CN118525091A - 用于抑制gpam表达的rnai构建体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本披露涉及用于降低GPAM基因的表达的RNAi构建体，如siRNA。还描述了使用这样的RNAi构建体治疗或预防肝病如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法。

Description

用于抑制GPAM表达的RNAI构建体及其使用方法

技术领域

本发明涉及用于调节线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM)的肝脏表达的组合物和方法。特别地，本发明涉及经由RNA干扰降低GPAM表达的基于核酸的治疗剂、以及使用这样的基于核酸的治疗剂来治疗或预防肝病，例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)构成一系列肝病变，为世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻倍，且如今据估计影响了超过20％世界人口(Sattar等人(2014)BMJ[英国医学杂志]349:g4596；Loomba和Sanyal(2013)Nature Reviews Gastroenterology&hepatology[自然评论：胃肠病学和肝病学]10(11):686-690；Kim和Kim(2017)ClinGastroenterol Hepatol[临床胃肠病学和肝病学]15(4):474-485；Petta等人(2016)DigLiver Dis[消化病和肝病]48(3):333-342；Huang等人(2021)Nat Rev Gastro&Hepatology[自然评论胃肠病学和肝病学杂志](18):223-238)。NAFLD开始于肝脏中的甘油三酯积累，且定义为个体中超过5％的肝细胞中存在细胞质脂滴，该个体1)无明显饮酒史且2)其中其他类型肝病的诊断已被排除在外(Zhu等人(2016)World J Gastroenterol[世界胃肠病学杂志]22(36):8226-33；Rinella(2015)JAMA[美国医学会杂志]313(22):2263-73；Yki-Jarvinen(2016)Diabetologia[糖尿病学]59(6):1104-11)。在一些个体中，肝脏中异位脂肪的积累(称为脂肪变性)触发炎症和肝细胞损伤，导致称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的更晚期疾病(Rinella，同上)。截至2015年，预计7500万至1亿名美国人患有NAFLD，其中NASH占NAFLD诊断的大约10％-30％(Rinella，同上；Younossi等人(2016)Hepatology[肝病学]64(5):1577-1586)。

具有在Genbank XM_005269998.1中发现的序列的线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM、GPAT1)与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关。GPAM的错义突变与肝脏脂肪过量积累和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关的表型相关(Jamialahmadi,O.等人，Exome-WideAssociation Study on Alanine Aminotransferase Identifies Sequence Variants inthe GPAM and APOE Associated With Fatty Liver Disease.[丙氨酸转氨酶全外显子组关联研究鉴定了与脂肪肝疾病相关的GPAM和APOE序列变体]Gastroenterology[胃肠病学],2021.160(5):第1634-1646页e7)。

目前，NAFLD症状是经由减重和治疗任何继发性病症来控制的，因为没有药理学治疗获得批准。因此，需要在受影响的个体中治疗NAFLD的组合物和方法。

发明内容

本披露提供了包含有义链和反义链的RNAi构建体，其中该反义链包含具有与GPAMmRNA序列(例如，表1所示的GPAM mRNA序列)互补的序列的区域，并且其中该RNAi构建体抑制GPAM的表达。在某些实施例中，RNAi构建体包含具有与在表2中列出的反义序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的区域。在一些实施例中，反义链与表1中列出的GPAMmRNA序列杂交。

在一些实施例中，本文所述的RNAi构建体的有义链包含与反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。在这些和其他实施例中，有义链和反义链的长度各自为约15至约30个核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个钝端。在其他实施例中，RNAi构建体包含至少一个核苷酸突出端。这样的核苷酸突出端可包含至少1至6个未配对核苷酸，且可位于有义链的3’端、反义链的3’端、或有义链和反义链两者的3’端。在某些实施例中，RNAi构建体在有义链3’端和反义链3’端处包含两个未配对核苷酸的突出端。在其他实施例中，RNAi构建体在反义链3’端处包含具有两个未配对核苷酸的突出端，且在有义链3’端/反义链5’端包含钝端。

