ES2231791T3 - Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia genica a las celulas. - Google Patents

Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia genica a las celulas.

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Abstract

SE DISPONE UN COMPLEJO MOLECULAR MULTIFUNCIONAL PARA EL TRASPASO DE UNA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO A UNA CELULA DIANA. EL COMPLEJO ESTA COMPUESTO DE A) DICHA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO Y B) UNA ESTRUCTURA DE TRASPASO QUE COMPRENDE 1) UNA O MAS POLIAMINAS CATIONICAS ENLAZADAS A DICHA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO, 2) UNO O MAS COMPONENTES DE INTERRUPCION DE MEMBRANA ENDOSOMA INCORPORADOS A AL MENOS UN NITROGENO DE LA POLIAMINA Y 3) UNO O MAS COMPONENTES DE UNION ESPECIFICOS DEL RECEPTOR.

Description

Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia génica a las células.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a los procedimientos para la transferencia de información genética, p. ej., ADN extraño en células diana, especialmente células eucarióticas. En particular, la presente invención se refiere a vehículos génicos no víricos que comprenden conjugados moleculares multifuncionales que incluyen, entre otros, lipopoliaminas de una determinada configuración, un componente que activa la destrucción del endosoma, y, opcionalmente, un componente de unión específico del receptor. La presente solicitud se refiere al documento U.S. número de serie 08/314.060 presentado el 28 de septiembre de 1994 y titulado "Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia génica a las células" que se incorpora a la presencia memoria como referencia.
En el pasado se han utilizado con éxito vectores víricos de varios tipos para inserción de la información genética extraña seleccionada en una célula diana, y en el caso de las células eucarióticas, para la incorporación de esta información genética en el genoma de la célula. Estos sistemas de vector vírico se han basado en el sistema molecular del virus, han evolucionado a lo largo del tiempo para superar los problemas significativos frente a un virus que intenta invadir, es decir, infectar una célula. A pesar de la eficacia de dichos vectores víricos, sin embargo, se ha mantenido el interés con respecto a la seguridad de utilizar virus, particularmente desde el punto de vista de los efectos secundarios no deseados. De este modo, ha existido un esfuerzo continuo para desarrollar sistemas de administración génica no víricos que sean tan eficaces como los vectores víricos, pero con un perfil de seguridad mejorado.
Los vectores o vehículos no víricos, del tipo al que se refiere la presente invención, tendrán que superar de este modo los mismos obstáculos que un vector vírico. Los problemas a los que se enfrentan dichos vehículos incluyen la persistencia en la biofase del organismo durante un tiempo suficiente para alcanzar a la célula diana; el reconocimiento de la célula diana y los medios para intervenir en el transporte del material genético a través de la membrana celular y en el citoplasma de la célula; el impedimento de la degradación dentro de la célula por el sistema reticuloendotelial; y el transporte hasta y a través de la membrana nuclear en el núcleo de la célula donde puede tener lugar la transcripción del material genético.
La presente invención se refiere a la superación de los problemas descritos anteriormente; y ya que los problemas son varios y diferentes, la presente invención comprende un complejo multifuncional, es decir, un conjugado molecular de varios ligandos destinado a superar obstáculos específicos.
La utilidad última de las técnicas de transferencia génica es de enorme utilidad potencial en numerosas áreas. La transferencia del material genético en las células es la base de numerosos procedimientos ampliamente aceptados actualmente en las áreas de la biología molecular, la terapia génica y la inmunización genética. La transferencia de la información genética codificada en el ADN a las células en las que expresa proteínas individuales identificadas, ha permitido la investigación de la función de dichas proteínas en un nivel celular y de la fisiología de la célula subyacente. El material genético ha sido también transferido a las células para introducir proteínas que están ausentes debido a una imperfección genética inherente en la célula que expresa una proteína inactiva o si no impide la expresión de la proteína en conjunto. La transferencia de material genético en las células se puede utilizar para impedir la expresión de las proteínas en aquellas células mediante el efecto de cadena complementaria bien conocido de las cadenas, complementaria de ADN o de ARN.
El material genético exógeno, es decir, extraño puede permitir a las células sintetizar cantidades importantes de proteínas que no están disponibles por otros medios desde el punto de vista económico práctico. Estas proteínas en cuestión se pueden desarrollar en varias células huésped tales como levaduras, bacterias o células de mamífero. Se puede utilizar también material genético para proporcionar respuestas inmunitarias protectoras in vivo por inyección de ADN que codifica proteínas inmunógenas, es decir, las que pueden estimular la respuesta inmunitaria deseada. La introducción in vivo del material genético exógeno en las células tiene también utilidad potencial en aplicaciones para el alivio, el tratamiento o la prevención de trastornos metabólicos, tumorales o infecciosos por los mismos mecanismos enumerados anteriormente.
Descripción de la técnica anterior
Es posible transferir material genético a las células diana sin la utilización de vectores o vehículos. Por ejemplo, se puede introducir material genético de forma generalizada mediante una inyección intravenosa o intraperitoneal para aplicaciones in vivo, o se puede introducir en la zona de acción por inyección directa en esta área. Por ejemplo, se ha reconocido hace tiempo que el ADN, por si mismo, inyectado en varios tejidos, se introducirá en las células y producirá una proteína que provocará una respuesta inmunitaria. Véase, p. ej., P. Atanasiu et al., Academie des Sciences (Paris) 254, 4228-30 (1962); M.A. Israel et al., J. Virol. 29, 990-96 (1979); H. Will et al., Nature, 299, 740-42 (1982); H. Robinson, solicitud de patente mundial WO 86/00930, publicada el 13 de febrero de 1986; P.L. Felgner, J.A. Wolff, G.H. Rhodes, R.W. Malone y D.A. Carson, solicitud de patente mundial WO 90/11092, publicada el 4 de octubre de 1990; y R.J. Debs y N. Zhu, solicitud de patente mundial WO 93/24640 publicada el 9 de diciembre de 1993. Sin embargo, el ADN por si mismo es hidrófilo y el carácter hidrófobo de la membrana celular coloca una barrera significativa a la transferencia del ADN a través de ella. Por consiguiente, se ha llegado a preferir en la técnica utilizar facilitadores que aumenten la transferencia de ADN en las células en inyección directa.
Otro enfoque en la técnica para la administración de material genético a las células diana es el que se aprovecha de las vías de endocitosis mediadas por el receptor natural que existe en dichas células. Se han identificado diversos receptores célulares en lo sucesivo como agentes deseables por medio de los cuales es posible conseguir el direccionamiento específico de los fármacos y especialmente de las macromoléculas y de los conjugados moleculares que sirven como vehículo de material genético del tipo al que se refiere la presente invención. Estos receptores celulares permiten el direccionamiento específico en virtud de estar localizados en un determinado tejido o que tienen una avidez aumentada o una actividad en un determinado tejido. Véase, por ejemplo, J.L. Bodmer y R.T. Dean, Meth. Enzymol., 112, 298-306 (1985). Esto proporciona las ventajas de dosis menores o efectos secundarios indeseables significativamente menores.
Uno de los ejemplos mejor conocidos de una célula y de un receptor selectivo de tejido es el receptor de asialoglucoproteína presente en los hepatocitos. El receptor asialoglucoproteína es un receptor extracelular con gran afinidad para la galactosa, especialmente para los oligosacáridos de tres antenas, es decir, aquellos con tres cadenas algo extendidas o brazos más espaciados con restos de galactosa terminal; véase, p. ej., H.F. Lodish, TIBS, 16, 374-77 (1991). Este receptor de gran afinidad está localizado en los hepatocitos y no está presente en las células de Kupffer; permitiendo un alto grado de selectividad en la administración al hígado.
Se ha propuesto también en la técnica de la transferencia génica mediada por el receptor que para que el procedimiento sea eficaz in vivo, el conjunto del complejo de ADN debería producir condensación del ADN en una dimensión adecuada para la absorción por vía endocítica. Véase, p. ej., J.C. Perales, T. Ferkol, H. Beegen, O.D. Ratnoff y R.W. Hanson, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 4086-4090 (1994).
Un método alternativo para proporcionar la unión selectiva de las células es atacar una entidad con capacidad para unirse al tipo de célula en cuestión; se utilizan frecuentemente a este respecto los anticuerpos que se pueden unir a las proteínas específicas presentes en las membranas celulares o en las regiones externas de las células diana. Han sido reconocidos también como útiles receptores alternativos para facilitar el transporte de las macromoléculas, tales como los receptores de biotina y de folato; véase P.S. Low, M.A. Horn y P.F. Heinstein, solicitud de patente mundial WO 90/12095, publicada el 18 de octubre de 1990; P.S. Low, M.A. Horn y P.F. Heinstein, solicitud de patente mundial WO 90/12096, publicada el 18 de octubre de 1990; P.S. Low, M.A. Horn y P.F. Heinstein, patente U.S. nº 5.108.921, 28 de abril, 1992; C.P. Leamon y P.S. Low, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 5572-5576 (1991); receptores de transferrina; receptores de insulina; y receptores de manosa (véase más adelante). Los receptores enumerados son meramente representativos y otros ejemplos se le ocurrirán fácilmente al especialista.
La conjugación de diferentes grupos funcionales en la misma molécula también se ha utilizado en la técnica. Por ejemplo, en 1988 G.Y. Wu y C.H. Wu, J. Biol. Chem., 263, 14621-14624 (1988) describió un procedimiento para la administración mediada por el receptor celular del ADN a hepatocitos. Este procedimiento fue descrito además en G.Y. Wu y C.H. Wu, Biochem., 27, 887-892 (1988); G.Y. Wu y C.H. Wu, patente U.S. nº 5.166.320, 24 de noviembre, 1992; y G.Y. Wu y C.H. Wu, solicitud de patente mundial WO 92/06180, publicada el 16 de abril de 1992. El procedimiento consiste en conectar una glucoproteína, asialoorosomucoide, a una poli-lisina para proporcionar un vehículo de ADN selectivo al hepatocito. La función de la poli-lisina es unirse al ADN mediante interacciones iónicas entre los grupos amino cargados positivamente (catiónicos) de las lisinas y los grupos fosfato cargados negativamente (aniónicos) del ADN. El orosomucoide es una glucoproteína que normalmente está presente en el suero humano. La eliminación del ácido siálico terminal (ácido N-acetil neuramínico) de los oligosacáridos ramificados expone los oligosacáridos de galactosa terminal, para los cuales los receptores de hepatocito tienen una gran afinidad, como se describió ya.
Después de la unión del receptor de asialoglucoproteína en los hepatocitos, la proteína es introducida en la célula por endocitosis en un endosoma pre-lisosómico. El ADN, unido iónicamente al vehículo poli-lisina asialoorosomucoide, es también introducido en el endosoma. Otro trabajo utilizando este sistema de administración, p. ej., el realizado por J.M. Wilson, M. Grossman, J.A. Cabrera, C.H. Wu y G.Y. Wu, J. Biol. Chem, 267, 11483-11489 (1992), ha descubierto que la hepatectomía parcial mejora la persistencia de la expresión del ADN administrado a los hepatocitos. La transferencia del ADN a las células por este mecanismo aumenta también de manera significativa mediante la adición de lípidos catiónicos. Véase, p. ej., K.D. Mack, R. Walzem y J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307, 138-143 (1994).
La utilización de una asialoglucoproteína específica no se necesita para conseguir unirse del receptor de asialoglucoproteína; esta unión se puede también realizar con gran afinidad mediante la utilización de pequeñas moléculas sintéticas que tienen una configuración similar. La parte de carbohidrato se puede eliminar a partir de una glucoproteína apropiada y conjugarse con otras macromoléculas; véase, p. ej., S.J. Wood y R. Wetzel, Bioconj. Chem., 3, 391-396 (1992). Mediante este procedimiento la parte de la glucoproteína de la unión del receptor celular se elimina y la parte específica requerida para la unión celular selectiva se puede transferir a otra molécula.
Existe amplia bibliografía para la preparación de glucósidos sintéticos que se pueden unir a macromoléculas y comunicarlas la capacidad para unirse al correspondiente receptor específico de galactosa. La importancia de los glucósidos ramificados fue reconocida al principio; véase Y.C. Lee, Carb. Res., 67, 509-514 (1978). El trabajo posterior indicó que la densidad del azúcar [K. Kawaguchi, M. Kuhlenschmidt, S. Roseman y Y.C. Lee, J. Biol. Chem., 256, 2230-2234 (1981)] y las relaciones espaciales [Y.C. Lee, R.R. Townsend, M.R. Hardy, J. Lonngren, J. Arnarp, M. Haraldsson y H. Lonn, J. Biol. Chem., 258, 199-202 (1983)] son importantes determinantes de la potencia de unión. La aminación reductora de un péptido con un terminal amino de tri-lisina ramificado da un ligando que finaliza con cuatro restos galactosilo que se pueden acoplar fácilmente a la poli-lisina o a otras macromoléculas; véase C. Plank, K. Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler y E. Wagner, Bioconj. Chem., 3, 533-539 (1992); y se ha utilizado para preparar construcciones de ADN.
Se han preparado derivados glucosídicos de tiopropionato y tiohexanoato de galactosa y unido a L-lisil-L-lisina para formar un derivado sintético de galactosa con tres antenas. Un derivado de bisacridina espermidina que contiene esta galactosa con tres antenas sintéticas se ha utilizado para dirigir el ADN a los hepatocitos; véase F.C. Szoka, Jr. y J. Haensler, solicitud de patente mundial WO 93/19768, publicada el 14 de octubre de 1993; y J. Haensler y F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 85-93 (1993).
Otros medios para proporcionar el receptor celular basados en la facilitación de la transferencia génica a las células utilizando poli-lisina como vehículo han sido descritos en la técnica. Se han utilizado anticuerpos específicos para la trombomodulina de la superficie celular con poli-lisina como un sistema de administración para ADN in vitro e in vivo; véase V.S. Trubetskoy, V.P. Torchilin, S.J. Kennel y L. Huang, Bioconj. Chem., 3; 323-327 (1992). Se ha utilizado también el receptor de transferrina para dirigir el ADN a los eritroblastos, a los macrófagos K562 y a las células leucémicas ML-60; véase E. Wagner, M. Zenke, M. Cotten, H. Beug y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990); M. Zenke, P. Steinlein, E. Wagner, M. Cotten, H. Beug y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1990); y G. Citro, D. Perrotti, C. Cucco, I. D'Agnano, A. Sacchi, G. Zupi y B. Calabretta, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7031-7035 (1990). Estos estudios utilizaron tanto oligodesoxinucleótidos pequeños como plásmidos grandes.
La capacidad de la poli-lisina para facilitar la introducción del ADN en las células aumenta de forma significativa si la poli-lisina se modifica químicamente con terminales hidrófobos; véase X. Zhou y L. Huang, Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203 (1994); acomplejados con lípidos catiónicos; véase K.D. Mack, R. Walzem y J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307, 138-143 (1994) o asociados con virus. Muchos virus infectan células específicas por la unión mediada por el receptor y la inserción del ADN/ARN vírico en la célula; y de este modo esta acción del virus es similar a la introducción facilitada del ADN descrito anteriormente.
Se ha utilizado adenovirus incompetente para la replicación para aumentar la introducción de ADN acomplejado por transferrina-poli-lisina en las células; véase D.T. Curiel, S. Agarwal, E. Wagner y M. Cotten, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854 (1991); E. Wagner, K. Zatloukal, M. Cotten, H. Kirlappos, K. Mechtler, D.T. Curiel y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 6099-6103 (1992); M. Cotten, E. Wagner, K. Zatloukal, S. Phillips, D.T. Curiel y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 6094-6098 (1992); y L. Gao, E. Wagner, M. Cotten, S. Agarwal, C. Harris, M. Romer, L. Miller, P. -C. Hu y D. Curiel, Hum. Gene Ther., 4, 17-24 (1993). El adenovirus aumenta la entrada del complejo de poli-lisina-transferrina-ADN cuando está unida por enlace covalente a la poli-lisina y cuando está conectada mediante un punto de unión al anticuerpo. No necesita ser una unión directa del adenovirus al complejo poli-lisina-transferrina-ADN y puede facilitar la entrada del complejo cuando está presente como una simple mezcla. El complejo poli-lisina-transferrina-ADN proporciona la unión específica del receptor a las células y está interiorizada en los endosomas junto con el ADN. Una vez dentro de los endosomas, el adenovirus facilita la entrada del complejo ADN/transferrina-poli-lisina en la célula por destrucción del compartimento endosómico con la liberación posterior del ADN en el citoplasma. Se ha utilizado también adenovirus incompetente para la replicación para aumentar la entrada de plásmidos de ADN no acomplejados en las células sin la ventaja de la selectividad del receptor de la célula comunicada por el complejo poli-lisina-transferrina; véase K. Yoshimura, M.A. Rosenfeld, P. Seth y R.G. Cristal, J. Biol. Chem., 268, 2300-2303 (1993).
Los péptidos sintéticos tal como la zona N-terminal de la proteína hemaglutinina de la gripe son conocidos por desestabilizar las membranas y son conocidos como péptidos fusógenos. Los conjugados que contienen el péptido fusógeno de la gripe acoplado a la poli-lisina junto con un péptido que tiene un ligando con terminal amino de tri-lisina ramificado que acaba con cuatro restos galactosilo han sido preparados como facilitadores de la introducción del ADN en los hepatocitos; véase C. Plank, K. Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler y E. Wagner, Bioconj. Chem., 3, 533-539 (1992). Estos conjugados combinan la unión mediada por el receptor de asialoglucoproteína comunicada por el péptido tetra-galactosa, las capacidades de destrucción endosómica del péptido fusógeno de la gripe y la unión al ADN de la poli-lisina. Estos conjugados suministran ADN a la célula por una combinación de absorción mediada por el receptor e interiorización en los endosomas. Esta interiorización es seguida por la destrucción de los endosomas por el péptido fusógeno de la gripe para liberar el ADN en el citoplasma. De un modo similar, el péptido fusógeno de la gripe se puede unir a poli-lisina y mezclar con el complejo transferrina-poli-lisina para proporcionar un vehículo de ADN similar selectivo para las células que llevan el receptor de transferrina; véase E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7934-7938 (1992). Se pueden también utilizar péptidos denominados sintéticamente; por ejemplo los péptido "GALA" [N.K. Subbarao, R.A. Parente, F.C. Szoka, Jr, L. Nadasdi y K. Pongracz, J. Biol. Chem., 26, 2964-2972 (1987)] se han acoplado a los vehículos de ADN y se observó un aumento de entrada facilitada en las células [J. Haensler y F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 372-379 (1993)]. El péptido amfipático catiónico gramicina S puede facilitar la introducción del ADN a las células [J.Y. Legendre y F.C. Szoka, Jr., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 893-897 (1993)], pero también requiere un fosfolípido para conseguir una transferencia significativa de ADN.
La poli-lisina no es la única en proporcionar un marco policatiónico para la introducción del ADN a las células. El DEAE-dextrano ha demostrado también ser eficaz para favorecer la entrada de ARN y ADN en las células; véase R. Juliano y E. Mayhew, Exp. Cell. Res. 73, 3-12 (1972); y E. Mayhew y R. Juliano, Exp. Cell. Res. 77, 409-414 (1973). Más recientemente, un copolímero en cascada dendrítico de etilendiamina y acrilato de metilo ha demostrado ser útil para proporcionar un vehículo de ADN que facilita la introducción en las células; véase J. Haensler y F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 372-379 (1993). Un polímero de polivinilpiridina alquilado se ha utilizado también para facilitar la introducción del ADN en las células; véase A.V. Kabanov, I.V. Astafieva, I.V. Maksimova, E.M. Lukanidin, G.P. Georgiev y V.A. Kabanov, Bioconj. Chem., 4, 448-454 (1993).
Se han utilizado también ampliamente liposomas cargados positivamente como vehículos de ADN que facilitan la introducción en las células; véase, p. ej., F.C. Szoka, Jr. y J. Haensler, solicitud de patente mundial WO 93/19768, publicada el 14 de octubre de 1993; R.J. Debs y N. Zhu, solicitud de patente mundial WO 93/24640, publicada el 9 de diciembre de 1993; P. L. Felgner, R. Kumar, C. Basava, R.C. Border y J.-Y. Hwang-Felgner, solicitud de patente mundial WO 91/16024, publicada el 31 de octubre de 1991; P.L. Felgner y G.M. Ringold, Nature, 337, 387-388 (1989); J.K. Rose, L. Buonocore y M.A. Whitt, BioTechniques, 10, 520-525 (1991); C.F. Bennett, M.Y. Chiang, H. Chan, J.E.E. Schoemaker y C.K. Mirabelli, Mol. Pharm. 41, 1023-1033 (1992); J.H. Felgner, R. Kumar, C.N. Sridhar, C.J. Wheeler, Y.J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin y P.L. Felgner, J. Biol. Chem., 269, 2550-2561 (1994); J.G. Smith, R.L. Walzem y J.B. German, Biochim. Biophys. Acta, 1154, 327-340 (1993). Estas composiciones del vehículo han incluido también liposomas sensibles al pH; véase C.-J. Chu, J. Dijkstra, M.-Z. Lai, K. Hong y F.C. Szoka, Jr., Pharm. Res., 7, 824-854 (1990); J.-Y. Legendre y F.C. Szoka, Jr., Pharm. Res., 9, 1253-1242 (1992).
Se ha preparado un lípido poli-catiónico acoplando dioctadecilamidoglicina y dipalmitoil fosfatidiletanolamina a una 5-carboxiespermina; véase P. Behr, B. Demeinex, J.-P. Loeffler y J. Perez-Mutul, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986 (1989); F. Barthel, J.-S. Remy, J.-P. Loeffler y J.P. Behr, DNA and Cell Biol., 12, 553-560 (1993); J.-P. Loeffler y J.-P. Behr, Meth. Enzymol., 217, 599-618 (1993); J.-P. Behr y J.-P. Loeffler, patente U.S. nº 5.171.678, 15 de diciembre, 1992. Estas esperminas lipófilas son muy activas para transferir el ADN a través de las membranas celulares.
Se han utilizado combinaciones de lípidos para facilitar la transferencia de los ácidos nucleicos dentro de las células. Por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.283.185 se ha expuesto dicho procedimiento que utiliza una dispersión de lípido mezclado de un lípido catiónico con un co-lípido en un disolvente adecuado. El lípido tiene una estructura que incluye un grupo lipófilo procedente de colesterol, un enlace conectador, un brazo intercalador de alquilo lineal y un grupo amino catiónico; y el co-lípido es fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina.
Los macrófagos tienen receptores tanto para la manosa como para manosa-6-fosfato que se puede unir a moléculas e interiorizarlas desplegando estos azúcares. Las moléculas se interiorizan por endocitosis dentro de un endosoma pre-lisosómico. Este interiorización se ha utilizado para la introducción de oligonucleótidos en macrófagos utilizando albúmina de suero bovino modificada con manosa-6-fosfato y unida a un oligodesoxinucleótido mediante un puente disulfuro a un extremo 3' modificado; véase E. Bonfils, C. Depierreux, P. Midoux, N.T. Thuong, M. Monsigny y A.C. Roche, Nucl. Acids Res. 20, 4621-4629 (1992). Asimismo, los oligodesoxinucleótidos modificados en el terminal 3' con biotina se combinaron con estreptavidina modificada con manosa y se observó también que han facilitado la introducción en los macrófagos; véase E. Bonfils, C. Mendes, A.C. Roche, M. Monsigny y P. Midoux, Bioconj. Chem., 3, 277-284 (1992).
