
【００９７】 この実験は、１１６ｋＤａタンパク質がビオチン化ＧＲＯで処置した細胞から
特異的に捕捉され、このタンパク質はヌクレオリン抗体によっても認識され、そ
してこのタンパク質は低活性ＧＲＯ１５Ｂにより捕捉されるより多く活性ＧＲＯ
１５Ａにより捕捉される、ということを示した。タンパク質−オリゴヌクレオチ
ド会合は細胞溶解またはオリゴヌクレオチド捕捉中に起こるという可能性は絶対
的には排除され得ないが、しかしオリゴヌクレオチドが細胞内部で遊離、非複合
化状態で存在するとは思われない。これらの結果は、細胞内部（またはおそらく
は細胞表面）での１１６ｋＤａタンパク質とのオリゴヌクレオチドの結合に関す
る強力な証拠を提供する。
特異的に捕捉され、このタンパク質はヌクレオリン抗体によっても認識され、そ
してこのタンパク質は低活性ＧＲＯ１５Ｂにより捕捉されるより多く活性ＧＲＯ
１５Ａにより捕捉される、ということを示した。タンパク質−オリゴヌクレオチ
ド会合は細胞溶解またはオリゴヌクレオチド捕捉中に起こるという可能性は絶対
的には排除され得ないが、しかしオリゴヌクレオチドが細胞内部で遊離、非複合
化状態で存在するとは思われない。これらの結果は、細胞内部（またはおそらく
は細胞表面）での１１６ｋＤａタンパク質とのオリゴヌクレオチドの結合に関す
る強力な証拠を提供する。
【００９８】 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質の細胞レベル以下位置を確定するため
に、サウスウエスタンおよびウエスタンブロッティング実験を行い、核抽出物、
細胞質抽出物および細胞膜由来タンパク質（５μｇ抽出物／レーン）を比較した
。図９Ｃは、これらの試験の結果を示す。サウスウエスタンブロットは、標識化
ＧＲＯ１５Ａを結合し得る１１６ｋＤａタンパク質が核抽出物中に存在し、細胞
質分画中にはそれより低い程度存在することを示す。同一帯域は、形質膜抽出物
中に存在し、ＧＲＯ１５Ａと強くハイブリダイズした。同一膜のウエスタンブロ
ッティングは、ヌクレオリンに対するモノクローナル抗体も各分画中の１１６ｋ
Ｄａでこれらの帯域を認識することを示した（約７０ｋＤａでの帯域もＧＲＯ１
５Ａおよびヌクレオリン抗体の両方により認識されたが、ヌクレオリンのタンパ
ク質分解性断片であり得る）。ＧＲＯ１５Ａおよびヌクレオリン抗体により認識
される帯域の位置および相対強度はともに同一であるため、これらの結果は、抗
増殖性冨Ｇオリゴヌクレオチドと結合するタンパク質がヌクレオリンである、と
いうさらなる証拠を提供する。形質膜抽出物中のＧＲＯ結合タンパク質の検出も
、細胞表面タンパク質との結合は、冨Ｇオリゴヌクレオチドの作用メカニズムに
重要であり得るという可能性を示唆する。
に、サウスウエスタンおよびウエスタンブロッティング実験を行い、核抽出物、
細胞質抽出物および細胞膜由来タンパク質（５μｇ抽出物／レーン）を比較した
。図９Ｃは、これらの試験の結果を示す。サウスウエスタンブロットは、標識化
ＧＲＯ１５Ａを結合し得る１１６ｋＤａタンパク質が核抽出物中に存在し、細胞
質分画中にはそれより低い程度存在することを示す。同一帯域は、形質膜抽出物
中に存在し、ＧＲＯ１５Ａと強くハイブリダイズした。同一膜のウエスタンブロ
ッティングは、ヌクレオリンに対するモノクローナル抗体も各分画中の１１６ｋ
Ｄａでこれらの帯域を認識することを示した（約７０ｋＤａでの帯域もＧＲＯ１
５Ａおよびヌクレオリン抗体の両方により認識されたが、ヌクレオリンのタンパ
ク質分解性断片であり得る）。ＧＲＯ１５Ａおよびヌクレオリン抗体により認識
される帯域の位置および相対強度はともに同一であるため、これらの結果は、抗
増殖性冨Ｇオリゴヌクレオチドと結合するタンパク質がヌクレオリンである、と
いうさらなる証拠を提供する。形質膜抽出物中のＧＲＯ結合タンパク質の検出も
、細胞表面タンパク質との結合は、冨Ｇオリゴヌクレオチドの作用メカニズムに
重要であり得るという可能性を示唆する。
【００９９】 さらに、ＧＲＯ作用に対する細胞系の感受性がＧＲＯ結合タンパク質のレベル
に関連することが見出された（細胞抽出物のサウスウエスタンブロッティングに
より検出）ため、ＧＲＯの抗増殖活性におけるヌクレオリン／ＧＲＯ結合タンパ
ク質の関与が示された。例えば、ＧＲＯ作用に対して最も感受性を示す細胞系（
ＤＥ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅＬａ）は高レベルのｐ１１０を有した
が、一方、低感受性細胞系（ＨＳ２７、ＭＣＦ−７）または耐性細胞系（メトト
レキセート耐性ＭＣＦ−７誘導体）は、低または検出不可能レベルのｐ１１０を
有した。さらに、ヌクレオリンレベルは、図９に示したような指数関数的成長に
