DE69533725T2

DE69533725T2 - Multifunktionelle molekulare komplexe für den gentransfer in zellen

Info

Publication number: DE69533725T2
Application number: DE69533725T
Authority: DE
Inventors: Raymond H. Boutin
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1995-09-28
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2015-09-29
Also published as: US5837533A; JP3925815B2; ES2231791T3; US6379965B1; US20050239204A1; US20040214328A9; AU3731795A; AU704796B2; CA2201396A1; US7202227B2; JPH10506901A; WO1996010038A1; EP0789708A4; DE69533725D1; EP0789708B1; EP0789708A1; US6127170A; PT789708E; CA2201396C; ATE281468T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich von Verfahren für den Transfer von genetischen Informationen, z.B. von Fremd-DNA, in Zielzellen, insbesondere eukaryotischen Zellen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf nicht-virale Genträger, umfassend multifunktionelle molekulare Konjugate, die unter anderem Lipopolyamine einer besonderen Konfiguration, eine Komponente, die Endosom-Zerstörung fördert, und gegebenenfalls eine Rezeptorspezifische Verbindungskomponente umfassen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die U.S. Serien-Nr. 08/314 060, eingereicht am 28. September 1994, mit dem Titel "Multifunctional molecular complexes für gene transfer to cells" (Multifunktionelle molekulare Komplexe für den Gentransfer in Zellen), die durch Bezugnahme hiermit einbezogen wird.
Vorher wurden virale Vektoren verschiedener Typen erfolgreich für die Insertion von ausgewählten fremden genetischen Informationen in eine Zielzelle und im Falle von eukaryotischen Zellen für die Einbeziehung dieser genetischen Information in das Genom der Zelle verwendet. Diese viralen Vektorsysteme waren auf den molekularen Aufbau des Virus angewiesen, der sich im Lauf der Zeit entwickelte, um die wichtigen Probleme, denen ein Virus beim Versuch einzudringen, d. h. eine Zelle zu infizieren, gegenübersteht, zu überwinden. Trotz der Effizienz von derartigen viralen Vektoren gab es jedoch fortwährend Bedenken hinsichtlich der Sicherheit der Verwendung von Viren, insbesondere vom Standpunkt der unerwünschten Nebeneffekte her. Somit gab es eine weitergehende Anstrengung, nicht-virale Gen-Freisetzungssysteme zu entwickeln, die als virale Vektoren effizient sind, aber ein verbessertes Sicherheitsprofil aufweisen.
Nicht-virale Vektoren oder Träger des Typs, mit dem sich die vorliegende Erfindung beschäftigt, müssen daher dieselben Hindernisse überwinden wie ein viraler Vektor. Die Probleme, denen derartige Träger gegenüber stehen, umfassen ein Beharrungsvermögen in der Biophase des Organismus für eine ausreichende Zeit, um die Zielzelle zu erreichen; Erkennung der Zielzelle und Mittel für den übermittelnden Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran und in das Zytoplasma der Zelle; Vermeiden von Zerstörung in der Zelle durch das retikuloendotheliale System und Transport zu und durch die Kernmembran in den Kern der Zelle, wo die Transkription des genetischen Materials stattfinden kann.
Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, die oben beschriebenen Probleme zu überwinden, und da die Probleme mehrere und verschieden sind, umfasst die vorliegende Erfindung einen multifunktionellen Komplex, d.h. ein molekulares Konjugat verschiedener Liganden, die vorgesehen sind, um spezifische Hindernisse zu überwinden.
Die schließliche Nützlichkeit von Gentransfer-Techniken ist von enormem potentiellem Nutzen in einer Anzahl von Gebieten. Der Transfer von genetischem Material in Zellen ist die Basis einer Anzahl von Verfahren, die nunmehr im Bereich der Molekularbiologie, Gentherapie und genetischen Immunisierung weitgehend akzeptiert sind. Der Transfer von in DNA kodierte genetische Information in Zellen, wo diese identifizierte einzelne Proteine exprimiert, hat eine Untersuchung der Funktion derartiger Proteine auf zellularem Niveau sowie der zugrundeliegenden Zellphysiologie ermöglicht. Genetisches Material wurde ebenfalls in Zellen transferiert, um Proteine einzuführen, die aufgrund eines inhärenten genetischen Fehlers in der Zelle fehlen, die ein inaktives Protein exprimieren oder ansonsten die Expression von Protein gänzlich verhindern. Der Transfer von genetischem Material in Zellen kann verwendet werden, um die Expression von Proteinen in jenen Zellen durch den wohlbekannten Antisense-Effekt von komplementären DNA- oder RNA-Strängen zu verhindern.
Exogenes, d. h. fremdes genetisches Material kann es Zellen ermöglichen, signifikante Mengen von Proteinen zu synthetisieren, die durch andere Mittel in praktischer wirtschaftlicher Hinsicht nicht erhältlich sind. Diese interessierenden Proteine können in einer Vielzahl von Wirtszellen, wie Hefe, bakteriellen oder Säugetierzellen wachsen gelassen werden. Genetisches Material kann ebenfalls verwendet werden, um Immun-Schutz-Reaktionen in vivo durch Injektion von DNA, die immunogene Proteine kodiert, d. h. solche, die die gewünschte Immun-Antwort stimulieren können, zur Verfügung zu stellen. Die in-vivo-Einführung von exogenem genetischem Material in Zellen hat ebenfalls potentielle Anwendung in Verwendungen für die Linderung, Behandlung oder Vorbeugung von metabolischen, Tumor- oder infektiösen Störungen durch die oben aufgezählten selben Mechanismen.
Beschreibung des Standes der Technik
Es ist möglich, genetisches Material in Zielzellen ohne die Verwendung von Vektoren oder Trägern zu transferieren. Beispielsweise kann genetisches Material systemisch durch eine intravenöse oder intraperitoneale Injektion für in-vivo-Anwendungen eingeführt werden oder kann zur Wirkungsstelle durch direkte Injektion in diesen Bereich eingeführt werden. Beispielsweise ist seit langem bekannt, dass DNA, an sich, injiziert in verschiedene Gewebe, in die Zellen eintritt und ein Protein erzeugt, das eine Immun-Antwort auslöst. Siehe z.B. P. Atanasiu et al., Academie des Sciences (Paris) 254, 4228–30 (1962); M.A. Israel et al., J. Virol. 29, 990–96 (1979); H. Will et al., Nature, 299, 740–42 (1982); H. Robinson, Welt-Patentanmeldung WO 86/00930, veröffentlicht am 13. Februar 1986; P.L. Felgner, J.A. Wolff, G.H. Rhodes, R.W. Malone und D.A. Carson, Welt-Patentanmeldung WO 90/11092, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; und R.J. Debs und N. Zhu, Welt-Patentanmeldung WO 93/24640, veröffentlicht am 9. Dezember 1993. Jedoch ist DNA an sich hydrophil und der hydrophobe Charakter der Zellmembran stellt eine wesentliche Barriere für den Transfer von DNA hindurch dar. Demgemäß war es im Stand der Technik bevorzugt, Vermittler zu verwenden, die den Transfer von DNA in Zellen bei direkter Injektion verstärken.
Ein weiterer Ansatz im Stand der Technik, um genetisches Material in Zielzellen freizusetzen, ist einer, der die natürlichen Rezeptor-vermittelten Endozytose-Wege, die in derartigen Zellen existieren, ausnutzt. Mehrere Zellularrezeptoren wurden vordem als erwünschte Mittel identifiziert, mit denen es möglich ist, eine spezifische zielgerichtete Einbringung von Arzneimitteln zu erreichen, und insbesondere Makromoleküle und molekulare Konjugate dienen als Träger von genetischem Material des Typs, mit dem sich die vorliegende Erfindung beschäftigt. Diese Zellrezeptoren ermöglichen spezifisch gezieltes Einbringen, weil sie in einem spezifischen Gewebe lokalisiert sind, oder weil sie eine erhöhte Avidität für oder Aktivität in einem speziellen Gewebe aufweisen. Siehe z.B. J.L. Bodmer und R.T. Dean, Meth. Enzymol., 112, 298–306 (1985). Dies bringt die Vorteile niedriger Dosierungen oder signifikant geringerer unerwünschter Nebeneffekte mit sich.
Eines der besser bekannten Beispiele einer Zelle sowie eines Gewebe-selektiven Rezeptors ist der in Hepatozyten vorliegende Asialoglykoprotein-Rezeptor. Der Asialoglykoprotein-Rezeptor ist ein extrazellulärer Rezeptor mit einer hohen Affinität für Galactose, insbesondere dreiarmige Oligosaccharide, d.h. jene mit drei etwas verlängerten Ketten oder Spacerarmen mit terminalen Galactose-Resten; siehe z.B. H.F. Lodish, TIBS, 16, 374–77 (1991). Dieser Rezeptor hoher Affinität ist in den Hepatozyten lokalisiert und liegt nicht in den Kupfferzellen vor, was einen hohen Grad an Selektivität der Freisetzung für die Leber ermöglicht.
Im Stand der Technik des Rezeptor-übermittelten Gentransfers wurde ebenfalls vorgeschlagen, dass die Zusammensetzung des DNA-Komplexes in einer Kondensation der DNA in einer Größe resultieren sollte, die geeignete ist für die Aufnahme über einen endozytischen Weg, damit das Verfahren in vivo effizient ist. Siehe z.B. J.C. Perales, T. Ferkol, H. Beegen, O.D. Ratnoff und R.W. Hanson, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 4086–4090 (1994).
Ein alternatives Verfahren Zell-selektives Binden bereitzustellen, ist es, eine Einheit mit einer Fähigkeit an den interessierenden Zell-Typ zu binden, einzubauen; in dieser Hinsicht werden herkömmlicherweise Antikörper eingesetzt, die an spezifische Proteine binden können, die in den Zellmembranen oder äußeren Regionen der Zielzellen vorliegen. Von alternativen Rezeptoren wurde ebenfalls erkannt, dass sie zur Erleichterung des Transports von Makromolekülen verwendbar sind, wie Biotin und Foliat-Rezeptoren, siehe P.S. Low, M.A. Horn und P.F. Heinstein, Welt-Patentanmeldung WO 90/12095, veröffentlicht am 18. Oktober 1990; P.S. Low, M.A. Horn und P.F. Heinstein, Welt-Patentanmeldung WO 90/12096, veröffentlicht am 18. Oktober 1990; P.S. Low, M.A. Horn und P.F. Heinstein, US-Patent 5 108 921, 28. April 1992; C.P. Leamon und P.S. Low, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 5572–5576 (1991); Transferrin-Rezeptoren; Insulin-Rezeptoren und Mannose-Rezeptoren (näheres siehe unten). Die aufgezählten Rezeptoren sind nur repräsentativ und andere Beispiele sind dem Fachmann ohne weiteres geläufig.
Die Vereinigung von verschiedenen Funktionalitäten auf demselben Molekül wurde ebenfalls im Stand der Technik eingesetzt. Beispielsweise wurde 1988 von G.Y. Wu und C.M. Wu, J. Biol. Chem. 263, 14621–14624 (1988), ein Verfahren für eine Zellulär-Rezeptor vermittelte Freisetzung von DNA für Hepatocyten beschrieben. Dieses Verfahren wurde ferner in G.Y. Wu und C.H. Wu, Biochem., 27, 887–892 (1988); G.Y. Wu und C.H. Wu, US-Patent 5 166 320, 24. November 1992; und G.Y. Wu und C.H. Wu, Welt-Patentanmeldung WO 92/06180, veröffentlicht am 16. April 1992, beschrieben. Das Verfahren besteht aus dem Einbau eines Glykoproteins, Asialoorosomucoid, in Polylysin, um einen Hepatozyt-selektiven DNA-Träger bereitzustellen. Die Funktion des Polylysins ist es, durch ionische Wechselwirkungen zwischen den positiv geladenen (kationischen) Aminogruppen der Lysine und den negativ geladenen (anionischen) Phosphatgruppen der DNA an die DNA zu binden. Orosomucoid ist ein Glykoprotein, das normalerweise im menschlichen Serum vorliegt. Die Entfernung der terminalen Sialinsäure (N-Acetylneuraminsäure) aus den verzweigten Oligosacchariden legt die terminalen Galactoseoligosaccharide frei, für die Hepatozyt-Rezeptoren eine hohe Affinität aufweisen, wie bereits beschrieben.
Nach dem Binden an den Asialoglykoprotein-Rezeptor auf den Hepatozyten wird das Protein durch Endozytose in ein prälysosomales Endosom in die Zelle überführt. Die DNA, die an den Polylysinasialoorosomucoid-Träger ionisch gebunden ist, wird ebenfalls in das Endosom überführt. Zusätzliche Arbeiten unter Verwendung dieses Freisetzungssystems, z.B. diejenige, durchgeführt durch J.M. Wilson, M. Grossman, J.A. Cabrera, C.H. Wu und G.Y. Wu, J. Biol. Chem., 267, 11483–11489 (1992), haben festgestellt, dass eine partielle Hepatektomie die Fortdauer der Expression der in den Hepatozyten freigesetzten DNA verbessert. Der Transfer der DNA in Zellen durch diesen Mechanismus wird ebenfalls durch die Zugabe von kationischen Lipiden bedeutend verstärkt; siehe z.B. K.D. Mack, R. Walzem und J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307, 138–143 (1994).
Die Verwendung eines spezifischen Asialoglykoproteins ist nicht erforderlich, um das Binden an den Asialoglykoprotein-Rezeptor zu erreichen; diese Bindung kann ebenfalls mit hoher Affinität durch Verwendung von kleinen synthetischen Molekülen mit einer ähnlichen Konfiguration durchgeführt werden. Der Kohlenhydratteil kann von einem geeigneten Glykoprotein ent fernt und mit anderen Makromolekülen konjugiert werden; siehe z.B. S.J. Wood und R. Wetzel, Bioconj. Chem., 3, 391–396 (1992). Durch dieses Verfahren wird der Zellrezeptor-Bindungsteil des Glykoproteins entfernt, und der für die selektive Zellbindung erforderliche spezifische Teil kann zu einem anderen Molekül transferiert werden.
Es gibt genügend Literatur zur Herstellung synthetischer Glykoside, die an Makromoleküle gebunden werden können und diesen die Fähigkeit verleihen, an einen korrespondierenden Galactose-spezifischen Rezeptor zu binden. Die Bedeutung von verzweigten Glykosiden wurde frühzeitig erkannt; siehe Y.C. Lee, Carb. Res., 67, 509–514 (1978). Weitere Arbeiten beschrieben, dass Zuckerdichte [K. Kawaguchi, M. Kuhlenschmidt, S. Roseman und Y.C. Lee, J. Biol. Chem., 256, 2230–2234 (1981)] und die räumlichen Verhältnisse [Y.C. Lee, R.R. Townsend, M.R. Hardy, J. Lonngren, J. Arnarp, M. Haraldsson und H. Lonn, J. Biol. Chem., 258, 199–202 (1983)] wichtige Bestimmungsfaktoren für die Bindungspotenz darstellen. Reduktive Aminierung eines Peptids mit einem verzweigten Trilysinamino-Ende ergibt einen Ligand, der mit vier Galactosyl-Resten endet, die ohne weiteres an Polylysin oder andere Makromoleküle gekoppelt werden können; siehe C. Plank, K. Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler und E. Wagner, Bioconj. Chem., 3, 533–539 (1992), und zur Herstellung von DNA-Konstrukten verwendet wurde.
Glykosidische Thiopropionat- und Thiohexanoat-Derivate von Galactose wurden hergestellt und mit L-Lysyl-L-Lysin verknüpft, um ein synthetisches dreiarmiges Galactose-Derivat zu bilden. Ein Bisacridinspermidin-Derivat, enthaltend diese synthetische dreiarmige Galactose wurde eingesetzt, um DNA-Hepatozyten zielgerichtet einzubringen; siehe F.C. Szoka, Jr und J. Haensler, Welt-Patentanmeldung WO 93/19768, veröffentlicht am 14. Oktober 1993; und J. Haensler und F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 85–93 (1993).
Andere Mittel zur Bereitstellung eines Zellrezeptors, basierend auf der Vereinfachung von Gentransfer in Zellen, unter Verwendung von Polylysin als einem Träger, wurden im Stand der Technik beschrieben. Antikörper, die für Thrombomodulin an der Zelloberfläche spezifisch sind, wurden mit Polylysin als Freisetzungssystem für DNA in vitro und in vivo verwendet. Siehe V.S. Trubetskoy, V.P. Torchilin, S.J. Kennel und L. Huang, Bioconj. Chem., 3, 323–327 (1992). Der Transferrin-Rezeptor wurde verwendet, um DNA in Erythroplasten, K562 Makrophagen und ML-60 leukämischen Zellen gezielt einzuführen; siehe E. Wagner, M. Zenke, M. Cotten, H. Beug und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3410–3414 (1990); M. Zenke, P. Steinlein, E. Wagner, M. Cotten, H. Beug und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1990); und G. Citro, D. Perrotti, C. Cucco, I. D'Agnano, A. Sacchi, G. Zupi und B. Calabretta, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7031–7035 (1990). Diese Studien verwendeten sowohl kleine Oligodesoxynucleotide als auch große Plasmide.
Die Fähigkeit von Polylysin, den DNA-Eintritt in Zellen zu vermitteln, wird bedeutend erhöht, wenn das Polylysin chemisch mit hydrophoben Anhängseln modifiziert wird; siehe X. Zhou und L. Huang, Biochem. Biophys. Acta, 1189, 195–203 (1994); komplexiert mit kationi schen Lipiden; siehe K.D. Mack, R. Walzern und J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307, 138–143 (1994), oder assoziiert mit Viren. Viele Viren infizieren spezifische Zellen durch Rezeptorvermitteltes Binden und Einbringen der viralen DNA/RNA in die Zelle; und somit ist diese Wirkung des Virus ähnlich zu dem oben beschriebenem erleichterten Eintritt in die DNA.
Der Replikations-unfähige Adenovirus wurde verwendet, um den Eintritt von Transferrinpolylysin-komplexierter DNA in Zellen zu verstärken; siehe D.T. Curiel, S. Agarwal, E. Wagner und M. Cotten, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 88, 8850–8854 (1991); E. Wagner, K. Zatloukal, M. Cotton, H. Kirlappos, K. Mechtlet, D. T. Curiel und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 6099–6103 (1992); M. Cotten, E. Wagner, K. Zatloukal, S. Phillips, D.T. Curiel und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 6094–6098 (1992); und L. Gao, E. Wagner, M. Cotten, S. Agarwal, C. Harris, M. Romer, L. Miller, P.-C. Hu und D. Curiel, Hum. Gene Ther., 4, 17–24 (1993). Der Adenovirus verstärkt den Eintritt des Polylysintransferrin-DNA-Komplexes, wenn kovalent an das Polylysin gebunden und wenn durch eine Antikörper-Bindungsstelle gebunden. Es muss keine direkte Bindung des Adenovirus an den Polylysintransferrin-DNA-Komplex vorliegen, und es kann der Eintritt des Komplexes erleichtert werden, wenn dieser als eine einfache Mischung vorliegt. Der Polylysintransferrin-DNA-Komplex liefert Rezeptor-spezifische Bindung an die Zellen und wird zusammen mit der DNA in die Endosomen eingebracht. Einmal innerhalb der Endosomen vereinfacht der Adenovirus den Eintritt des DNA/Transferrinpolylysin-Komplexes in die Zelle durch Zerstörung des endosomalen Kompartiments mit darauf folgender Freisetzung der DNA ins Zytoplasma. Der Replikations-unfähige Adenovirus wurde ebenfalls verwendet, um den Eintritt von nicht komplexierten DNA-Plasmiden in Zellen ohne den Vorteil der Zellrezeptorselektivität, der durch den Polylysintransferrin-Komplex verliehen wird, zu verstärken; siehe K. Yoshimura, M.A. Rosenfeld, P. Seth und R.G. Crystal, J. Biol. Chem., 268, 2300–2303 (1993).
Von synthetischen Peptiden, wie dem N-terminalen Bereich von Influenza-Hämagglutininprotein ist bekannt, dass sie Membranen destabilisieren und sie sind als fusogene Peptide bekannt. Konjugate, die Influenza-fusogene Peptide, gekoppelt an Polylysin zusammen mit einem Peptid mit einem verzweigten Trilysinamin-terminalen Liganden, der mit vier Galactosyl-Resten endet, enthalten, wurden als Vermittler des DNA-Eintritts in Hepatozyten hergestellt; siehe C. Plank, K. Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler und E. Wagner, Bioconj. Chem., 3, 533–539 (1992). Diese Konjugate kombinieren das durch das Tetragalactosepeptid verliehene Asialoglykoprotein-Rezeptor-übermittelte Binden, die endosomale Zerstörungsfähigkeit des Influenza-fusogenen Peptids sowie die DNA-Bindung des Polylysins. Diese Konjugate setzen DNA in der Zelle frei durch eine Kombination von Rezeptor-vermittelter Aufnahme und Einbringung in Endosome. Diese Einbringung wird gefolgt von einer Zerstörung der Endosome durch das fusogene Influenzapeptid, um die DNA in das Zytoplasma freizusetzen. In einer ähnlichen An kann das fusogene Influenzapeptid an ein Polylysin gebunden und mit dem Transferrinpolylysin-Komplex gemischt werden, um einen ähnlichen DNA-Träger bereitzustellen, der selektiv für Zellen ist, die den Transferrin-Rezeptor tragen; siehe E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7934–7938 (1992). Synthetisch gestaltete Peptide können ebenfalls verwendet werden; z.B. die "GALA"-Peptide [N.K. Subbarao, R.A. Parente, F.C. Szoka, Jr, L. Nadasdi und K. Pongracz, J. Biol. Chem., 26, 2964–2972 (1987)] wurden an DNA-Träger gekoppelt und ein verbesserter, vereinfachter Eintritt in Zellen wurde beobachtet [J. Haensler und F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 372–379 (1993)]. Das kationische amphipathische Peptid Gramicidin S kann den Eintritt von DNA in Zellen erleichtern [J.-Y. Legendre und F.C. Szoka, Jr., Proc. Nat. Acad Sci. USA, 90, 893–897 (1993)], erfordert aber auch ein Phospholipid, um signifikanten Transfer von DNA zu erreichen.
Polylysin ist nicht einzigartig in der Bereitstellung eines polykationischen Systems für den Eintritt von DNA in Zellen. Von DEAE-Dextran wurde ebenfalls gezeigt, dass es zur Förderung des RNA- und DNA-Eintritts in Zellen effektiv ist; siehe R. Juliano und E. Mayhew, Exp. Cell. Res. 73, 3–12 (1972); und E. Mayhew und R. Juliano, Exp. Cell. Res. 77, 409–414 (1973). Erst vor kurzem wurde von einem dendritischen Kaskade-Copolymer von Ethylendiamin und Methylacrylat gezeigt, dass es für die Bereitstellung eines DNA-Trägers verwendbar ist, der den Eintritt in Zellen erleichtert; siehe J. Haensler und F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 372–379 (1993). Ein alkyliertes Polyvinylpyridinpolymer wurde ebenfalls verwendet, um den DNA Eintritt in Zellen zu erleichtern; siehe A.V. Kabanov, I.V. Astafieva, I.V. Maksimova, E.M. Lukanidin, G.P. Georgiev und V.A. Kabanov, Bioconj. Chem., 4, 448–454 (1993).
Positiv geladene Liposomen wurden ebenfalls in großem Umfang als Träger für DNA verwendet, die den Eintritt in Zellen erleichtern; siehe z.B. F.C. Szoka, Jr. und J. Haensler, Welt-Patentanmeldung WO 93/19768, veröffentlicht am 14. Oktober 1993; R.J. Debs und N. Zhu, Welt-Patentanmeldung WO 93/24640, veröffentlicht am 9. Dezember 1993; P.L. Felgner, R. Kumar, C. Basava, R.C. Border und J.-Y. Hwang-Felgner, Welt-Patentanmeldung WO 91/16024, veröffentlicht am 31. Oktober 1991; P.L. Felgner und G.M. Ringold, Nature, 337, 387–388 (1989); J.K. Rose, L. Buonocore und M.A. Whitt, BioTechniques, 10, 520–525 (1991); C.F. Bennett, M.Y. Chiang, H. Chan, J.E.E. Shoemaker und C.K. Mirabelli, Mol. Pharm. 41, 1023–1033 (1992); J.H. Felgner, R. Kumar, C.N. Sridhar, C.J. Wheeler, Y.J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin und P.L. Felgner, J. Biol. Chem., 269, 2550–2561 (1994); J.G. Smith, R.L. Walzem und J.B. German, Biochim. Biophys. Acta, 1154, 327–340 (1993). Diese Trägerzusammensetzungen enthalten ebenfalls pH-empfindliche Liposomen; siehe C.-J. Chu, J. Dijkstra, M.-Z. Lai, K. Hong und F.C. Szoka, Jr., Pharm. Res., 7, 824–854 (1990); J.-Y. Legendre und F.C. Szoka, Jr., Pharm. Res., 9, 1253–1242 (1992).
Ein polykationisches Lipid wurde hergestellt durch Koppeln von Dioctadecylamidoglycin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin an ein 5-Carboxyspermin; J.-P. Behr, B. Demeniex, J.-P. Loeffler und J. Perez-Mutul, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 86, 6982–6986 (1989); F. Barthel, J.- S. Remy, J.-P. Loeffler und J.P. Behr, DNA and Cell Biol., 12, 553–560 (1993); J.-P. Loeffler und J.P. Behr, Meth. Enzymol., 217, 599–618 (1993); J.-P. Behr und J.P. Loeffler, US-Patent 5 171 678, 15. Dezember 1992. Diese lipophilen Spermine sind sehr aktiv beim Transfer von DNA durch Zellmembranen.
Kombinationen von Lipiden wurden verwendet, um den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen zu erleichtern. Beispielsweise ist im US-Patent 5 283 185 ein derartiges Verfahren offenbart, das eine gemischte Lipiddispersion eines kationischen Lipids mit einem Co-Lipid in einem geeigneten Lösungsmittel verwendet. Das Lipid hat eine Struktur, die eine lipophile Gruppe enthält, abgeleitet von Cholesterol, einer Linker-Bindung, einem linearen Alkyl-Spacerarm und einer kationischen Aminogruppe, und das Co-Lipid ist Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin.
Makrophagen haben Rezeptoren sowohl für Mannose als auch Mannose-6-phosphat, die binden können an und eingebaut werden von Molekülen, die diese Zucker darstellen. Die Moleküle werden durch Endozytose in ein prälysosomales Endosom eingebracht. Diese Einbringung wurde verwendet, um den Eintritt von Oligonucleotiden in Makrophagen unter Verwendung von Rinderserum Albumin, modifiziert mit Mannose-6-phosphat und verknüpft mit einem Oligodesoxynucleotid durch eine Dischwefel-Brücke an ein modifiziertes 3'-Ende zu verstärken; siehe E. Bonfils, C. Depierreux, P. Midoux, N.T. Thuong, M. Monsigny und A.C. Roche, Nucl. Acids Res. 20, 4621–4629 (1992). In ähnlicher Weise wurden Oligodesoxynucleotide, modifiziert am 3'-Ende mit Biotin, mit Mannose-modifiziertem Streptavidin kombiniert, und es wurde ebenfalls festgestellt, dass der Eintritt in Makrophagen erleichtert wurde; siehe E. Bonfils, C. Mendes, A.C. Roche, M. Monsigny und P. Midoux, Bioconj. Chem., 3, 277–284 (1992).
Von verschiedenen Peptiden und Proteinen, von denen viele natürlich auftreten, wurde gezeigt, dass sie auf den Zelloberflächen Rezeptoren aufweisen, so dass, wenn sie einmal daran gebunden sind, es ihnen möglich ist, durch Endozytose eingebracht zu werden. An diese Rezeptoren gebundene Materialien werden in die endosomalen Kompartimente innerhalb der Zelle freigesetzt. Beispiele umfassen Insulin, Vasopressin, Lipoprotein niedriger Dichte, Epidermal-Wachstumsfaktor und andere. Diese Einbringung wurde ebenfalls verwendet, um den Eintritt von DNA in die Zellen zu erleichtern, z.B. wurde Insulin an Polylysin konjugiert, um erleichterten DNA-Eintritt in Zellen bereitzustellen, die einen Insulin-Rezeptor besitzen; siehe B. Huckett, M. Ariatti und A.O. Hawtrey, Biochem. Pharmacol., 40, 253–263 (1990).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen multifunktionellen molekularen Komplex zum Transferieren einer Nukleinsäurezusammensetzung zu einer Zielzelle, umfassend in irgendeiner funktionellen Kombination: A) die Nukleinsäure; B) ein Freisetzungshilfsmittel, hier bezeichnet als den "Transfer-Rest", umfassend a) ein oder mehrere kationische Polyamin- Komponenten, gebunden an die Nukleinsäure, wobei jeder 3 bis 12 Stickstoffatome umfasst; b) ein oder mehrere Endosommembran-Spaltungsförderungskomponenten, gebunden an ein Stickstoffatom der kationischen Polyamin-Komponente durch eine Alkyl-, Carboxamid-, Carbamat-, Thiocarbamat- oder Carbamoyl-Brückengruppe, umfassend i) mindestens eine lipophile lange Alkyl-Kettengruppe, ii) ein fusogenes Peptid, umfassend Spike-Glykoproteine von umhüllten Tierviren, oder iii) Cholinsäure, Cholesteryl oder Derivate hiervon, und gegebenenfalls C) ein oder mehrere rezeptorspezifische Bindungskomponenten, die Liganden für natürliche Rezeptoren der Zielzelle sind, gebunden durch eine Alkyl-, Carboxamid-, Carbamat-, Thiocarbamat- oder Carbamoyl-Brückengruppe zu entweder a) einem weiteren Stickstoffatom einer kationischen Polyamin-Komponente, an die eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente gebunden ist, oder b) ein Stickstoffatom einer kationischen Polyamin-Komponente, die keine daran gebundene Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente aufweist.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein multifunktioneller molekularer Komplex zum Transferieren einer Nukleinsäurezusammensetzung zu einer Zielzelle bereitgestellt, wobei der multifunktionelle molekulare Komplex umfasst:

A) die Nukleinsäure und
B) einen Transfer-Rest, umfassend eine oder mehrere kationische Polyaminkomponenten, gebunden an die Nukleinsäure und mit der Formel (1):
worin:
R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl;
man jeder Stelle unabhängig ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 2 bis 5;
n ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 1 bis 10; und jedes R³ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1–6-Alkyl und einer Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente;
worin der Transfer-Rest mindestens eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, gebunden an ein Stickstoffatom der kationischen Polyaminkomponente, umfaßt, und worin jede Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
(a)-B-(CR¹R²)_j-C(R)₃;
worin R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl;
j eine ganze Zahl von einschließlich 6 bis 24 darstellt; und
B optional fehlt oder eine Brückengruppe der Formel darstellt: (i) -(CR¹R²)_k-C(=O)-Z-; (ii) -(CR¹R²)_k-N(R)-C(=O)-Z-; (iii) -(CR¹R²)_k-N(R)-{-C(=O)-CH₂-O-[-(CH₂)₂-O-]_l-(CH₂)_k-N(R)}_P-C(=O)-Z-; oder (iv) -(CR¹R²)_k-C(=O)-{-N(R)-[-(CH₂)₂-O-]_l-CH₂-C(=O)}_p-Z-;
worin k unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt;
l eine ganze Zahl von einschließlich 0 bis 30 darstellt;
p eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 3 darstellt;
R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; und
Z O, S, N(R) darstellt oder fehlt; und
(b) -B-(R⁴)R;
worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1–6-Alkyl oder fehlt;
B eine Brückengruppe darstellt, die unabhängig ausgewählt ist aus den Gruppen (i) bis (iv), wie oben in (a) in diesem Anspruch definiert, und zusätzlich aus einer Gruppe der Formel:
(v) -(CR¹R²)_j'-X
worin j' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 8 darstellt;
R¹ und R² jedes unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl;
X O, S, N(R) darstellt oder fehlt; und
R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglykoproteine von umhüllten Tierviren; (ii) Cholinsäurederivaten der Formel (2);
worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt; die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass beide Bindungen nicht ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R⁶ -H, -OH- -CO₂H, -C(=O)NH₂, -OC(=O)NH₂, -NH₂ oder -O(CH₂CH₂O)_n'H darstellt, worin n' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt;
R⁷ einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholinsäurederivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl- oder -C_1–6-Alkylcarbonylgruppe; und
R⁸ eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt; und (iii) Cholesterylderivaten der Formel (3):
worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass beide Bindungen nicht ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R^6a einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholesterylderivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl-, -OC(=O)- oder -OCH₂C(=O)-Gruppe;
R^7a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt; und
R^8a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt.

Mindestens eine der R³-Gruppen kann die Formel -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃ aufweisen, worin B fehlt.
Bevorzugt ist j 8 bis 18.
Noch bevorzugter ist j 8 bis 12.
Mindestens eine der R³-Gruppen kann die Formel -(CR¹R²)_j'-X(R⁴)R aufweisen, worin X N(R) ist und R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglycoproteine von umhüllten Tierviren und (ii) Cholinsäure und Derivaten hiervon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3α, 7α, 12a-Trihydroxy-5β-cholan-24-ester und – amid.
Bevorzugt beträgt j' 2 bis 4.
Mindestens eine der R³-Gruppen kann die Formel -(CR¹R²)_j'-X(R⁴)R aufweisen kann, worin X O oder S darstellt und R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglycoproteine von umhüllten Tierviren und (ii) einer Cholesterylgruppe und Derivaten hiervon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat und -β-methylencarboxamid.
In derartigen Ausführungsformen können R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff darstellen, wo immer sie auftreten, m kann 3 oder 4 betragen, n kann 1 bis 6 betragen, j' kann eine ganze Zahl von einschließlich 2 bis 4 darstellen und R⁴ kann Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat oder -β-methylencarboxamid darstellen.
Die Gruppe, aus der R³ ausgewählt werden kann, umfasst weiterhin Gruppen mit der Formel -B-(R⁵)R und mindestens eine der R³-Gruppen weist die Formel -B-(R⁵)R auf;

worin B eine Brückengruppe darstellt, unabhängig ausgewählt aus den Gruppen einschließlich (i) bis (v), wie definiert in Anspruch 1;
R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl, oder fehlt; und
R⁵ eine rezeptorspezifische Bindungskomponente darstellt, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) D-Biotin; (ii) β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid; (iii) N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (iv) N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (v) 5-Methyltetrahydrofoliat; (vi) Folsäure; (vii) Folinsäure; (viii) α-3'-Propionylthiomannosid; und (ix) α-3'-Propionylthiomannosid-6-phosphat.

Mindestens eine der R³-Gruppen kann die Formel -(CR¹R²)_j'-N(R⁵)R aufweisen, worin j' 1 bis 6 beträgt.
Zwei der R³-Gruppen können die Formel -(CR¹R²)_j'-N(R⁵)R aufweisen.
Mindestens eine der R³-Gruppen hiervon kann die Formel -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃ aufweisen, worin B fehlt, jedes R, R¹ und R², wo sie auftreten, Wasserstoff darstellt, m 3 oder 4 ist, n 1 bis 6 beträgt und j eine ganze Zahl von einschließlich 8 bis 18 darstellt.
Der Transfer-Rest kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus:

N⁴-Octylspermidin;
N⁴-Dodecylspermidin;
N⁴-Octadecylspermidin;
N⁴-Octylspermin;
N⁴-Dodecylspermin; und
N⁴-Octadecylspermin.

Der Transfer-Rest kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus:

N²-Octyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)pentylspermidin;
N²-Dodecyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)pentylspermidin;
N⁶-Octadecyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)pentylspermidin;
N⁶-Octyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin;
N²-Dodecyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin; und
N²-Octadecyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin.

Bevorzugt wird der Transfer-Rest ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)spermidintrihydrochlorid;
N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-HA2-peptid;
N⁴-(5'-N-(3"α,7"α,12"α-Trihydroxy-5"β-cholanamido)pentyl)spermidintrihydrochlorid;
N⁴-(5-N-(α-3'-Propionamidothiomannosid)pentyl)spermidintrihydrochlorid;
N⁴-(N-CBZ-5-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5-aminopentyl)spermintetrahydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(octyl)spermintetrahydrochlorid; 1,12-Bis-N-guanidino-N⁴,N⁹-bis-(octyl)-4,9-diazadodecantetrahydrochlorid;
N⁴-(5-N-(Cholesten-3'β-carbamoyl)pentyl)spermintetrahydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)spermintetrahydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(12'-dodecansäure)spermintetrahydrochlorid;
N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid;
N⁴-(12'-Dodecansäure)spermintetrahydrochlorid;
N⁴,N⁹-Bis(5-(α-3'-propionylthiomannosid)aminopentyl)spermintetraacetat;
N⁴-(5-N-(23'-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat;
N⁴-(5-N-(O-(5-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)pentyl)-O-(2-acetamido)nonadecaethylenglycol)pentyl)spermintetraacetat; und
N⁴-(((23-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat.

Der multifunktionelle molekulare Komplex kann weiterhin verschiedene kationische Polyamin-Komponenten umfassen.
Der multifunktionelle molekulare Komplex kann weiterhin eine erste kationische Polyamin-Komponente mit einer damit verknüpften Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente und eine zweite kationische Polyamin-Komponente mit einer damit verknüpften Rezeptorspezifischen Bindungskomponente aufweisen.
Die Nukleinsäurezusammensetzung kann ein Nukleinsäuremolekül darstellen, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die ein Peptid oder Protein kodiert, oder als Matrize für ein Nukleinsäuremolekül dient.
Die Nukleinsäurezusammensetzung kann ein Plasmid sein.
Nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen multifunktionellen molekularen Komplex, wie oben beschrieben, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder einen Ester hiervon, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes, wie oben beschrieben, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für den Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in den Komplex der Zielzellen eines Individuums bereitgestellt.
Nach einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes, wie oben definiert, bereitgestellt für die Herstellung eines sich selbst organisierenden Freisetzungssystems für den Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in Zielzellen eines Individuums.
Es wird weiterhin ein sich selbst organisierendes Freisetzungssystem für den Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in eine Zielzelle bereitgestellt, umfassend die nachfolgenden einzelnen Komponenten, die in der Lage sind, zusammengebracht zu werden und chemisch in einem Molekularkomplex durch einfaches Mischen zu binden: A) die zu transferierende Nukleinsäure und B) einen wie oben definierten Transfer-Rest.
Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in Zielzellen auf einer in-vitro-Basis offenbart. Das Verfahren umfasst den Schritt des in Kontaktbringens der Zielzellen mit einem multifunktionellen molekularen Komplex, der die Nukleinsäurezusammensetzung enthält, wie zuvor detailliert dargestellt, wodurch ein Transfer eines Nukleinsäuremoleküls, das ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert oder als Matrize für funktionelle Nukleinsäuremoleküle dient, in die Zellen stattfindet. Das gewünschte Protein oder funktionelle Nukleinsäuremolekül kann jedes Produkt der Industrie, des Handels oder des wissenschaftlichen Interesses sein, z.B. therapeutische Mittel, einschließlich Vakzine, Nahrungsmittel und Ernährungsergänzungen, Verbindungen mit landwirtschaftlicher Bedeutung, wie Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren, Insektizide, Milben-tötende Mittel, Rodentizide und Fungizide, Ver bindungen, die in der Tiergesundheit verwendbar sind, wie Parasiten-tötende Mittel, einschließlich Nematozide; usw. Die Zielzellen sind typischerweise Kulturen von Wirtszellen, umfassend Mikroorganismuszellen, wie Bakterien und Hefe, können aber ebenfalls Pflanzen- und Säugetierzellen umfassen. Die Zellkulturen werden gemäß den dem Stand der Technik gut bekannten Fermentationstechniken versorgt, die die Erzeugung des gewünschten Proteins oder funktionellen Nukleinsäuremoleküls maximieren, und die Fermentationsprodukte werden durch bekannte Verfahren geerntet und gereinigt.
Es ist weiterhin ein Verfahren zum Transferieren einer Nukleinsäurezusammensetzung in die Zellen eines Individuums offenbart. Das Verfahren umfasst den Schritt des in Kontaktbringens von Zellen des Individuums mit einem multifunktionellen molekularen Komplex, der die Nukleinsäurezusammensetzung enthält, wie weiter oben detailliert erläutert, durch Verabreichen eines Nukleinsäuremoleküls an die Zellen, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die entweder ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert oder als Matrize für funktionelle Nukleinsäuremoleküle dient. Das Nukleinsäuremolekül wird ohne retrovirale Partikel verabreicht. Das gewünschte Protein kann entweder ein Protein sein, das im Individuum funktioniert oder dazu dient, eine Immunantwort zu initiieren. Das Nukleinsäuremolekül kann den Zellen des Individuums entweder auf einer in-vivo- oder einer ex-vivo-Basis verabreicht werden, d. h. der Kontakt mit den Zellen des Individuums kann innerhalb des Körpers des Individuums gemäß den Verfahren, die am typischsten eingesetzt werden, stattfinden, oder der Kontakt mit den Zellen des Individuums kann außerhalb des Körpers des Individuums durch Entnehmen der Zellen, stattfinden, von denen gewünscht ist, dass sie vom Körper des Individuums durch verschiedene geeignete Mittel behandelt werden, gefolgt von in Kontaktbringen der Zellen mit dem Nukleinsäuremolekül, wiederum gefolgt von der Rückführung der Zellen in den Körper des Individuums.
Es ist ebenfalls ein Verfahren zum Immunisieren eines Individuums gegen ein Pathogen offenbart. Das Verfahren umfasst den Schritt des in Kontaktbringens von Zellen des Individuums mit einem multifunktionellen molekularen Komplex, der eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, wie weiter oben detailliert erläutert, durch Verabreichen eines Nukleinsäuremoleküls an die Zellen, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop umfasst, das mit einem Epitop identisch oder im wesentlichen ähnlich ist, das auf dem Pathogen als Antigen vorliegt, und die Nucleotid-Sequenz mit den regulatorischen Sequenzen funktionsfähig verknüpft ist. Das Nukleinsäuremolekül ist in der Lage, in den Zellen des Individuums exprimiert zu werden.
Es sind ebenfalls Verfahren zum Immunisieren eines Individuums gegen eine hyperproliferative Erkrankung oder eine Autoimmunerkrankung offenbart. Die Verfahren umfassen den Schritt des in Kontakttretens von Zellen des Individuums mit einem multifunkionellen molekularen Komplex, der eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, wie weiter oben detailliert erläutert, durch Verabreichen eines Nukleinsäuremoleküls an die Zellen des Individuums, das eine Nucleo tid-Sequenz umfasst, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop umfasst, das identisch oder im wesentlichen identisch zu einem Epitop ist, das auf einem mit einer hyperproliferativen Krankheit in Zusammenhang stehendes Protein bzw. einem mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang stehendes Protein vorliegt, und mit den regulatorischen Sequenzen funktionsfähig verknüpft ist. Das Nukleinsäuremolekül kann in den Zellen exprimiert werden.
Auch werden Verfahren zum Behandeln eines Individuums, das unter einer Autoimmunerkrankung leidet, offenbart, umfassend die Schritte des in Kontaktbringens von Zellen des Individuums mit einem multifunktionellen molekularen Komplex, der eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, wie weiter vorne detailliert erläutert, durch Verabreichen eines Nukleinsäuremoleküls an die Zellen des Individuums, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die die Aktivität eines fehlenden, defekten oder inhibierten Gens wiederherstellt, oder das ein Protein kodiert, das einen therapeutischen Effekt im Indivuum erzeugt, und mit den regulatorischen Sequenzen funktionsfähig verknüpft ist; das Nukleinsäuremolekül kann in den Zellen exprimiert werden.
Es werden ebenfalls pharmazeutische Kits offenbart, die einen Behälter umfassen, der eine Nukleinsäurezusammensetzung aufweist, sowie einen Behälter, der einen Transfer-Rest aufweist. Optional sind in derartigen Kits Hilfsstoffe, Träger, Konservierungsmittel und Vehikel, wie Lösungsmittel, enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein multifunktioneller molekularer Komplex für den Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in eine Zielzelle bereitgestellt, der für einen hohen Level an Transfektion und Expression der Nukleinsäuremoleküle im Ziel, d. h. der Wirtszelle, sorgt. Dieser multifunktionelle molekulare Komplex umfasst im wesentlichen die Kombination von zwei Schlüsselelementen, (I) der Nukleinsäure, von der erwünscht ist, dass sie in die Zielzelle transferiert wird, und (II) den Transfer-Rest, der mit dem Nukleinsäuremolekül komplexiert und mehrere Komponenten umfasst, deren Funktion es ist, i) die gewünschte Zielzelle im Körper eines Individuums mittels einer Rezeptor-spezifischen Bindungskomponente, die auf einen spezifischen Rezeptor auf der Membranoberfläche der Zielzelle reagiert, zu lokalisieren; ii) die aus der hydrophilen Natur des Nukleinsäuremoleküls und der lipophilen Natur der Zellmembran herrührenden Inkompatibilität zu überwinden, so dass die erstere durch die letztere hindurchtreten kann, und iii) den Abbau des Nukleinsäuremoleküls in ein Liposom der Zielzelle durch Spaltung des Preliposoms, eine endosome Bildungsstufe, zu verhindern, die mittels einer Endosommembran-Spaltungskomponente bewerkstelligt wird, die dem multifunktionellen molekularen Komplex ermöglicht, einem als Ergebnis des Endozytose- oder Pinozytose-Verfahrens der Zielzelle gebildeten Endosom zu entgehen, wobei der multifunktionelle molekulare Komplex in die Zielzelle eintritt und in das Endosom einbezogen wird.
Die Komponenten des Transfer-Rests sind wie folgt: A) Eine kationische Polyamin-Komponente, gebunden an die Nukleinsäurezusammensetzung, umfassend 3 bis 12 Stickstoffatome; B) eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, umfassend mindestens eine lipophile langkettige Alkylgruppe, gebunden an ein Stickstoffatom des Polyamins, oder eine kurze Alkyl-Brückengruppe mit einer endständigen Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe, an die ein fusogenes Peptid oder Cholinsäure oder Cholesteryl oder Derivat gebunden ist, und optional C) ein oder mehrere Rezeptor-spezifische Bindungskomponenten, die Liganden für natürliche Rezeptoren der Zielzelle sind, gebunden an eine kürzere Alkyl-Brückengruppe, gebunden an ein weiteres Stickstoffatom des Polyamins durch die Endgruppe hiervon.
Der Transfer-Rest wird dargestellt als eine oder mehrere unabhängig ausgewählte kationische Polyamin-Komponenten der Formel (1):

worin:
R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl;
m an jeder Stelle unabhängig ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 2 bis 5; und bevorzugt 3 oder 4 ist;
n ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 1 bis 10; bevorzugt 1 bis 6 beträgt;
jedes R³ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1–6-Alkyl und ein oder mehreren Endosommembran-Spaltungsförderungskomponenten;
worin der Transfer-Rest mindestens eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, gebunden an ein Stickstoffatom der kationischen Polyaminkomponente, umfaßt, und worin jede Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
(a)-B-(CR¹R²)_j-C(R)₃; worin R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; j eine ganze Zahl von einschließlich 6 bis 24 darstellt; bevorzugt 8 bis 18, insbesondere bevorzugt einschließlich 8 bis 12; und B optional fehlt oder eine Brückengruppe der Formel darstellt: (i) -(CR¹R²)_k-C(=O)-Z-; (ii) -(CR¹R²)_k-N(R)-C(=O)-Z-; (iii) -(CR¹R²)_k-N(R)-{-C(=O)-CH₂-O-[-(CH₂)₂-O-]_l-(CH₂)_k-N(R)}_p-C(=O)-Z-; oder (iv) -(CR¹R²)_k-C(=O)-{-N(R)-[-(CH₂)₂-O-]_l-CH₂-C(=O)}_p-Z-;
worin k unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6, bevorzugt 3 bis 5, 1 eine ganze Zahl von einschließlich 0 bis 30, bevorzugt von 4 bis 9 darstellt; p eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 3, bevorzugt 1 darstellt; R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; und Z O, S, N(R) darstellt oder fehlt, d. h. eine Einzelbindung ist; und
(b) -B-(R⁴)R; worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff C_1–6-Alkyl oder fehlt; B kann nicht fehlen und ist eine Brückengruppe, die unabhängig ausgewählt ist aus den Gruppen (i) bis (iv), wie oben, und zusätzlich aus der Gruppe der Formel: (v) -(CR¹R²)_j'-X-, worin j' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 8 darstellt, bevorzugt einschließlich 2 bis 6 und noch bevorzugter 5; R¹ und R² jedes unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl;
X O, S, N(R) darstellt oder fehlt; und
R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglykoproteine von umhüllten Tierviren; (ii) Cholinsäurederivaten der Formel (2);
worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass nicht beide Bindungen ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R⁶ -H, -OH- -CO₂H, -C(=O)NH₂, -OC(=O)NH₂, -NH₂ oder -O(CH₂CH₂O)_n·H darstellt, worin n' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt;
R⁷ einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholinsäurederivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl- oder -C_1–6-Alkylcarbonylgruppe; und
R⁸ eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt, insbesondere CH₃, einschließlich der bevorzugten Cholinsäurederivate 3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholan-ester oder -amid; und iii) Cholesterylderivaten der Formel (3):
worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass nicht beide Bindungen ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R^6a einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholesterylderivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl-, -OC(=O)- oder -OCH₂C(=O)-Gruppe;
R^7a eine C_1–6-Alkylgruppe, insbesondere (CH₂)₃CH(CH₃)₂ darstellt; und
R^8a eine C_1–6-Alkylgruppe, insbesondere CH₃ darstellt; einschließlich der bevorzugten Cholesteryl-Derivate Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat oder -β-methylencarboxamid;
OPTIONAL kann R³ ein oder mehrere der nachfolgend definierten Gruppen sein, gebunden entweder an ein weiteres Stickstoffatom einer kationischen Polyamin-Komponente, an die eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente gebunden ist, oder an ein Stickstoffatom einer katonischen Polyamin-Komponente, die nicht an eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente gebunden ist:
c) -B-(R⁵)R, worin B nicht fehlen kann und eine Brückengruppe darstellt, die unabhängig ausgewählt ist aus den Gruppen einschließlich i) bis v); R ist unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl oder fehlt; und
R⁵ ist eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) D-Biotin; (ii) β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid; (iii) N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (iv) N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (v) 5-Methyltetrahydrofoliat; (vi) Folsäure; (vii) Folinsäure; (viii) α-3'-Propionylthiomannosid; und (ix) α-3'-Propionylthiomannosid-6-phosphat.

