ES2231791T3 - Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia genica a las celulas. - Google Patents
Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia genica a las celulas.Info
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Abstract
SE DISPONE UN COMPLEJO MOLECULAR MULTIFUNCIONAL PARA EL TRASPASO DE UNA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO A UNA CELULA DIANA. EL COMPLEJO ESTA COMPUESTO DE A) DICHA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO Y B) UNA ESTRUCTURA DE TRASPASO QUE COMPRENDE 1) UNA O MAS POLIAMINAS CATIONICAS ENLAZADAS A DICHA COMPOSICION DE ACIDO NUCLEICO, 2) UNO O MAS COMPONENTES DE INTERRUPCION DE MEMBRANA ENDOSOMA INCORPORADOS A AL MENOS UN NITROGENO DE LA POLIAMINA Y 3) UNO O MAS COMPONENTES DE UNION ESPECIFICOS DEL RECEPTOR.
Description
Complejos moleculares multifuncionales para la
transferencia génica a las células.
La presente invención se refiere a los
procedimientos para la transferencia de información genética, p.
ej., ADN extraño en células diana, especialmente células
eucarióticas. En particular, la presente invención se refiere a
vehículos génicos no víricos que comprenden conjugados moleculares
multifuncionales que incluyen, entre otros, lipopoliaminas de una
determinada configuración, un componente que activa la destrucción
del endosoma, y, opcionalmente, un componente de unión específico
del receptor. La presente solicitud se refiere al documento U.S.
número de serie 08/314.060 presentado el 28 de septiembre de 1994 y
titulado "Complejos moleculares multifuncionales para la
transferencia génica a las células" que se incorpora a la
presencia memoria como referencia.
En el pasado se han utilizado con éxito vectores
víricos de varios tipos para inserción de la información genética
extraña seleccionada en una célula diana, y en el caso de las
células eucarióticas, para la incorporación de esta información
genética en el genoma de la célula. Estos sistemas de vector vírico
se han basado en el sistema molecular del virus, han evolucionado a
lo largo del tiempo para superar los problemas significativos frente
a un virus que intenta invadir, es decir, infectar una célula. A
pesar de la eficacia de dichos vectores víricos, sin embargo, se ha
mantenido el interés con respecto a la seguridad de utilizar virus,
particularmente desde el punto de vista de los efectos secundarios
no deseados. De este modo, ha existido un esfuerzo continuo para
desarrollar sistemas de administración génica no víricos que sean
tan eficaces como los vectores víricos, pero con un perfil de
seguridad mejorado.
Los vectores o vehículos no víricos, del tipo al
que se refiere la presente invención, tendrán que superar de este
modo los mismos obstáculos que un vector vírico. Los problemas a los
que se enfrentan dichos vehículos incluyen la persistencia en la
biofase del organismo durante un tiempo suficiente para alcanzar a
la célula diana; el reconocimiento de la célula diana y los medios
para intervenir en el transporte del material genético a través de
la membrana celular y en el citoplasma de la célula; el impedimento
de la degradación dentro de la célula por el sistema
reticuloendotelial; y el transporte hasta y a través de la membrana
nuclear en el núcleo de la célula donde puede tener lugar la
transcripción del material genético.
La presente invención se refiere a la superación
de los problemas descritos anteriormente; y ya que los problemas son
varios y diferentes, la presente invención comprende un complejo
multifuncional, es decir, un conjugado molecular de varios ligandos
destinado a superar obstáculos específicos.
La utilidad última de las técnicas de
transferencia génica es de enorme utilidad potencial en numerosas
áreas. La transferencia del material genético en las células es la
base de numerosos procedimientos ampliamente aceptados actualmente
en las áreas de la biología molecular, la terapia génica y la
inmunización genética. La transferencia de la información genética
codificada en el ADN a las células en las que expresa proteínas
individuales identificadas, ha permitido la investigación de la
función de dichas proteínas en un nivel celular y de la fisiología
de la célula subyacente. El material genético ha sido también
transferido a las células para introducir proteínas que están
ausentes debido a una imperfección genética inherente en la célula
que expresa una proteína inactiva o si no impide la expresión de la
proteína en conjunto. La transferencia de material genético en las
células se puede utilizar para impedir la expresión de las proteínas
en aquellas células mediante el efecto de cadena complementaria bien
conocido de las cadenas, complementaria de ADN o de ARN.
El material genético exógeno, es decir, extraño
puede permitir a las células sintetizar cantidades importantes de
proteínas que no están disponibles por otros medios desde el punto
de vista económico práctico. Estas proteínas en cuestión se pueden
desarrollar en varias células huésped tales como levaduras,
bacterias o células de mamífero. Se puede utilizar también material
genético para proporcionar respuestas inmunitarias protectoras in
vivo por inyección de ADN que codifica proteínas inmunógenas, es
decir, las que pueden estimular la respuesta inmunitaria deseada. La
introducción in vivo del material genético exógeno en las
células tiene también utilidad potencial en aplicaciones para el
alivio, el tratamiento o la prevención de trastornos metabólicos,
tumorales o infecciosos por los mismos mecanismos enumerados
anteriormente.
Es posible transferir material genético a las
células diana sin la utilización de vectores o vehículos. Por
ejemplo, se puede introducir material genético de forma generalizada
mediante una inyección intravenosa o intraperitoneal para
aplicaciones in vivo, o se puede introducir en la zona de
acción por inyección directa en esta área. Por ejemplo, se ha
reconocido hace tiempo que el ADN, por si mismo, inyectado en varios
tejidos, se introducirá en las células y producirá una proteína que
provocará una respuesta inmunitaria. Véase, p. ej., P. Atanasiu
et al., Academie des Sciences (Paris) 254,
4228-30 (1962); M.A. Israel et al., J.
Virol. 29, 990-96 (1979); H. Will et al.,
Nature, 299, 740-42 (1982); H. Robinson,
solicitud de patente mundial WO 86/00930, publicada el 13 de febrero
de 1986; P.L. Felgner, J.A. Wolff, G.H. Rhodes, R.W. Malone y D.A.
Carson, solicitud de patente mundial WO 90/11092, publicada el 4 de
octubre de 1990; y R.J. Debs y N. Zhu, solicitud de patente mundial
WO 93/24640 publicada el 9 de diciembre de 1993. Sin embargo, el ADN
por si mismo es hidrófilo y el carácter hidrófobo de la membrana
celular coloca una barrera significativa a la transferencia del ADN
a través de ella. Por consiguiente, se ha llegado a preferir en la
técnica utilizar facilitadores que aumenten la transferencia de ADN
en las células en inyección directa.
Otro enfoque en la técnica para la administración
de material genético a las células diana es el que se aprovecha de
las vías de endocitosis mediadas por el receptor natural que existe
en dichas células. Se han identificado diversos receptores célulares
en lo sucesivo como agentes deseables por medio de los cuales es
posible conseguir el direccionamiento específico de los fármacos y
especialmente de las macromoléculas y de los conjugados moleculares
que sirven como vehículo de material genético del tipo al que se
refiere la presente invención. Estos receptores celulares permiten
el direccionamiento específico en virtud de estar localizados en un
determinado tejido o que tienen una avidez aumentada o una actividad
en un determinado tejido. Véase, por ejemplo, J.L. Bodmer y R.T.
Dean, Meth. Enzymol., 112, 298-306 (1985).
Esto proporciona las ventajas de dosis menores o efectos secundarios
indeseables significativamente menores.
Uno de los ejemplos mejor conocidos de una célula
y de un receptor selectivo de tejido es el receptor de
asialoglucoproteína presente en los hepatocitos. El receptor
asialoglucoproteína es un receptor extracelular con gran afinidad
para la galactosa, especialmente para los oligosacáridos de tres
antenas, es decir, aquellos con tres cadenas algo extendidas o
brazos más espaciados con restos de galactosa terminal; véase, p.
ej., H.F. Lodish, TIBS, 16, 374-77 (1991).
Este receptor de gran afinidad está localizado en los hepatocitos y
no está presente en las células de Kupffer; permitiendo un alto
grado de selectividad en la administración al hígado.
Se ha propuesto también en la técnica de la
transferencia génica mediada por el receptor que para que el
procedimiento sea eficaz in vivo, el conjunto del complejo de
ADN debería producir condensación del ADN en una dimensión adecuada
para la absorción por vía endocítica. Véase, p. ej., J.C. Perales,
T. Ferkol, H. Beegen, O.D. Ratnoff y R.W. Hanson, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 91, 4086-4090 (1994).
Un método alternativo para proporcionar la unión
selectiva de las células es atacar una entidad con capacidad para
unirse al tipo de célula en cuestión; se utilizan frecuentemente a
este respecto los anticuerpos que se pueden unir a las proteínas
específicas presentes en las membranas celulares o en las regiones
externas de las células diana. Han sido reconocidos también como
útiles receptores alternativos para facilitar el transporte de las
macromoléculas, tales como los receptores de biotina y de folato;
véase P.S. Low, M.A. Horn y P.F. Heinstein, solicitud de patente
mundial WO 90/12095, publicada el 18 de octubre de 1990; P.S. Low,
M.A. Horn y P.F. Heinstein, solicitud de patente mundial WO
90/12096, publicada el 18 de octubre de 1990; P.S. Low, M.A. Horn y
P.F. Heinstein, patente U.S. nº 5.108.921, 28 de abril, 1992; C.P.
Leamon y P.S. Low, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88,
5572-5576 (1991); receptores de transferrina;
receptores de insulina; y receptores de manosa (véase más adelante).
Los receptores enumerados son meramente representativos y otros
ejemplos se le ocurrirán fácilmente al especialista.
La conjugación de diferentes grupos funcionales
en la misma molécula también se ha utilizado en la técnica. Por
ejemplo, en 1988 G.Y. Wu y C.H. Wu, J. Biol. Chem., 263,
14621-14624 (1988) describió un procedimiento para
la administración mediada por el receptor celular del ADN a
hepatocitos. Este procedimiento fue descrito además en G.Y. Wu y
C.H. Wu, Biochem., 27, 887-892 (1988); G.Y.
Wu y C.H. Wu, patente U.S. nº 5.166.320, 24 de noviembre, 1992; y
G.Y. Wu y C.H. Wu, solicitud de patente mundial WO 92/06180,
publicada el 16 de abril de 1992. El procedimiento consiste en
conectar una glucoproteína, asialoorosomucoide, a una
poli-lisina para proporcionar un vehículo de ADN
selectivo al hepatocito. La función de la
poli-lisina es unirse al ADN mediante interacciones
iónicas entre los grupos amino cargados positivamente (catiónicos)
de las lisinas y los grupos fosfato cargados negativamente
(aniónicos) del ADN. El orosomucoide es una glucoproteína que
normalmente está presente en el suero humano. La eliminación del
ácido siálico terminal (ácido N-acetil neuramínico)
de los oligosacáridos ramificados expone los oligosacáridos de
galactosa terminal, para los cuales los receptores de hepatocito
tienen una gran afinidad, como se describió ya.
Después de la unión del receptor de
asialoglucoproteína en los hepatocitos, la proteína es introducida
en la célula por endocitosis en un endosoma
pre-lisosómico. El ADN, unido iónicamente al
vehículo poli-lisina asialoorosomucoide, es también
introducido en el endosoma. Otro trabajo utilizando este sistema de
administración, p. ej., el realizado por J.M. Wilson, M. Grossman,
J.A. Cabrera, C.H. Wu y G.Y. Wu, J. Biol. Chem, 267,
11483-11489 (1992), ha descubierto que la
hepatectomía parcial mejora la persistencia de la expresión del ADN
administrado a los hepatocitos. La transferencia del ADN a las
células por este mecanismo aumenta también de manera significativa
mediante la adición de lípidos catiónicos. Véase, p. ej., K.D. Mack,
R. Walzem y J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307,
138-143 (1994).
La utilización de una asialoglucoproteína
específica no se necesita para conseguir unirse del receptor de
asialoglucoproteína; esta unión se puede también realizar con gran
afinidad mediante la utilización de pequeñas moléculas sintéticas
que tienen una configuración similar. La parte de carbohidrato se
puede eliminar a partir de una glucoproteína apropiada y conjugarse
con otras macromoléculas; véase, p. ej., S.J. Wood y R. Wetzel,
Bioconj. Chem., 3, 391-396 (1992). Mediante
este procedimiento la parte de la glucoproteína de la unión del
receptor celular se elimina y la parte específica requerida para la
unión celular selectiva se puede transferir a otra molécula.
Existe amplia bibliografía para la preparación de
glucósidos sintéticos que se pueden unir a macromoléculas y
comunicarlas la capacidad para unirse al correspondiente receptor
específico de galactosa. La importancia de los glucósidos
ramificados fue reconocida al principio; véase Y.C. Lee, Carb.
Res., 67, 509-514 (1978). El trabajo posterior
indicó que la densidad del azúcar [K. Kawaguchi, M. Kuhlenschmidt,
S. Roseman y Y.C. Lee, J. Biol. Chem., 256,
2230-2234 (1981)] y las relaciones espaciales [Y.C.
Lee, R.R. Townsend, M.R. Hardy, J. Lonngren, J. Arnarp, M.
Haraldsson y H. Lonn, J. Biol. Chem., 258,
199-202 (1983)] son importantes determinantes de la
potencia de unión. La aminación reductora de un péptido con un
terminal amino de tri-lisina ramificado da un
ligando que finaliza con cuatro restos galactosilo que se pueden
acoplar fácilmente a la poli-lisina o a otras
macromoléculas; véase C. Plank, K. Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler
y E. Wagner, Bioconj. Chem., 3, 533-539
(1992); y se ha utilizado para preparar construcciones de ADN.
Se han preparado derivados glucosídicos de
tiopropionato y tiohexanoato de galactosa y unido a
L-lisil-L-lisina
para formar un derivado sintético de galactosa con tres antenas. Un
derivado de bisacridina espermidina que contiene esta galactosa con
tres antenas sintéticas se ha utilizado para dirigir el ADN a los
hepatocitos; véase F.C. Szoka, Jr. y J. Haensler, solicitud de
patente mundial WO 93/19768, publicada el 14 de octubre de 1993; y
J. Haensler y F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4,
85-93 (1993).
Otros medios para proporcionar el receptor
celular basados en la facilitación de la transferencia génica a las
células utilizando poli-lisina como vehículo han
sido descritos en la técnica. Se han utilizado anticuerpos
específicos para la trombomodulina de la superficie celular con
poli-lisina como un sistema de administración para
ADN in vitro e in vivo; véase V.S. Trubetskoy, V.P.
Torchilin, S.J. Kennel y L. Huang, Bioconj. Chem., 3;
323-327 (1992). Se ha utilizado también el receptor
de transferrina para dirigir el ADN a los eritroblastos, a los
macrófagos K562 y a las células leucémicas ML-60;
véase E. Wagner, M. Zenke, M. Cotten, H. Beug y M.L. Birnstiel,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414
(1990); M. Zenke, P. Steinlein, E. Wagner, M. Cotten, H. Beug y M.L.
Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87,
3655-3659 (1990); y G. Citro, D. Perrotti, C. Cucco,
I. D'Agnano, A. Sacchi, G. Zupi y B. Calabretta, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 89, 7031-7035 (1990). Estos estudios
utilizaron tanto oligodesoxinucleótidos pequeños como plásmidos
grandes.
La capacidad de la poli-lisina
para facilitar la introducción del ADN en las células aumenta de
forma significativa si la poli-lisina se modifica
químicamente con terminales hidrófobos; véase X. Zhou y L. Huang,
Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203 (1994);
acomplejados con lípidos catiónicos; véase K.D. Mack, R. Walzem y
J.B. Zeldis, Am. J. Med. Sci., 307, 138-143
(1994) o asociados con virus. Muchos virus infectan células
específicas por la unión mediada por el receptor y la inserción del
ADN/ARN vírico en la célula; y de este modo esta acción del virus es
similar a la introducción facilitada del ADN descrito
anteriormente.
Se ha utilizado adenovirus incompetente para la
replicación para aumentar la introducción de ADN acomplejado por
transferrina-poli-lisina en las
células; véase D.T. Curiel, S. Agarwal, E. Wagner y M. Cotten,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854
(1991); E. Wagner, K. Zatloukal, M. Cotten, H. Kirlappos, K.
Mechtler, D.T. Curiel y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 89, 6099-6103 (1992); M. Cotten, E. Wagner,
K. Zatloukal, S. Phillips, D.T. Curiel y M.L. Birnstiel, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 89, 6094-6098 (1992); y L.
Gao, E. Wagner, M. Cotten, S. Agarwal, C. Harris, M. Romer, L.
Miller, P. -C. Hu y D. Curiel, Hum. Gene Ther.,
4, 17-24 (1993). El adenovirus aumenta la entrada
del complejo de
poli-lisina-transferrina-ADN
cuando está unida por enlace covalente a la
poli-lisina y cuando está conectada mediante un
punto de unión al anticuerpo. No necesita ser una unión directa del
adenovirus al complejo
poli-lisina-transferrina-ADN
y puede facilitar la entrada del complejo cuando está presente como
una simple mezcla. El complejo
poli-lisina-transferrina-ADN
proporciona la unión específica del receptor a las células y está
interiorizada en los endosomas junto con el ADN. Una vez dentro de
los endosomas, el adenovirus facilita la entrada del complejo
ADN/transferrina-poli-lisina en la
célula por destrucción del compartimento endosómico con la
liberación posterior del ADN en el citoplasma. Se ha utilizado
también adenovirus incompetente para la replicación para aumentar la
entrada de plásmidos de ADN no acomplejados en las células sin la
ventaja de la selectividad del receptor de la célula comunicada por
el complejo
poli-lisina-transferrina; véase K.
Yoshimura, M.A. Rosenfeld, P. Seth y R.G. Cristal, J. Biol.
Chem., 268, 2300-2303 (1993).
Los péptidos sintéticos tal como la zona
N-terminal de la proteína hemaglutinina de la gripe
son conocidos por desestabilizar las membranas y son conocidos como
péptidos fusógenos. Los conjugados que contienen el péptido fusógeno
de la gripe acoplado a la poli-lisina junto con un
péptido que tiene un ligando con terminal amino de
tri-lisina ramificado que acaba con cuatro restos
galactosilo han sido preparados como facilitadores de la
introducción del ADN en los hepatocitos; véase C. Plank, K.
Zatlouhal, M. Cotten, K. Mechtler y E. Wagner, Bioconj.
Chem., 3, 533-539 (1992). Estos conjugados
combinan la unión mediada por el receptor de asialoglucoproteína
comunicada por el péptido tetra-galactosa, las
capacidades de destrucción endosómica del péptido fusógeno de la
gripe y la unión al ADN de la poli-lisina. Estos
conjugados suministran ADN a la célula por una combinación de
absorción mediada por el receptor e interiorización en los
endosomas. Esta interiorización es seguida por la destrucción de los
endosomas por el péptido fusógeno de la gripe para liberar el ADN en
el citoplasma. De un modo similar, el péptido fusógeno de la gripe
se puede unir a poli-lisina y mezclar con el
complejo transferrina-poli-lisina
para proporcionar un vehículo de ADN similar selectivo para las
células que llevan el receptor de transferrina; véase E. Wagner, C.
Plank, K. Zatloukal, M. Cotten y M.L. Birnstiel, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 89, 7934-7938 (1992). Se pueden
también utilizar péptidos denominados sintéticamente; por ejemplo
los péptido "GALA" [N.K. Subbarao, R.A. Parente, F.C. Szoka,
Jr, L. Nadasdi y K. Pongracz, J. Biol. Chem., 26,
2964-2972 (1987)] se han acoplado a los vehículos de
ADN y se observó un aumento de entrada facilitada en las células [J.
Haensler y F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4,
372-379 (1993)]. El péptido amfipático catiónico
gramicina S puede facilitar la introducción del ADN a las células
[J.Y. Legendre y F.C. Szoka, Jr., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
90, 893-897 (1993)], pero también requiere un
fosfolípido para conseguir una transferencia significativa de
ADN.
La poli-lisina no es la única en
proporcionar un marco policatiónico para la introducción del ADN a
las células. El DEAE-dextrano ha demostrado también
ser eficaz para favorecer la entrada de ARN y ADN en las células;
véase R. Juliano y E. Mayhew, Exp. Cell. Res. 73,
3-12 (1972); y E. Mayhew y R. Juliano, Exp. Cell.
Res. 77, 409-414 (1973). Más recientemente, un
copolímero en cascada dendrítico de etilendiamina y acrilato de
metilo ha demostrado ser útil para proporcionar un vehículo de ADN
que facilita la introducción en las células; véase J. Haensler y
F.C. Szoka, Jr., Bioconj. Chem., 4, 372-379
(1993). Un polímero de polivinilpiridina alquilado se ha utilizado
también para facilitar la introducción del ADN en las células; véase
A.V. Kabanov, I.V. Astafieva, I.V. Maksimova, E.M. Lukanidin, G.P.
Georgiev y V.A. Kabanov, Bioconj. Chem., 4,
448-454 (1993).
Se han utilizado también ampliamente liposomas
cargados positivamente como vehículos de ADN que facilitan la
introducción en las células; véase, p. ej., F.C. Szoka, Jr. y J.
Haensler, solicitud de patente mundial WO 93/19768, publicada el 14
de octubre de 1993; R.J. Debs y N. Zhu, solicitud de patente mundial
WO 93/24640, publicada el 9 de diciembre de 1993; P. L. Felgner, R.
Kumar, C. Basava, R.C. Border y J.-Y.
Hwang-Felgner, solicitud de patente mundial WO
91/16024, publicada el 31 de octubre de 1991; P.L. Felgner y G.M.
Ringold, Nature, 337, 387-388 (1989); J.K.
Rose, L. Buonocore y M.A. Whitt, BioTechniques, 10,
520-525 (1991); C.F. Bennett, M.Y. Chiang, H. Chan,
J.E.E. Schoemaker y C.K. Mirabelli, Mol. Pharm. 41,
1023-1033 (1992); J.H. Felgner, R. Kumar, C.N.
Sridhar, C.J. Wheeler, Y.J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin y
P.L. Felgner, J. Biol. Chem., 269, 2550-2561
(1994); J.G. Smith, R.L. Walzem y J.B. German, Biochim. Biophys.
Acta, 1154, 327-340 (1993). Estas composiciones
del vehículo han incluido también liposomas sensibles al pH; véase
C.-J. Chu, J. Dijkstra, M.-Z. Lai, K. Hong y F.C. Szoka, Jr.,
Pharm. Res., 7, 824-854 (1990); J.-Y.
Legendre y F.C. Szoka, Jr., Pharm. Res., 9,
1253-1242 (1992).
Se ha preparado un lípido
poli-catiónico acoplando dioctadecilamidoglicina y
dipalmitoil fosfatidiletanolamina a una
5-carboxiespermina; véase P. Behr, B. Demeinex,
J.-P. Loeffler y J. Perez-Mutul, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 86, 6982-6986 (1989); F. Barthel,
J.-S. Remy, J.-P. Loeffler y J.P. Behr, DNA and Cell Biol.,
12, 553-560 (1993); J.-P. Loeffler y J.-P. Behr,
Meth. Enzymol., 217, 599-618 (1993); J.-P.
Behr y J.-P. Loeffler, patente U.S. nº 5.171.678, 15 de diciembre,
1992. Estas esperminas lipófilas son muy activas para transferir el
ADN a través de las membranas celulares.
Se han utilizado combinaciones de lípidos para
facilitar la transferencia de los ácidos nucleicos dentro de las
células. Por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.283.185 se ha expuesto
dicho procedimiento que utiliza una dispersión de lípido mezclado de
un lípido catiónico con un co-lípido en un
disolvente adecuado. El lípido tiene una estructura que incluye un
grupo lipófilo procedente de colesterol, un enlace conectador, un
brazo intercalador de alquilo lineal y un grupo amino catiónico; y
el co-lípido es fosfatidilcolina o
fosfatidiletanolamina.
Los macrófagos tienen receptores tanto para la
manosa como para manosa-6-fosfato
que se puede unir a moléculas e interiorizarlas desplegando estos
azúcares. Las moléculas se interiorizan por endocitosis dentro de un
endosoma pre-lisosómico. Este interiorización se ha
utilizado para la introducción de oligonucleótidos en macrófagos
utilizando albúmina de suero bovino modificada con
manosa-6-fosfato y unida a un
oligodesoxinucleótido mediante un puente disulfuro a un extremo 3'
modificado; véase E. Bonfils, C. Depierreux, P. Midoux, N.T. Thuong,
M. Monsigny y A.C. Roche, Nucl. Acids Res. 20,
4621-4629 (1992). Asimismo, los
oligodesoxinucleótidos modificados en el terminal 3' con biotina se
combinaron con estreptavidina modificada con manosa y se observó
también que han facilitado la introducción en los macrófagos; véase
E. Bonfils, C. Mendes, A.C. Roche, M. Monsigny y P. Midoux,
Bioconj. Chem., 3, 277-284 (1992).
Se ha demostrado que varios péptidos y proteínas,
muchos de los cuales son naturales, tienen receptores en las
superficies celulares, que una vez están unidos a ellas, les
permiten llegar a ser interiorizados por endocitosis. Los materiales
unidos a estos receptores se administran a los compartimentos
endosómicos dentro de la célula. Los ejemplos incluyen la insulina,
vasopresina, lipoproteína de baja densidad, factor de crecimiento
epidérmico y otros. Esta interiorización se ha utilizado también
para facilitar la introducción del ADN en las células; p. ej., se ha
conjugado la insulina a la polilisina para proporcionar la entrada
del ADN facilitada en las células que poseen un receptor de
insulina; véase B. Huckett, M. Ariatti y A.O. Hawtrey, Biochem.
Pharmacol., 40, 253-263 (1990).