おいてＧＲＯ処置細胞および非処置細胞により有意に変えられることが判明した
が、この場合、免疫蛍光の全体的増大は、抗ヌクレオリン染色を用いたＧＲＯ２
９Ａ処置後７２時間目に、処置（Ｂ）対非処置（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
に関して見出され、細胞質へのトランスロケーションも観察された。
に関連することが見出された（細胞抽出物のサウスウエスタンブロッティングに
より検出）ため、ＧＲＯの抗増殖活性におけるヌクレオリン／ＧＲＯ結合タンパ
ク質の関与が示された。例えば、ＧＲＯ作用に対して最も感受性を示す細胞系（
ＤＥ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅＬａ）は高レベルのｐ１１０を有した
が、一方、低感受性細胞系（ＨＳ２７、ＭＣＦ−７）または耐性細胞系（メトト
レキセート耐性ＭＣＦ−７誘導体）は、低または検出不可能レベルのｐ１１０を
有した。さらに、ヌクレオリンレベルは、図９に示したような指数関数的成長に
おいてＧＲＯ処置細胞および非処置細胞により有意に変えられることが判明した
が、この場合、免疫蛍光の全体的増大は、抗ヌクレオリン染色を用いたＧＲＯ２
９Ａ処置後７２時間目に、処置（Ｂ）対非処置（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
に関して見出され、細胞質へのトランスロケーションも観察された。
【０１００】 ＴＥＬ−タンパク質複合体は、２つの強力な抗増殖性オリゴヌクレオチドであ
るＧＲＯ２９ＡおよびＯＭＲ２９Ａ（レーン２および１３）により最も効果的に
競合される。複合体は、抗増殖活性を有さない化合物（例えば、カフェイン、ポ
リミキシンまたはヘパリン）によって、またはそのメカニズムがヌクレオリン結
合以外の特性に起因することが知られている一般的に用いられる治療薬（例えば
、５−ＦＵ、タキソールまたはシスプラチン）によっては競合されないか、また
は低度に競合される。
るＧＲＯ２９ＡおよびＯＭＲ２９Ａ（レーン２および１３）により最も効果的に
競合される。複合体は、抗増殖活性を有さない化合物（例えば、カフェイン、ポ
リミキシンまたはヘパリン）によって、またはそのメカニズムがヌクレオリン結
合以外の特性に起因することが知られている一般的に用いられる治療薬（例えば
、５−ＦＵ、タキソールまたはシスプラチン）によっては競合されないか、また
は低度に競合される。
【０１０１】 本明細書中に既述したあらゆる特許または出版物は、本発明が属する業界の当
業者のレベルを示す。これらの特許および出版物は、各々の個々の出版物が特定
的に且つ個別に参照により援用されることが示される場合と同程度に、参照によ
り本明細書中に援用される。
業者のレベルを示す。これらの特許および出版物は、各々の個々の出版物が特定
的に且つ個別に参照により援用されることが示される場合と同程度に、参照によ
り本明細書中に援用される。
【０１０２】 本発明の前記で引用した特徴、利点および目的、ならびに明らかになる他のも
のが得られ、詳細に理解され得るよう、添付の図面に説明するそのいくつかの実
施態様を参照することにより前記で簡単に要約した本発明のさらに特定の説明が
示され得る。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付の
図面は本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、したがってそれらの範
囲に限定して考えられるべきではない、ということに留意すべきである。
のが得られ、詳細に理解され得るよう、添付の図面に説明するそのいくつかの実
施態様を参照することにより前記で簡単に要約した本発明のさらに特定の説明が
示され得る。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付の
図面は本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、したがってそれらの範
囲に限定して考えられるべきではない、ということに留意すべきである。
【０１０３】 本発明は、目的を実行し、前記の目的および利益を、ならびにそれに付随する
ものを達成するために十分に適応される、ということを当業者は容易に理解する
であろう。本明細書中に記載した本発明の方法、手法、処置、分子および特定の
化合物は、目下、好ましい実施態様を代表するものであり、適例であり、そして
本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に定義されたような本発
明の精神内に包含される変更およびその他の使用は、当業者には明らかである。