本发明的RNAi构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸，包括对核糖环、核碱基或磷酸二酯主链具有修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含一种或多种经2'-修饰的核苷酸。此类经2'-修饰的核苷酸可包括经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-O-甲基修饰的核苷酸、经2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(BNA)、乙二醇核酸(GNA)、反向碱基(例如反向腺苷)或其组合。在一个特定实施例中，RNAi构建体包含一个或多个经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。在一些实施例中，RNAi构建体的有义链和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。

在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个主链修饰，如经修饰的核苷酸间或核苷间键。在某些实施例中，本文所述的RNAi构建体包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在特定实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于有义链和/或反义链的3’或5’端。

在一些实施例中，本发明的RNAi构建体的反义链和/或有义链可包含来自表2中列出的反义和有义序列的序列或由其组成。在某些实施例中，RNAi构建体可为表2中列出的任一种双链体化合物。

本披露还提供了组合物，该组合物包含上述RNAi构建体和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂；以及在有需要的患者中降低GPAM表达的方法，这些方法包括向该患者施用上述RNAi构建体或组合物。

具体实施方式

本发明部分地基于靶向GPAM基因且降低肝脏细胞中GPAM表达的RNAi构建体的设计和产生。GPAM表达的特异性抑制可用于治疗或预防与GPAM表达相关的病症，包括肝相关疾病，例如单纯性脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化(肝的不可逆的、晚期瘢痕形成)、或GPAM相关性肥胖。

本披露提供了用于调节线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM)基因的表达的组合物和方法。在一些实施例中，基因可处于细胞或受试者(如哺乳动物(例如人))内。在一些实施例中，本发明的组合物包含靶向GPAM mRNA并且降低细胞或哺乳动物中GPAM表达的RNAi构建体。此类RNAi构建体可用于治疗或预防各种形式的肝相关疾病，例如单纯性脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化(肝的不可逆的、晚期瘢痕化)、或GPAM相关性肥胖。

人类遗传证据指示GPAM rs2792751(T)中的单核苷酸多态性(SNP)为“促进NAFLD”。此SNP是一种常见的错义突变，其导致GPAM中的氨基酸发生变化：Ile43Val。此SNP的携带者表现出磁共振成像质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)增加，并且患脂肪肝和全因肝硬化的风险(比值比，OR)增加。携带者还表现出升高的血清总胆固醇、LDL、HDL、甘油三酯(TG)、ALT和ALP，升高的中性粒细胞和性激素结合球蛋白水平(Haas,M.E.等人，Machinelearning enables new insights into clinical significance of and geneticcontributions to liver fat accumulation[机器学习使人们对肝脏脂肪积累的临床意义和遗传贡献有了新的认识]2020:medRxiv2020.09.03.20187195；Jamialahmadi,O.等人，Exome-Wide Association Study on Alanine Aminotransferase Identifies SequenceVariants in the GPAM and APOE Associated With Fatty Liver Disease.[丙氨酸转氨酶全外显子组关联研究鉴定了与脂肪肝疾病相关的GPAM和APOE序列变体]Gastroenterology[胃肠病学],2021.160(5):第1634-1646页e7；Hammond,L.E.等人，Mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase-deficient mice havereduced weight and liver triacylglycerol content and altered glycerolipidfatty acid composition[缺乏线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶的小鼠体重和肝脏三酰甘油含量降低，并且甘油脂质脂肪酸组成发生改变]Mol Cell Biol[细胞分子生物],2002.22(23):第8204-14页)。因此，人类数据证据指示GPAM siRNA介导的疗法治疗NASH患者的正确方向性。