La presente invención se refiere a un complejo
molecular multifuncional para la transferencia de una compuesto de
ácido nucleico a una célula diana que comprende en cualquier
combinación funcional: A) dicho ácido nucleico; B) un vehículo de
administración, denominado en esta memoria "grupo de
transferencia", que comprende a) uno o más componentes de
poliamina catiónica unidos a dicho ácido nucleico, comprendiendo
cada uno de tres a doce átomos de nitrógeno; b) uno o más
componentes que favorecen la destrucción de la membrana del endosoma
unidos a un átomo de nitrógeno del componente de poliamina
catiónica, mediante un grupo alquilo, carboxamida, carbamato,
tiocarbamato o carbamoilo en puente, que comprende i) al menos un
grupo alquilo de cadena larga lipófilo, ii) un péptido fusógeno que
comprende glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados,
o iii) ácido cólico, colesterilo o derivados de los mismos; y
opcionalmente C) uno o más componentes del enlace específico del
receptor que son ligandos para receptores naturales de dicha célula
diana, unidos mediante un grupo puente de alquilo, carboxamida,
carbamato, tiocarbamato o carbamoilo a ya sea a) otro átomo de
nitrógeno de un componente de poliamina catiónico al que se une un
componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma,
o b) un átomo de nitrógeno de un componente de poliamina catiónico
al que no se ha unido un componente que favorece la destrucción de
la membrana del endosoma.
Según el primer aspecto de la presente invención
se proporciona un complejo molecular multifuncional para transferir
una composición de ácido nucleico a una célula diana, complejo
molecular multifuncional que comprende:
A) el ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia que comprende uno o
más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido nucleico y
que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la
que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente
de entre los enteros 2 a 5 inclusive;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10
inclusive; y
cada R^{3} se selecciona independientemente de
entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo
C_{1-6} y un componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende
al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana
del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de
poliamina catiónico; y
en la que cada componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por:
(a)-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3};
en la que R, R^{1}y R^{2} se
seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo
constituido por hidrógeno y alquilo
C_{1-6};
j es un entero de 6 a 24 inclusive; y
B está ausente opcionalmente, o es un grupo de
unión de fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en la que k es, independientemente,
un entero de 1 a 6
inclusive;
l es un entero de 0 a 30 inclusive;
p es un entero de 1 a 3 inclusive;
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6}; y
Z es O, S, N(R), o está ausente;
y
(b)-B-(R^{4})R;
en la que R se selecciona cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6} o está
ausente;
B es un grupo puente seleccionado
independientemente de entre los grupos (i) a (iv) como se definió
anteriormente (a) en esta reivindicación, y además un grupo de
fórmula:
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-
en la que j' es un entero de 1 a 8
inclusive;
R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre
el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden
glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula
(2);
en la
que:
- - -
representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición
de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el
sistema de anillo es \Delta4 o
\Delta5.
\Delta5.
R^{6} es -H, -OH,
-CO_{2}H, -C(=O)NH_{2},
-OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o
-O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n'
es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión
del derivado de ácido cólico, que comprende un grupo alquilo
C_{1-6} o un grupo alquilcarbonilo
C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo
C_{1-6}; y
(iii) colesteril-derivados de
fórmula (3):
en la
que:
- - -
representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición
de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el
sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de
unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo
alquilo-C_{1-6},
-OC(=O)- o -OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo
C_{1-6}; y
R^{8a} es un grupo alquilo
C_{1-6}.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la
fórmula
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que B está ausente.
Preferentemente, j es 8 a 18.
Más preferentemente, j es 8 a 12.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la
fórmula
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R,
en la que X es N(R) y R^{4} se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos
fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus
encapsulado de animales, y (ii) ácido cólico y derivados del mismo
seleccionados de entre el grupo constituido por éster y amida del
ácido 3\alpha, 7\alpha,
12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
Preferentemente, j' es 2 a 4.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la
fórmula
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R,
en la que X es O o S y R^{4} se selecciona independientemente de
entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden
glucoproteínas en punta de virus encapsulados de animal, y (ii) un
grupo colesterilo y derivados del mismo seleccionados de entre el
grupo constituido por
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
\beta-carbamato
y-\beta-metilencarboxamida.
En dichas formas de realización, R, R^{1} y
R^{2} pueden ser cada uno hidrógeno, donde quiera que se
encuentren, m puede ser 3 ó 4, n puede ser 1 a 6, j' puede ser un
entero de 2 a 4 inclusive, y R^{4} puede ser
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
-\beta-carbamato o
-\beta-metilen-carboxamida.
El grupo del que R^{3}se puede seleccionar
comprende además grupos que tienen la fórmula
-B-(R^{5})R, y al menos uno de los grupos R^{3} tiene la
fórmula -B-(R^{5})R;
en la que B es un grupo de enlace seleccionado
independientemente de entre los grupos (i) a (v) inclusive tal como
se define en la reivindicación 1;
R se selecciona independientemente de entre el
grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}
o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico
del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo
constituido por:
(i) D-biotina;
(ii)
galactosil-\beta1-4-tioglucósido
de \beta-3'-propionilo;
(iii)
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv)
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de
\alpha-3'-propionilo; y
(ix)
tiomanósido-6-fosfato de
\alpha-3'-propionilo.
Al menos uno de los grupos R^{3} puede tener la
fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}
-N(R^{5})R, en la que j' es 1 a 6.
Dos de los grupos R^{3} pueden tener la fórmula
-(CR^{1}R^{2})_{j'}
-N(R^{5})R.
Al menos uno de los grupos R^{3} de la misma
puede tener la fórmula
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que B está ausente, R, R^{1} y R^{2} son cada uno
hidrógeno donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6 y j
es un entero de 8 a 18 inclusive.
El grupo de transferencia se puede seleccionar de
entre el grupo constituido por:
N^{4}-octilespermidina;
N^{4}-dodecilespermidina;
N^{4}-octadecilespermidina;
N^{4}-octilespermina;
N^{4}-dodecilespermina; y
N^{4}-octadecilespermina.
El grupo transferencia se puede seleccionar de
entre el grupo constituido por:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
Preferentemente, el grupo de transferencia se
puede seleccionar de entre el grupo constituido por:
trihidrocloruro de N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-espermidina;
péptido de
N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina
HA2;
trihidrocloruro de
N^{4}-(5'-N-(3''\alpha, 7''a,
12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de
N^{4}-(5-N-(\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(octil)espermina;
tetrahidrocloruro de
1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano;
tetrahidrocloruro de
N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta
carbamoil)pentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanamida)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(bencil
12'-dodecanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(12'-ácido
dodecanoico)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(bencil
12'-dodenanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(12'-ácido
dodecanoico)-espermina;
tetraacetato de
N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil
tiomanósido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(\alpha-3''-propionamido
tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido
tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecatileno
glicol)pentil)-espermina; y
tetraacetato de
N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricasanamido)aminopentil)-espermina.
El complejo molecular multifuncional puede
comprender además diferentes componentes de poliamina catiónica.
El complejo molecular multifuncional puede
comprender además un primer componente de poliamina catiónica que
tiene un componente que favorece la destrucción de la membrana del
endosoma unido a éste y un segundo componente de poliamina catiónica
que tiene un componente con enlace específico del receptor unido a
éste.
La composición de ácido nucleico puede ser una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido
que codifica un péptido o proteína, o sirve como plantilla para una
molécula de ácido nucleico.
La composición de ácido nucleico puede ser un
plásmido.
Según el segundo aspecto de la presente invención
se proporciona una composición farmacéutica que comprende un
complejo molecular multifuncional como se describió anteriormente, o
una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Según el tercer aspecto de la presente invención
se proporciona una utilización de un complejo molecular
multifuncional como el descrito anteriormente para la preparación de
una composición farmacéutica para la transferencia de la composición
de ácido nucleico en el complejo a las células diana de un
individuo.
Según el cuarto aspecto de la presente invención
se proporciona una utilización de un complejo molecular
multifuncional como el definido anteriormente para la preparación de
un sistema de administración autoacoplable para la transferencia de
la composición de ácido nucleico a las células diana de un
individuo.
Se ha dado a conocer además un sistema de
administración autoacoplable para la transferencia de una
composición de ácido nucleico a la célula diana que comprende los
siguientes componentes independientes capaces de ser llevados
conjuntamente y de unirse químicamente en un complejo molecular por
simple mezclado: A) dicho ácido nucleico que ha de ser transferido;
y B) un grupo de transferencia definido anteriormente.
Se ha dado a conocer también un procedimiento
para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las
células diana en una base in vitro. El procedimiento
comprende la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con
un complejo molecular multifuncional que incluye dicha composición
de ácido nucleico, tal como se detalló más anteriormente,
transfiriendo de este modo a dichas células, una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido o una proteína deseados, o sirve como plantilla para las
moléculas de ácido nucleico funcional. La proteína o la molécula de
ácido nucleico funcional deseadas puede ser cualquier producto de
interés industrial, comercial o científico, p. ej., agentes
terapéuticos incluyendo vacunas; comestibles y complementos
nutritivos; compuestos de importancia agrícola tales como herbicidas
y reguladores del crecimiento vegetal, insecticidas, acaricidas,
rodenticidas y fungicidas; compuestos útiles en sanidad animal tales
como parasiticidas incluyendo nematocidas; y así sucesivamente. Las
células diana son normalmente cultivos de células huésped que
comprenden células de microorganismos tales como bacterias y
levaduras, pero pueden incluir además células vegetales y de
mamíferos. Los cultivos celulares se mantienen según las técnicas de
fermentación bien conocidas en la técnica, que maximizan la
producción de la proteína o de la molécula de ácido nucleico
funcional deseadas y los productos de la fermentación se recogen y
purifican por procedimientos conocidos.
Se ha dado a conocer también un procedimiento
para la transferencia de una composición de ácido nucleico a las
células diana en una base in vitro. El procedimiento
comprende la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con
un complejo molecular multifuncional que incluye dicha composición
de ácido nucleico, tal como se detalló además anteriormente,
administrando de este modo a dichas células, una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido o una proteína deseados, o sirve como plantilla para las
moléculas de ácido nucleico funcional. La molécula de ácido nucleico
se administra exenta de partículas retrovíricas. La proteína deseada
puede ser una proteína que funcione dentro del individuo o sirva
para iniciar una respuesta inmunitaria. La molécula de ácido
nucleico se puede administrar a las células de dicho individuo en
una base in vivo o ex vivo, es decir, el contacto con
las células del individuo puede tener lugar dentro del cuerpo del
individuo según los procedimientos que se emplean más típicamente, o
el contacto con las células del individuo puede tener lugar fuera
del cuerpo del individuo extrayendo las células que se desea para
tratarlas fuera del cuerpo del individuo por varios medios
adecuados, seguido de poner en contacto dichas células con dicha
molécula de ácido nucleico, seguido a su vez por la devolución de
dichas células al cuerpo de dicho individuo.
Se ha dado a conocer también un procedimiento de
inmunización de un individuo contra un patógeno. El procedimiento
comprende la etapa de poner en contacto las células de dicho
individuo con un complejo molecular multifuncional que incluye una
composición de ácido nucleico, tal como se detalló además
anteriormente, administrando de este modo a las células una molécula
de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico a, o
sustancialmente similar a un epítopo desplegado en dicho patógeno
como antígeno, y dicha secuencia de nucleótidos se conecta
operativamente a las secuencias reguladoras. La molécula de ácido
nucleico es capaz de expresarse en las células del individuo.
Se han dado a conocer también procedimientos de
inmunización de un individuo contra una enfermedad hiperproliferante
o una enfermedad autoinmunitaria. Los procedimientos comprenden la
etapa de poner en contacto las células de dicho individuo con un
complejo molecular multifuncional que incluye una composición de
ácido nucleico, tal como se detalló además anteriormente,
administrando de este modo a las células una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente
similar a un epítopo desplegado en una proteína relacionada con una
enfermedad hiperproliferante o una proteína relacionada con una
enfermedad autoinmunitaria, respectivamente, y está conectado
operativamente a las secuencias reguladoras. Siendo capaz la
molécula de ácido nucleico de expresarse en las células.
Se han dado a conocer también procedimientos para
el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad
autoinmunitaria que comprende las etapas de poner en contacto las
células de dicho individuo con un complejo molecular multifuncional
que incluye una composición de ácido nucleico, tal como la detallada
además anteriormente, administrando de este modo a las células de
dicho individuo, una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que restablece la actividad de un gen
ausente, defectuoso o inhibido, o que codifica una proteína que
produce un efecto terapéutico en el individuo y está funcionalmente
ligada a las secuencias reguladoras; siendo la molécula de ácido
nucleico capaz de expresarse en dichas células.
Se han descrito además kits farmacéuticos que
comprenden un recipiente que consta de una composición de ácido
nucleico y un recipiente que consta de un grupo de transferencia.
Opcionalmente, se ha incluido en dichos kits excipientes,
portadores, conservantes y vehículos tales como disolventes.
Según una forma de realización de la presente
invención se proporciona un complejo molecular multifuncional para
la transferencia de una composición de ácido nucleico a una célula
diana, que proporciona un alto nivel de transfección y la expresión
de las moléculas de ácido nucleico en la diana, es decir, la célula
huésped. Este complejo molecular multifuncional comprende
esencialmente la combinación de dos elementos clave, (I) el ácido
nucleico que se desea transferir a la célula diana, y (II) el grupo
de transferencia, que se acompleja con la molécula de ácido nucleico
y comprende varios componentes cuya función es i) localizar la
célula diana deseada dentro del cuerpo de un individuo por medio de
un componente de la unión específica del receptor sensible del
receptor específico en la superficie de la membrana de dicha célula
diana; ii) superar la incompatibilidad que surge de la naturaleza
hidrófila de la molécula de ácido nucleico y la naturaleza lipófila
de la membrana de modo que la primera pueda pasar a través de esta
última; y iii) impedir la degradación de la molécula de ácido
nucleico en un lisosoma de dicha célula diana, destruyendo el
pre-lisosoma, etapa de formación de endosomas, que
se lleva a cabo por medio de una membrana de endosoma que destruye
el componente que permite al complejo molecular multifuncional
librarse de un endosoma formado como resultado del proceso de
endocitosis o pinocitosis de la célula diana, de este modo el
complejo molecular multifuncional se introduce en la célula diana y
se incorpora en dicho endosoma.
Los componentes del grupo de transferencia son
los siguientes: A) un componente de poliamina catiónica unido a
dicha composición de ácido nucleico, que comprende de tres a doce
átomos de nitrógeno; B) la destrucción de la membrana del endosoma
que activa al componente que comprende al menos un grupo alquilo de
cadena larga lipófila unida al átomo de nitrógeno de dicha
poliamina, o un grupo que se extiende al alquilo más corto que tiene
un grupo carbonilo, amino, hidroxilo o sulfhidrilo terminal al que
se une un péptido fusógeno, o ácido cólico o colesterilo o un
derivado; y opcionalmente C) uno o más componentes del enlace
específico del receptor que son ligandos de los receptores naturales
de dicha célula diana, unidos a un grupo que se extiende al alquilo
más corto unido a un átomo de nitrógeno adicional de dicha
poliamina, a través de dicho grupo terminal de la misma.
El grupo de transferencia está representado por
uno o más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido
nucleico y que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la
que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente
de entre los enteros 2 a 5 inclusive; y preferentemente es 3 ó
4;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10
inclusive; y preferentemente es 1 a 6;
cada R^{3} se selecciona independientemente de
entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo
C_{1-6} y uno o más componentes que favorecen la
destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende
al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana
del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de
poliamina catiónica; y en la que cada componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por:
(a)
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que R, R^{1}y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6}; j es un entero de 6 a 24
inclusive; preferentemente de 8 a 18, más preferentemente de 8 a 12
inclusive; y B está opcionalmente ausente, o es un grupo puente de
la fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en las que k es,
independientemente, un entero de 1 a 6 inclusive, preferentemente de
3 a 5, l es un entero de 0 a 30 inclusive, preferentemente de 4 a 9,
y p es un entero de 1 a 3 inclusive, preferentemente 1; R, R^{1} y
R^{2} se seleccionan cada uno independientemente, de entre el
grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6};
y Z es O, S, N(R), o está ausente, es decir, un enlace
simple;
(b) -B-(R^{4})R, en la que R
se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por
hidrógeno y alquilo C_{1-6} o está ausente; B no
puede estar ausente y es un grupo puente seleccionado
independientemente de entre los grupos i) a iv) anteriores, y además
de entre el grupo de fórmula:
(v)
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en la que j' es
un entero de 1 a 8 inclusive, preferentemente de 2 a 6 inclusive, y
más preferentemente 5; R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre
el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden
glucoproteínas en punta de virus encapsulados de animales;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula
(2);
en la
que:
- - -
representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos
enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo
es \Delta4 o \Delta5;
R^{6} es -H, -OH,
-CO_{2}H, -C(=O)NH_{2},
-OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o
-O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n'
es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión
del derivado de ácido cólico, que comprende un grupo alquilo
C_{1-6} o un grupo alquilcarbonilo
C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo
C_{1-6}; especialmente CH_{3}; incluyendo los
derivados éster o amida 3\alpha, 7\alpha,
12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico
del ácido cólico preferidos; y
(iii) colesteril-derivados de
fórmula (3):
en la
que:
- - -
representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición
de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el
sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de
unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo
C_{1-6}, -OC(=O)- o
-OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo
alquilo-C_{1-6}; especialmente
(CH_{2})_{3}CH(CH_{3})_{2}; y
R^{8a} es un grupo alquilo
C_{1-6}, especialmente CH_{3}; incluyendo los
derivados de colesterilo,
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
-\beta-carbamato o
-\beta-metilencarboxamida.
Opcionalmente, R^{3} puede ser uno o más grupos
definidos a continuación, unidos a un átomo de nitrógeno adicional
de un componente de poliamina catiónica al que se une un componente
que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, o a un
átomo de nitrógeno de un componente de poliamina catiónica que no
tiene unido a éste un componente que favorece la destrucción de la
membrana del endosoma:
c) -B-(R^{5})R, en la que B
no puede estar ausente, y es un grupo de unión seleccionado
independientemente de los grupos i) a v) inclusive; R se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6} o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico
del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo
constituido por:
(i) D-biotina;
(ii)
galactosil-\beta1-4-tioglucósido
de \beta-3'-propionilo;
(iii)
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv)
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionilgalactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de
\alpha-3'-propionilo; y
(ix)
tiomanósido-6-fosfato de
\alpha-3'-propionilo.
Los dos componentes básicos del complejo
molecular multifuncional de la presente invención son la composición
de ácido nucleico y el grupo de transferencia. "Composición de
ácido nucleico" significa uno cualquiera o más grupos de
compuestos en los que una o más moléculas de ácido fosfórico se
combinan con el carbohidrato, es decir, las moléculas de pentosa o
hexosa, que a su vez se combinan con las bases derivadas de la
purina, p. ej., adenina, y de la pirimidina, p. ej., timina. Las
moléculas de ácido nucleico naturales en concreto incluyen el ácido
desoxirribonucleico (ADN) genómico y el ácido ribonucleico (ARN)
genómico, así como diversas formas diferentes de este último, p.
ej., ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN
ribosómico (ARNr). También se incluyen los diferentes ADN que son
complementarios (ADNc) de los diferentes ARN. Se contempla el ADN
sintetizado o un híbrido del mismo con ADN natural.
Las composiciones de ácido nucleico utilizadas en
la presente invención pueden ser de una sola cadena o de doble
cadena, pueden ser lineales o circulares, p. ej., un plásmido y son
oligo- o polinucleótidos. Éstas pueden comprender
solamente 15 bases o pares de bases, o pueden incluir hasta 20 mil
bases o pares de bases (20 kb). Ya que el grupo de transferencia se
emplea en base de prorrata cuando se añade a la composición de ácido
nucleico, las consideraciones prácticas de transporte físico
gobernarán en gran medida el límite superior del tamaño de las
composiciones de ácido nucleico que se pueden utilizar.
Además de estos materiales naturales, las
composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención
pueden también incluir composiciones sintéticas, es decir, análogos
de ácido nucleico. Se ha descubierto que éstas son particularmente
útiles en la metodología de la cadena complementaria, que es la
hibridación complementaria de oligonucleótidos relativamente cortos
a ARN de una sola cadena o ADN de una sola cadena, de modo que las
funciones normales y esenciales de estos ácidos nucleicos
intracelulares se destruyen. Véase, p. ej., Cohen,
Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expresión, CRC
Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1989).
Las dimensiones, naturaleza y la secuencia
específica de la composición de ácido nucleico que se ha de
transferir a la célula diana se pueden optimizar para la aplicación
determinada para la que se desean y dicha optimización está
comprendida dentro del conocimiento del especialista en este campo.
Sin embargo, la naturaleza de las células diana en el individuo al
que se desea transferir una composición de ácido nucleico, puede
tener una relación significativa en la selección del complejo
molecular multifuncional en concreto de la presente invención. Por
ejemplo, cuando se desea transferir moléculas de ácido nucleico a
células diana inyectándolas por vía intramuscular para provocar una
respuesta inmunitaria, se observará que esta transferencia se puede
efectuar utilizando un complejo molecular multifuncional de la
presente invención, tal como se definió anteriormente, que comprende
una poliamina catiónica a la que se une, como componente que
favorece la destrucción de la membrana del endosoma, un grupo
alquilo de cadena larga lipófilo como se definió anteriormente.
Cuando las células diana son, por ejemplo, hepatocitos, la
transferencia de la composición de ácido nucleico deseada se realiza
fácilmente mediante la utilización del complejo molecular
multifuncional de la presente invención en el que se une a la
poliamina catiónica un componente del enlace específico del receptor
que permitirá la discriminación entre las células del cuerpo, que
comprenden, p. ej.,
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina,
o
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina.
La composición de ácido nucleico que se ha de
transferir a una célula diana según la presente invención debe tener
un marco de lectura abierto apropiado y un activador para expresar
una proteína, así como otras secuencias reguladoras que pueden ser
apropiadas para la expresión. Las composiciones de ácido nucleico
que se han de administrar mediante los procedimientos de la presente
invención se pueden diseñar y construir de modo que sean apropiadas
para la particular aplicación deseada, todas las cuales están
comprendidas dentro de la experiencia ordinaria del especialista en
este campo.
Las moléculas de ácido nucleico que se
administran a las células utilizando el complejo molecular
multifuncional de la presente invención pueden servir como: 1)
plantillas genéticas para las proteínas que funcionan como agentes
de inmunización profilácticos y/o terapéuticos; 2) copias de
sustitución de genes defectuosos, desaparecidos o que no funcionan;
3) plantillas genéticas para proteínas terapéuticas; 4) plantillas
genéticas para moléculas de cadena complementaria y moléculas con
cadena complementaria per se; o 5) plantillas genéticas para
ribozimas.
En el caso de las moléculas de ácido nucleico que
codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico comprenden
preferentemente las secuencias reguladoras necesarias para la
transcripción y traducción en las células diana de cada animal al
que se administran.
En el caso de moléculas de ácido nucleico que
sirven como plantillas para las moléculas y ribozimas con cadena
complementaria, dichas moléculas de ácido nucleico se unen
preferentemente a elementos reguladores necesarios para la
producción de copias suficientes de la cadena complementaria y de
las moléculas de ribozima codificadas por éstas respectivamente. Las
moléculas de ácido nucleico están exentas de partículas retrovíricas
y se proporcionan preferentemente como ADN en forma de
plásmidos.
El núcleo o eje central del grupo de
transferencia es la poliamina catiónica, que contiene entre 3 y 12
aminas. Pueden ser más de uno de estos componentes de poliamina
catiónica, cuya función es superar la incompatibilidad en aumento de
naturaleza hidrófila de la molécula de ácido nucleico y la
naturaleza lipófila de la membrana celular, aunque ésta por sí mismo
no permitirá a la primera pasar a través de la última. Los grupos
catiónicos de poliamina se unen a los grupos aniónicos del ácido
nucleico mediante enlace iónico, neutralizando de este modo las
cargas y sirviendo también como punto de unión para el complejo. Un
\mug de ADN contiene 3,2 nanomoles de cargas aniónicas de fosfato,
suponiendo un peso molecular medio de 325 para la sal sódica del
nucleótido. El grupo de transferencia de la presente invención será
eficaz para conseguir la transferencia de la composición de ácido
nucleico hasta que las cargas aniónicas de dicho ácido nucleico sean
neutralizadas sustancialmente por las cargas catiónicas del
componente de poliamina del grupo de transferencia.
Se valorará que en una forma de realización de la
presente invención, se pueda emplear una sola poliamina catiónica
que, teóricamente, equilibre las cargas aniónicas del ácido nucleico
de una forma más o menos estequiométrica, aunque debe entenderse
que, desde un punto de vista práctico, será necesario emplear
cantidades de poliamina catiónica que están significativamente en
exceso de la cantidad estequiométrica, debido a la presencia de
puntos de unión competitivos en la diana y otras células, cuya
existencia es bien conocida por el especialista y que impiden
competitivamente o si no interfieren con la unión de la poliamina en
el ácido nucleico como se desea. Se contempla también que se pueden
emplear más de una de dichas poliaminas catiónicas, en cuyo caso
cada cadena de poliamina o un fragmento es menor que el
correspondiente ácido nucleico al que se va a unir. Debe entenderse,
sin embargo, que el tamaño o la longitud total de cada uno de estos
componentes de poliamina catiónicos deberían ser todos prácticamente
del mismo tamaño o longitud que el componente del ácido nucleico,
para que la neutralización de las cargas aniónicas del ácido
nucleico tenga lugar. De nuevo, debe entenderse que por razones
prácticas, será necesario un exceso significativo de componentes de
poliamina catiónica, sobre la cantidad de componente de ácido
nucleico presente. El utilizar más de un componente de poliamina
catiónica permite flexibilidad con respecto a los tipos de los
grupos que se unen a éste. Por ejemplo, un componente de poliamina
catiónica puede llevar un componente que favorece la destrucción de
la membrana del endosoma particular, mientras que otro componente de
poliamina catiónica lleva un componente que se une de forma
específica al reactor o quizás un componente diferente que favorece
la destrucción de la membrana del endosoma. El número total de
dichos componentes de poliamina catiónica es variable, y dependerá
no solamente del tamaño o longitud del componente de ácido nucleico,
sino también del número y tipo de grupos unidos a éste.