ものを達成するために十分に適応される、ということを当業者は容易に理解する
であろう。本明細書中に記載した本発明の方法、手法、処置、分子および特定の
化合物は、目下、好ましい実施態様を代表するものであり、適例であり、そして
本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に定義されたような本発
明の精神内に包含される変更およびその他の使用は、当業者には明らかである。
【配列表】
【図１】 冨Ｇオリゴヌクレオチドまたは対照としての水で処理された腫瘍
細胞の成長を経時的に示すＭＴＴアッセイの図である。ここで、（Ａ）細胞型は
ＤＵ１４５であり、（Ｂ）細胞型はＭＤＡ−ＭＢ−２３１であり、（Ｃ）細胞型
はＨｅＬａであり、そして（Ｄ）細胞型はＭＣＦ−７であって、□はＧＲＯ１５
Ａ、◇はＧＲＯ１５Ｂ、○はＧＲＯ２９Ａ、△はＧＲＯ２６Ａおよび田は水であ
る。
細胞の成長を経時的に示すＭＴＴアッセイの図である。ここで、（Ａ）細胞型は
ＤＵ１４５であり、（Ｂ）細胞型はＭＤＡ−ＭＢ−２３１であり、（Ｃ）細胞型
はＨｅＬａであり、そして（Ｄ）細胞型はＭＣＦ−７であって、□はＧＲＯ１５
Ａ、◇はＧＲＯ１５Ｂ、○はＧＲＯ２９Ａ、△はＧＲＯ２６Ａおよび田は水であ
る。
【図２】 ＧＲＯ２９Ａ活性オリゴヌクレオチド（■）、ＧＲＯ１５Ｂ（不
活性オリゴヌクレオチド、半黒四角）またはオリゴヌクレオチドなし（□）で処
理した（Ａ）ＤＵ１４５細胞、（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および（Ｃ）Ｈ
Ｓ２７細胞の成長を示すＭＴＴアッセイの結果を説明する図である。
活性オリゴヌクレオチド、半黒四角）またはオリゴヌクレオチドなし（□）で処
理した（Ａ）ＤＵ１４５細胞、（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および（Ｃ）Ｈ
Ｓ２７細胞の成長を示すＭＴＴアッセイの結果を説明する図である。
【図３】 白血病細胞系Ｕ９３７およびＫ５６３、ならびに非悪性マウス造
血幹細胞系（ＡＴＣＣ２０３７）に関するＧＲＯ２９Ａによる成長抑制の用量依
存性を示すＭＴＴアッセイの図である。
血幹細胞系（ＡＴＣＣ２０３７）に関するＧＲＯ２９Ａによる成長抑制の用量依
存性を示すＭＴＴアッセイの図である。
【図４】 冨ＧオリゴヌクレオチドによるＧ四重形成を査定するためのＵＶ
熱再生曲線の図である。ここで、（Ａ）はＴＥＬであり、（Ｂ）はＧＲＯ２９Ａ
であり、（Ｃ）はＧＲＯ１５Ａであり、（Ｄ）はＧＲＯ１５Ｇであり、そして（
Ｅ）はＧＲＯ２６Ａである。
熱再生曲線の図である。ここで、（Ａ）はＴＥＬであり、（Ｂ）はＧＲＯ２９Ａ
であり、（Ｃ）はＧＲＯ１５Ａであり、（Ｄ）はＧＲＯ１５Ｇであり、そして（
Ｅ）はＧＲＯ２６Ａである。
【図５】 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞による冨Ｇオリゴヌクレオチドの
取込みを説明するクロマトグラムの図である。
取込みを説明するクロマトグラムの図である。
【図６】 （Ａ）５μｇＨｅＬａ核抽出物との32Ｐ標識化オリゴヌクレオチ
ドの結合、および非標識化競合体オリゴヌクレオチド（標識化オリゴヌクレオチ
ドより１００倍ｍｏｌ余分量）による競合を示す電気泳動移動度シフトアッセイ
（ＥＭＳＡ）の図である。競合体オリゴヌクレオチドは、Ｔ（ＴＥＬ）、２９（
ＧＲＯ２９Ａ）、２６（ＧＲＯ２６Ａ）および１５Ａ（ＧＲＯ１５Ａ）と略記す
る。（Ｂ）32Ｐ標識化ＴＥＬオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）および５μｇ Ｈｅ
Ｌａ核抽出物間に形成される複合体、ならびに非標識化競合体冨Ｇオリゴヌクレ
オチド（１０または１００ｎＭ）の作用を示すＥＭＳＡの図である。（Ｃ）非標
識化競合体（１００倍ｍｏｌ余分量）の非存在下または存在下でインキュベート
した標識化オリゴヌクレオチドおよびＨｅＬａ核抽出物のＵＶ架橋により形成さ
れた複合体を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの図である。（Ｄ）32Ｐ標識
化冨ＧオリゴヌクレオチドでプローブしたＨｅＬａ核抽出物のサウスウエスタン
ブロット（２×１０6カウント／分、約０．７５ｎｎｍｏｌ）。
ドの結合、および非標識化競合体オリゴヌクレオチド（標識化オリゴヌクレオチ
ドより１００倍ｍｏｌ余分量）による競合を示す電気泳動移動度シフトアッセイ
（ＥＭＳＡ）の図である。競合体オリゴヌクレオチドは、Ｔ（ＴＥＬ）、２９（
ＧＲＯ２９Ａ）、２６（ＧＲＯ２６Ａ）および１５Ａ（ＧＲＯ１５Ａ）と略記す