Se ha demostrado que varios péptidos y proteínas, muchos de los cuales son naturales, tienen receptores en las superficies celulares, que una vez están unidos a ellas, les permiten llegar a ser interiorizados por endocitosis. Los materiales unidos a estos receptores se administran a los compartimentos endosómicos dentro de la célula. Los ejemplos incluyen la insulina, vasopresina, lipoproteína de baja densidad, factor de crecimiento epidérmico y otros. Esta interiorización se ha utilizado también para facilitar la introducción del ADN en las células; p. ej., se ha conjugado la insulina a la polilisina para proporcionar la entrada del ADN facilitada en las células que poseen un receptor de insulina; véase B. Huckett, M. Ariatti y A.O. Hawtrey, Biochem. Pharmacol., 40, 253-263 (1990).
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un complejo molecular multifuncional para la transferencia de una compuesto de ácido nucleico a una célula diana que comprende en cualquier combinación funcional: A) dicho ácido nucleico; B) un vehículo de administración, denominado en esta memoria "grupo de transferencia", que comprende a) uno o más componentes de poliamina catiónica unidos a dicho ácido nucleico, comprendiendo cada uno de tres a doce átomos de nitrógeno; b) uno o más componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma unidos a un átomo de nitrógeno del componente de poliamina catiónica, mediante un grupo alquilo, carboxamida, carbamato, tiocarbamato o carbamoilo en puente, que comprende i) al menos un grupo alquilo de cadena larga lipófilo, ii) un péptido fusógeno que comprende glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados, o iii) ácido cólico, colesterilo o derivados de los mismos; y opcionalmente C) uno o más componentes del enlace específico del receptor que son ligandos para receptores naturales de dicha célula diana, unidos mediante un grupo puente de alquilo, carboxamida, carbamato, tiocarbamato o carbamoilo a ya sea a) otro átomo de nitrógeno de un componente de poliamina catiónico al que se une un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, o b) un átomo de nitrógeno de un componente de poliamina catiónico al que no se ha unido un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma.
Según el primer aspecto de la presente invención se proporciona un complejo molecular multifuncional para transferir una composición de ácido nucleico a una célula diana, complejo molecular multifuncional que comprende:
A) el ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia que comprende uno o más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido nucleico y que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente de entre los enteros 2 a 5 inclusive;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10 inclusive; y
cada R^{3} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-6} y un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de poliamina catiónico; y
en la que cada componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(a)-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3};
en la que R, R^{1}y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
j es un entero de 6 a 24 inclusive; y
B está ausente opcionalmente, o es un grupo de unión de fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en la que k es, independientemente, un entero de 1 a 6 inclusive;
l es un entero de 0 a 30 inclusive;
p es un entero de 1 a 3 inclusive;
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; y
Z es O, S, N(R), o está ausente;
y
(b)-B-(R^{4})R;
en la que R se selecciona cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente;
B es un grupo puente seleccionado independientemente de entre los grupos (i) a (iv) como se definió anteriormente (a) en esta reivindicación, y además un grupo de fórmula:
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-
en la que j' es un entero de 1 a 8 inclusive;
R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula (2);
1
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o
\Delta5.
R^{6} es -H, -OH, -CO_{2}H, -C(=O)NH_{2}, -OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o -O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n' es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión del derivado de ácido cólico, que comprende un grupo alquilo C_{1-6} o un grupo alquilcarbonilo C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo C_{1-6}; y
(iii) colesteril-derivados de fórmula (3):
7
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo-C_{1-6}, -OC(=O)- o -OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo C_{1-6}; y
R^{8a} es un grupo alquilo C_{1-6}.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que B está ausente.
Preferentemente, j es 8 a 18.
Más preferentemente, j es 8 a 12.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R, en la que X es N(R) y R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus encapsulado de animales, y (ii) ácido cólico y derivados del mismo seleccionados de entre el grupo constituido por éster y amida del ácido 3\alpha, 7\alpha, 12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
Preferentemente, j' es 2 a 4.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R, en la que X es O o S y R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus encapsulados de animal, y (ii) un grupo colesterilo y derivados del mismo seleccionados de entre el grupo constituido por colest-5-en-3'-\beta-carbonato, \beta-carbamato y-\beta-metilencarboxamida.
En dichas formas de realización, R, R^{1} y R^{2} pueden ser cada uno hidrógeno, donde quiera que se encuentren, m puede ser 3 ó 4, n puede ser 1 a 6, j' puede ser un entero de 2 a 4 inclusive, y R^{4} puede ser colest-5-en-3'-\beta-carbonato, -\beta-carbamato o -\beta-metilen-carboxamida.
El grupo del que R^{3}se puede seleccionar comprende además grupos que tienen la fórmula -B-(R^{5})R, y al menos uno de los grupos R^{3} tiene la fórmula -B-(R^{5})R;
en la que B es un grupo de enlace seleccionado independientemente de entre los grupos (i) a (v) inclusive tal como se define en la reivindicación 1;
R se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo constituido por:
(i) D-biotina;
(ii) galactosil-\beta1-4-tioglucósido de \beta-3'-propionilo;
(iii) N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv) N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de \alpha-3'-propionilo; y
(ix) tiomanósido-6-fosfato de \alpha-3'-propionilo.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'} -N(R^{5})R, en la que j' es 1 a 6.
Dos de los grupos R^{3} pueden tener la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'} -N(R^{5})R.
Al menos uno de los grupos R^{3} de la misma puede tener la fórmula -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que B está ausente, R, R^{1} y R^{2} son cada uno hidrógeno donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6 y j es un entero de 8 a 18 inclusive.
El grupo de transferencia se puede seleccionar de entre el grupo constituido por:
N^{4}-octilespermidina;
N^{4}-dodecilespermidina;
N^{4}-octadecilespermidina;
N^{4}-octilespermina;
N^{4}-dodecilespermina; y
N^{4}-octadecilespermina.
El grupo transferencia se puede seleccionar de entre el grupo constituido por:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina; y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
Preferentemente, el grupo de transferencia se puede seleccionar de entre el grupo constituido por:
trihidrocloruro de N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-espermidina;
péptido de N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina HA2;
trihidrocloruro de N^{4}-(5'-N-(3''\alpha, 7''a, 12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de N^{4}-(5-N-(\alpha-3'-propionamido tiomanósido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(octil)espermina;
tetrahidrocloruro de 1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta carbamoil)pentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(12'-ácido dodecanoico)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(bencil 12'-dodenanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(12'-ácido dodecanoico)-espermina;
tetraacetato de N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil tiomanósido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecatileno glicol)pentil)-espermina; y
tetraacetato de N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricasanamido)aminopentil)-espermina.
El complejo molecular multifuncional puede comprender además diferentes componentes de poliamina catiónica.
El complejo molecular multifuncional puede comprender además un primer componente de poliamina catiónica que tiene un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma unido a éste y un segundo componente de poliamina catiónica que tiene un componente con enlace específico del receptor unido a éste.
La composición de ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un péptido o proteína, o sirve como plantilla para una molécula de ácido nucleico.
La composición de ácido nucleico puede ser un plásmido.
Según el segundo aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo molecular multifuncional como se describió anteriormente, o una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según el tercer aspecto de la presente invención se proporciona una utilización de un complejo molecular multifuncional como el descrito anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para la transferencia de la composición de ácido nucleico en el complejo a las células diana de un individuo.
Según el cuarto aspecto de la presente invención se proporciona una utilización de un complejo molecular multifuncional como el definido anteriormente para la preparación de un sistema de administración autoacoplable para la transferencia de la composición de ácido nucleico a las células diana de un individuo.
Se ha dado a conocer además un sistema de administración autoacoplable para la transferencia de una composición de ácido nucleico a la célula diana que comprende los siguientes componentes independientes capaces de ser llevados conjuntamente y de unirse químicamente en un complejo molecular por simple mezclado: A) dicho ácido nucleico que ha de ser transferido; y B) un grupo de transferencia definido anteriormente.
Se ha dado a conocer también un procedimiento para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células diana en una base in vitro. El procedimiento comprende la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con un complejo molecular multifuncional que incluye dicha composición de ácido nucleico, tal como se detalló más anteriormente, transfiriendo de este modo a dichas células, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o una proteína deseados, o sirve como plantilla para las moléculas de ácido nucleico funcional. La proteína o la molécula de ácido nucleico funcional deseadas puede ser cualquier producto de interés industrial, comercial o científico, p. ej., agentes terapéuticos incluyendo vacunas; comestibles y complementos nutritivos; compuestos de importancia agrícola tales como herbicidas y reguladores del crecimiento vegetal, insecticidas, acaricidas, rodenticidas y fungicidas; compuestos útiles en sanidad animal tales como parasiticidas incluyendo nematocidas; y así sucesivamente. Las células diana son normalmente cultivos de células huésped que comprenden células de microorganismos tales como bacterias y levaduras, pero pueden incluir además células vegetales y de mamíferos. Los cultivos celulares se mantienen según las técnicas de fermentación bien conocidas en la técnica, que maximizan la producción de la proteína o de la molécula de ácido nucleico funcional deseadas y los productos de la fermentación se recogen y purifican por procedimientos conocidos.
Se ha dado a conocer también un procedimiento para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células diana en una base in vitro. El procedimiento comprende la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con un complejo molecular multifuncional que incluye dicha composición de ácido nucleico, tal como se detalló además anteriormente, administrando de este modo a dichas células, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o una proteína deseados, o sirve como plantilla para las moléculas de ácido nucleico funcional. La molécula de ácido nucleico se administra exenta de partículas retrovíricas. La proteína deseada puede ser una proteína que funcione dentro del individuo o sirva para iniciar una respuesta inmunitaria. La molécula de ácido nucleico se puede administrar a las células de dicho individuo en una base in vivo o ex vivo, es decir, el contacto con las células del individuo puede tener lugar dentro del cuerpo del individuo según los procedimientos que se emplean más típicamente, o el contacto con las células del individuo puede tener lugar fuera del cuerpo del individuo extrayendo las células que se desea para tratarlas fuera del cuerpo del individuo por varios medios adecuados, seguido de poner en contacto dichas células con dicha molécula de ácido nucleico, seguido a su vez por la devolución de dichas células al cuerpo de dicho individuo.
Se ha dado a conocer también un procedimiento de inmunización de un individuo contra un patógeno. El procedimiento comprende la etapa de poner en contacto las células de dicho individuo con un complejo molecular multifuncional que incluye una composición de ácido nucleico, tal como se detalló además anteriormente, administrando de este modo a las células una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico a, o sustancialmente similar a un epítopo desplegado en dicho patógeno como antígeno, y dicha secuencia de nucleótidos se conecta operativamente a las secuencias reguladoras. La molécula de ácido nucleico es capaz de expresarse en las células del individuo.
Se han dado a conocer también procedimientos de inmunización de un individuo contra una enfermedad hiperproliferante o una enfermedad autoinmunitaria. Los procedimientos comprenden la etapa de poner en contacto las células de dicho individuo con un complejo molecular multifuncional que incluye una composición de ácido nucleico, tal como se detalló además anteriormente, administrando de este modo a las células una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo desplegado en una proteína relacionada con una enfermedad hiperproliferante o una proteína relacionada con una enfermedad autoinmunitaria, respectivamente, y está conectado operativamente a las secuencias reguladoras. Siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en las células.
Se han dado a conocer también procedimientos para el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad autoinmunitaria que comprende las etapas de poner en contacto las células de dicho individuo con un complejo molecular multifuncional que incluye una composición de ácido nucleico, tal como la detallada además anteriormente, administrando de este modo a las células de dicho individuo, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que restablece la actividad de un gen ausente, defectuoso o inhibido, o que codifica una proteína que produce un efecto terapéutico en el individuo y está funcionalmente ligada a las secuencias reguladoras; siendo la molécula de ácido nucleico capaz de expresarse en dichas células.
Se han descrito además kits farmacéuticos que comprenden un recipiente que consta de una composición de ácido nucleico y un recipiente que consta de un grupo de transferencia. Opcionalmente, se ha incluido en dichos kits excipientes, portadores, conservantes y vehículos tales como disolventes.
Descripción detallada de la invención
Según una forma de realización de la presente invención se proporciona un complejo molecular multifuncional para la transferencia de una composición de ácido nucleico a una célula diana, que proporciona un alto nivel de transfección y la expresión de las moléculas de ácido nucleico en la diana, es decir, la célula huésped. Este complejo molecular multifuncional comprende esencialmente la combinación de dos elementos clave, (I) el ácido nucleico que se desea transferir a la célula diana, y (II) el grupo de transferencia, que se acompleja con la molécula de ácido nucleico y comprende varios componentes cuya función es i) localizar la célula diana deseada dentro del cuerpo de un individuo por medio de un componente de la unión específica del receptor sensible del receptor específico en la superficie de la membrana de dicha célula diana; ii) superar la incompatibilidad que surge de la naturaleza hidrófila de la molécula de ácido nucleico y la naturaleza lipófila de la membrana de modo que la primera pueda pasar a través de esta última; y iii) impedir la degradación de la molécula de ácido nucleico en un lisosoma de dicha célula diana, destruyendo el pre-lisosoma, etapa de formación de endosomas, que se lleva a cabo por medio de una membrana de endosoma que destruye el componente que permite al complejo molecular multifuncional librarse de un endosoma formado como resultado del proceso de endocitosis o pinocitosis de la célula diana, de este modo el complejo molecular multifuncional se introduce en la célula diana y se incorpora en dicho endosoma.
Los componentes del grupo de transferencia son los siguientes: A) un componente de poliamina catiónica unido a dicha composición de ácido nucleico, que comprende de tres a doce átomos de nitrógeno; B) la destrucción de la membrana del endosoma que activa al componente que comprende al menos un grupo alquilo de cadena larga lipófila unida al átomo de nitrógeno de dicha poliamina, o un grupo que se extiende al alquilo más corto que tiene un grupo carbonilo, amino, hidroxilo o sulfhidrilo terminal al que se une un péptido fusógeno, o ácido cólico o colesterilo o un derivado; y opcionalmente C) uno o más componentes del enlace específico del receptor que son ligandos de los receptores naturales de dicha célula diana, unidos a un grupo que se extiende al alquilo más corto unido a un átomo de nitrógeno adicional de dicha poliamina, a través de dicho grupo terminal de la misma.
El grupo de transferencia está representado por uno o más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido nucleico y que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente de entre los enteros 2 a 5 inclusive; y preferentemente es 3 ó 4;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10 inclusive; y preferentemente es 1 a 6;
cada R^{3} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-6} y uno o más componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de poliamina catiónica; y en la que cada componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(a) -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que R, R^{1}y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; j es un entero de 6 a 24 inclusive; preferentemente de 8 a 18, más preferentemente de 8 a 12 inclusive; y B está opcionalmente ausente, o es un grupo puente de la fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en las que k es, independientemente, un entero de 1 a 6 inclusive, preferentemente de 3 a 5, l es un entero de 0 a 30 inclusive, preferentemente de 4 a 9, y p es un entero de 1 a 3 inclusive, preferentemente 1; R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente, de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; y Z es O, S, N(R), o está ausente, es decir, un enlace simple;
(b) -B-(R^{4})R, en la que R se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente; B no puede estar ausente y es un grupo puente seleccionado independientemente de entre los grupos i) a iv) anteriores, y además de entre el grupo de fórmula:
(v) -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en la que j' es un entero de 1 a 8 inclusive, preferentemente de 2 a 6 inclusive, y más preferentemente 5; R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus encapsulados de animales;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula (2);
3
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5;
R^{6} es -H, -OH, -CO_{2}H, -C(=O)NH_{2}, -OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o -O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n' es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión del derivado de ácido cólico, que comprende un grupo alquilo C_{1-6} o un grupo alquilcarbonilo C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo C_{1-6}; especialmente CH_{3}; incluyendo los derivados éster o amida 3\alpha, 7\alpha, 12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico del ácido cólico preferidos; y
(iii) colesteril-derivados de fórmula (3):
4
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo C_{1-6}, -OC(=O)- o -OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo-C_{1-6}; especialmente (CH_{2})_{3}CH(CH_{3})_{2}; y
R^{8a} es un grupo alquilo C_{1-6}, especialmente CH_{3}; incluyendo los derivados de colesterilo, colest-5-en-3'-\beta-carbonato, -\beta-carbamato o -\beta-metilencarboxamida.
Opcionalmente, R^{3} puede ser uno o más grupos definidos a continuación, unidos a un átomo de nitrógeno adicional de un componente de poliamina catiónica al que se une un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, o a un átomo de nitrógeno de un componente de poliamina catiónica que no tiene unido a éste un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma:
c) -B-(R^{5})R, en la que B no puede estar ausente, y es un grupo de unión seleccionado independientemente de los grupos i) a v) inclusive; R se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo constituido por:
(i) D-biotina;
(ii) galactosil-\beta1-4-tioglucósido de \beta-3'-propionilo;
(iii) N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv) N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionilgalactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de \alpha-3'-propionilo; y
(ix) tiomanósido-6-fosfato de \alpha-3'-propionilo.
Composición de ácido nucleico
Los dos componentes básicos del complejo molecular multifuncional de la presente invención son la composición de ácido nucleico y el grupo de transferencia. "Composición de ácido nucleico" significa uno cualquiera o más grupos de compuestos en los que una o más moléculas de ácido fosfórico se combinan con el carbohidrato, es decir, las moléculas de pentosa o hexosa, que a su vez se combinan con las bases derivadas de la purina, p. ej., adenina, y de la pirimidina, p. ej., timina. Las moléculas de ácido nucleico naturales en concreto incluyen el ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico y el ácido ribonucleico (ARN) genómico, así como diversas formas diferentes de este último, p. ej., ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr). También se incluyen los diferentes ADN que son complementarios (ADNc) de los diferentes ARN. Se contempla el ADN sintetizado o un híbrido del mismo con ADN natural.
Las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención pueden ser de una sola cadena o de doble cadena, pueden ser lineales o circulares, p. ej., un plásmido y son oligo- o polinucleótidos. Éstas pueden comprender solamente 15 bases o pares de bases, o pueden incluir hasta 20 mil bases o pares de bases (20 kb). Ya que el grupo de transferencia se emplea en base de prorrata cuando se añade a la composición de ácido nucleico, las consideraciones prácticas de transporte físico gobernarán en gran medida el límite superior del tamaño de las composiciones de ácido nucleico que se pueden utilizar.
Además de estos materiales naturales, las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención pueden también incluir composiciones sintéticas, es decir, análogos de ácido nucleico. Se ha descubierto que éstas son particularmente útiles en la metodología de la cadena complementaria, que es la hibridación complementaria de oligonucleótidos relativamente cortos a ARN de una sola cadena o ADN de una sola cadena, de modo que las funciones normales y esenciales de estos ácidos nucleicos intracelulares se destruyen. Véase, p. ej., Cohen, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expresión, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1989).
Las dimensiones, naturaleza y la secuencia específica de la composición de ácido nucleico que se ha de transferir a la célula diana se pueden optimizar para la aplicación determinada para la que se desean y dicha optimización está comprendida dentro del conocimiento del especialista en este campo. Sin embargo, la naturaleza de las células diana en el individuo al que se desea transferir una composición de ácido nucleico, puede tener una relación significativa en la selección del complejo molecular multifuncional en concreto de la presente invención. Por ejemplo, cuando se desea transferir moléculas de ácido nucleico a células diana inyectándolas por vía intramuscular para provocar una respuesta inmunitaria, se observará que esta transferencia se puede efectuar utilizando un complejo molecular multifuncional de la presente invención, tal como se definió anteriormente, que comprende una poliamina catiónica a la que se une, como componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, un grupo alquilo de cadena larga lipófilo como se definió anteriormente. Cuando las células diana son, por ejemplo, hepatocitos, la transferencia de la composición de ácido nucleico deseada se realiza fácilmente mediante la utilización del complejo molecular multifuncional de la presente invención en el que se une a la poliamina catiónica un componente del enlace específico del receptor que permitirá la discriminación entre las células del cuerpo, que comprenden, p. ej., N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina, o N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina.
La composición de ácido nucleico que se ha de transferir a una célula diana según la presente invención debe tener un marco de lectura abierto apropiado y un activador para expresar una proteína, así como otras secuencias reguladoras que pueden ser apropiadas para la expresión. Las composiciones de ácido nucleico que se han de administrar mediante los procedimientos de la presente invención se pueden diseñar y construir de modo que sean apropiadas para la particular aplicación deseada, todas las cuales están comprendidas dentro de la experiencia ordinaria del especialista en este campo.
Las moléculas de ácido nucleico que se administran a las células utilizando el complejo molecular multifuncional de la presente invención pueden servir como: 1) plantillas genéticas para las proteínas que funcionan como agentes de inmunización profilácticos y/o terapéuticos; 2) copias de sustitución de genes defectuosos, desaparecidos o que no funcionan; 3) plantillas genéticas para proteínas terapéuticas; 4) plantillas genéticas para moléculas de cadena complementaria y moléculas con cadena complementaria per se; o 5) plantillas genéticas para ribozimas.
En el caso de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico comprenden preferentemente las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción en las células diana de cada animal al que se administran.
En el caso de moléculas de ácido nucleico que sirven como plantillas para las moléculas y ribozimas con cadena complementaria, dichas moléculas de ácido nucleico se unen preferentemente a elementos reguladores necesarios para la producción de copias suficientes de la cadena complementaria y de las moléculas de ribozima codificadas por éstas respectivamente. Las moléculas de ácido nucleico están exentas de partículas retrovíricas y se proporcionan preferentemente como ADN en forma de plásmidos.
Grupo de transferencia
El núcleo o eje central del grupo de transferencia es la poliamina catiónica, que contiene entre 3 y 12 aminas. Pueden ser más de uno de estos componentes de poliamina catiónica, cuya función es superar la incompatibilidad en aumento de naturaleza hidrófila de la molécula de ácido nucleico y la naturaleza lipófila de la membrana celular, aunque ésta por sí mismo no permitirá a la primera pasar a través de la última. Los grupos catiónicos de poliamina se unen a los grupos aniónicos del ácido nucleico mediante enlace iónico, neutralizando de este modo las cargas y sirviendo también como punto de unión para el complejo. Un \mug de ADN contiene 3,2 nanomoles de cargas aniónicas de fosfato, suponiendo un peso molecular medio de 325 para la sal sódica del nucleótido. El grupo de transferencia de la presente invención será eficaz para conseguir la transferencia de la composición de ácido nucleico hasta que las cargas aniónicas de dicho ácido nucleico sean neutralizadas sustancialmente por las cargas catiónicas del componente de poliamina del grupo de transferencia.