GPAM的遗传学与已知的其作用机制和生物学一致。GPAM的功能性酶作用已得到很好的表征(Gimeno,R.E.和J.Cao,Thematic review series:glycerolipids.[专题回顾系列：甘油脂质]Mammalian glycerol-3-phosphate acyltransferases:new genes for anold activity.[哺乳动物甘油-3-磷酸酯酰基转移酶：旧活动的新基因]J Lipid Res[脂类研究杂志],2008.49(10):第2079-88页；Gonzalez-Baro,M.R.,T.M.Lewin，和R.A.Coleman,Regulation of Triglyceride Metabolism.[甘油三酯代谢的调节]II.Function ofmitochondrial GPAT1 in the regulation of triacylglycerol biosynthesis andinsulin action.[线粒体GPAT1在三酰甘油生物合成和胰岛素作用调节中的功能]Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol[美国生理学杂志-胃肠道和肝脏生理学],2007.292(5):第G1195-9页)。主要在脂肪形成组织中表达的GPAM蛋白位于线粒体外膜，并且将酰基辅酶A从甘油-3-磷酸酯转移到溶血磷脂酸，作为启动TG合成途径的限速步骤。缺乏GPAM的小鼠具有生存能力和生育能力，且未表现出任何严重异常(Hammond等人(2002))。在高脂肪饮食下，缺乏GPAM的小鼠不会出现脂肪垫增加、肝脏TG积累、血清脂质升高的现象，并且表现出增加的肝细胞β-氧化、血浆酮水平，以及减少的TG合成(Hammond等人(2002)；Hammond,L.E.等人，Mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase-1is essential in liver for the metabolism of excess acyl-CoAs.[线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶-1对于肝脏中过量酰基辅酶A的代谢至关重要]J Biol Chem[生物化学杂志],2005.280(27):第25629-36页；Kuhajda,F.P.等人，Pharmacological glycerol-3-phosphate acyltransferase inhibition decreases food intake and adiposity andincreases insulin sensitivity in diet-induced obesity.[药理学甘油-3-磷酸酯酰基转移酶抑制减少食物摄入和肥胖，并增加饮食引起的肥胖的胰岛素敏感性]Am JPhysiolRegul Integr Comp Physiol[美国生理学杂志-监管综合和比较生理学],2011.301(1):第R116-30页；Wendel,A.A.等人，Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1deficiency inob/ob mice diminishes hepatic steatosis but does not protect against insulinresistance or obesity.[ob/ob小鼠的甘油-3-磷酸酯酰基转移酶1缺乏减轻肝脏脂肪变性，但不预防胰岛素抵抗或肥胖]Diabetes[糖尿病],2010.59(6):第1321-9页；Xu,H.等人，Hepatic knockdown of mitochondrial GPAT1 in ob/ob mice improves metabolicprofile.[ob/ob小鼠肝脏线粒体GPAT1敲低可改善代谢状况]Biochem Biophys ResCommun[生物化学和生物物理研究通讯],2006.349(1):第439-48页)。

GPAM在临床前非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型中的作用已被描述(Liao,K.等人，Glycerol-3-phosphate Acyltransferase1 Is a Model-Agnostic Node inNonalcoholic Fatty Liver Disease:Implications for Drug Development andPrecision Medicine.[甘油-3-磷酸酯酰基转移酶1是非酒精性脂肪性肝病的模型不可知节点：对药物开发和精准医学的影响]ACS Omega[美国化学学会Ω],2020.5(29):第18465-18471页)。使用三种不同的动物模型来诱导NASH和纤维化程度的增加，观察到GPAM mRNA和蛋白质表达的增加与NAFLD活动评分(NAS)和纤维化的增加之间存在直接相关性。研究还表明，缺乏GPAM的小鼠可以预防肝细胞癌(HCC)(Ellis,J.M.等人，Mice deficient inglycerol-3-phosphate acyltransferase-1have a reduced susceptibility to livercancer.[缺乏甘油-3-磷酸酯酰基转移酶-1的小鼠患肝癌的几率降低]Toxicol Pathol[毒理学病理学杂志],2012.40(3):第513-21页)。因此，除了调节脂肪变性之外，数据表明沉默肝脏中的GPAM可能会改善严重的肝脏后果(Li,X.等人，Genomic analysis of livercancer unveils novel driver genes and distinct prognostic features.[肝癌基因组分析揭示了新颖的驱动基因和独特的预后特征]Theranostics[治疗诊断学],2018.8(6):第1740-1751页；Ng,C.K.Y.等人，Proteogenomic characterization ofhepatocellular carcinoma.[肝细胞癌的蛋白质组学特征]2021:bioRxiv2021.03.05.434147)。