Die Nukleinsäurezusammensetzung
Die zwei grundlegenden Komponenten des multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung sind die Nukleinsäurezusammensetzung und der Transfer-Rest. Mit der "Nukleinsäurezusammensetzung" ist irgendeine oder mehrere der Gruppe von Verbindungen gemeint, worin ein oder mehrere Moleküle von Phosphorsäure kombiniert sind mit einem Kohlenhydrat, d.h. Pentose oder Hexose, Molekülen, die wiederum mit Basen, abgeleitet von Purin, z.B. Adenin, und von Pyrimidin, z.B. Thymin, kombiniert sind. Insbesondere natürlich vorkommende Nukleinsäuremoleküle umfassen genomische Desoxyribonucleinsäure (DNA) und genomische Ribonucleinsäure (RNA), genauso wie mehrere verschiedene Formen der letzteren, z.B. Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (t-RNA) und ribosomale RNA (rRNA). Auch umfasst sind die verschiedenen DNA, die komplementär (cDNA) zu verschiedenen RNA sind. Synthetisierte DNA oder ein Hybrid hiervon mit natürlich auftretender DNA ist komplementär.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Nukleinsäurezusammensetzungen können entweder einsträngig oder zweisträngig, linear oder kreisförmig sein, wie z. B. ein Plasmid, und sind entweder Oligo- oder Polynucleotide. Sie können so wenig wie 15 Basen oder Basenpaare umfassen oder können so viel wie 20 Tausend Basen oder Basenpaare (20kb) umfassen. Da der Transfer-Rest auf einer anteilsmäßigen Basis, wenn hinzugegeben zur Nukleinsäurezusammensetzung, verwendet wird, werden praktische Erwägungen des physikalischen Transports weitgehend durch die Obergrenze hinsichtlich der Größe der Nukleinsäurezusammensetzungen, die eingesetzt werden können, bestimmt.
Zusätzlich zu diesen natürlich auftretenden Materialien können die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Nukleinsäurezusammensetzungen ebenfalls synthetische Zusammensetzungen, d.h. Nukleinsäure-Analoga, umfassen. Von diesen wurde festgestellt, dass sie insbesondere in der Antisense-Methode verwendbar sind, was die komplementäre Hybridisierung relativ kurzer Oligonucleotide an einzelsträngiger RNA oder einzelsträngiger DNA ist, so dass die normalen wesentlichen Funktionen dieser intrazellulären Nukleinsäuren gestört werden. Siehe z.B. Cohen, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (Antisense-Inhibitoren der Gen-Expression), CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1989).
Die Größe, Art und spezifische Sequenz der zur Zielzelle zu transferierenden Nukleinsäurezusammensetzung kann für besondere Anwendungen, für die sie beabsichtigt ist, optimiert werden, und derartige Optimierung liegt innerhalb der Fertigkeit des Fachmanns in diesem Gebiet. Jedoch kann die Art der Zielzellen im Individuum, in die es erwünscht ist, eine Nukleinsäurezusammensetzung zu transferieren, eine signifikante Auswirkung auf die Wahl des speziellen multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung haben. Beispielsweise, wo es erwünscht ist, die Nukleinsäuremoleküle in die Zielzellen zu transferieren, indem diese intramuskulär injiziert werden, um eine Immunreaktion hervorzurufen, wird festgestellt, dass dieser Transfer durch Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, durchgeführt werden kann, der ein kationisches Polyamin umfasst, an das als die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, eine wie oben definierte lipophile langkettige Alkylgruppe gebunden ist. Wo die Zielzellen beispielsweise Hepatozyten darstellen, wird der Transfer von der gewünschten Nukleinsäurezusammensetzung ohne weiteres durchgeführt durch Verwendung des multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung, worin an das kationische Polyamin eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente gebunden wird, die eine Unterscheidung zwischen den Körperzellen erlaubt, umfassend z.B. N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin oder N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)-lysin.
Die erfindungsgemäß zur Zielzelle zu transferierende Nukleinsäurezusammensetzung muss ein geeignetes offenes Leseraster sowie einen Promotor zum Exprimieren eines Proteins genauso wie auch jede andere regulatorische Sequenz aufweisen, die zur Expression geeignet sein kann. Durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung freizusetzende Nukleinsäurezusammensetzungen können so geschaffen und konstruiert werden, um für die gewünschte besondere Anwendung geeignet zu sein, was alles innerhalb der durchschnittlichen Fähigkeiten des Fachmanns in diesem Bereich liegt.
Die Nuleinsäuremoleküle, die an die Zellen unter Verwendung des multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung geliefert werden, können dienen als: 1) genetische Matrizen für Proteine, die als prophylaktische und/oder therapeutische Immunisierungsmittel fungieren; 2) Ersetzungskopien für defekte, fehlende oder nicht funktionierende Gene; 3) genetische Matrizen für therapeutische Proteine; 4) genetische Matrizen für Antisense-Moleküle und als Antisense-Moleküle per se oder 5) genetische Matrizen für Ribozyme.
In dem Fall von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine kodieren, umfassen die Nukleinsäuremoleküle bevorzugt die notwendigen regulatorischen Sequenzen für Transkription und Translation in den Zielzellen des individuellen Tiers, dem sie verabreicht werden.
Im Falle von Nukleinsäuremolekülen, die als Matrizen für Antisense-Moleküle und Ribozyme dienen, sind derartige Nukleinsäuremoleküle bevorzugt mit regulatorischen Elementen verknüpft, die für die Produktion von ausreichend Kopien der Antisense- und Ribozymmoleküle, die dabei jeweils kodiert werden, notwendig sind. Die Nukleinsäuremoleküle sind frei von retroviralen Partikeln und werden bevorzugt vorgesehen als DNA in der Form von Plasmiden.
Der Transfer-Rest
Der Kern oder das Grundgerüst des Transfer-Rests ist das kationische Polyamin, enthaltend zwischen 3 und 12 Amine. Es kann mehr als eine dieser kationischen Polyamin-Komponenten geben, deren Funktion es ist, die aus der hydrophilen Natur des Nukleinsäuremoleküls und der lipophilen Natur der Zellmembran herrührende Inkompatibilität zu überwinden, obwohl dies an sich nicht erlaubt, dass das erstere durch das letztere hindurchtritt. Die kationischen Gruppen des Polyamins binden an die anionischen Gruppen der Nukleinsäure durch ionische Bindung, wodurch jene Ladungen neutralisiert werden, und sie dienen ebenfalls als ein Verknüpfungspunkt für den Komplex. Ein μg DNA enthält 3,1 Nanomole an phosphatanionischen Ladungen, woraus man ein mittleres Molekulargewicht von 325 für ein Nucleotid-Natriumsalz annimmt. Der Transfer-Rest der vorliegenden Erfindung ist nicht wirksam, um einen Transfer der Nukleinsäurezusammensetzung zu erreichen, bis die anionischen Ladungen der Nukleinsäure im wesentlichen durch die kationischen Ladungen der Polyamin-Komponente des Transfer-Rests neutralisiert sind.
Es ist anzuerkennen, dass in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein einzelnes kationisches Polyamin eingesetzt werden kann, das konzeptionell die anionischen Ladungen der Nukleinsäure in mehr oder weniger stöchiometrischer Art und Weise ausgleicht, auch wenn verständlich ist, dass es in praktischer Hinsicht notwendig ist, Mengen an kationischen Polyaminen zu verwenden, die deutlich über der stöchiometrischen Menge liegen, da aufgrund der Gegenwart von konkurrierenden Bindungsstellen in den Ziel- und anderen Zellen, deren Existenz dem Fachmann gut bekannt ist, die gewünschte Bindung des Polyamins an die Nukleinsäure kompetitiv verhindert oder ansonsten beeinträchtigt wird. Es ist ebenfalls zu erwägen, dass mehr als ein derartiges kationisches Polyamin eingesetzt werden kann, wobei in diesem Fall jede Polyamin-Kette oder -Teil kleiner ist als die entsprechende Nukleinsäure, an die dieses gebunden werden wird. Es ist jedoch verständlich, dass die Gesamtgröße oder -länge dieser einzelnen kationischen Polyamin-Komponenten zusammen im wesentlichen dieselbe Größe oder Länge wie die Nukleinsäure-Komponente haben sollte, damit die Neutralisation der anionischen Ladungen der Nukleinsäure stattfindet. Wieder ist verständlich, dass aus praktischen Gründen ein signifikanter Überschuss an kationischen Polyamin-Komponenten gegenüber der vorhandenen Nukleinsäure-Komponente notwendig sein wird. Die Verwendung von mehr als einer kationischen Polyamin-Komponente erlaubt Flexibilität hinsichtlich der Typen von Gruppen, die daran gebunden werden. Beispielsweise kann eine kationische Polyamin-Komponente eine spezielle Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente tragen, während eine weitere kationische Polyamin-Komponente eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente trägt, oder vielleicht eine andere Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente. Die Gesamtzahl an derartigen kationischen Polyamin-Komponenten ist variabel und hängt nicht nur von der Größe oder Länge der Nukleinsäure-Komponente ab, sondern genauso von der Anzahl und dem Typ der daran gebundenen Gruppen.
Die Transfereffizienz, d. h. die Transfektion, wird nicht optimal, bis der multifunktionelle molekulare Komplex, die Kombination des Transfer-Rests und der Nukleinsäure, eine starke positive Ladung trägt. Somit muss die Menge an Transfer-Rest ausgewählt werden, indem man dies berücksichtigt, und die tatsächliche ausgewählte Menge hängt von dessen Ladungsdichte ab, die durch im Stand der Technik wohl bekannte Mittel berechnet werden kann.
Die Triamin-, Tetramin- und Pentamin- und höhere Polyamin-Komponenten des Transfer-Rests müssen kationisch sein, um, wie oben erläutert, zu funktionieren. Dies kann erreicht werden durch das einfache Hilfsmittel, dass man ein Säure-Additionssalz, z.B. das Hydrochloridsalz, herstellt, wobei Ammoniumchlorid-Einheiten gebildet werden. Es kann auch der Fall sein, dass die kationische Form des Polyamins unter Bedingungen von physiologischem pH gebildet werden, in welchem Falle es nicht notwendig ist, das Kation direkt zu bilden. Somit soll der Begriff "kationisches Polyamin" diese beiden Möglichkeiten umfassen.
Es ist zu erwägen, dass die Anzahl an Amingruppen, die erwünscht im Polyamin vorliegen sollen, in einigem Ausmaß vom Verabreichungsweg des multifunktionellen molekularen Komplexes, der verwendet wird, abhängt. Beispielsweise wird für die intramuskuläre Verabreichung berücksichtigt, dass es bevorzugt ist, 3 bis 5 Aminogruppen im Polyamin zu haben, wohingegen es für systemische Injektion, z.B. intravenöse Injektion, bevorzugt ist, 5 bis 8 Aminogruppen im Polyamin zu haben. Für in-vitro-Anwendungen ist es im allgemeinen bevorzugt, 5 bis 8 Aminogruppen im Polyamin zu haben.
Die nächste Komponente des Transfer-Rests ist die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, von der es erforderlich ist, dass sie vorliegt. Diese kann entweder ein oder mehrere lipophile langkettige Alkylgruppen umfassen, die durch ein oder mehrere Stickstoffatome an das Polyamin gebunden sind, oder kann eine Brückengruppe "B" umfassen, z.B. einen kürzeren Alkyl-Vernetzungsrest, optional mit einer End-Amino-, -Hydroxyl- oder -Sulfhydrylgruppe, durch die ein fusogenes Peptid oder Cholinsäure oder Cholesteryl oder eine Derivatverbindung verbunden ist.
Die lipophile langkettige Alkylgruppe wird definiert durch die Formel: -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃, worin B eine Brückengruppe, wie definiert, darstellt; R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl, und j ist eine ganze Zahl einschließlich 6 bis 24, bevorzugt einschließlich 1 bis 18, noch bevorzugter einschließlich 8 bis 12.
Die Gruppe "-B-" kann fehlen, d.h. eine Einzelbindung sein, worin R³ eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente ist, umfassend eine lipophile langkettige Alkylgruppe, wie oben definiert unter "a)". Die Gruppe "-B-" kann ebenfalls ein Brückenelement darstellen, das ein Bestandteil ist, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

i) -(CR¹R²)_k-C(=O)-N(R)-;
ii) -(CR¹R²)_k-N(R)-C(=O)-O-;
iii) -(CR¹R²)_k-N(R)-{-C(=O)-CH₂-O-[-(CH₂)₂-O-]_l-(CH₂)_k-N(R)}_p-C(=O)-z-;
iv) -(CR¹R²)_k-C(=O)-{-N(R)-[-(CH₂)₂-O-]_l-CH₂-C(=O)}_p-N(R)- oder
v) -(CR¹R²)_j'-X-,
worin die verschiedenen Substituenten wie oben definiert sind.

Wo die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente eher als eine lipophile langkettige Alkylgruppe anstelle eines fusogenen Peptids oder einer Cholinsäure oder Cholesteryl oder einer Derivatverbindung vorliegt, ist es erforderlich, dass die Brückengruppe "B" vorhanden ist, und ein Bestandteil ist, der unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe i) bis v) oben. Diese Auswahl hängt von dem erforderlichen oder erwünschten Typ an vorzuliegender chemischer Bindung ab. Beispielsweise sind die Bestandteile i) und iv) Carboxamid-Bindungen, wohingegen die Bestandteile ii) und iii) Carbamat-, Thiocarbamat- oder Carbamoyl-Bindungen sind, abhängig davon, ob "Z" O, S ist bzw. fehlt. Für Bestandteil v) werden die Bindungen Oxy, Thio, Amino oder Alkylen sein, abhängig davon, ob "X" O, S, N(R) ist bzw. fehlt. Die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente kann andererseits eine Carbonyl-, Amino- oder einige andere Endgruppen darstellen, die die Auswahl an zu verwendendem Brückenbestandteil bestimmt. All diese Auswahlmöglichkeiten liegen jedoch innerhalb des Könnens des Fachmanns in diesem Bereich.
Am einfachsten kann die Brückengruppe einen in erster Linie aus sterischen Überlegungen verwendete Alkylenverbindungs-Rest darstellen. Jedoch können die anderen Brückengruppen ebenfalls erwünscht sein, um dem multifunktionellen molekularen Komplex der vorliegenden Erfindung verschiedene physikalische und chemische genauso wie Konfigurationseigenschaften zu verliehen. Die Polyethylenglykolgruppe kann insbesondere in dieser Hinsicht verwendbar sein.
Der Begriff "C_1–6-Alkyl", wie oben über die gesamte Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf geradkettige und verzweigte Alkylgruppen, einschließlich, aber nicht beschränkt, auf Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl und n-Pentyl.
In der Formel für die lipophile langkettige Alkylgruppe oben ist es bevorzugt, dass R, R¹ und R² sämtliche Wasserstoff sind, und wie angegeben, dass j eine ganze Zahl einschließlich 8 bis 18 darstellt. Es muss mindestens eine dieser lipophilen langkettigen Alkylgruppen vorliegen, aber bevorzugt sind nicht mehr als drei derartige Gruppen vorhanden. Es ist bevorzugt, dass nur eine derartige Gruppe vorliegt. Somit sind Beispiele von bevorzugten Transfer-Resten zur Verwendung in einem Komplex der vorliegenden Erfindung, wo die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente eine lipophile langkettige Alkylgruppe, wie oben beschrieben, ist:

N⁴-Octylspermidin,
N⁴-Dodecylspermidin,
N⁴-Octadecylspermidin,
N⁴-Octylspermin,
N⁴-Dodecylspermin und
N⁴-Octadecylspermin.

Die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente kann ebenfalls eine kürzere Alkyl-Brückengruppe aufweisen, optional mit einer terminalen Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe, durch die ein fusogenes Peptid oder Cholesterol oder eine Derivatverbindung hier verknüpft ist. Eine derartige Komponente kann dargestellt werden durch die Formel -B-(R⁴)R, worin die B-Gruppe ist: -(CR¹R²)_j'-X-, worin R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; j' eine ganze Zahl einschließlich 1 bis 8 darstellt, bevorzugt einschließlich 2 bis 4; X O, S, N(R) ist oder fehlt.
Es ist bevorzugt, dass R¹ und R² jeweils Wasserstoff sind und, wie angegeben, dass j' 2 bis 4 darstellt, während X definiert ist als N(R). Somit ist die kürzere Alkyl-Brückengruppe bevorzugt Ethyl, n-Propyl oder n-Butyl und hat eine terminale Aminogruppe, an die das fusogene Peptid oder Cholinsäure oder Cholesteryl oder eine Derivatverbindung gebunden ist, die die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente umfasst.
Alternativ können andere Bestandteile der "B"-Brückengruppe ausgewählt werden. Beispielsweise liefert der Bestandteil i) einen Alkyl-Brückenrest mit einer Carboxamid-Bindung, der einfachste Vertreter hiervon wäre die Gruppe -(CH₂)-C(=O)-NH-. Bestandteil ii) liefert einen Alkylen-Brückenrest mit einer Bindung vom Carbamat-Typ, und der einfachste Vertreter dieses Bestandteils wäre die Gruppe -(CH₂)-NH-C(=O)-, die eine Bindung vom Carbamoyl-Typ darstellt. Eine Carbamat-Bindung würde durch die Gruppe -(CH₂)-NH-C(=O)-O- repräsentiert, während eine einfache Variante dieser Gruppe eine Thiocarbamat-Bindung liefern würde: -(CH₂)-NH-C(=O)-S-. Die Bestandteile iii) und iv) liefern dieselben terminalen Bindungsvarianten, während Zugeben zum Alkyl-Brückenrest einen Polyethylenglykol-Brückenrest variabler Größe, d.h. die Anzahl der sich wiederholenden Ethylenoxidmonomer-Einheiten, abhängig von den Definitionen von "1" und "p", ergibt.
Das fusogene Peptid, das als Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente fungiert, umfasst die Spike-Glykoproteine von im Stand der Technik bekannten umhüllten Tierviren. Membranfusion, ob planar oder ringförmig, umfasst die Schritte der ursprünglichen Annäherung, Koaleszenz und Separation. Fusionsreaktionen sind schnell, hochspezifisch und zuverlässig. Die Membranproteine von umhüllten Tierviren umfassen Glykoproteine, die die Bilayer der Virusmembran überspannen und den Hauptteil ihrer Masse extern aufweisen und nicht überspannte nicht-glykosylierte Proteine, die mit der inneren Bilayer-Oberfläche verbunden sind. Die Glykoproteine bilden auf der Oberfläche der Virusmembran radiale Vorsprünge, und diese Spike- Glykoproteine spielen eine Schlüsselrolle beim Viruseintritt in Wirtszellen. Spike-Glykoproteine gehören zu den bestcharakterisierten Virusmembranproteinen. Beim Zelleintritt sind die Spike-Glykoproteine verantwortlich für die Bindung des Viruspartikels an die Zelloberfläche und für die Penetration des Nucleocapsids in das Cytosol, wonach Endozytose des Viruspartikels die Spike-Glykoproteine bei Fusion mit der Begrenzungsmembran des Endosoms eine Rolle spielen, wobei das Nucleocapsid in das Cytosol eintritt. In einigen umhüllten Tierviren übernehmen die Spike-Glykoproteine ein spezialisiertes Merkmal, z.B. in Orthomyxoviren, wo eines eine Neuraminidase und ein weiteres ein Hämagglutinin darstellt. All diese fusogenen Peptide waren im Hinblick auf ihre Aminosäure-Sequenzen, grobe Morphologie, Rolle im Gesamtverfahren der Fusion und Erfordernisse für die Aktivität Gegenstand lang andauernder Studien und wurden im Detail in der technischen Literatur offenbart. Siehe z.B. J. White, M. Kielian und A. Helenius, Quarterly Reviews of Biophysics, 16, 151–195 (1983), die hier in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme miteinbezogen ist.
Beispiele derartiger fusogener Peptide und von Spike-Glykoproteinen von umhüllten Viren abgeleiteten Homologen umfassen die nachfolgenden Peptid-Sequenzen, gelesen vom N-Ende zum C-Ende:

SEQ ID NO. 1: KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCP (R. Schlegel und M. Wade, J. Biol. Chem., 259, 4691 – 94 (1984)) – VSV;
Poly(Glu-Aib-Leu-Aib) (K. Kono, H. Nishii und T. Takagishi, Biochim. Biophys. Acta, 1164, 81 – 90 (1993));
SEQ ID NO. 2: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQ – HIV-1;
SEQ ID NO. 3: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTTALVATQQ – MuLV (J.S. Jones und R. Risser, J. Virol., 67; 67 – 74 (1993));
SEQ ID NO. 4: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS – HIV-1 (J.L. Nieva, S. Nir, A. Muga, F.M. Goňi und J. Wilschut, Biochem., 33, 3201 – 09 (1994));
SEQ ID NO. 5: AVGAIGALFLGFLGAAG- HIV-1 (S. Soukchareun, G.W. Tregear und J. Haralambidis, Bioconj. Chem., 6, 43–53 (1995));
SEQ ID NO. 6: GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA -HA-2 (P. Midoux, C. Mendes, A. Legrand, J. Raimond, R. Mayer, M. Monsigny und A.C. Roche, Nucl. Acids Res., 21, 871 – 78 (1993));
SEQ ID NO. 7: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFR -HA-2;
SEC ID NO. 8: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAAS -HIV-1 gp41;
SEC ID NO. 9: FAGVVIGLAALGVATAANVTAAVALVK – SVS F1;
SEQ ID NO. 10: KVYTGVYPFMWGGAYCFCD – SFV E1;
SEQ ID NO. 11: KLICTGISSIPPIRALFAAINIP – PH-30 α (J.M. White, Science, 258, 917 – 24 (1992));
sSEQ ID NO. 12: FFGAVIGTIALGVATATAAQIT -Sendai F1;
SEQ ID NO. 13: FAGVVIGLAALGVATATAAQVT – SVS F1;
SEQ ID NO. 14: FIGAIIGGVALGVATATAAQIT – NDV F1;
SEQ ID NO. 15: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQN – HA-2 X:31;
SEQ ID NO. 16: GLFGAIAGFIENGWEGLVDGWYGFRHQN – HA-2 FPV;
SEQ ID NO. 17: GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHG – HA-2 B/Lee;
SEQ ID NO. 18: FVAAIILGISALIAIITSFAVATTALVKEM – MMTV; gp36;
SEQ ID NO. 19: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGIGTGTTALMATQQFQQLQAAVQDDLREVEKS – MoMLV p15E;
SEQ ID NO. 20: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTTALVATQQFQQLHAAVQDDLKEVEKS – F-MuLV p15E;
SEQ ED NO. 21: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTTALVATQQFQQLQAAMHDDLKEVKS – AKV p15E;
SEQ ID NO. 22: DYQCKVYTGVYPFMWGGAYCFCDSENT – SFV E1;
SEQ ID NO. 23: DYTCKVFGGVYPFMWGGAQCFCDSENS -Sindbis E1 (J. White, M Kielian und A. Helenius, Q. Rev. Biophys., 16, 151 – 95 (1983));
SEQ ID NO. 24: FAGVVLAGAALGVAAAAQI – Masern;
SEQ ID NO. 25: FAGVVLAGAALGVATAAQI – Masern (P.L. Yeagle, R.M. Epand, C.D. Richardson und T.D. Flanagan, Biochim. Biophys. Acta., 1065, 49 – 53 (1991));
SEQ ID NO. 26: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGGC – HA-2 (E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten und M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7934 – 38 (1992));
SEQ ID NO. 27: GLFGAIAGFIENGWEGMIDG -X31F/68 HA-2;
SEQ ID NO. 28: GIFGAIAGFIENGWEGMIDG -VIC/75 HA-2;
SEQ ID NO. 29: GLFGAIAGFIEGGWTGMIDG – PR/8/34 HA-2;
SEQ ID NO. 30: GLFGAIAGFIEGGWEGMVDG – Jap/57 HA-2;
SEQ ID NO. 31: GLFGAIAGFIEGGWEGLVDG – PPV/34 HA-2 und
SEQ ID NO. 32: GFFGAIAGFLEGGWEGMIAG – X31F/68 HA-2 (J.D. Lear und W.F. DeGrado, J. Biol. Chem., 262, 6500–05 (1987)).

Einer mit durchschnittlichem Können im Stand der Technik würde ohne weiteres erkennen, dass andere derartige fusogene Peptide in einem Komplex der Erfindung verwendet werden könnten, einschließlich Peptide, die funktionell äquivalent zu den beschriebenen sind, aber mit einer oder mehreren Aminosäure-Additionen, -Deletionen oder -Substitution, insbesondere jenen mit beibehaltenen Aminosäure-Substitutionen.
Die Cholinsäure und Derivate, die als Endosommembran-Spaltungsförderungskomponenten fungieren umfassen Verbindungen der Formel (2):

worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass nicht beide Bindungen ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R⁶ -H, -OH-, -CO₂H, -C(=O)NH₂, -OC(=O)NH₂, -NH₂ oder -O(CH₂CH₂O)_n·H darstellt, worin n' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt;
R⁷ einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholinsäurederivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl- oder -C_1–6-Alkylcarbonylgruppe; und
R⁸ eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt, insbesondere CH₃. Es ist bevorzugt, dass die Cholinsäure und Derivatverbindungen ein oder mehrere Bestandteile umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-ester und -amid.

Das Cholesteryl und Derivate, die als Endosommembran-Spaltungsförderungskomponenten fungieren, umfassen Verbindungen der Formel (3)

worin:
www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt;
--- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass nicht beide Bindungen ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt;
R^6a einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholesterylderivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl-, -OC(=O)- oder -OCH₂C(=O)-Gruppe;
R^7a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt, insbesondere (CH₂)₃CH(CH₃)₂; und
R^8a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt, insbesondere CH₃. Es ist bevorzugt, dass die Cholesteryl- und Derivatverbindungen ein oder mehrere Bestandteile umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat- und -β-methylencarboxyamid.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Komplex eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente, die hilft, den Transfer von Nukleinsäurezusammensetzungen zu Zielzellen, insbesondere eukaryotischen Zellen, zu bewirken, indem sie die natürlichen Rezeptor-übermittelten Endozytose-Wege, die in diesen Zellen existieren, ausnutzt. Die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente ist daher ein Ligand für den natürlichen Rezeptor und kann somit bei Bindung des multifunktionellen molekularen Komplexes an die Zielzelle mitwirken. Endozytose oder Pinozytose werden dann stattfinden, wobei der gesamte Komplex in die Zielzelle transferiert wird, eingeschlossen in ein Endosom.
Die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente dient der wichtigen Funktion, dass sie es ermöglicht, dass der multifunktionelle molekulare Komplex der vorliegenden Erfindung zu spezifischen Zellpopulationen, z.B. Hepatozyten, zielgerichtet übermittelt wird. Die Bindungskomponente erleichtert die Lokalisierung der erwünschten Zielzellen im Körper des Tiers, denen der Komplex verabreicht wird, mit darauffolgender Bindung des Komplexes an die Zielzellen.
Wo die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente verwendet wird, wird auf dem multifunktionellen molekularen Komplex eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, wie weiter oben definiert, vorliegen. Wenn demgemäß die Bindungskomponente die erwünschte Zielzelle im Individuum lokalisiert hat, und der Komplex durch Binden des Rezeptors an die Zelle gebunden ist, wird der Komplex durch Endozytose in die Zelle transferiert, woraufhin dieser in ein Endosom eingehüllt wird. Zu diesem Zeitpunkt übernimmt die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente ihre wichtige Rolle der Spaltung der Membran, indem sie die Freisetzung des Komplexes in das Zytoplasma der Zelle ermöglicht.
Während des normalen Ablaufs der Vorgänge in der Zielzelle ist die Endosombildung ein Auftakt, irgendein fremdes Protein auf Lysosomen zielgerichtet zu vermitteln, wo ein Abbau des Fremdproteins durch hydrolytische Enzyme stattfindet.
Folglich kann die Akkumulation in lysosomalen Kompartimenten ein Haupthindernis für die Effektivität der Nukleinsäure-Freisetzungssysteme sein. Der multifunktionelle molekulare Komplex der vorliegenden Erfindung würde dasselbe Schicksal erleiden, wenn nicht die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente vorliegen würde. Diese Komponente ermöglicht dem Komplex, dem Endosom zu entgehen, woraufhin dieser in den Kern der Zielzelle migriert und die Nukleinsäurezusammensetzung freisetzt, deren genetische Information dann in den Kern transkribiert werden kann. Obwohl der exakte Mechanismus, der diese Schritte und Wege ausmacht, nicht gut verstanden wird, findet Expression des in den multifunktionellen molekularen Komplex enthaltenen Nukleinsäuremoleküls statt, wie in den Beispielen weiter unten gezeigt.
Die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente kann durch die Formel: -B-(R⁵)R dargestellt werden, worin R unabhängig Wasserstoff oder C_1–6-Alkyl ist oder fehlt; B kann unter anderem – (CR¹R²)_j'-X- sein, worin R¹ und R² wie oben definiert sind, X stellt N(R) dar und j' ist eine ganze Zahl einschließlich 1 bis 6, bevorzugt einschließlich 2 bis 4, und R⁵ ist eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(i) D-Biotin;
(ii) β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid,
(iii) N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin,
(iv) N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin,
(v) 5-Methyltetrahydrofoliat,
(vi) Folsäure,
(vii) Folinsäure,
(viii) α-3'-Propionylthiomannosid, und
(ix) α-3'-Propionylthiomannosid-6-phosphat.