Se valorará que en una forma de realización de la presente invención, se pueda emplear una sola poliamina catiónica que, teóricamente, equilibre las cargas aniónicas del ácido nucleico de una forma más o menos estequiométrica, aunque debe entenderse que, desde un punto de vista práctico, será necesario emplear cantidades de poliamina catiónica que están significativamente en exceso de la cantidad estequiométrica, debido a la presencia de puntos de unión competitivos en la diana y otras células, cuya existencia es bien conocida por el especialista y que impiden competitivamente o si no interfieren con la unión de la poliamina en el ácido nucleico como se desea. Se contempla también que se pueden emplear más de una de dichas poliaminas catiónicas, en cuyo caso cada cadena de poliamina o un fragmento es menor que el correspondiente ácido nucleico al que se va a unir. Debe entenderse, sin embargo, que el tamaño o la longitud total de cada uno de estos componentes de poliamina catiónicos deberían ser todos prácticamente del mismo tamaño o longitud que el componente del ácido nucleico, para que la neutralización de las cargas aniónicas del ácido nucleico tenga lugar. De nuevo, debe entenderse que por razones prácticas, será necesario un exceso significativo de componentes de poliamina catiónica, sobre la cantidad de componente de ácido nucleico presente. El utilizar más de un componente de poliamina catiónica permite flexibilidad con respecto a los tipos de los grupos que se unen a éste. Por ejemplo, un componente de poliamina catiónica puede llevar un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma particular, mientras que otro componente de poliamina catiónica lleva un componente que se une de forma específica al reactor o quizás un componente diferente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma. El número total de dichos componentes de poliamina catiónica es variable, y dependerá no solamente del tamaño o longitud del componente de ácido nucleico, sino también del número y tipo de grupos unidos a éste.
La eficacia de la transferencia, es decir, transfección, no llega a ser óptima hasta que el complejo molecular multifuncional, la combinación del grupo de transferencia y el ácido nucleico, llevan una carga positiva fuerte. De este modo, la cantidad del grupo de transferencia se puede seleccionar con esta mentalidad y la cantidad real seleccionada dependerá de la densidad de carga de la misma, que se puede calcular por medios bien conocidos en la técnica.
La triamina, tetraamina, pentamina y componentes de poliamina superiores del grupo de transferencia deben ser catiónicos para que sean funcionales, como se explicó anteriormente. Esto se puede realizar mediante el recurso sencillo de preparar una sal de adición de ácido, p. ej., la sal hidrocloruro, en la que se forman unidades de cloruro amónico. Este puede ser el caso en que la forma catiónica de la poliamida se forma en condiciones de pH fisiológico, en cuyo caso no es necesario formar directamente el catión. Así pues, la expresión "poliamina catiónica" está destinada a incluir ambas posibilidades.
Se contempla que el número de grupos amina que se desea que estén presentes en la poliamina dependerá en cierta medida del modo de administración del complejo molecular multifuncional que se utilice. Por ejemplo, se contempla que para administración intramuscular, se prefiere tener de 3 a 5 grupos amina en la poliamina, en tanto que, para inyección generalizada, p. ej., inyección intravenosa, se prefiere que tenga de 5 a 8 grupos amino en la poliamina. Para aplicaciones in vitro generalmente, se prefiere tener de 5 a 8 grupos amino en la poliamina.
El componente siguiente del grupo de transferencia es el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, que se necesita que esté presente. Éste puede comprender uno o más grupos alquilo de cadena larga lipófilos unidos mediante uno o más átomos de hidrógeno de dicha poliamina, o puede comprender un grupo puente "B", p. ej., un grupo con enlace alquilo más corto, opcionalmente con un grupo amino, hidroxilo o sulfhidrilo terminal, mediante el cual se une un péptido fusógeno, o el ácido cólico o el colesterilo o un compuesto derivado.
El grupo alquilo de cadena larga lipófilo está definido por la fórmula: -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que B es un grupo puente como el definido; R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; y j es un entero de 6 a 24 inclusive, preferentemente de 8 a 18, más preferentemente de 8 a 12 inclusive.
El grupo "-B-" puede estar ausente, es decir, un enlace sencillo, en el que R^{3}es el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma que comprende un grupo alquilo de cadena larga lipófilo como el definido en "a)" anteriormente. El grupo "-B-" puede ser también un elemento de puente que es un elemento seleccionado independientemente de entre el grupo constituido por:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-N(R)-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-O-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{-C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O}\}_{p}-N(R)-;
o
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-,
en los que los diversos sustituyentes son los definidos anteriormente.
Cuando el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, en lugar de ser un grupo alquilo de cadena larga lipófila, es un péptido fusógeno o un ácido cólico o colesterilo o un compuesto derivado, el grupo en puente "B" se necesita que esté presente y será un elemento seleccionado independientemente de entre el grupo i) a v) anteriormente. Esta selección dependerá del tipo requerido o deseado de enlace químico que esté presente. Por ejemplo, los elementos i) y iv) son enlaces carboxamida, mientras que los elementos ii) y iii) son enlaces carbamato, tiocarbamato o carbamoilo, dependiendo de si "Z" es O, S o está ausente, respectivamente. Para el elemento v) los enlaces serán oxi, tio, amino o alquileno, dependiendo de si "X" es O, S, N(R) o está ausente, respectivamente. El componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, por otra parte, puede tener un grupo carbonil, amino o algún otro grupo terminal, que puede determinar la selección del elemento puente que se ha de utilizar. Todas estas posibilidades, sin embargo, están comprendidas dentro de la experiencia del especialista en este campo.
De modo más sencillo, el grupo puente puede ser un grupo con enlace alquileno utilizado principalmente por consideraciones estéricas. Sin embargo, los demás grupos puente también pueden ser deseados para comunicar varias propiedades físicas y químicas, así como de configuración al complejo molecular multifuncional de la presente invención. El grupo polietilenglicol puede ser especialmente útil a este respecto.
La expresión "alquilo C_{1-6}", utilizada anteriormente, y en toda la descripción de la presente invención, se refiere a grupos alquilo de cadena lineal y ramificada incluyendo, pero sin limitarse a metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, t-butilo y n-pentilo.
En las fórmulas del grupo alquilo de cadena larga lipófila anteriores, se prefiere que R, R^{1} y R^{2} sean todos hidrógeno, y, según se indica que j sea un entero de 8 a 18 inclusive. Debe estar presente al menos uno de estos grupos alquilo de cadena larga lipófila, pero preferentemente no están presentes más de tres de dichos grupos. Se prefiere que tenga sólo uno de dichos grupos. Así pues, los ejemplos de los grupos de transferencia preferidos para utilización en un complejo de la presente invención, en el que el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma es un grupo alquilo de cadena larga lipófilo descrito anteriormente, son N^{4}-octilespermidina, N^{4}-dodecilespermidina, N^{4}-octadecilespermidina, N^{4}-octilespermina, N^{4}-dodecilespermina y N^{4}-octadecilespermina.
El componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma puede comprender asimismo un grupo puente de alquilo más corto, opcionalmente con un grupo carboxilo, amino, hidroxilo o sulfhidrilo terminal mediante el que se une a un péptido fusógeno o colesterol o un compuesto derivado. Dicho componente puede estar representado por la fórmula -B-(R^{4})R, en la que el grupo B es -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en el que R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; j' es un entero de 1 a 8 inclusive, preferentemente de 2 a 4 inclusive; X es O, S, N(R) o está ausente.
Es preferible que R^{1} y R^{2} sean cada uno hidrógeno, y tal como se indica, que j' sea 2 a 4, mientras que X se define como N(R). De este modo, el grupo puente alquilo más corto será preferentemente etilo, n-propilo o n-butilo y tendrá un grupo amino terminal al que se une el péptido fusógeno, el ácido cólico, colesterilo o un compuesto derivado, que comprende el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma.
Por otra parte, se puede seleccionar otro de los elementos del grupo puente "B". Por ejemplo, el elemento i) proporciona un grupo con enlace alquilo con un enlace carboxamida, cuyo representante más sencillo sería el grupo -(CH_{2})-C(=O)-NH-. El elemento ii) proporciona un grupo con enlace alquileno con un tipo de enlace de carbamato; y el representante más sencillo de este elemento sería el grupo -(CH_{2})-NH-C(=O)-, que es un tipo de enlace carbamoilo. Un enlace carbamato estaría representado por el grupo -(CH_{2})-NH-C(=O)-O-, mientras que una variante sencilla de este grupo proporcionaría un enlace tiocarbamato: -(CH_{2})-NH-C(=O)-S-. Los elementos iii) y iv) proporcionan las mismas variantes de enlace terminal, aunque añadiendo al grupo puente alquilo un grupo puente de polietilenglicol de tamaño variable, es decir, numerosas unidades de monómero de óxido de etileno repetidas, dependiendo de las definiciones de "l" y "p".
El péptido fusógeno que funciona como componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, comprende las glucoproteínas en punta de los virus de animales encapsulados conocidos en la técnica. La fusión de la membrana, ya sea plana o anular, comprende las etapas de enfoque inicial, coalescencia y separación. Las reacciones de fusión son rápidas, muy específicas y sin defectos. Las proteínas de la membrana de los virus de animales encapsulados comprenden glucoproteínas que se extienden en la bicapa de la membrana del virus y tienen el conjunto de su masa asociada externamente y proteínas no extensibles, no glucosiladas en la superficie de la bicapa interna. Las glucoproteínas forman proyecciones radiales en la superficie de la membrana del virus y estas glucoproteínas en punta desempeñan un papel clave en la introducción del virus en las células huésped. Las glucoproteínas en punta están entre las proteínas de la membrana del virus mejor caracterizadas. En la introducción a la célula las glucoproteínas en punta son responsables de la unión de la partícula de virus a la superficie de la célula y de la penetración de la nucleocápside en el citosol, donde, después de la endocitosis de la partícula de virus, las glucoproteínas en punta desempeñan un papel en la fusión con la membrana limitante del endosoma, mediante el cual la nucleocápside vuelve a introducirse en el citosol. En algunos virus de animales encapsulados, las glucoproteínas en punta tienen un carácter especializado, p. ej. en los ortomixovirus, en los que una es una neuraminidasa y la otra es una hemaglutinina. Todos estos péptidos fusógenos, desde el punto de vista de sus secuencias de aminoácido, morfología en conjunto, papel en el proceso general de fusión y requisitos para la actividad, han sido objeto de estudio a largo plazo y han sido expuestos con detalle en la bibliografía técnica. Véase, p. ej., J. White, M. Kielian y A. Helenius, Quarterly Reviews of Biophysics, 16, 151-195 (1983), que se incorpora a esta memoria como referencia en su totalidad.
Ejemplos de dichos péptidos fusógenos y homólogos derivados de glucoproteínas en punta de virus encapsulados, incluyen las siguientes lecturas de secuencias de péptido desde el terminal N al terminal C:
SEQ ID nº:1: KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCP (R. Schlegel y M. Wade, J. Biol. Chem., 259, 4691-94 (1984))-VSV; poli(Glu-Aib-Leu-Aib) (K. Kono, H. Nishii y T. Takagishi, Biochim. Biophys. Acta, 1164, 81-90 (1993));
SEC ID nº:2: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQ-HIV-1;
SEC ID nº:3: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQ-MuLV (J.S. Jones y R. Risser, J. Virol., 67, 67-74 (1993));
SEC ID nº:4: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS-HIV-1 (J.L. Nieva, S. Nir, A. Muga, F.M. Goñi y J. Wilschut, Biochem., 33, 3201-09 (1994));
SEC ID nº:5: AVGAIGALFLGFLGAAG-HIV-1 (S. Soukchareun, G.W. Tregear y J. Haralambidis, Bioconj. Chem., 6, 43-53 (1995));
SEC ID nº:6: GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA-HA-2 (P. Midoux, C. Mendes, A. Legrand, J. Raimond, R. Mayer, M. Monsigny y A.C. Roche, Nucl. Acids Res., 21, 871-78 (1993));
SEC ID nº:7: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFR-HA-2;
SEC ID nº:8: AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAAS-HIV-1 gp41;
SEC ID nº:9: FAGVVIGLAALGVATAANVTAAVALVK-SV5 F1;
SEC ID nº:10: KVYTGVYPFMWGGAYCFCD-SFV E1;
SEC ID nº:11: KLlCTGlSSlPPlRALFAAlNIP-PH-30 \alpha (J.M. White, Science, 258, 917-24 (1992));
SEC ID nº:12: FFGAVIGTIALGVATATAAQIT-Sendai F1;
SEC ID nº:13: FAGVVIGLAALGVATATAAQVT-SV5 F1;
SEC ID nº:14: FlGAllGGVALGVATATAAQlT-NDV F1;
SEC ID nº:15: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQN-HA-2 X:31;
SEC ID nº:16: GLFGAIAGFIENGWEGLVDGWYGFRHQN-HA-2 FPV;
SEC ID nº:17: GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHG-HA-2 B/Lee;
SEC ID nº:18: FVAAIILGISALIAIITSFAVATALVKEM-MMTV gp36;
SEC ID nº:19: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGIGTGTALMATQQFQQLQAAVQDDLREVEKS-MoMLV p15E;
SEC ID nº:20: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQFQQLHAAVQDDLKEVEKS-F-MuLV p15E;
SEC ID nº:21: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQFQQLQAAMHDDLKEVEKS-AKV p15E;
SEC ID nº:22: DYQCKVYTGVYPFMWGGAYCFCDSENT-SFV E1;
SEC ID nº:23: DYTCKVFGGVYPFMWGGAQCFCDSENS-Sindbis E1 (J. White, M Kielian y A. Helenius, Q. Rev. Biophys., 16 151-95 (1983));
SEC ID nº:24: FAGVVLAGAALGVAAAAQI-sarampión;
SEC ID nº:25: FAGVVLAGAALGVATAAQI-sarampión (P.L. Yeagle, R.M. Epand, C.D. Richardson y T.D. Flanagan, Biochim. Biophys. Acta, 1065, 49-53 (1991));
SEC ID nº:26: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGGC-HA-2 (E. Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten y M. L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7934-38 (1992));
SEC ID nº:27: GLFGAIAGFIENGWEGMIDG-X31F/68 HA-2;
SEC ID nº:28: GIFGAIAGFIENGWEGMIDG-VIC/75 HA-2;
SEC ID nº:29: GLFGAIAGFIEGGWTGMIDG-PR8/34 HA-2;
SEC ID nº:30: GLFGAIAGFIEGGWEGMVDG-Jap/57 HA-2;
SEC ID nº:31: GLFGAIAGFIEGGWEGLVDG-PPV/34 HA-2; y
SEC ID nº:32: GFFGAIAGFLEGGWEGMIAG-X31F/68 HA-2 (J.D. Lear y W.F. DeGrado, J. Biol. Chem., 262, 6500-05 (1987)).
Cualquier experto en la técnica reconocerá fácilmente que en un complejo de la invención se podrían utilizar otros péptidos fusógenos, incluyendo los péptidos funcionalmente equivalentes a los descritos, pero que tienen una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, especialmente las que han conservado las sustituciones de aminoácidos.
El ácido cólico y derivados cuya función como componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma, comprenden los compuestos de fórmula (2):
5
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6} es H, OH, CO_{2}H, -C(=O)NH_{2}, -OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o -O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n' es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión del derivado de ácido cólico, que comprende un alquilo C_{1-6} o un alquilcarbonilo C_{1-6}; y
R^{8} es un alquilo C_{1-6}, en especial CH_{3}. Es preferible que el ácido cólico y los compuestos derivados comprendan uno o más elementos seleccionados del éster o amida de 3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
El colesterilo y derivados, cuya función como componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma, comprende los compuestos de fórmula (3):
6
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo C_{1-6}, -OC(=O)- o -OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo C_{1-6}; especialmente (CH_{2})_{3}CH(CH_{3})_{2}; y
R^{8a} es un grupo alquilo C_{1-6}, especialmente CH_{3}. Es preferible que el colesterilo y los compuestos derivados comprenden uno o más elementos seleccionados de entre el grupo que consta de colest-5-en-3'-\beta-carbonato, -\beta-carbamato y -\beta-metilencarboxamida.
En otra forma de realización de la presente invención el complejo comprende un componente del enlace específico del receptor que ayuda a la transferencia del efecto de las composiciones con ácido nucleico a las células diana, especialmente a células eucarióticas, aprovechándose de las vías de endocitosis, mediadas por el receptor natural, que existen en estas células. El componente del enlace específico del receptor es de este modo un ligando para el receptor natural y puede ayudar en el enlace del complejo molecular multifuncional a la célula diana. La endocitosis o pinocitosis tendrá lugar por lo que el complejo completo se transfiere a la célula diana, encerrado en un endosoma.
El componente del enlace específico del receptor cumple la importante función de permitir al complejo molecular multifuncional de la presente invención dirigirse a poblaciones de células específicas, p. ej., hepatocitos. El componente del enlace facilita la localización de las células diana deseadas en el cuerpo del animal al que se administra el complejo, con la posterior unión del complejo a las células diana.
Cuando se emplea el componente del enlace específico del receptor, también estará presente en el complejo molecular multifuncional un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, tal como el definido además anteriormente. Por consiguiente, una vez el componente del enlace ha localizado la célula diana deseada en el individuo, y une el complejo a dicha célula mediante el enlace a dicho receptor, el complejo se transferirá a dicha célula por endocitosis, después de lo cual se encerrará dentro de un endosoma. En este momento, el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma asume su importante papel destruyendo dicha membrana, permitiendo escapar del complejo en el citoplasma de dicha célula.
Durante el curso normal de los acontecimientos en la célula diana, la formación del endosoma es un preludio al direccionamiento de cualquier proteína extraña a los liposomas donde tendrá lugar la degradación de la proteína extraña por enzimas hidrolíticos. Por consiguiente, la acumulación en los compartimentos del lisosoma puede ser un obstáculo principal para la eficacia de los sistemas de administración de ácido nucleico. El complejo molecular multifuncional de la presente invención debería correr la misma suerte, si no fuera por la presencia del componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma. Este componente permite al complejo salir del endosoma, después de lo cual puede migrar al núcleo de la célula diana y liberar la composición de ácido nucleico, cuya información genética puede ser transcrita a continuación dentro de dicho núcleo. Aunque los mecanismos exactos que realizan estas etapas y vías no son bien comprendidos, la expresión de la molécula del ácido nucleico contenida en el complejo molecular multifuncional no tiene lugar, como se demuestra en los ejemplos experimentales más adelante.
El componente con enlace específico del receptor puede estar representado por la fórmula -B-(R^{5})R, en la que R es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-6} o está ausente; B puede ser entre otros, -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en la que R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, X es N(R) y j' es un entero de 1 a 6 inclusive, preferentemente 2 a 4 inclusive; y R^{5} es un componente del enlace específico del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo constituido por:
i) D-biotina;
ii) galactosil-\beta1-4-tioglucósido de \beta-3'-propionilo;
iii) N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
iv) N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
v) 5-metiltetrahidrofolato;
vi) ácido fólico;
vii) ácido folínico;
viii) tiomanósido de \alpha-3'-propionilo; y
ix) tiomanósido-6-fosfato de \alpha-3'-propionilo.
Es preferible que R, R^{1} y R^{2}sean cada uno hidrógeno y como se indicó, que j' sea 2 a 6. De este modo, el grupo puente alquilo más corto será preferentemente etilo, n-propilo o n-butilo y el componente puente específico del receptor se unirá al grupo amino terminal.
Ya que el componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma también puede estar presente, los ejemplos de grupos de transferencia preferidos de la presente invención, en los que el componente del enlace específico del receptor es un grupo galactosilo como se describió anteriormente, son:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina; y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
Por consiguiente, se ha descrito con detalle anteriormente el complejo molecular multifuncional de la presente invención para la transferencia de composiciones de ácido nucleico a una célula diana.
También se ha descrito un procedimiento para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células diana en base in vitro. En este procedimiento las células diana se ponen en contacto con un complejo molecular multifuncional que incluye dicha composición de ácido nucleico. En un ejemplo, las células diana se han aislado de un individuo y de este modo todas las células son del mismo tipo, y no es necesario, por lo tanto, que el complejo incluya un componente de enlace específico del receptor. En otro ejemplo, se mantiene un cultivo de microorganismos en condiciones de fermentación y un producto de proteína es expresado por el microorganismo como resultado de la transferencia a éste de las composiciones de ácido nucleico que utilizan el complejo molecular multifuncional de la presente invención. El producto proteínico se aísla y purifica. Aquí de nuevo, está implicado un solo tipo de célula diana, de modo que no es necesario que esté presente el componente del enlace específico del receptor.
Este procedimiento proporciona la transferencia a las células diana de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido deseado o proteína, o sirve como plantilla para las moléculas de ácido nucleico funcionales. La proteína o la molécula de ácido nucleico funcional deseada puede ser cualquier producto de interés industrial, comercial o científico, p. ej., agentes terapéuticos incluyendo vacunas; comestibles y complementos nutritivos; compuestos de importancia agrícola tales como herbicidas y reguladores del crecimiento vegetal, insecticidas, acaricidas, rodenticidas y fungicidas; compuestos útiles en sanidad animal tales como parasiticidas incluyendo nematocidas; y así sucesivamente. Las células diana son normalmente cultivos de células huésped que comprenden células de microorganismos tales como bacterias y levaduras, pero pueden incluir además células vegetales y de mamíferos. Los cultivos celulares se mantienen según técnicas de fermentación bien conocidas en la técnica, que maximizan la producción de la proteína o de la molécula de ácido nucleico funcional deseada y los productos de la fermentación se recogen y purifican por procedimientos conocidos.
Se ha dado a conocer también un procedimiento para la transferencia in vitro de una composición de ácido nucleico a las células de un individuo. El procedimiento comprende la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con un complejo molecular multifuncional de la presente invención, que incluye dicha composición de ácido nucleico. Aquí de nuevo, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o una proteína deseados, o sirve como plantilla para las moléculas de ácido nucleico funcional. La molécula de ácido nucleico se administra exenta de partículas retrovíricas. La proteína deseada puede ser una proteína que funciona dentro del individuo o sirve para iniciar una respuesta inmunitaria.
La molécula de ácido nucleico se puede administrar a las células de dicho individuo en una base in vivo o ex vivo, es decir, el contacto con las células del individuo puede tener lugar dentro del cuerpo del individuo según los procedimientos que se emplean más típicamente, o el contacto con las células del individuo puede tener lugar fuera del cuerpo del individuo extrayendo las células que se desea para tratarlas fuera del cuerpo del individuo por varios medios adecuados, después de poner en contacto dichas células con dicha molécula de ácido nucleico, después a su vez de la devolución de dichas células al cuerpo de dicho individuo.
El procedimiento de transferencia de una composición de ácido nucleico de un individuo tal como se describe en esta memoria, incluye particularmente un procedimiento de inmunización de un individuo contra un patógeno. En este procedimiento, la composición de ácido nucleico administrada a dichas células, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico, o prácticamente similar, a un epítopo desplegado en dicho patógeno como antígeno, y dicha secuencia de nucleótidos se conecta operativamente a las secuencias reguladoras. La molécula de ácido nucleico debe, desde luego, ser capaz de expresarse en las células del individuo.