る。（Ｂ）32Ｐ標識化ＴＥＬオリゴヌクレオチド（１ｎＭ）および５μｇ Ｈｅ
Ｌａ核抽出物間に形成される複合体、ならびに非標識化競合体冨Ｇオリゴヌクレ
オチド（１０または１００ｎＭ）の作用を示すＥＭＳＡの図である。（Ｃ）非標
識化競合体（１００倍ｍｏｌ余分量）の非存在下または存在下でインキュベート
した標識化オリゴヌクレオチドおよびＨｅＬａ核抽出物のＵＶ架橋により形成さ
れた複合体を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの図である。（Ｄ）32Ｐ標識
化冨ＧオリゴヌクレオチドでプローブしたＨｅＬａ核抽出物のサウスウエスタン
ブロット（２×１０6カウント／分、約０．７５ｎｎｍｏｌ）。
【図７】 （Ａ）１回１０μＭ用量の冨Ｇオリゴヌクレオチドまたは対照と
してのＰＢＳで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイを説明する
クロマトグラムの図である。アッセイは、９日目（１日目にオリゴヌクレオチド
付加）に実施した。（Ｂ）32Ｐ標識化ＴＥＬオリゴヌクレオチドとの５μｇＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１核抽出物の結合により形成される複合体、および非標識化冨Ｇ
オリゴヌクレオチド（１０倍ｍｏｌ余分量）による競合を示すＥＭＳＡを説明す
る図である。（Ｃ）１回１０μＭ用量の３’−保護冨Ｃオリゴヌクレオチド（Ｃ
ＲＯ）または混合配列オリゴヌクレオチド（ＭＩＸ１）で、あるいは２０単位／
ｍｌのヘパリン（ＨＥＰ）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセ
イの結果を、不活性（ＧＲＯ１５Ｂ）および活性（ＧＲＯ２９Ａ）冨Ｇオリゴヌ
クレオチドと比較して説明するクロマトグラムの図である。この場合、アッセイ
は７日目に実施した。（Ｄ）１回１０μＭ用量の非修飾化混合配列オリゴヌクレ
オチドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイ結果を、非修飾化
ＧＲＯ２９Ａ類似体（２９Ａ−ＯＨ）およびＴＥＬと比較して説明するクロマト
グラムの図である。この場合、細胞を処理するために、培地を１０μＭのオリゴ
ヌクレオチドを含有する無血清培地と取り換えて、４時間後、３７℃で、ウシ胎
仔血清を付加して１０％ｖ／ｖとし、７日目にアッセイを実施した。
してのＰＢＳで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイを説明する
クロマトグラムの図である。アッセイは、９日目（１日目にオリゴヌクレオチド
付加）に実施した。（Ｂ）32Ｐ標識化ＴＥＬオリゴヌクレオチドとの５μｇＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１核抽出物の結合により形成される複合体、および非標識化冨Ｇ
オリゴヌクレオチド（１０倍ｍｏｌ余分量）による競合を示すＥＭＳＡを説明す
る図である。（Ｃ）１回１０μＭ用量の３’−保護冨Ｃオリゴヌクレオチド（Ｃ
ＲＯ）または混合配列オリゴヌクレオチド（ＭＩＸ１）で、あるいは２０単位／
ｍｌのヘパリン（ＨＥＰ）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセ
イの結果を、不活性（ＧＲＯ１５Ｂ）および活性（ＧＲＯ２９Ａ）冨Ｇオリゴヌ
クレオチドと比較して説明するクロマトグラムの図である。この場合、アッセイ
は７日目に実施した。（Ｄ）１回１０μＭ用量の非修飾化混合配列オリゴヌクレ
オチドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイ結果を、非修飾化
ＧＲＯ２９Ａ類似体（２９Ａ−ＯＨ）およびＴＥＬと比較して説明するクロマト
グラムの図である。この場合、細胞を処理するために、培地を１０μＭのオリゴ
ヌクレオチドを含有する無血清培地と取り換えて、４時間後、３７℃で、ウシ胎
仔血清を付加して１０％ｖ／ｖとし、７日目にアッセイを実施した。
【図８】 （上）：種々の細胞系からの核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）抽出物
中のＧＲＯ結合タンパク質を検出するための放射能標識化ＧＲＯ１５Ａを用いた
サウスウエスタンブロットの図である。（下）：ＧＲＯ２９ＡおよびＧＲＯ１５
Ａの成長抑制作用に対する種々の細胞系の感受性を示す図である。
中のＧＲＯ結合タンパク質を検出するための放射能標識化ＧＲＯ１５Ａを用いた
サウスウエスタンブロットの図である。（下）：ＧＲＯ２９ＡおよびＧＲＯ１５
Ａの成長抑制作用に対する種々の細胞系の感受性を示す図である。