Es ist bevorzugt, dass, R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff sind und, wie angegeben, dass j' 2 bis 6 ist. Somit ist die kürzere Alkyl-Brückengruppe bevorzugt Ethyl, n-Propyl oder n-Butyl, und die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente ist an die terminale Aminogruppe gebunden.
Da die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente ebenfalls vorliegen muss, sind Beispiele von bevorzugten Transfer-Resten der vorliegenden Erfindung, wo die Rezeptorspezifische Bindungskomponente eine Galactosylgruppe, wie oben beschrieben, darstellt:

Somit wurde oben detailliert der multifunktionelle molekulare Komplex der vorliegenden Erfindung zum Transfer von Nukleinsäurezusammensetzungen in eine Zielzelle beschrieben.
Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zum Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung zu Zielzellen auf einer in-vitro-Basis. In diesem Verfahren werden Zielzellen mit einem multifunktionellen molekularen Komplex in Kontakt gebracht, die die Nukleinsäurezusammensetzung umfassen. In einem Beispiel wurden die Zielzellen von einem Individuum isoliert und sämtliche Zellen sind somit vom selben Typ, und es ist daher nicht notwendig für den Komplex, dass er eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente umfasst. In einem weiteren Beispiel wird eine Mikroorganismuskultur unter Fermentationsbedingungen versorgt und ein Proteinprodukt wird durch den Mikroorganismus als Ergebnis des Transfers von Nukleinsäurezusammensetzungen unter Verwendung des multifunktionellen molekularen Komplexes der vorliegenden Erfindung exprimiert. Das Proteinprodukt wird isoliert und gereinigt. Hier wird wieder ein einzelner Typ einer Zielzelle einbezogen, so dass es nicht notwendig ist, dass eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente vorliegt.
Dieses Verfahren liefert den Transfer zu Zielzellen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die entweder ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert oder als Matrize für funktionelle Nukleinsäuremoleküle dient. Das gewünschte Protein oder funktionelle Nukleinsäuremolekül kann jedes in einem Produkt von industriellem, kommerziellem oder wissenschaftlichem Interesse sein, z.B. therapeutische Mittel, einschließlich Vakzine; Nahrungsmittel und Ernährungsergänzungen; Verbindungen von landwirtschaftlicher Bedeutung, wie Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren, Insektizide, Milben-tötende Mittel, Rodentizide und Fungizide, Verbindungen, verwendbar für die Tiergesundheit, wie parasitäre Mittel, einschließlich nematizide Mittel usw. Die Zielzellen sind typischerweise Kulturen von Wirtszellen, umfassend Mikroorganismuszellen, wie Bakterien und Hefe, können aber ebenfalls Pflanzen und Säugetierzellen umfassen. Die Zellkulturen werden entsprechend im Stand der Technik gut bekannten Fermentationstechniken versorgt, was die Produktion des gewünschten Proteins oder funktionellen Nukleinsäuremoleküls maximiert, und die Fermentationsprodukte werden durch bekannte Verfahren geerntet und gereinigt.
Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zum Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung zu den Zellen eines Individuums in einer in-vivo-Art und Weise. Das Verfahren umfasst den Schritt des in Kontaktbringens von Zellen des Individuums mit einem multifunktionellen molekularen Komplex der vorliegenden Erfindung, der die Nukleinsäurezusammensetzung umfasst. Hier umfasst das Nukleinsäuremolekül wieder eine Nucleotid-Sequenz, die entweder ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert oder als Matrize für funktionelle Nukleinsäuremoleküle dient. Das Nukleinsäuremolekül wird ohne retrovirale Partikel verabreicht. Das gewünschte Protein kann entweder ein Protein sein, das im Individuum funktioniert oder dazu dient, eine Immunreaktion auszulösen.
Das Nukleinsäuremolekül kann zu den Zellen des Individuums entweder auf einer in-vivo- oder ex-vivo-Basis verabreicht werden, d. h. der Kontakt mit den Zellen des Individuums kann im Körper des Individuums gemäß den Verfahren, die am typischsten eingesetzt werden, stattfinden, oder der Kontakt mit den Zellen des Individuums kann außerhalb des Körpers des Individuums durch Entnehmen von Zellen stattfinden, von denen es erwünscht ist, dass sie aus dem Körper des Individuums durch verschiedene geeignete Mittel behandelt werden, gefolgt von in Kontaktbringen der Zellen mit dem Nukleinsäuremolekül, gefolgt seinerseits von Rückführen der Zellen zum Körper des Individuums.
Das Verfahren des Transferierens einer Nukleinsäurezusammensetzung in Zellen eines Individuums, wie hier beschrieben, umfasst insbesondere ein Verfahren zum Immunisieren eines Individuums gegen ein Pathogen. In diesem Verfahren umfasst die Nukleinsäurezusammensetzung, die den Zellen verabreicht wird eine Nucleotid-Sequenz, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop aufweist, das identisch oder im wesentlichen ähnlich zu einem Epitop ist, das auf dem Pathogen als Antigen vorliegt, und die Nucleotid-Sequenz ist funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verknüpft. Das Nukleinsäuremolekül muss natürlich in der Lage sein, in den Zellen des Individuums exprimiert zu werden.
Das Verfahren zum Transferieren einer Nukleinsäurezusammensetzung zu Zellen eines hier beschriebenen Individuums umfasst ferner Verfahren zum Immunisieren eines Individuums gegen eine hyperproliferative Erkrankung oder eine Autoimmunerkrankung. In derartigen Verfahren umfasst die Nukleinsäurezusammensetzung, die den Zellen des Individuums verabreicht wird, eine Nucleotid-Sequenz, die ein Peptid kodiert, das mindestens ein Epitop umfasst, das identisch oder im wesentlichen ähnlich einem Epitop ist, das auf einem mit einer hyperproliferativen Erkrankung in Zusammenhang stehenden Protein vorliegt bzw. auf einem mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang stehenden Protein und wird funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen verknüpft. Hier muss das Nukleinsäuremolekül wieder in der Lage sein, in den Zellen des Individuums exprimiert zu werden.
Es sind ebenfalls Verfahren zum Behandeln eines Individuums beschrieben, das unter einer Autoimmunerkrankung leidet, worin die Zellen des Individuums mit einem multifunktionellen molekularen Komplex in Kontakt gebracht werden, einschließlich einer Nukleinsäurezusammensetzung, wobei ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die die Aktivität eines fehlenden, defekten oder inhibierten Gens wiederherstellt, oder das ein Protein kodiert, das einen therapeutischen Effekt in dem Individuum erzeugt, verabreicht wird, und das mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, wobei das Nukleinsäuremolekül in der Lage ist, in den Zellen exprimiert zu werden.
Um die oben beschriebenen Verfahren durchzuführen, liefert die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die den multifunktionellen molekularen Komplex, einschließlich einer Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, genauso wie pharmazeutisch akzeptable Salze und Ester-Formen des molekularen Komplexes, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Ebenfalls beschrieben sind Kits, die einen Behälter aufweisen, umfassend eine Nukleinsäurezusammensetzung sowie einen Behälter, umfassend einen Transfer-Rest, wie hier beschrieben. Optional sind in derartigen Kits Hilfsstoffe, Träger, Konservierungsmittel und Vehikel, wie Lösungsmittel, enthalten.
Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die ein Individuum prophylaktisch und/oder therapeutisch gegen ein Pathogen oder abnormale krankheitsbezogene Zellen immunisieren. Das genetische Material kodiert ein Peptid oder Protein, das mindestens ein Epitop mit einem immunogenen Protein, gefunden auf dem Pathogen oder den abzielenden Zellen, teilt. Das genetische Material wird durch die Zellen des Individuums exprimiert und dient als ein immunogenes Ziel, gegen das eine Immunantwort ausgelöst wird. Die resultierende Immunantwort erfolgt auf breiter Basis: Zusätzlich zu einer humoralen Immunantwort werden beide Arme der zellulären Immunantwort ausgelöst. Die hier beschriebenen Verfahren sind verwendbar, um prophylaktisch und therapeutisch Immunität zu verleihen. Somit umfasst ein Verfahren zur Immunisierung beide Verfahren des Schutzes eines Individuums vor pathogenem Angriff oder Auftreten oder Proliferation von spezifischen Zellen, genauso wie Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das unter einer pathogenen Infektion, hyperproliferativen Erkrankung oder Autoimmunerkrankung leidet. Somit sind diese Verfahren verwendbar, um breite Immunantworten gegen ein Zielprotein auszulösen, d.h. Proteine, die speziell mit Pathogenen in Zusammenhang stehen oder die dem Individuum eigenen "abnormalen" Zellen.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls verwendbar zur Bekämpfung hyperproliferativer Erkrankungen und Störungen, wie Krebs, durch Auslösen einer Immunantwort gegen ein Zielprotein, das speziell mit den hyperproliferativen Zellen in Zusammenhang steht. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin verwendbar zur Bekämpfung von Autoimmunerkrankungen und Störungen durch Auslösen einer Immunantwort gegen ein Zielprotein, das spezifisch in Zusammenhang steht mit Zellen, die in den Autoimmunzustand einbezogen sind.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Gentherapie. Diese umfasst Zusammensetzungen zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in die Zellen eines Individuums, die exogene Kopien von Genen darstellen, die entweder defekten, fehlenden oder nicht funktionierenden oder partiell funktionierenden Genen im Individuum entsprechen, oder die therapeutische Proteine kodieren, d. h. Proteine, deren Gegenwart im Individuum ein Defizit im Individuum eliminiert und/oder deren Gegenwart einen therapeutischen Effekt auf das Individuum liefert. Es wird somit ein Mittel zum Freisetzen eines derartigen Proteins bereitgestellt, das ein geeignetes und sogar bevorzugtes alternatives Mittel darstellt, um dem Individuum direkt das Protein zu verabreichen.
Wie hier verwendet, soll der Begriff "gewünschtes Protein" sich auf Peptide und Proteine beziehen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Genkonstrukte kodieren, die entweder als Zielproteine für eine Immunantwort dienen oder als Therapeutikum oder Kompensationsprotein in Gentherapie-Kuren.
Unter Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird DNA oder RNA, die ein gewünschtes Protein kodiert, in die Zellen eines Individuums eingeführt, wo diese exprimiert und somit das gewünschte Protein erzeugt wird. Die Nukleinsäurezusammensetzung, z.B. DNA oder RNA, die das gewünschte Protein kodieren, ist mit regulatorischen Elementen verknüpft, die für die Expression in den Zellen des Individuums notwendig sind. Regulatorische Elemente für DNA-Expression umfassen einen Promotor und ein Polyadenylierungssignal. Zusätzlich können andere Elemente, wie eine Kozak-Region, ebenfalls in der Nukleinsäurezusammensetzung enthalten sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Nukleinsäurezusammensetzung" auf die DNA oder RNA oder andere Nukleinsäuremoleküle, die eine Nucleotid-Sequenz umfassen, die das gewünschte Protein kodieren und die Initiations- und Terminationssignale enthalten, die mit regulatorischen Elementen funktionsfähig verknüpft sind, einschließlich eines Promotors und eines Polyadenylierungssignals, das in der Lage ist, die Expression in den Zellen des Individuums, dem das Konstrukt verabreicht wird, zu regulieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "exprimierbare Form" auf Genkonstrukte, die die notwendigen regulatorischen Elemente enthalten, die mit einer Kodierungssequenz, die ein Zielprotein kodiert, funktionsfähig verknüpft sind, derart, dass, wenn sie in der Zelle des Individuums vorliegen, die Kodierungssequenz exprimiert wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "genetisches Vakzin" auf eine pharmazeutische Zubereitung, die eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, die eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die ein Zielprotein kodiert, einschließlich pharmazeutischer Zubereitungen, die verwendbar sind, um eine therapeutische Immunreaktion hervorzurufen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "genetisch therapeutisch" auf eine pharmazeutische Zubereitung, die eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, die eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die ein therapeutisches oder kompensierendes Protein kodiert.
Alternativ kann ein genetisches Therapeutikum Antisense-Sequenzen kodieren, die unerwünschte Genexpression inhibiert. Weiterhin können genetische Therapeutika Ribozyme kodieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Zielprotein" auf ein Protein, gegen das eine Immunantwort ausgelöst werden kann. Das Zielprotein ist ein immunogenes Protein, das mindestens ein Epitop mit einem Protein aus dem Pathogen oder unerwünschten Zell-Typ teilt, wie eine Krebszelle, oder eine in eine Autoimmunerkrankung einbezogene Zelle, gegen die Immunisierung erforderlich ist. Die gegen das Zielprotein gerichtete Immunantwort schützt das Individuum gegen und behandelt das Individuum für die spezifische Infektion oder Erkrankung, mit der das Zielprotein in Zusammenhang steht.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Teilen eines Epitops" auf Proteine, die mindestens ein Epitop umfassen, das identisch oder im wesentlichen ähnlich zu einem Epitop eines weiteren Proteins ist. Und der Begriff "im wesentlichen ähnliches Epitop" bedeutet, dass auf ein Epitop Bezug genommen wird, das eine Struktur aufweist, die nicht identisch ist mit einem Epitop eines Proteins, aber nichtsdestoweniger eine zellulare oder humorale Immunantwort hervorruft, die mit dem Protein kreuzreagiert.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "therapeutisches Protein", dass auf Proteine Bezug genommen wird, deren Anwesenheit dem Individuum einen therapeutischen Vorteil verleiht.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Kompensierungsprotein", dass auf Proteine Bezug genommen wird, deren Anwesenheit das Fehlen eines vollständig funktionierenden endogen erzeugten Proteins aufgrund eines fehlenden, defekten, nicht funktionierenden oder partiell funktionierenden endogenen Gens kompensiert.
Wenn von einer Zielzelle aufgenommen, kann eine in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Nukleinsäurezusammensetzung, die die Nucleotid-Sequenz enthält, die das gewünschte Protein kodiert, das mit regulatorischen Elementen funktionsfähig verknüpft ist, in der Zelle als funktionierendes extrachromosomales Molekül verbleiben, oder es kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. DNA kann in Zellen eingeführt werden, wo diese als separates genetisches Material in Form eines Plasmids verbleibt. Alternativ kann lineare DNA, die in das Chromosom integriert werden kann, in die Zielzelle eingeführt werden. Wenn DNA in die Zelle eingeführt wird, können Reagenzien, die die DNA-Integration in Chromosomen fördern, zugegeben werden. DNA-Sequenzen, die verwendbar sind, um die Integration zu fördern, können ebenfalls in das DNA-Molekül einbezogen werden. Alternativ kann der Zelle RNA verabreicht werden. Es ist ebenfalls zu berücksichtigen, die Nukleinsäurezusammensetzung als ein lineares Minichromosom bereitzustellen, einschließlich eines Centromers, Telomeren und einem Replikationsstamm. Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe "DNA-Konstrukt", "Nukleinsäurezusammensetzung" und "Nucleotid-Sequenz" sowohl auf DNA- als auch RNA-Moleküle.
Die für die Genexpression eines DNA-Moleküls notwendigen regulatorischen Elemente umfassen: Einen Promotor, ein Initiationskodon, ein Stopp-Kodon und ein Polyadenylierungssignal. Zusätzlich werden häufig verstärkende Mittel für die Genexpression erforderlich. Es ist notwendig, dass diese Elemente mit der Sequenz, die die gewünschten Proteine kodiert, funktionsfähig verknüpft sind, und dass die regulatorischen Elemente im Individuum, dem sie verabreicht werden, funktionsfähig sind.
Initiationskodons und Stopp-Kodons werden im allgemeinen als Teil einer Nucleotid-Sequenz angesehen, die das gewünschte Protein kodiert. Es ist jedoch notwendig, dass diese Elemente im Individuum, dem das Genkonstrukt verabreicht wird, funktionieren. Die Initiations- und Terminationskodons müssen mit den Kodierungssequenzen im Raster sein. Promotoren und verwendete Polyadenylierungssignale müssen ebenfalls in den Zellen des Individuums funktionsfähig sein.
Beispiele von mit den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäurezusammensetzungen verwendbaren Promotoren, insbesondere bei Herstellung eines genetischen Vakzins für Menschen, umfassen, sind aber nicht beschränkt, auf Promotoren vom Simian-Virus 40 (SV40), Maus-mammärer Tumorvirus(MMTV)-Promotor, Humanimmun-Defektvirus (HIV), wie dem HIV-Long-Terminal-Repeat(LTR)-Promotor, Moloney-Virus, ALV, Cytomegalinvirus (CMV), wie der CMV-unmittelbar frühe Promotor, Epstein-Barr-Virus (EBV), Rous-Sarcoma-Virus (RSV), genauso wie Promotoren von Humangenen, wie humanes Actin, humanes Myosin, humanes Hämoglobin, humanes Muskelkreatin und humanes Metalothionein.
Beispiele von mit der in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Nukleinsäurezusammensetzungen verwendbaren Polyadenylierungssignalen, insbesondere bei Herstellung eines genetischen Vakzins für Menschen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, SV40-Polyadenylierungssignale und LTR-Polyadenylierungssignale. Insbesondere kann das SV40-Polyadenylierungssignal, das im pCEP4-Plasmid (Invitrogen, San Diego, CA) vorliegt, bezeichnet als das SV40-Polyadenylierungssignal, verwendet werden.
Zusätzlich zu den für die Nukleinsäuremolekül-Expression erforderlichen regulatorischen Elemente können andere Elemente ebenfalls in das DNA-Molekül einbezogen sein. Derartige zusätzliche Elemente umfassen verstärkende Mittel. Die verstärkenden Mittel können ausgewählt sein aus der Gruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: humanes Actin, humanes Myosin, humanes Hämoglobin, humanes Muskelkreatin, und virale Verstärker, wie jene von CMV, RSV und EBV.
Nukleinsäurezusammensetzungen können mit Säugetier-Replikations-Startpunkten bereitgestellt werden, um das Konstrukt extrachromosomal zu erhalten und multiple Kopien des Konstrukts in der Zelle zu erzeugen. Die Plasmide pCEP4 und pREP4 aus Invitrogen (San Diego, CA) enthalten den Epstein-Barr-Virus-Replikations-Start, und die Nuklear-Antigen-EBNA-1-Kodierungsregion, die große Kopien episomaler Replikation ohne Integration erzeugt. In Aspekten der Erfindung, die sich auf die Gentherapie beziehen, sind Konstrukte mit Replikations-Startpunkten, einschließlich der notwendigen Antigene zur Aktivierung, bevorzugt.
In anderen Verwendungen der vorliegenden Erfindung, die sich auf Immunisierungsanwendungen beziehen, enthält die Nukleinsäurezusammensetzung Nucleotid-Sequenzen, die ein Ziel-Protein kodieren, und weiterhin Gene für Proteine enthalten, die die Immunreaktion gegen derartige Ziel-Proteine verstärken. Beispiele derartiger Gene sind jene, die Cytokine und Lymphokine kodieren, wie α-Interferon, γ-Interferon, von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermale Wachstumsfaktoren (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12. In einigen Verwendungen ist es bevorzugt, dass das Gen für GM-CSF in für Immunisierungszusammensetzungen verwendeten Nukleinsäurezusammensetzungen enthalten ist.
Ein zusätzliches Element kann zur Nukleinsäurezusammensetzung zugegeben werden, das als Ziel für die Zellzerstörung dient, wenn es erwünscht ist, aus irgendwelchen Gründen, die die Nukleinsäurezusammensetzung aufnehmenden Zellen zu eliminieren. Ein Herpes-Thymidin-Kinase(tk)-Gen kann in einer exprimierbaren Form in der Nukleinsäurezusammensetzung enthalten sein. Der Arzneistoff Gangcyclovir kann dann dem Individuum verabreicht werden, und der Arzneistoff verursacht die selektive Abtötung jeglicher tk-produzierender Zelle, wodurch die Mittel für die selektive Zerstörung der Zellen, die die Nukleinsäurezusammensetzung enthalten, bereitgestellt werden.
Um die Protein-Produktion zu maximieren, können regalutorische Sequenzen ausgewählt werden, die für die Genexpression in Zellen, in die das Konstrukt transferiert wird, gut geeignet sind. Darüber hinaus können Kodons ausgewählt werden, die in der Zielzelle am effektivsten transkribieren. Einer mit durchschnittlichem Können im Stand der Technik kann ohne weiteres DNA-Konstrukte erzeugen, die in den Zielzellen funktionieren.
Nukleinsäurezusammensetzungen können auf in-vitro-Expressionslevels getestet werden, indem Gewebekultur von Zellen desselben zu behandelnden Typs getestet werden. Wenn beispielsweise das genetische Vakzin humanen Muskelzellen zu verabreichen ist, können in Kultur gezüchtete Zellen, wie feste Muskeltumorzellen von Rhabdomyosarcoma als in-vitro-Modell verwendet werden, um den Expressionslevel zu messen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäurezusammensetzungen sind nicht in retroviralen Partikeln einbezogen. Die Nukleinsäurezusammensetzungen werden durch die Zelle auf retrovirale Partikel-vermittelte Insertion aufgenommen, so wie diejenige, die auftritt, wenn Retrovirus-Partikeln mit retroviraler RNA eine Zelle infizieren. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "frei von retroviralen Partikeln" auf Nukleinsäurezusammensetzungen, die nicht in retroviralen Partikeln einbezogen sind. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "dissoziiert aus einem infektiösen Mittel" auf genetisches Material, das nicht Teil eines viralen, bakteriellen oder eukaryotischen Vektors ist, egal ob aktiv oder inaktiv lebend oder tot, der in der Lage ist, eine Zelle zu infizieren.
In einigen Ausführungsformen stellen die Nukleinsäurezusammensetzungen weniger als ein vollständiges, replizierbares virales Genom dar, so dass bei Einführung in die Zelle die Nukleinsäurezusammensetzung unzureichende genetische Information besitzt, um eine direkte Erzeugung von infektiösen viralen Partikeln zu steuern. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "unvollständiges virales Genom" auf eine Nukleinsäurezusammensetzung, die weniger als ein vollständiges Genom enthält, so dass Einbeziehung einer derartigen Nukleinsäurezusammensetzung in eine Zelle nicht die Einführung von ausreichender genetischer Information zur Erzeugung eines infektiösen Virus darstellt.
In einigen Ausführungsformen kann ein abgeschwächtes virales Vakzin als Nukleinsäurezusammensetzung bereitgestellt werden, das genug genetisches Material enthält, um die Erzeugung von viralen Partikeln zu erlauben. Die Bereitstellung des abgeschwächten Vakzins als Nuklein säurezusammensetzung erlaubt die Erzeugung großer Mengen an sicherem, reinem und aktivimmunisierendem Produkt.
Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um ein Individuum gegen sämtliche Pathogene, wie Viren, prokaryotische und pathogene eukaryotische Organismen, wie einzellige pathogene Organismen und mehrzellige Parasiten zu immunisieren. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere verwendbar, um ein Individuum gegen solche Pathogene, die Zellen infizieren und die nicht eingekapselt sind, wie Viren und Prokaryoten, wie Gonorrhoea, Listeria und Shigella, zu immunisieren. Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung ebenfalls verwendbar zur Immunisierung eines Individuums gegen Protozoan-Pathogene, einschließlich irgendeiner Stufe in ihrem Lebenszyklus, in dem sie intrazelluläre Pathogene darstellen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "intrazellulares Pathogen" auf ein Virus oder einen pathogenen Organismus, der während mindestens einem Teil seiner Reproduktivität oder seines Lebenszyklus in einer Wirtszelle existiert und darin pathogene Proteine erzeugt oder deren Erzeugung hervorruft. Tabelle 1 liefert eine Auflistung von einigen viralen Familien und Gattungen, für die erfindungsgemäße Vakzine hergestellt werden können. DNA-Konstrukte, die DNA-Sequenzen umfassen, die die Peptide kodieren, die mindestens ein mit einem Epitop, das auf einem pathogenen Antigen vorliegt, identisch oder im wesentlichen ähnlich sind, wie jene in der Tabelle aufgelisteten Antigene, sind verwendbar in Vakzinen.
Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung ebenfalls verwendbar, um ein Individuum gegen andere Pathogene, einschließlich prokaryotische und eukaryotische Protozoan-Pathogene genauso wie mehrzellige Parasiten, wie denen in Tabelle 2 aufgelisteten, zu immunisieren.
Um ein genetisches Vakzin zu erzeugen, um gegen pathogene Infektion zu schützen, muss genetisches Material, das immunogene Proteine kodiert, gegen die eine protektive Immunantwort eingeführt werden kann, in der Nukleinsäurezusammensetzung enthalten sein. Ob das Pathogen intrazellulär infiziert, wofür die vorliegende Erfindung insbesondere verwendbar ist, oder extrazellulär, es ist unwahrscheinlich, dass sämtliche pathogenen Antigene eine protektive Reaktion hervorrufen. Da DNA und RNA beide relativ klein sind und relativ einfach hergestellt werden können, liefert die vorliegende Erfindung den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Impfung mit multiplen pathogenen Antigenen erlaubt. Die im genetischen Vakzin verwendete Nukleinsäurezusammensetzung kann genetisches Material enthalten, das viele pathogene Antigene kodiert. Beispielsweise können mehrere virale Gene in einem einzelnen Konstrukt enthalten sein, wodurch multiple Ziele bereitgestellt werden. Zusätzlich können multiple Impfmaterialien, die für verschiedene Zellen in einem Individuum bereitgestellt werden können, hergestellt werden, um insgesamt in einigen Fällen einen vollständigen oder noch bevorzugter einen unvollständigen, z.B. fast vollständigen Satz an Genen im Vakzin zu enthalten. Beispielsweise kann ein kompletter Satz an viralen Genen unter Verwendung von zwei Konstrukten verabreicht werden, die jeweils eine verschiedene Hälfte des Genoms enthalten, das an verschiedenen Stellen verabreicht wird.
Somit kann eine Immunantwort gegen jedes Antigen hervorgerufen werden, ohne Gefahr, dass ein infektiöser Virus eingebaut wird. Dies ermöglicht die Einführung von mehr als einem Antigen-Ziel und kann das Erfordernis eliminieren, protektive Antigene zu identifizieren.
Die Einfachheit der Handhabung und die kostengünstige Natur von DNA und RNA ermöglichen weiterhin effizientere Mittel zum Screenen auf protektive Antigene. Die Gene können sortiert und systematisch sehr viel einfacher getestet werden als Proteine. Wenn einmal die pathogenen Mittel und Organismen für ein protektives Vakzin ausgewählt sind, wird dann ein immunogenes Protein identifiziert. Die Tabellen 1 und 2 umfassen Listen von einigen pathogenen Mitteln und Organismen, für die genetische Vakzine hergestellt werden können, um ein Individuum vor Infektion durch diese zu schützen. Die Verfahren der Immunisierung eines Individuums gegen ein Pathogen können insbesondere gegen HIV, HTLV oder HBV gerichtet sein.
Hier ist ebenfalls ein Verfahren beschrieben, das eine protektive Immunantwort gegen hyperproliferative Zellen, die für hyperproliferative Erkrankungen charakteristisch sind, auf breiter Basis verleiht, genauso wie ein Verfahren zur Behandlung von Individuen, die unter hyperproliferativen Erkrankungen leiden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "hyperproliferative Erkrankungen" auf jene Erkrankungen und Störungen, die durch Hyperproliferation von Zellen gekennzeichnet sind. Beispiele von hyperproliferativen Erkrankungen umfassen alle Formen von Krebs und Psoriasis.
Es wurde festgestellt, dass die Einführung einer Nukleinsäurezusammensetzung, die eine Nucleotid-Sequenz enthält, die ein immunogenes mit "hyperproliferativen Zellen" in Zusammenhang stehendes Protein in der Zelle eines Individuums kodiert, in der Erzeugung dieser Proteine in den vakzinierten Zellen eines Individuums resultiert. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "mit der Hyperproliferation in Zusammenhang stehendes Protein" auf Proteine, die mit einer hyperproliferativen Erkrankung in Zusammenhang stehen. Um gegen hyperproliferative Erkrankungen zu immunisieren, wird eine Nukleinsäurezusammensetzung, die eine Nucleotid-Sequenz enthält, die ein Protein kodiert, das mit einer hyperproliferativen Erkrankung in Zusammenhang steht, an ein Individuum verabreicht.
Damit das mit der Hyperproliferation in Zusammenhang stehende Protein ein effektives immunogenes Ziel darstellt, muss es ein Protein sein, das, verglichen mit normalen Zellen, ausschließlich oder in hohen Niveaus in hyperproliferativen Zellen erzeugt wird. Ziel-Antigene umfassen derartige Proteine, Fragmente hiervon und Peptide, die mindestens ein auf derartigen Proteinen gefundenes Epitop umfassen. In einigen Fällen ist das mit der Hyperproliferation in Zusammenhang stehende Protein das Produkt einer Mutation eines Gens, das ein Protein kodiert. Das mutierte Gen kodiert ein Protein, das fast identisch ist mit dem normalen Protein, außer dass es eine leicht verschiedene Aminosäure-Sequenz aufweist, was in einem anderen nicht auf dem normalen Protein zu findenden Epitop resultiert. Derartige Zielproteine umfassen jene mit einem Protein, die Onkogene kodieren, wie myb, myc, fyn, und die Translokationsgene bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk und EGRF. Zusätzlich zu onkogenen Produkten als Ziel-Antigene enthalten sie Ziel-Proteine für Anti-Krebsbehandlungen und Schutzkuren variabler Regionen von Antikörpern, hergestellt durch B-Zell-Lymphomas und variable Regionen von T-Zell-Rezeptoren von T-Zell-Lymphomas, die in einigen Ausführungsformen ebenfalls als Ziel-Antigene für Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Andere mit Tumoren in Zusammenhang stehende Proteine können als Ziel-Proteine verwendet werden, wie Proteine, die mit höheren Niveaus in Tumorzellen gefunden werden, einschließlich des Proteins, das den monoklonalen Antikörper 17-1A erkennt, und Foliat-Bindungsproteine.