La eficacia de la transferencia, es decir,
transfección, no llega a ser óptima hasta que el complejo molecular
multifuncional, la combinación del grupo de transferencia y el ácido
nucleico, llevan una carga positiva fuerte. De este modo, la
cantidad del grupo de transferencia se puede seleccionar con esta
mentalidad y la cantidad real seleccionada dependerá de la densidad
de carga de la misma, que se puede calcular por medios bien
conocidos en la técnica.
La triamina, tetraamina, pentamina y componentes
de poliamina superiores del grupo de transferencia deben ser
catiónicos para que sean funcionales, como se explicó anteriormente.
Esto se puede realizar mediante el recurso sencillo de preparar una
sal de adición de ácido, p. ej., la sal hidrocloruro, en la que se
forman unidades de cloruro amónico. Este puede ser el caso en que la
forma catiónica de la poliamida se forma en condiciones de pH
fisiológico, en cuyo caso no es necesario formar directamente el
catión. Así pues, la expresión "poliamina catiónica" está
destinada a incluir ambas posibilidades.
Se contempla que el número de grupos amina que se
desea que estén presentes en la poliamina dependerá en cierta medida
del modo de administración del complejo molecular multifuncional que
se utilice. Por ejemplo, se contempla que para administración
intramuscular, se prefiere tener de 3 a 5 grupos amina en la
poliamina, en tanto que, para inyección generalizada, p. ej.,
inyección intravenosa, se prefiere que tenga de 5 a 8 grupos amino
en la poliamina. Para aplicaciones in vitro generalmente, se
prefiere tener de 5 a 8 grupos amino en la poliamina.
El componente siguiente del grupo de
transferencia es el componente que favorece la destrucción de la
membrana del endosoma, que se necesita que esté presente. Éste puede
comprender uno o más grupos alquilo de cadena larga lipófilos unidos
mediante uno o más átomos de hidrógeno de dicha poliamina, o puede
comprender un grupo puente "B", p. ej., un grupo con enlace
alquilo más corto, opcionalmente con un grupo amino, hidroxilo o
sulfhidrilo terminal, mediante el cual se une un péptido fusógeno, o
el ácido cólico o el colesterilo o un compuesto derivado.
El grupo alquilo de cadena larga lipófilo está
definido por la fórmula:
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que B es un grupo puente como el definido; R, R^{1} y
R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo
constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}; y j
es un entero de 6 a 24 inclusive, preferentemente de 8 a 18, más
preferentemente de 8 a 12 inclusive.
El grupo "-B-" puede estar ausente, es
decir, un enlace sencillo, en el que R^{3}es el componente que
favorece la destrucción de la membrana del endosoma que comprende un
grupo alquilo de cadena larga lipófilo como el definido en "a)"
anteriormente. El grupo "-B-" puede ser también un elemento de
puente que es un elemento seleccionado independientemente de entre
el grupo constituido por:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-N(R)-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-O-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{-C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O}\}_{p}-N(R)-;
o
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-,
en los que los diversos
sustituyentes son los definidos
anteriormente.
Cuando el componente que favorece la destrucción
de la membrana del endosoma, en lugar de ser un grupo alquilo de
cadena larga lipófila, es un péptido fusógeno o un ácido cólico o
colesterilo o un compuesto derivado, el grupo en puente "B" se
necesita que esté presente y será un elemento seleccionado
independientemente de entre el grupo i) a v) anteriormente. Esta
selección dependerá del tipo requerido o deseado de enlace químico
que esté presente. Por ejemplo, los elementos i) y iv) son enlaces
carboxamida, mientras que los elementos ii) y iii) son enlaces
carbamato, tiocarbamato o carbamoilo, dependiendo de si "Z" es
O, S o está ausente, respectivamente. Para el elemento v) los
enlaces serán oxi, tio, amino o alquileno, dependiendo de si
"X" es O, S, N(R) o está ausente, respectivamente. El
componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma,
por otra parte, puede tener un grupo carbonil, amino o algún otro
grupo terminal, que puede determinar la selección del elemento
puente que se ha de utilizar. Todas estas posibilidades, sin
embargo, están comprendidas dentro de la experiencia del
especialista en este campo.
De modo más sencillo, el grupo puente puede ser
un grupo con enlace alquileno utilizado principalmente por
consideraciones estéricas. Sin embargo, los demás grupos puente
también pueden ser deseados para comunicar varias propiedades
físicas y químicas, así como de configuración al complejo molecular
multifuncional de la presente invención. El grupo polietilenglicol
puede ser especialmente útil a este respecto.
La expresión "alquilo
C_{1-6}", utilizada anteriormente, y en toda la
descripción de la presente invención, se refiere a grupos alquilo de
cadena lineal y ramificada incluyendo, pero sin limitarse a metilo,
etilo, propilo, isopropilo, n-butilo,
iso-butilo,
sec-butilo, t-butilo y
n-pentilo.
En las fórmulas del grupo alquilo de cadena larga
lipófila anteriores, se prefiere que R, R^{1} y R^{2} sean todos
hidrógeno, y, según se indica que j sea un entero de 8 a 18
inclusive. Debe estar presente al menos uno de estos grupos alquilo
de cadena larga lipófila, pero preferentemente no están presentes
más de tres de dichos grupos. Se prefiere que tenga sólo uno de
dichos grupos. Así pues, los ejemplos de los grupos de transferencia
preferidos para utilización en un complejo de la presente invención,
en el que el componente que favorece la destrucción de la membrana
del endosoma es un grupo alquilo de cadena larga lipófilo descrito
anteriormente, son N^{4}-octilespermidina,
N^{4}-dodecilespermidina,
N^{4}-octadecilespermidina,
N^{4}-octilespermina,
N^{4}-dodecilespermina y
N^{4}-octadecilespermina.
El componente que favorece la destrucción de la
membrana del endosoma puede comprender asimismo un grupo puente de
alquilo más corto, opcionalmente con un grupo carboxilo, amino,
hidroxilo o sulfhidrilo terminal mediante el que se une a un péptido
fusógeno o colesterol o un compuesto derivado. Dicho componente
puede estar representado por la fórmula
-B-(R^{4})R, en la que el grupo B es
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en el que
R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno independientemente de
entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo
C_{1-6}; j' es un entero de 1 a 8 inclusive,
preferentemente de 2 a 4 inclusive; X es O, S, N(R) o está
ausente.
Es preferible que R^{1} y R^{2} sean cada uno
hidrógeno, y tal como se indica, que j' sea 2 a 4, mientras que X se
define como N(R). De este modo, el grupo puente alquilo más
corto será preferentemente etilo, n-propilo o
n-butilo y tendrá un grupo amino terminal al
que se une el péptido fusógeno, el ácido cólico, colesterilo o un
compuesto derivado, que comprende el componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma.
Por otra parte, se puede seleccionar otro de los
elementos del grupo puente "B". Por ejemplo, el elemento i)
proporciona un grupo con enlace alquilo con un enlace carboxamida,
cuyo representante más sencillo sería el grupo
-(CH_{2})-C(=O)-NH-. El elemento
ii) proporciona un grupo con enlace alquileno con un tipo de enlace
de carbamato; y el representante más sencillo de este elemento sería
el grupo
-(CH_{2})-NH-C(=O)-, que es un
tipo de enlace carbamoilo. Un enlace carbamato estaría representado
por el grupo
-(CH_{2})-NH-C(=O)-O-,
mientras que una variante sencilla de este grupo proporcionaría un
enlace tiocarbamato:
-(CH_{2})-NH-C(=O)-S-.
Los elementos iii) y iv) proporcionan las mismas variantes de enlace
terminal, aunque añadiendo al grupo puente alquilo un grupo puente
de polietilenglicol de tamaño variable, es decir, numerosas unidades
de monómero de óxido de etileno repetidas, dependiendo de las
definiciones de "l" y "p".
El péptido fusógeno que funciona como componente
que favorece la destrucción de la membrana del endosoma, comprende
las glucoproteínas en punta de los virus de animales encapsulados
conocidos en la técnica. La fusión de la membrana, ya sea plana o
anular, comprende las etapas de enfoque inicial, coalescencia y
separación. Las reacciones de fusión son rápidas, muy específicas y
sin defectos. Las proteínas de la membrana de los virus de animales
encapsulados comprenden glucoproteínas que se extienden en la bicapa
de la membrana del virus y tienen el conjunto de su masa asociada
externamente y proteínas no extensibles, no glucosiladas en la
superficie de la bicapa interna. Las glucoproteínas forman
proyecciones radiales en la superficie de la membrana del virus y
estas glucoproteínas en punta desempeñan un papel clave en la
introducción del virus en las células huésped. Las glucoproteínas en
punta están entre las proteínas de la membrana del virus mejor
caracterizadas. En la introducción a la célula las glucoproteínas en
punta son responsables de la unión de la partícula de virus a la
superficie de la célula y de la penetración de la nucleocápside en
el citosol, donde, después de la endocitosis de la partícula de
virus, las glucoproteínas en punta desempeñan un papel en la fusión
con la membrana limitante del endosoma, mediante el cual la
nucleocápside vuelve a introducirse en el citosol. En algunos virus
de animales encapsulados, las glucoproteínas en punta tienen un
carácter especializado, p. ej. en los ortomixovirus, en los que una
es una neuraminidasa y la otra es una hemaglutinina. Todos estos
péptidos fusógenos, desde el punto de vista de sus secuencias de
aminoácido, morfología en conjunto, papel en el proceso general de
fusión y requisitos para la actividad, han sido objeto de estudio a
largo plazo y han sido expuestos con detalle en la bibliografía
técnica. Véase, p. ej., J. White, M. Kielian y A. Helenius,
Quarterly Reviews of Biophysics, 16, 151-195
(1983), que se incorpora a esta memoria como referencia en su
totalidad.
Ejemplos de dichos péptidos fusógenos y homólogos
derivados de glucoproteínas en punta de virus encapsulados, incluyen
las siguientes lecturas de secuencias de péptido desde el terminal N
al terminal C:
SEQ ID nº:1: KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCP (R.
Schlegel y M. Wade, J. Biol. Chem., 259,
4691-94 (1984))-VSV;
poli(Glu-Aib-Leu-Aib)
(K. Kono, H. Nishii y T. Takagishi, Biochim. Biophys. Acta,
1164, 81-90 (1993));
SEC ID nº:2:
AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQ-HIV-1;
SEC ID nº:3:
EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQ-MuLV (J.S. Jones
y R. Risser, J. Virol., 67, 67-74
(1993));
SEC ID nº:4:
AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARS-HIV-1 (J.L.
Nieva, S. Nir, A. Muga, F.M. Goñi y J. Wilschut, Biochem., 33,
3201-09 (1994));
SEC ID nº:5:
AVGAIGALFLGFLGAAG-HIV-1 (S.
Soukchareun, G.W. Tregear y J. Haralambidis, Bioconj. Chem., 6,
43-53 (1995));
SEC ID nº:6:
GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA-HA-2 (P.
Midoux, C. Mendes, A. Legrand, J. Raimond, R. Mayer, M. Monsigny y
A.C. Roche, Nucl. Acids Res., 21, 871-78
(1993));
SEC ID nº:7:
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFR-HA-2;
SEC ID nº:8:
AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAAS-HIV-1
gp41;
SEC ID nº:9:
FAGVVIGLAALGVATAANVTAAVALVK-SV5 F1;
SEC ID nº:10:
KVYTGVYPFMWGGAYCFCD-SFV E1;
SEC ID nº:11:
KLlCTGlSSlPPlRALFAAlNIP-PH-30
\alpha (J.M. White, Science, 258, 917-24
(1992));
SEC ID nº:12:
FFGAVIGTIALGVATATAAQIT-Sendai F1;
SEC ID nº:13:
FAGVVIGLAALGVATATAAQVT-SV5 F1;
SEC ID nº:14:
FlGAllGGVALGVATATAAQlT-NDV F1;
SEC ID nº:15:
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQN-HA-2
X:31;
SEC ID nº:16:
GLFGAIAGFIENGWEGLVDGWYGFRHQN-HA-2
FPV;
SEC ID nº:17:
GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHG-HA-2
B/Lee;
SEC ID nº:18:
FVAAIILGISALIAIITSFAVATALVKEM-MMTV gp36;
SEC ID nº:19:
EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGIGTGTALMATQQFQQLQAAVQDDLREVEKS-MoMLV
p15E;
SEC ID nº:20:
EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQFQQLHAAVQDDLKEVEKS-F-MuLV
p15E;
SEC ID nº:21:
EPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGVGTGTALVATQQFQQLQAAMHDDLKEVEKS-AKV
p15E;
SEC ID nº:22:
DYQCKVYTGVYPFMWGGAYCFCDSENT-SFV E1;
SEC ID nº:23:
DYTCKVFGGVYPFMWGGAQCFCDSENS-Sindbis E1 (J. White, M
Kielian y A. Helenius, Q. Rev. Biophys., 16
151-95 (1983));
SEC ID nº:24:
FAGVVLAGAALGVAAAAQI-sarampión;
SEC ID nº:25:
FAGVVLAGAALGVATAAQI-sarampión (P.L. Yeagle, R.M.
Epand, C.D. Richardson y T.D. Flanagan, Biochim. Biophys. Acta,
1065, 49-53 (1991));
SEC ID nº:26:
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGGC-HA-2 (E.
Wagner, C. Plank, K. Zatloukal, M. Cotten y M. L. Birnstiel,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 7934-38
(1992));
SEC ID nº:27:
GLFGAIAGFIENGWEGMIDG-X31F/68
HA-2;
SEC ID nº:28:
GIFGAIAGFIENGWEGMIDG-VIC/75
HA-2;
SEC ID nº:29:
GLFGAIAGFIEGGWTGMIDG-PR8/34
HA-2;
SEC ID nº:30:
GLFGAIAGFIEGGWEGMVDG-Jap/57
HA-2;
SEC ID nº:31:
GLFGAIAGFIEGGWEGLVDG-PPV/34 HA-2;
y
SEC ID nº:32:
GFFGAIAGFLEGGWEGMIAG-X31F/68 HA-2
(J.D. Lear y W.F. DeGrado, J. Biol. Chem., 262,
6500-05 (1987)).
Cualquier experto en la técnica reconocerá
fácilmente que en un complejo de la invención se podrían utilizar
otros péptidos fusógenos, incluyendo los péptidos funcionalmente
equivalentes a los descritos, pero que tienen una o más adiciones,
deleciones o sustituciones de aminoácidos, especialmente las que han
conservado las sustituciones de aminoácidos.
El ácido cólico y derivados cuya función como
componentes que favorecen la destrucción de la membrana del
endosoma, comprenden los compuestos de fórmula (2):
en la
que:
- - -
representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos
enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo
es \Delta4 o \Delta5.
R^{6} es H, OH, CO_{2}H,
-C(=O)NH_{2}, -OC(=O)NH_{2},
-NH_{2} o
-O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n' es un
entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión
del derivado de ácido cólico, que comprende un alquilo
C_{1-6} o un alquilcarbonilo
C_{1-6}; y
R^{8} es un alquilo C_{1-6},
en especial CH_{3}. Es preferible que el ácido cólico y los
compuestos derivados comprendan uno o más elementos seleccionados
del éster o amida de
3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
El colesterilo y derivados, cuya función como
componentes que favorecen la destrucción de la membrana del
endosoma, comprende los compuestos de fórmula (3):
en la
que:
- - -
representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo, con la condición de que ambos
enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el sistema de anillo
es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de
unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo
C_{1-6}, -OC(=O)- o
-OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo alquilo
C_{1-6}; especialmente
(CH_{2})_{3}CH(CH_{3})_{2}; y
R^{8a} es un grupo alquilo
C_{1-6}, especialmente CH_{3}. Es preferible que
el colesterilo y los compuestos derivados comprenden uno o más
elementos seleccionados de entre el grupo que consta de
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
-\beta-carbamato y
-\beta-metilencarboxamida.
En otra forma de realización de la presente
invención el complejo comprende un componente del enlace específico
del receptor que ayuda a la transferencia del efecto de las
composiciones con ácido nucleico a las células diana, especialmente
a células eucarióticas, aprovechándose de las vías de endocitosis,
mediadas por el receptor natural, que existen en estas células. El
componente del enlace específico del receptor es de este modo un
ligando para el receptor natural y puede ayudar en el enlace del
complejo molecular multifuncional a la célula diana. La endocitosis
o pinocitosis tendrá lugar por lo que el complejo completo se
transfiere a la célula diana, encerrado en un endosoma.
El componente del enlace específico del receptor
cumple la importante función de permitir al complejo molecular
multifuncional de la presente invención dirigirse a poblaciones de
células específicas, p. ej., hepatocitos. El componente del enlace
facilita la localización de las células diana deseadas en el cuerpo
del animal al que se administra el complejo, con la posterior unión
del complejo a las células diana.
Cuando se emplea el componente del enlace
específico del receptor, también estará presente en el complejo
molecular multifuncional un componente que favorece la destrucción
de la membrana del endosoma, tal como el definido además
anteriormente. Por consiguiente, una vez el componente del enlace ha
localizado la célula diana deseada en el individuo, y une el
complejo a dicha célula mediante el enlace a dicho receptor, el
complejo se transferirá a dicha célula por endocitosis, después de
lo cual se encerrará dentro de un endosoma. En este momento, el
componente que favorece la destrucción de la membrana del endosoma
asume su importante papel destruyendo dicha membrana, permitiendo
escapar del complejo en el citoplasma de dicha célula.
Durante el curso normal de los acontecimientos en
la célula diana, la formación del endosoma es un preludio al
direccionamiento de cualquier proteína extraña a los liposomas donde
tendrá lugar la degradación de la proteína extraña por enzimas
hidrolíticos. Por consiguiente, la acumulación en los compartimentos
del lisosoma puede ser un obstáculo principal para la eficacia de
los sistemas de administración de ácido nucleico. El complejo
molecular multifuncional de la presente invención debería correr la
misma suerte, si no fuera por la presencia del componente que
favorece la destrucción de la membrana del endosoma. Este componente
permite al complejo salir del endosoma, después de lo cual puede
migrar al núcleo de la célula diana y liberar la composición de
ácido nucleico, cuya información genética puede ser transcrita a
continuación dentro de dicho núcleo. Aunque los mecanismos exactos
que realizan estas etapas y vías no son bien comprendidos, la
expresión de la molécula del ácido nucleico contenida en el complejo
molecular multifuncional no tiene lugar, como se demuestra en los
ejemplos experimentales más adelante.
El componente con enlace específico del receptor
puede estar representado por la fórmula
-B-(R^{5})R, en la que R es independientemente hidrógeno o
alquilo C_{1-6} o está ausente; B puede ser entre
otros,
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-, en la que
R^{1} y R^{2} son tal como se definieron anteriormente, X es
N(R) y j' es un entero de 1 a 6 inclusive, preferentemente 2
a 4 inclusive; y R^{5} es un componente del enlace específico del
receptor independientemente seleccionado de entre el grupo
constituido por:
i) D-biotina;
ii)
galactosil-\beta1-4-tioglucósido
de \beta-3'-propionilo;
iii)
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
iv)
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
v) 5-metiltetrahidrofolato;
vi) ácido fólico;
vii) ácido folínico;
viii) tiomanósido de
\alpha-3'-propionilo; y
ix)
tiomanósido-6-fosfato de
\alpha-3'-propionilo.
Es preferible que R, R^{1} y R^{2}sean cada
uno hidrógeno y como se indicó, que j' sea 2 a 6. De este modo, el
grupo puente alquilo más corto será preferentemente etilo,
n-propilo o n-butilo y
el componente puente específico del receptor se unirá al grupo amino
terminal.
Ya que el componente que favorece la destrucción
de la membrana del endosoma también puede estar presente, los
ejemplos de grupos de transferencia preferidos de la presente
invención, en los que el componente del enlace específico del
receptor es un grupo galactosilo como se describió anteriormente,
son:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
Por consiguiente, se ha descrito con detalle
anteriormente el complejo molecular multifuncional de la presente
invención para la transferencia de composiciones de ácido nucleico a
una célula diana.
También se ha descrito un procedimiento para la
transferencia de una composición de ácido nucleico a las células
diana en base in vitro. En este procedimiento las células
diana se ponen en contacto con un complejo molecular multifuncional
que incluye dicha composición de ácido nucleico. En un ejemplo, las
células diana se han aislado de un individuo y de este modo todas
las células son del mismo tipo, y no es necesario, por lo tanto, que
el complejo incluya un componente de enlace específico del receptor.
En otro ejemplo, se mantiene un cultivo de microorganismos en
condiciones de fermentación y un producto de proteína es expresado
por el microorganismo como resultado de la transferencia a éste de
las composiciones de ácido nucleico que utilizan el complejo
molecular multifuncional de la presente invención. El producto
proteínico se aísla y purifica. Aquí de nuevo, está implicado un
solo tipo de célula diana, de modo que no es necesario que esté
presente el componente del enlace específico del receptor.
Este procedimiento proporciona la transferencia a
las células diana de una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido deseado o
proteína, o sirve como plantilla para las moléculas de ácido
nucleico funcionales. La proteína o la molécula de ácido nucleico
funcional deseada puede ser cualquier producto de interés
industrial, comercial o científico, p. ej., agentes terapéuticos
incluyendo vacunas; comestibles y complementos nutritivos;
compuestos de importancia agrícola tales como herbicidas y
reguladores del crecimiento vegetal, insecticidas, acaricidas,
rodenticidas y fungicidas; compuestos útiles en sanidad animal tales
como parasiticidas incluyendo nematocidas; y así sucesivamente. Las
células diana son normalmente cultivos de células huésped que
comprenden células de microorganismos tales como bacterias y
levaduras, pero pueden incluir además células vegetales y de
mamíferos. Los cultivos celulares se mantienen según técnicas de
fermentación bien conocidas en la técnica, que maximizan la
producción de la proteína o de la molécula de ácido nucleico
funcional deseada y los productos de la fermentación se recogen y
purifican por procedimientos conocidos.
Se ha dado a conocer también un procedimiento
para la transferencia in vitro de una composición de ácido
nucleico a las células de un individuo. El procedimiento comprende
la etapa de poner en contacto dichas células objetivo con un
complejo molecular multifuncional de la presente invención, que
incluye dicha composición de ácido nucleico. Aquí de nuevo, la
molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica un péptido o una proteína deseados, o sirve como
plantilla para las moléculas de ácido nucleico funcional. La
molécula de ácido nucleico se administra exenta de partículas
retrovíricas. La proteína deseada puede ser una proteína que
funciona dentro del individuo o sirve para iniciar una respuesta
inmunitaria.
La molécula de ácido nucleico se puede
administrar a las células de dicho individuo en una base in
vivo o ex vivo, es decir, el contacto con las células del
individuo puede tener lugar dentro del cuerpo del individuo según
los procedimientos que se emplean más típicamente, o el contacto con
las células del individuo puede tener lugar fuera del cuerpo del
individuo extrayendo las células que se desea para tratarlas fuera
del cuerpo del individuo por varios medios adecuados, después de
poner en contacto dichas células con dicha molécula de ácido
nucleico, después a su vez de la devolución de dichas células al
cuerpo de dicho individuo.
El procedimiento de transferencia de una
composición de ácido nucleico de un individuo tal como se describe
en esta memoria, incluye particularmente un procedimiento de
inmunización de un individuo contra un patógeno. En este
procedimiento, la composición de ácido nucleico administrada a
dichas células, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico, o
prácticamente similar, a un epítopo desplegado en dicho patógeno
como antígeno, y dicha secuencia de nucleótidos se conecta
operativamente a las secuencias reguladoras. La molécula de ácido
nucleico debe, desde luego, ser capaz de expresarse en las células
del individuo.
El procedimiento de transferencia de una
composición de ácido nucleico de un individuo tal como se describe
en esta memoria, incluye además procedimientos para inmunizar a un
individuo contra una enfermedad hiperproliferante o una enfermedad
autoinmunitaria. En dichos procedimientos la composición de ácido
nucleico que se administra a las células del individuo comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que comprende al
menos un epítopo idéntico a, o sustancialmente similar a un epítopo
desplegado en una proteína relacionada con una enfermedad
hiperproliferante o una proteína relacionada con una enfermedad
autoinmunitaria, respectivamente, y está conectado operativamente a
las secuencias reguladoras. De nuevo aquí la molécula de ácido
nucleico debe ser capaz de expresarse en las células del
individuo.
Se han descrito también procedimientos para el
tratamiento de un individuo que padece una enfermedad
autoinmunitaria, en la que las células de dicho individuo se ponen
en contacto con un complejo molecular multifuncional que incluye una
composición de ácido nucleico, administrando de este modo una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que restablece la actividad de un gen ausente,
defectuoso o inhibido, o que codifica una proteína que produce un
efecto terapéutico en dicho individuo y está funcionalmente ligada a
las secuencias reguladoras; siendo la molécula de ácido nucleico
capaz de expresarse en dichas células.
Para realizar los procedimientos descritos
anteriormente, la presente invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden el complejo molecular multifuncional
que incluye una composición de ácido nucleico, así como formas de
sal y éster farmacéuticamente aceptables de dicho complejo
molecular, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Se han
descrito además kits farmacéuticos que comprenden un recipiente que
consta de una composición de ácido nucleico y un recipiente que
consta de un grupo de transferencia, descritos en esta memoria.
Opcionalmente, en dichos kits se ha incluido excipientes,
portadores, conservantes y vehículos tales como disolventes.