【図９】 （Ａ）32Ｐ標識化活性冨Ｇオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ１５Ａ）
またはヌクレオリン抗血清でそれぞれプローブしたサウスウエスタン（ＳＷ）お
よびウエスタン（Ｗ）ブロットの図である。左パネルはＭＤＡ−ＭＢ−２３１核
抽出物（５μｇ／レーン）を示す。右パネルは、ＨｅＬａ核抽出物（Promega In
c., ５μｇ／レーン）を示す。（Ｂ）オリゴヌクレオチドなし（なし）、活性冨
Ｇオリゴヌクレオチド（１５Ａ）または低活性冨Ｇオリゴヌクレオチド（１５Ｂ
）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の溶解物から捕捉したタンパク質のサウ
スウエスタンおよびウエスタンブロットの図である。（Ｃ） ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１細胞からのタンパク質抽出物（３μｇ／レーン）とのＧＲＯ１５Ａおよびヌ
クレオリン抗体の結合を示すサウスウエスタンおよびウエスタンブロットの図で
ある。核抽出物（ＮＵ）、細胞質抽出物（ＣＹ）および膜タンパク質（ＭＥ）。
またはヌクレオリン抗血清でそれぞれプローブしたサウスウエスタン（ＳＷ）お
よびウエスタン（Ｗ）ブロットの図である。左パネルはＭＤＡ−ＭＢ−２３１核
抽出物（５μｇ／レーン）を示す。右パネルは、ＨｅＬａ核抽出物（Promega In
c., ５μｇ／レーン）を示す。（Ｂ）オリゴヌクレオチドなし（なし）、活性冨
Ｇオリゴヌクレオチド（１５Ａ）または低活性冨Ｇオリゴヌクレオチド（１５Ｂ
）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の溶解物から捕捉したタンパク質のサウ
スウエスタンおよびウエスタンブロットの図である。（Ｃ） ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１細胞からのタンパク質抽出物（３μｇ／レーン）とのＧＲＯ１５Ａおよびヌ
クレオリン抗体の結合を示すサウスウエスタンおよびウエスタンブロットの図で
ある。核抽出物（ＮＵ）、細胞質抽出物（ＣＹ）および膜タンパク質（ＭＥ）。
【図１０】 処理後７２時間のＧＲＯ２９Ａで未処理（Ａ）および処理（Ｂ
）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗ヌクレオリン染色を示す免疫蛍光試験の結
果を説明する図である。
）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗ヌクレオリン染色を示す免疫蛍光試験の結
果を説明する図である。
【図１１】 ヌクレオリン抗体による非透過化ＤＵ１４５細胞の染色の図で
ある。形質膜中のヌクレオリンの存在を示す。
ある。形質膜中のヌクレオリンの存在を示す。
【図１２】 （Ａ）水素結合相互作用を示すＧ四重の図である。（Ｂ）８つ
のＧ四重により安定化された提唱される二量体構造を示すＧＲＯ２９Ａの分子モ
デルの図である。（Ｃ）予測モデルと一致するループ領域グアノシンの選択的メ
チル化を示すＧＲＯ２９Ａのジメチルスルフェートフットプリンティングの図で
ある。
のＧ四重により安定化された提唱される二量体構造を示すＧＲＯ２９Ａの分子モ
デルの図である。（Ｃ）予測モデルと一致するループ領域グアノシンの選択的メ
チル化を示すＧＲＯ２９Ａのジメチルスルフェートフットプリンティングの図で
ある。
【図１３】 （Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対する新規の冨グアノ
シンオリゴヌクレオチドの抗増殖活性を示すＭＴＴアッセイの図である。（Ｂ）
新規冨グアノシンオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
シンオリゴヌクレオチドの抗増殖活性を示すＭＴＴアッセイの図である。（Ｂ）
新規冨グアノシンオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図１４】 ヌクレオリン結合化合物をスクリーニングするための電気泳動
移動度シフトアッセイの結果を示す写真である。 レーン：説明 １． ＧＲＯ１５Ｂ：不活性冨Ｇオリゴヌクレオチド ２． ＧＲＯ２９Ａ：抗増殖性冨Ｇオリゴヌクレオチド ３． カフェイン：刺激物質；ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤 ４． ５−フルオロウラシル：ヌクレオシド類似体：癌薬：ＤＮＡ損傷剤 ５． シスプラチン：癌薬；ＤＮＡ架橋剤 ６． ポリミキシンＢスルフェート：ポリペプチド；抗生物質 ７． Ａｒａ−Ｃ：ヌクレオチド類縁体；癌薬；ＤＮＡ損傷剤 ８． カンプトテシン：天然生成物；癌薬；トポイソメラーゼＩ阻害剤 ９． ＰＭＡ：ホルボールエステル；腫瘍促進剤；ＰＫＣ活性剤 １０． タキソール：天然生成物；癌薬；抗有糸分裂剤 １１． ドキソルビシン（アドリアマイシン）：抗腫瘍性抗生物質；ＤＮＡ