Während die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, um ein Individuum gegen ein oder mehrere verschiedene Formen von Krebs zu immunisieren, ist die vorliegende Erfindung insbesondere verwendbar, um ein Individuum prophylaktisch zu immunisieren, das prädisponiert ist, um einen speziellen Krebs zu entwickeln, oder das Krebs hatte und daher für einen Rückfall empfindlich ist. Entwicklungen in der Genetik und Biotechnologie genauso wie in der Epidemiologie erlauben die Bestimmung von Möglichkeiten und Gefahrbeurteilung für die Entwicklung von Krebs in einem Individuum. Unter Verwendung von genetischem Screening und/oder Familiengesundheitshistorie ist es möglich, die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass ein spezielles Individuum zur Entwicklung von einem oder mehreren Krebs-Typen neigt.
In ähnlicher Weise neigen diese Individuen, die bereits Krebs entwickelt haben und die behandelt wurden, um Krebs zu beseitigen, und ansonsten in Remission sind, insbesondere zum Rückfall und Wiederauftreten. Als Teil einer Behandlungskur können derartige Individuen gegen den Krebs immunisiert werden, der bei ihnen diagnostiziert wurde, um ein derartiges Wiederauftreten zu bekämpfen. Wenn daher einmal bekannt ist, dass Individuen einen Krebs-Typ hatten und für einen Rückfall gefährdet sind, können sie immunisiert werden, um ihre Immunsysteme vorzubereiten, jedes zukünftige Auftreten von Krebs zu bekämpfen.
Ebenfalls beschrieben ist hier ein Verfahren zur Behandlung von Individuen, die unter hyperproliferativen Erkrankungen leiden. In derartigen Verfahren dient die Einführung von Nukleinsäurezusammensetzungen als ein Immuntherapeutikum, das das Immunsystem des Individuums reguliert und fördert, um die hyperproliferativen Zellen, die das Ziel-Protein erzeugen, zu bekämpfen.
Es ist ein Verfahren zur Behandlung von Individuen offenbart, die unter Autoimmunerkrankungen und Störungen leiden, indem eine protektive Immunantwort auf breiter Basis gegen Ziele verliehen wird, die mit Autoimmunität in Zusammenhang stehen, einschließlich Zellrezeptoren und Zellen, die "selbst" gerichtete Antikörper erzeugen.
T-Zellen-vermittelte Autoimmunerkrankungen umfassen rheumatoide Arthritis (RA), Multiple Sklerose (MS), Sjogren's Syndrom, Sarcoidose, Insulin-abhängige Diabetes mellitus (IDDM), autoimmune Thyroiditis, reaktive Arthritis, Ankylosing Spondylitis, Skleroderma, Polymyositis, Dermatomyositis, Psoriasis, Vaskulitis, Wegener's Granulomatosis, Crohn's Erkran kung und ulcerative Colitis. Jede dieser Erkrankungen ist gekennzeichnet durch T-Zellen-Rezeptoren, die an endogene Antigene binden und die die entzündliche Kaskade, die mit den Autoimmunerkrankungen verbunden ist, auslösen. Eine Impfung gegen die variablen Bereiche der T-Zellen würde eine Immunreaktion, einschließlich CTL hervorrufen, um diese T-Zellen zu eliminieren.
In der RA wurden mehrere spezifische variable Regionen von T-Zell-Rezeptoren (TCR) charakterisiert, die in die Erkrankung eingreifen. Diese TCR umfassen Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 und Va-17. Daher ruft die Impfung mit einer Nukleinsäurezusammensetzung, die mindestens eines dieser Proteine kodiert, eine Immunantwort hervor, die Ziel-RA-einbezogene T-Zellen zum Ziel haben. Siehe: Howell, M.D. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 10921–10925; Paliard, X. et al., 1991, Science 253:325–329; Williams, W.V. et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 326–333; jede hiervon wird durch Bezugnahme miteinbezogen.
Bei MS wurden mehrere spezifische variable Regionen von TCR, die die Krankheit bedingen, charakterisiert. Diese TCR umfassen Vβ-7 und Vα-10. Somit ruft eine Impfung mit einer Nukleinsäurezusammensetzung, die mindestens eines dieser Proteine kodiert, eine Immunantwort hervor, die in MS einbezogene T-Zellen zum Ziel hat. Siehe: Wucherpfennig, K.W. et al., 1990, Science 248: 1016–1019; Oksenberg, J.R. et al., 1990, Nature 345: 344–346; jede hiervon wird durch Bezugnahme miteinbezogen.
In Skleroderma wurden mehrere spezifische variable Regionen von TCR charakterisiert, die in der Krankheit eine Rolle spielen. Diese TCR umfassen Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 und Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 und Vα-12. Somit ruft eine Impfung mit einer Nukleinsäurezusammensetzung, die mindestens eines dieser Proteine kodiert, eine Immunantwort hervor, die in Skleroderma einbezogene T-Zellen zum Ziel hat.
Um die Patienten, die unter einer T-Zellen-vermittelten Autoimmunerkrankung leiden, zu behandeln, insbesondere jene, für die die variable Region des TCR nunmehr charakterisiert wurde, kann eine synoviale Biopsie durchgeführt werden. Proben der vorhandenen T-Zellen können genommen werden, und die variable Region dieser TCR unter Verwendung von Standardtechniken identifiziert werden. Genetische Vakzine können unter Verwendung dieser Information hergestellt werden.
B-Zellen-vermittelte Autoimmunerkrankungen, einschließlich Lupus (SLE), Grave's Erkrankung, Myasthenia gravis, Autoimmun-hämolytische Anämie, Autoimmun-Thrombozytopenia, Asthma, Cryoglobulinämie, primäre Gallensklerose und pernitiöse Anämie. Jede dieser Erkrankungen ist durch Antikörper gekennzeichnet, die an endogene Antigene binden, und die eine entzündliche Kaskade, die mit Autoimmunerkrankungen verbunden ist, auslösen. Impfung gegen die variable Region derartiger Antikörper würde eine Immunreaktion auslösen, einschließlich CTL, um diese B-Zellen, die den Antikörper erzeugen, zu eliminieren.
Um einen Patienten zu behandeln, der unter einer B-Zellen-vermittelten Autoimmunerkrankung leidet, muss die variable Region der in die Autoimmunaktivität einbezogenen Antikörper identifiziert werden. Eine Biopsie kann durchgeführt werden und Proben der vorhandenen Antikörper an einer Entzündungsstelle können genommen werden. Die variable Region dieser Antikörper kann unter Verwendung von Standardtechniken identifiziert werden. Genetische Vakzine können unter Verwendung dieser Information hergestellt werden.
Im Falle von SLE nimmt man an, dass ein Antigen DNA ist. Somit können bei gegen SLE zu immunisierenden Patienten ihre Seren auf Anti-DNA-Antikörper gescreent werden, und ein Vakzin kann hergestellt werden, das Nukleinsäurezusammensetzungen enthält, die diese variable Region von in den Seren gefundenen derartigen Anti-DNA-Antikörpern kodiert.
Herkömmliche Strukturmerkmale der variablen Regionen sowohl von TCR als auch Antikörpern sind gut bekannt. Die ein besonderes TCR oder einen Antikörper kodierende DNA-Sequenz kann im allgemeinen gefunden werden, indem man bekannten Verfahren folgt, wie jenes, beschrieben in Kabat et al., 1987, Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, das durch Bezugnahme miteinbezogen wird. Zusätzlich kann ein allgemeines Verfahren zum Klonieren funktionell variabler Regionen von Antikörpern gefunden werden in Chaudhary, V.K. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1066, das durch Bezugnahme miteinbezogen wird.
In den Aspekten der vorliegenden Erfindung, die sich auf Gentherapie beziehen, enthalten die Nukleinsäurezusammensetzungen entweder Kompensierungsgene oder Gene, die therapeutische Proteine kodieren. Beispiele von kompensierenden Genen umfassen ein Gen, das Dystrophin oder ein funktionelles Fragment kodiert, ein Gen, das das defekte Gen in Patienten, die unter zystischer Fibrose leiden, kompensiert, ein Gen, das das defekte Gen in Patienten, die unter ADA leiden, kompensiert, sowie ein Gen, das Faktor-VIII kodiert. Beispiele von Genen, die therapeutische Proteine kodieren, umfassen Gene, die Erythropoetin, Interferon, LDL-Rezeptor, GM-CSF, IL-2, IL-4 und TNF kodieren. Zusätzlich können Nukleinsäurezusammensetzungen, die Einzelketten-Antikörper-Komponenten kodieren, die speziell an toxische Substanzen binden, verabreicht werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das Dystrophin-Gen als Teil eines Minigens bereitgestellt und verwendet, um Individuen, die an muskulärer Dystrophie leiden, zu behandeln. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Minigen bereitgestellt, das eine Kodierungssequenz für ein partielles Dystrophinprotein enthält. Dystrophin-Abnormitäten sind verantwortlich für sowohl die mildere Becker's muskuläre Dystrophie (BMD) als auch die schwere Duchenne's muskuläre Dystrophie (DMD). Bei BMD wird Dystrophin hergestellt, aber es ist abnormal sowohl in Größe und/oder Menge. Der Patient ist schwach bis moderat schwach. Bei DMD wird kein Protein hergestellt, und der Patient ist bis zum Alter von 13 an den Rollstuhl gebunden und stirbt in der Regel im Alter von 20. Bei einigen Patienten, insbesondere jenen, die unter BMD leiden, kann ein partielles Dystrophinprotein, erzeugt durch Ex pression eines Minigens, bereitgestellt entsprechend der vorliegenden Erfindung verbesserte Muskulfunktion liefern.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden IL-2, IL-4, Interferon oder TNF-kodierende Gene an Tumorzellen freigesetzt, die entweder vorliegen oder beseitigt werden und dann in das Individuum wieder eingeführt werden. In einigen Ausführungsformen wird ein γ-Interferon-kodierendes Gen einem Individuum verabreicht, das unter Multipler Sklerose leidet.
Antisense-Moleküle und Ribozyme können ebenfalls den Zellen eines Individuums durch Einführen einer Nukleinsäurezusammensetzung, die als Matrize für Kopien derartiger aktiver Mittel dient, bereitgestellt werden. Diese inaktiven oder sonstigen Mittel interferieren mit der Expression von Genen, die Proteine kodieren, deren Anwesenheit unerwünscht ist. Nukleinsäurezusammensetzungen, die Sequenzen enthalten, die Antisense-Moleküle kodieren, können eingesetzt werden, um die Erzeugung von Proteinen in Zellen zu inhibieren oder zu verhindern. Somit kann die Erzeugung von Proteinen, wie onkogenen Produkten, eliminiert oder verringert werden. In ähnlicher Weise können Ribozyme die Genexpression durch selektive Zerstörung der Messenger-RNA, bevor diese in Proteine translatiert wird, zerstören. Zellen können unter Verwendung von Nukleinsäurezusammensetzungen, die Antisense oder Ribozyme kodieren, als Teil einer therapeutischen Kur, die die Verabreichung von anderen Therapeutika und Verfahren einbezieht, behandelt werden. Nukleinsäurezusammensetzungen, die Antisense-Moleküle und Ribzyme kodieren, verwenden ähnliche Vektoren, wie jene, die verwendet werden, wenn die Proteinerzeugung erwünscht ist, außer dass die Kodierungssequenz kein Startkodon enthält, um die Translation von RNA in Protein auszulösen.
Ribozyme sind katalytische RNA, die zur Selbstspaltung oder Spaltung von weiteren RNA-Molekülen in der Lage sind. Mehrere verschiedene Typen von Ribozymen, wie Hammerhead, Hairpin, Tetrahymenagruppe I Intron, Axhead und RNase P, sind im Stand der Technik bekannt, siehe S. Edgington, Biotechnology (1992), 10, 256–262. Hammerhead-Ribozyme haben eine katalytische Stelle, die bis zu einem Kern von weniger als 40 Nucleotiden kartiert wurde. Mehrere Ribozyme in Pflanzenviroiden und Satelliten-RNA teilen eine gemeinsame sekundäre Struktur sowie bestimmte konservierte Nucleotide. Obwohl diese Ribozyme natürlicherweise als ihre eigenen Substrate dienen, kann die Enzym-Domäne auf ein weiteres RNA-Substrat durch Basenpaarung mit Sequenzflankierung der konservierten Spaltungsstelle zielgerichtet werden. Diese Fähigkeit, geschaffene Ribozyme zu bewahren, erlaubt diesen für Sequenz-spezifische RNA-Spaltung eingesetzt zu werden, siehe G. Paolella et al., EMBO (1992); 1913–1919). Es liegt daher im Können von Jemanden aus dem Stand der Technik, verschiedene katalytische Sequenzen von verschiedenen Typen von Ribozymen zu verwenden, wie die katalytische Hammerhead-Sequenz, und diese in der hier offenbarten An und Weise zu gestalten. Ribozyme können gegen eine Vielzahl von Zielen, einschließlich pathogenen Nucleotid-Sequenzen und onkogenen Sequenzen, gestaltet werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen ausreichende Komplemen tarität gegenüber spezifischen Zielen des abl-bcr-Fusionstranskripts, während die Effizienz der Spaltungsreaktion aufrechterhalten bleibt.
Der multifunktionelle molekulare Komplex der vorliegenden Erfindung, der die gewünschte Nukleinsäurezusammensetzung enthält, kann einem Individuum unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung verabreicht werden. Der multifunktionelle molekulare Komplex, der die gewünschte Nukleinsäurezusammensetzung enthält, kann gleichzeitig einem Individuum intradermal, subkutan und intramuskulär unter Verwendung einer nadellosen Injektionsvorrichtung verabreicht werden. Nadellose Injektionsvorrichtungen sind gut bekannt und in großem Umfang erhältlich. Einer mit durchschnittlichem Können im Stand der Technik kann den Lehren hier folgend nadellose Injektionsvorrichtungen verwenden, um multifunktionelle molekulare Komplexe, die die gewünschten Nukleinsäurezusammensetzungen enthalten, den Zellen eines Individuums zu liefern. Nadellose Injektionsvorrichtungen sind gut geeignet, um diese Komplexe an sämtliche dieser Gewebe bereitzustellen. Sie sind insbesondere verwendbar, um die Komplexe der vorliegenden Erfindung an Haut und Muskelzellen bereitzustellen.
Eine nadellose Injektionsvorrichtung kann eingesetzt werden, um die Komplexe der vorliegenden Erfindung in flüssiger Form, wie DNA-Moleküle, in Richtung der Oberfläche der Haut des Individuums einzubringen. Die Flüssigkeit wird mit einer ausreichenden Geschwindigkeit eingebracht, so dass bei Auftreffen auf die Haut die Flüssigkeit die Oberfläche der Haut penetriert, und die Haut und das darunter liegende Muskelgewebe durchdringt. Somit wird die Nukleinsäurezusammensetzung gleichzeitig intradermal, subkutan und intramuskulär verabreicht.
Eine nadellose Injektionsvorrichtung kann verwendet werden, um Nukleinsäurezusammensetzungen dem Gewebe anderer Organe zuzuführen, um ein Nukleinsäuremolekül an Zellen dieses Organs einzuführen.
Die multifunktionellen molekularen Komplexe der vorliegenden Erfindung, die Nukleinsäurezusammensetzungen enthalten, können direkt in das zu immunisierende Individuum verabreicht werden, oder ex-vivo in entfernte Zellen des Individuums, die nach der Verabreichung reimplantiert werden. Durch beide Wege wird das genetische Material in Zellen eingeführt, die im Körper des Individuums vorliegen. Verabreichungswege umfassen, aber sind nicht begrenzt auf intramuskulär, intraperitoneal, intradermal, subkutan, intravenös, intraarteriell, intraokular und oral, genauso wie transdermal oder Inhalation oder Zäpfchen. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale und subkutane Injektion. Die Bereitstellung von Nukleinsäurezusammensetzungen, die Ziel-Proteine kodieren, verleihen Individuen, die mit einem Verabreichungsweg immunisiert wurden, mucosale Immunität, indem das Material den mit der mucosalen Immunität in Zusammenhang stehenden Geweben verabreicht wird. Somit kann die Nukleinsäurezusammensetzung durch Verabreichung in die Mundhöhle im Mund eines Individuums bereitgestellt werden.
Die multifunktionellen molekularen Komplexe, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäurezusammensetzungen enthalten, umfassen im allgemein etwa 1 Nanogramm bis etwa 1.000 μg DNA. In einigen bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Komplexe etwa 10 Nanogramm bis etwa 800 μg DNA. In besonders bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Komplexe etwa 0,1 bis etwa 500 μg DNA. In noch bevorzugteren Ausführungsformen enthalten die Komplexe etwa 1 bis etwa 350 μg DNA. In noch mehr bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Komplexe etwa 25 bis etwa 250 μg DNA. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Komplexe etwa 100 μg DNA.
Die multifunktionellen molekularen Komplexe, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäurezusammensetzungen enthalten, werden entsprechend dem eingesetzten Verabreichungsweg formuliert. Jemand mit durchschnittlichem Können im Stand der Technik kann ohne weiteres eine pharmazeutische Zusammensetzung formulieren, die eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst. In Fällen, wo intramuskuläre Injektion als Verabreichungsweg ausgewählt wird, wird bevorzugt eine isotonische Formulierung verwendet. Im allgemeinen können isotonische Additive, wie Natriumchlorid, Dextrose, Mannitol, Sorbitol und Lactose enthalten sein. In einigen Fällen sind isotonische Lösungen, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung, bevorzugt. Stabilisatoren umfassen Gelatine und Albumin. In einigen Ausführungsformen wird ein vasokonstriktorisches Mittel zur Formulierung zugegeben. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden hergestellt, um steril und pyrogenfrei zu sein.
Zusätzlich zu anderen Mitteln, die als Transfektionsmittel und/oder Replikationsmittel funktionieren können, können mit den Komplexen der vorliegenden Erfindung Wachstumsfaktoren, Cytokine und Lymphokine, wie α-Interferon, γ-Interferon, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12, genauso fibroblastische Wachstumsfaktoren, oberflächenaktive Mittel, wie immunstimulierende Komplexe (ISCOMS), Freund'sches unvollständiges Adjuvans, LPS-Analoga, einschließlich Monophosphoryllipid A(MPL), Muramylpeptide, Chinon-Analoga und Vesikel, wie Squalin und Hyaluronsäure, verwendet werden, verabreicht in Verbindung mit den Komplexen der vorliegenden Erfindung. In einigen Ausführungsformen werden Kombinationen dieser Mittel in Verbindung mit den Komplexen der vorliegenden Erfindung verabreicht.
Die Komplexe der vorliegenden Erfindung können mit Collagen als einer Emulsion kombiniert und parenteral bereitgestellt werden. Die Collagenemulsion liefert ein Mittel für die verzögerte Freisetzung von DNA; 50 μl bis 2 ml Collagen können verwendet werden. Etwa 100 μg DNA werden mit 1 ml Collagen in einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung dieser Formulierung kombiniert. Andere verzögerte Freisetzungsformulierungen, wie jene beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, einem Standard-Referenztext in diesem Bereich, werden durch Bezugnahme hiermit einbezogen. Derartige Formulierungen umfassen wässerige Suspensionen, ölige Lösungen und Suspensionen, Emulsionen und Implantate, genauso wie Reservoirs, Depots und transdermale Vorrichtungen. In einigen Ausführungsformen sind zeitverzögerte Formulierungen für die Komplexe bevorzugt; wo es wünschenswert ist, kann der Komplex zeitlich verzögert zwischen 6 bis 144 Stunden, bevorzugt 12 bis 96 Stunden, noch bevorzugter 18 bis 72 Stunden, freigesetzt werden.
Das Individuum kann einer Einzelimpfung unterzogen werden, um eine vollständige, breite Immunantwort zu erzeugen. Alternativ kann das Individuum einer Reihe von Impfungen unterzogen werden, um eine vollständige, breite Immunantwort zu erzeugen. Es ist bevorzugt, dass mindestens zwei und bevorzugt vier bis fünf Injektionen über eine Zeitdauer gegeben werden.
Die Zeitdauer zwischen Injektionen können 24 Stunden bis zu 2 Wochen oder länger, bevorzugt 1 Woche, sein. Alternativ werden mindestens zwei bis zu vier getrennte Injektionen gleichzeitig an verschiedenen Stellen gegeben.
Eine vollständige Impfung kann eine Injektion eines einzelnen Impfstoffs sein, der eine Nukleinsäurezusammensetzung enthält, einschließlich Sequenzen, die ein oder mehrere Ziel-Epitope kodieren.
Alternativ kann eine vollständige Impfung Injektionen von zwei oder mehreren verschiedenen Impfstoffen in verschiedene Stellen umfassen. Beispielsweise kann ein HIV-Vakzin zwei verschiedene Impfstoffe umfassen, worin jeder einzelne eine Nukleinsäurezusammensetzung umfasst, die verschiedene virale Proteine kodieren. Dieses Impfverfahren erlaubt die Einführung von so viel wie einem vollständigen Satz an viralen Genen in das Individuum ohne die Gefahr, einen infektiösen viralen Partikel zusammenzustellen. Somit kann eine Immunantwort gegen die meisten oder sämtliche Viren im geimpften Individuum hervorgerufen werden. Die Injektion von jedem Impfstoff wird an verschiedenen Stellen durchgeführt, bevorzugt in einem Abstand, um sicherzustellen, dass keine Zellen die gesamte Kombination von Nukleinsäurezusammensetzungen erhalten. Als weitere Sicherheitsvorkehrung können einige Gene weggelassen oder verändert werden, um weiterhin die Kapazität einer infektiösen viralen Anordnung zu verhindern.
Entsprechend der Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die die Zuführung des multifunktionellen molekularen Komplexes vereinfachen, der seinerseits zum erleichterten Transfer der Nukleinsäurezusammensetzung, die darin enthalten ist, an Zielzellen fungiert. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann nicht mehr sein als ein inertes Verdünnungsmittel sowie ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder eine Ester-Form des molekularen Komplexes. Jedoch können auch andere pharmazeutisch akzeptable Träger, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, geeigneterweise eingesetzt werden, um die gewünschten Eigenschaften zu liefern. Somit können ein oder mehrere Mittel aus den nachfolgend anerkannten pharmazeutischen Klassen von Hilfsstoffen ausgewählt werden: Lösungsmittel, Lösungsmittelsysteme und solubilisierende und dispergierende Mittel, einschließlich Tenside und emulgierende Mittel, viskositätsmodifizierende Mittel und stabilisierende und konservierende Mittel, einschließlich Antioxidantien, UV-absorbierende Mittel, antibakterielle Mittel und Puffermittel.
Es werden hier ebenfalls pharmazeutische Kits offenbart, die einen Behälter aufweisen, umfassend eine Nukleinsäurezusammensetzung, sowie einen Behälter, umfassend einen Transfer-Rest. Optional sind in derartigen Kits Hilfsstoffe, Träger, Konservierungsmittel und Vehikel des oben im Hinblick auf pharmazeutische Zusammensetzungen beschriebenen Typs enthalten. Der pharmazeutische Kit soll ebenfalls in den zuvor erwähnten Verfahren eingesetzte multiple Impfstoffe umfassen.
Derartige Kits umfassen getrennte Behälter, umfassend verschiedene Impfstoffe und Transfer-Reste. Die pharmazeutischen Kits sollen ebenfalls einen Satz an Impfstoffen enthalten, die in den Immunisierungsverfahren und/oder therapeutischen Verfahren, wie oben beschrieben, verwendet werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind im Bereich von sowohl der Human- als auch Tiermedizin verwendbar. Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine genetische Immunisierung und therapeutische Behandlung von Säugetieren, Vögeln und Fischen. Diese hier offenbarten Verfahren können insbesondere für die genetische Immunisierung und therapeutische Behandlung von Säugetier-Spezies, einschließlich Mensch, Rind, Schaf, Schwein, Pferd, Kaninchen und Katzen-Spezies, verwendet werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die nachfolgend dargestellten Beispiele umfassen repräsentative Demonstrationen verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sollen nicht den Schutzumfang der Erfindung begrenzen, sondern eher nur als Veranschaulichung hiervon dienen. Darüber hinaus ist Jemand mit durchschnittlichem Können im Stand der Technik dazu in der Lage, ohne weiteres zusätzliche Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, basierend auf den vorangehend detaillierten Beschreibungen, einzuschätzen. Wenn nicht anders angegeben, sind alle zitierten Temperaturen in den nachfolgenden Beispielen Celsius-Temperaturen.
BEISPIEL 1
Herstellung von N⁴-5'-Aminopentylspermidin-hydrochlorid 8
N⁴-(4-Cyanobutyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (6)
Eine Lösung von N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (2,92 g, 8,45 mmo1, 1,0 Äq.) [S. Nagarajan und B. Ganem, J. Org. Chem., 50, 5735–37 (1985)] in Acetonitril (125 ml) wurden mit N,N-Diisopropylethylamin (3,534 ml, 20,0 mmo1, 2,4 Äq.), Kaliumiodid (2,81 g, 16,90 mmol, 2,0 Äq.) und 5-Chlorvaleronitril (1,902 ml, 16,90 mmo1, 2,0 Äq.) behandelt. Die resultierende homogene Lösung wurde 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Mischung wurde mit zusätzlichem N,N-Diisopropylethylamin (1,767 ml, 1,2 Äq.), Kaliumiodid (1,41 g, 1,0 Äq.) und 5-Chlorvaleronitril (0,951 ml, 1,0 Äq.) behandelt und zusätzlich 18 Stunden unter Rückfluss gekocht. Dünnschichtchromatographie (DSC) zeigte kein verbleibendes Ausgangsmaterial. Das Acetonitril wurde unter Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform (250 ml) aufgenommen. Diese Lösung wurde mit Wasser (200 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), das Lösungsmittel abgezogen, um rohes Produkt als Öl zu erhalten. Das Material wurde auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Gradienten von 2-Propanol in Chloroform + 1% N,N-Diisopropylethylamin gereinigt, um ein Öl zu ergeben (3,40 g); ¹H NMR (CDCl₃): δ 1,44 (s, 20,8H; sollte 18H sein), 1,58–1,80 (m, 9,8H), 2,38 – 2,44 (m, 9,4H; sollte 8,0 H sein), 3,16 (m, 4,1H), 4,80 (m, 0,8H), 5,38 (m 0,8H).
N⁴-(5-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (7)
sEine Lösung 6 (0,77 g, 1,81 mmol) in Eisessig (100 ml) wurde mit 5% Palladium auf Kohlenstoff (0,08 g, 10 Gew.-%) behandelt und auf einen Parr-Hydrogenator für 2,75 Stunden gegeben (50 psi Wasserstoffgasdruck). Die Mischung wurde durch Celite^® Brand-Diatomeenerde-Filterhilfe filtriert (vorgespült mit Eisessig) und die Celite mit Chloroform gespült. Das Filtrat und die Chloroformwäsche wurden kombiniert und das Lösungsmittel entfernt, um ein Öl zu ergeben. Das rohe Material wurde einer Siliciumdioxid-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform + 0,4% Diisopropylethylamin unterzogen. Das Material bestand aus einem farblosen Öl (0,32 g). ¹H NMR (CDCl₃) : δ 1,33 (m, 3,5H; sollte 2,0 H sein), 1,44 (s, 19,1H; sollte 18,0 H sein), 1,59 (m, 10,3H), 2,37 – 2,45 (m, 6,2H), 2,70 (t, 1,5H), 3,14 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 0,7H), 5,57 (m, 0,8H).
N⁴-(5-Aminopentyl)spermidin-hydrochlorid (8)
Verbindung 7 (0,200 g, 0,46 mmol) wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde unter Vakuum entfernt, gefolgt von dreimaliger Chloroform-Zugabe und nachfolgendem Abdampfen unter Vakuum. Das resultierende rohe Öl wurde zweimal in 0,1 N HCl (30 ml) aufgenommen und lyophilisiert, um 8 als einen hygroskopen Feststoff (0,19 g) zu ergeben.
BEISPIEL 2
Herstellung von N⁴-(5-(β-3'-Propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)-aminopentyl)spermidin 9
S-(Succinimidyl-β-3'-propionyl)hepta-O-acetylgalactosyl-β1'4-thioglucosid (10)
Eine Lösung von S-β-3'-Propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid [M. Elofsson, S. Roy, B. Walse und J. Kihlberg, Carb. Res., 246, 89–103 (1993)] (4,60 g, 6,35 mmol) in 1:1 Isopropanol/Chloroform (100 ml) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (0,73 g, 6,35 mmol) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,31 g, 6,35 mmol) behandelt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 19 Stunden wurde die Mischung 1 Stunde auf 4°C gekühlt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat unter Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der aus 2-Propanol (3,43 g) umkristallisiert wurde. Das isolierte Produkt war 92% rein nach Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). ¹H NMR (CDCl₃): δ 2,0–2,16 (7s, 21,0 H), 2,85 (s, 3,8 H), 2,85 – 3,1 (m, 4,2 H), 3,65 (m, 0,7H), 3,78 (t, 1,0 H), 3,88 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,54 (m, 2,8H), 4,97 (m, 1,8H), 5,11 (m, 1,0 H), 5,23 (t, 1,0 H), 5,36 (d, 0,7H).
N⁴-(5-(S-β-3'-Propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (11)
Eine Lösung von 10 (0,300 g, 0,70 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) wurde mit einer Lösung von 7 (0,57 g, 0,70 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) behandelt. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt. Siliciumdioxidchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 2-Propanol in Chloroform ergab ein gereinigtes Produkt als farbloses Glas (0,49 g); Reinheit 100%, bestimmt durch HPLC. ¹H NMR (CDCl₃) : δ 1,33 (m, 3,0 H; sollte 2,0 H sein), 1,44 (s, 20,0 H; sollte 18,0 H sein), 1,54 (m, 10,7 H; sollte 6,0 H sein), 1,68 (m, 2,0 H), 1,97 – 2,16 (7s, 27,3 H; sollte 21,0 H sein), 2,25 (m, 6,0 H; sollte 4H sein), 2,52 (m, 9,0 H; sollte 8,0 H sein), 2,84 (m, 1,0 H), 3,01 (m, 1,0 H), 3,1 – 3,27 (m, 6,7H), 3,64 (m, 1,0 H), 3,80 (t, 1,0 H), 3,90 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,55 (d, 2,0 H), 4,70 (d, 1,0 H), 4,91 – 5,0 (m, 3,0 H; sollte 2,0 H sein), 5,11 (m, 1,3H), 5,21 (t, 1,0 H), 5,36 (d, 1,0 H), 5,44 (m, 0,7H), 6,28 (m, 0,7H). FAB Massenspektrum MH⁺= 1138.
N⁴-(5-(S-β-3'-Propionylhepta-O-acerylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)aminopentyl)spermidintrifluoracetat (12)
Verbindung 11 (0,200 g, 0,18 mmol) wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) behandelt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure (TFA) wurde weitgehend unter Vakuum entfernt und der Rest dreifacher Zugabe von Chloroform unterzogen, gefolgt vom Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum. Das Produkt wurde als Öl (0,22 g) wiedergewonnen mit augenscheinlich Spuren von TFA; Reinheit von 100%, wie bestimmt durch HPLC. ¹H NMR (CDCl₃) : δ 1,25 – 1,53 (m, 5,5 H), 1,6 – 2,0 (m, 5,5; sollte 4H sein), 2,00 – 2,15 (7s, 23,0 H; sollte 21,0 H sein), 2,56 (m, 1,0 H), 2,68 (m, 1,3 H), 2,80 (m, 1,0 H), 3,0 – 3,4 (m, 11,0H; sollte 10,0 H sein), 3,64 (m, 1,0 H), 3,79 (m, 1,0 H), 3,94 (m, 1,0 H), 4,11 (m, 2,5 H), 4,55 (m, 1,5 H), 4,70 (m, 1,3 H), 4,90 – 5,20 (breit m, 16,0 H; verbreitert durch Wasser; sollte 2,0 oder 4,0 H sein), 5,36 (m, 1,0 H), 7,12 (m, 0,5H), 7,86 (m, 2,3H), 8,07 (m, 2,3H), 9,8 (m, 0,5 H).
N⁴-(5-(β-3'-Propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)aminopentyl)spermidin (9)