Por consiguiente la presente invención
proporciona composiciones que inmunizan profiláctica y/o
terapéuticamente a un individuo contra un patógeno o célula anómala,
relacionada con la enfermedad. El material genético codifica un
péptido o proteína que comparte al menos un epítopo con una proteína
inmunógena que se encuentra en el patógeno o en las células a las
que se dirige. El material genético es expresado por las células del
individuo y sirve como diana inmunógena contra el que se produce la
respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria tiene una amplia
base: además de la respuesta inmunitaria humoral, se producen ambas
posibilidades de la respuesta inmunitaria celular. Los
procedimientos descritos en esta memoria son útiles para comunicar
inmunidad profiláctica y terapéutica. Así pues, un procedimiento de
inmunización incluye tanto métodos de protección de un individuo en
la prueba con patógeno como la aparición o proliferación de células
específicas, así como de procedimientos de tratamiento de un
individuo que padece la infección por el patógeno, la enfermedad
hiperproliferante o la enfermedad autoinmunitaria. Así pues, estos
procedimientos son útiles para producir respuestas inmunitarias
amplias contra una proteína diana, es decir proteínas asociadas de
forma específica con patógenos o las propias células "anómalas"
del individuo.
La presente invención también es útil para
combatir las enfermedades hiperproliferantes y los trastornos tales
como el cáncer, produciendo una respuesta inmunitaria contra una
proteína diana que está asociada de forma específica con las células
hiperproliferantes. La presente invención es además útil para
combatir enfermedades y trastornos autoinmunitarios produciendo una
respuesta inmunitaria contra una proteína diana que está asociada de
modo específico con las células implicadas en la enfermedad
autoinmunitaria.
Otros aspectos de la presente invención se
refieren a la terapia génica. Esto implica composiciones, para
introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un
individuo que son copias exógenas de genes que corresponden a genes
defectuosos, desaparecidos, que no funcionan o que funcionan
parcialmente en el individuo, o que codifican proteínas
terapéuticas, es decir, proteínas cuya presencia en el individuo
eliminarán una insuficiencia en el individuo y/o cuya presencia
proporcionará un efecto terapéutico en el individuo. Así pues, se
proporciona un medio de administrar dicha proteína que es adecuado,
e incluso una alternativa preferida a la administración directa de
la proteína al individuo.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión
"proteína deseada" está destinada a referirse a los péptidos y
proteínas codificados por las construcciones génicas utilizadas en
la presente invención, que actúan como proteínas diana para una
respuesta inmunitaria o como proteínas terapéuticas o de
compensación en los regímenes de terapia génica.
Utilizando las composiciones de la presente
invención, el ADN o ARN que codifica una proteína deseada se
introduce en las células de un individuo donde se expresa,
produciendo de este modo la proteína deseada. La composición de
ácido nucleico, p. ej., ADN o ARN que codifica la proteína deseada
está ligada a los elementos reguladores necesarios para la expresión
en las células del individuo. Los elementos reguladores para la
expresión del ADN incluyen un activador y una señal de
poliadenilación. Además, otros elementos, tales como una zona Kozak,
se pueden también incluir en la composición de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"composición de ácido nucleico" se refiere al ADN o ARN, o a
otra molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia de
nucleótidos que codifique la proteína deseada y que incluye las
señales de iniciación y terminación ligadas de forma operativa a los
elementos reguladores incluyendo un activador y una señal de
poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del
individuo al que se administra la construcción.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión
"forma expresable" se refiere a las construcciones génicas que
contienen los elementos reguladores necesarios ligados de forma
operativa a una secuencia de codificación que codifica una proteína
diana, de modo que cuando está presente en la célula del individuo,
se exprese la secuencia de codificación.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"vacuna genética" se refiere a una preparación farmacéutica que
comprende una composición de ácido nucleico que contiene una
secuencia de nucleótido que codifica una proteína diana, incluyendo
las preparaciones farmacéuticas útiles para provocar una respuesta
inmunitaria terapéutica.
Tal como se utiliza en esta memoria la expresión
"terapéutica genética" se refiere a una preparación
farmacéutica que comprende una composición de ácido nucleico que
contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
terapéutica o de compensación. Por otra parte, un producto
terapéutico genético puede codificar secuencias de la cadena
complementaria que inhiben la expresión génica no deseada. Además,
los productos terapéuticos genéticos pueden codificar ribozimas.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"proteína diana" se refiere a una proteína contra la que se
puede producir una respuesta inmunitaria. La proteína diana es una
proteína inmunógena que comparte al menos un epítopo con una
proteína del patógeno o del tipo de célula indeseable, tales como
una célula cancerosa o una célula implicada en la enfermedad
autoinmunitaria, contra la que se necesita inmunización. La
respuesta inmunitaria dirigida contra la proteína diana protegerá al
individuo contra, y tratará al individuo de, la infección o
enfermedad específica a la que está asociada la proteína diana.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"compartir un epítopo" se refiere a las proteínas que contienen
al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un
epítopo de otra proteína. Y, la expresión "epítopo prácticamente
similar" se refiere a un epítopo que tiene una estructura que no
es idéntica a la de un epítopo de una proteína, pero no obstante
provoca una respuesta inmunitaria celular o humoral que
interreacciona con esta proteína.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"proteína terapéutica" se refiere a proteínas cuya presencia
comunica una utilidad terapéutica al individuo.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"proteína de compensación" se refiere a proteínas cuya
presencia se compensa por la ausencia de una proteína producida de
forma endógena que funciona completamente, debido a un gen endógeno
ausente, defectuoso, que no funciona o que funciona
parcialmente.
Cuando es absorbida por una célula diana, una
composición de ácido nucleico utilizada en la presente invención,
que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína
deseada ligada operativamente a elementos reguladores, puede
permanecer presente en la célula como molécula extracromosómica en
funcionamiento, o se puede integrar en el ADN cromosómico de la
célula. El ADN se puede introducir en las células donde permanece
como material genético separado en forma de plásmido. Por otra
parte, el ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma puede
introducirse en la célula diana. Al introducir el ADN en la célula,
se pueden añadir reactivos que favorecen la integración del ADN en
los cromosomas. Pueden también incluirse en la molécula de ADN las
secuencias de ADN que son útiles para favorecer la integración. Como
alternativa, se puede administrar ARN a la célula. Se contempla
también el proporcionar la composición de ácido nucleico como un
minicromosoma lineal incluyendo un centrómero, telómeros y un origen
de replicación. Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones
"construcción de ADN", "composición de ácido nucleico" y
"secuencia de nucleótidos" se refieren tanto a moléculas de ADN
como de ARN.
Los elementos reguladores necesarios para la
expresión génica de una molécula de ADN incluyen: un activador, un
codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de
poliadenilación. Además, se necesitan con frecuencia potenciadores
para la expresión génica. Es necesario que estos elementos se
conecten de forma operable a la secuencia que codifica las proteínas
deseadas y que los elementos reguladores sean operables en el
individuo al que se administran.
En general se considera que los codones de
iniciación y el codón de terminación forman parte de una secuencia
de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es
necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al
que se administra la construcción del gen. Los codones de iniciación
y terminación pueden estar en el marco con la secuencia de
codificación. Los activadores y las señales de poliadenilación
utilizados además deben ser funcionales dentro de las células del
individuo.
Ejemplos de activadores útiles con las
composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente invención,
especialmente en la producción de una vacuna genética para el
hombre, incluyen pero no están limitados a, activadores del virus 40
de simios (SV40), activador del virus del tumor de mama de ratón
(MMTV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como el
activador de repetición terminal largo de VIH (LTR), virus de
Moloney, ALV, citomegalovirus (CMV) tal como el activador precoz
inmediato de CMV, virus de Epstein Barr (EBV), virus del sarcoma de
Rous (RSV), así como activadores de genes humanos tales como Actina
humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo
humano y melatotioneína humana.
Ejemplos de señales de poliadenilación útiles con
las composiciones de ácido nucleico utilizadas en la presente
invención, especialmente para la producción de una vacuna genética
para el hombre, incluyen pero no se limitan a, señales de
poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. En
particular, se puede utilizar la señal de poliadenilación SV40 que
está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA) denominada
señal de poliadenilación SV40.
Además de los elementos reguladores requeridos
para la expresión de la molécula de ácido nucleico, se pueden
incluir también otros elementos en la molécula de ADN. Dichos
elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador se
puede seleccionar de entre el grupo que incluye, pero no se limita
a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del
músculo humano y potenciadores víricos tales como los de CMV, RSV y
EBV.
Se pueden proporcionar composiciones de ácido
nucleico con origen de replicación en mamíferos para mantener la
construcción fuera de los cromosomas y producir copias múltiples de
la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de
Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de la replicación del
virus Epstein Barr y la zona de codificación EBNA-1
del antígeno nuclear, que produce mucha copia de la replicación del
episoma sin integración. En los aspectos de la invención que se
refieren a la terapia génica, se prefieren construcciones con
orígenes de replicación que incluyen el antígeno para la
activación.
En otras utilizaciones de la presente invención
que se refieren a aplicaciones de inmunización, la composición del
ácido nucleico contiene secuencias de nucleótidos que codifican una
proteína diana y además incluyen genes para las proteínas que
aumentan la respuesta inmunitaria frente a dichas proteínas diana.
Ejemplos de dichos genes son los que codifican citocinas y
linfocinas tales como interferon \alpha, interferon \gamma,
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF),
GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de
crecimiento epidérmico (EGF), IL-1,
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-8, IL-10 e IL-12.
En algunas utilizaciones, se preferirá que el gen para
GM-CSF se incluya en las composiciones de ácido
nucleico utilizadas en las composiciones de inmunización.
Si se desea eliminar las células que reciben la
composición de ácido nucleico por alguna razón, se puede añadir otro
elemento a la composición de ácido nucleico que sirve como diana
para la destrucción celular. Se puede incluir un gen de timidina
cinasa (tk) del herpes en forma expresable en la composición de
ácido nucleico. Se puede administrar al individuo el fármaco
gangciclovir y este fármaco producirá la destrucción selectiva de
cualquier célula que produzca tk, proporcionando de este modo los
medios para la destrucción selectiva de las células que contienen la
composición de ácido nucleico.
Para maximizar la producción de proteínas, se
pueden seleccionar secuencias reguladoras que son muy aconsejables
para la expresión génica en las células a las que se transfiere la
construcción. Además, se pueden seleccionar codones que se
transcriben más eficazmente en la célula diana. Cualquier experto en
la técnica puede producir fácilmente construcciones de ADN que sean
funcionales en las células diana.
Se puede analizar los niveles de expresión in
vitro en las composiciones de ácido nucleico utilizando cultivo
de tejido de células del mismo tipo que las que se han de tratar.
Por ejemplo, si la vacuna genética se ha de administrar a células de
músculo humano, se cultivan las células del músculo en el cultivo,
tales como las células del tumor sólido en el músculo de
rabdomiosarcoma, se pueden utilizar como un modelo in vitro
para medir el nivel de expresión.
Las composiciones de ácido nucleico utilizadas en
la presente invención no se incorporan en las partículas
retrovíricas. Las composiciones de ácido nucleico son absorbidas por
la célula sin inserción mediada por partículas retrovíricas, tal
como sucede cuando las partículas de retrovirus con ARN retrovírico,
infectan una célula. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "exentas de partículas retrovíricas" se refiere a las
composiciones de ácido nucleico que no se incorporan a las
partículas retrovíricas. Tal como se utiliza en esta memoria,
"disociado de un agente infeccioso" se refiere al material
genético que no forma parte de un vector vírico, bacteriano o
eucariótico, activo, inactivado, vivo o muerto, que es capaz de
infectar una célula.
En algunas formas de realización, las
composiciones de ácido nucleico constituyen menos de un genoma
vírico replicable, completo, de modo que en la introducción en la
célula, la composición de ácido nucleico posee información genética
insuficiente para la producción directa de partículas víricas
infecciosas. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión
"genoma vírico incompleto" se refiere a una composición de
ácido nucleico que contiene menos de un genoma completo de modo que
la incorporación de dicha composición de ácido nucleico a la célula
no constituye la introducción de información genética suficiente
para la producción de virus infeccioso.
En algunas formas de realización, se puede
administrar una vacuna vírica atenuada como una composición de ácido
nucleico que contiene suficiente material genético para permitir la
producción de partículas víricas. La administración de la vacuna
atenuada como composición de ácido nucleico permite la producción de
grandes cantidades de producto de inmunización seguro, puro y
activo.
La presente invención se puede utilizar para
inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como
virus, organismos procarióticos y eucarióticos patógenos tales como
los organismos patógenos unicelulares y parásitos multicelulares. La
presente invención es particularmente útil para inmunizar a un
individuo contra aquellos patógenos que infectan células y que no
están encapsulados, tales como virus y procariotas como por ejemplo
Gonorrhoea, Listeria y Shigella. Además, la
presente invención es también útil para inmunizar a un individuo
contra patógenos protozoarios, incluyendo cualquier etapa en su
ciclo vital y que son patógenos intracelulares. Tal como se utiliza
en esta memoria, la expresión "patógeno intracelular" se
refiere a un virus u organismo patógeno que, durante al menos parte
de su ciclo reproductor o vital, existe dentro de una célula huésped
y en la que produce o da lugar a que se produzcan, proteínas
patógenas. La Tabla 1 proporciona una relación de algunas de las
familias y géneros víricos para los que se pueden preparar vacunas
según la presente invención. En las vacunas son útiles las
construcciones de ADN que comprenden las secuencias de ADN que
codifican los péptidos que comprenden al menos un epítopo idéntico o
prácticamente similar a un epítopo desplegado en un antígeno
patógeno, como por ejemplo los antígenos relacionados en dicha
tabla.
Además, la presente invención sirve también para
inmunizar un individuo contra otros patógenos incluyendo los
patógenos procarióticos y eucarióticos protozoarios así como
parásitos multicelulares, tales como los relacionados en la Tabla
2.
Con el fin de producir una vacuna genética para
proteger de la infección patógena, el material genético que codifica
las proteínas inmunógenas contra el que se puede montar una
respuesta inmunitaria protectora, se debe incluir en la composición
de ácido nucleico. Si el patógeno infecta en el interior de la
célula, para el que la presente invención es particularmente útil, o
en el exterior de la célula, es improbable que todos los antígenos
patógenos produzcan una respuesta protectora. Debido a que el ADN y
el ARN son ambos relativamente pequeños y se pueden producir de
forma relativamente fácil, la presente invención proporciona la
ventaja adicional de permitir la vacunación con antígenos de
patógeno múltiples. La composición de ácido nucleico utilizada en la
vacuna genética puede incluir material genético que codifica muchos
antígenos patógenos. Por ejemplo, se pueden incluir varios genes
víricos en una sola construcción, proporcionando de este modo varias
dianas. Además, se pueden preparar los inoculadores múltiples que se
pueden administrar a diferentes células en un individuo para incluir
conjuntamente, en algunos casos, una serie completa de genes o, más
preferentemente, una serie incompleta, p. ej., casi completa en la
vacuna. Por ejemplo, una serie completa de genes víricos se puede
administrar utilizando dos construcciones que contienen cada una una
mitad diferente del genoma que se administran en puntos diferentes.
Así pues, se puede provocar una respuesta inmunitaria contra cada
antígeno sin riesgo de que se acople el virus infeccioso. Este
permite la introducción de más de un solo antígeno diana y puede
eliminar el requisito de que se identifiquen los antígenos
protectores.
La facilidad de manejo y la naturaleza económica
del ADN y del ARN permiten además medios más eficaces de
identificación de antígenos protectores. Los genes se pueden
clasificar y analizar sistemáticamente mucho más fácilmente que las
proteínas. Una vez se seleccionan los agentes y organismos patógenos
para los que se busca una vacuna protectora, se identifica a
continuación una proteína inmunógena. Las Tablas 1 y 2 incluyen
listas de algunos de los agentes y organismos patógenos para los que
se pueden preparar vacunas genéticas para proteger a un individuo de
la infección por ellos. Los procedimientos para inmunizar a un
individuo contra un patógeno se pueden dirigir particularmente
contra VIH, HTLV o HBV.
Se describe también en esta memoria un
procedimiento para comunicar una respuesta inmunitaria protectora de
amplia base contra células hiperproliferantes que son
características de enfermedades hiperproliferantes, así como un
procedimiento para el tratamiento de individuos que padecen
enfermedades hiperproliferantes. Tal como se utiliza en esta
memoria, la expresión "enfermedades hiperproliferantes" se
refiere a aquellas enfermedades y trastornos caracterizados por la
proliferación de las células. Ejemplos de enfermedades
hiperproliferantes incluyen todas las formas de cáncer y
psoriasis.
Se ha descubierto que la introducción de una
composición de ácido nucleico que incluye una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína asociada a una "célula
hiperproliferante" inmunógena en las células de un individuo, da
como resultado la producción de estas proteínas en las células
vacunadas de un individuo. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "proteína asociada hiperproliferante" se refiere a
las proteínas que están relacionadas con una enfermedad
hiperproliferante. Para inmunizar contra enfermedades
hiperproliferantes, se administra a un individuo una composición de
ácidos nucleicos que incluye una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que está relacionada con una enfermedad
hiperproliferante.
Para que la proteína asociada hiperproliferante
sea una diana inmunógena eficaz, debe ser una proteína que se
produzca exclusivamente o en grandes concentraciones en las células
hiperproliferantes en comparación con las células normales. Los
antígenos diana incluyen dichas proteínas, fragmentos de las mismas
y péptidos que comprenden al menos un epítopo que se encuentra en
dichas proteínas. En algunos casos, una proteína hiperproliferante
asociada es el producto de una mutación de un gen que codifica una
proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a
la proteína normal excepto que tiene una secuencia de aminoácidos
ligeramente diferente que produce diferentes epítopos que no se
encuentran en la proteína normal. Dichas proteínas diana incluyen
aquellas que son proteínas codificadas por oncogenes tales como
myb, myc, fyn y los genes de transposición
bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk
y EGRF. Además de los productos del oncogén como antígenos diana,
las proteínas diana para tratamientos anticancerosos y regímenes
protectores incluyen varias zonas variables de anticuerpos
preparados por los linfomas de linfocitos B y zonas variables de
receptores de linfocitos T de los linfomas de linfocitos T que, en
algunas formas de realización, se utilizan también como antígenos
diana para las enfermedades autoinmunitarias. Se pueden utilizar
otras proteínas relacionadas con el tumor como proteínas diana,
tales como las proteínas que se encuentran en concentraciones
mayores en las células tumorales, incluyendo la proteína reconocida
por el anticuerpo monoclonal 17-1A y las proteínas
que se unen al folato.
Aunque la presente invención se puede utilizar
para inmunizar a un individuo contra una o más de las diversas
formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para
inmunizar profilácticamente a un individuo que está predispuesto a
desarrollar un determinado cáncer o que ha tenido cáncer y es por lo
tanto susceptible a una recaída. Los desarrollos en genética y
biotecnología, así como en epidemiología, permiten la determinación
de la probabilidad y de la evaluación de riesgo para el desarrollo
del cáncer en un individuo. Utilizando la identificación genética
y/o los antecedentes sanitarios familiares, es posible predecir la
probabilidad de que un determinado individuo pueda desarrollar
cualquiera de los diversos tipos de cáncer.
Asimismo, los individuos que han desarrollado ya
cáncer y que han sido tratados para eliminar el cáncer o están si no
en remisión, son particularmente susceptibles de recaer y reincidir.
Como parte de un régimen de tratamiento, dichos individuos pueden
ser inmunizados contra el cáncer del que han sido diagnosticados o
que ha habido que combatir dicha recaída. Así pues, una vez se sabe
qué individuos han padecido un tipo de cáncer y están en riesgo de
recaída, pueden ser inmunizados para preparar sus sistemas
inmunitarios para combatir cualquier aparición futura del
cáncer.
Se describe también en esta memoria un
procedimiento de tratamiento de los individuos que padecen
enfermedades hiperproliferantes. En dichos procedimientos, la
introducción de las composiciones con ácidos nucleicos sirve como
agente inmunoterapéutico, dirigiendo y activando el sistema
inmunitario del individuo para combatir las células
hiperproliferantes que producen la proteína diana.
Se ha dado a conocer un procedimiento de
tratamiento de los individuos que padecen enfermedades y trastornos
autoinmunitarios comunicando una respuesta inmunitaria protectora de
amplia base contra dianas que están relacionadas con la
autoinmunidad, incluyendo los receptores celulares y las células que
producen anticuerpos "auto"-dirigidos.
Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por
linfocitos T incluyen la artritis reumatoide (RA), la esclerosis
múltiple (MS), el síndrome de Sjogren, la sarcoidosis, la diabetes
mellitus dependiente de la insulina (IDDM), la tiroiditis
autoinmunitaria, la artritis reactiva, la espondiloartritis
anquilosante, la esclerodermia, la polimiositis, la dermatomiositis,
la psoriasis, la vasculitis, la granulomatosis de Wegener, la
enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Cada una de estas
enfermedades está caracterizada por los receptores de los linfocitos
T que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada
inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunitarias. La vacunación
contra la zona invariable de los linfocitos T provocaría una
respuesta inmunitaria que incluye las CTL para eliminar aquellos
linfocitos T.
En la RA, se han caracterizado varias zonas
específicas variables de los receptores de los linfocitos T (TCR)
que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen
V\beta-3, V\beta-14,
V\beta-17 y V\alpha-17. Así
pues, la vacunación con una composición de ácido nucleico que
codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta
inmunitaria que dirigirá los linfocitos T implicados en la RA.
Véase: Howell, M.D., et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al.,
1991 Science 253 : 325-329; Williams, W.V.,
et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:
326-333; cada una de las cuales se incorpora a esta
memoria como referencia.
En la MS, se han caracterizado varias zonas
específicas variables de los receptores de las TCR que están
implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen
V\beta-7 y V\alpha-10. Así pues,
la vacunación con una composición de ácido nucleico que codifica al
menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que
se dirigirá a los linfocitos T implicados en la MS. Véase:
Wucherpfenning, K.W., et al., 1990 Science 248:
1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990
Nature 345: 344-346; cada una de las cuales
se incorpora a esta memoria como referencia.
En la esclerodermia, se han caracterizado varias
zonas específicas variables de los receptores de las TCR que están
implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen
V\beta-6, V\beta-8,
V\beta-14, y V\alpha-16,
V\alpha-3C, V\alpha-7,
V\alpha-14, V\alpha-15,
V\alpha-16, V\alpha-28 y
V\alpha-12. Así pues, la vacunación con una
composición de ácido nucleico que codifica al menos una de estas
proteínas provocará una respuesta inmunitaria que se dirigirá a los
linfocitos T implicados en la esclerodermia.
Para tratar los pacientes que padecen una
enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, en particular
aquellos cuya zona variable de la TCR ha de ser caracterizada
todavía, se puede realizar una biopsia sinovial. Se pueden tomar
muestras de los linfocitos T presentes y de la zona variable de las
TCR identificada utilizando técnicas normalizadas. Se pueden
preparar vacunas genéticas utilizando esta información.
Las enfermedades autoinmunitarias mediadas por
linfocitos B incluyen el lupus (SLE), la enfermedad de Grave, la
miastenia grave, la anemia hemolítica autoinmunitaria, la
trombocitopenia autoinmunitaria, el asma, la crioglobulinemia, la
esclerosis biliar primaria y la anemia perniciosa. Cada una de estas
enfermedades está caracterizada por anticuerpos que se unen a
antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las
enfermedades autoinmunitarias. La vacunación contra la zona variable
de dichos anticuerpos provocaría una respuesta inmunitaria que
incluye las CTL para eliminar aquellos linfocitos T que producen el
anticuerpo.
Para tratar los pacientes que padecen una
enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos B, se debe
identificar la zona variable de los anticuerpos implicados en la
actividad autoinmunitaria. Se puede realizar una biopsia y se pueden
tomar muestras de los anticuerpos presentes en la zona de la
inflamación. Se puede identificar la zona variable de esos
anticuerpos utilizando técnicas normalizadas. Se pueden preparar
vacunas genéticas utilizando esta información.
En el caso de la SLE, se cree que un antígeno es
el ADN. Así pues, en pacientes que se han de inmunizar contra SLE,
se pueden identificar los anticuerpos anti-ADN en su
suero y se puede preparar una vacuna que incluya composiciones de
ácidos nucleicos que codifiquen la zona variable de dichos
anticuerpos anti-ADN encontrados en el suero.
Las características estructurales comunes entre
las zonas variables de ambas TCR y los anticuerpos son bien
conocidas. La secuencia de ADN que codifica una determinada TCR o un
anticuerpo se puede encontrar generalmente siguiendo los
procedimientos bien conocidos tales como los descritos en Kabat,
et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological
Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda
MD, que está incorporada a esta memoria como referencia. Además, se
puede encontrar un procedimiento general para la clonación de las
zonas funcionales variables en anticuerpos en Chaudhary, V.K., et
al., 1990 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1066, que se
incorpora a esta memoria como referencia.
En aspectos de la presente invención que se
refieren a la terapia genética, las composiciones de ácidos
nucleicos contienen genes de compensación o genes que codifican
proteínas terapéuticas. Ejemplos de genes de compensación incluyen
un gen que codifica la distrofina o un fragmento funcional, un gen
para compensar el gen defectuoso en los pacientes que padecen
fibrosis quística, un gen para compensar el gen defectuoso en
pacientes que padecen ADA y un gen que codifica el Factor VIII.