結合剤 １２． ヘパリン：ポリ陰イオン性多糖 １３． ＯＭＲ２９Ａ：修飾化主鎖を有する冨Ｇオリゴ；抗増殖性
移動度シフトアッセイの結果を示す写真である。 レーン：説明 １． ＧＲＯ１５Ｂ：不活性冨Ｇオリゴヌクレオチド ２． ＧＲＯ２９Ａ：抗増殖性冨Ｇオリゴヌクレオチド ３． カフェイン：刺激物質；ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤 ４． ５−フルオロウラシル：ヌクレオシド類似体：癌薬：ＤＮＡ損傷剤 ５． シスプラチン：癌薬；ＤＮＡ架橋剤 ６． ポリミキシンＢスルフェート：ポリペプチド；抗生物質 ７． Ａｒａ−Ｃ：ヌクレオチド類縁体；癌薬；ＤＮＡ損傷剤 ８． カンプトテシン：天然生成物；癌薬；トポイソメラーゼＩ阻害剤 ９． ＰＭＡ：ホルボールエステル；腫瘍促進剤；ＰＫＣ活性剤 １０． タキソール：天然生成物；癌薬；抗有糸分裂剤 １１． ドキソルビシン（アドリアマイシン）：抗腫瘍性抗生物質；ＤＮＡ
結合剤 １２． ヘパリン：ポリ陰イオン性多糖 １３． ＯＭＲ２９Ａ：修飾化主鎖を有する冨Ｇオリゴ；抗増殖性
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/522 Ａ６１Ｋ 31/522 31/573 31/573 31/7048 31/7048 33/24 33/24 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 43/00 Ｃ１２Ｑ 1/04 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/04 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/53 33/53 Ｍ 33/566 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (71)出願人 Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａ ｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａ ｍ， ＡＢ1120Ｇ， 1530 ３ｒｄ Ａｖ ｅｎｕｅ Ｓｏｕｔｈ， Ｂｉｒｍｉｎｇ ｈａｍ， ＡＬ 35294−0111， Ｕ．Ｓ． Ａ． (72)発明者 ミラー、ドナルド・エム アメリカ合衆国、ケンタッキー州、ルイヴ ィル、バーバリー・レーン 537 (72)発明者 ベイツ、ポーラ・ジェイ アメリカ合衆国、ケンタッキー州、ルイヴ ィル、マラード・クリーク・ロード 473 (72)発明者 トレント、ジョン・オー アメリカ合衆国、ケンタッキー州、ルイヴ ィル、マラード・クリーク・ロード 473 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB02 DA12 DA13 DA36 DA78 FB02 FB05 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR41 QS31 QS33 4C084 AA19 MA02 NA05 ZB21 ZB26 ZC75 4C086 AA01 AA02 BA02 BC43 CB07 CB21 DA10 DA32 EA11 EA16 HA12 HA28 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZB21 ZB26 ZC75 4C206 AA01 FA31 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZB21 ZB26 ZC75
Claims (41)
- 【請求項１】 被験者における悪性、異形成および／または過増殖性細胞の
増殖の抑制方法であって、治療的有効量の冨グアノシンオリゴヌクレオチドを被
験者に投与することを包含する方法。 - 【請求項２】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのＧ
ＧＴモチーフを含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドがグアノシン四重構造
を形成可能な請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの連続グアノシン