RNA干扰(RNAi)为将外源性RNA引入细胞，导致编码靶向的蛋白质的mRNA特异性降解，从而导致蛋白质表达降低的过程。RNAi技术和肝递送两者的进展以及用其他基于RNAi的疗法的不断增长的积极结果表明，RNAi是通过直接靶向GPAM来治疗学上治疗NAFLD的有力手段。

如本文所用，术语“RNAi构建体”是指包含RNA分子的试剂，该RNA分子在被引入细胞时能够通过RNA干扰机制下调靶基因(例如GPAM)的表达。“RNA干扰”是核酸分子以序列特异性方式(例如通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径)诱导靶RNA分子(例如，信使RNA或mRNA分子)的切割和降解的过程。在一些实施例中，RNAi构建体包含双链RNA(dsRNA)分子，该分子包含两条反平行的连续核苷酸链，其彼此充分互补以杂交形成双链体区。双链RNAi构建体也可以被称为RNAi“触发物”。术语“杂交(hybridize或hybridization)”是指互补多核苷酸的配对，典型地经由在两个多核苷酸中的互补碱基之间的氢键合(例如，Watson-Crick氢键合、Hoogsteen氢键合或反向Hoogsteen氢键合)而配对。包含具有与靶序列(例如靶mRNA)基本上互补的序列的区域的链被称为“反义链”。“有义链”是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的链。在一些实施例中，有义链可以包含具有与靶序列基本上相同的序列的区域。

在某些实施例中，双链RNA的有义链和反义链可以是两个单独的分子，这两个分子杂交而形成双链体区，否则是未连接的。由两条单独的链形成的这样的双链RNA分子被称为“小干扰RNA”或“短干扰RNA”(siRNA)。siRNA是一类非编码双链RNA分子，通常约有20-27个碱基对，是RNAi的核心。因此，在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含siRNA。在其他实施例中，RNAi构建体可以是微小RNA(也称为“miRNA”或“成熟miRNA”)。miRNA是存在于植物、动物和一些病毒中的小的(长度大约18-24个核苷酸)非编码RNA分子。miRNA类似于siRNA，但miRNA源自发夹mRNA结构。miRNA通过与靶mRNA的互补区域进行碱基配对来调节基因表达。

在一些实施例中，本发明是针对GPAM的RNAi构建体。在一些实施例中，RNAi构建体是包含有义链和反义链的siRNA，其中该反义链包含与GPAM mRNA序列互补的区域。RNAi反义链的区域可以与GPAM mRNA序列的任何合适的区域互补。

在一些实施例中，RNAi构建体结合GPAM rs2792751(T)位点。然而，所披露的RNAi构建体不需要与特定的GPAM SNP杂交。在一些实施例中，RNAi构建体是含有表1或2中列出的任何序列的siRNA分子。

双链RNAi分子可以包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括对核糖核苷酸的核糖、碱基或主链组分的修饰，如本文所述或本领域已知那些。出于本披露的目的，术语“双链RNA”涵盖如在双链RNA分子(例如siRNA、shRNA等)中所采用的任何这样的修饰。