Ejemplos de genes que codifican proteínas terapéuticas incluyen los
genes que codifican eritropoyetina, interferón, receptor LDL,
GM-CSF, IL-2, IL-4 y
TNF. Además, se pueden administrar composiciones de ácidos nucleicos
que codifican componentes de anticuerpo de una sola cadena que se
unen de forma específica a sustancias tóxicas. En algunas formas de
realización preferidas, se proporciona el gen de distrofina como
parte de un mini-gen y se utiliza para tratar
individuos que padecen distrofia muscular. En algunas formas de
realización preferidas, se proporciona un mini-gen
que contiene una secuencia de codificación para una proteína de
distrofina parcial. Las anomalías de la distrofina son responsables
tanto de la distrofia muscular leve de Becker (BMD) y de la
distrofia muscular grave de Duchenne (DMD). En la BMD se forma
distrofina, pero su tamaño y/o cantidad son anómalos. El paciente
está poco o moderadamente débil. En la DMD no se forma ninguna
proteína y el paciente está en silla de ruedas a los 13 años y muere
normalmente a los 20 años. En algunos pacientes, particularmente en
los que padecen BMD, la proteína distrofina parcial producida por
expresión de un mini-gen administrado según la
presente invención puede proporcionar una función muscular
mejorada.
En algunas formas de realización preferidas, los
genes que codifican IL-2, IL-4,
interferón o TNF se administran a células tumorales que están
presentes o eliminadas y a continuación se reintroducen en un
individuo. En algunas formas de realización, un gen que codifica el
interferón \gamma se administra a un individuo que padece
esclerosis múltiple.
Se pueden administrar también moléculas de la
cadena complementaria y ribozimas a las células de un individuo
introduciendo una composición de ácidos nucleicos que actúa como
plantilla para las copias de dichos agentes activos. Estos agentes
inactivan o si no interfieren con la expresión de los genes que
codifican las proteínas cuya presencia es indeseable. Las
composiciones de ácidos nucleicos que contienen secuencias que
codifican moléculas de la cadena complementaria se pueden utilizar
para inhibir o impedir la producción de proteínas en las células.
Así pues, se puede eliminar o reducir la producción de proteínas
tales como los productos del oncogén. Asimismo, las ribozimas pueden
destruir la expresión génica destruyendo selectivamente el ARN
mensajero antes de que se traduzca en la proteína. Se pueden tratar
las células utilizando composiciones de ácidos nucleicos que
codifican la cadena complementaria o las ribozimas como parte de un
régimen terapéutico que implica la administración de otros productos
terapéuticos y procedimientos. Las composiciones de ácidos nucleicos
que codifican las moléculas de la cadena complementaria y las
ribozimas utilizan vectores similares a los que se utilizan cuando
se desea la producción de proteínas excepto que la secuencia de
codificación no contenga un codón de iniciación para iniciar la
traducción del ARN en la proteína.
Las ribozimas son ARN catalíticos que son capaces
de auto-escisión o de la escisión de otras moléculas
de ARN. Varios tipos diferentes de ribozimas, tales como cabeza de
martillo, horquilla, intrón tetrahimena del grupo I, cabeza de hacha
y P de RNasa son conocidos en la técnica; véase S. Edgington,
Biotechnology (1992) 10, 256-262. Las
ribozimas de cabeza de martillo tienen un punto catalítico que ha
sido cartografiado en un núcleo de menos de 40 nucleótidos. Varios
ribozimas en viroides vegetales y ARN satélites comparten una
estructura secundaria común y determinados nucleótidos conservados.
Aunque estos ribozimas sirven naturalmente como su propio sustrato,
el dominio de la enzima puede dirigirse a otro sustrato de ARN
mediante emparejamiento de bases con secuencias que flanquean al
punto de escisión conservado. Esta capacidad para acostumbrarse al
diseño de las ribozimas les ha permitido ser utilizados para la
escisión del ARN de secuencia específica; véase G. Paolella et
al., EMBO (1992), 1913-1919). Por
consiguiente la experiencia de un experto en la técnica comprende
utilizar diferentes secuencias catalíticas en varios tipos de
ribozimas, tal como la secuencia catalítica de cabeza de martillo y
diseñarlas de la manera descrita en esta memoria. Se pueden diseñar
ribozimas contra una variedad de dianas incluyendo las secuencias de
nucleótidos patógenas y secuencias oncogénicas. Las formas de
realización preferidas incluyen suficiente complementariedad para
dirigir de forma específica la transcripción de la fusión
abl-bcr mientras mantienen la eficacia de la
reacción de escisión.
El complejo molecular multifuncional de la
presente invención que contiene la composición deseada de ácidos
nucleicos se puede administrar a un individuo utilizando un
dispositivo de inyección sin aguja. El complejo molecular
multifuncional que contiene la composición deseada de ácidos
nucleicos se puede administrar simultáneamente a un individuo por
vía intradérmica, subcutánea e intramuscular utilizando un
dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección
sin aguja son bien conocidos y ampliamente disponibles. Cualquier
experto en la técnica puede utilizar, siguiendo las directrices de
esta memoria, dispositivos de inyección sin aguja para administrar
complejos moleculares multifuncionales que contienen las
composiciones deseadas de ácidos nucleicos a las células de un
individuo. Los dispositivos de inyección sin aguja son muy
aconsejables para administrar estos complejos a todos estos tejidos.
Son particularmente útiles para administrar los complejos de la
presente invención a las células de la piel y del músculo. Un
dispositivo de inyección sin aguja puede utilizarse para impulsar
los complejos de la presente invención en forma líquida, que
contienen moléculas de ADN, hacia la superficie de la piel del
individuo. El líquido es impulsado a una velocidad suficiente de
modo que en el momento del impacto con la piel, el líquido penetra
en la superficie de la piel y penetra el tejido subyacente de la
piel y del músculo. De este modo, la composición de ácido nucleico
se administra simultáneamente por vía intradérmica, subcutánea e
intramuscular.
Se puede utilizar un dispositivo de inyección sin
aguja para administrar composiciones de ácido nucleico al tejido de
otros órganos para introducir una molécula de ácido nucleico a las
células de este órgano.
Los complejos moleculares multifuncionales de la
presente invención que contienen composiciones de ácidos nucleicos
se pueden administrar directamente al individuo que se ha de
inmunizar o ex vivo en las células extraídas del individuo
que se vuelven a implantar después de la administración. Por ambas
vías, se introduce el material genético en las células que están
presentes en el cuerpo del individuo. Las vías de administración
incluyen, pero no se limitan a, la intramuscular, intraperitoneal,
intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y
oral así como por vía transdérmica o por inhalación o supositorio.
Las vías preferidas de administración incluyen la inyección
intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. La
administración de composiciones de ácido nucleico que codifican
proteínas diana puede comunicar inmunidad a las mucosas en
individuos inmunizados por un modo de administración en el que el
material se presenta a los tejidos relacionados con la inmunidad a
las mucosas. Así pues, la composición de ácidos nucleicos se puede
administrar por administración a la cavidad bucal dentro de la boca
de un individuo.
Los complejos moleculares multifuncionales que
contienen composiciones de ácido nucleico según la presente
invención comprenden generalmente entre aproximadamente 1 nanogramo
y aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. En algunas formas de
realización preferidas, los complejos contienen entre
aproximadamente 10 nanogramos y aproximadamente 800 microgramos de
ADN. En formas de realización más preferidas, los complejos
contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500
microgramos de ADN. En formas de realización todavía más preferidas,
los complejos contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente
350 microgramos de ADN. En formas de realización aún más preferidas,
los complejos contienen entre aproximadamente 25 y aproximadamente
250 microgramos de ADN. En las formas de realización más preferidas,
los complejos contienen aproximadamente 100 microgramos de ADN.
Los complejos moleculares multifuncionales que
contienen composiciones de ácidos nucleicos según la presente
invención se formulan según el modo de administración que se ha de
utilizar. Cualquier experto en la técnica puede formular fácilmente
una composición farmacéutica que comprenda una composición de ácidos
nucleicos. En los casos en los que el modo de administración
seleccionado es la inyección intramuscular, se utiliza
preferentemente una formulación isotónica. En general, los aditivos
para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa,
manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las
soluciones isotónicas tal como la solución salina tamponada con
fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. En algunas
formas de realización, se añade un agente de vasoconstricción a la
formulación. Las composiciones farmacéuticas según la presente
invención se preparan de modo que estén esterilizadas y exentas de
pirógenos.
Además de otros agentes que pueden funcionar como
agentes transfectantes y/o agentes de replicación, se pueden
administrar conjuntamente con los complejos de la presente invención
factores de crecimiento, citocinas y linfocinas, tales como
interferon-\alpha,
interferon-\gamma frente a factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF,
GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF),
IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-8, IL-10 e
IL-12, así como el factor de crecimiento de
fibroblastos, agentes tensioactivos tales como los complejos
estimulantes inmunitarios (ISCOMS), el adyuvante incompleto de
Freund, el análogo de LPS incluyendo el monofosforil Lípido A (MPL),
péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como el
escualeno y el ácido hialurónico se pueden utilizar también,
administrados juntamente con los complejos de la presente invención.
En algunas formas de realización, las combinaciones de estos agentes
se administran juntamente con los complejos de la presente
invención.
Los complejos de la presente invención se pueden
combinar con colágeno como emulsión y administrar por vía
parenteral. La emulsión de colágeno proporciona un medio para la
liberación lenta del ADN; se pueden utilizar entre 50 \mul y 2 ml
de colágeno. En una forma de realización preferida que utiliza esta
formulación se combinan aproximadamente 100 \mug de ADN con 1 ml
de colágeno. Otras formulaciones de liberación lenta tales como las
descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol,
texto de referencia habitual en este campo, que se incorpora a esta
memoria como referencia. Dichas formulaciones incluyen las
suspensiones acuosas, las soluciones y suspensiones de aceite, las
emulsiones e implantes así como depósitos, dispositivos de
liberación lenta y transdérmicos. En algunas formas de realización,
se prefieren las formulaciones de liberación lenta para los
complejos; en las que es deseable que el complejo se libere en un
tiempo comprendido entre 6 y 144, preferentemente entre 12 y 96
horas, más preferentemente entre 18 y 72 horas.
El individuo se puede someter a una sola
vacunación para producir una respuesta inmunitaria completa y
amplia. Como alternativa, el individuo se puede someter a una serie
de vacunaciones para producir una respuesta inmunitaria completa y
amplia. Es preferible administrar al menos dos y preferentemente
cuatro a cinco inyecciones durante un periodo de tiempo.
El periodo de tiempo entre las inyecciones puede
ser de 24 horas separadas dos semanas o más entre las inyecciones,
preferentemente separadas una semana. Como alternativa, se
administran simultáneamente en diferentes puntos al menos dos y
hasta cuatro inyecciones por separado.
Una vacunación completa puede incluir la
inyección de un solo inoculante que contiene una composición de
ácido nucleico que incluye las secuencias que codifican uno o más
epítopos dirigidos.
Como alternativa, una vacunación completa puede
incluir la inyección de dos o más inoculantes diferentes en
diferentes puntos. Por ejemplo, una vacuna contra el VIH puede
comprender dos inoculantes diferentes en los que cada uno comprende
una composición de ácido nucleico que codifica diferentes proteínas
víricas. Este procedimiento de vacunación permite la introducción,
como mucho, de una serie completa de genes víricos en el individuo
sin el riesgo de acoplar una partícula vírica infecciosa. De este
modo, se puede provocar una respuesta inmunitaria contra la mayoría
o todos los virus en el individuo vacunado. La inyección de cada
inoculante se realiza en diferentes puntos, preferentemente a una
distancia que asegure que ninguna célula recibe la combinación total
de las composiciones de ácido nucleico. Como precaución adicional de
seguridad, algunos genes pueden ser eliminados o alterados para
impedir además la capacidad del conjunto vírico infeccioso.
Según la presente invención, se proporcionan
composiciones farmacéuticas que facilitan la administración del
complejo molecular multifuncional, que a su vez funciona para
facilitar la transferencia de la composición de ácido nucleico que
está contenida en éstas, a las células diana. La composición
farmacéutica puede ser nada más que un diluyente inerte y una sal o
forma éster farmacéuticamente aceptables de dicho complejo
molecular. Sin embargo, se pueden emplear de forma adecuada otros
vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos por el especialista
en este campo, para proporcionar las propiedades deseadas. Así pues,
se pueden seleccionar uno o más agentes de entre las siguientes
clases de excipientes farmacéuticos reconocidos: disolventes,
sistemas de disolvente, solubilizantes y agentes de dispersión
incluyendo tensioactivos y agentes emulsionantes; agentes
modificadores de la viscosidad; y estabilizantes y agentes
conservantes, incluyendo antioxidantes, agentes absorbentes de UV,
agentes antibacterianos y agentes tamponantes.
Se ha dado a conocer en esta memoria kits
farmacéuticos que comprenden un recipiente que contiene una
composición de ácido nucleico y un recipiente que contiene un grupo
de transferencia. Opcionalmente, se incluyen en dichos kits
excipientes, portadores, conservantes y vehículos del tipo descrito
anteriormente con respecto a las composiciones farmacéuticas. La
expresión kit farmacéutico está destinada también a incluir
múltiples inoculantes utilizados en los métodos mencionados
anteriormente. Dichos kits incluyen recipientes independientes que
comprenden diferentes inoculantes y grupos de transferencia. Los
kits farmacéuticos se contemplan también para incluir una serie de
inoculantes utilizados en los procedimientos de inmunización y/o en
los procedimientos terapéuticos, descritos anteriormente.
Las composiciones de la presente invención son
útiles en los campos tanto de la medicina humana como veterinaria.
Por consiguiente, la presente invención se refiere al tratamiento de
inmunización genético y terapéutico de mamíferos, pájaros y peces.
Los procedimientos descritos en esta memoria pueden ser
particularmente útiles para el tratamiento de inmunización genética
y terapéutica de especies de mamíferos incluyendo las especies
humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina.
Los ejemplos indicados a continuación incluyen
demostraciones representativas de varios aspectos de la presente
invención. Los ejemplos no están destinados a limitar el alcance de
la invención; sino más bien están destinados meramente a servir como
ilustraciones de la misma. Además, cualquier experto en la técnica
será capaz de valorar fácilmente los aspectos y las formas de
realización adicionales de la presente invención, basándose en la
siguiente descripción detallada de la misma. Excepto que se indique
de otra manera, todas las temperaturas citadas en los siguientes
Ejemplos son temperaturas en la escala Celsius.
Una solución de
N^{1}-N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina
(2,92 g, 8,45 mmoles, 1,0 eq) [S. Nagarajan y B. Ganem, J. Org.
Chem., 50, 5735-37 (1985)] en acetonitrilo (125
ml) se trató con N,N-diisopropiletilamina (3,534 ml,
20,0 mmoles, 2,4 eq), yoduro potásico (2,81 g, 16,90 mmoles, 2,0 eq)
y 5-clorovaleronitrilo (1,902 ml, 16,90 mmoles, 2,0
eq). La solución homogénea resultante se calentó a reflujo durante 2
horas. Se trató la mezcla con más
N,N-diisopropiletilamina (1,767 ml, 1,2 eq), yoduro
potásico (1,4 g, 1,0 eq) y 5-clorovaleronitrilo
(0,951 ml, 1,0 eq) y se calentó a reflujo otras 18 horas. La
cromatografía en capa fina (TLC) indicó que no quedaba ningún
material de partida. Se eliminó el acetonitrilo al vacío y se
absorbió el residuo en cloroformo (250 ml). Se lavó esta solución
con agua (200 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}), y se arrastró el
disolvente para dar el producto en bruto como un aceite. Se purificó
el material en sílice utilizando un gradiente de
2-propanol en cloroformo más 1% de
N,N-diisopropiletilamina para dar un aceite (3,40
g); ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,44 (s, 20,8 H; debería ser
18 H), 1,58-1,80 (m, 9,8 H),
2,38-2,44 (m, 9,4 H; debería ser 8,0 H), 3,16 (m,
4,1 H), 4,80 (m, 0,8 H), 5,38 (m, 0,8 H).
Se trató una solución de 6 (0,77 g, 1,81 mmoles)
en ácido acético glacial (100 ml) con paladio al 5% sobre carbono
(0,08 g, 10% p/p) y se colocó en un hidrogenador Parr (gas hidrógeno
a 50 psi de presión) durante 2,75 horas. Se filtró la mezcla a
través de un filtro de tierra de diatomeas marca Celite® (enjuagado
previamente con ácido acético glacial) y se enjuagó el Celite con
cloroformo. El filtrado y el lavado con cloroformo se combinaron y
se eliminó el disolvente para dar un aceite. Se sometió el material
en bruto a cromatografía en sílice utilizando un gradiente de
metanol en cloroformo más 0,4% de diisopropiletilamina. El material
consistió en un aceite incoloro (0,32 g). ^{1}H RMN (CDCl_{3}):
\delta 1,33 (m, 3,5 H; debería ser 2,0 H), 1,44 (s, 19,1 H;
debería ser 18,0 H), 1,59 (m, 10,3 H), 2,37-2,45 (m,
6,2 H), 2,70 (t, 1,5 H), 3,14 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 0,7 H), 5,57 (m,
0,8 H).
Se agitó el compuesto 7 (0,200 g, 0,46 mmoles)
con ácido trifluoracético (5 ml) a temperatura ambiente durante 2
horas. Se eliminó el ácido trifluoracético al vacío, seguido de tres
adiciones de cloroformo y posteriores evaporaciones al vacío. El
aceite en bruto resultante se extrajo dos veces en HCl 0,1 N (30 ml)
y se liofilizó para dar 8 como un sólido hidroscópico (0,19 g).
Una solución de
galactosil-\beta1'-4-tioglucósido
de
S-\beta-3'-propionil
hepta-O-acetilo [M. Elofsson, S.
Roy, B. Walse y J. Kihlberg, Carb. Res., 246,
89-103 (1993)] (4,60 g, 6,35 mmoles) en
isopropanol/cloroformo 1:1 (100 ml) se trató con
N-hidroxisuccinimida (0,73 g, 6,35 mmoles) y
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (1,31 g, 6,35 mmoles).
Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas, se enfrió
la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el disolvente
del filtrado al vacío para dar un sólido blanco que se recristalizó
en 2-propanol (3,43 g). El producto aislado era del
92% de pureza por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 2,0-2,16 (7s,
21,0 H), 2,85 (s, 3,8 H), 2,85-3,1 (m, 4,2 H), 3,65
(m, 0,7 H), 3,78 (t, 1,0 H), 3,88 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,54
(m, 2,8 H), 4,97 (m, 1,8 H), 5,11 (m, 1,0 H), 5,23 (t, 1,0 H), 5,36
(d, 0,7 H).
Se trató una solución de 10 (0,300 g, 0,70
mmoles) en cloruro de metileno (30 ml) con una solución de 7 (0,57
g, 0,70 mmoles) en cloruro de metileno (30 ml). Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante 18 horas. Se eliminaron los disolventes
al vacío. La cromatografía en sílice utilizando un gradiente de
2-propanol en cloroformo dio el producto purificado
como un cristal incoloro (0,49 g); pureza del 100% determinada por
HPLC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,33 (m, 3,0 H; debería ser
2,0 H), 1,44 (s, 20,0 H; debería ser 18,0 H), 1,54 (m, 10,7 H;
debería ser 6,0 H), 1,68 (m, 2,0 H), 1,97-2,16 (7s,
27,3 H; debería ser 21,0 H), 2,25 (m, 6,0 H; debería ser 4H), 2,52
(m, 9,0 H; debería ser 8,0 H), 2,84 (m, 1,0 H), 3,01 (m, 1,0 H),
3,1-3,27 (m, 6,7 H), 3,64 (m, 1,0 H), 3,80 (t, 1,0
H), 3,90 (t, 1,0 H), 4,11 (m, 4,0 H), 4,55 (d, 2,0 H), 4,70 (d, 1,0
H), 4,91-5,0 (m, 3,0 H; debería ser 2,0 H), 5,11 (m,
1,3 H), 5,21 (t, 1,0 H), 5,36 (d, 1,0 H), 5,44 (m, 0,7 H), 6,28 (m,
0,7 H). Espec. de masas FAB MH^{+} = 1138.
Se trató el compuesto 11 (0,200 g, 0,18 mmoles)
con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente
durante 2 h. Se eliminó al vacío en su mayor parte el ácido
trifluoracético (TFA) y se sometió el residuo a tres adiciones de
cloroformo, seguidas de la eliminación del disolvente al vacío. Se
recuperó el producto en forma de aceite (0,22 g) con vestigios de
TFA visibles; se determinó la pureza del 100% por HPLC. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}): \delta 1,25-1,53 (m, 5,5 H),
1,6-2,0 (m, 5,5; debería ser 4 H),
2,00-2,15 (7 s, 23,0 H; debería ser 21,0 H), 2,56
(m, 1,0 H), 2,68 (m, 1,3 H), 2,80 (m, 1,0 H),
3,0-3,4 (m, 11,0 H; debería ser 10,0 H), 3,64 (m,
1,0 H), 3,79 (m, 1,0 H), 3,94 (m, 1,0 H), 4,11 (m, 2,5 H), 4,55 (m,
1,5 H), 4,70 (m, 1,3 H), 4,90-5,20 (m amplia, 16,0
H; hinchado por agua; debería ser 2,0 ó 4,0 H), 5,36 (m, 1,0 H),
7,12 (m, 0,5 H), 7,86 (m, 2,3 H), 8,07 (m, 2,3 H), 9,8 (m, 0,5
H).
Se trató una solución de 12 (0,20 g; 0,18 mmoles)
en metanol (20 ml) con carbonato de sodio (0,38 g; 3,08 mmoles; 18
eq) y agua (35 ml) para una solución homogénea. Después de 6 h a
temperatura ambiente, se evaporaron los disolventes y se desaló el
residuo utilizando una resina de filtración de gel en medio Sephadex
G-25, y ácido acético glacial al 1% como eluyente.
Se combinaron el producto que contiene las fracciones y se liofilizó
para dar un producto puro como sal de triacetato (0,10 g); pureza
del 100% determinada por HPLC. ^{1}H RMN (DMSO-
d_{6} D_{2}O): \delta 1,15 (m o t ancho, 1,5 H),
1,3-1,5 (m, 8,0 H), 1,65 (m, 2,0 H), 1,66 (s, 14,0
H; debería ser 9,0 H), 2,34 (m, 6,5 H), 2,60 (m, 3,0 H; debería ser
2,0 H), 2,74 (m, 6,0 H), 3,00 (m, 3,0 H), 3,27 (m, 3,5 H), 3,40 (m,
1,5 H), 3,47 (m, 2,0 H), 3,50 (m, 1,0), 3,60 (m, 1,0 H), 3,71 (d,
1,0 H), 4,14 (s ancho, enmascarado por un pico de agua), 4,27 (m,
4,0 H).
Con fines comparativos, la denominación en estilo
CAS del compuesto 18 indicado anteriormente es la siguiente: sal
acetato de
4-[(N^{2}-[N^{2},N^{6}-bis(3-[4-O(\beta-D-galactopiranosil)-\beta-D-glucopiranosiltio]propionil)lisil]N^{6}-(3-[4-O-(\beta-D-galactopiranosil)-\beta-D-glucopiranosiltio]-propionil)lisinamido)pentil]-1,8-diamino-4-azaoctano.
Se añadió
N,N-diisopropiletilamina (0,336 ml, 1,95 mmoles, 3,0
eq) y el compuesto 10 (1,859, 2,25 mmoles) a una solución de
lisil-lisina (0,25 g, 0,64 mmoles) en
agua/acetonitrilo 1:1 (100 ml) y se agitó a temperatura ambiente
durante unos pocos minutos hasta conseguir la homogeneidad. Se
controló el pH con cuidado a intervalos regulares, y se añadió
N,N-diisopropiletilamina según se necesitaba para
mantener el pH entre 7 y 8. Se añadió un total de 7 eq de base
durante 1 hora antes de que se estabilizase el pH entre 7 y 7,5. Se
utilizó la HPLC en fase inversa para seguir la evolución de la
reacción. Después de 24 h a temperatura ambiente, la reacción
pareció que se había interrumpido con aproximadamente la formación
de 50% de producto. Se evaporó el acetonitrilo al vacío y se trató
la mezcla acuosa con HCl diluido (pH 5). Se extrajo la solución en
cloroformo (2 \times 200 ml). Se secaron (Na_{2}SO_{4}) las
capas orgánicas combinadas y se eliminó el disolvente al vacío para
dar el producto en bruto como un cristal (2,17 g). Se sometió el
material a cromatografía de flash en sílice utilizando un gradiente
de isopropanol en cloroformo más 1% de ácido acético glacial como
eluyente (1,09 g). Se determinó la pureza por HPLC que fue
aproximadamente del 96%. Espec. de masas FAB: MH+ = 2394.
Una solución de
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)-lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina
(1,00 g, 0,42 mmoles) en isopropanol/cloroformo 1:1 (20 ml) se trató
con N-hidroxisuccinimida (48,1 mg, 0,42 mmoles) y
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (86,2 mg, 0,42
mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas,
se enfrió la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el
disolvente del filtrado al vacío y se recristalizó el producto en
2-propanol. Se recogió el producto por filtración y
se secó al vacío para dar un sólido en polvo blanco (0,76 g). Este
material se demostró por HPLC que consistía en una mezcla del ácido
libre de partida y del éster de succinimidilo en una proporción de
aproximadamente 1:2 respectivamente. La mezcla no se sometió a
purificación adicional, sino que se utilizó en la siguiente etapa.
^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 1,96-2,20 (s
múltiple, 86,4 H; debería ser 63,0 H), 2,28 (m, 3,6 H), 2,53 (m, 6,6
H), 2,88 (m, 6,6 H), 3,02 (m, 3,6 H), 3,18-3,40 (m,
4,2 H), 3,62 (m, 3,6 H), 3,85 (m, 3,6 H), 3,95 (m, 3,6 H), 4,10 (m,
12,0 H), 4,57 (m, 6,0 H), 4,70 (m, 4,2 H), 5,02 (m, 7,2 H), 5,10 (m,
3,6 H), 5,20 (t, 3,6 H), 5,36 (d, 3,0 H), 6,31 (t, 0,6 H), 6,58 (t,
0,6 H), 6,90 (d, 0,6 H), 7,47 (d, 0,6 H).