El procedimiento de transferencia de una composición de ácido nucleico de un individuo tal como se describe en esta memoria, incluye además procedimientos para inmunizar a un individuo contra una enfermedad hiperproliferante o una enfermedad autoinmunitaria. En dichos procedimientos la composición de ácido nucleico que se administra a las células del individuo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico a, o sustancialmente similar a un epítopo desplegado en una proteína relacionada con una enfermedad hiperproliferante o una proteína relacionada con una enfermedad autoinmunitaria, respectivamente, y está conectado operativamente a las secuencias reguladoras. De nuevo aquí la molécula de ácido nucleico debe ser capaz de expresarse en las células del individuo.
Se han descrito también procedimientos para el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad autoinmunitaria, en la que las células de dicho individuo se ponen en contacto con un complejo molecular multifuncional que incluye una composición de ácido nucleico, administrando de este modo una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que restablece la actividad de un gen ausente, defectuoso o inhibido, o que codifica una proteína que produce un efecto terapéutico en dicho individuo y está funcionalmente ligada a las secuencias reguladoras; siendo la molécula de ácido nucleico capaz de expresarse en dichas células.
Para realizar los procedimientos descritos anteriormente, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el complejo molecular multifuncional que incluye una composición de ácido nucleico, así como formas de sal y éster farmacéuticamente aceptables de dicho complejo molecular, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Se han descrito además kits farmacéuticos que comprenden un recipiente que consta de una composición de ácido nucleico y un recipiente que consta de un grupo de transferencia, descritos en esta memoria. Opcionalmente, en dichos kits se ha incluido excipientes, portadores, conservantes y vehículos tales como disolventes.
Por consiguiente la presente invención proporciona composiciones que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra un patógeno o célula anómala, relacionada con la enfermedad. El material genético codifica un péptido o proteína que comparte al menos un epítopo con una proteína inmunógena que se encuentra en el patógeno o en las células a las que se dirige. El material genético es expresado por las células del individuo y sirve como diana inmunógena contra el que se produce la respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria tiene una amplia base: además de la respuesta inmunitaria humoral, se producen ambas posibilidades de la respuesta inmunitaria celular. Los procedimientos descritos en esta memoria son útiles para comunicar inmunidad profiláctica y terapéutica. Así pues, un procedimiento de inmunización incluye tanto métodos de protección de un individuo en la prueba con patógeno como la aparición o proliferación de células específicas, así como de procedimientos de tratamiento de un individuo que padece la infección por el patógeno, la enfermedad hiperproliferante o la enfermedad autoinmunitaria. Así pues, estos procedimientos son útiles para producir respuestas inmunitarias amplias contra una proteína diana, es decir proteínas asociadas de forma específica con patógenos o las propias células "anómalas" del individuo.
La presente invención también es útil para combatir las enfermedades hiperproliferantes y los trastornos tales como el cáncer, produciendo una respuesta inmunitaria contra una proteína diana que está asociada de forma específica con las células hiperproliferantes. La presente invención es además útil para combatir enfermedades y trastornos autoinmunitarios produciendo una respuesta inmunitaria contra una proteína diana que está asociada de modo específico con las células implicadas en la enfermedad autoinmunitaria.
Otros aspectos de la presente invención se refieren a la terapia génica. Esto implica composiciones, para introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un individuo que son copias exógenas de genes que corresponden a genes defectuosos, desaparecidos, que no funcionan o que funcionan parcialmente en el individuo, o que codifican proteínas terapéuticas, es decir, proteínas cuya presencia en el individuo eliminarán una insuficiencia en el individuo y/o cuya presencia proporcionará un efecto terapéutico en el individuo. Así pues, se proporciona un medio de administrar dicha proteína que es adecuado, e incluso una alternativa preferida a la administración directa de la proteína al individuo.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión "proteína deseada" está destinada a referirse a los péptidos y proteínas codificados por las construcciones génicas utilizadas en la presente invención, que actúan como proteínas diana para una respuesta inmunitaria o como proteínas terapéuticas o de compensación en los regímenes de terapia génica.
Utilizando las composiciones de la presente invención, el ADN o ARN que codifica una proteína deseada se introduce en las células de un individuo donde se expresa, produciendo de este modo la proteína deseada. La composición de ácido nucleico, p. ej., ADN o ARN que codifica la proteína deseada está ligada a los elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Los elementos reguladores para la expresión del ADN incluyen un activador y una señal de poliadenilación. Además, otros elementos, tales como una zona Kozak, se pueden también incluir en la composición de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "composición de ácido nucleico" se refiere al ADN o ARN, o a otra molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique la proteína deseada y que incluye las señales de iniciación y terminación ligadas de forma operativa a los elementos reguladores incluyendo un activador y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo al que se administra la construcción.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión "forma expresable" se refiere a las construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios ligados de forma operativa a una secuencia de codificación que codifica una proteína diana, de modo que cuando está presente en la célula del individuo, se exprese la secuencia de codificación.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "vacuna genética" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una composición de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótido que codifica una proteína diana, incluyendo las preparaciones farmacéuticas útiles para provocar una respuesta inmunitaria terapéutica.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión "terapéutica genética" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una composición de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica o de compensación. Por otra parte, un producto terapéutico genético puede codificar secuencias de la cadena complementaria que inhiben la expresión génica no deseada. Además, los productos terapéuticos genéticos pueden codificar ribozimas.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína diana" se refiere a una proteína contra la que se puede producir una respuesta inmunitaria. La proteína diana es una proteína inmunógena que comparte al menos un epítopo con una proteína del patógeno o del tipo de célula indeseable, tales como una célula cancerosa o una célula implicada en la enfermedad autoinmunitaria, contra la que se necesita inmunización. La respuesta inmunitaria dirigida contra la proteína diana protegerá al individuo contra, y tratará al individuo de, la infección o enfermedad específica a la que está asociada la proteína diana.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "compartir un epítopo" se refiere a las proteínas que contienen al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de otra proteína. Y, la expresión "epítopo prácticamente similar" se refiere a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a la de un epítopo de una proteína, pero no obstante provoca una respuesta inmunitaria celular o humoral que interreacciona con esta proteína.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína terapéutica" se refiere a proteínas cuya presencia comunica una utilidad terapéutica al individuo.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína de compensación" se refiere a proteínas cuya presencia se compensa por la ausencia de una proteína producida de forma endógena que funciona completamente, debido a un gen endógeno ausente, defectuoso, que no funciona o que funciona parcialmente.
Cuando es absorbida por una célula diana, una composición de ácido nucleico utilizada en la presente invención, que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína deseada ligada operativamente a elementos reguladores, puede permanecer presente en la célula como molécula extracromosómica en funcionamiento, o se puede integrar en el ADN cromosómico de la célula. El ADN se puede introducir en las células donde permanece como material genético separado en forma de plásmido. Por otra parte, el ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma puede introducirse en la célula diana. Al introducir el ADN en la célula, se pueden añadir reactivos que favorecen la integración del ADN en los cromosomas. Pueden también incluirse en la molécula de ADN las secuencias de ADN que son útiles para favorecer la integración. Como alternativa, se puede administrar ARN a la célula. Se contempla también el proporcionar la composición de ácido nucleico como un minicromosoma lineal incluyendo un centrómero, telómeros y un origen de replicación. Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones "construcción de ADN", "composición de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" se refieren tanto a moléculas de ADN como de ARN.
Los elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ADN incluyen: un activador, un codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de poliadenilación. Además, se necesitan con frecuencia potenciadores para la expresión génica. Es necesario que estos elementos se conecten de forma operable a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores sean operables en el individuo al que se administran.
En general se considera que los codones de iniciación y el codón de terminación forman parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al que se administra la construcción del gen. Los codones de iniciación y terminación pueden estar en el marco con la secuencia de codificación. Los activadores y las señales de poliadenilación utilizados además deben ser funcionales dentro de las células del individuo.
Ejemplos de activadores útiles con las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para el hombre, incluyen pero no están limitados a, activadores del virus 40 de simios (SV40), activador del virus del tumor de mama de ratón (MMTV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como el activador de repetición terminal largo de VIH (LTR), virus de Moloney, ALV, citomegalovirus (CMV) tal como el activador precoz inmediato de CMV, virus de Epstein Barr (EBV), virus del sarcoma de Rous (RSV), así como activadores de genes humanos tales como Actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humano y melatotioneína humana.
Ejemplos de señales de poliadenilación útiles con las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención, especialmente para la producción de una vacuna genética para el hombre, incluyen pero no se limitan a, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se puede utilizar la señal de poliadenilación SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA) denominada señal de poliadenilación SV40.
Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión de la molécula de ácido nucleico, se pueden incluir también otros elementos en la molécula de ADN. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador se puede seleccionar de entre el grupo que incluye, pero no se limita a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humano y potenciadores víricos tales como los de CMV, RSV y EBV.
Se pueden proporcionar composiciones de ácido nucleico con origen de replicación en mamíferos para mantener la construcción fuera de los cromosomas y producir copias múltiples de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de la replicación del virus Epstein Barr y la zona de codificación EBNA-1 del antígeno nuclear, que produce mucha copia de la replicación del episoma sin integración. En los aspectos de la invención que se refieren a la terapia génica, se prefieren construcciones con orígenes de replicación que incluyen el antígeno para la activación.
En otras utilizaciones de la presente invención que se refieren a aplicaciones de inmunización, la composición del ácido nucleico contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína diana y además incluyen genes para las proteínas que aumentan la respuesta inmunitaria frente a dichas proteínas diana. Ejemplos de dichos genes son los que codifican citocinas y linfocinas tales como interferon \alpha, interferon \gamma, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. En algunas utilizaciones, se preferirá que el gen para GM-CSF se incluya en las composiciones de ácido nucleico utilizadas en las composiciones de inmunización.
Si se desea eliminar las células que reciben la composición de ácido nucleico por alguna razón, se puede añadir otro elemento a la composición de ácido nucleico que sirve como diana para la destrucción celular. Se puede incluir un gen de timidina cinasa (tk) del herpes en forma expresable en la composición de ácido nucleico. Se puede administrar al individuo el fármaco gangciclovir y este fármaco producirá la destrucción selectiva de cualquier célula que produzca tk, proporcionando de este modo los medios para la destrucción selectiva de las células que contienen la composición de ácido nucleico.
Para maximizar la producción de proteínas, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que son muy aconsejables para la expresión génica en las células a las que se transfiere la construcción. Además, se pueden seleccionar codones que se transcriben más eficazmente en la célula diana. Cualquier experto en la técnica puede producir fácilmente construcciones de ADN que sean funcionales en las células diana.
Se puede analizar los niveles de expresión in vitro en las composiciones de ácido nucleico utilizando cultivo de tejido de células del mismo tipo que las que se han de tratar. Por ejemplo, si la vacuna genética se ha de administrar a células de músculo humano, se cultivan las células del músculo en el cultivo, tales como las células del tumor sólido en el músculo de rabdomiosarcoma, se pueden utilizar como un modelo in vitro para medir el nivel de expresión.
Las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención no se incorporan en las partículas retrovíricas. Las composiciones de ácido nucleico son absorbidas por la célula sin inserción mediada por partículas retrovíricas, tal como sucede cuando las partículas de retrovirus con ARN retrovírico, infectan una célula. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "exentas de partículas retrovíricas" se refiere a las composiciones de ácido nucleico que no se incorporan a las partículas retrovíricas. Tal como se utiliza en esta memoria, "disociado de un agente infeccioso" se refiere al material genético que no forma parte de un vector vírico, bacteriano o eucariótico, activo, inactivado, vivo o muerto, que es capaz de infectar una célula.
En algunas formas de realización, las composiciones de ácido nucleico constituyen menos de un genoma vírico replicable, completo, de modo que en la introducción en la célula, la composición de ácido nucleico posee información genética insuficiente para la producción directa de partículas víricas infecciosas. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "genoma vírico incompleto" se refiere a una composición de ácido nucleico que contiene menos de un genoma completo de modo que la incorporación de dicha composición de ácido nucleico a la célula no constituye la introducción de información genética suficiente para la producción de virus infeccioso.
En algunas formas de realización, se puede administrar una vacuna vírica atenuada como una composición de ácido nucleico que contiene suficiente material genético para permitir la producción de partículas víricas. La administración de la vacuna atenuada como composición de ácido nucleico permite la producción de grandes cantidades de producto de inmunización seguro, puro y activo.
La presente invención se puede utilizar para inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como virus, organismos procarióticos y eucarióticos patógenos tales como los organismos patógenos unicelulares y parásitos multicelulares. La presente invención es particularmente útil para inmunizar a un individuo contra aquellos patógenos que infectan células y que no están encapsulados, tales como virus y procariotas como por ejemplo Gonorrhoea, Listeria y Shigella. Además, la presente invención es también útil para inmunizar a un individuo contra patógenos protozoarios, incluyendo cualquier etapa en su ciclo vital y que son patógenos intracelulares. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "patógeno intracelular" se refiere a un virus u organismo patógeno que, durante al menos parte de su ciclo reproductor o vital, existe dentro de una célula huésped y en la que produce o da lugar a que se produzcan, proteínas patógenas. La Tabla 1 proporciona una relación de algunas de las familias y géneros víricos para los que se pueden preparar vacunas según la presente invención. En las vacunas son útiles las construcciones de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los péptidos que comprenden al menos un epítopo idéntico o prácticamente similar a un epítopo desplegado en un antígeno patógeno, como por ejemplo los antígenos relacionados en dicha tabla.
Además, la presente invención sirve también para inmunizar un individuo contra otros patógenos incluyendo los patógenos procarióticos y eucarióticos protozoarios así como parásitos multicelulares, tales como los relacionados en la Tabla 2.
Con el fin de producir una vacuna genética para proteger de la infección patógena, el material genético que codifica las proteínas inmunógenas contra el que se puede montar una respuesta inmunitaria protectora, se debe incluir en la composición de ácido nucleico. Si el patógeno infecta en el interior de la célula, para el que la presente invención es particularmente útil, o en el exterior de la célula, es improbable que todos los antígenos patógenos produzcan una respuesta protectora. Debido a que el ADN y el ARN son ambos relativamente pequeños y se pueden producir de forma relativamente fácil, la presente invención proporciona la ventaja adicional de permitir la vacunación con antígenos de patógeno múltiples. La composición de ácido nucleico utilizada en la vacuna genética puede incluir material genético que codifica muchos antígenos patógenos. Por ejemplo, se pueden incluir varios genes víricos en una sola construcción, proporcionando de este modo varias dianas. Además, se pueden preparar los inoculadores múltiples que se pueden administrar a diferentes células en un individuo para incluir conjuntamente, en algunos casos, una serie completa de genes o, más preferentemente, una serie incompleta, p. ej., casi completa en la vacuna. Por ejemplo, una serie completa de genes víricos se puede administrar utilizando dos construcciones que contienen cada una una mitad diferente del genoma que se administran en puntos diferentes. Así pues, se puede provocar una respuesta inmunitaria contra cada antígeno sin riesgo de que se acople el virus infeccioso. Este permite la introducción de más de un solo antígeno diana y puede eliminar el requisito de que se identifiquen los antígenos protectores.
La facilidad de manejo y la naturaleza económica del ADN y del ARN permiten además medios más eficaces de identificación de antígenos protectores. Los genes se pueden clasificar y analizar sistemáticamente mucho más fácilmente que las proteínas. Una vez se seleccionan los agentes y organismos patógenos para los que se busca una vacuna protectora, se identifica a continuación una proteína inmunógena. Las Tablas 1 y 2 incluyen listas de algunos de los agentes y organismos patógenos para los que se pueden preparar vacunas genéticas para proteger a un individuo de la infección por ellos. Los procedimientos para inmunizar a un individuo contra un patógeno se pueden dirigir particularmente contra VIH, HTLV o HBV.
Se describe también en esta memoria un procedimiento para comunicar una respuesta inmunitaria protectora de amplia base contra células hiperproliferantes que son características de enfermedades hiperproliferantes, así como un procedimiento para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades hiperproliferantes. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "enfermedades hiperproliferantes" se refiere a aquellas enfermedades y trastornos caracterizados por la proliferación de las células. Ejemplos de enfermedades hiperproliferantes incluyen todas las formas de cáncer y psoriasis.
Se ha descubierto que la introducción de una composición de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína asociada a una "célula hiperproliferante" inmunógena en las células de un individuo, da como resultado la producción de estas proteínas en las células vacunadas de un individuo. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína asociada hiperproliferante" se refiere a las proteínas que están relacionadas con una enfermedad hiperproliferante. Para inmunizar contra enfermedades hiperproliferantes, se administra a un individuo una composición de ácidos nucleicos que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que está relacionada con una enfermedad hiperproliferante.
Para que la proteína asociada hiperproliferante sea una diana inmunógena eficaz, debe ser una proteína que se produzca exclusivamente o en grandes concentraciones en las células hiperproliferantes en comparación con las células normales. Los antígenos diana incluyen dichas proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que comprenden al menos un epítopo que se encuentra en dichas proteínas. En algunos casos, una proteína hiperproliferante asociada es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal excepto que tiene una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente que produce diferentes epítopos que no se encuentran en la proteína normal. Dichas proteínas diana incluyen aquellas que son proteínas codificadas por oncogenes tales como myb, myc, fyn y los genes de transposición bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de los productos del oncogén como antígenos diana, las proteínas diana para tratamientos anticancerosos y regímenes protectores incluyen varias zonas variables de anticuerpos preparados por los linfomas de linfocitos B y zonas variables de receptores de linfocitos T de los linfomas de linfocitos T que, en algunas formas de realización, se utilizan también como antígenos diana para las enfermedades autoinmunitarias. Se pueden utilizar otras proteínas relacionadas con el tumor como proteínas diana, tales como las proteínas que se encuentran en concentraciones mayores en las células tumorales, incluyendo la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A y las proteínas que se unen al folato.
Aunque la presente invención se puede utilizar para inmunizar a un individuo contra una o más de las diversas formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para inmunizar profilácticamente a un individuo que está predispuesto a desarrollar un determinado cáncer o que ha tenido cáncer y es por lo tanto susceptible a una recaída. Los desarrollos en genética y biotecnología, así como en epidemiología, permiten la determinación de la probabilidad y de la evaluación de riesgo para el desarrollo del cáncer en un individuo. Utilizando la identificación genética y/o los antecedentes sanitarios familiares, es posible predecir la probabilidad de que un determinado individuo pueda desarrollar cualquiera de los diversos tipos de cáncer.
Asimismo, los individuos que han desarrollado ya cáncer y que han sido tratados para eliminar el cáncer o están si no en remisión, son particularmente susceptibles de recaer y reincidir. Como parte de un régimen de tratamiento, dichos individuos pueden ser inmunizados contra el cáncer del que han sido diagnosticados o que ha habido que combatir dicha recaída. Así pues, una vez se sabe qué individuos han padecido un tipo de cáncer y están en riesgo de recaída, pueden ser inmunizados para preparar sus sistemas inmunitarios para combatir cualquier aparición futura del cáncer.
Se describe también en esta memoria un procedimiento de tratamiento de los individuos que padecen enfermedades hiperproliferantes. En dichos procedimientos, la introducción de las composiciones con ácidos nucleicos sirve como agente inmunoterapéutico, dirigiendo y activando el sistema inmunitario del individuo para combatir las células hiperproliferantes que producen la proteína diana.
Se ha dado a conocer un procedimiento de tratamiento de los individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunitarios comunicando una respuesta inmunitaria protectora de amplia base contra dianas que están relacionadas con la autoinmunidad, incluyendo los receptores celulares y las células que producen anticuerpos "auto"-dirigidos.
Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T incluyen la artritis reumatoide (RA), la esclerosis múltiple (MS), el síndrome de Sjogren, la sarcoidosis, la diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM), la tiroiditis autoinmunitaria, la artritis reactiva, la espondiloartritis anquilosante, la esclerodermia, la polimiositis, la dermatomiositis, la psoriasis, la vasculitis, la granulomatosis de Wegener, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades está caracterizada por los receptores de los linfocitos T que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunitarias. La vacunación contra la zona invariable de los linfocitos T provocaría una respuesta inmunitaria que incluye las CTL para eliminar aquellos linfocitos T.
En la RA, se han caracterizado varias zonas específicas variables de los receptores de los linfocitos T (TCR) que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V\beta-3, V\beta-14, V\beta-17 y V\alpha-17. Así pues, la vacunación con una composición de ácido nucleico que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que dirigirá los linfocitos T implicados en la RA. Véase: Howell, M.D., et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253 : 325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90: 326-333; cada una de las cuales se incorpora a esta memoria como referencia.
En la MS, se han caracterizado varias zonas específicas variables de los receptores de las TCR que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V\beta-7 y V\alpha-10. Así pues, la vacunación con una composición de ácido nucleico que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T implicados en la MS. Véase: Wucherpfenning, K.W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345: 344-346; cada una de las cuales se incorpora a esta memoria como referencia.
En la esclerodermia, se han caracterizado varias zonas específicas variables de los receptores de las TCR que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V\beta-6, V\beta-8, V\beta-14, y V\alpha-16, V\alpha-3C, V\alpha-7, V\alpha-14, V\alpha-15, V\alpha-16, V\alpha-28 y V\alpha-12. Así pues, la vacunación con una composición de ácido nucleico que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los linfocitos T implicados en la esclerodermia.
Para tratar los pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, en particular aquellos cuya zona variable de la TCR ha de ser caracterizada todavía, se puede realizar una biopsia sinovial. Se pueden tomar muestras de los linfocitos T presentes y de la zona variable de las TCR identificada utilizando técnicas normalizadas. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.
Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos B incluyen el lupus (SLE), la enfermedad de Grave, la miastenia grave, la anemia hemolítica autoinmunitaria, la trombocitopenia autoinmunitaria, el asma, la crioglobulinemia, la esclerosis biliar primaria y la anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades está caracterizada por anticuerpos que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las enfermedades autoinmunitarias. La vacunación contra la zona variable de dichos anticuerpos provocaría una respuesta inmunitaria que incluye las CTL para eliminar aquellos linfocitos T que producen el anticuerpo.
Para tratar los pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos B, se debe identificar la zona variable de los anticuerpos implicados en la actividad autoinmunitaria. Se puede realizar una biopsia y se pueden tomar muestras de los anticuerpos presentes en la zona de la inflamación. Se puede identificar la zona variable de esos anticuerpos utilizando técnicas normalizadas. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.
En el caso de la SLE, se cree que un antígeno es el ADN. Así pues, en pacientes que se han de inmunizar contra SLE, se pueden identificar los anticuerpos anti-ADN en su suero y se puede preparar una vacuna que incluya composiciones de ácidos nucleicos que codifiquen la zona variable de dichos anticuerpos anti-ADN encontrados en el suero.
Las características estructurales comunes entre las zonas variables de ambas TCR y los anticuerpos son bien conocidas. La secuencia de ADN que codifica una determinada TCR o un anticuerpo se puede encontrar generalmente siguiendo los procedimientos bien conocidos tales como los descritos en Kabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, que está incorporada a esta memoria como referencia. Además, se puede encontrar un procedimiento general para la clonación de las zonas funcionales variables en anticuerpos en Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1066, que se incorpora a esta memoria como referencia.