Eine Lösung von 12 (0,20 g, 0,18 mmol) in Methanol (20 ml) wurde mit Natriumcarbonat (0,38 g, 3,08 mmo1, 18 Äq.) und Wasser (35 ml) für eine homogene Lösung behandelt. Nach 6 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel abgedampft und der Rest unter Verwendung eines Sephadex-G-25-Mediumgel-Filtrationsharzes und 1% Eisessig als Eluierungsmittel entsalzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und lyophilisiert für ein reines Produkt, als dem Triacetatsalz (0,10 g); Reinheit von 100%, wie bestimmt durch HPLC. ¹H NMR (DMSO-d₆ D₂O) : δ 1,15 (m oder breites t: 1,5H), 1,3 – 1,5 (m, 8,0 H), 1,65 (m, 2,0 H), 1,66 (s, 14,0 H; sollte 9,0 H sein), 2,34 (m, 6,5H), 2,60 (m, 3,0 H; sollte 2,0 H sein), 2,74 (m, 6,0 H), 3,00 (m, 3,0 H), 3,27 (m, 3,5 H), 3,40 (m, 1,5 H), 3,47 (m, 2,0 H), 3,50 (m, 1,0 H), 3,60 (m, 1,0 H), 3,71 (d, 1,0 H), 4,14 (breites s, maskiert durch Wasserpeak), 4,27 (m, 4,0H).
BEISPIEL 3
Herstellung von N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermidin-acetatsalz 18
Für Vergleichszwecke ist der CAS-Name der oben dargestellten Verbindung 18 wie folgt: 4-[(N²-[N²,N⁶-Bis(3-[4-O(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosylthio]propionyl)lysyl]-N⁶-(3-[4-O-(β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranosylthio]propionyl)lysinamido)pentyl]-1,8-diamino-4-azaoctan-acetatsalz.
N⁴-(5-[N²N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin (14)
Zu einer Lösung von Lysyllysin (0,25 g, 0,64 mmol) in 1:1 Wasser/Acetonitril (100 ml) wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,336 ml, 1,95 mmol, 3,0 Äq.) und Verbindung 10 (1,859, 2,25 mmol) zugegeben und wenige Minuten bei Raumtemperatur gerührt, bis Homogenität erreicht war. Der pH wurde in regelmäßigen Intervallen genaustens überwacht und N,N-Diisopropylethylamin zugegeben, wenn es gebraucht wurde, um den pH zwischen 7 und 8 zu halten. Insgesamt wurden 7 Äquivalente Base über 1 Stunde zugegeben, bevor sich der pH bei 7 bis 7,5 stabilisierte. Umkehrphasen-HPLC wurde verwendet, um dem Fortschreiten der Reaktion zu folgen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur schien die Reaktion bei etwa 50% Produktbildung gestoppt zu haben. Das Acetonitril wurde unter Vakuum abgedampft und die wässerige Mischung mit verdünnter HCl (pH 5) behandelt. Die Lösung wurde in Chloroform (2 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um ein rohes Produkt als Glas (2,17 g) zu erhalten. Das Material wurde einer Siliciumdioxid-Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform + 1% Eisessig als Eluierungsmittel (1,09 g) unterzogen. Die Reinheit wurde bestimmt durch HPLC mit etwa 96%. FAB Massenspektrum: MH⁺ = 2394.
Succinimidyl-N²,N⁶-bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysine (15)
Eine Lösung von N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysine (1,00 g, 0,42 mmol) in 1:1 Isopropanol/Chloroform (20 ml) wurden mit N-Hydroxysuccinimid (48,1 mg, 0,42 mmol) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (86,2 mg, 0,42 mmol) behandelt. Nach Rühren für 19 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 1 Stunde auf 4°C abgekühlt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat unter Vakuum entfernt, und das rohe Produkt wurde aus 2-Propanol umkristallisiert. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um einen weißen pulverigen Feststoff (0,76 g) zu ergeben. Von diesem Material wurde durch HPLC gezeigt, dass es aus einer Mischung der freien Ausgangsäure und dem Succinimidylester in einem Verhältnis jeweils von etwa 1:2 bestand. Die Mischung wurde keiner weiteren Reinigung unterzogen, sondern wurde im nächsten Schritt verwendet. ¹H NMR (CDCl₃) : δ 1,96 – 2,20 (multiples s, 86,4 H; sollte 63,0 H sein), 2,28 (m, 3,6H), 2,53 (m, 6,6H), 2,88 (m, 6,6H), 3,02 (m, 3,6 H), 3,18 – 3,40 (m, 4,2H), 3,62 (m, 3,6 H), 3,85 (m, 3,6H), 3,95 (m, 3,6H), 4,10 (m, 12,0 H) 4,57 (m, 6,0 H), 4,70 (m, 4,2 H), 5,02 (m, 7,2 H), 5,10 (m, 3,6H), 5,20 (t, 3,6 H), 5,36 (d, 3,0 H), 6,31 (t, 0,6 H), 6,58 (t, 0,6 H), 6,90 (d, 0,6 H), 7,47 (d, 0,6 H).
N⁴,(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acerylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl-N¹,N⁶-bis(tert.-butoxycarbonyl)spermidin (16)
Eine Lösung von 7 (87 mg, 0,20 mmol) in Methylenchlorid (20 ml) wurde mit einer Lösung von 15 (0,76 g in einer 66%igen Mischung, entsprechend 0,50 g des Esters; 0,20 mmol) in Methylenchlorid (20 ml) behandelt. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt vom Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum. Das rohe Produkt wurde durch Siliciumdioxid-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform gereinigt. Das resultierende unreine Produkt bestand aus einer 65:35-Mischung des Produkts aus freier Säure, die als Verunreinigungssubstanz im Ausgangsester vorlag. Eine zweite Silikasäule unter Verwendung desselben Gradienten + 0,5% Eisessig führte effektiv zur Isolierung des reinen Produkts (0,38 g); Reinheit 100%, wie bestimmt durch HPLC. ¹H NMR (CDCl₃) : δ 1,30 – 1,39 (m, 4,0 H), 1,44 (s, 13,5 H; sollte 18,0 H sein), 1,53 (m, 8,6H), 1,60 – 1,90 (m, 6,1 H), 1,97 – 2,16 (multiples s, 73,8 H; sollte 63,0 H sein), 2,27 (m, 3,7 H), 2,49 – 2,70 (m, 8,0 H), 2,85 (m, 2,5 H), 3,00 (m, 2,5H), 3,23 (m, 6,2 H), 3,65 (m, 2,5 H), 3,80 – 3,93 (m, 5,5 H), 4,12 (m, 8,0 H), 4,20 – 4,40 (m, 1,8 H), 4,57 – 4,69 (m, 8,0 H), 4,91 – 5,00 (m, 5,5 H), 5,09 (m, 3,1 H), 5,21 (t, 3,1 H), 5,36 (d, 2,5 H), 6,57 (m, 0,9 H), 6,95 (m, 0,6 H), 7,20 (m, 0,6 H).
N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidin (17)
Verbindung 16 (0,170 g, 0,059 mmol) wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) behandelt und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde weitgehend unter Vakuum entfernt (0,19 g). Die Reinheit wurde mit HPLC mit etwa 100% bestimmt. ¹H NMR (CDCl₃): δ 1,20 – 1,80 (m, 4,8 H), 1,96 – 2,15 (multiples s, 84,0 H; sollte 63,0 H sein), 2,54 (m, 12,0 H; möglicherweise durch Wasserpeak verbreitert), 3,65 (m, 3,0 H), 3,81 (m, 3,0 H), 3,93 (m, 4,0 H), 4,12 (m, 12,0 H), 4,29 (m, 2,0 H), 4,55 (m, 6,0 H), 4,69 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 3,0 H), 5,09 (m, 6,0 H), 5,19 (m, 4,0 H), 5,38 (d, 3,0 H), 6,99 (m, 1,0 H), 7,60 (m, 0,5 H), 7,91 (m, 1,0 H), 8,09 (m, 1,0 H).
N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidin-acetatsalz (18]
Zu einer Lösung von 17 (0,17 g, 0,059 mmol) in Methanol (20 ml) wurde Natriumcarbonat (0,37 g, 2,95 mmol), gefolgt von Wasser (40 ml), zugegeben, bis Homogenität erreicht wurde. Nach dem Rühren für 4 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel abgezogen und das rohe Produkt mit einer Sephadex-G-25-Mediumsäule unter Verwendung von 1%igem Eisessig als Eluierungsmittel eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurde vereinigt und lyophilisiert, um reines Produkt als extrem hygroskopischen Feststoff (0,07 g) zu erhalten.
BEISPIEL 4
Herstellung von N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]-aminopentyl)spermidin-acetatsalz (23)
Succinimidyl-N²,N⁶-Bis(β-3'propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lyin (20)
Eine Lösung von N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin (1,00 g, 0,42 mmol) in 1:1 Isopropanol/Chloroform (20 ml) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (48,1 mg, 0,42 mmol) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (86,2 mg, 0,42 mmol) behandelt. Nach Rühren für 19 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung für 1 Stunde auf 4°C abgekühlt und filtriert. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum aus dem Filtrat entfernt und das rohe Produkt aus 2-Propanol umkristallisiert. Das Produkt wird durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um einen weißen pulverigen Feststoff (0,76 g) zu ergeben. Von diesem Material wird durch HPLC gezeigt, dass es aus einer Mischung der freien Ausgangssäure und dem Succinimidylester in einem Verhältnis jeweils von etwa 1:2 besteht. Die Mischung wird keiner weiteren Reinigung unterzogen, sondern wird wie sie ist im nächsten Schritt verwendet.
N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)-N¹,N⁶-bis(tert.-butoxycarbonyl)spermidin (21)
Eine Lösung von 7 (87 mg, 0,20 mmol) in Methylenchlorid (20 ml) wurde mit einer Lösung von 20 (0,769 g in einer 66%igen Mischung, entsprechend 0,50 g des Esters; 0,20 mmol) in Methylenchlorid (20 ml) behandelt. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt vom Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum. Das rohe Produkt wurde durch Siliciumdioxid-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform gereinigt. Das resultierende unreine Produkt bestand aus einer 65:35-Mischung des Produkts aus freier Säure, die als Verunreinigungssubstanz im Ausgangsester vorlag. Eine zweite Silikasäule unter Verwendung desselben Gradienten + 0,5% Eisessig führte effektiv zur Isolierung des reinen Produkts (0,38 g); Reinheit 100%, wie bestimmt durch HPLC.
N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]-aminopentyl)spermidin (22)
Verbindung 21 (0,170 g, 0,059 mmol) wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml) behandelt und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde weitgehend unter Vakuum entfernt (0,19 g). Die Reinheit wurde mit HPLC mit etwa 100% bestimmt.
N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidinacetatsalz (23)
sZu einer Lösung von 22 (0,17 g, 0,059 mmol) in Methanol (20 ml) wurde Natriumcarbonat (0,37 g, 2,95 mmol), gefolgt von Wasser (40 ml), zugegeben, bis Homogenität erreicht wurde. Nach dem Rühren für 4 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel abgezogen und das rohe Produkt mit einer Sephadex-G-25-Mediumsäule unter Verwendung von 1%igem Eisessig als Eluierungsmittel eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurde vereinigt und lyophilisiert, um reines Produkt als extrem hygroskopischen Feststoff (0,07 g) zu erhalten.
BEISPIEL 5
Herstellung von N⁴-5-(D-Biotinyl)aminopentylspermidin-hydrochloridsalz (24)
Zu einer Lösung von 7 (0,20 g, 0,47 mmol) in 20 ml Acetonitril und 10 ml Wasser wurden 160 mg Succinimidyl-D-biotin zugegeben. Die Lösung wurde 18 Stunden gerührt. Das Volumen der Lösung wurde unter Vakuum auf 15 ml reduziert, und die verbleibende Lösung wurde auf Octadecylsilyl-gebundenes Siliciumdioxid unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril-Gradienten, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um einen wachsartigen weißen Feststoff (94% rein durch HPLC) zu ergeben. Zum weißen Feststoff wurden 10 ml 2-Propanol und 10 ml 4 N HCl in Dioxan zugegeben. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt. Der resultierende weiße Feststoff wurde in Wasser erneut gelöst und unter Vakuum getrocknet, um einen hygroskopischen Schaum (0,11 g) zu ergeben. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,31 (m, 4 H), 1,44 (m, 6 H), 1,64 (m, 8 H), 2,09 (m, 4 H), 2,63 (d, 2 H), 2,91 (m, 4 H), 3,06 (m, 8 H), 4,18 (m, 1 H), 4,36 (m, 1 H).
BEISPIEL 6
Herstellung von N⁴-(5-Cholesten-3'β-oxycarbonyl)aminopentylspermidinhydrochloridsalz (25)
Zu einer Lösung von 7 (0,20 g, 0,47 mmol) in 20 ml Methylenchlorid wurden 210 mg Cholesterylchlorformiat und 200 μl Diisopropylethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 24 Stunden gerührt. Das Methylenchlorid wurde unter Vakuum entfernt, und das verbliebene Öl wurde erneut in Chloroform gelöst und auf Siliciumdioxid unter Verwendung eines Methanol/Chloroform-Gradienten, enthaltend 0,1 % Diisopropylethylamin, gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um einen wachsartigen weißen Feststoff (0,29 g) zu ergeben. Zum weißen Feststoff wurden 10 ml 2-Propanol und 10 ml 4 N HCl in Dioxan zugegeben. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt. Der resultierende weiße Feststoff wurde erneut in Wasser gelöst und unter Vakuum getrocknet, um einen wachsartigen weißen Feststoff (0,15 g) zu ergeben.
BEISPIEL 7
Herstellung von N⁴-Octyl-N¹,N⁶-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (26)
Zu einer Lösung von N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (1,0 g, 2,89 mmol) in Aceton (100 ml) wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,605 ml, 3,47 mmo1, 1,2 Äq.), Kaliumiodid (0,489, 2,89 mmol) und 1-Bromoctan (0,500 ml, 2,89 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt, gefolgt von der Zugabe von N,N-Diisopropylethylamin (0,605 ml, 3,47 mmol) und Kaliumiodid (0,48 g, 2,89 mmol). Nach zusätzlichen 3 Stunden unter Rückfluss wurde 1-Bromoctan (0,500 ml, 2,89 mmol) zugegeben und der Rückfluss wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt. Das Aceton wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rest wurde in Chloroform (125 ml) aufgenommen und mit Wasser (2 × 75 ml) gewachen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um eine Flüssigkeit zu ergeben. Die Flüssigkeit wurde mit Silika-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform + 1 % N,N-Diisopropylethylamin gereinigt. Das reine Produkt wurde als blass-oranges Öl gewonnen (0,59 g). ¹H NMR (CDCl₃) : δ 0,88 (t, 3,5 H), 1,27 (m, 14,2 H; sollte 16,0 H sein), 1,44 (s, 18,7 H), 1,58 (m, 1,6 H), 1,82 (m, 1,6 H), 2,37 (m, 2,4 H), 2,44 (m, 2,2 H), 3,19 (m, 4,0 H), 4,84 (m, 0,3 H), 5,62 (m, 0,3 H).
Das N⁴-Octyl-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,15 g) wurde in 6 ml 4 N HCl in Dioxan gelöst und bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und das gelbe Öl in Chloroform suspendiert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in 10 ml absolutem Ethanol gelöst und durch die Zugabe von 30 ml Diethylether ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Dekantieren von der Flüssigkeit isoliert und unter Vakuum getrocknet (0,10 g). ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 0,86 (m, 3 H), 1,28 (m, 10 H), 1,58 – 1,80 (m, 6 H), 2,00 (m, 2H), 2,80 (m, 2 H), 2,89 (m, 2 H), 3,03 (m, 4 H), 3,15 (m, 2 H), 8,01 und 8,13 (zwei m, 5 H, sollte 6 H sein), Anal.: Berechnet für C₁₅H₃₈Cl₃N₃ C 49,11, H 10,44, N 11,45, Gefunden C 48,57, H 10,75, N 11,29.
BEISPIEL 8
Herstellung von N⁴-Dodecylspermidintrihydrochlorid (27)
Eine Lösung von N¹,N^B-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,50 g, 1,45 mmol) in Aceton (50 ml) wurde mit N,N-Diisopropylethylamin (0,604 ml, 3,48 mmol), Kaliumiodid (0,48 g, 2,90 mmol) und 1-Bromdodecan (0,348 ml, 2,90 mmol) behandelt. Die Mischung wurde 18 Stunden unter Rückfluss gekocht und mit zusätzlichem 1-Bromdodecan (0,348 ml, 2,90 mmol) behandelt. Der Rückfluss wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Das Aceton wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rest in Chloroform (250 ml) aufgenommen. Die Lösung wurde mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel für das Rohprodukt entfernt. Das Material wurde mit Silika-Flash-Chromatographie gereinigt und eluiert mit einem Gradienten von Isopropanol in Chloroform + 0,4% N,N-Diisopropylethylamin. Das reine Produkt wurde als ein Öl einer Masse von 0,52 g gewonnen. ¹H NMR (CDCl₃) 6 0,88 (t, 3,0 H), 1,26 (breites s, 21,0 H; sollte 20,0 H sein), 1,44 (s, 20,5; sollte 18,0 H sein), 1,64 (m, 5,8H), 2,37 (m, 3,8H), 2,46 (t, 2,5 H), 3,15 (m, 4,0 H), 4,84 (m, 0,5 H), 5,62 (m, 0,8 H).
Das N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)-N⁴-dodecylspermidin (0,52 g, 1,01 mmol) wurde in 2-Propanol (5 ml) gelöst und mit 4 N HCl in Dioxan (10 ml) behandelt. Die homogene Lösung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft. Das rohe Öl wurde in Ethanol (20 ml) aufgenommen und mit Ether (10 bis 15 ml) unter Rühren behandelt. Ein Feststoff fiel aus der Lösung aus und wurde durch Filtration gesammelt (85 mg). Eine zweite Menge wurde für zusätzliche 79 mg gewonnen. Die Gesamtausbeute betrug 164 mg. ¹H NMR (DMSO – d₆): δ 0,86 (t, 2,3 H), 1,25 (m, 18,0 H), 1,63 (m, 3,7 H), 1,76 (m, 2,3 H), 1,99 (m 1,3 H), 2,79 (m, 2,0 H), 2,90 (m, 2,0 H), 3,02 (m, 3,7 H), 3,16 (m, 2,3 H), 8,03 (m, 1,7 H), 8,14 (m, 2,7 H).
BEISPIEL 9
Herstellung von N⁴-Hexadecylspermidintrihydrochlorid (28)
Eine Lösung von N¹,N8-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,50 g, 1,45 mmol) in Aceton (50 ml) wurde mit N,N-Diisopropylethylamin (0,302 ml, 1,74 mmo1, 1,2 Äq.), Kaliumiodid (0,24 g, 1,45 mmol) und 1-Bromhexadecan (0,442 ml, 1,45 mmol) behandelt. Die Mischung wurde 20 Stunden unter Rückfluss gekocht und die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rest wurde in Chloroform (250 ml) aufgenommen und mit Wasser (150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft, um rohes Produkt als ein amberfarbiges Öl zu erhalten. Das Material wurde durch Silika-Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform + 0,4% N,N-Diisopropylethylamin gereinigt. Das reine Produkt wurde als ein schwach-gelbes Öl mit einer Masse von 0,42 g gewonnen. ¹H NMR (CDCl₃): δ 0,88 (t, 2,9 H), 1,26 (breites s, 30,3 H; sollte 28,0 H sein), 1,44 (s, 22,9 H; sollte 18,0 H sein), 1,60 (m, 4,0 H), 1,72 (m, 1,7 H), 2,37 (m, 3,7 H), 2,46 (m, 2,9 H; sollte 2,0 H sein), 3,17 (m, 4,0 H), 4,83 (m, 0,6 H), 5,62 (m, 0,6 H).
Das N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)-N⁴-hexadecylspermidin (0,42 g, 0,74 mmol) wurde in 2-Propanol (5 ml) gelöst und mit 4 N HCl in Dioxan (10 ml) behandelt. Die homogene Lösung wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck. Der Rest wurde in Ethanol (12 ml) aufgenommen und mit Ether (10 ml) unter Rühren behandelt. Ein Niederschlag fiel aus der Lösung aus und wurde durch Filtration gesammelt; Masse 125 mg. Eine zweite Menge wurde mit einer Masse von 75 mg zu einer Gesamtausbeute von 0,200 g gewonnen. ¹H NMR (DMSO -d₆ + D₂O): δ 0,83 (t, 2,1 H; sollte 3,0 H sein), 1,22 (m, 26,6 H), 1,54 – 1,70 (m, 6,0 H), 1,96 (m, 1,7 H), 2,81 (m, 1,7 H), 2,89 (m, 2,1 H), 3,04 – 3,12 (m, 6,0 H).
BEISPIEL 10
Transfektion von zusammenhängenden Zellen in Kultur unter Verwendung von Rezeptor-tragenden Zellen
Humanhepatozellulare Carcinoma-HuH7-Zellen wurden gezüchtet und in eine Platte mit 96 Vertiefungen mit 1 – 2 × 10⁴ Zellen in 100 μl Minimalmedium α, eine Modifikation mit 10% Serum, gesät. Die Platten wurden in einem 37°-CO₂-Inkubator inkubiert, bis die Zellen 60 bis 80% konfluent (etwa 24 Stunden) waren. Das Medium wurde entfernt und die Zellen einmal mit Optimem^® (serumfreies Medium) gewaschen. Optimem^® (100 μl), enthaltend 0,5 μg pCMVβ-Plasmid (von Clonetech, Nr. 6177-1), 0,5 μg N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidin und 2,5 μg N⁴-(5-Cholesten-3'β-oxycarbonyl)aminopentyl)spermidin wurden zu den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden mit der Mischung 4 Stunden in einem 37°-CO₂-Inkubator inkubiert; danach wurden 100 μl Medium, enthaltend 20% Serum zugegeben, und die Inkubation für weitere 20 Stunden fortgesetzt. Die Zellen lysierten mit 0,5% NP-40 in 140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, wurden auf β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung von o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid getestet und ergaben A₄₀₅ = 1,35 nach 30 min. In Platten mit 6 Vertiefungen (25 mm Durchmesser) gezüchteten und ähnlich behandelte Zellen wurden mit 2% Paraformaldehyd fixiert und auf β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid getestet (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989). Die visuelle Inspektion zeigte, dass 5 bis 10% der Zellen transfek tiert waren, wie durch Lichtmikroskopie bewiesen wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Rezeptor-spezifische Bindungskomponente des multifunktionellen molekularen Komplexes aus der Zellkultur weggelassen wurde, während die Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente des multifunktionellen molekularen Komplexes beibehalten wurde.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit N⁴-(5-(β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)aminopentyl)spermidin; und N⁴-(5-(Methyltetrahydrofolyl)aminopentyl)spermidin; mit den Endosommembran-Spaltungsförderungskomponenten darin enthalten. Ähnliche Ergebnisse können ebenfalls erhalten werden mit N⁴-Octylspermidin, N⁴-Dodecylspermidin, fusogenen Peptiden, acetyliert am N-Ende mit N⁴-(5-Carboxypentyl)spermidin; N⁴-(5-(3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-oin)aminopentylspermidinamid, mit den darin enthaltenen Rezeptor-spezifischen Bindungskomponenten.
BEISPIEL 11
Transfektion von Muskelzellen in vivo
Lösungen wurden hergestellt, enthaltend 100 μg pCMVβ-Plasmid und 100 μg entweder N⁴-Octylspermidin, N⁴-Dodecylspermidin oder N⁴-(5-Cholesten-3'β-oxycarbonyl)aminopentyl)spermidin, jeweils in 100 μl Phosphat-gepufferter Salzlösung. Die Plasmidlösung (100 μl) wurde in den hinteren Quadrizeps von 6 bis 12 Wochen alten BALB-C-Mäusen injiziert. Die Mäuse werden etwa 96 Stunden später getötet, und das gesamte Quadrizeps-Muskelgewebe wurde entfernt. Der Muskel wurde mit Formalin 2 Stunden fixiert und auf β-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid getestet (1 mg/ml in Tris/BDTA pH 8,5). Alle drei Injektionen wurden als positiv bewertet, da die blaue Farbe intensiver war als die Kontrolle: Injektion von 100 μg pCMVβ-Plasmid, injiziert in 100 μl von 0,25% Bupivacaine HCl in Citrat-Puffer pH 6,0. Ähnliche Ergebnisse können ebenfalls erhalten werden mit fusogenen Peptiden, acetyliert am N-Ende durch N⁴-(5-Carboxypentyl)spermidin und N⁴-(5-(3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-oin)aminopentyl)spermidinamid.
BEISPIEL 12
Transfektion von Leberzellen in vivo
Eine Lösung wird hergestellt, enthaltend 10 μg von pHBVSA-Plasmid, 5 μg N⁴-(5-[N²,N⁶-Bis-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidin und 25 μg N⁴-(5-Cholesten-3'β-oxycarbonyl)aminopentyl)-spermidin in 100 μl Phosphat-gepufferier Salzlösung. Die Plasmidlösung (100 μl) wird in die Schwanzvene von 6 bis 12 Wochen alten BALB-C-Mäusen injiziert. Die Mäuse werden 48 bis 120 Stunden später getötet und das Serum auf Hepatitis B-Oberflächenantigen unter Verwendung eines herkömmlichen Enzym-gebundenen Immunoassays getestet. Die Erzeugung von Oberflächenantigen ist größer als die positive Kontrolle, erhalten mit dem Kit bei 48 Stunden nach Injektion.
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten mit N⁴-(5-(β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)aminopentyl)spermidin, N²,N⁶-(5-[Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]aminopentyl)spermidin, N⁴-(5-(Methyltetrahydrofolyl)aminopentyl)spermidin, N⁴-(5-(Folinyl)aminopentyl)spermidin, N⁴-(5-(α-3'-Propionylthiomannosid)aminopentyl)spermidin und N⁴-(5-(α-3'-Propionylthiomannosid-6-phosphat)aminopentyl)spermidin, mit darin enthaltenen Rezeptor-spezifischen Bindungskomponenten.
Ähnliche Ergebnisse können ebenfalls erhalten werden mit N⁴-Octylspermidin, N⁴-Dodecylspermidin, fusogenen Peptiden, acetyliert am N-Ende mit N⁴-(5-Carboxypentyl)spermidin, N⁴-5-(Cholest-5-en-3'-β-carbamoyl)aminopentyl)spermidin und N⁴-(5-(3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-oin)aminopentyl)spermidinamid mit darin enthaltener Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente.
BEISPIEL 13
Ein Kit für Forschungs- und Herstellungsverwendung
Ein Kit zur Verwendung der multifunktionellen molekularen Komplexe der vorliegenden Erfindung in einem Forschungs- und Herstellungs-Satz, wo der einzelne Verwender seine eigene DNA bereitstellt, umfasst ein Fläschchen, enthaltend den Transfer-Rest der vorliegenden Erfindung, gelöst bei 0,1 bis 10 mg/ml und bevorzugt bei 1 mg/ml in einem sterilen Puffer bei pH 6 bis 8 und bevorzugt bei pH 6,5 bis 7,5. Akzeptable Puffer würden Citrat, HEPES und Phosphat einschließen. Die Verwendung des Kits umfasst die Entfernung eines Aliquots des Transfer-Rests und Zugeben des Aliquots zur Lösung der DNA (bei 0,05 bis 2 mg/ml und bevorzugt 0,25 bis 0,75 mg/ml) derart, dass das Endverhältnis mg Transfer-Rest zu mg DNA zwischen 0,5 und 5,0 mg/mg liegt. Optimale Verhältnisse können ohne weiteres bestimmt werden. Die DNA-Transfer-Rest-Mischung wird kurz gemischt und 15 bis 60 Minuten bei 37°C gehalten. Die DNA-Transfer-Rest-Mischung, die nun den multifunktionellen molekularen Komplex der vorliegenden Erfindung bildet, wird dann mit Minimalmedium (serumfrei) auf eine Konzentration von 5 bis 100 μg/ml verdünnt und zu den Zellen in Kultur zugegeben. Optimale Konzentrationen können ohne weiteres bestimmt werden.
BEISPIEL 14
Ein Kit zur klinischen und veterinärmedizinischen Verwendung
Ein Kit zur Verwendung der hier offenbarten Transfer-Reste in einem klinischen oder veterinärmedizinischen Satz, wo die einzelnen Verwender ihre eigene DNA bereitstellen, umfasst ein Fläschchen, enthaltend den Transfer-Rest, gelöst bei 0,1 bis 10 mg/ml und bevorzugt bei 1 mg/ml in einem sterilen Puffer bei pH 6 bis 8 und bevorzugt bei pH 6,5 bis '7,5. Akzeptable Puf fer umfassen Citrat, HEPES und Phosphat. Die Verwendung des Kits umfasst die Entfernung eines Aliquots des Transfer-Rests und Zugeben des Aliquots zur Lösung der DNA (bei 0,05 bis 2 mg/ml und bevorzugt 0,25 bis 0,75 mg/ml) derart, dass das Endverhältnis von mg von Transfer-Rest zu mg DNA zwischen 0,5 und 5,0 mg/mg und bevorzugt 1 mg/mg liegt. Optimale Verhältnisse können ohne weiteres bestimmt werden. Die DNA-Verbindungs-Mischung wird kurz gemischt und 30 bis 60 Minuten bei Umgebungstemperatur gehalten. Die DNA-Transfer-Rest-Mischung (10 bis 500 μg DNA), die nun den multifunktionellen molekularen Komplex der vorliegenden Erfindung bildet, wird dann in den Patient oder das Subjekt, Mensch oder Tier, injiziert, wie es mit der erwünschten Anwendung im Einklang steht, z.B. i.m.-Injektion für Immunisierung, i.v.-Injektion für Leberlokalisation etc.
BEISPIEL 15
Ein Kit zur klinischen und veterinärmedizinischen Verwendung, einschließlich DNA
Ein Kit zur Verwendung der multifunktionellen molekularen Komplexe der vorliegenden Erfindung in einem klinischen oder veterinärmedizinischen Satz, worin die DNA als Teil des Kits bereitgestellt wird, umfasst ein Fläschchen, enthaltend die Verbindung, gelöst bei 0,5 bis 10 mg/ml und bevorzugt bei 0,5 bis 1 mg/ml, in einem sterilen Puffer bei pH 6 bis 8 und bevorzugt bei pH 6,5 bis 7,5. Akzeptable Puffer umfassen Citrat, HEPES und Phosphat. Das Kit enthält ebenfalls DNA, die für den beabsichtigten Zweck geeignet ist (bei 0,05 bis 2 mg/ml und bevorzugt 0,25 bis 0,75 mg/ml), derart, dass das Endverhältnis mg Transfer-Rest-Komponente des Kits zu mg der DNA-Komponente des Kits zwischen 0,5 und 5,0 mg/mg und bevorzugt 1 mg/mg liegt. Optimale Verhältnisse können ohne weiteres bestimmt werden. Die DNA-Transfer-Rest-Mischung wird 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die DNA-Transfer-Rest-Mischung (10 bis 500 μg DNA) wird dann in den Patient oder das Subjekt, Mensch oder Tier, injiziert, wie es mit der erwünschten Anwendung im Einklang steht, z.B. i.m.-Injektion für Immunisierung, i.v.-Injektion für Leberlokalisation etc.
BEISPIEL 16
Kit, enthaltend lyophilisiere Komponenten
Die in Beispiel 13 bis 15 oben beschriebenen Kits können ebenfalls die Komponenten hiervon bereitgestellt als lyophilisierte Pulver, aufweisen, worin die Transfer-Reste, Pufferkomponenten und Hilfsstoffe an der Verwendungsstelle durch Zugabe von sterilem Wasser erneut gebildet werden. Diese lyophilisierten Kits können ebenfalls die DNA als eine lyophilisierte Komponente enthalten.
BEISPIEL 17
Herstellung von N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)spermidintrihydrochlorid
Benzyl-6-bromhexanoat wurde hergestellt durch tropfenweises Zugeben einer Lösung von 6-Bromhexanoylchlorid (20,0 ml) in 100 ml Methylenchlorid zu einer Lösung von 66,22 ml Benzylalkohol in 60 ml Pyridin. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Eiswasserbads 90 Minuten abgekühlt, dann 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit 200 ml 1 N HCl extrahiert, gefolgt von 2 × 150 ml gesättigtem NaHCO₃. Die Extrakte wurden verworfen und die Lösung über Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösung wurde filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde über Silikagel gereinigt, mit einem Gradient von Chloroform in Hexan eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,52, CHCl₃/Hexan 6:4) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 24,4 g zu ergeben.
N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin wurde hergestellt durch Behandeln von N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (3,0 g) mit drei Aliquoten Benzyl-6-bromhexanoat (jeweils 2,45 g) und K₂CO₃ (jeweils 1,19 g) in 1-Stunde-Intervallen unter Rückfluss in Acetonitril. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest aufgeteilt zwischen 200 ml Wasser und 2 × 150 ml CHCl₃. Die CHCl₃-Schichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,50, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 3,82 g von N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin als ein Öl zu ergeben.
N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,20 g) wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde im Vakuum entfernt und der Rest zweimal in Chloroform (50 ml) gelöst und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der ölige Rest wurde aus 10 ml 0,1 N HCl lyophilisiert, um 126 mg von N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)spermidintrihydrochlorid als ein Öl zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,37 (2 H), 1,77 (9,4 H), 2,05 (2 H), 2,42 (1,8 H), 2,9 (1,7 H), 3,00 (4,4 H), 3,20 (1,7 H), 5,12 (1,7 H), 7,37 (5 H), 8,19 (5 H), 10,77 (1 H).
BEISPIEL 18
Herstellung von N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-HA-2-peptid