Se trató una solución de 7 (87 mg, 0,20 mmoles)
en cloruro de metileno (20 ml) con una solución de 15 (0,76 g de la
mezcla al 66%, correspondiente a 0,50 g del éster; 0,20 mmoles) en
cloruro de metileno (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 h, seguido de eliminación del disolvente al
vacío. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en sílice
utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo. El producto
impuro resultante constaba de una mezcla 65:35 de producto al ácido
libre presente como contaminante en el éster de partida. Una segunda
columna de sílice que utiliza el mismo gradiente más ácido acético
glacial al 0,5% aisló de forma eficaz el producto puro (0,38 g);
pureza del 100% determinada por HPLC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}):
\delta 1,30-1,39 (m, 4,0 H), 1,44 (s, 13,5 H;
debería ser 18,0 H), 1,53 (m, 8,6 H), 1,60-1,90 (m,
6,1 H), 1,97-2,16 (s múltiple, 73,8 H; debería ser
63,0 H), 2,27 (m, 3,7 H), 2,49-2,70 (m, 8,0 H), 2,85
(m, 2,5 H), 3,00 (m, 2,5 H), 3,23 (m, 6,2 H), 3,65 (m, 2,5 H),
3,80-3,93 (m, 5,5 H), 4,12 (m, 8,0 H),
4,20-4,40 (m, 1,8 H), 4,57-4,69 (m,
8,0 H), 4,91-5,00 (m, 5,5 H), 5,09 (m, 3,1 H), 5,21
(t, 3,1 H), 5,36 (d, 2,5 H), 6,57 (m, 0,9 H), 6,95 (m, 0,6 H), 7,20
(m, 0,6 H).
El compuesto 16 (0,170 g, 0,059 mmoles) se trató
con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente
durante 2,5 horas. Se eliminó la mayor parte del ácido
trifluoracético al vacío (0,19 g). Se determinó la pureza por HPLC
que fue aproximadamente del 100%. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta
1,20-1,80 (m, 4,8 H), 1,96-2,15 (s
múltiple, 84,0 H; debería ser 63,0 H), 2,54 (m, 12,0 H; posiblemente
hinchado por un pico de agua), 3,65 (m, 3,0 H), 3,81 (m, 3,0 H),
3,93 (m, 4,0 H), 4,12 (m, 12,0 H), 4,29 (m, 2,0 H), 4,55 (m, 6,0 H),
4,69 (m, 4,0 H), 4,89 (m, 3,0 H), 5,09 (m, 6,0 H), 5,19 (m, 4,0 H),
5,38 (d, 3,0 H), 6,99 (m, 1,0 H), 7,60 (m, 0,5 H), 7,91 (m, 1,0 H),
8,09 (m, 1,0 H).
A una solución de 17 (0,17 g, 0,059 mmoles) en
metanol (20 ml) se añadió carbonato sódico (0,37 g, 2,95 mmoles),
seguido de agua (40 ml) hasta conseguir la homogeneidad. Después de
agitar a temperatura ambiente durante 4 h, se arrastraron los
disolventes y se eluyó el producto en bruto en una columna con medio
de Sephadex G-25 utilizando ácido acético glacial al
1% como eluyente. Las fracciones que contienen producto se
combinaron y se liofilizaron para dar el producto puro como un
sólido sumamente higroscópico (0,07 g).
Una solución de
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)
lisina (1,00 g, 0,42 mmoles) en isopropanol/cloroformo 1:1 (20 ml)
se trató con N-hidroxi-succinimida
(48,1 mg, 0,42 mmoles) y
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (86,2 mg, 0,42
mmoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 19 horas,
se enfrió la mezcla a 4ºC durante 1 h y se filtró. Se eliminó el
disolvente del filtrado al vacío y se recristalizó el producto en
2-propanol. Se recogió el producto por filtración y
se secó al vacío para dar un sólido en polvo blanco (0,76 g). Este
material se demostró por HPLC que consistía en una mezcla del ácido
libre de partida y del éster succinimidílico en una proporción de
aproximadamente 1:2 respectivamente. La mezcla no se sometió a
purificación adicional, sino que se utilizó en la siguiente
etapa.
Se trató una solución de 7 (87 mg, 0,20 mmoles)
en cloruro de metileno (20 ml) con una solución de 20 (0,769 g de la
mezcla al 66%, correspondiente a 0,50 g del éster; 0,20 mmoles) en
cloruro de metileno (20 ml). Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 h, seguido de la eliminación del disolvente al
vacío. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en sílice
utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo. El producto
impuro resultante estaba constituido por una mezcla 65:35 de
producto a ácido libre presente como contaminante en el éster de
partida. Una segunda columna de sílice que utiliza el mismo
gradiente más ácido acético glacial al 0,5% aisló de forma efectiva
el producto puro (0,38 g); pureza del 100% determinada por HPLC.
Se trató el compuesto 21 (0,170 g, 0,059 mmoles)
con ácido trifluoracético (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente
durante 2,5 horas. Se eliminó la mayor parte del ácido
trifluoracético al vacío (0,19 g). Se determinó la pureza por HPLC
que fue aproximadamente del 100%.
A una solución de 22 (0,17 g, 0,059 mmoles) en
metanol (20 ml) se añadió carbonato sódico (0,37 g, 2,95 mmoles),
seguido de agua (40 ml) hasta conseguir la homogeneidad. Después de
agitar a temperatura ambiente durante 4 h, se arrastraron los
disolventes y se eluyó el producto en bruto en una columna con medio
G-25 de Sephadex utilizando ácido acético glacial al
1% como eluyente. Las fracciones que contenían el producto se
combinaron y se liofilizaron para dar el producto puro como un
sólido sumamente higroscópico (0,07 g).
A una solución de 7 (0,20 g, 0,47 mmoles) en 20
ml de acetonitrilo y 10 ml de agua se añadió 160 mg de succinimidil
D-biotina. Se agitó la solución durante 18 h. Se
redujo el volumen de la solución a 15 ml al vacío y se purificó la
solución restante en sílice ligada a octadecilsililo utilizando un
gradiente agua/acetonitrilo que contiene ácido trifluoracético al
0,1%. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se
eliminó el disolvente al vacío para dar un sólido blanco céreo
(pureza del 94% por HPLC). Se añadió al sólido blanco 10 ml de
2-propanol y 10 ml de HCl 4 N en dioxano. Se
eliminaron los disolventes al vacío. El sólido blanco resultante se
redisolvió en agua y se secó al vacío para dar una espuma
higroscópica (0,11 g). ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}):
\delta 1-31 (m, 4 H), 1,44 (m, 6 H), 1,64 (m, 8
H), 2,09 (m, 4 H), 2,63 (d, 2 H), 2,91 (m, 4 H), 3,06 (m, 8 H), 4,18
(m, 1 H), 4,36 (m, 1 H).
A una solución de 7 (0,20 g, 0,47 mmoles) en 20
ml de cloruro de metileno se añadió 210 mg de cloroformato de
colesterilo y 200 \mul de diisopropiletilamina. Se agitó la
solución durante 24 h. Se eliminó el cloruro de metileno al vacío,
se redisolvió el aceite restante en cloroformo y se purificó en
sílice utilizando un gradiente metanol/cloroformo que contenía 0,1%
de diisopropiletilamina. Se combinaron las fracciones que contenían
el producto y se eliminó el disolvente al vacío para dar un sólido
blanco céreo (0,29 g). Se añadió al sólido blanco 10 ml de
2-propanol y 10 ml de HCl 4 N en dioxano. Se
eliminaron los disolventes al vacío. El sólido blanco resultante se
redisolvió en agua y se secó al vacío para dar un sólido blanco
céreo (0,15 g).
A una solución de
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(1,0 g, 2,89 mmoles) en acetona (100 ml) se añadió
N,N-diisopropiletilamina (0,605 ml, 3,47 mmoles, 1,2
eq), yoduro potásico (0,489, 2,89 mmoles) y
1-bromooctano (0,500 ml, 2,89 mmoles). Se calentó la
mezcla a reflujo durante una hora, seguido de adición de
N,N-diisopropiletilamina (0,605 ml, 3,47 mmoles) y
yoduro potásico (0,48 g, 2,89 mmoles). Después de otras 3 h a
reflujo, se añadió 1-bromooctano (0,500 ml, 2,89
mmoles) y se continuó a reflujo durante otra hora. Se evaporó la
acetona al vacío. Se absorbió el residuo en cloroformo (125 ml) y se
lavó con agua (2 \times 75 ml). Se secó (Na_{2}SO_{4}) la
capa orgánica y se eliminó el disolvente al vacío para dar un
líquido. Se purificó el líquido por cromatografía en sílice
utilizando un gradiente de isopropanol en cloroformo más 1% de
N,N-diisopropil-etilamina. Se
recuperó el producto puro como un aceite naranja pálido (0,59 g).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 3,5 H), 1,27 (m, 14,2
H; debería ser 16,0 H), 1,44 (s, 18,7 H), 1,58 (m, 1,6 H), 1,82 (m,
1,6 H), 2,37 (m, 2,4 H), 2,44 (m, 2,2 H), 3,19 (m, 4,0 H), 4,84 (m,
0,3 H), 5,62 (m, 0,3 H).
N^{4}-octil-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,15 g) se disolvió en 6 ml de HCl 4 N en dioxano y se agitó a
temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente al vacío
y el aceite amarillo se puso en suspensión en cloroformo y se
eliminó el disolvente al vacío. Se disolvió el aceite resultante en
10 ml de etanol absoluto y se precipitó mediante adición de 30 ml de
éter dietílico. Se aisló el sólido por decantación del líquido y
secado al vacío (0,10 g). ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}):
\delta 0,86 (m, 3 H), 1,28 (m, 10 H), 1,58-1,80
(m, 6 H), 2,00 (m, 2H), 2,80 (m, 2 H), 2,89 (m, 2 H), 3,03 (m, 4 H),
3,15 (m, 2 H), 8,01 y 8,13 (dos m, 5 H, debería ser 6 H). Anal:
Calculado para C_{15}H_{38}Cl_{3}N_{3} C 49,11, H 10,44, N
11,45. Obtenido C 48,57, H 10,75, N 11,29.
Se trató una solución de
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,50 g, 1,45 mmoles) en acetona (50 ml) con
N,N-diisopropiletilamina (0,604 ml, 3,48 mmoles),
yoduro potásico (0,48 g, 2,90 mmoles) y
1-bromododecano (0,348 ml, 2,90 mmoles). La mezcla
se calentó a reflujo durante 18 horas y se trató con
1-bromododecano (0,348 ml, 2,90 mmoles). Se continuó
calentando a reflujo durante 4 horas. Se eliminó la acetona a
presión reducida y se absorbió el residuo en cloroformo (250 ml). Se
lavó la solución con agua (2 \times 100 ml). Se secó
(Na_{2}SO_{4}) la capa orgánica y se eliminó el disolvente al
vacío para dar un producto en bruto. Se purificó el líquido por
cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol en
cloroformo más 0,4% de N,N-diisopropiletilamina. Se
recuperó el producto puro como un aceite de 0,52 g de masa. ^{1}H
RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 3,0 H), 1,26 (s ancho, 21,0 H;
debería ser 20,0 H), 1,44 (s, 20,5 H; debería ser 18,0 H), 1,64 (m,
5,8 H), 2,37 (m, 3,8 H), 2,46 (t, 2,5 H), 3,15 (m, 4,0 H), 4,84 (m,
0,5 H), 5,62 (m, 0,8 H).
Se disolvió la
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-N^{4}-dodecil-espermidina
(0,52 g, 1,01 mmoles) en 2-propanol (5 ml) y se
trató con HCl 4 N en dioxano (10 ml). Se agitó la solución homogénea
a temperatura ambiente durante 20 h y se evaporaron los disolventes
a presión reducida. Se absorbió el aceite en bruto en etanol (20 ml)
y se trató con éter (10 a 15 ml) en agitación. Precipitó un sólido
de la solución y se recogió por filtración (85 mg). Se recuperó una
segunda recogida de 79 mg adicionales. El rendimiento total fue 164
mg. ^{1}H RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,86 (t, 2,3
H), 1,25 (m, 18,0 H), 1,63 (m, 3,7 H), 1,76 (m, 2,3 H), 1,99 (m, 1,3
H), 2,79 (m, 2,0 H), 2,90 (m, 2,0 H), 3,02 (m, 3,7 H), 3,16 (m, 2,3
H), 8,03 (m, 1,7 H), 8,14 (m, 2,7 H).
Se trató una solución de
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,50 g, 1,45 mmoles) en acetona (50 ml) con
N,N-diisopropiletilamina (0,302 ml, 1,74 mmoles, 1,2
eq), yoduro potásico (0,24, 1,45 mmoles) y
1-bromohexadecano (0,442 ml, 1,45 mmoles). Se
calentó la mezcla a reflujo durante 20 horas y se eliminaron los
disolventes al vacío. Se absorbió el residuo en cloroformo (250 ml)
y se lavó con agua (150 ml). Se secó (Na_{2}SO_{4}) la capa
orgánica y se evaporó el disolvente a presión reducida para dar el
producto en bruto en forma de aceite ámbar. Se purificó el material
por cromatografía en sílice utilizando un gradiente de isopropanol
en cloroformo más 0,4% de
N,N-diisopropil-etilamina. Se
recuperó el producto puro como un aceite amarillo pálido de 0,42 g
de masa. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 0,88 (t, 2,9 H), 1,26 (s
ancho, 30,3 H; debería ser 28,0 H), 1,44 (s, 22,9 H; debería ser
18,0 H), 1,60 (m, 4,0 H), 1,72 (m, 1,7 H), 2,37 (m, 3,7 H), 2,46 (m,
2,9 H, debería ser 2,0 H), 3,17 (m, 4,0 H), 4,83 (m, 0,6 H), 5,62
(m, 0,6 H).
Se disolvió la
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-N^{4}-dodecil-espermidina
(0,42 g, 0,74 mmoles) en 2-propanol (5 ml) y se
trató con HCl 4 N en dioxano (10 ml). Se agitó la solución homogénea
a temperatura ambiente durante 1,5 h, seguido de evaporación de los
disolventes a presión reducida. Se absorbió el residuo en etanol (12
ml) y se trató con éter (10 ml) en agitación. Se formó un
precipitado en la solución y se recogió por filtración 125 mg de
masa. Se recuperó una segunda recogida de 75 mg para un rendimiento
total de 0,200 g. ^{1}H RMN (DMSO- d_{6} +
D_{2}O): \delta 0,83 (t, 2,1 H; debería ser 3,0 H), 1,22 (m,
26,6 H), 1,54-1,70 (m, 6,0), 1,96 (m, 1,7 H), 2,81
(m, 1,7 H), 2,89 (m, 2,1 H), 3,04-3,12 (m, 6,0
H).
Se cultivaron células HuH7 de carcinoma
hepatocelular humano y se sembraron en una placa de 96 pocillos con
1-2 \times 10^{4} células en 100 \mul de
modificación con suero al 10% del medio \alpha mínimo esencial. Se
incubaron las placas en un incubador con CO_{2} a 37ºC hasta que
las células fueron confluentes del 60 al 80% (aproximadamente 24 h).
Se eliminó el medio y se lavaron las células una vez con Optimem®
(medio exento de suero). Se añadió a las células Optimem® (100
\mul) conteniendo 0,5 \mug de plásmido pCMV\beta (de
Clonetech, nº 6177-1), 0,5 \mug de
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionilgalactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)-espermidina
y 2,5 \mug de
N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)-aminopentil)espermidina.
Se incubaron las células con la mezcla durante 4 h en un incubador
con CO_{2} a 37ºC; a continuación se añadió 100 \mul de medio
conteniendo suero al 20% y la incubación continuó durante otras 20
h. Se analizó la actividad de \beta-galactosidasa
en las células lisadas con 0,5% de NP-40 en NaCl 140
mM, tris 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM utilizando
o-nitrofenil
\beta-D-galactopiranosido y dio
A_{405}= 1,35 después de 30 min. Se cultivaron las células en
placas de 6 pocillos (25 mm de diámetro) y se trataron de igual
modo, se fijaron con paraformaldehído al 2% y se analizó la
actividad de \beta-galactosidasa utilizando
\beta-D-galactopiranosido de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, 1989). La inspección visual demostró
que entre el 5 y el 10% de las células se transfectaron según se
probó por microscopía óptica. Se obtuvieron resultados similares
cuando el componente de enlace específico del receptor del complejo
molecular multifuncional se retiró del cultivo celular, aunque
manteniendo el componente activador de la destrucción de la membrana
del endosoma del complejo molecular multifuncional.
Se obtuvieron resultados similares con
N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)aminopentil)espermidina;
y
N^{4}-(5-(metiltetrahidrofolil)aminopentil)-espermidina;
con los componentes activadores de la destrucción de la membrana del
endosoma incluidos en éste. Se pueden obtener resultados similares
con N^{4}-octil-espermidina;
N^{4}-dodecilespermidina; péptidos fusógenos
acilados con el terminal N mediante
N^{4}-(5-carboxipentil)espermidina; amida
de
N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina,
con los componentes del enlace específico del receptor incluidos en
éste.
Se prepararon soluciones conteniendo 100 \mug
de plásmido pCMV\beta y 100 \mug de
N^{4}-octilespermidina,
N^{4}-dodecilespermidina o
N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)-aminopentil)espermidina,
cada uno en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato. Se
inyectó la solución del plásmido (100 \mul) en el cuádriceps
trasero de ratones BALB-C de 6 a 12 semanas de vida.
Se sacrificaron los ratones aproximadamente 96 h después y se
eliminó el tejido muscular del cuádriceps completo. Se fijó el
músculo con formalina durante 2 h y se analizó la actividad de
\beta-galactosidasa utilizando
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido
(1 mg/ml en tris/EDTA pH 8,5). Las tres inyecciones se calificaron
como positivas ya que el color azul era más intenso que el de la
referencia: inyección de 100 \mug de plásmido pCMV\beta
inyectado en 100 \mul de hidrocloruro de bupivicaína al 0,25% en
tampón de citrato pH 6,0. Se pueden obtener también resultados
similares con péptidos fusógenos acilados en el terminal N por
N^{4}-(5-carboxipentil)espermidina y la
amida de
N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina.
Se prepara una solución conteniendo 10 \mug de
plásmido pHBVSA, 5 \mug de
N^{4}-(5-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-aminopentil)espermidina
y 25 \mug de
N^{4}-(5-colesteno-3'\beta-oxicarbonil)aminopentil)espermidina
en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato. La solución
del plásmido (100 \mul) se inyecta en la vena de la cola de
ratones BALB-C de 6 a 12 semanas de vida. Se
sacrifican los ratones 48 a 120 h después y se analiza en el suero
el antígeno de superficie de la hepatitis B utilizando un
inmunoanálisis de enzima ligado comercial. La producción de antígeno
de superficie es mayor que la del control positivo suministrado con
el kit a las 48 h después de la inyección.
Se obtuvieron resultados similares con
N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)aminopentil)espermidina;
N^{2},N^{6}-(5-[bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]aminopentil)espermidina;
N^{4}-(5-(metiltetrahidrofolil)aminopentil)-espermidina;
N^{4}-(5-(folinil)aminopentil)-espermidina;
N^{4}-(5-(\alpha-3'-propionil
tiomanósido)-aminopentil)espermidina y
N^{4}-(5-(\alpha-3'-propionil
tiomanósido-6-fosfato)aminopentil)-espermidina,
con los componentes de enlace específico del receptor incluidos en
éste.
Se pueden obtener también resultados similares
con N^{4}-octilespermidina;
N^{4}-dodecilespermidina; péptidos fusógenos
acilados en el terminal N por
N^{4}-(5-carboxi-pentil)espermidina;
N^{4}-(5-(colest-5-en-3'-\beta-carbamoil)-aminopentil)espermidina;
y amida de
N^{4}-(5-(3\alpha,7\alpha,12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico)aminopentil)espermidina,
con los componentes que favorecen la destrucción de la membrana del
endosoma incluidos en éstas.
Un kit para utilizar los complejos moleculares
multifuncionales de la presente invención en un equipo para
investigación y fabricación, en el que cada usuario suministra su
propio ADN, incluye un vial que contiene el grupo de transferencia
de la presente invención disuelto en 0,1 a 10 mg/ml y
preferentemente en 1 mg/ml en un tampón esterilizado a pH entre 6 y
8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones aceptables
incluirían citrato, HEPES y fosfato. La utilización del kit implica
extraer una alícuota del grupo de transferencia y añadir la alícuota
a la solución de ADN (entre 0,05 y 2 mg/ml y preferentemente entre
0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la proporción final de mg del grupo
de transferencia al mg del ADN esté comprendida entre 0,5 y 5,0
mg/mg. Las proporciones óptimas se pueden determinar fácilmente. El
grupo de transferencia de ADN mixto se mezcla brevemente y se
mantiene a 37ºC durante 15 a 60 minutos. El grupo de transferencia
del ADN mixto, que ha formado ahora el complejo molecular
multifuncional de la presente invención, se diluye a continuación
con medio mínimo esencial (exento de suero) hasta una concentración
de 5 a 100 \mug/ml y se añade a las células en el cultivo. Las
concentraciones óptimas se pueden determinar fácilmente.
Un kit para utilizar los grupos de transferencia
descritos en esta memoria en un equipo clínico o veterinario, en el
que cada usuario suministra su propio ADN, incluye un vial que
contiene el grupo de transferencia disuelto en 0,1 a 10 mg/ml y
preferentemente en 1 mg/ml en un tampón esterilizado a pH entre 6 y
8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones aceptables
incluirían citrato, HEPES y fosfato. La utilización del kit implica
extraer una alícuota del grupo de transferencia y añadir la alícuota
a la solución de ADN (entre 0,05 y 2 mg/ml y sea preferentemente
entre 0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la proporción final de mg del
grupo de transferencia a mg del ADN esté comprendida entre 0,5 y 5,0
mg/mg y sea preferentemente 1 mg/mg. Las proporciones óptimas se
pueden determinar fácilmente. La mezcla
ADN-compuesto se mezcla brevemente y se mantiene a
temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. La mezcla de
ADN-grupo de transferencia (10 a 500 \mug de ADN),
que ha formado ahora el complejo molecular multifuncional de la
presente invención, se mezcla a continuación en el paciente o
individuo, humano o animal, acorde con la aplicación deseada, p.
ej., inyección i.m. para inmunización, inyección i.v. para
localización en el hígado, etc.
Un kit para utilizar los complejos moleculares
multifuncionales de la presente invención en un equipo clínico o
veterinario, en el que el ADN es suministrado como parte del kit,
incluye un vial que contiene el compuesto disuelto en 0,05 a 10
mg/ml y preferentemente en 0,5 a 1 mg/ml en un tampón esterilizado a
pH entre 6 y 8 y preferentemente a pH entre 6,5 y 7,5. Los tampones
aceptables incluirían citrato, HEPES y fosfato. El kit contiene
también ADN apropiado para la utilización deseada (entre 0,05 y 2
mg/ml, y preferentemente entre 0,25 y 0,75 mg/ml), de modo que la
proporción final de mg del grupo de transferencia a mg del ADN esté
comprendida entre 0,5 y 5,0 mg/mg y sea preferentemente 1 mg/mg. La
mezcla ADN-grupo de transferencia se mantiene a
temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. La mezcla de
ADN-grupo de transferencia (10 a 500 \mug de ADN),
se inyecta a continuación en el paciente o individuo, humano o
animal, acorde con la aplicación deseada, p. ej., inyección i.m.
para inmunización, inyección i.v. para localización en el hígado,
etc.
Los kits descritos en los Ejemplos 13 a 15
anteriormente, pueden tener también los componentes de los mismos
suministrados en forma de polvos liofilizados en los que los grupos
de transferencia, los componentes del tampón y los excipientes se
redisuelven en el momento de su utilización mediante la adición de
agua esterilizada. Estos kits liofilizados pueden incluir además el
ADN como componente liofilizado.
Se preparó 6-bromohexanoato de
bencilo por adición gota a gota de una solución de cloruro de
6-bromohexanoilo (20,0 ml) en 100 ml de cloruro de
metileno a una solución de 66,22 ml de alcohol bencílico en 60 ml de
piridina. Se enfrió la mezcla utilizando un baño de agua con hielo
durante 90 min, a continuación se agitó a temperatura ambiente
durante 18 h. Se extrajo la solución con 200 ml de HCl 1 N seguido
de 2 \times 150 ml de NaHCO_{3} saturado Se descartaron los
extractos y se secó la solución sobre Na_{2}SO_{4}. Se filtró la
solución y se eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se
purificó este aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de
cloroformo en hexanos. Se combinaron las fracciones que contenían el
producto (TLC R_{f} 0,52, CHCl_{3}/hexanos 6:4) y se eliminó el
disolvente para dar 24,4 g.
Se preparó N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
tratando
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(3,0 g) con tres alícuotas de 6-bromohexanoato de
bencilo (de 2,45 g cada una) y K_{2}CO_{3} (de 1,19 g cada una)
en intervalos de una hora en acetonitrilo a reflujo. Se eliminó el
disolvente al vacío y se dividió el residuo entre 200 ml de agua y 2
\times 150 ml de CHCl_{3}. Se mezclaron las capas de CHCl_{3},
se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se eliminó el
disolvente al vacío para dar un aceite. Se purificó este aceite en
gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo.
Se combinaron las fracciones que contenían el producto (TLC R_{f}
0,50, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar
3,82 g de N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
en forma de aceite.
Se disolvió N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,20 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura
ambiente durante una hora. Se eliminó el ácido trifluoracético al
vacío, se disolvió el residuo dos veces en cloroformo (50 ml) y se
eliminó el disolvente al vacío. Se liofilizó el residuo aceitoso en
10 ml de HCl 0,1 N para dar 126 mg de trihidrocloruro de
N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-espermidina como un
aceite. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,37 (2 H), 1,77
(9,4 H), 2,05 (2 H), 2,42 (1,8 H), 2,9 (1,7 H), 3,00 (4,4 H), 3,20
(1,7 H), 5,12 (1,7 H), 7,37 (5 H), 8,19 (5 H), 10,77 (1 H).