En aspectos de la presente invención que se refieren a la terapia genética, las composiciones de ácidos nucleicos contienen genes de compensación o genes que codifican proteínas terapéuticas. Ejemplos de genes de compensación incluyen un gen que codifica la distrofina o un fragmento funcional, un gen para compensar el gen defectuoso en los pacientes que padecen fibrosis quística, un gen para compensar el gen defectuoso en pacientes que padecen ADA y un gen que codifica el Factor VIII. Ejemplos de genes que codifican proteínas terapéuticas incluyen los genes que codifican eritropoyetina, interferón, receptor LDL, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. Además, se pueden administrar composiciones de ácidos nucleicos que codifican componentes de anticuerpo de una sola cadena que se unen de forma específica a sustancias tóxicas. En algunas formas de realización preferidas, se proporciona el gen de distrofina como parte de un mini-gen y se utiliza para tratar individuos que padecen distrofia muscular. En algunas formas de realización preferidas, se proporciona un mini-gen que contiene una secuencia de codificación para una proteína de distrofina parcial. Las anomalías de la distrofina son responsables tanto de la distrofia muscular leve de Becker (BMD) y de la distrofia muscular grave de Duchenne (DMD). En la BMD se forma distrofina, pero su tamaño y/o cantidad son anómalos. El paciente está poco o moderadamente débil. En la DMD no se forma ninguna proteína y el paciente está en silla de ruedas a los 13 años y muere normalmente a los 20 años. En algunos pacientes, particularmente en los que padecen BMD, la proteína distrofina parcial producida por expresión de un mini-gen administrado según la presente invención puede proporcionar una función muscular mejorada.
En algunas formas de realización preferidas, los genes que codifican IL-2, IL-4, interferón o TNF se administran a células tumorales que están presentes o eliminadas y a continuación se reintroducen en un individuo. En algunas formas de realización, un gen que codifica el interferón \gamma se administra a un individuo que padece esclerosis múltiple.
Se pueden administrar también moléculas de la cadena complementaria y ribozimas a las células de un individuo introduciendo una composición de ácidos nucleicos que actúa como plantilla para las copias de dichos agentes activos. Estos agentes inactivan o si no interfieren con la expresión de los genes que codifican las proteínas cuya presencia es indeseable. Las composiciones de ácidos nucleicos que contienen secuencias que codifican moléculas de la cadena complementaria se pueden utilizar para inhibir o impedir la producción de proteínas en las células. Así pues, se puede eliminar o reducir la producción de proteínas tales como los productos del oncogén. Asimismo, las ribozimas pueden destruir la expresión génica destruyendo selectivamente el ARN mensajero antes de que se traduzca en la proteína. Se pueden tratar las células utilizando composiciones de ácidos nucleicos que codifican la cadena complementaria o las ribozimas como parte de un régimen terapéutico que implica la administración de otros productos terapéuticos y procedimientos. Las composiciones de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la cadena complementaria y las ribozimas utilizan vectores similares a los que se utilizan cuando se desea la producción de proteínas excepto que la secuencia de codificación no contenga un codón de iniciación para iniciar la traducción del ARN en la proteína.
Las ribozimas son ARN catalíticos que son capaces de auto-escisión o de la escisión de otras moléculas de ARN. Varios tipos diferentes de ribozimas, tales como cabeza de martillo, horquilla, intrón tetrahimena del grupo I, cabeza de hacha y P de RNasa son conocidos en la técnica; véase S. Edgington, Biotechnology (1992) 10, 256-262. Las ribozimas de cabeza de martillo tienen un punto catalítico que ha sido cartografiado en un núcleo de menos de 40 nucleótidos. Varios ribozimas en viroides vegetales y ARN satélites comparten una estructura secundaria común y determinados nucleótidos conservados. Aunque estos ribozimas sirven naturalmente como su propio sustrato, el dominio de la enzima puede dirigirse a otro sustrato de ARN mediante emparejamiento de bases con secuencias que flanquean al punto de escisión conservado. Esta capacidad para acostumbrarse al diseño de las ribozimas les ha permitido ser utilizados para la escisión del ARN de secuencia específica; véase G. Paolella et al., EMBO (1992), 1913-1919). Por consiguiente la experiencia de un experto en la técnica comprende utilizar diferentes secuencias catalíticas en varios tipos de ribozimas, tal como la secuencia catalítica de cabeza de martillo y diseñarlas de la manera descrita en esta memoria. Se pueden diseñar ribozimas contra una variedad de dianas incluyendo las secuencias de nucleótidos patógenas y secuencias oncogénicas. Las formas de realización preferidas incluyen suficiente complementariedad para dirigir de forma específica la transcripción de la fusión abl-bcr mientras mantienen la eficacia de la reacción de escisión.
El complejo molecular multifuncional de la presente invención que contiene la composición deseada de ácidos nucleicos se puede administrar a un individuo utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. El complejo molecular multifuncional que contiene la composición deseada de ácidos nucleicos se puede administrar simultáneamente a un individuo por vía intradérmica, subcutánea e intramuscular utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son bien conocidos y ampliamente disponibles. Cualquier experto en la técnica puede utilizar, siguiendo las directrices de esta memoria, dispositivos de inyección sin aguja para administrar complejos moleculares multifuncionales que contienen las composiciones deseadas de ácidos nucleicos a las células de un individuo. Los dispositivos de inyección sin aguja son muy aconsejables para administrar estos complejos a todos estos tejidos. Son particularmente útiles para administrar los complejos de la presente invención a las células de la piel y del músculo. Un dispositivo de inyección sin aguja puede utilizarse para impulsar los complejos de la presente invención en forma líquida, que contienen moléculas de ADN, hacia la superficie de la piel del individuo. El líquido es impulsado a una velocidad suficiente de modo que en el momento del impacto con la piel, el líquido penetra en la superficie de la piel y penetra el tejido subyacente de la piel y del músculo. De este modo, la composición de ácido nucleico se administra simultáneamente por vía intradérmica, subcutánea e intramuscular.
Se puede utilizar un dispositivo de inyección sin aguja para administrar composiciones de ácido nucleico al tejido de otros órganos para introducir una molécula de ácido nucleico a las células de este órgano.
Los complejos moleculares multifuncionales de la presente invención que contienen composiciones de ácidos nucleicos se pueden administrar directamente al individuo que se ha de inmunizar o ex vivo en las células extraídas del individuo que se vuelven a implantar después de la administración. Por ambas vías, se introduce el material genético en las células que están presentes en el cuerpo del individuo. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, la intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral así como por vía transdérmica o por inhalación o supositorio. Las vías preferidas de administración incluyen la inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. La administración de composiciones de ácido nucleico que codifican proteínas diana puede comunicar inmunidad a las mucosas en individuos inmunizados por un modo de administración en el que el material se presenta a los tejidos relacionados con la inmunidad a las mucosas. Así pues, la composición de ácidos nucleicos se puede administrar por administración a la cavidad bucal dentro de la boca de un individuo.
Los complejos moleculares multifuncionales que contienen composiciones de ácido nucleico según la presente invención comprenden generalmente entre aproximadamente 1 nanogramo y aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. En algunas formas de realización preferidas, los complejos contienen entre aproximadamente 10 nanogramos y aproximadamente 800 microgramos de ADN. En formas de realización más preferidas, los complejos contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ADN. En formas de realización todavía más preferidas, los complejos contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN. En formas de realización aún más preferidas, los complejos contienen entre aproximadamente 25 y aproximadamente 250 microgramos de ADN. En las formas de realización más preferidas, los complejos contienen aproximadamente 100 microgramos de ADN.
Los complejos moleculares multifuncionales que contienen composiciones de ácidos nucleicos según la presente invención se formulan según el modo de administración que se ha de utilizar. Cualquier experto en la técnica puede formular fácilmente una composición farmacéutica que comprenda una composición de ácidos nucleicos. En los casos en los que el modo de administración seleccionado es la inyección intramuscular, se utiliza preferentemente una formulación isotónica. En general, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las soluciones isotónicas tal como la solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. En algunas formas de realización, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación. Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se preparan de modo que estén esterilizadas y exentas de pirógenos.
Además de otros agentes que pueden funcionar como agentes transfectantes y/o agentes de replicación, se pueden administrar conjuntamente con los complejos de la presente invención factores de crecimiento, citocinas y linfocinas, tales como interferon-\alpha, interferon-\gamma frente a factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12, así como el factor de crecimiento de fibroblastos, agentes tensioactivos tales como los complejos estimulantes inmunitarios (ISCOMS), el adyuvante incompleto de Freund, el análogo de LPS incluyendo el monofosforil Lípido A (MPL), péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como el escualeno y el ácido hialurónico se pueden utilizar también, administrados juntamente con los complejos de la presente invención. En algunas formas de realización, las combinaciones de estos agentes se administran juntamente con los complejos de la presente invención.
Los complejos de la presente invención se pueden combinar con colágeno como emulsión y administrar por vía parenteral. La emulsión de colágeno proporciona un medio para la liberación lenta del ADN; se pueden utilizar entre 50 \mul y 2 ml de colágeno. En una forma de realización preferida que utiliza esta formulación se combinan aproximadamente 100 \mug de ADN con 1 ml de colágeno. Otras formulaciones de liberación lenta tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, texto de referencia habitual en este campo, que se incorpora a esta memoria como referencia. Dichas formulaciones incluyen las suspensiones acuosas, las soluciones y suspensiones de aceite, las emulsiones e implantes así como depósitos, dispositivos de liberación lenta y transdérmicos. En algunas formas de realización, se prefieren las formulaciones de liberación lenta para los complejos; en las que es deseable que el complejo se libere en un tiempo comprendido entre 6 y 144, preferentemente entre 12 y 96 horas, más preferentemente entre 18 y 72 horas.
El individuo se puede someter a una sola vacunación para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. Como alternativa, el individuo se puede someter a una serie de vacunaciones para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. Es preferible administrar al menos dos y preferentemente cuatro a cinco inyecciones durante un periodo de tiempo.
El periodo de tiempo entre las inyecciones puede ser de 24 horas separadas dos semanas o más entre las inyecciones, preferentemente separadas una semana. Como alternativa, se administran simultáneamente en diferentes puntos al menos dos y hasta cuatro inyecciones por separado.
Una vacunación completa puede incluir la inyección de un solo inoculante que contiene una composición de ácido nucleico que incluye las secuencias que codifican uno o más epítopos dirigidos.
Como alternativa, una vacunación completa puede incluir la inyección de dos o más inoculantes diferentes en diferentes puntos. Por ejemplo, una vacuna contra el VIH puede comprender dos inoculantes diferentes en los que cada uno comprende una composición de ácido nucleico que codifica diferentes proteínas víricas. Este procedimiento de vacunación permite la introducción, como mucho, de una serie completa de genes víricos en el individuo sin el riesgo de acoplar una partícula vírica infecciosa. De este modo, se puede provocar una respuesta inmunitaria contra la mayoría o todos los virus en el individuo vacunado. La inyección de cada inoculante se realiza en diferentes puntos, preferentemente a una distancia que asegure que ninguna célula recibe la combinación total de las composiciones de ácido nucleico. Como precaución adicional de seguridad, algunos genes pueden ser eliminados o alterados para impedir además la capacidad del conjunto vírico infeccioso.
Según la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que facilitan la administración del complejo molecular multifuncional, que a su vez funciona para facilitar la transferencia de la composición de ácido nucleico que está contenida en éstas, a las células diana. La composición farmacéutica puede ser nada más que un diluyente inerte y una sal o forma éster farmacéuticamente aceptables de dicho complejo molecular. Sin embargo, se pueden emplear de forma adecuada otros vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos por el especialista en este campo, para proporcionar las propiedades deseadas. Así pues, se pueden seleccionar uno o más agentes de entre las siguientes clases de excipientes farmacéuticos reconocidos: disolventes, sistemas de disolvente, solubilizantes y agentes de dispersión incluyendo tensioactivos y agentes emulsionantes; agentes modificadores de la viscosidad; y estabilizantes y agentes conservantes, incluyendo antioxidantes, agentes absorbentes de UV, agentes antibacterianos y agentes tamponantes.
Se ha dado a conocer en esta memoria kits farmacéuticos que comprenden un recipiente que contiene una composición de ácido nucleico y un recipiente que contiene un grupo de transferencia. Opcionalmente, se incluyen en dichos kits excipientes, portadores, conservantes y vehículos del tipo descrito anteriormente con respecto a las composiciones farmacéuticas. La expresión kit farmacéutico está destinada también a incluir múltiples inoculantes utilizados en los métodos mencionados anteriormente. Dichos kits incluyen recipientes independientes que comprenden diferentes inoculantes y grupos de transferencia. Los kits farmacéuticos se contemplan también para incluir una serie de inoculantes utilizados en los procedimientos de inmunización y/o en los procedimientos terapéuticos, descritos anteriormente.
Las composiciones de la presente invención son útiles en los campos tanto de la medicina humana como veterinaria. Por consiguiente, la presente invención se refiere al tratamiento de inmunización genético y terapéutico de mamíferos, pájaros y peces. Los procedimientos descritos en esta memoria pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de inmunización genética y terapéutica de especies de mamíferos incluyendo las especies humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina.
Descripción de las formas de realización preferidas
Los ejemplos indicados a continuación incluyen demostraciones representativas de varios aspectos de la presente invención. Los ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la invención; sino más bien están destinados meramente a servir como ilustraciones de la misma. Además, cualquier experto en la técnica será capaz de valorar fácilmente los aspectos y las formas de realización adicionales de la presente invención, basándose en la siguiente descripción detallada de la misma. Excepto que se indique de otra manera, todas las temperaturas citadas en los siguientes Ejemplos son temperaturas en la escala Celsius.
Ejemplo 1 Preparación de hidrocloruro de N^{4}-5'-aminopentilespermidina 8 N^{4}-(4-cianobutil)-N^{1}-N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (6)
Una solución de N^{1}-N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (2,92 g, 8,45 mmoles, 1,0 eq) [S. Nagarajan y B. Ganem, J. Org. Chem., 50, 5735-37 (1985)] en acetonitrilo (125 ml) se trató con N,N-diisopropiletilamina (3,534 ml, 20,0 mmoles, 2,4 eq), yoduro potásico (2,81 g, 16,90 mmoles, 2,0 eq) y 5-clorovaleronitrilo (1,902 ml, 16,90 mmoles, 2,0 eq). La solución homogénea resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. Se trató la mezcla con más N,N-diisopropiletilamina (1,767 ml, 1,2 eq), yoduro potásico (1,4 g, 1,0 eq) y 5-clorovaleronitrilo (0,951 ml, 1,0 eq) y se calentó a reflujo otras 18 horas. La cromatografía en capa fina (TLC) indicó que no quedaba ningún material de partida. Se eliminó el acetonitrilo al vacío y se absorbió el residuo en cloroformo (250 ml). Se lavó esta solución con agua (200 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), y se arrastró el disolvente para dar el producto en bruto como un aceite. Se purificó el material en sílice utilizando un gradiente de 2-propanol en cloroformo más 1% de N,N-diisopropiletilamina para dar un aceite (3,40 g); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,44 (s, 20,8 H; debería ser 18 H), 1,58-1,80 (m, 9,8 H), 2,38-2,44 (m, 9,4 H; debería ser 8,0 H), 3,16 (m, 4,1 H), 4,80 (m, 0,8 H), 5,38 (m, 0,8 H).
N^{4}-(5-aminopentil)-N^{1}-N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (7)
Se trató una solución de 6 (0,77 g, 1,81 mmoles) en ácido acético glacial (100 ml) con paladio al 5% sobre carbono (0,08 g, 10% p/p) y se colocó en un hidrogenador Parr (gas hidrógeno a 50 psi de presión) durante 2,75 horas. Se filtró la mezcla a través de un filtro de tierra de diatomeas marca Celite® (enjuagado previamente con ácido acético glacial) y se enjuagó el Celite con cloroformo. El filtrado y el lavado con cloroformo se combinaron y se eliminó el disolvente para dar un aceite. Se sometió el material en bruto a cromatografía en sílice utilizando un gradiente de metanol en cloroformo más 0,4% de diisopropiletilamina. El material consistió en un aceite incoloro (0,32 g). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,33 (m, 3,5 H; debería ser 2,0 H), 1,44 (s, 19,1 H; debería ser 18,0 H), 1,59 (m, 10,3 H), 2,37-2,45 (m, 6,2 H), 2,70 (t, 1,5 H), 3,14 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 0,7 H), 5,57 (m, 0,8 H).
Hidrocloruro de N^{4}-(5-aminopentil)espermidina (8)
Se agitó el compuesto 7 (0,200 g, 0,46 mmoles) con ácido trifluoracético (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminó el ácido trifluoracético al vacío, seguido de tres adiciones de cloroformo y posteriores evaporaciones al vacío. El aceite en bruto resultante se extrajo dos veces en HCl 0,1 N (30 ml) y se liofilizó para dar 8 como un sólido hidroscópico (0,19 g).
Ejemplo 2 Preparación de N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)aminopentil)espermidina 9 Galactosil-\beta1'4-tioglucósido de S-(succinimidil-\beta-3'-propionil)hepta-O-acetilo (10)
Una solución de galactosil-\beta1'-4-tioglucósido de S-\beta-3'-propionil hepta-O-acetilo [M. Elofsson, S. Roy, B. Walse y J. Kihlberg, Carb. Res., 246, 89-103 (1993)] (4,60 g, 6,35 mmoles) en isopropanol/cloroformo 1:1 (100 ml) se trató con N-hidroxisuccinimida (0,73 g, 6,35 mmoles) y N,N'-diciclohexilcarbodiimida (1,31 g, 6,35 mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas, se enfrió la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el disolvente del filtrado al vacío para dar un sólido blanco que se recristalizó en 2-propanol (3,43 g). El producto aislado era del 92% de pureza por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,0-2,16 (7s, 21,0 H), 2,85 (s, 3,8 H), 2,85-3,1 (m, 4,2 H), 3,65 (m, 0,7 H), 3,78 (t, 1,0 H), 3,88 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,54 (m, 2,8 H), 4,97 (m, 1,8 H), 5,11 (m, 1,0 H), 5,23 (t, 1,0 H), 5,36 (d, 0,7 H).
N^{4}(5(S-\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (11)
Se trató una solución de 10 (0,300 g, 0,70 mmoles) en cloruro de metileno (30 ml) con una solución de 7 (0,57 g, 0,70 mmoles) en cloruro de metileno (30 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se eliminaron los disolventes al vacío. La cromatografía en sílice utilizando un gradiente de 2-propanol en cloroformo dio el producto purificado como un cristal incoloro (0,49 g); pureza del 100% determinada por HPLC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,33 (m, 3,0 H; debería ser 2,0 H), 1,44 (s, 20,0 H; debería ser 18,0 H), 1,54 (m, 10,7 H; debería ser 6,0 H), 1,68 (m, 2,0 H), 1,97-2,16 (7s, 27,3 H; debería ser 21,0 H), 2,25 (m, 6,0 H; debería ser 4H), 2,52 (m, 9,0 H; debería ser 8,0 H), 2,84 (m, 1,0 H), 3,01 (m, 1,0 H), 3,1-3,27 (m, 6,7 H), 3,64 (m, 1,0 H), 3,80 (t, 1,0 H), 3,90 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,55 (d, 2,0 H), 4,70 (d, 1,0 H), 4,91-5,0 (m, 3,0 H; debería ser 2,0 H), 5,11 (m, 1,3 H), 5,21 (t, 1,0 H), 5,36 (d, 1,0 H), 5,44 (m, 0,7 H), 6,28 (m, 0,7 H). Espec. de masas FAB MH^{+} = 1138.
Trifluoracetato de N^{4}-(5-(S-\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta''-4'-tioglucósido)aminopentil)espermidina (12)
Se trató el compuesto 11 (0,200 g, 0,18 mmoles) con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminó al vacío en su mayor parte el ácido trifluoracético (TFA) y se sometió el residuo a tres adiciones de cloroformo, seguidas de la eliminación del disolvente al vacío. Se recuperó el producto en forma de aceite (0,22 g) con vestigios de TFA visibles; se determinó la pureza del 100% por HPLC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,25-1,53 (m, 5,5 H), 1,6-2,0 (m, 5,5; debería ser 4 H), 2,00-2,15 (7 s, 23,0 H; debería ser 21,0 H), 2,56 (m, 1,0 H), 2,68 (m, 1,3 H), 2,80 (m, 1,0 H), 3,0-3,4 (m, 11,0 H; debería ser 10,0 H), 3,64 (m, 1,0 H), 3,79 (m, 1,0 H), 3,94 (m, 1,0 H), 4,11 (m, 2,5 H), 4,55 (m, 1,5 H), 4,70 (m, 1,3 H), 4,90-5,20 (m amplia, 16,0 H; hinchado por agua; debería ser 2,0 ó 4,0 H), 5,36 (m, 1,0 H), 7,12 (m, 0,5 H), 7,86 (m, 2,3 H), 8,07 (m, 2,3 H), 9,8 (m, 0,5 H).
N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)-aminopentil)espermidina (9)
Se trató una solución de 12 (0,20 g; 0,18 mmoles) en metanol (20 ml) con carbonato de sodio (0,38 g; 3,08 mmoles; 18 eq) y agua (35 ml) para una solución homogénea. Después de 6 h a temperatura ambiente, se evaporaron los disolventes y se desaló el residuo utilizando una resina de filtración de gel en medio Sephadex G-25, y ácido acético glacial al 1% como eluyente. Se combinaron el producto que contiene las fracciones y se liofilizó para dar un producto puro como sal de triacetato (0,10 g); pureza del 100% determinada por HPLC. ^{1}H RMN (DMSO- d_{6} D_{2}O): \delta 1,15 (m o t ancho, 1,5 H), 1,3-1,5 (m, 8,0 H), 1,65 (m, 2,0 H), 1,66 (s, 14,0 H; debería ser 9,0 H), 2,34 (m, 6,5 H), 2,60 (m, 3,0 H; debería ser 2,0 H), 2,74 (m, 6,0 H), 3,00 (m, 3,0 H), 3,27 (m, 3,5 H), 3,40 (m, 1,5 H), 3,47 (m, 2,0 H), 3,50 (m, 1,0), 3,60 (m, 1,0 H), 3,71 (d, 1,0 H), 4,14 (s ancho, enmascarado por un pico de agua), 4,27 (m, 4,0 H).
Ejemplo 3 Preparación de la sal acetato de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galctosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)pentil-espermidina 18
Con fines comparativos, la denominación en estilo CAS del compuesto 18 indicado anteriormente es la siguiente: sal acetato de 4-[(N^{2}-[N^{2},N^{6}-bis(3-[4-O(\beta-D-galactopiranosil)-\beta-D-glucopiranosiltio]propionil)lisil]N^{6}-(3-[4-O-(\beta-D-galactopiranosil)-\beta-D-glucopiranosiltio]-propionil)lisinamido)pentil]-1,8-diamino-4-azaoctano.