N⁴-(6'-Hexansäure)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (1,46 g) wurde mit 0,37 g N-Hydroxysuccinimid und 0,66 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Tetrahydrofuran 20 Stunden behandelt. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um 1,99 g von N⁴-(Succinimidyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin zu ergeben. Das Peptid SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG wurde unter Verwendung eines ABI-Modell 431A-Peptid-Synthetisators, vorbeladener FMOC-Aminosäure-Kas setten und vorbeladenem FMOC-GIy-p-alkoxybenzylalkoholharz, hergestellt. Die FMOC-Schutzgruppe wurde aus dem N-terminalen Serin entfernt und das Harz getrocknet. Das Peptidharz wurde mit 1,99 g N⁴-(Succinimidyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin und 1,24 ml Diisopropylethylamin in 50 ml Dimethylformamid 24 Stunden behandelt. Das Harz wurde durch Filtration isoliert und mit Dichlormethan gespült. Das N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH wurde aus dem Harz unter Verwendung einer Mischung von Wasser (0,25 ml), Ethandithiol (0,25 ml), Thioanisol (0,50 ml) und Trifluoressigsäure (9,5 ml) abgespalten. Das verbrauchte Harz wurde durch Filtration entfernt und das rohe N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH durch Addition von Diethylether ausgefällt und durch Filtration isoliert. Eine Probe des rohen N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH (100 mg) wurde durch HPLC auf einer 25 × 250 mm C-18-Säule, eluiert mit einem Gradient von 0,05 M Ammoniumbicarbonat und 0,05 M Ammoniumbicarbonat in 80% Acetonitril, gereinigt. FAB-Massenspektrum MH⁺ = 2775.
BEISPIEL 19
Herstellung von N⁴-(5'-N-(3"α,7"α,12"α-Trihydroxy-5"β-cholanamido)pentyl)-spermidintrihydrochlorid
Cholinsäure (95 mg) wurde in 10 ml Tetrahydrofuran und N-Hydroxysuccinimid (27 mg) gelöst und Dicyclohexylcarbodiimid (48 mg) zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, um gelöst zu werden, und N⁴-(5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (100 mg) zugegeben. Die Mischung wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das rohe Wachs wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,39, CHCl₃/Methanol 85:15) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,15 g N⁴-(5'-(3"α, 7"α,12"α-Trihydroxy-5"β-cholanamido)pentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin als weißen Feststoff zu ergeben. Dieser Feststoff wurde in 10 ml 2-Propanol gelöst und zu dieser Lösung wurden 10 ml 4 N HCl in Dioxan zugegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, während dieser Zeit N⁴-(5'-(3"α, 7"α, 12"α-Trihydroxy-5"β-cholanamido)pentyl)spermidintrihydrochlorid als feines weißes Pulver ausgefällt wurde. Dieses wurde durch Filtration isoliert, um 67 mg zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 0,58 (s, 3H), 0,81 (s, 3H), 0,92 (m, 5,5H), 1,28 (m, 20,8H), 1,62 (m, 16,2H), 2,05 (m, 8,8H), 2,8 (q, 2,8H), 2,9 (q, 2,8H), 3,02 (q, 8,3H), 3,18 (m, 4,4H), 7,87 (m, 1,1H), 8,13 (br s, 4H), 8,23 (br s, 4H), 10,78 (br s, 1,1H).
BEISPIEL 20
Herstellung von N⁴-(5-N-(α-3'-Propionamidothiomannosid)pentyl)spermidintrihydrochlorid
Eine Lösung von S-α-3'-Propionyltetra-O-acetylthiomannosid (ähnlich hergestellt wie S-β-3'-Propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid, M. Elofsson, S. Roy, B. Walse und J. Kihlberg, Carb. Res., 246, 89 – 103 (1993)) (0,90 g) wurde in 50 ml CHCl₃ hergestellt. Zu der Lösung wurden 5 ml 2-Propanol, 0,43 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,24 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann bei 4°C über Nacht gelagert. Ein Niederschlag wurde abfiltriert und das Lösungsmittel vom Filtrat im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von N⁴-(5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,86 g) (in 50 ml Tetrahydrofuran und 30 ml Wasser) sowie 0,55 ml Diisopropylethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, die resultierenden Feststoffe abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde in 100 ml gesättigter NaHCO₃ suspendiert und mit 2 × 75 ml CHCl₃ extrahiert. Die Lösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,30, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt, und das Lösungsmittel entfernt, um 0,10 g von N⁴-(5'-N-(S-α-3'-Propionamido-tetra-O-acetylthiomannosid)pentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin als ein Glas zu ergeben. Dieses Glas wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest erneut gelöst und das Lösungsmittel unter Verwendung von Chloroform (3 × 20 ml) entfernt. Der Feststoff wurde mit 15% NH₄OH in 55%igem Ethanol 2 Stunden behandelt. Das Produkt wurde dann lyophilisiert (3×) aus 0,05 N HCl, um N⁴-(5-(α-3'-Propionylthiomannosid)aminopentyl)spermidintrihydrochlorid als einen weißen Feststoff (64 mg) zu ergeben.
BEISPIEL 21
Herstellung von N⁴-(N-CBZ-S-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid
N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin wurde hergestellt ähnlich zu N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin durch Behandlung von N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,5 g) mit vier Aliquoten von N-CBZ-5-Amino-1-brompentan (jeweils 1,74 g) und fünf Aliquoten von K₂CO₃ (jeweils 1,00 g). Das resultierende Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert (DSC R_f 0,47, CHCl₃/Methanol 9:1 bis 0,4% Diisopropylethylamin), um 0,72 g von N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin als ein Öl zu ergeben.
N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin (0,24 g) wurden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und in einem Eiswasserbad unter Stickstoff 2 Stunden gerührt. Kalter Ether wurde zum Niederschlag des Produkts als ein Öl zugegeben. Die Lösungsmittel wurden durch Dekantation entfernt und das Öl in 25 ml 0,1 N HCl gelöst und lyophilisiert, um 0,16 g von N⁴-(N-CBZ-5-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid als ein Glas zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,28 (m, 2H), 1,47 (m, 2H), 1,61 (m, 8H), 2,01 (m, 2H), 2,82, 2,90 (m, 4H), 3,02 (m, 8H), 3,15 (m, 2,7H), 5,01 (s, 2H), 7,35 (s+m, 6,7H), 8,00, 8,11 (überlappend br m, 7,3H).
BEISPIEL 22
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-S-aminopentyl)spermintetrahydrochlorid
N¹,N'²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde hergestellt ähnlich zu N¹,N⁸-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin unter Verwendung derselben Umsetzungssequenz. N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5'-aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde in ähnlicher Weise hergestellt zu N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin unter Verwendung einer einzigen Addition von N-CBZ-5-Amino-1-brompentan (5,10 g) und K₂CO₃ (4,70 g) zu 3,42 g N¹,N¹²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin in unter Rückfluss kochendem Acetonitril (100 ml). Die Aufarbeitung wie zuvor ergab das Produkt als Öl, das auf Silikagel gereinigt wurde und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform, enthaltend Diisopropylethylamin (0,2%), eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,43, CHCl₃/Methanol 9:1 + 0,4% Diisopropylethylamin) wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde entfernt, um 6,0 g von N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5'-aminopentyl)-N¹,N'²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Ein Aliquot (0,25 g) dieses Materials wurde entschützt und zum Hydrochlorid, wie oben für N⁴-(N-CBZ-5-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid beschrieben, umzuwandeln, um 0,13 g von N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5-aminopentyl)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,28 (m, 4H), 1,43 (m, 4H), 1,76 (m, 8,8H), 2,01 (m, 4H), 2,90, 3,00 (überlappend m, 18,4H), 3,17 (m, 4,4H), 5,03 (s, 4H), 7,35 (s, 12 H), 8,11 (br m, 5,6H).
BEISPIEL 23
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(octyl)spermintetrahydrochlorid
N⁴,N⁹-Bis(octyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde hergestellt unter Verwendung einer Einzeladdition von 1-Bromoctan (0,53 g), Kaliumiodid (0,45 g) und Diisopropylethylamin (0,54 ml) zu 0,50 g N¹,N¹²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin in Aceton (30 ml) und Rückflusskochen über Nacht. Das Aceton wurde im Vakuum entfernt und die Mischung in 200 ml Chloroform aufgenommen und mit 100 ml Wasser gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um das Produkt als Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,54, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,26 g von N⁴,N⁹-Bis(octyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Wachs zu ergeben. Dieses Material (0,26 g) wurde mit 10 ml 4 N HCl in Dioxan für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 0,21 g N⁴,N⁹-Bis(octyl)spermintetrahydrochlorid als ein Wachs zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 0,94 (t, 6H), 1,35 (m, 22H), 1,74, 1,83 (überlappend m, 8,2H), 2,10 (m, 4H), 2,97, 3,12, 3,26 (überlappend m, 18H), 8,27; (br m, 5,6H).
BEISPIEL 24
Herstellung von 1,12-Bis-N-guanidino-N⁴N⁹-bis(octyl)-4,9-diazadodecantetrahydrochlorid
Zu 0,68 von N⁴,N⁹-Bis(octyl)spermintetratrifluoracetat in 50 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Wasser wurden 0,77 g N,N'-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)-S-methylisothioharnstoff und 0,85 ml Diisopropylethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde unter Rückfluss gekocht, dann bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom bei 60°C entfernt. Der resultierende Feststoff wurde in 100 ml gesättigter NaHCO₃ suspendiert und mit 2 × 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,39, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,18 g 1,12-Bis-N-(N',N"-bis(tert.-butyloxycarbonylguanidino)-N⁴,N⁹-bis(octyl)-4,9-diazadodecan als ein Wachs zu ergeben. Dieses Wachs wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel entfernt (2 × 20 ml), um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 30 ml 0,1 N HCl gelöst und lyophilisiert, um 1,12-Bis-N-guanidino-N⁴,N⁹-bis(octyl)-4,9-diazadodecantetrahydrochlorid (86 mg) als Öl zu ergeben. NMR (MeOH-d₄) δ 0,82 (m, 3H), 1,23, 1,30 (überlappend m, 10H), 1,64, 1,71 (überlappend m, 4H), 1,90 (m, 2H), 3,14 (m, 6H).
BEISPIEL 25
Herstellung von N⁴-(5-N-(Cholesten-3'β-carbamoyl)pentyl)spermintetrahydrochlorid
N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde als Minderkomponente während der Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5'-aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin isoliert. Fraktionen, die das N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (DSC R_f 0,26, CHCl₃/Methanol 9:1 + 0,4% Diisopropylethylamin) enthielten, wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,84 g eines Öls zu ergeben. Zu diesem Öl wurden 50 ml Acetonitril, 0,47 ml Diisopropylethylamin und 0,35 g Ditert.-butyldicarbonat zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in 100 ml Chloroform aufgenommen und mit 100 ml Wasser gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um 0,83 g N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben, wobei ein einzelner Fleck mit DSC (R_f 0,56, CHCl₃/Methanol 9:1 + 0,4% Diisopropylethylamin) vorlag. Das N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,22 g) in 20 ml Methanol wurde mit 0,04 g 10% Pd/C und 50 PSIG H₂ 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Pd/C wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um N⁴-(-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl (0,14 g) zu ergeben. Dieses Öl wurde in Methylenchlorid gelöst und zur Lösung wurden Diisopropylethylamin (0,146 ml) und Cholesterylchlorformiat (0,094 g) zugegeben. Die Lösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das resultierende Öl auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform, enthaltend Diisopropylethylamin, eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,29, CHCl₃/Methanol 9:1 + 0,4% Diisopropylethylamin) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,19 g von N⁴-(5-(Cholesten-3'β-carbamoyl)pentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst und unter Stickstoff in einem Eiswasserbad 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel entfernt (2 × 20 ml), um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 10 ml 0,1 N HCl gelöst und lyophilisiert, um ein leicht braunes Öl zu ergeben (0,077 g). NMR (DMSO-d₆) δ,0,58 (s, 3H), 0,78: (zwei s, 6H), 0,90 (überlappend m, 18H), 1,43 (überlappend m, 15H), 1,64 (überlappend m, 8H), 1,96 (m, 6H), 2,85 (überlappend m, 16H), 3,12 (m, 4H), 5,25 (m, 1H), 7,0 (br t, 1H), 8,06 (br m, 8H), 9,19 (br m, 2H).
BEISPIEL 26
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)spermintetrahydrochlorid
Zu einer Suspension von 7,8 g 12-Bromdodecanonsäure in 100 ml Wasser wurden 14 ml 2 M Dimethylamin in Tetrahydrofuran zugegeben, was in einer klaren Lösung resultierte. Der pH wurde mit 1 N HCl auf 7 eingestellt und 5,36 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid wurden zugegeben. Die Lösung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende N,N-Dimethyl-12-bromdodecanamid fiel aus der Lösung als weißer Feststoff während dieser Zeit aus. Dieser Feststoff wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, dann im Vakuum getrocknet. N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)-N¹,N'²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde ähnlich zu N⁴-(N-CBZ-5'Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin unter Verwendung einer einzelnen Addition von N,N-Dimethyl-12-bromdodecanamid (2,34 g) und K₂CO₃ (1,70 g) zu 0,50 g N¹,N¹²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin in unter Rückfluss kochendem Acetonitril (50 ml) hergestellt. Aufarbeitung wie zuvor ergab das Produkt als ein Öl, das auf Sili kagel gereinigt wurde und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform, enthaltend Diisopropylethylamin (0,2%), eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,53, CHCl₃/Methanol 8:2 + 0,2% Diisopropylethylamin) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,49 g N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Ein Aliquot (0,20 g) dieses Materials wurde entschützt und wie oben beschrieben für N⁴-(N-CBZ-S-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid beschrieben zum Hydrochlorid umgewandelt, um 0,19 g N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,26 (m, 25,6H), 1,46 (m, 3H), 1,70, 1,80 (überlappend m, 6H), 2,04 (m, 3H), 2,79 (s, 6H), 2,94 (s, 6H), 3,0–3,2 (überlappend m, 18H), 8,15 (br m, 5H).
BEISPIEL 27
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid
Zu einer Lösung von 12-Bromdodecanonsäure (1,0 g) und Benzylalkohol (0,74 ml) in 200 ml Toluol wurde p-Toluolsulfonsäure (0,10 g) zugegeben. Das meiste (ca. 180 ml) des Toluols wurde durch einfache Destillation bei Atmosphärendruck entfernt, und das verbliebene Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rest wurde in Ethylacetat (200 ml) aufgenommen und mit gesättigter NaHCO₃ gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um rohes Benzyl-12-bromdodecanoat (1,75 g) als rohe Flüssigkeit zu ergeben. DSC (Chloroform/Hexan 85:15) zeigte nur Produkt (R_f 0,78) und Benzylalkohol (R_f 0,08). N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)-spermin wurde ähnlich zu N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin hergestellt unter Verwendung einer einzelnen Addition von rohem Benzyl-12-bromdodecanoat (4,6 g) und K₂CO₃ (1,70 g) zu 1,0 g von N¹,N¹²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin in unter Rückfluss kochendem Acetonitril (100 ml). Aufarbeitung wie vorher ergab das Produkt als ein Öl, das auf Silikagel gereinigt wurde und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,35, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,36 g von N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Ein Aliquot (0,27 g) dieses Materials wurde entschützt und wie oben beschrieben für N⁴-(N-CBZ-S-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid zum Hydrochlorid umgewandelt, um 0,17 g N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,24 (m, 31,4H), 1,55 (m, 4,2H), 1,70, 1,80 (überlappend m, 8,6H), 2,02 (m, 4,2H), 2,9–3,2 (überlappend m, 21,4H), 5,08 (s, 4,2H), 7,36 (s, 10H) 8,13 (br m, 5,8H).
BEISPIEL 28
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(12'-dodecanonsäure)spermintetrahydrochlorid
N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,51 g) wurde in 50 ml Methanol gelöst und mit 0,05 g 10% Pd/C und 50 PSIG H₂ bei Raumtemperatur 3 Stunden behandelt. Das Pd/C wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt. Das Lösungsmittel wurde vom Filtrat im Vakuum entfernt, um N⁴,N⁹-Bis(12'-dodecanoinsäure)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Ein Aliquot (0,22 g) dieses Materials wurde entschützt und wie oben beschrieben für N⁴-(N-CBZ-S-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid zum Hydrochlorid umgewandelt, um 0,17 g N⁴,N⁹-Bis(12'-dodecanonsäure)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,25 (m, 28H), 1,47 (m, 5H), 1,66, 1,76 (überlappend m, 8H), 2,02 (m, 3,6H), 2,91–3,17 (überlappend m, 19H), 8,11 (br m, 5H).
BEISPIEL 29
Herstellung von N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid
N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin wurde ähnlich zu N⁴-(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N⁸-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermidin hergestellt unter Verwendung einer einzelnen Addition von Benzyl-12-bromdodecanoat (6,58 g) zu 1,43 g N¹,N¹²-Bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin in unter Rückfluss kochendem Acetonitril (100 ml). Aufarbeitung wie zuvor ergab das Produkt als ein Öl, das auf Silikagel gereinigt wurde und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform, enthaltend Diisopropylethylamin (0,2%) eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,08, CHCl₃/Methanol 8:2 + 0,2% Diisopropylethylamin) wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde entfernt, um 0,36 g von N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Ein Aliquot (0,29 g) dieses Materials wurde entschützt und wie oben beschrieben für N⁴-(N-CBZ-5-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid zum Hydrochlorid umgewandelt, um 0,19 g von N⁴-(Benzyl-12'-dodenanoyl)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,24 (m, 12H), 1,53 (m, 1,5H), 1,69, 1,80 (überlappend m, 4H), 2,01 (m, 4H), 2,9–3,2 (überlappend m, 14H), 5,08 (s, 2H), 7,36 (s, 5H) 7,47 (m, 1H), 8,09 (br m, 5,5H), 9,20 (br m, 2H).
BEISPIEL 30
Herstellung von N⁴-(12'-Dodecanonsäure)spermintetrahydrochlorid
N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,29 g) wurde in 30 ml Methanol gelöst und mit 0,03 g 10% Pd/C und 50 PSIG H₂ 1,5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Pd/C wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat im Vakuum entfernt, um N⁴-(12'-Dodecanonsäure)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Öl (0,19 g) zu ergeben. Dieses Material (0,19 g) wurde entschützt und wie oben beschrieben für N⁴-(N-CBZ-S-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid in das Hyd rochlorid umgewandelt, um 0,18 g N⁴-(12'-Dodecanonsäure)spermintetrahydrochlorid zu ergeben. NMR (DMSO-d₆) δ 1,26 (m, 16,7H), 1,48 (m, 2,7H), 1,70, 1,78 (überlappend m, 6H), 2,01 (m, 4H), 2,91–3,17 (überlappend m, 12H), 8,17 (br m, 5,3H), 9,30 (br m, 2H).
BEISPIEL 31
Herstellung von N⁴,N⁹-Bis(5-(α-3'-propionylthiomannosid)-aminopentyl)spermintetraacetat
N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-5'-Aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tent.-butyloxycarbonyl)spermin (2,04 g) wurde in 50 ml Methanol gelöst und mit 0,84 g 10% Pd/C und 50 PSIG H₂ 2,5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Pd/C wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt, das Lösungsmittel vom Filtrat im Vakuum entfernt, um N⁴,N⁹-Bis(5'-aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,79 g) als ein Öl zu ergeben. Eine Lösung von S-α-3'-Propionyltetra-O-acetylthiomannosid (2,94 g) wurde in 100 ml Tetrahydrofuran hergestellt. Zur Thiomannosidlösung wurden 1,39 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,78 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben. Die Lösung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann 0,5 Stunden bei 4°C gelagert. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Lösungsmittel vom Filtrat im Vakuum entfernt, um Succinimidyl-S-α-3'-propionyltetra-O-acetylthiomannosid (3, 30 g) als weißen Feststoff zu ergeben. Das N⁴,N⁹-Bis(5'-aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,79 g) wurde in Tetrahydrofuran (75 ml) gelöst, und zur Lösung wurden 0,64 ml Diisopropylethylamin und 1,32 g Succinimidyl-S-α-3'-propionyltetra-O-acetylthiomannosid zugegeben und die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Glas zu ergeben. Dieses Glas wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform, enthaltend Diisopropylethylamin (0,2%), eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,30, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,69 g N⁴,N⁹-Bis(5-(α-3'-propionyltetra-O-acetylthiomannosid)aminopentyl)-N¹,N¹²-bis(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als ein Glas zu ergeben. Dieses Glas wurde in 20 ml Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform gelöst, und das Lösungsmittel entfernt (2 × 20 ml), um 0,78 g von N⁴,N⁹-Bis(5-N-(α-3'-propionamidotetra-O-acetylthiomannosid)pentyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 25 ml Methanol gelöst, und zur Lösung wurden 25 ml Wasser und 1,56 g Na₂CO₃ zugegeben und die Lösung 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und der Rest in 6 ml 1%iger Essigsäure aufgenommen und in drei 2 ml-Aliquoten auf drei Sephadex^TM-G-25-Mediumsäulen (12 ml jeweils) gereinigt und mit 1 % Essigsäure eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, um 0,31 g von N⁴,N⁹-Bis(5-N-(α-3'-propionamidothiomannosid)pentyl)spermintetraacetat als einen weißen Feststoff zu ergeben. NMR (D₂O) δ 1,42 (m, 4H), 1,59 (m, 4H), 1,79 (m, 9,5H), 1,95 (s, 38,5H), 2,14 (m, 5H), 2,62 (t, 4H), 2,94 (m, 4H), 3,10 (m, 4,5H), 3,24 (m, 18H), 3,72 (m, 6H), 4,05 (m, 6,5H), 5,34 (s, 2H).
BEISPIEL 32
Herstellung von N⁴-(5-N-(23'-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-Hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat
Eine Lösung von Pentaethylenglykol (5,0 g) und 50 ml Tetrahydrofuran wurde zu einer schnell gerührten Suspension von NaH (0,42 g von 60%) und 40 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff gehalten und in einem Eiswasserbad suspendiert und 0,5 Stunden gerührt. Eine Lösung von N-CBZ-5-Amino-1-brompentan (3,78 g) in 30 ml Tetrahydrofuran wurde zugegeben und die Mischung im Eiswasserbad 1 Stunde gerührt, dann für 18 Stunden bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von 2-Propanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,30, CHCl₃/2-Propanol 95:5) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 3,25 g von N-CBZ-20-Amino-3,6,9,12,15-pentaoxa-1-eicosanol als ein Öl zu ergeben. Eine Lösung von N-CBZ-20-Amino-3,6,9,12,15-pentaoxa-1-eicosanol (3,25 g) in 50 ml Tetrahydrofuran wurde zu einer schnell gerührten Suspension von NaH (0,28 g, 60%ig) in 25 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff gehalten und in einem Eiswasserbad suspendiert und für 0,5 Stunden gerührt. Zur Lösung wurde tert.-Butyl-1-Bromacetat (1,15 ml) zugegeben und die Mischung im Eiswasserbad für 1 Stunde gerührt, dann für 4 Tage bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in 100 ml Chloroform suspendiert und mit Wasser (50 ml) gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und der Rest in 100 ml Chloroform suspendiert und mit Wasser (50 ml) gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von 2-Propanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,45, CHCl₃/2-Propanol 95:5) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 3,24 g tert-Butyl-N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-1-tricosanoat als ein farbloses Öl zu ergeben. Ein Aliquot des tert-Butyl-N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-1-tricosanoat (0,49 g) wurde in 10 ml 4 N HCl in Dioxan gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt. Die resultierende rohe N-CBZ-23-Amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-1-tricosansäure wurde in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung wurden N-Hydroxysuccinimid (0,10 g), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (0,16 g) und N⁴-(5'-Aminopentyl)-N1,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,50 g) zugegeben. Die Lösung wurde 2,5 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Dimethylformamid wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform (100 ml) aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde nacheinander mit 0,1 N HCl (75 ml) und gesättigter NaHCO₃ ge waschen. Die Chloroformlösung wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von 2-Propanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,33, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,19 g von N⁴-(5-N-(N-CBZ-23'-Amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,-N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonal)spermin als ein farbloses Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst und mit 0,19 g 10% Pd/C und 50 PSIG H₂ 2,5 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Pd/C wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt und das Lösungsmittel aus dem Filtrat im Vakuum entfernt, um N⁴-(5-N-(23'-Amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonal)spermin als ein farbloses Öl (0,13 g) zu ergeben. N⁴-(5-N-(23'-Amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)-aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonal)spermin (0,13 g) wurde in Tetrahydrofuran (20 ml) gelöst und zur Lösung wurden 0,048 ml Diisopropylethylamin und 0,073 g Succinimidyl-S-α-3'-propionyltetra-O-acetylthiomannosid zugegeben und die Lösung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Glas zu ergeben. Dieses Glas wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenen Fraktionen (DSC R_f 0,36, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,10 g N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidotetra-O-acetylthiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris-(tert.-butyloxycarbonal)spermin als ein Öl zu ergeben. FAB-Massenspektrum, MH⁺ = 3328. Das N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidotetra-O-acetylthiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonal)spermin (0,55 g) wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel entfernt (2 x 20 ml), um 0,76 g von N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidotetra-O-acetylthiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in 20 ml Methanol gelöst und zur Lösung 20 ml Wasser und 0,85 g Na₂CO₃ zugegeben und die Lösung 6,5 Stunden bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und der Rest in 6 ml 1%ige Essigsäure aufgenommen und in vier 1,5 ml-Aliquoten auf 3 SephadexTM-G-25-Mediumsäulen (jeweils 12 ml) gereinigt und mit 1% Essigsäure eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, um 0,22 g von N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat als ein Öl zu ergeben. NMR (D₂O) δ 1,35 (m, 4H), 1,55 (m, 6H), 1,75 (m, 6,4H), 1,91 (s, 14H), 2,09 (m, 4,2H), 2,58 (t, 1,7H), 2,90 (m, 1,7H), 3,09, 3,19 (überlappend m, 18,1H), 3,53 (t, 2,5H), 3,69 (m, 22H), 3,88 (m, 3,8H), 4,06 (s, 1,7H), 5,30 (s, 1H).
BEISPIEL 33
Herstellung von N⁴-(5-N-(O-(5-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)pentyl-O-(2-acetamido)nonadecaethylenglykol)pentyl)spermintetracetat
N⁴-(5-N-(O-(5-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)pentyl-O-(2-acetamido)nonadecaethylenglykol)pentyl)spermintetracetat konnte ähnlich zu N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat durch Ersatz von 18,9 g Poly(ethylenglykol) eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 900 für das Pentaethylenglykol in dem in Beispiel 32 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
BEISPIEL 34
Herstellung von N⁴-(((23-[N²,N⁴-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat
N⁴-(((23-[N²,N⁴-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-spermintetraacetat wurde hergestellt ähnlich zu N⁴-(5-N-(23'-N-(S-α-3'-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat sowie dem in Beispiel 32 beschriebenen Verfahren. N⁴-(5-N-(23'-Amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,14 g) wurden in Tetrahydrofuran (25 ml) gelöst und zur Lösung wurden 0,052 ml Diisopropylethylamin und 0,37 g Succinimidyl-N²,N⁴-bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysinat zugegeben und die Lösung 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um ein Glas zu ergeben. Dieses Glas wurde auf Silikagel gereinigt und mit einem Gradient von Methanol in Chloroform eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen (DSC R_f 0,46, CHCl₃/Methanol 9:1) wurden vereinigt und das Lösungsmittel entfernt, um 0,15 g von N⁴-(((5-N-(23'-N-(N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris(tert.-butyloxycarbonyl)spermin als einen weißen Feststoff zu ergeben. FAB-Massenspektrum, MH⁺ = 3328. Das N⁴-(((5-N-(23'-N-(N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)aminopentyl)-N¹,N⁹,N¹²-tris-(tert.-butyloxycarbonyl)spermin (0,28 g) wurde in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel entfernt (2 × 20 ml), um 0,36 g von N⁴-(((5-N-(23'-N-(N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylhepta-O-acetylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanami do)aminopentyl)spermin als ein Öl zu ergeben. Dieses 01 wurde in 10 ml Methanol gelöst und zur Lösung wurden 10 ml Wasser und 0,44 g Na₂CO₃ zugegeben und die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt und der Rest in 5 ml 1%iger Essigsäure und 1 ml Ethanol aufgenommen und in vier 1,5 ml-Aliquoten auf 2-Sephadex^TM-G-25-Mediumsäulen (15 ml und 20 ml) gereinigt und mit 10% Ethanol in 1% Eissigsäure eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, um 0,095 g von N⁴-(((23-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxa-tricosanamido)-aminopentyl)spermintetraacetat zu ergeben.
Tabelle 1
Tabelle 2