Se trató N^{4}-(6'-ácido
hexanoico)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(1,46 g) con 0,37 g de N-hidroxisuccinimida y 0,66 g
de N,N-diciclohexilcarbodiimida en 100 ml de
tetrahidrofurano durante 20 h. Se eliminó el precipitado por
filtración y se eliminó el disolvente al vacío para dar 1,99 g de
N^{4}-(succinimidil
6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina.
Se preparó el péptido SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG utilizando un
sintetizador de péptidos modelo 431A de ABI, se cargó previamente
cartuchos con FMOC-aminoácido y se cargó previamente
resina de
FMOC-Gly-p-alcoxi-bencílico.
Se eliminó el grupo protector FMOC del terminal N de serina y se
secó la resina. Se trató la resina con péptido con 1,99 g de
N^{4}-(succinimidil
6'-hexanoil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
y 1,24 ml de diisopropiletilamina en 50 ml de dimetilformamida
durante 24 h. Se aisló la resina por filtración y se enjuagó con
diclorometano. La
N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH
se escindió de la resina utilizando una mezcla de agua (0,25 ml),
etanoditiol (0,25 ml), tioanisol (0,50 ml) y ácido trifluoracético
(9,5 ml). La resina agotada se eliminó por filtración y se precipitó
N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH
por adición del éter dietílico y se aisló por filtración. Se
purificó una muestra de
N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina-SGSGGLFEAIAENGWEGMIDGGG-OH
(100 mg) por HPLC en una columna C-18 de 25 \times
250 mm eluyendo con un gradiente de bicarbonato de amonio 0,05 M y
bicarbonato de amonio 0,05 M en acetonitrilo al 80%. Espectro de
masas FAB MH^{+} = 2775.
Se disolvió ácido cólico (95 mg) en 10 ml de
tetrahidrofurano y N-hidroxisuccinimida (27 mg) y se
añadió diciclohexilcarbodiimida (48 mg). Se agitó la mezcla hasta
disolver y se añadió
N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina
(100 mg). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 48 h. Se
eliminó el disolvente al vacío. Se purificó la cera en bruto en gel
de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se
combinaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f}
0,39, CHCl_{3}/metanol 85:15) y se eliminó el disolvente para dar
0,15 g de
N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''\alpha,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
como un sólido blanco. Se disolvió este sólido en 10 ml de
2-propanol y a esta solución se añadió 10 ml de HCl
4 N en dioxano. Se agitó la mezcla durante 18 h a temperatura
ambiente, durante este tiempo precipitó el
N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''\alpha,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina
en forma de polvo blanco fino. Se aisló éste por filtración para dar
67 mg. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,58 (s, 3 H), 0,81
(s, 3 H), 0,92 (m, 5,5 H), 1,28 (m, 20,8 H), 1,62 (m, 16,2 H), 2,05
(m, 8,8 H), 2,8 (q, 2,8 H), 2,9 (q, 2,8 H), 3,02 (q, 8,3 H), 3,18
(m, 4,4 H), 7,87 (m, 1,1 H), 8,13 (br s, 4 H), 8,23 (br s, 4 H),
10,78 (br s, 1,1 H).
Se preparó en 50 ml de CHCl_{3} una solución de
tetra-O-acetil-tiomanósido
de
S-\alpha-3'-propionilo
(0,90 g) (preparada asimismo en
hepta-O-acetil-galactosil-\beta1-4-tioglucósido
de
S-\alpha-3'-propionilo,
M. Elofsson, S. Roy, B. Walse y J. Kihlberg, Carb. Res.
246, 89-103 (1993)). Se añadió a la
solución 5 ml de 2-propanol, 0,43 g de
diciclohexilcarbodiimida y 0,24 g de
N-hidroxisuccinimida. Se agitó la solución a
temperatura ambiente durante 1 h, a continuación se almacenó a 4ºC
toda la noche. Se filtró un precipitado y se eliminó el disolvente
del filtrado al vacío para dar un aceite. Se disolvió el aceite en
30 ml de tetrahidrofurano. A esta solución se añadió una solución de
N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermidina
(0,86 g) (en 50 ml de tetrahidrofurano y 30 ml de agua) y 0,55 ml de
diisopropiletilamina. Se agitó la solución a temperatura ambiente
durante 2 h, se filtraron los sólidos resultantes y se eliminó el
disolvente al vacío para dar un aceite. Se puso en suspensión el
aceite en 100 ml de NaHCO_{3} saturado y se extrajo con 2 \times
75 ml de CHCl_{3}. Se secó la solución sobre Na_{2}SO_{4}, se
filtró y se eliminó el disolvente para dar un aceite. Se purificó el
aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en
cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto
(TLC R_{f} 0,30, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el
disolvente para dar 0,10 g de
N^{4}-(5'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tetra-O-acetil-tiomanósido)pentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxi-carbonil)espermidina
como un cristal. Se disolvió este cristal en 10 ml de ácido
trifluoracético y se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura
ambiente. Se eliminó el disolvente al vacío y se redisolvió el
residuo y se eliminó el disolvente utilizando cloroformo (3 \times
20 ml). Se trató el sólido con NH_{4}OH al 15% en etanol al 55%
durante dos horas. Se liofilizó a continuación el producto
(3\times) en HCl 0,05 N para dar trihidrocloruro de
N^{4}-(5'-(\alpha-3'-propionil
tiomanósido)aminopentil)-espermidina como un
sólido blanco (64 mg).
Se preparó
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
al igual que N^{4}-(bencil 6'-hexanoil)-
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
por tratamiento de
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,5 g) con cuatro alícuotas de
N-CBZ-5-amino-1-bromopentano
(cada una de 1,74 g) y cinco alícuotas de K_{2}CO_{3} (1,00 g
cada una). Se purificó el aceite resultante en gel de sílice,
eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo (TLC R_{f}
0,47, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al 0,4%) para
dar 0,72 g de
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
como un aceite.
Se disolvió
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
(0,24 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó en un baño de
agua con hielo bajo nitrógeno durante 2 horas. Se añadió éter frío
para precipitar el producto como un aceite. Se eliminaron los
disolventes por decantación y el aceite se disolvió en 25 ml de HCl
0,1 N y se liofilizó para dar 0,16 g de trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
como un cristal. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,28 (m,
2 H), 1,47 (m, 2 H), 1,61 (m, 8 H), 2,01 (m, 2 H), 2,82, 2,90 (m, 4
H), 3,02 (m, 8 H), 3,15 (m, 2,7 H), 5,01 (s, 2 H), 7,35 (s+m, 6,7
H), 8,00, 8,11 (br m solapante, 7,3 H).
Se preparó
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
al igual que
N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
utilizando la misma secuencia de reacciones. Se preparó
N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
al igual que
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
utilizando una sola adición de
N-CBZ-5-amino-1-bromopentano
(5,10 g) y K_{2}CO_{3} (4,70 g) en 3,42 g de
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en acetonitrilo a reflujo (100 ml). La preparación anterior dio el
producto como un aceite que se purificó en gel de sílice, eluyendo
con un gradiente de metanol en cloroformo conteniendo
diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que
contienen el producto (TLC R_{f} 0,43, CHCl_{3}/metanol 9:1 +
diisopropiletilamina al 0,4%) y se eliminó el disolvente para dar
6,0 g de
N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un aceite. Se desprotegió una alícuota (0,25 g) de este
material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió
anteriormente para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,13 g de tetrahidrocloruro de
N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina.
RMN (DMSO- d_{6}): \delta 1,28 (m, 4 H), 1,43 (m, 4
H), 1,76 (m, 8,8 H), 2,01 (m, 4 H), 2,90, 3,00 (m solapante, 18,4
H), 3,17 (m, 4,4 H), 5,03 (s, 4 H), 7,35 (s, 12 H), 8,11 (br m, 5,6
H).
Se preparó
N^{4}-N^{9}-bis(octil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
utilizando una sola adición de 1-bromooctano (0,53
g), yoduro de potasio (0,45 g) y diisopropiletilamina (0,54 ml) en
0,50 g de
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en acetona (30 ml) y se calentó a reflujo toda la noche. Se eliminó
la acetona al vacío y se absorbió la mezcla en 200 ml de cloroformo
y se lavó con 100 ml de agua. Se secó la solución de cloroformo
sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al
vacío para dar el producto en forma de aceite. Se purificó este
aceite en gel de sílice, se eluyó con gradiente de metanol en
cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto
(TLC R_{f} 0,54, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el
disolvente para dar 0,26 g de
N^{4}-N^{9}-bis(octil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
como una cera. Se trató este material (0,26 g) con 10 ml de HCl 4 N
en dioxano durante dos horas a temperatura ambiente. Se eliminó el
disolvente al vacío para dar 0,21 g de tetrahidrocloruro de
N^{4}-N^{9}-bis(octil)-espermina
como una cera. RMN (DMSO- d_{6}): \delta 0,94 (t, 6
H), 1,35 (m, 22 H), 1,74, 1,83 (m solapante, 8,2 H), 2,10 (m, 4 H),
2,97, 3,12, 3,26 (m solapante, 18 H), 8,27 (br m, 5,6 H).
A 0,68 g de trifluoracetato de
N^{4}-N^{9}-bis(octil)-espermina
en 50 ml de tetrahidrofurano y 1 ml de agua se añadió 0,77 g de
N,N'-bis(terc-butiloxicarbonil)-S-metilisotiourea
y 0,85 ml de diisopropiletilamina. Se reflujó la reacción durante 1
h, se agitó a continuación a temperatura ambiente durante 18 h. Se
eliminó el disolvente en una corriente de nitrógeno a 60º, se puso
en suspensión el sólido resultante en 100 ml de NaHCO_{3} saturado
y se extrajo con 2 \times 100 ml de cloroformo. Se secó la
solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se
eliminó el disolvente al vacío para dar un aceite. Se purificó este
aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en
cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto
(TLC R_{f} 0,39, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el
disolvente para dar 0,18 g de
1,12-bis-N-(N',N''-bis-(terc-butiloxicarbonil-guanidino))-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diazadodeano
como una cera. Se disolvió esta cera en 10 ml de ácido
trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se
eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en
cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar un
aceite. Se disolvió este aceite en 30 ml de HCl 0,1 N y se liofilizó
para dar tetrahidrocloruro de
1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano
(86 mg en forma de aceite). RMN (MeOH- d_{4}):
\delta 0,82 (m, 3 H), 1,23, 1,30 (m solapante, 10 H), 1,64, 1,71
(m solapante, 4 H), 1,90 (m, 2 H), 3,14 (m, 6 H).
Se aisló
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un componente minoritario durante la preparación de
N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina.
Las fracciones que contienen la
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
(TLC R_{f} 0,26, CHCl_{3}/metanol 9:1 + diisopropiletilamina al
0,4%) se mezclaron y se eliminó el disolvente para dar 0,84 g de un
aceite. Se añadió a este aceite 50 ml de acetonitrilo, 0,47 ml de
diisopropiletilamina y 0,35 g de bicarbonato de
di-terc-butilo. Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante 4 h. Se eliminó el disolvente al vacío
y se absorbió el residuo en 100 ml de cloroformo y se lavó con 100
ml de agua. Se secó la solución de cloroformo sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para
dar 0,83 g de
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina,
un único punto por TLC (R_{f} 0,56, CHCl_{3}/metanol 9:1 +
diisopropiletilamina al 0,4%). Se trató la
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,22 g) en 20 ml de metanol con 0,04 g de Pd al 10%/C y H_{2} a
50 PSIG durante 2 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por
filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó el
disolvente al vacío para dar
N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un aceite (0,14 g). Se disolvió este aceite en cloruro de
metileno y se añadió a la solución diisopropiletilamina (0,146 ml) y
cloroformato de colesterilo (0,094 g). Se agitó la solución a
temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminó el disolvente al vacío
y se purificó el aceite resultante en gel de sílice, eluyendo con un
gradiente de metanol en cloroformo que contiene
diisopropiletilamina. Se mezclaron las fracciones que contenían el
producto (TLC R_{f} 0,29, CHCl_{3}/metanol 9:1 +
diisopropiletilamina al 0,4%) y se eliminó el disolvente para dar
0,19 g de
N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta
carbamoil)pentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un aceite. Se disolvió este aceite en 5 ml de ácido
trifluoracético y se agitó en nitrógeno en un baño de agua con hielo
durante 2 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el
residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml)
para dar un aceite. Se disolvió este aceite en 10 ml de HCl 0,1 N y
se liofilizó para dar un aceite marrón claro (0,077 g). RMN (DMSO-
d_{6}): \delta 0,58 (s, 3 H), 0,78 (dos s, 6 H),
0,90 (m solapante, 18 H), 1,43 (m solapante, 15 H), 1,64 (m
solapante, 8 H), 1,96 (m, 6 H), 2,85 (m solapante, 16 H), 3,12 (m, 4
H), 5,25 (m, 1 H), 7,0 (br t, 1 H), 8,06 (br m, 8 H), 9,19 (br m, 2
H).
A una suspensión de 7,8 g de ácido
12-bromododecanoico en 100 ml de agua se añadió 14
ml de dimetilamina 2 M en tetrahidrofurano produciendo una solución
transparente. Se ajustó el pH a 7 con HCl 1 N y se añadió 5,36 g de
1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida.
Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 18 h. La
12-bromododecanamida de N,N-dimetilo
resultante precipitó en la solución como un sólido blanco durante
este tiempo. Se filtró este sólido y se lavó con agua, a
continuación se secó al vacío.
N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanamida)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
se preparó igualmente a
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
utilizando una sola adición de
12-bromo-dodecanamida de
N,N-dimetilo (2,34 g) y K_{2}CO_{3} (1,70 g) en
0,50 g de
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en acetonitrilo (50 ml) a reflujo. La preparación anterior dio el
producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice,
eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo conteniendo
diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que
contienen el producto (TLC R_{f} 0,53, CHCl_{3}/metanol 8:2 +
diisopropiletilamina al 0,2%) y se eliminó el disolvente para dar
0,49 g de
N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanamida)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,20 g) de este
material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió
anteriormente para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,19 g de tetrahidrocloruro de
N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanamida)-espermina. RMN
(DMSO- d_{6}): \delta 1,26 (m, 25,6 H), 1,46 (m, 3
H), 1,70, 1,80 (m solapante, 6 H), 2,04 (m, 3 H), 2,79 (s, 6 H),
2,94 (s, 6 H), 3,0-3,2 (m solapante, 18 H), 8,15 (br
m, 5 H).
A una solución de ácido
12-bromododecanoico (1,0 g) y alcohol bencílico
(0,74 ml) en 200 ml de tolueno se añadió ácido
p-toluensulfónico (0,10 g). Se eliminó la mayor
parte (aprox. 180 ml) del tolueno por destilación simple a presión
atmosférica y se eliminó el disolvente restante al vacío. Se
absorbió el residuo en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con
NaHCO_{3} saturado Se secó la solución de acetato de etilo sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se eliminó el disolvente al vacío para
dar 12-bromododecanoato de bencilo (1,75 g) como un
líquido en bruto. La TLC (cloroformo/hexano 85:15) presentó
solamente producto (R_{f} 0,78) y alcohol bencílico (R_{f}
0,08). La
N^{4}-N^{9}-bis(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
se preparó al igual que la
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
utilizando una sola adición de 12-bromododecanoato
de bencilo (4,6 g) en bruto y K_{2}CO_{3} (1,70 g) en 1,0 g de
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en acetonitrilo (100 ml) a reflujo. La preparación anterior dio el
producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice,
eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo. Se mezclaron las
fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,35,
CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar 0,36 g
de N^{4}-N^{9}-bis(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermina
en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,27 g) de este
material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió
anteriormente para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,17 g de tetrahidrocloruro de
N^{4}-N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanoil)-espermina. RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,24 (m, 31,4 H), 1,55 (m,
4,2 H), 1,70, 1,80 (m solapante, 8,6 H), 2,02 (m, 4,2 H),
2,9-3,2 (m solapante, 21,4 H), 5,08 (s, 4,2 H), 7,36
(s, 10 H), 8,13 (br m, 5,8 H).
Se disolvió
N^{4}-N^{9}-bis(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,51 g) en 50 ml de metanol y se trató con 0,05 g de Pd al 10%/C y
H_{2} a 50 PSIG durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el
Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas. Se eliminó el
disolvente del filtrado al vacío para dar
N^{4}-N^{9}-bis(ácido
12'-dodecanoico)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,22 g) de este
material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió
anteriormente para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,17 g de
N^{4}-N^{9}-bis(ácido
12'-dodecanoico)-espermina. RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,25 (m, 28 H), 1,47 (m, 5
H), 1,66, 1,76 (m solapante, 8 H), 2,02 (m, 3,6 H),
2,91-3,17 (m solapante, 19 H), 8,11 (br m, 5 H).
Se preparó N^{4}-(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
de igual modo que
N^{4}-(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{8}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermidina
utilizando una sola adición de 12-bromododecanoato
de bencilo (6,58 g) en 1,43 g de
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en acetonitrilo a reflujo (100 ml). La preparación anterior dio el
producto en forma de aceite que se purificó en gel de sílice,
eluyendo con un gradiente de metanol en cloroformo que contenía
diisopropiletilamina (0,2%). Se mezclaron las fracciones que
contienen el producto (TLC R_{f} 0,08, CHCl_{3}/metanol 8:2 +
diisopropiletilamina al 0,2%) y se eliminó el disolvente para dar
0,36 g de N^{4}(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite. Se desprotegió una alícuota (0,29 g) de este
material y se transformó en el hidrocloruro tal como se describió
anteriormente para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,19 g de tetrahidrocloruro de N^{4}(bencil
12'-dodecanoil)-espermina. RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,24 (m, 12 H), 1,53 (m,
1,5 H), 1,69, 1,80 (m solapante, 4 H), 2,01 (m, 4 H),
2,9-3,2 (m solapante, 14 H), 5,08 (s, 2 H), 7,36 (s,
5 H), 7,47 (m, 1 H), 8,09 (br m, 5,5 H), 9,20 (br m, 2 H).
Se disolvió N^{4}-(bencil
12'-dodecanoil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,29 g) en 30 ml de metanol y se trató con 0,03 g de Pd al 10%/C y
H_{2} a 50 PSIG durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó
el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas. Se eliminó
el disolvente al vacío para dar N^{4}-(ácido
12'-dodecanoico)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite (0,19 g). Se desprotegió este material (0,19 g) y
se transformó en el hidrocloruro tal como se describió anteriormente
para el trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina
para dar 0,18 g de tetrahidrocloruro de N^{4}-(ácido
12'-dodecanoico)-espermina. RMN
(DMSO- d_{6}): \delta 1,26 (m, 16,7 H), 1,48 (m, 2,7
H), 1,70, 1,78 (m solapante, 6 H), 2,01 (m, 4 H),
2,91-3,17 (m solapante, 12 H), 8,17 (br m, 5,3 H),
9,30 (br m, 2 H).
Se disolvió
N^{4}-N^{9}-bis(N-CBZ-5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)-espermina
(2,04 g) en 50 ml de metanol y se trató con 0,84 g de Pd al 10%/C y
H_{2} a 50 PSIG durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó
el Pd/C por filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó
el disolvente del filtrado al vacío para dar
N^{4}-N^{9}-bis(5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,79 g) en forma de aceite. Se preparó una solución de
tetra-O-acetil-tiomanósido
de
S-\alpha-3'-propionilo
(2,94 g) en 100 ml de tetrahidrofurano. A la solución de tiomanósido
se añadió 1,39 g de diciclohexilcarbodiimida y 0,78 g de
N-hidroxisuccinimida. Se agitó la solución a
temperatura ambiente durante 20 h, a continuación se almacenó a 4ºC
durante 0,5 h. Se filtró un precipitado y se eliminó el disolvente
del filtrado para dar
S-\alpha-3'-propionil
tetra-O-acetil-tiomanósido
de succinimidilo (3,80 g) como un sólido blanco. Se disolvió la
N^{4}-N^{9}-bis(5'-aminopentil)-N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,79 g) en tetrahidrofurano (75 ml) y se añadió a la solución 0,64
ml de diisopropiletilamina y 1,32 g de
S-\alpha-3'-propionil
tetra-O-acetil-tiomanósido
de succinimidilo, y se agitó la solución a temperatura ambiente
durante 24 h. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal.
Se purificó este cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente
de metanol en cloroformo que contenía diisopropiletilamina (0,2%).
Se mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f}
0,30, CHCl_{3}/metanol 9:1) y se eliminó el disolvente para dar
0,69 g de
N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil
tetra-O-acetil
tiomanósido)aminopentil)-
N^{1},N^{12}-bis(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de cristal. Se disolvió este cristal en 20 ml de ácido
trifluoracético y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se
eliminó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en
cloroformo y se eliminó el disolvente (2 \times 20 ml) para dar
0,78 g de
N^{4},N^{9}-bis(5-N-(\alpha-3'-propionamido
tetra-O-acetil
tiomanósido)pentil)-espermina en forma de
aceite. Se disolvió este aceite en 25 ml de metanol y se añadió a la
solución 25 ml de agua y 1,56 g de Na_{2}CO_{3}, y se agitó la
solución a temperatura ambiente durante 5 h. Se eliminaron los
disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 6 ml de ácido
acético al 1% y se purificó en tres alícuotas de 2 ml en tres
columnas con medio G-25 de Sephadex^{TM} (cada una
de 12 ml), eluyendo con ácido acético al 1%. Se mezclaron las
fracciones que contienen el producto y se liofilizaron para dar 0,31
g de tetraacetato de
N^{4},N^{9}-bis(5-N-(\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)pentil)-espermina en forma de un
sólido blanco. RMN (D_{2}O) \delta 1,42 (m, 4 H), 1,59 (m, 4 H),
1,79 (m, 9,5), 1,95 (s, 38,5 H), 2,14 (m, 5 H), 2,62 (t, 4 H), 2,94
(m, 4 H), 3,10 (m, 4,5 H), 3,24 (m, 18 H), 3,72 (m, 6 H), 4,05 (m,
6,5 H), 5,34 (s, 2 H).
Se añadió una solución de pentaetilenglicol (5,0
g) en 50 ml de tetrahidrofurano a una suspensión agitada rápidamente
de NaH (0,42 g de 60%) en 40 ml de tetrahidrofurano. La mezcla de
reacción se mantuvo bajo nitrógeno y se puso en suspensión en un
baño de agua con hielo y se agitó durante 0,5 h. Se añadió una
solución de
N-CBZ-5-amino-1-bromopentano
(3,78 g) en 30 ml de tetrahidrofurano y se agitó la mezcla en el
baño de agua con hielo durante 1 h, a continuación a temperatura
ambiente durante 18 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se
purificó el residuo en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de
2-propanol en cloroformo. Se mezclaron las
fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,30,
CHCl_{3}/2-propanol 95:5) y se eliminó el
disolvente para dar 3,25 g de
N-CBZ-20-amino-3,6,9,12,15-penta-oxa-1-eicosanol
en forma de aceite. Se añadió una solución de
N-CBZ-20-amino-3,6,9,12,15-penta-oxa-1-eicosanol
(3,25 g) en 50 ml de tetrahidrofurano a una suspensión de NaH (0,28
g de 60%) agitada rápidamente en 25 ml de tetrahidrofurano. Se
mantuvo la mezcla de reacción bajo nitrógeno y se puso en suspensión
en un baño de agua con hielo y se agitó durante 0,5 h. Se añadió a
la solución 1-bromoacetato de
terc-butilo (1,15 ml) y se agitó la mezcla en el
baño de agua con hielo durante 1 h, a continuación a temperatura
ambiente durante cuatro días. Se eliminó el disolvente al vacío y se
puso en suspensión el residuo en 100 ml de cloroformo y se lavó con
agua (50 ml). Se secó la solución de cloroformo sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtró y el disolvente se eliminó al vacío para
dar un aceite. Se purificó el aceite en gel de sílice, eluyendo con
un gradiente de 2-propanol en cloroformo. Se
mezclaron las fracciones que contienen el producto (TLC R_{f}
0,45, CHCl_{3}/2-propanol 95:5) se combinaron y se
eliminó el disolvente para dar 3,24 g de
N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoato
de terc-butilo en forma de aceite. Una alícuota del
N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoato
de terc-butilo (0,49 g) se disolvió en 100 ml de
HCl 4 N en dioxano y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Se
eliminaron los disolventes al vacío. Se disolvió el ácido
N-CBZ-23-amino-3,6,9,12,15,18-hexa-oxa-1-tricosanoico
en bruto resultante en 15 ml de dimetilformamida. A esta solución se
añadió N-hidroxisuccinimida (0,10 g), carbodiimida
de
1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilo
(0,16 g) y
N^{4}-(5'-aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,50 g). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 2,5
días. Se eliminó la dimetilformamida al vacío y se absorbió el
residuo en cloroformo (100 ml). Se lavó la solución de cloroformo
sucesivamente con HCl 0,1 N (75 ml) y NaHCO_{3} saturado Se secó
la solución de cloroformo sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y el
disolvente se eliminó al vacío para dar un aceite. Se purificó el
aceite en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de
2-propanol en cloroformo. Se mezclaron las
fracciones que contienen el producto (TLC R_{f} 0,33,
CHCl_{3}/2-metanol 9:1) se combinaron y se eliminó
el disolvente para dar 0,19 g de
N^{4}-(5-N-(N-CBZ-23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)ami-nopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite. Se disolvió este aceite en 50 ml de acetato de
etilo y se trató con 0,19 g de Pd al 10%/C y H_{2} a 50 PSIG
durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se eliminó el Pd/C por
filtración a través de tierra de diatomeas y se eliminó el
disolvente del filtrado para dar
N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un aceite incoloro (0,13 g). Se disolvió
N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
(0,13 g) en tetrahidrofurano (20 ml) y se añadió a la solución 0,048
ml de diisopropiletilamina y 0,073 g de
tetra-O-acetil-tiomanósido
de
S-\alpha-3'-propionil
y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. Se
eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal. Se purificó este
cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de metanol en
cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen el producto
(TLC R_{f} 0,36, CHCl_{3}/metanol 9:1) se combinaron y se
eliminó el disolvente para dar 0,10 g de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propioamido
tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
en forma de aceite. Espectro de masas FAB, MH^{+}=3328. Se
disolvió la
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbo-nil)espermina
(0,55 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura
ambiente durante 2 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se
disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2
\times 20 ml) para dar 0,76 g de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tetra-O-acetil-tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-esper-mina
como un aceite. Se disolvió este aceite en 20 ml de metanol y se
añadió a la solución 20 ml de agua y 0,85 de Na_{2}CO_{3}y se
agitó la solución a temperatura ambiente durante 6,5 h. Se
eliminaron los disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 6 ml
de ácido acético al 1% y se purificó en cuatro alícuotas de 1,5 ml
en tres columnas con medio G-25 de Sephadex^{TM}
(de 12 ml cada una), eluyendo con ácido acético al 1%. Se mezclaron
las fracciones que contenían el producto y se liofilizaron para dar
0,22 g de tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanami-do)aminopentil)-espermina
como un aceite. RMN (D_{2}O) \delta 1,35 (m, 4 H), 1,55 (m, 6
H), 1,75 (m, 6,4 H), 1,91 (s, 14 H), 2,09 (m, 4,2 H), 2,58 (t, 1,7
H), 2,90 (m, 1,7 H), 3,09, 3,19 (m solapante, 18,1 H), 3,53 (t, 2,5
H), 3,69 (m, 22 H), 3,88 (m, 3,8 H), 4,06 (s, 1,7 H), 5,30 (s, 1
H).
El tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido
tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecaetilenglicol)pentil)-espermina
se puede preparar de igual manera que el tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina
sustituyendo 18,9 g de poli(etilenglicol) de peso molecular
medio 900 por el pentaetilenglicol en el procedimiento descrito en
el Ejemplo 32.
El tetraacetato de
N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-trico-sanamido)aminopentil)-espermina
se preparó de igual manera que el tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(S-\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)a-minopentil)-espermina
y el procedimiento descrito en el Ejemplo 32. Se disolvió
N^{4}-(5-N-(23'-amino-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-buti-loxicarbonil)espermina
(0,14 g) en tetrahidrofurano (25 ml) y se añadió a la solución 0,052
ml de diisopropiletilamina y 0,37 g de
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglu-cósido)lisinato
de succinimidilo y se agitó la solución a temperatura ambiente
durante 72 h. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un cristal.
Se purificó este cristal en gel de sílice, eluyendo con un gradiente
de metanol en cloroformo. Se mezclaron las fracciones que contienen
el producto (TLC R_{f} 0,46, CHCl_{3}/metanol 9:1) se combinaron
y se eliminó el disolvente para dar 0,15 g de
N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucó-sido)lisinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbonil)espermina
como un sólido blanco. Espectro de masas FAB, MH^{+}=3328. Se
disolvió la
N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisinamido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-N^{1},N^{9},N^{12}-tris(terc-butiloxicarbo-nil)espermina
(0,28 g) en 10 ml de ácido trifluoracético y se agitó a temperatura
ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente al vacío y se
disolvió el residuo en cloroformo y se eliminó el disolvente (2
\times 20 ml) para dar 0,36 g de
N^{4}-(((5-N-(23'-N-(N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
hepta-O-acetil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisinamido)-3',6',9',12',-15',-18'-hexa-oxa-tricosonamido)ami-nopentil)-espermina
como un aceite. Se disolvió este aceite en 10 ml de metanol y se
añadió a la solución 10 ml de agua y 0,44 de Na_{2}CO_{3}y se
agitó la solución a temperatura ambiente durante 24 h. Se eliminaron
los disolventes al vacío y se absorbió el residuo en 5 ml de ácido
acético al 1% y 1 ml de etanol y se purificó en cuatro alícuotas de
1,5 ml en dos columnas con medio G-25 de
Sephadex^{TM} (de 15 ml y 20 ml), eluyendo con etanol al 10% en
ácido acético al 1%. Se mezclaron las fracciones que contenían el
producto y se liofilizaron para dar 0,095 g de tetraacetato de
N^{4}-(((23'-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosonamido)aminopentil)-espermina.
Familia
Picornavirus
Géneros: | Rinovirus: (Medicina) responsable de \sim 50% de los casos del resfriado común. |
\begin{minipage}[t]{120mm}Eterovirus: (Medicina) incluye poliovirus, virus Coxsackie, virus ECHO y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A.\end{minipage} | |
Aftovirus: (Veterinaria) estos son los virus de enfermedades de los pies y la boca. | |
Antígenos diana: | VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. |
Familia de
calcivirus
Géneros: | \begin{minipage}[t]{120mm}Grupo de virus de Norwalk: (Medicina) estos virus son agentes patógenos importantes de la gastroenteritis epidémica.\end{minipage} |
Géneros: | Alfavirus: (Medicina y Veterinaria) |
\begin{minipage}[t]{120mm}los ejemplos incluyen los virus Senilis, virus de RossRiver y de la encefalitis equina oriental y occidental.\end{minipage} | |
Reovirus: (Medicina) virus de la rubeola. |
\begin{minipage}[t]{120mm}Los ejemplos incluyen: (Medicina) virus del dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis y encefalitis transmitida por la garrapata.\end{minipage} |
Virus de la hepatitis C: (Medicina)
estos virus no están clasificados en una familia todavía pero se
cree que son un togavirus o un flavivirus. La mayoría de las
similitudes son con la familia
togavirus.
Virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral) | |
Virus gastroenterítico de transmisión porcina (cerdo) | |
Virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdo) | |
Virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos) | |
Coronavirus entérico felino (gato) | |
Coronavirus canino (perro) | |
\begin{minipage}[t]{120mm} Los coronavirus respiratorios humanos producen \sim 40 casos de resfriado común. EX. 224E, 0C43\end{minipage} | |
Nota- los coronavirus pueden producir hepatitis no-A, B o C | |
Antígenos diana | |
E1-también denominado M o proteína de la matriz | |
E2-también denominado S o proteína de Spike | |
\begin{minipage}[t]{120mm} E3-también denominado HE o glucoproteína de hemaglutina-elterosa (no presente en todos los coronavirus)\end{minipage} | |
N-nucleocápside |
Géneros: | Vesiliovirus |
Lisavirus: (Medicina y Veterinaria) rabia |
Antígeno diana: | Proteína G |
Proteína N |
Virus de la fiebre hemorrágica tales como virus Marburg y Ébola |
Géneros: | Paramixovirus (Medicina y Veterinaria) |
\begin{minipage}[t]{120mm} Virus de parotiditis, virus de la enfermedad de New Castle (patógeno importante en pollos)\end{minipage} | |
Morbilivirus: (Medicina y Veterinaria) | |
Sarampión, moquillo canino | |
Neuminvirus: (Medicina y Veterinaria) | |
Virus sincitial respiratorio |
Virus de la gripe |
Géneros: | Bungavirus: (Medicina) encefalitis de California, |
LA Crosse | |
Flebovirus: (Medicina) fiebre del valle del Rift | |
Hantavirus: Puremala es un virus de la fiebre de hemahagina | |
Nairvirus (Veterinaria) enfermedad de ovejas de Nairobi | |
Además muchos bungavirus no asignados |
LCM, virus de la fiebre de Lassa |
Géneros: | Reovirus: un posible patógeno humano |
Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños | |
Orbivirus: (Medicina y Veterinaria) | |
\begin{minipage}[t]{120mm}Fiebre de la garrapata de Colorado, encefalosis equina de Lebombo (hombre), lengua azul\end{minipage} |
Familia
Retrovirus
Sub-familia: | |
Oncorrivirinal: (Veterinaria) (Medicina) virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII | |
\begin{minipage}[t]{120mm}Lentivirinal: (Medicina y Veterinaria) VIH, virus de la inmunodeficiencia felina, infecciones equinas, virus de la anemia\end{minipage} | |
Espumavirinal |
Sub-familia: | |
Poliomavirus: (Medicina) virus BKU y JCU | |
Sub-familia: | |
\begin{minipage}[t]{120mm}Papilomavirus: (Medicina) muchos tipos víricos relacionados con cánceres o la evolución maligna del papiloma\end{minipage} | |
Adenoviurs (Medicina) | |
\begin{minipage}[t]{120mm}EX AD7, ARD. O.B.-producen enfermedades respiratorias-algunos adenovirus tales como 275 producen enteritis\end{minipage} |
Parvovirus felino: producen enteritis felina | |
Panleucopeniavirus felina | |
Parvovirus canino | |
Parvovirus porcino |
Sub-familia: | alfaherpesviridue |
Géneros: | virus simple (Medicina) |
HSVI, HSVII | |
Virus de la varicela: (Medicina-Veterinaria) | |
Pseudo-rabia-varicela zoster | |
Sub-familia-Herpesviridue beta | |
Géneros: | Citomegalovirus (Medicina) |
HCMV | |
Muromegalovirus |
Sub-familia: | Herpesviridue gamma |
Géneros: | Limfocriptovirus (Medicina) |
EBV-(linfo de Burkitts) | |
Radinovirus |
Sub-familia: | Cordopoxviridue (Medicina-veterinaria) |
Géneros: | Viruela (Smallpox) |
Enfermedad vírica de las vacas (viruela vacuna) | |
Parapoxivirus-veterinaria | |
Auipoxvirus-veterinaria | |
Virus de la viruela caprina | |
Leporipoxvirus | |
Virus de la viruela porcina | |
Sub-familia: | Entemopoxviridue |
Virus de la hepatitis B |
Virus de la hepatitis delta |
Patógenos
bacterianos
- Los cocos gram-positivos patógenos incluyen: pneumococos; estafilococos e estreptococos. Los cocos gram-negativos patógenos incluyen: meningococos y gonococos.
- Los bacilos gram-negativos entéricos patógenos incluyen: enterobacteriáceas; pseusomonas, acinetobacterias y eiquenelas; melioindosis; salmonelas; sigelosis; hemofilus; chancroide; brucelosis; tularemia; yersinia (pasteurela); estreptobacilo moliniforme y espirilo; monocitogenes de listeria; erisipelotrix rusiopatía; difteria; cólera; ántrax; donovanosis (granuloma inguinal) y bartonelosis.
- Las bacterias anaeróbicas patógenas incluyen: tétanos; botulismo; otros clostridios; tuberculosis; lepra y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patógenas incluyen: sífilis; treponematosis: frambesia, pinta y sífilis endémica; y leptospirosis.
- Otras infecciones causadas por bacterias muy patógenas y hongos patógenos incluyen: actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, criptococopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis.
- Las infecciones por ricketsias incluyen la ricketsial y la ricketsiosis.
- Ejemplos de infecciones de micoplasma y clamidiales incluyen: pneumonía de micoplasma; linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales.
Eucariotas
patógenos
- Los protozoos patógenos y helmintos y las infecciones por éstos incluyen: amebiasis; paludismo; leismaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocistis carinii; babesiosis; giardiosis; triquinosis; filariosis; esquistosomiasis; infecciones por nemátodos; tremátodos o helmintos y céstodos (tenia).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Boutin, Raymond H.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Complejos moleculares multifuncionales para la transferencia génica a las células
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Remitente: Woodcook Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One Liberty Place 46th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Filadelfia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Pensilvania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 19103
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/314.060
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-SEP-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- APODERADO / AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DeLuca, Mark
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.229
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: APOL-0216
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 215-568-3100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 215-568-3439
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys
Gly Asn Trp Lys Asn}
\sac{Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- (D) CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe
Leu Gly Ala Ala Gly}
\sac{Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr
Val Gln Ala Arg Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Val Ser Leu Thr Leu Ala Leu Leu Leu
Gly Gly Leu Thr Met}
\sac{Gly Gly Ile Ala Ala Gly Val Gly Thr Gly Thr
Thr Ala Leu Val Ala}
\sac{Thr Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe
Leu Gly Ala Ala Gly}
sac{Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ala Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly
phe Leu Gly Ala Ala}
\sac{Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu
Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Ile Glu Gly Cys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe
Leu Gly Ala Ala Gly}
\sac{Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala Leu
Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Ala Asn Val Thr Ala Ala Val Ala Leu Val
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Val Tyr Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp
Gly Gly Ala Tyr Cys}
\sac{Phe Cys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lis Leu Ile Cys Thr Gly Ile Ser Ser Ile Pro
Pro Ile Arg Ala Leu}
\sac{Phe Ala Ala Ile Asn Ile Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu
Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala Leu
Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Val Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu
Gly Val Ala Thr ala}
\sac{Thr Ala Ala Gln Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu
Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Val Ala Ala Ile Ile Leu Gly Ile Ser Ala
Leu Ile Ala Ile Ile}
\sac{Thr Ser Phe Ala Val Ala Thr Thr Ala Leu Val
Lys Glu Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Gln Cys Lys Val Tyr Thr Gly Val Tyr
Pro Phe Met Trp Gly}
\sac{Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Thr Cys Lys Val Phe Gly Gly Val Tyr
Pro Phe Met Trp Gly}
\sac{Gly Ala Gln Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu
Gly Val Ala Ala Ala}
\sac{Ala Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu
Gly Val Ala Thr Ala}
\sac{Ala Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Gly Gly Trp Thr Gly}
\sac{Met Ile Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Val Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Leu Val Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu
Gly Gly Trp Glu Gly}
\sac{Met Ile Ala Gly}
Claims (31)
1. Complejo molecular multifuncional para
transferir una composición de ácido nucleico a una célula diana,
comprendiendo dicho complejo molecular multifuncional:
A) el ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia que comprende uno o
más componentes de poliamina catiónica unidos al ácido nucleico y
que tiene la fórmula (1):
(1)NR(R^{3})-[-(CR^{1}R^{2})_{m}-N(R^{3})-]_{n}-(CR^{1}R^{2})_{m}-NR(R^{3})
en la
que:
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
m en cada caso se selecciona independientemente
de entre los enteros 2 a 5 inclusive;
n se selecciona de entre los enteros 1 a 10
inclusive; y
cada R^{3} se selecciona independientemente de
entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo
C_{1-6} y un componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma;
en la que dicho grupo de transferencia comprende
al menos un componente que favorece la destrucción de la membrana
del endosoma unido a un átomo de nitrógeno del componente de
poliamina catiónico; y
en la que cada componente que favorece la
destrucción de la membrana del endosoma se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por:
(a)-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3};
en la que R, R^{1}y R^{2} se
seleccionan cada uno independientemente de entre el grupo
constituido por hidrógeno y alquilo
C_{1-6};
j es un entero de 6 a 24 inclusive; y
B está ausente opcionalmente, o es un grupo de
unión de la fórmula:
(i)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-Z-;
(ii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-C(\text{=O})-Z-;
(iii)-(CR^{1}R^{2})_{k}-N(R)-\{C(\text{=O})-CH_{2}-O-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-(CH_{2})_{k}-N(R)\}_{p}-C(\text{=O})-Z-;
o
(iv)-(CR^{1}R^{2})_{k}-C(\text{=O})-\{-N(R)-[-(CH_{2})_{2}-O-]_{l}-CH_{2}-C(\text{=O})_{p}-Z-;
en la que k es, independientemente,
un entero de 1 a 6
inclusive;
l es un entero de 0 a 30 inclusive;
p es un entero de 1 a 4 inclusive;
R, R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6}; y
Z es O, S, N(R), o está ausente;
y
(b)
-B-(R^{4})R;
en la que R se selecciona cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6} o está
ausente;
B es un grupo puente seleccionado
independientemente de entre los grupos (i) a (iv) como se definió
anteriormente (a) en esta reivindicación, y además un grupo de
fórmula:
(v)-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X-
en la que j' es un entero de 1 a 8
inclusive;
R^{1} y R^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo C_{1-6};
X es O, S, N(R), o está ausente; y
R^{4} se selecciona independientemente de entre
el grupo constituido por:
(i) péptidos fusógenos que comprenden
glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados;
(ii) derivados del ácido cólico de fórmula
(2);
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- - -
representa un enlace sencillo o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición
de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el
sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6} es -H, -OH,
-CO_{2}H, -C(=O)NH_{2},
-OC(=O)NH_{2}, -NH_{2} o
-O(CH_{2}CH_{2}O)_{n'}H en la que n'
es un entero de 1 a 6 inclusive;
R^{7} es un radical que forma el punto de unión
del derivado de ácido cólico, que comprende un acilo
-C_{1-6} o el grupo
alquilcarbonilo-C_{1-6}; y
R^{8} es un grupo alquilo
C_{1-6}; y
(iii) colesteril derivados de fórmula (3):
en la
que:
- - -
representa un enlace simple o doble, formando una parte saturada o
insaturada del sistema de anillo de estas células con la condición
de que ambos enlaces no pueden estar insaturados, por lo que el
sistema de anillo es \Delta4 o \Delta5.
R^{6a} es un radical que forma el punto de
unión del derivado de colesterilo que comprende un grupo alquilo
C_{1-6}, -OC(=O)-, o
-OCH_{2}C(=O)-;
R^{7a} es un grupo
alquilo-C_{1-6}; y
R^{8a} es un grupo alquilo
C_{1-6}.
2. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} puede
tener la fórmula
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que B está ausente.
3. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 2, en el que j es 8 a 18.
4. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 2, en el que j es 8 a 12.
5. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} tiene
la fórmula
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R,
en la que X es N(R) y R^{4} se selecciona
independientemente de entre el grupo constituido por (i) péptidos
fusógenos que comprenden glucoproteínas en punta de virus
encapsulado de animales, y (ii) ácido cólico y derivados del mismo
seleccionados de entre el grupo constituido por éster y amida del
ácido 3\alpha, 7\alpha,
12\alpha-trihidroxi-5\beta-colan-24-oico.
6. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 5, en el que j' es 2 a 4.
7. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R^{3} puede
tener la fórmula
-(CR^{1}R^{2})_{j'}-X(R^{4})R,
en la que X es O o S y R^{4} se selecciona independientemente de
entre el grupo constituido por (i) péptidos fusógenos que comprenden
glucoproteínas en punta de virus de animales encapsulados, y (ii) un
grupo colesterilo y derivados del mismo seleccionados de entre el
grupo constituido por
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
\beta-carbamato y
-\beta-metilencarboxamida.
8. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 7, en el que R, R^{1} y R^{2} son cada uno
hidrógeno, donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6,
j' es un entero de 2 a 4 inclusive, y R^{4} es
colest-5-en-3'-\beta-carbonato,
-\beta-carbamato
o-\beta-metilencarboxamida.
9. Complejo molecular multifuncional según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el grupo del que
R^{3}se puede seleccionar comprende además grupos que tienen la
fórmula -B-(R^{5})R, y al menos uno de los
grupos R^{3} tiene la
fórmula-B-(R^{5})R;
en la que B es un grupo puente seleccionado
independientemente de entre los grupos (i) a (v) inclusive tal como
se define en la reivindicación 1;
R se selecciona independientemente de entre el
grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-6}
o está ausente; y
R^{5} es un componente del enlace específico
del receptor independientemente seleccionado de entre el grupo
constituido por:
(i) D-biotina;
(ii)
galactosil-\beta1-4-tioglucósido
de \beta-3'-propionilo;
(iii)
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(iv)
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
(v) 5-metiltetrahidrofolato;
(vi) ácido fólico;
(vii) ácido folínico;
(viii) tiomanósido de
\alpha-3'-propionilo; y
(ix)
tiomanósido-6-fosfato de
\alpha-3'-propionilo.
10. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 9, en el que al menos uno de los grupos R_{3} tiene
la fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}
-N(R^{5})R, en la que j' es 1 a 6.
11. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 10, en el que dos de los grupos R_{3} tienen la
fórmula -(CR^{1}R^{2})_{j'}
-N(R^{5})R.
12. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que al menos uno de los grupos R_{3} tiene
la fórmula
-B-(CR^{1}R^{2})_{j}-C(R)_{3},
en la que B está ausente, R, R^{1} y R^{2} son cada uno
hidrógeno donde quiera que se encuentren, m es 3 ó 4, n es 1 a 6 y j
es un entero de 8 a 18 inclusive.
13. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona
de entre el grupo constituido por:
N^{4}-octilespermidina;
N^{4}-dodecilespermidina;
N^{4}-octadecilespermidina;
N^{4}-octilespermina;
N^{4}-dodecilespermina; y
N^{4}-octadecilespermina.
14. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona
de entre el grupo constituido por:
N^{2}-octil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentilespermidina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octadecil-N^{4}-(5-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1''-4'-tioglucósido)amino)pentil-espermidina;
N^{6}-octil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
N^{2}-dodecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina;
y
N^{2}-octadecil-N^{4}-(5-[N^{2'},N^{6'}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6'}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]amino)pentilespermina.
15. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 1, en el que el grupo de transferencia se selecciona
de entre el grupo constituido por:
trihidrocloruro de N^{4}-(bencil
6'-hexanoil)-espermidina;
péptido de
N^{4}-(6'-hexanoil)-espermidina
HA2;
trihidrocloruro de
N^{4}-(5'-N-(3''\alpha,7''a,12''\alpha-trihidroxi-5''\beta-colanamido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de
N^{4}-(5-N-(\alpha-3'-propionamido
tiomanósido)pentil)-espermidina;
trihidrocloruro de
N^{4}-(N-CBZ-5-aminopentil)-espermidina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(N-CBZ-5-aminopentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(octil)espermina;
tetrahidrocloruro de
1,12-bis-N-guanidino-N^{4},N^{9}-bis(octil)-4,9-diaza-dodecano;
tetrahidrocloruro de
N^{4}-(5-N-(colesteno-3'\beta
carbamoil)pentil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(N,N-dimetil
12'-dodecanamida)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(bencil
12'-dodecanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de
N^{4},N^{9}-bis(12'-ácido
dodecanoico)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(bencil
12'-dodenanoil)-espermina;
tetrahidrocloruro de N^{4}-(12'-ácido
dodecanoico)-espermina;
tetraacetato de
N^{4},N^{9}-bis(5-(\alpha-3'-propionil
tiomanósido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(23'-N-(\alpha-3''-propionamido
tiomanósido)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricosanamido)aminopentil)-espermina;
tetraacetato de
N^{4}-(5-N-(O-(5-N-(\alpha-3''-propionamido
tiomanósido)pentil)-O-(2-acetamido)nonadecatileno
glicol)pentil)-espermina; y
tetraacetato de
N^{4}-(((23-[N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil]-amino)-3',6',9',12'-15'-18'-hexa-oxa-tricasanamido)aminopentil)-espermina.
16. Complejo molecular multifuncional según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende diferentes
componentes de poliamina catiónica.
17. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 16, que comprende un primer componente de poliamina
catiónica que tiene un componente que favorece la destrucción de la
membrana del endosoma ligado a éste y un segundo componente de
poliamina catiónica que tiene un componente con enlace específico
del receptor ligado a éste.
18. Complejo molecular multifuncional según
cualquier reivindicación anterior, en el que dicha composición de
ácido nucleico consiste en una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido o
proteína o sirve de plantilla para una molécula de ácido
nucleico.
19. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 18, en el que dicha composición de ácido nucleico es
un plásmido.
20. Composición farmacéutica que comprende un
complejo molecular multifuncional según cualquier reivindicación
anterior, o una sal o un éster farmacéuticamente aceptables de la
misma y un portador farmacéuticamente aceptable.
21. Utilización de un complejo molecular
multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para
la preparación de una composición farmacéutica para la transferencia
de la composición de ácido nucleico desde el complejo a las células
diana de un individuo.
22. Utilización de un complejo molecular
multifuncional según se define en la reivindicación 1, para la
preparación de un sistema de administración
auto-acoplado para la transferencia de una
composición de ácido nucleico a las células diana de un
individuo.
23. Grupo de transferencia según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho grupo de transferencia
comprende más de un componente de poliamina catiónica.
24. Grupo de transferencia según la
reivindicación 23, en el que un primer componente de poliamina
catiónica comprende un componente que favorece la destrucción de la
membrana del endosoma y un segundo componente de poliamina catiónica
comprende un componente con enlace específico del receptor.
25. Complejo molecular multifuncional útil para
la transferencia de una composición de ácido nucleico a las células,
en el que dicho complejo molecular multifuncional comprende:
A) una composición de ácido nucleico; y
B) un grupo de transferencia según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha poliamina catiónica no
esta unida por enlace covalente a dicha composición de ácido
nucleico.
26. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 23, en el que dicha composición de ácido nucleico
consiste en una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido o proteína o
sirve de plantilla para una molécula de ácido nucleico.
27. Complejo molecular multifuncional según la
reivindicación 26, en el que dicha composición de ácido nucleico es
un plásmido.
28. Complejo molecular multifuncional según
cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, que comprende una
poliamina catiónica unida a un componente del enlace específico del
receptor que comprende un compuesto seleccionado de entre el grupo
que consta de:
N^{2},N^{6}-bis(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisina;
y
N^{2},N^{6}-bis(\beta1-3'-propionil
galactosil-\beta1-4-tioglucósido)lisil-N^{6}-(\beta-3'-propionil
galactosil-\beta-4-tioglucósido)lisina.
29. Composición farmacéutica que comprende un
complejo molecular multifuncional según cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 28, o una sal o éster del mismo
farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente
aceptable.
30. Utilización de un complejo molecular
multifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28,
para la preparación de una composición farmacéutica para la
transferencia de la composición de ácido nucleico desde el complejo
a un individuo.
31. Utilización de un grupo de transferencia
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la preparación
de un sistema de administración auto-acoplado para
la transferencia de una composición de ácido nucleico a una célula
diana.
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