反復を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチドが３’末端および５’末端を有し、
前記３’末端が修飾されて前記オリゴヌクレオチドの特性を変える請求項１記載
の方法。 - 【請求項６】 前記３’末端が、そこに結合されたプロピルアミン基を含む
請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチ
ルまたはホスホロチオエート主鎖を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号１〜２０で示される配列
から成る群から選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドの他に化学療法薬を投
与する工程をさらに含む請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 前記化学療法薬がミトキサントロン、エトポシド、シスプ
ラチン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ミトラマイ
シンＡ、パクリタキセル、ドセタキセル、デキサメタソンおよびカフェインから
成る群から選択される請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 被験者における悪性、異形成および／または過増殖性細胞
の増殖の抑制方法であって、以下の： 有効量の冨グアノシンオリゴヌクレオチドを被験者に投与する工程、および 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドを細胞増殖に関連した少なくとも１つの
タンパク質と結合する工程 を包含する方法。 - 【請求項１２】 前記細胞増殖に関連したタンパク質がヌクレオリンである
請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの
ＧＧＴモチーフを含む請求項９記載の方法。 - 【請求項１４】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドがグアノシン四重構
造を形成可能な請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの連続グアノシ
ン反復を含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項１６】 前記オリゴヌクレオチドが３’末端および５’末端を有し
、前記３’末端が修飾されて前記オリゴヌクレオチドの特性を変える請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１７】 前記３’末端が、そこに結合されたプロピルアミン基を含
む請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号１〜２０で示される配
列から成る群から選択される請求項１１記載の方法。 - 【請求項１９】 前記冨グアノシンオリゴヌクレオチドの他に化学療法薬を
投与する過程をさらに含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項２０】 前記化学療法薬がミトキサントロン、エトポシド、シスプ
ラチン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ミトラマイ
シンＡ、パクリタキセル、ドセタキセル、デキサメタソンおよびカフェインから
成る群から選択される請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 ヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。
- 【請求項２２】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのＧＧＴモチー
フを含む請求項１６記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２３】 前記オリゴヌクレオチドがグアノシン四重構造を形成可能
な請求項２１記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２４】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの連続グアノシ
ン反復を含む請求項２１記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２５】 前記オリゴヌクレオチドが３’末端および５’末端を有し