Claims

Multifunktioneller molekularer Komplex zum Transferieren einer Nukleinsäurezusammensetzung zu einer Zielzelle, wobei der multifunktionelle molekulare Komplex umfaßt: A) die Nukleinsäure und B) einen Transfer-Rest, umfassend eine oder mehrere kationische Polyaminkomponenten, gebunden an die Nukleinsäure und mit der Formel (1):
worin: R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; m an jeder Stelle unabhängig ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 2 bis 5; n ausgewählt ist aus den ganzen Zahlen von einschließlich 1 bis 10; und jedes R³ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1–6-Alkyl und einer Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente; worin der Transfer-Rest mindestens eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente, gebunden an ein Stickstoffatom der kationischen Polyaminkomponente, umfaßt, und worin jede Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃; worin R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; j eine ganze Zahl von einschließlich 6 bis 24 darstellt; und B optional fehlt oder eine Brückengruppe der Formel darstellt: (i) -(CR¹R²)_k-C(=O)-Z-; (ii) -(CR¹R²)_k-N(R)-C(=O)-Z-; (iii) -(CR¹R²)_k-N(R)-{-C(=O)-CH₂-O-[-(CHz)₂-O-]_l-(CH₂)_k-N(R)}_P-C(=O)-Z-; oder (iv) -(CR¹R²)_k-C(=O)-{-N(R)-[-(CH₂)₂-O-]_l-CH₂-C(=O)}_P-Z-; worin k unabhängig eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt; 1 eine ganze Zahl von einschließlich 0 bis 30 darstellt; p eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 3 darstellt; R, R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; und Z O, S, N(R) darstellt oder fehlt; und (b) -B-(R⁴)R; worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C_1–6-Alkyl oder fehlt; B eine Brückengruppe darstellt, die unabhängig ausgewählt ist aus den Gruppen (i) bis (iv), wie oben in (a) in diesem Anspruch definiert, und zusätzlich aus einer Gruppe der Formel: (v) -(CR¹R²)_j'-X worin j' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 8 darstellt; R¹ und R² jedes unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl; X O, S, N(R) darstellt oder fehlt; und R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglykoproteine von umhüllten Tierviren; (ii) Cholinsäurederivaten der Formel (2);
worin: www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt; --- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass beide Bindungen nicht ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt; R⁶ -H, -OH- -CO₂H, -C(=O)NH₂, -OC(=O)NH₂, -NH₂ oder -O(CH₂CH₂O)_n·H darstellt, worin n' eine ganze Zahl von einschließlich 1 bis 6 darstellt; R⁷ einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholinsäurederivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl- oder -C_1–6-Alkylcarbonylgruppe; und R⁸ eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt; und (iii) Cholesterylderivaten der Formel (3):
worin: www eine Bindung unspezifizierter Stereochemie darstellt; --- eine Einzel- oder Doppelbindung darstellt, die einen gesättigten oder ungesättigten Teil des Ringsystems bildet, vorausgesetzt, dass beide Bindungen nicht ungesättigt sein können, wobei das Ringsystem entweder Δ4 oder Δ5 darstellt; R^6a einen Rest darstellt, der den Verknüpfungspunkt des Cholesterylderivats bildet, umfassend eine -C_1–6-Alkyl-, -OC(=O)- oder -OCH₂C(=O)-Gruppe; R^7a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt; und R^8a eine C_1–6-Alkylgruppe darstellt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin mindestens eine der R³-Gruppen die Formel -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃ aufweisen kann, worin B fehlt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 2, worin j 8 bis 18 beträgt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 2, worin j 8 bis 12 beträgt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin mindestens eine der R³-Gruppen die Formel -(CR¹R²)_j'-X(R⁴)R darstellt, worin X N(R) ist und R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglycoproteine von umhüllten Tierviren und (ii) Cholinsäure und Derivaten hiervon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3α, 7α, 12α-Trihydroxy-5β-cholan-24-ester und -amid.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 5, worin j' 2 bis 4 beträgt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin mindestens eine der R³-Gruppen die Formel -(CR¹R²)_j'-X(R⁴)R aufweisen kann, worin X O oder S darstellt und R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (i) fusogenen Peptiden, umfassend Spikeglycoproteine von umhüllten Tierviren und (ii) einer Cholesterylgruppe und Derivaten hiervon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat und -β-methylencarboxamid.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 7, worin R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff darstellen, wo immer sie auftreten, m 3 oder 4 beträgt, n 1 bis 6 beträgt, j' eine ganze Zahl von einschließlich 2 bis 4 darstellt und R⁴ Cholest-5-en-3'-β-carbonat, -β-carbamat und -β-methylencarboxamid darstellt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Gruppe, aus der R³ ausgewählt werden kann weiterhin umfaßt: Gruppen mit der Formel -B-(R⁵)R und mindestens eine der R³-Gruppen die Formel -B-(R⁵)R aufweist; worin B eine Brückengruppe darstellt, unabhängig ausgewählt aus den Gruppen einschließlich (i) bis (v), wie definiert in Anspruch 1; R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und C_1–6-Alkyl, oder fehlt; und R⁵ eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente darstellt, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) D-Biotin; (ii) β-3'-Propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid; (iii) N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (iv) N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; (v) 5-Methyltetrahydrofoliat; (vi) Folsäure; (vii) Folinsäure; (viii) α-3'-Propionylthiomannosid; und (ix) α-3'-Propionylthiomannosid-6-phosphat.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 9, worin mindestens eine der R³-Gruppen die Formel -(CR¹R²)_j'-N(R⁵)R aufweist, worin j' 1 bis 6 beträgt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 10, worin 2 der R³-Gruppen die Formel -(CR¹R²)_j'-N(R⁵)R aufweisen.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin mindestens eine der R³-Gruppen hiervon die Formel -B-(CR¹R²)_j-C(R)₃ aufweist, worin B fehlt, jedes R, R¹ und R², wo sie auftreten, Wasserstoff darstellt, m 3 oder 4 ist, n 1 bis 6 beträgt und j eine ganze Zahl von einschließlich 8 bis 18 darstellt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin der Transfer-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: N⁴-Octylspermidin; N⁴-Dodecylspermidin; N⁴-Octadecylspermidin; N⁴-Octylspermin; N⁴-Dodecylspermin; und N⁴-Octadecylspermin.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin der Transfer-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: N²-Octyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)penrylspermidin; N²-Dodecyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)pentylspermidin; N⁶-Octadecyl-N⁴-(5-(β-3'-propionylgalactosyl-β1"-4'-thioglucosid)amino)pentylspermidin; N⁶-Octyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin; N²-Dodecyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin; und N²-Octadecyl-N⁴-(5-[N^2',N^6'-bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N^6'-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]amino)pentylspermin.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 1, worin der Transfer-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: N⁴-(Benzyl-6'-hexanoyl)spermidintrihydrochlorid; N⁴-(6'-Hexanoyl)spermidin-HA2-peptid; N⁴-(5'-N-(3"α,7"α,12"α-Trihydroxy-5"β-cholanamido)pentyl)spermidintrihydrochlorid; N⁴-(5-N-(α-3'-Propionamidothiomannosid)pentyl)spermidintrihydrochlorid; N⁴-(N-CBZ-5-Aminopentyl)spermidintrihydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(N-CBZ-S-aminopentyl)spermintetrahydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(octyl)spermintetrahydrochlorid; 1,12-Bis-N-guanidino-N⁴,N⁹-bis-(octyl)-4,9-diaza-dodecantetrahydrochlorid; N⁴-(5-N-(Cholesten-3'β-carbamoyl)pentyl)spermintetrahydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(N,N-dimethyl-12'-dodecanamid)spermintetrahydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(12'-dodecansäure)spermintetrahydrochlorid; N⁴-(Benzyl-12'-dodecanoyl)spermintetrahydrochlorid; N⁴-(12'-Dodecansäure)spermintetrahydrochlorid; N⁴,N⁹-Bis(5-(α-3'-propionylthiomannosid)-aminopentyl)spermintetraacetat; N⁴-(5-N-(23'-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat; N⁴-(5-N-(O-(5-N-(α-3"-Propionamidothiomannosid)pentyl)-O-(2-acetamido)nonadecaethylenglycol)pentyl)spermintetraacetat; und N⁴-(((23-[N²,N⁶-Bis(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl]-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexaoxatricosanamido)aminopentyl)spermintetraacetat.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, der verschiedene kationische Polyaminkomponenten umfaßt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 16, der eine erste kationische Polyaminkomponente aufweist mit einer damit verknüpften Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente und eine zweite kationische Polyaminkomponente mit einer damit verknüpften Rezeptor-spezifischen Bindungskomponente.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin die Nukleinsäurezusammensetzung ein Nukleinsäuremolekül darstellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Peptid oder Protein kodiert oder als Matrize für ein Nukleinsäuremolekül dient.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 18, worin die Nukleinsäurezusammensetzung ein Plasmid darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen multifunktionellen molekularen Komplex nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche oder ein pahrmazeutisch akzeptables Salz oder einen Ester hiervon sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für den Transfer der Nukleinsäurezusammensetzung im Komplex in Zielzellen eines Individuums.
Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes, wie definiert in Anspruch 1, zur Herstellung eines sich selbst organisierenden Freisetzungssystems für den Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in Zielzellen eines Individuums.
Transfer-Rest nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, worin der Transfer-Rest mehr als eine kationische Polyaminkomponente umfaßt.
Transfer-Rest nach Anspruch 23, worin eine erste kationische Polyaminkomponente eine Endosommembran-Spaltungsförderungskomponente und eine zweite kationische Polyaminkomponente eine Rezeptor-spezifische Bindungskomponente umfaßt.
Multifunktioneller molekularer Komplex, verwendbar zum Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in Zellen, worin der multifunktionelle molekulare Komplex umfaßt: A) eine Nukleinsäurezusammensetzung und B) einen Transfer-Rest nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 24, worin jedes kationische Polyamin nichtkovalent an die Nukleinsäurezusammensetzung gebunden ist.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 23, worin die Nukleinsäurezusammensetzung ein Nukleinsäuremolekül darstellt, das eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die ein Peptid oder Protein kodiert, oder als Matrize für ein Nukleinsäuremolekül dient.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach Anspruch 26, worin die Nukleinsäurezusammensetzung ein Plasmid darstellt.
Multifunktioneller molekularer Komplex nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 27, umfassend ein mit der Rezeptor-spezifischen Bindungskomponente verknüpftes kationisches Polyamin, umfassend eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N²,N⁶-Bis((3-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysin; und N²,N⁶-Bis(β1-3'-propionylgalactosyl-β1-4-thioglucosid)lysyl-N⁶-(β-3'-propionylgalactosyl-(β-4-thioglucosid)lysin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen multifunktionellen molekularen Komplex nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder einen Ester hiervon sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung eines multifunktionellen molekularen Komplexes nach irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Transfer der Nukleinsäurezusammensetzung im Komplex in ein Individuum.
Verwendung eines Transfer-Rests nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung eines sich selbst organisierenden Freisetzungssystems zum Transfer einer Nukleinsäurezusammensetzung in eine Zielzelle.