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina (14)
Se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,336 ml, 1,95 mmoles, 3,0 eq) y el compuesto 10 (1,859, 2,25 mmoles) a una solución de lisil-lisina (0,25 g, 0,64 mmoles) en agua/acetonitrilo 1:1 (100 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante unos pocos minutos hasta conseguir la homogeneidad. Se controló el pH con cuidado a intervalos regulares, y se añadió N,N-diisopropiletilamina según se necesitaba para mantener el pH entre 7 y 8. Se añadió un total de 7 eq de base durante 1 hora antes de que se estabilizase el pH entre 7 y 7,5. Se utilizó la HPLC en fase inversa para seguir la evolución de la reacción. Después de 24 h a temperatura ambiente, la reacción pareció que se había interrumpido con aproximadamente la formación de 50% de producto. Se evaporó el acetonitrilo al vacío y se trató la mezcla acuosa con HCl diluido (pH 5). Se extrajo la solución en cloroformo (2 \times 200 ml). Se secaron (Na_{2}SO_{4}) las capas orgánicas combinadas y se eliminó el disolvente al vacío para dar el producto en bruto como un cristal (2,17 g). Se sometió el material a cromatografía de flash en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo más 1% de ácido acético glacial como eluyente (1,09 g). Se determinó la pureza por HPLC que fue aproximadamente del 96%. Espec. de masas FAB: MH+ = 2394.
Succinimidil N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina (15)
Una solución de N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)-lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina (1,00 g, 0,42 mmoles) en isopropanol/cloroformo 1:1 (20 ml) se trató con N-hidroxisuccinimida (48,1 mg, 0,42 mmoles) y N,N'-diciclohexilcarbodiimida (86,2 mg, 0,42 mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas, se enfrió la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el disolvente del filtrado al vacío y se recristalizó el producto en 2-propanol. Se recogió el producto por filtración y se secó al vacío para dar un sólido en polvo blanco (0,76 g). Este material se demostró por HPLC que consistía en una mezcla del ácido libre de partida y del éster de succinimidilo en una proporción de aproximadamente 1:2 respectivamente. La mezcla no se sometió a purificación adicional, sino que se utilizó en la siguiente etapa. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,96-2,20 (s múltiple, 86,4 H; debería ser 63,0 H), 2,28 (m, 3,6 H), 2,53 (m, 6,6 H), 2,88 (m, 6,6 H), 3,02 (m, 3,6 H), 3,18-3,40 (m, 4,2 H), 3,62 (m, 3,6 H), 3,85 (m, 3,6 H), 3,95 (m, 3,6 H), 4,10 (m, 12,0 H), 4,57 (m, 6,0 H), 4,70 (m, 4,2 H), 5,02 (m, 7,2 H), 5,10 (m, 3,6 H), 5,20 (t, 3,6 H), 5,36 (d, 3,0 H), 6,31 (t, 0,6 H), 6,58 (t, 0,6 H), 6,90 (d, 0,6 H), 7,47 (d, 0,6 H).
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil-N^{1},N^{8}-bis(terc-butoxicarbonil)espermidina (16)
Se trató una solución de 7 (87 mg, 0,20 mmoles) en cloruro de metileno (20 ml) con una solución de 15 (0,76 g de la mezcla al 66%, correspondiente a 0,50 g del éster; 0,20 mmoles) en cloruro de metileno (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 h, seguido de eliminación del disolvente al vacío. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo. El producto impuro resultante constaba de una mezcla 65:35 de producto al ácido libre presente como contaminante en el éster de partida. Una segunda columna de sílice que utiliza el mismo gradiente más ácido acético glacial al 0,5% aisló de forma eficaz el producto puro (0,38 g); pureza del 100% determinada por HPLC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,30-1,39 (m, 4,0 H), 1,44 (s, 13,5 H; debería ser 18,0 H), 1,53 (m, 8,6 H), 1,60-1,90 (m, 6,1 H), 1,97-2,16 (s múltiple, 73,8 H; debería ser 63,0 H), 2,27 (m, 3,7 H), 2,49-2,70 (m, 8,0 H), 2,85 (m, 2,5 H), 3,00 (m, 2,5 H), 3,23 (m, 6,2 H), 3,65 (m, 2,5 H), 3,80-3,93 (m, 5,5 H), 4,12 (m, 8,0 H), 4,20-4,40 (m, 1,8 H), 4,57-4,69 (m, 8,0 H), 4,91-5,00 (m, 5,5 H), 5,09 (m, 3,1 H), 5,21 (t, 3,1 H), 5,36 (d, 2,5 H), 6,57 (m, 0,9 H), 6,95 (m, 0,6 H), 7,20 (m, 0,6 H).
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)espermidina (17)
El compuesto 16 (0,170 g, 0,059 mmoles) se trató con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. Se eliminó la mayor parte del ácido trifluoracético al vacío (0,19 g). Se determinó la pureza por HPLC que fue aproximadamente del 100%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,20-1,80 (m, 4,8 H), 1,96-2,15 (s múltiple, 84,0 H; debería ser 63,0 H), 2,54 (m, 12,0 H; posiblemente hinchado por un pico de agua), 3,65 (m, 3,0 H), 3,81 (m, 3,0 H), 3,93 (m, 4,0 H), 4,12 (m, 12,0 H), 4,29 (m, 2,0 H), 4,55 (m, 6,0 H), 4,69 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 3,0 H), 5,09 (m, 6,0 H), 5,19 (m, 4,0 H), 5,38 (d, 3,0 H), 6,99 (m, 1,0 H), 7,60 (m, 0,5 H), 7,91 (m, 1,0 H), 8,09 (m, 1,0 H).
Sal acetato de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)espermidina (18)
A una solución de 17 (0,17 g, 0,059 mmoles) en metanol (20 ml) se añadió carbonato sódico (0,37 g, 2,95 mmoles), seguido de agua (40 ml) hasta conseguir la homogeneidad. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4 h, se arrastraron los disolventes y se eluyó el producto en bruto en una columna con medio de Sephadex G-25 utilizando ácido acético glacial al 1% como eluyente. Las fracciones que contienen producto se combinaron y se liofilizaron para dar el producto puro como un sólido sumamente higroscópico (0,07 g).
Ejemplo 4 Preparación de la sal acetato de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galctosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)espermidina 23 Succinimidil N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina (20)
Una solución de N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido) lisina (1,00 g, 0,42 mmoles) en isopropanol/cloroformo 1:1 (20 ml) se trató con N-hidroxi-succinimida (48,1 mg, 0,42 mmoles) y N,N'-diciclohexilcarbodiimida (86,2 mg, 0,42 mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas, se enfrió la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el disolvente del filtrado al vacío y se recristalizó el producto en 2-propanol. Se recogió el producto por filtración y se secó al vacío para dar un sólido en polvo blanco (0,76 g). Este material se demostró por HPLC que consistía en una mezcla del ácido libre de partida y del éster succinimidílico en una proporción de aproximadamente 1:2 respectivamente. La mezcla no se sometió a purificación adicional, sino que se utilizó en la siguiente etapa.
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino-pentil-N^{1},N^{8}-bis(terc-butoxicarbonil)espermidina (21)
Se trató una solución de 7 (87 mg, 0,20 mmoles) en cloruro de metileno (20 ml) con una solución de 20 (0,769 g de la mezcla al 66%, correspondiente a 0,50 g del éster; 0,20 mmoles) en cloruro de metileno (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 h, seguido de la eliminación del disolvente al vacío. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo. El producto impuro resultante estaba constituido por una mezcla 65:35 de producto a ácido libre presente como contaminante en el éster de partida. Una segunda columna de sílice que utiliza el mismo gradiente más ácido acético glacial al 0,5% aisló de forma efectiva el producto puro (0,38 g); pureza del 100% determinada por HPLC.
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino-pentil)espermidina (22)
Se trató el compuesto 21 (0,170 g, 0,059 mmoles) con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. Se eliminó la mayor parte del ácido trifluoracético al vacío (0,19 g). Se determinó la pureza por HPLC que fue aproximadamente del 100%.
Sal acetato de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino-pentil)espermidina (23)
A una solución de 22 (0,17 g, 0,059 mmoles) en metanol (20 ml) se añadió carbonato sódico (0,37 g, 2,95 mmoles), seguido de agua (40 ml) hasta conseguir la homogeneidad. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4 h, se arrastraron los disolventes y se eluyó el producto en bruto en una columna con medio G-25 de Sephadex utilizando ácido acético glacial al 1% como eluyente. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron para dar el producto puro como un sólido sumamente higroscópico (0,07 g).
Ejemplo 5 Preparación de la sal hidrocloruro de N^{4}-5-(D-biotinil)aminopentil espermidina 24
A una solución de 7 (0,20 g, 0,47 mmoles) en 20 ml de acetonitrilo y 10 ml de agua se añadió 160 mg de succinimidil D-biotina. Se agitó la solución durante 18 h. Se redujo el volumen de la solución a 15 ml al vacío y se purificó la solución restante en sílice ligada a octadecilsililo utilizando un gradiente agua/acetonitrilo que contiene ácido trifluoracético al 0,1%. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se eliminó el disolvente al vacío para dar un sólido blanco céreo (pureza del 94% por HPLC). Se añadió al sólido blanco 10 ml de 2-propanol y 10 ml de HCl 4 N en dioxano. Se eliminaron los disolventes al vacío. El sólido blanco resultante se redisolvió en agua y se secó al vacío para dar una espuma higroscópica (0,11 g). ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1-31 (m, 4 H), 1,44 (m, 6 H), 1,64 (m, 8 H), 2,09 (m, 4 H), 2,63 (d, 2 H), 2,91 (m, 4 H), 3,06 (m, 8 H), 4,18 (m, 1 H), 4,36 (m, 1 H).
Ejemplo 6 Preparación de la sal hidrocloruro de N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)aminopentil espermidina 25
A una solución de 7 (0,20 g, 0,47 mmoles) en 20 ml de cloruro de metileno se añadió 210 mg de cloroformato de colesterilo y 200 \mul de diisopropiletilamina. Se agitó la solución durante 24 h. Se eliminó el cloruro de metileno al vacío, se redisolvió el aceite restante en cloroformo y se purificó en sílice utilizando un gradiente metanol/cloroformo que contenía 0,1% de diisopropiletilamina. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se eliminó el disolvente al vacío para dar un sólido blanco céreo (0,29 g). Se añadió al sólido blanco 10 ml de 2-propanol y 10 ml de HCl 4 N en dioxano. Se eliminaron los disolventes al vacío. El sólido blanco resultante se redisolvió en agua y se secó al vacío para dar un sólido blanco céreo (0,15 g).
Ejemplo 7 Preparación de N^{4}-octil-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina 26
A una solución de N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (1,0 g, 2,89 mmoles) en acetona (100 ml) se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,605 ml, 3,47 mmoles, 1,2 eq), yoduro potásico (0,489, 2,89 mmoles) y 1-bromooctano (0,500 ml, 2,89 mmoles). Se calentó la mezcla a reflujo durante una hora, seguido de adición de N,N-diisopropiletilamina (0,605 ml, 3,47 mmoles) y yoduro potásico (0,48 g, 2,89 mmoles). Después de otras 3 h a reflujo, se añadió 1-bromooctano (0,500 ml, 2,89 mmoles) y se continuó a reflujo durante otra hora. Se evaporó la acetona al vacío. Se absorbió el residuo en cloroformo (125 ml) y se lavó con agua (2 \times 75 ml). Se secó (Na_{2}SO_{4}) la capa orgánica y se eliminó el disolvente al vacío para dar un líquido. Se purificó el líquido por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo más 1% de N,N-diisopropil-etilamina. Se recuperó el producto puro como un aceite naranja pálido (0,59 g). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 3,5 H), 1,27 (m, 14,2 H; debería ser 16,0 H), 1,44 (s, 18,7 H), 1,58 (m, 1,6 H), 1,82 (m, 1,6 H), 2,37 (m, 2,4 H), 2,44 (m, 2,2 H), 3,19 (m, 4,0 H), 4,84 (m, 0,3 H), 5,62 (m, 0,3 H).
N^{4}-octil-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,15 g) se disolvió en 6 ml de HCl 4 N en dioxano y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente al vacío y el aceite amarillo se puso en suspensión en cloroformo y se eliminó el disolvente al vacío. Se disolvió el aceite resultante en 10 ml de etanol absoluto y se precipitó mediante adición de 30 ml de éter dietílico. Se aisló el sólido por decantación del líquido y secado al vacío (0,10 g). ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,86 (m, 3 H), 1,28 (m, 10 H), 1,58-1,80 (m, 6 H), 2,00 (m, 2H), 2,80 (m, 2 H), 2,89 (m, 2 H), 3,03 (m, 4 H), 3,15 (m, 2 H), 8,01 y 8,13 (dos m, 5 H, debería ser 6 H). Anal: Calculado para C_{15}H_{38}Cl_{3}N_{3} C 49,11, H 10,44, N 11,45. Obtenido C 48,57, H 10,75, N 11,29.
Ejemplo 8 Preparación del trihidrocloruro de N^{4}-dodecilespermidina 27
Se trató una solución de N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,50 g, 1,45 mmoles) en acetona (50 ml) con N,N-diisopropiletilamina (0,604 ml, 3,48 mmoles), yoduro potásico (0,48 g, 2,90 mmoles) y 1-bromododecano (0,348 ml, 2,90 mmoles). La mezcla se calentó a reflujo durante 18 horas y se trató con 1-bromododecano (0,348 ml, 2,90 mmoles). Se continuó calentando a reflujo durante 4 horas. Se eliminó la acetona a presión reducida y se absorbió el residuo en cloroformo (250 ml). Se lavó la solución con agua (2 \times 100 ml). Se secó (Na_{2}SO_{4}) la capa orgánica y se eliminó el disolvente al vacío para dar un producto en bruto. Se purificó el líquido por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo más 0,4% de N,N-diisopropiletilamina. Se recuperó el producto puro como un aceite de 0,52 g de masa. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 3,0 H), 1,26 (s ancho, 21,0 H; debería ser 20,0 H), 1,44 (s, 20,5 H; debería ser 18,0 H), 1,64 (m, 5,8 H), 2,37 (m, 3,8 H), 2,46 (t, 2,5 H), 3,15 (m, 4,0 H), 4,84 (m, 0,5 H), 5,62 (m, 0,8 H).
Se disolvió la N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-N^{4}-dodecil-espermidina (0,52 g, 1,01 mmoles) en 2-propanol (5 ml) y se trató con HCl 4 N en dioxano (10 ml). Se agitó la solución homogénea a temperatura ambiente durante 20 h y se evaporaron los disolventes a presión reducida. Se absorbió el aceite en bruto en etanol (20 ml) y se trató con éter (10 a 15 ml) en agitación. Precipitó un sólido de la solución y se recogió por filtración (85 mg). Se recuperó una segunda recogida de 79 mg adicionales. El rendimiento total fue 164 mg. ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,86 (t, 2,3 H), 1,25 (m, 18,0 H), 1,63 (m, 3,7 H), 1,76 (m, 2,3 H), 1,99 (m, 1,3 H), 2,79 (m, 2,0 H), 2,90 (m, 2,0 H), 3,02 (m, 3,7 H), 3,16 (m, 2,3 H), 8,03 (m, 1,7 H), 8,14 (m, 2,7 H).
Ejemplo 9 Preparación del trihidrocloruro de N^{4}-hexadecilespermidina 28
Se trató una solución de N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,50 g, 1,45 mmoles) en acetona (50 ml) con N,N-diisopropiletilamina (0,302 ml, 1,74 mmoles, 1,2 eq), yoduro potásico (0,24, 1,45 mmoles) y 1-bromohexadecano (0,442 ml, 1,45 mmoles). Se calentó la mezcla a reflujo durante 20 horas y se eliminaron los disolventes al vacío. Se absorbió el residuo en cloroformo (250 ml) y se lavó con agua (150 ml). Se secó (Na_{2}SO_{4}) la capa orgánica y se evaporó el disolvente a presión reducida para dar el producto en bruto en forma de aceite ámbar. Se purificó el material por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo más 0,4% de N,N-diisopropil-etilamina. Se recuperó el producto puro como un aceite amarillo pálido de 0,42 g de masa. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 2,9 H), 1,26 (s ancho, 30,3 H; debería ser 28,0 H), 1,44 (s, 22,9 H; debería ser 18,0 H), 1,60 (m, 4,0 H), 1,72 (m, 1,7 H), 2,37 (m, 3,7 H), 2,46 (m, 2,9 H, debería ser 2,0 H), 3,17 (m, 4,0 H), 4,83 (m, 0,6 H), 5,62 (m, 0,6 H).
Se disolvió la N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-N^{4}-dodecil-espermidina (0,42 g, 0,74 mmoles) en 2-propanol (5 ml) y se trató con HCl 4 N en dioxano (10 ml). Se agitó la solución homogénea a temperatura ambiente durante 1,5 h, seguido de evaporación de los disolventes a presión reducida. Se absorbió el residuo en etanol (12 ml) y se trató con éter (10 ml) en agitación. Se formó un precipitado en la solución y se recogió por filtración 125 mg de masa. Se recuperó una segunda recogida de 75 mg para un rendimiento total de 0,200 g. ^{1}H RMN (DMSO- d_{6} + D_{2}O): \delta 0,83 (t, 2,1 H; debería ser 3,0 H), 1,22 (m, 26,6 H), 1,54-1,70 (m, 6,0), 1,96 (m, 1,7 H), 2,81 (m, 1,7 H), 2,89 (m, 2,1 H), 3,04-3,12 (m, 6,0 H).
Ejemplo 10 Transfección de células adhesivas en cultivo utilizando células que llevan receptor
Se cultivaron células HuH7 de carcinoma hepatocelular humano y se sembraron en una placa de 96 pocillos con 1-2 \times 10^{4} células en 100 \mul de modificación con suero al 10% del medio \alpha mínimo esencial. Se incubaron las placas en un incubador con CO_{2} a 37ºC hasta que las células fueron confluentes del 60 al 80% (aproximadamente 24 h). Se eliminó el medio y se lavaron las células una vez con Optimem® (medio exento de suero). Se añadió a las células Optimem® (100 \mul) conteniendo 0,5 \mug de plásmido pCMV\beta (de Clonetech, nº 6177-1), 0,5 \mug de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)-espermidina y 2,5 \mug de N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)-aminopentil)espermidina. Se incubaron las células con la mezcla durante 4 h en un incubador con CO_{2} a 37ºC; a continuación se añadió 100 \mul de medio conteniendo suero al 20% y la incubación continuó durante otras 20 h. Se analizó la actividad de \beta-galactosidasa en las células lisadas con 0,5% de NP-40 en NaCl 140 mM, tris 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM utilizando o-nitrofenil \beta-D-galactopiranosido y dio A_{405}= 1,35 después de 30 min. Se cultivaron las células en placas de 6 pocillos (25 mm de diámetro) y se trataron de igual modo, se fijaron con paraformaldehído al 2% y se analizó la actividad de \beta-galactosidasa utilizando \beta-D-galactopiranosido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989). La inspección visual demostró que entre el 5 y el 10% de las células se transfectaron según se probó por microscopía óptica. Se obtuvieron resultados similares cuando el componente de enlace específico del receptor del complejo molecular multifuncional se retiró del cultivo celular, aunque manteniendo el componente activador de la destrucción de la membrana del endosoma del complejo molecular multifuncional.
Se obtuvieron resultados similares con N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)aminopentil)espermidina; y N^{4}-(5-(metiltetrahidrofolil)aminopentil)-espermidina; con los componentes activadores de la destrucción de la membrana del endosoma incluidos en éste. Se pueden obtener resultados similares con N^{4}-octil-espermidina; N^{4}-dodecilespermidina; péptidos fusógenos acilados con el terminal N mediante N^{4}-(5-carboxipentil)espermidina; amida de N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina, con los componentes del enlace específico del receptor incluidos en éste.
Ejemplo 11 Transfección de las células musculares in vivo
Se prepararon soluciones conteniendo 100 \mug de plásmido pCMV\beta y 100 \mug de N^{4}-octilespermidina, N^{4}-dodecilespermidina o N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)-aminopentil)espermidina, cada uno en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato. Se inyectó la solución del plásmido (100 \mul) en el cuádriceps trasero de ratones BALB-C de 6 a 12 semanas de vida. Se sacrificaron los ratones aproximadamente 96 h después y se eliminó el tejido muscular del cuádriceps completo. Se fijó el músculo con formalina durante 2 h y se analizó la actividad de \beta-galactosidasa utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido (1 mg/ml en tris/EDTA pH 8,5). Las tres inyecciones se calificaron como positivas ya que el color azul era más intenso que el de la referencia: inyección de 100 \mug de plásmido pCMV\beta inyectado en 100 \mul de hidrocloruro de bupivicaína al 0,25% en tampón de citrato pH 6,0. Se pueden obtener también resultados similares con péptidos fusógenos acilados en el terminal N por N^{4}-(5-carboxipentil)espermidina y la amida de N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina.
Ejemplo 12 Transfección de células hepáticas in vivo
Se prepara una solución conteniendo 10 \mug de plásmido pHBVSA, 5 \mug de N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)espermidina y 25 \mug de N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)aminopentil)espermidina en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato. La solución del plásmido (100 \mul) se inyecta en la vena de la cola de ratones BALB-C de 6 a 12 semanas de vida. Se sacrifican los ratones 48 a 120 h después y se analiza en el suero el antígeno de superficie de la hepatitis B utilizando un inmunoanálisis de enzima ligado comercial. La producción de antígeno de superficie es mayor que la del control positivo suministrado con el kit a las 48 h después de la inyección.
Se obtuvieron resultados similares con N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)aminopentil)espermidina; N^{2},N^{6}-(5-[bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]aminopentil)espermidina; N^{4}-(5-(metiltetrahidrofolil)aminopentil)-espermidina; N^{4}-(5-(folinil)aminopentil)-espermidina; N^{4}-(5-(\alpha-3'-propionil tiomanósido)-aminopentil)espermidina y N^{4}-(5-(\alpha-3'-propionil tiomanósido-6-fosfato)aminopentil)-espermidina, con los componentes de enlace específico del receptor incluidos en éste.
Se pueden obtener también resultados similares con N^{4}-octilespermidina; N^{4}-dodecilespermidina; péptidos fusógenos acilados en el terminal N por N^{4}-(5-carboxi-pentil)espermidina; N^{4}-(5-(colest-5-en-3'-\beta-carbamoil)-aminopentil)espermidina; y amida de N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina, con los componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma incluidos en éstas.
Ejemplo 13 Kit para su utilización en investigación y fabricación
Un kit para utilizar los complejos moleculares multifuncionales de la presente invención en un equipo para investigación y fabricación, en el que cada usuario suministra su propio ADN, incluye un vial que contiene el grupo de transferencia de la presente invención disuelto en 0,1 a 10 mg/ml y preferentemente en 1 mg/ml en un tampón esterilizado a pH entre 6 y 8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones aceptables incluirían citrato, HEPES y fosfato. La utilización del kit implica extraer una alícuota del grupo de transferencia y añadir la alícuota a la solución de ADN (entre 0,05 y 2 mg/ml y preferentemente entre 0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la proporción final de mg del grupo de transferencia al mg del ADN esté comprendida entre 0,5 y 5,0 mg/mg. Las proporciones óptimas se pueden determinar fácilmente. El grupo de transferencia de ADN mixto se mezcla brevemente y se mantiene a 37ºC durante 15 a 60 minutos. El grupo de transferencia del ADN mixto, que ha formado ahora el complejo molecular multifuncional de la presente invención, se diluye a continuación con medio mínimo esencial (exento de suero) hasta una concentración de 5 a 100 \mug/ml y se añade a las células en el cultivo. Las concentraciones óptimas se pueden determinar fácilmente.