如本文所用，若包含第一序列的多核苷酸可以在某些条件(如生理条件)下与包含第二序列的多核苷酸杂交形成双链体区，则该第一序列与该第二序列“互补”。其他这样的条件可以包括本领域普通技术人员已知的中等或严格杂交条件。若在一个或两个核苷酸序列的整个长度上包含第一序列的多核苷酸与包含第二序列的多核苷酸碱基配对而无任何错配，则认为该第一序列与该第二序列完全互补(100％互补)。若序列与靶序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，则该序列与靶序列“基本上互补”。互补百分比可以通过将第一序列中与第二或靶序列中对应位置处的碱基互补的碱基数除以该第一序列的总长度来计算。若在两个序列杂交时在30个碱基对的双链体区上存在不超过5个、4个、3个、2个或1个错配，则还可说序列与另一个序列基本上互补。通常，若存在如本文所定义的任何核苷酸突出端，则在确定两个序列之间的互补程度时不考虑这样的突出端的序列。举例而言，长度为21个核苷酸的有义链和长度为21个核苷酸的反义链杂交形成在各链3’端处具有2个核苷酸突出端的19个碱基对双链体区，这两条链将被认为是完全互补，如该术语在本文中所用。

在一些实施例中，反义链的区域包含与靶RNA序列(例如GPAM mRNA)的区域完全互补的序列。在这样的实施例中，有义链可以包含与反义链的序列完全互补的序列。在其他此类实施例中，有义链可包含与反义链的序列基本上互补的序列，例如，在由有义链和反义链形成的双链体区中有1、2、3、4或5个错配。在某些实施例中，优选在末端区域内(例如，在链5’端和/或3’端的6、5、4、3、2或1个核苷酸内)发生任何错配。在一个实施例中，由有义链和反义链形成的双链体区中的任何错配理想地发生在反义链5’端的6、5、4、3、2或1个核苷酸内。

当dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子构成时，那些分子不需要但可以共价连接。如果两条链通过以除了在一条链的3’端与相应的另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链以外的方式共价连接从而形成双链体结构，则连接结构被称为“接头”。RNA链可具有相同或不同数目的核苷酸。双链体中碱基对的最大数目为dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除双链体结构外，RNAi可包含一个或多个核苷酸突出端。

在其他实施例中，杂交形成双链体区的有义链和反义链可为单个RNA分子的一部分，即有义链和反义链为单个RNA分子的自身互补区的一部分。在这样的情况下，单个RNA分子包含双链体区(也称为茎区)和环区。有义链的3’端通过将形成环区的连续未配对核苷酸序列与反义链的5’端连接。环区典型地具有足够的长度以允许RNA分子自身向后折叠，使得反义链可以与有义链碱基配对以形成双链体或茎区。环区可以包含约3至约25、约5至约15、或约8至约12个未配对核苷酸。如本文所指出，具有至少部分自我互补区的这样的RNA分子被称为“短发夹RNA”(shRNA)。在一些实施例中，环区可包含至少1、2、3、4、5、10、20或25个未配对核苷酸。在其他实施例中，环区可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或更少个未配对核苷酸。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体包含shRNA。单个的至少部分自我互补的RNA分子的长度可以是约35个核苷酸至约100个核苷酸、约45个核苷酸至约85个核苷酸、或约50至约60个核苷酸，并且包含双链体区和环区，各区具有本文所叙述的长度。

在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含有义链和反义链，其中反义链包含具有与GPAM信使RNA(mRNA)序列基本上或完全互补的序列的区域。如本文所用，“GPAM mRNA序列”是指编码GPAM蛋白(包括来自任何物种(例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物、人)的GPAM蛋白变体或同种型)的任何信使RNA序列，包括剪接变体。GPAM蛋白也称为GPAT或GPAT1。

GPAM mRNA序列还包括表达为其互补DNA(cDNA)序列的转录物序列。cDNA序列是指表达为DNA碱基(例如，鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)而非RNA碱基(例如，鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶)的mRNA转录物的序列。因此，本发明的RNAi构建体的反义链可以包含具有与靶GPAM mRNA序列或GPAM cDNA序列基本上或完全互补的序列的区域。GPAM mRNA或cDNA序列可以包括但不限于任何GPAM mRNA或cDNA序列，如可以衍生自NCBI参考序列NM_001244949.2或NM_020918.6。