、前記３’末端が修飾されて前記オリゴヌクレオチドの特性を変える請求項２１
記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２６】 前記３’末端が、そこに結合されたプロピルアミン基を含
む請求項２５記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２７】 前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メ
チルまたはホスホロチオエート主鎖を含む請求項２１記載のヌクレオリン結合オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２８】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号１〜２０で示される配
列から成る群から選択される請求項２１記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項２９】 前記オリゴヌクレオチドがＴＥＬ結合タンパク質と結合可
能な請求項２１記載のヌクレオリン結合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３０】 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合する分子の
同定方法であって、以下の： 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質に結合するそれらの能力に関してスク
リーニングされるべき分子を提供すること、 前記分子を冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質を含有する試薬と併合する
こと、および 前記冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合したオリゴヌクレオチドを
同定すること を包含する方法。 - 【請求項３１】 前記同定工程が電気泳動移動度シフトアッセイを実施する
ことを包含する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 前記分子がオリゴヌクレオチドを含む請求項３０記載の方
法。 - 【請求項３３】 前記分子がオリゴヌクレオチドでない請求項３０記載の方
法。 - 【請求項３４】 前記冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質がヌクレオリ
ンである請求項３０記載の方法。 - 【請求項３５】 前記同定工程が、前記冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパ
ク質と結合した分子を電気泳動的に同定することを包含する請求項３０記載の方
法。 - 【請求項３６】 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合する分子の
同定方法であって、以下の： 冨Ｇオリゴヌクレオチド結合タンパク質と結合するそれらの能力に関してスク
リーニングされるべき非標識化分子を提供すること、 標識化冨Ｇオリゴヌクレオチドの存在下で前記非標識化分子を核抽出物ととも
にインキュベートすること、 前記インキュベート済みの混合物に電気泳動移動度シフトアッセイを実施する
こと、および 前記電気泳動移動度シフトアッセイ工程後のシフト化帯域の強度の低減を引き
起こす非標識化オリゴヌクレオチドを同定すること を包含する方法。 - 【請求項３７】 抗増殖薬の同定方法であって、以下の： それらの抗増殖作用に関してスクリーニングされるべき分子を培養中で成長中
の細胞と併合すること、そして ヌクレオリン強度および局在化の変化を引き起こす分子を同定することにより
抗増殖分子を同定すること を包含する方法。 - 【請求項３８】 前記同定工程が標識化抗ヌクレオリン抗体を前記細胞に付
加してヌクレオリン強度および局在化の変化を同定することを包含する請求項３
７記載の方法。 - 【請求項３９】 前記抗増殖分子が、細胞の核から細胞質へのヌクレオリン
のトランスロケーションにより同定される請求項３８記載の方法。 - 【請求項４０】 ヌクレオリン機能を抑制することによる新形成性または過
増殖性疾患の治療方法。 - 【請求項４１】 請求項２１記載の冨グアニンオリゴヌクレオチドおよび製
薬上許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
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