Ejemplo 14 Kit para su utilización clínica y veterinaria
Un kit para utilizar los grupos de transferencia descritos en esta memoria en un equipo clínico o veterinario, en el que cada usuario suministra su propio ADN, incluye un vial que contiene el grupo de transferencia disuelto en 0,1 a 10 mg/ml y preferentemente en 1 mg/ml en un tampón esterilizado a pH entre 6 y 8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones aceptables incluirían citrato, HEPES y fosfato. La utilización del kit implica extraer una alícuota del grupo de transferencia y añadir la alícuota a la solución de ADN (entre 0,05 y 2 mg/ml y sea preferentemente entre 0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la proporción final de mg del grupo de transferencia a mg del ADN esté comprendida entre 0,5 y 5,0 mg/mg y sea preferentemente 1 mg/mg. Las proporciones óptimas se pueden determinar fácilmente. La mezcla ADN-compuesto se mezcla brevemente y se mantiene a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. La mezcla de ADN-grupo de transferencia (10 a 500 \mug de ADN), que ha formado ahora el complejo molecular multifuncional de la presente invención, se mezcla a continuación en el paciente o individuo, humano o animal, acorde con la aplicación deseada, p. ej., inyección i.m. para inmunización, inyección i.v. para localización en el hígado, etc.
Ejemplo 15 Kit para utilización clínica y veterinaria, incluyendo ADN
Un kit para utilizar los complejos moleculares multifuncionales de la presente invención en un equipo clínico o veterinario, en el que el ADN es suministrado como parte del kit, incluye un vial que contiene el compuesto disuelto en 0,05 a 10 mg/ml y preferentemente en 0,5 a 1 mg/ml en un tampón esterilizado a pH entre 6 y 8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones aceptables incluirían citrato, HEPES y fosfato. El kit contiene también ADN apropiado para la utilización deseada (entre 0,05 y 2 mg/ml, y preferentemente entre 0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la proporción final de mg del grupo de transferencia a mg del ADN esté comprendida entre 0,5 y 5,0 mg/mg y sea preferentemente 1 mg/mg. La mezcla ADN-grupo de transferencia se mantiene a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. La mezcla de ADN-grupo de transferencia (10 a 500 \mug de ADN), se inyecta a continuación en el paciente o individuo, humano o animal, acorde con la aplicación deseada, p. ej., inyección i.m. para inmunización, inyección i.v. para localización en el hígado, etc.
Ejemplo 16 Kit que contiene componentes liofilizados
Los kits descritos en los Ejemplos 13 a 15 anteriormente, pueden tener también los componentes de los mismos suministrados en forma de polvos liofilizados en los que los grupos de transferencia, los componentes del tampón y los excipientes se redisuelven en el momento de su utilización mediante la adición de agua esterilizada. Estos kits liofilizados pueden incluir además el ADN como componente liofilizado.
Ejemplo 17 Preparación de trihidrocloruro de N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-espermidina
Se preparó 6-bromohexanoato de bencilo por adición gota a gota de una solución de cloruro de 6-bromohexanoilo (20,0 ml) en 100 ml de cloruro de metileno a una solución de 66,22 ml de alcohol bencílico en 60 ml de piridina. Se enfrió la mezcla utilizando un baño de agua con hielo durante 90 min, a continuación se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. Se extrajo la solución con 200 ml de HCl 1 N seguido de 2 \times 150 ml de NaHCO_{3} saturado Se descartaron los extractos y se secó la solución sobre Na_{2}SO_{4}. Se filtró la solución y se eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se purificó este aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de cloroformo en hexanos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto (TLC R_{f} 0,52, CHCl_{3}/hexanos 6:4) y se eliminó el disolvente para dar 24,4 g.
Se preparó N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina tratando N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (3,0 g) con tres alícuotas de 6-bromohexanoato de bencilo (de 2,45 g cada una) y K_{2}CO_{3} (de 1,19 g cada una) en intervalos de una hora en acetonitrilo a reflujo. Se eliminó el disolvente al vacío y se dividió el residuo entre 200 ml de agua y 2 \times 150 ml de CHCl_{3}. Se mezclaron las capas de CHCl_{3}, se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se purificó este aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se combinaron las fracciones que contenían el producto (TLC R_{f} 0,50, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 3,82 g de N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina en forma de aceite.
Se disolvió N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,20 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se eliminó el ácido trifluoracético al vacío, se disolvió el residuo dos veces en cloroformo (50 ml) y se eliminó el disolvente al vacío. Se liofilizó el residuo aceitoso en 10 ml de HCl 0,1 N para dar 126 mg de trihidrocloruro de N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-espermidina como un aceite. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,37 (2 H), 1,77 (9,4 H), 2,05 (2 H), 2,42 (1,8 H), 2,9 (1,7 H), 3,00 (4,4 H), 3,20 (1,7 H), 5,12 (1,7 H), 7,37 (5 H), 8,19 (5 H), 10,77 (1 H).
Ejemplo 18 Preparación del péptido N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-HA-2
Se trató N^{4}-(6'-ácido hexanoico)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (1,46 g) con 0,37 g de N-hidroxisuccinimida y 0,66 g de N,N-diciclohexilcarbodiimida en 100 ml de tetrahidrofurano durante 20 h. Se eliminó el precipitado por filtración y se eliminó el disolvente al vacío para dar 1,99 g de N^{4}-(succinimidil 6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina. Se preparó el péptido SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG utilizando un sintetizador de péptidos modelo 431A de ABI, se cargó previamente cartuchos con FMOC-aminoácido y se cargó previamente resina de FMOC-Gly-p-alcoxi-bencílico. Se eliminó el grupo protector FMOC del terminal N de serina y se secó la resina. Se trató la resina con péptido con 1,99 g de N^{4}-(succinimidil 6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina y 1,24 ml de diisopropiletilamina en 50 ml de dimetilformamida durante 24 h. Se aisló la resina por filtración y se enjuagó con diclorometano. La N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH se escindió de la resina utilizando una mezcla de agua (0,25 ml), etanoditiol (0,25 ml), tioanisol (0,50 ml) y ácido trifluoracético (9,5 ml). La resina agotada se eliminó por filtración y se precipitó N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH por adición del éter dietílico y se aisló por filtración. Se purificó una muestra de N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH (100 mg) por HPLC en una columna C-18 de 25 \times 250 mm eluyendo con un gradiente de bicarbonato de amonio 0,05 M y bicarbonato de amonio 0,05 M en acetonitrilo al 80%. Espectro de masas FAB MH^{+} = 2775.
Ejemplo 19 Preparación de trihidrocloruro de N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''\alpha,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina
Se disolvió ácido cólico (95 mg) en 10 ml de tetrahidrofurano y N-hidroxisuccinimida (27 mg) y se añadió diciclohexilcarbodiimida (48 mg). Se agitó la mezcla hasta disolver y se añadió N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (100 mg). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 48 h. Se eliminó el disolvente al vacío. Se purificó la cera en bruto en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se combinaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,39, CHCl_{3}/metanol 85:15) y se eliminó el disolvente para dar 0,15 g de N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''\alpha,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina como un sólido blanco. Se disolvió este sólido en 10 ml de 2-propanol y a esta solución se añadió 10 ml de HCl 4 N en dioxano. Se agitó la mezcla durante 18 h a temperatura ambiente, durante este tiempo precipitó el N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''\alpha,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina en forma de polvo blanco fino. Se aisló éste por filtración para dar 67 mg. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,58 (s, 3 H), 0,81 (s, 3 H), 0,92 (m, 5,5 H), 1,28 (m, 20,8 H), 1,62 (m, 16,2 H), 2,05 (m, 8,8 H), 2,8 (q, 2,8 H), 2,9 (q, 2,8 H), 3,02 (q, 8,3 H), 3,18 (m, 4,4 H), 7,87 (m, 1,1 H), 8,13 (br s, 4 H), 8,23 (br s, 4 H), 10,78 (br s, 1,1 H).
Ejemplo 20 Preparación de trihidrocloruro de N^{4}-(5-N-(\alpha-3'-propionamido tiomanósido)pentil)-espermidina
Se preparó en 50 ml de CHCl_{3} una solución de tetra-O-acetil-tiomanósido de S-\alpha-3'-propionilo (0,90 g) (preparada asimismo en hepta-O-acetil-galactosil-\beta1-4-tioglucósido de S-\alpha-3'-propionilo, M. Elofsson, S. Roy, B. Walse y J. Kihlberg, Carb. Res. 246, 89-103 (1993)). Se añadió a la solución 5 ml de 2-propanol, 0,43 g de diciclohexilcarbodiimida y 0,24 g de N-hidroxisuccinimida. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 1 h, a continuación se almacenó a 4ºC toda la noche. Se filtró un precipitado y se eliminó el disolvente del filtrado al vacío para dar un aceite. Se disolvió el aceite en 30 ml de tetrahidrofurano. A esta solución se añadió una solución de N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina (0,86 g) (en 50 ml de tetrahidrofurano y 30 ml de agua) y 0,55 ml de diisopropiletilamina. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2 h, se filtraron los sólidos resultantes y se eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se puso en suspensión el aceite en 100 ml de NaHCO_{3} saturado y se extrajo con 2 \times 75 ml de CHCl_{3}. Se secó la solución sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente para dar un aceite. Se purificó el aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,30, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,10 g de N^{4}-(5'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tetra-O-acetil-tiomanósido)pentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxi-carbonil)espermidina como un cristal. Se disolvió este cristal en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente al vacío y se redisolvió el residuo y se eliminó el disolvente utilizando cloroformo (3 \times 20 ml). Se trató el sólido con NH_{4}OH al 15% en etanol al 55% durante dos horas. Se liofilizó a continuación el producto (3\times) en HCl 0,05 N para dar trihidrocloruro de N^{4}-(5'-(\alpha-3'-propionil tiomanósido)aminopentil)-espermidina como un sólido blanco (64 mg).
Ejemplo 21 Preparación de trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
Se preparó N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina al igual que N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)- N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina por tratamiento de N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,5 g) con cuatro alícuotas de N-CBZ-5-amino-1-bromopentano (cada una de 1,74 g) y cinco alícuotas de K_{2}CO_{3} (1,00 g cada una). Se purificó el aceite resultante en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo (TLC R_{f} 0,47, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%) para dar 0,72 g de N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina como un aceite.
Se disolvió N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina (0,24 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó en un baño de agua con hielo bajo nitrógeno durante 2 horas. Se añadió éter frío para precipitar el producto como un aceite. Se eliminaron los disolventes por decantación y el aceite se disolvió en 25 ml de HCl 0,1 N y se liofilizó para dar 0,16 g de trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina como un cristal. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,28 (m, 2 H), 1,47 (m, 2 H), 1,61 (m, 8 H), 2,01 (m, 2 H), 2,82, 2,90 (m, 4 H), 3,02 (m, 8 H), 3,15 (m, 2,7 H), 5,01 (s, 2 H), 7,35 (s+m, 6,7 H), 8,00, 8,11 (br m solapante, 7,3 H).
Ejemplo 22 Preparación de trihidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina
Se preparó N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina al igual que N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina utilizando la misma secuencia de reacciones. Se preparó N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina al igual que N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina utilizando una sola adición de N-CBZ-5-amino-1-bromopentano (5,10 g) y K_{2}CO_{3} (4,70 g) en 3,42 g de N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en acetonitrilo a reflujo (100 ml). La preparación anterior dio el producto como un aceite que se purificó en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo conteniendo diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,43, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%) y se eliminó el disolvente para dar 6,0 g de N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina como un aceite. Se desprotegió una alícuota (0,25 g) de este material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,13 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,28 (m, 4 H), 1,43 (m, 4 H), 1,76 (m, 8,8 H), 2,01 (m, 4 H), 2,90, 3,00 (m solapante, 18,4 H), 3,17 (m, 4,4 H), 5,03 (s, 4 H), 7,35 (s, 12 H), 8,11 (br m, 5,6 H).
Ejemplo 23 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(octil)-espermina
Se preparó N^{4}-N^{9}-bis(octil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina utilizando una sola adición de 1-bromooctano (0,53 g), yoduro de potasio (0,45 g) y diisopropiletilamina (0,54 ml) en 0,50 g de N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en acetona (30 ml) y se calentó a reflujo toda la noche. Se eliminó la acetona al vacío y se absorbió la mezcla en 200 ml de cloroformo y se lavó con 100 ml de agua. Se secó la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para dar el producto en forma de aceite. Se purificó este aceite en gel de sílice, se eluyó con gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,54, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,26 g de N^{4}-N^{9}-bis(octil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina como una cera. Se trató este material (0,26 g) con 10 ml de HCl 4 N en dioxano durante dos horas a temperatura ambiente. Se eliminó el disolvente al vacío para dar 0,21 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(octil)-espermina como una cera. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,94 (t, 6 H), 1,35 (m, 22 H), 1,74, 1,83 (m solapante, 8,2 H), 2,10 (m, 4 H), 2,97, 3,12, 3,26 (m solapante, 18 H), 8,27 (br m, 5,6 H).
Ejemplo 24 Preparación de tetrahidrocloruro de 1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano
A 0,68 g de trifluoracetato de N^{4}-N^{9}-bis(octil)-espermina en 50 ml de tetrahidrofurano y 1 ml de agua se añadió 0,77 g de N,N'-bis(terc-butiloxicarbonil)-S-metilisotiourea y 0,85 ml de diisopropiletilamina. Se reflujó la reacción durante 1 h, se agitó a continuación a temperatura ambiente durante 18 h. Se eliminó el disolvente en una corriente de nitrógeno a 60º, se puso en suspensión el sólido resultante en 100 ml de NaHCO_{3} saturado y se extrajo con 2 \times 100 ml de cloroformo. Se secó la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se purificó este aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,39, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,18 g de 1,12-bis-N-(N',N''-bis-(terc-butiloxicarbonil-guanidino))-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diazadodeano como una cera. Se disolvió esta cera en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar un aceite. Se disolvió este aceite en 30 ml de HCl 0,1 N y se liofilizó para dar tetrahidrocloruro de 1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano (86 mg en forma de aceite). RMN (MeOH- d_{4}): \delta 0,82 (m, 3 H), 1,23, 1,30 (m solapante, 10 H), 1,64, 1,71 (m solapante, 4 H), 1,90 (m, 2 H), 3,14 (m, 6 H).
Ejemplo 25 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta carbamoil)pentil)-espermina
Se aisló N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina como un componente minoritario durante la preparación de N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina. Las fracciones que contienen la N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina (TLC R_{f} 0,26, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%) se mezclaron y se eliminó el disolvente para dar 0,84 g de un aceite. Se añadió a este aceite 50 ml de acetonitrilo, 0,47 ml de diisopropiletilamina y 0,35 g de bicarbonato de di-terc-butilo. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se absorbió el residuo en 100 ml de cloroformo y se lavó con 100 ml de agua. Se secó la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para dar 0,83 g de N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina, un único punto por TLC (R_{f} 0,56, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%). Se trató la N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,22 g) en 20 ml de metanol con 0,04 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG durante 2 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó el disolvente al vacío para dar N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina como un aceite (0,14 g). Se disolvió este aceite en cloruro de metileno y se añadió a la solución diisopropiletilamina (0,146 ml) y cloroformato de colesterilo (0,094 g). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el aceite resultante en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo que contiene diisopropiletilamina. Se mezclaron las fracciones que contenían el producto (TLC R_{f} 0,29, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%) y se eliminó el disolvente para dar 0,19 g de N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta carbamoil)pentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina como un aceite. Se disolvió este aceite en 5 ml de ácido trifluoracético y se agitó en nitrógeno en un baño de agua con hielo durante 2 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar un aceite. Se disolvió este aceite en 10 ml de HCl 0,1 N y se liofilizó para dar un aceite marrón claro (0,077 g). RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,58 (s, 3 H), 0,78 (dos s, 6 H), 0,90 (m solapante, 18 H), 1,43 (m solapante, 15 H), 1,64 (m solapante, 8 H), 1,96 (m, 6 H), 2,85 (m solapante, 16 H), 3,12 (m, 4 H), 5,25 (m, 1 H), 7,0 (br t, 1 H), 8,06 (br m, 8 H), 9,19 (br m, 2 H).
Ejemplo 26 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-espermina
A una suspensión de 7,8 g de ácido 12-bromododecanoico en 100 ml de agua se añadió 14 ml de dimetilamina 2 M en tetrahidrofurano produciendo una solución transparente. Se ajustó el pH a 7 con HCl 1 N y se añadió 5,36 g de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 18 h. La 12-bromododecanamida de N,N-dimetilo resultante precipitó en la solución como un sólido blanco durante este tiempo. Se filtró este sólido y se lavó con agua, a continuación se secó al vacío. N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina se preparó igualmente a N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina utilizando una sola adición de 12-bromo-dodecanamida de N,N-dimetilo (2,34 g) y K_{2}CO_{3} (1,70 g) en 0,50 g de N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en acetonitrilo (50 ml) a reflujo. La preparación anterior dio el producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo conteniendo diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,53, CHCl_{3}/metanol 8:2 + diisopropiletilamina al 0,2%) y se eliminó el disolvente para dar 0,49 g de N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,20 g) de este material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,19 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-espermina. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,26 (m, 25,6 H), 1,46 (m, 3 H), 1,70, 1,80 (m solapante, 6 H), 2,04 (m, 3 H), 2,79 (s, 6 H), 2,94 (s, 6 H), 3,0-3,2 (m solapante, 18 H), 8,15 (br m, 5 H).
Ejemplo 27 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-espermina
A una solución de ácido 12-bromododecanoico (1,0 g) y alcohol bencílico (0,74 ml) en 200 ml de tolueno se añadió ácido p-toluensulfónico (0,10 g). Se eliminó la mayor parte (aprox. 180 ml) del tolueno por destilación simple a presión atmosférica y se eliminó el disolvente restante al vacío. Se absorbió el residuo en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con NaHCO_{3} saturado Se secó la solución de acetato de etilo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para dar 12-bromododecanoato de bencilo (1,75 g) como un líquido en bruto. La TLC (cloroformo/hexano 85:15) presentó solamente producto (R_{f} 0,78) y alcohol bencílico (R_{f} 0,08). La N^{4}-N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina se preparó al igual que la N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina utilizando una sola adición de 12-bromododecanoato de bencilo (4,6 g) en bruto y K_{2}CO_{3} (1,70 g) en 1,0 g de N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en acetonitrilo (100 ml) a reflujo. La preparación anterior dio el producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,35, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,36 g de N^{4}-N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermina en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,27 g) de este material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,17 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanoil)-espermina. RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,24 (m, 31,4 H), 1,55 (m, 4,2 H), 1,70, 1,80 (m solapante, 8,6 H), 2,02 (m, 4,2 H), 2,9-3,2 (m solapante, 21,4 H), 5,08 (s, 4,2 H), 7,36 (s, 10 H), 8,13 (br m, 5,8 H).
Ejemplo 28 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-N^{9}-bis(ácido 12'-dodecanoico)-espermina
Se disolvió N^{4}-N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,51 g) en 50 ml de metanol y se trató con 0,05 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas. Se eliminó el disolvente del filtrado al vacío para dar N^{4}-N^{9}-bis(ácido 12'-dodecanoico)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,22 g) de este material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,17 g de N^{4}-N^{9}-bis(ácido 12'-dodecanoico)-espermina. RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,25 (m, 28 H), 1,47 (m, 5 H), 1,66, 1,76 (m solapante, 8 H), 2,02 (m, 3,6 H), 2,91-3,17 (m solapante, 19 H), 8,11 (br m, 5 H).
Ejemplo 29 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-(bencil 12'-dodecanoil)-espermina
Se preparó N^{4}-(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina de igual modo que N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina utilizando una sola adición de 12-bromododecanoato de bencilo (6,58 g) en 1,43 g de N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en acetonitrilo a reflujo (100 ml). La preparación anterior dio el producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo que contenía diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,08, CHCl_{3}/metanol 8:2 + diisopropiletilamina al 0,2%) y se eliminó el disolvente para dar 0,36 g de N^{4}(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,29 g) de este material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,19 g de tetrahidrocloruro de N^{4}(bencil 12'-dodecanoil)-espermina. RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,24 (m, 12 H), 1,53 (m, 1,5 H), 1,69, 1,80 (m solapante, 4 H), 2,01 (m, 4 H), 2,9-3,2 (m solapante, 14 H), 5,08 (s, 2 H), 7,36 (s, 5 H), 7,47 (m, 1 H), 8,09 (br m, 5,5 H), 9,20 (br m, 2 H).
Ejemplo 30 Preparación de tetrahidrocloruro de N^{4}-(ácido 12'-dodecanoico)-espermina
Se disolvió N^{4}-(bencil 12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,29 g) en 30 ml de metanol y se trató con 0,03 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas. Se eliminó el disolvente al vacío para dar N^{4}-(ácido 12'-dodecanoico)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite (0,19 g). Se desprotegió este material (0,19 g) y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente para el trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina para dar 0,18 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-(ácido 12'-dodecanoico)-espermina. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,26 (m, 16,7 H), 1,48 (m, 2,7 H), 1,70, 1,78 (m solapante, 6 H), 2,01 (m, 4 H), 2,91-3,17 (m solapante, 12 H), 8,17 (br m, 5,3 H), 9,30 (br m, 2 H).
Ejemplo 31 Preparación de tetraacetato de N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil tiomanósido)aminopentil)-espermina
Se disolvió N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermina (2,04 g) en 50 ml de metanol y se trató con 0,84 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó el disolvente del filtrado al vacío para dar N^{4}-N^{9}-bis(5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,79 g) en forma de aceite. Se preparó una solución de tetra-O-acetil-tiomanósido de S-\alpha-3'-propionilo (2,94 g) en 100 ml de tetrahidrofurano. A la solución de tiomanósido se añadió 1,39 g de diciclohexilcarbodiimida y 0,78 g de N-hidroxisuccinimida. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 20 h, a continuación se almacenó a 4ºC durante 0,5 h. Se filtró un precipitado y se eliminó el disolvente del filtrado para dar S-\alpha-3'-propionil tetra-O-acetil-tiomanósido de succinimidilo (3,80 g) como un sólido blanco. Se disolvió la N^{4}-N^{9}-bis(5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,79 g) en tetrahidrofurano (75 ml) y se añadió a la solución 0,64 ml de diisopropiletilamina y 1,32 g de S-\alpha-3'-propionil tetra-O-acetil-tiomanósido de succinimidilo, y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal. Se purificó este cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo que contenía diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,30, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,69 g de N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil tetra-O-acetil tiomanósido)aminopentil)- N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de cristal. Se disolvió este cristal en 20 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar 0,78 g de N^{4},N^{9}-bis(5-N-(\alpha-3'-propionamido tetra-O-acetil tiomanósido)pentil)-espermina en forma de aceite. Se disolvió este aceite en 25 ml de metanol y se añadió a la solución 25 ml de agua y 1,56 g de Na_{2}CO_{3}, y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 5 h. Se eliminaron los disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 6 ml de ácido acético al 1% y se purificó en tres alícuotas de 2 ml en tres columnas con medio G-25 de Sephadex^{TM} (cada una de 12 ml), eluyendo con ácido acético al 1%. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto y se liofilizaron para dar 0,31 g de tetraacetato de N^{4},N^{9}-bis(5-N-(\alpha-3'-propionamido tiomanósido)pentil)-espermina en forma de un sólido blanco. RMN (D_{2}O) \delta 1,42 (m, 4 H), 1,59 (m, 4 H), 1,79 (m, 9,5), 1,95 (s, 38,5 H), 2,14 (m, 5 H), 2,62 (t, 4 H), 2,94 (m, 4 H), 3,10 (m, 4,5 H), 3,24 (m, 18 H), 3,72 (m, 6 H), 4,05 (m, 6,5 H), 5,34 (s, 2 H).
Ejemplo 32 Preparación de tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina
Se añadió una solución de pentaetilenglicol (5,0 g) en 50 ml de tetrahidrofurano a una suspensión agitada rápidamente de NaH (0,42 g de 60%) en 40 ml de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se mantuvo bajo nitrógeno y se puso en suspensión en un baño de agua con hielo y se agitó durante 0,5 h. Se añadió una solución de N-CBZ-5-amino-1-bromopentano (3,78 g) en 30 ml de tetrahidrofurano y se agitó la mezcla en el baño de agua con hielo durante 1 h, a continuación a temperatura ambiente durante 18 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de 2-propanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,30, CHCl_{3}/2-propanol 95:5) y se eliminó el disolvente para dar 3,25 g de N-CBZ-20-amino-3,6,9,12,15-penta-oxa-1-eicosanol en forma de aceite. Se añadió una solución de N-CBZ-20-amino-3,6,9,12,15-penta-oxa-1-eicosanol (3,25 g) en 50 ml de tetrahidrofurano a una suspensión de NaH (0,28 g de 60%) agitada rápidamente en 25 ml de tetrahidrofurano. Se mantuvo la mezcla de reacción bajo nitrógeno y se puso en suspensión en un baño de agua con hielo y se agitó durante 0,5 h. Se añadió a la solución 1-bromoacetato de terc-butilo (1,15 ml) y se agitó la mezcla en el baño de agua con hielo durante 1 h, a continuación a temperatura ambiente durante cuatro días. Se eliminó el disolvente al vacío y se puso en suspensión el residuo en 100 ml de cloroformo y se lavó con agua (50 ml). Se secó la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y el disolvente se eliminó al vacío para dar un aceite. Se purificó el aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de 2-propanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,45, CHCl_{3}/2-propanol 95:5) se combinaron y se eliminó el disolvente para dar 3,24 g de N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoato de terc-butilo en forma de aceite. Una alícuota del N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoato de terc-butilo (0,49 g) se disolvió en 100 ml de HCl 4 N en dioxano y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Se eliminaron los disolventes al vacío. Se disolvió el ácido N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoico en bruto resultante en 15 ml de dimetilformamida. A esta solución se añadió N-hidroxisuccinimida (0,10 g), carbodiimida de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilo (0,16 g) y N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,50 g). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2,5 días. Se eliminó la dimetilformamida al vacío y se absorbió el residuo en cloroformo (100 ml). Se lavó la solución de cloroformo sucesivamente con HCl 0,1 N (75 ml) y NaHCO_{3} saturado Se secó la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y el disolvente se eliminó al vacío para dar un aceite. Se purificó el aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de 2-propanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,33, CHCl_{3}/2-metanol 9:1) se combinaron y se eliminó el disolvente para dar 0,19 g de N^{4}-(5-N-(N-CBZ-23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)ami-nopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite. Se disolvió este aceite en 50 ml de acetato de etilo y se trató con 0,19 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó el disolvente del filtrado para dar N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina como un aceite incoloro (0,13 g). Se disolvió N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina (0,13 g) en tetrahidrofurano (20 ml) y se añadió a la solución 0,048 ml de diisopropiletilamina y 0,073 g de tetra-O-acetil-tiomanósido de S-\alpha-3'-propionil y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal. Se purificó este cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,36, CHCl_{3}/metanol 9:1) se combinaron y se eliminó el disolvente para dar 0,10 g de N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propioamido tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina en forma de aceite. Espectro de masas FAB, MH^{+}=3328. Se disolvió la N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbo-nil)espermina (0,55 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar 0,76 g de N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-esper-mina como un aceite. Se disolvió este aceite en 20 ml de metanol y se añadió a la solución 20 ml de agua y 0,85 de Na_{2}CO_{3}y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 6,5 h. Se eliminaron los disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 6 ml de ácido acético al 1% y se purificó en cuatro alícuotas de 1,5 ml en tres columnas con medio G-25 de Sephadex^{TM} (de 12 ml cada una), eluyendo con ácido acético al 1%. Se mezclaron las fracciones que contenían el producto y se liofilizaron para dar 0,22 g de tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanami-do)aminopentil)-espermina como un aceite. RMN (D_{2}O) \delta 1,35 (m, 4 H), 1,55 (m, 6 H), 1,75 (m, 6,4 H), 1,91 (s, 14 H), 2,09 (m, 4,2 H), 2,58 (t, 1,7 H), 2,90 (m, 1,7 H), 3,09, 3,19 (m solapante, 18,1 H), 3,53 (t, 2,5 H), 3,69 (m, 22 H), 3,88 (m, 3,8 H), 4,06 (s, 1,7 H), 5,30 (s, 1 H).
Ejemplo 33 Preparación del tetraacetato de N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecaetilenglicol)pentil)-espermina
El tetraacetato de N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecaetilenglicol)pentil)-espermina se puede preparar de igual manera que el tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina sustituyendo 18,9 g de poli(etilenglicol) de peso molecular medio 900 por el pentaetilenglicol en el procedimiento descrito en el Ejemplo 32.
Ejemplo 34 Preparación del tetraacetato de N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3'-6'-9'-12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina
El tetraacetato de N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-trico-sanamido)aminopentil)-espermina se preparó de igual manera que el tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)a-minopentil)-espermina y el procedimiento descrito en el Ejemplo 32. Se disolvió N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-buti-loxicarbonil)espermina (0,14 g) en tetrahidrofurano (25 ml) y se añadió a la solución 0,052 ml de diisopropiletilamina y 0,37 g de N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglu-cósido)lisinato de succinimidilo y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 72 h. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal. Se purificó este cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,46, CHCl_{3}/metanol 9:1) se combinaron y se eliminó el disolvente para dar 0,15 g de N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucó-sido)lisinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina como un sólido blanco. Espectro de masas FAB, MH^{+}=3328. Se disolvió la N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbo-nil)espermina (0,28 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar 0,36 g de N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil hepta-O-acetil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisinamido)-3',6',9',12',-15',-18'-hexa-oxa-tricosonamido)ami-nopentil)-espermina como un aceite. Se disolvió este aceite en 10 ml de metanol y se añadió a la solución 10 ml de agua y 0,44 de Na_{2}CO_{3}y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminaron los disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 5 ml de ácido acético al 1% y 1 ml de etanol y se purificó en cuatro alícuotas de 1,5 ml en dos columnas con medio G-25 de Sephadex^{TM} (de 15 ml y 20 ml), eluyendo con etanol al 10% en ácido acético al 1%. Se mezclaron las fracciones que contenían el producto y se liofilizaron para dar 0,095 g de tetraacetato de N^{4}-(((23'-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-espermina.
TABLA 1
Familia Picornavirus
Géneros: Rinovirus: (Medicina) responsable de \sim 50% de los casos del resfriado común.
\begin{minipage}[t]{120mm}Eterovirus: (Medicina) incluye poliovirus, virus Coxsackie, virus ECHO y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A.\end{minipage}
Aftovirus: (Veterinaria) estos son los virus de enfermedades de los pies y la boca.
Antígenos diana: VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG.
TABLA 1 (continuación)
Familia de calcivirus
Géneros: \begin{minipage}[t]{120mm}Grupo de virus de Norwalk: (Medicina) estos virus son agentes patógenos importantes de la gastroenteritis epidémica.\end{minipage}
Familia Togavirus
Géneros: Alfavirus: (Medicina y Veterinaria)
\begin{minipage}[t]{120mm}los ejemplos incluyen los virus Senilis, virus de RossRiver y de la encefalitis equina oriental y occidental.\end{minipage}
Reovirus: (Medicina) virus de la rubeola.
Familia Flariviridue
\begin{minipage}[t]{120mm}Los ejemplos incluyen: (Medicina) virus del dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis y encefalitis transmitida por la garrapata.\end{minipage}
Virus de la hepatitis C: (Medicina) estos virus no están clasificados en una familia todavía pero se cree que son un togavirus o un flavivirus. La mayoría de las similitudes son con la familia togavirus.
Familia coronavirus: (Medicina y Veterinaria)
Virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral)
Virus gastroenterítico de transmisión porcina (cerdo)
Virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdo)
Virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos)
Coronavirus entérico felino (gato)
Coronavirus canino (perro)
\begin{minipage}[t]{120mm} Los coronavirus respiratorios humanos producen \sim 40 casos de resfriado común. EX. 224E, 0C43\end{minipage}
Nota- los coronavirus pueden producir hepatitis no-A, B o C
Antígenos diana
E1-también denominado M o proteína de la matriz
E2-también denominado S o proteína de Spike
\begin{minipage}[t]{120mm} E3-también denominado HE o glucoproteína de hemaglutina-elterosa (no presente en todos los coronavirus)\end{minipage}
N-nucleocápside
Familia de Rabdovirus
Géneros: Vesiliovirus
Lisavirus: (Medicina y Veterinaria) rabia
TABLA 1 (continuación)
Antígeno diana: Proteína G
Proteína N
Familia Filoviridue: (Medicina)
Virus de la fiebre hemorrágica tales como virus Marburg y Ébola
Familia Paramixovirus
Géneros: Paramixovirus (Medicina y Veterinaria)
\begin{minipage}[t]{120mm} Virus de parotiditis, virus de la enfermedad de New Castle (patógeno importante en pollos)\end{minipage}
Morbilivirus: (Medicina y Veterinaria)
Sarampión, moquillo canino
Neuminvirus: (Medicina y Veterinaria)
Virus sincitial respiratorio
Familia Ortomixovirus (Medicina)
Virus de la gripe
Familia Bungavirus
Géneros: Bungavirus: (Medicina) encefalitis de California,
LA Crosse
Flebovirus: (Medicina) fiebre del valle del Rift
Hantavirus: Puremala es un virus de la fiebre de hemahagina
Nairvirus (Veterinaria) enfermedad de ovejas de Nairobi
Además muchos bungavirus no asignados
Familia Arenavirus (Medicina)
LCM, virus de la fiebre de Lassa
Familia Reovirus
Géneros: Reovirus: un posible patógeno humano
Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños
Orbivirus: (Medicina y Veterinaria)
\begin{minipage}[t]{120mm}Fiebre de la garrapata de Colorado, encefalosis equina de Lebombo (hombre), lengua azul\end{minipage}
TABLA 1 (continuación)
Familia Retrovirus
Sub-familia:
Oncorrivirinal: (Veterinaria) (Medicina) virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII
\begin{minipage}[t]{120mm}Lentivirinal: (Medicina y Veterinaria) VIH, virus de la inmunodeficiencia felina, infecciones equinas, virus de la anemia\end{minipage}
Espumavirinal
Familia Papovavirus
Sub-familia:
Poliomavirus: (Medicina) virus BKU y JCU
Sub-familia:
\begin{minipage}[t]{120mm}Papilomavirus: (Medicina) muchos tipos víricos relacionados con cánceres o la evolución maligna del papiloma\end{minipage}
Adenoviurs (Medicina)
\begin{minipage}[t]{120mm}EX AD7, ARD. O.B.-producen enfermedades respiratorias-algunos adenovirus tales como 275 producen enteritis\end{minipage}
Familia Parvovirus (Veterinaria)
Parvovirus felino: producen enteritis felina
Panleucopeniavirus felina
Parvovirus canino
Parvovirus porcino
Familia de Herpesvirus
Sub-familia: alfaherpesviridue
Géneros: virus simple (Medicina)
HSVI, HSVII
Virus de la varicela: (Medicina-Veterinaria)
Pseudo-rabia-varicela zoster
Sub-familia-Herpesviridue beta
Géneros: Citomegalovirus (Medicina)
HCMV
Muromegalovirus
TABLA 1 (continuación)
Sub-familia: Herpesviridue gamma
Géneros: Limfocriptovirus (Medicina)
EBV-(linfo de Burkitts)
Radinovirus
Familia Poxvirus
Sub-familia: Cordopoxviridue (Medicina-veterinaria)
Géneros: Viruela (Smallpox)
Enfermedad vírica de las vacas (viruela vacuna)
Parapoxivirus-veterinaria
Auipoxvirus-veterinaria
Virus de la viruela caprina
Leporipoxvirus
Virus de la viruela porcina
Sub-familia: Entemopoxviridue
Familia Hepadnavirus
Virus de la hepatitis B
Sin clasificar
Virus de la hepatitis delta
TABLA 2
Patógenos bacterianos
Los cocos gram-positivos patógenos incluyen: pneumococos; estafilococos e estreptococos. Los cocos gram-negativos patógenos incluyen: meningococos y gonococos.
Los bacilos gram-negativos entéricos patógenos incluyen: enterobacteriáceas; pseusomonas, acinetobacterias y eiquenelas; melioindosis; salmonelas; sigelosis; hemofilus; chancroide; brucelosis; tularemia; yersinia (pasteurela); estreptobacilo moliniforme y espirilo; monocitogenes de listeria; erisipelotrix rusiopatía; difteria; cólera; ántrax; donovanosis (granuloma inguinal) y bartonelosis.
Las bacterias anaeróbicas patógenas incluyen: tétanos; botulismo; otros clostridios; tuberculosis; lepra y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patógenas incluyen: sífilis; treponematosis: frambesia, pinta y sífilis endémica; y leptospirosis.
Otras infecciones causadas por bacterias muy patógenas y hongos patógenos incluyen: actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, criptococopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis.
Las infecciones por ricketsias incluyen la ricketsial y la ricketsiosis.
Ejemplos de infecciones de micoplasma y clamidiales incluyen: pneumonía de micoplasma; linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales.
TABLA 2 (continuación)
Eucariotas patógenos
Los protozoos patógenos y helmintos y las infecciones por éstos incluyen: amebiasis; paludismo; leismaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocistis carinii; babesiosis; giardiosis; triquinosis; filariosis; esquistosomiasis; infecciones por nemátodos; tremátodos o helmintos y céstodos (tenia).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Boutin, Raymond H.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia génica a las células
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 32
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(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
Remitente: Woodcook Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris
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(B)
CALLE: One Liberty Place 46th Floor
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(C)
CIUDAD: Filadelfia
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(D)
ESTADO: Pensilvania
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(E)
PAÍS: U.S.A.
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(F)
Código postal: 19103
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(v)
LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
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(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/314.060
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-SEP-1994
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
APODERADO / AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DeLuca, Mark
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.229
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: APOL-0216
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 215-568-3100
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 215-568-3439
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn}
\sac{Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
(D) CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly}
\sac{Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Val Ser Leu Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Gly Leu Thr Met}
\sac{Gly Gly Ile Ala Ala Gly Val Gly Thr Gly Thr Thr Ala Leu Val Ala}
\sac{Thr Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly}
sac{Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ala Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly phe Leu Gly Ala Ala}
\sac{Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Ile Glu Gly Cys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly}
\sac{Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Ala Asn Val Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Val Tyr Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys}
\sac{Phe Cys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lis Leu Ile Cys Thr Gly Ile Ser Ser Ile Pro Pro Ile Arg Ala Leu}
\sac{Phe Ala Ala Ile Asn Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Val Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Val Ala Ala Ile Ile Leu Gly Ile Ser Ala Leu Ile Ala Ile Ile}
\sac{Thr Ser Phe Ala Val Ala Thr Thr Ala Leu Val Lys Glu Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Gln Cys Lys Val Tyr Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly}
\sac{Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Thr Cys Lys Val Phe Gly Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly}
\sac{Gly Ala Gln Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala}
\sac{Ala Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Ala Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Val Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Val Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Ala Gly}

Claims (31)

1. Complejo molecular multifuncional para transferir una composición de ácido nucleico a una célula diana, comprendiendo dicho complejo molecular multifuncional:
A) el ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia que comprende uno o más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido nucleico y que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente de entre los enteros 2 a 5 inclusive;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10 inclusive; y
cada R^{3} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-6} y un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de poliamina catiónico; y
en la que cada componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(a)-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3};
en la que R, R^{1}y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
j es un entero de 6 a 24 inclusive; y
B está ausente opcionalmente, o es un grupo de unión de la fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en la que k es, independientemente, un entero de 1 a 6 inclusive;
l es un entero de 0 a 30 inclusive;
p es un entero de 1 a 4 inclusive;
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; y
Z es O, S, N(R), o está ausente;
y
(b) -B-(R^{4})R;
en la que R se selecciona cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente;
B es un grupo puente seleccionado independientemente de entre los grupos (i) a (iv) como se definió anteriormente (a) en esta reivindicación, y además un grupo de fórmula:
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-
en la que j' es un entero de 1 a 8 inclusive;
R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula (2);
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6} es -H, -OH, -CO_{2}H, -C(=O)NH_{2}, -OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o -O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n' es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión del derivado de ácido cólico, que comprende un acilo -C_{1-6} o el grupo alquilcarbonilo-C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo C_{1-6}; y
(iii) colesteril derivados de fórmula (3):
11
en la que:
2 representa un enlace de estereoquímica no especificada;
- - - representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo C_{1-6}, -OC(=O)-, o -OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo-C_{1-6}; y
R^{8a} es un grupo alquilo C_{1-6}.
2. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que B está ausente.
3. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 2, en el que j es 8 a 18.
4. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 2, en el que j es 8 a 12.
5. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} tiene la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R, en la que X es N(R) y R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus encapsulado de animales, y (ii) ácido cólico y derivados del mismo seleccionados de entre el grupo constituido por éster y amida del ácido 3\alpha, 7\alpha, 12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
6. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 5, en el que j' es 2 a 4.
7. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R, en la que X es O o S y R^{4} se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados, y (ii) un grupo colesterilo y derivados del mismo seleccionados de entre el grupo constituido por colest-5-en-3'-\beta-carbonato, \beta-carbamato y -\beta-metilencarboxamida.
8. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 7, en el que R, R^{1} y R^{2} son cada uno hidrógeno, donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6, j' es un entero de 2 a 4 inclusive, y R^{4} es colest-5-en-3'-\beta-carbonato, -\beta-carbamato o-\beta-metilencarboxamida.
9. Complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el grupo del que R^{3}se puede seleccionar comprende además grupos que tienen la fórmula -B-(R^{5})R, y al menos uno de los grupos R^{3} tiene la fórmula-B-(R^{5})R;
en la que B es un grupo puente seleccionado independientemente de entre los grupos (i) a (v) inclusive tal como se define en la reivindicación 1;
R se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo constituido por:
(i) D-biotina;
(ii) galactosil-\beta1-4-tioglucósido de \beta-3'-propionilo;
(iii) N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv) N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de \alpha-3'-propionilo; y
(ix) tiomanósido-6-fosfato de \alpha-3'-propionilo.
10. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 9, en el que al menos uno de los grupos R_{3} tiene la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'} -N(R^{5})R, en la que j' es 1 a 6.
11. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 10, en el que dos de los grupos R_{3} tienen la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'} -N(R^{5})R.
12. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R_{3} tiene la fórmula -B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3}, en la que B está ausente, R, R^{1} y R^{2} son cada uno hidrógeno donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6 y j es un entero de 8 a 18 inclusive.
13. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona de entre el grupo constituido por:
N^{4}-octilespermidina;
N^{4}-dodecilespermidina;
N^{4}-octadecilespermidina;
N^{4}-octilespermina;
N^{4}-dodecilespermina; y
N^{4}-octadecilespermina.
14. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona de entre el grupo constituido por:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina; y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
15. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona de entre el grupo constituido por:
trihidrocloruro de N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-espermidina;
péptido de N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina HA2;
trihidrocloruro de N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''a,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de N^{4}-(5-N-(\alpha-3'-propionamido tiomanósido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(octil)espermina;
tetrahidrocloruro de 1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta carbamoil)pentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(N,N-dimetil 12'-dodecanamida)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(bencil 12'-dodecanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4},N^{9}-bis(12'-ácido dodecanoico)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(bencil 12'-dodenanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(12'-ácido dodecanoico)-espermina;
tetraacetato de N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil tiomanósido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de N^{4}-(5-N-(23'-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecatileno glicol)pentil)-espermina; y
tetraacetato de N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricasanamido)aminopentil)-espermina.
16. Complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende diferentes componentes de poliamina catiónica.
17. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 16, que comprende un primer componente de poliamina catiónica que tiene un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma ligado a éste y un segundo componente de poliamina catiónica que tiene un componente con enlace específico del receptor ligado a éste.
18. Complejo molecular multifuncional según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha composición de ácido nucleico consiste en una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido o proteína o sirve de plantilla para una molécula de ácido nucleico.
19. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 18, en el que dicha composición de ácido nucleico es un plásmido.
20. Composición farmacéutica que comprende un complejo molecular multifuncional según cualquier reivindicación anterior, o una sal o un éster farmacéuticamente aceptables de la misma y un portador farmacéuticamente aceptable.
21. Utilización de un complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de una composición farmacéutica para la transferencia de la composición de ácido nucleico desde el complejo a las células diana de un individuo.
22. Utilización de un complejo molecular multifuncional según se define en la reivindicación 1, para la preparación de un sistema de administración auto-acoplado para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células diana de un individuo.
23. Grupo de transferencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho grupo de transferencia comprende más de un componente de poliamina catiónica.
24. Grupo de transferencia según la reivindicación 23, en el que un primer componente de poliamina catiónica comprende un componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma y un segundo componente de poliamina catiónica comprende un componente con enlace específico del receptor.
25. Complejo molecular multifuncional útil para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células, en el que dicho complejo molecular multifuncional comprende:
A) una composición de ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha poliamina catiónica no esta unida por enlace covalente a dicha composición de ácido nucleico.
26. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 23, en el que dicha composición de ácido nucleico consiste en una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido o proteína o sirve de plantilla para una molécula de ácido nucleico.
27. Complejo molecular multifuncional según la reivindicación 26, en el que dicha composición de ácido nucleico es un plásmido.
28. Complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, que comprende una poliamina catiónica unida a un componente del enlace específico del receptor que comprende un compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de:
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina; y
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil galactosil-\beta-4-tioglucósido)lisina.
29. Composición farmacéutica que comprende un complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, o una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente aceptable.
30. Utilización de un complejo molecular multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, para la preparación de una composición farmacéutica para la transferencia de la composición de ácido nucleico desde el complejo a un individuo.
31. Utilización de un grupo de transferencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la preparación de un sistema de administración auto-acoplado para la transferencia de una composición de ácido nucleico a una célula diana.
ES95935213T 1994-09-28 1995-09-28 Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia genica a las celulas. Expired - Lifetime ES2231791T3 (es)

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