反义链的区域可以与GPAM mRNA序列的至少15个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施例中，GPAM mRNA序列的靶区(其反义链包含互补区)的范围可以是从约15至约30个连续核苷酸、从约16至约28个连续核苷酸、从约18至约26个连续核苷酸、从约17至约24个连续核苷酸，从约19至约25个连续核苷酸、从约19至约23个连续核苷酸、或从约19至约21个连续核苷酸。在某些实施例中，包含与GPAM mRNA序列基本上或完全互补的序列的反义链的区域，在一些实施例中，可以包含来自在表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸。在其他实施例中，反义序列包含来自表2中列出的反义序列的至少16、至少17、至少18或至少19个连续核苷酸。在一些实施例中，有义和/或反义序列包含来自表2中列出的序列且具有不超过1、2或3个核苷酸错配的至少15个核苷酸。

RNAi构建体的有义链典型地包含与反义链的序列充分互补，使得两条链在生理条件下杂交以形成双链体区的序列。“双链体区”是指在两个互补或基本上互补的多核苷酸中的区域，这两个多核苷酸通过Watson-Crick碱基配对或其他氢键合相互作用而相互形成碱基对，从而在两个多核苷酸之间产生双链体。RNAi构建体的双链体区应具有足够的长度以允许RNAi构建体例如通过接合Dicer酶和/或RISC复合物(描述在下面)进入RNA干扰途径。例如，在一些实施例中，双链体区的长度为约15至约30个碱基对。在该范围内的双链体区的其他长度也是合适的，如约15至约28个碱基对、约15至约26个碱基对、约15至约24个碱基对、约15至约22个碱基对、约17至约28个碱基对、约17至约26个碱基对、约17至约24个碱基对、约17至约23个碱基对、约17至约21个碱基对、约19至约25个碱基对、约19至约23个碱基对、或约19至约21个碱基对。在一个实施例中，双链体区的长度为约17至约24个碱基对。在另一个实施例中，双链体区的长度为约19至约21个碱基对。

在一些实施例中，本发明的RNAi构建体含有约24至约30个核苷酸的双链体区，其与靶RNA序列(例如GPAM靶mRNA序列)相互作用，从而指导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，引入细胞内的长双链RNA可通过称为Dicer的III型内切核酸酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:485)。Dicer为核糖核酸酶-III样酶，其将dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3’突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人，(2001)Nature[自然]409:363)。然后将siRNA掺入经RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链体，使得互补反义链能够指导靶识别(Nykanen等人，(2001)Cell[细胞]107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种内切核酸酶使靶裂解，以诱导沉默(Elbashir等人(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:188)。

对于其中有义链和反义链为两个单独分子的实施例(例如siRNA RNAi构建体)，有义链和反义链的长度不需要与双链体区的长度相同。例如，一条或两条链可能长于双链体区，且具有侧接该双链体区的一个或多个未配对核苷酸或错配。因此，在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个核苷酸突出端。如本文所用，“核苷酸突出端”是指延伸超过在链末端处的双链体区的未配对的一个或多个核苷酸。当一条链的3’端延伸超过另一条链的5’端或当一条链的5’端延伸超过另一条链的3’端时，典型地产生核苷酸突出端。核苷酸突出端的长度通常是在1与6个核苷酸之间、1与5个核苷酸之间、1与4个核苷酸之间、1与3个核苷酸之间、2与6个核苷酸之间、2与5个核苷酸之间、或2与4个核苷酸之间。在一些实施例中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6个核苷酸。在一个特定实施例中，核苷酸突出端包含1至4个核苷酸。在某些实施例中，核苷酸突出端包含2个核苷酸。突出端中的核苷酸可为如本文所述的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一些实施例中，突出端包含5'-尿苷尿苷-3'(5'-UU-3')二核苷酸。在这样的实施例中，UU二核苷酸可包含核糖核苷酸或经修饰的核苷酸，例如经2’-修饰的核苷酸。在其他实施例中，突出端包含5’-脱氧胸苷-脱氧胸苷-3’(5’-dTdT-3’)二核苷酸。

核苷酸突出端可以在一条或两条链的5’端或3’端处。例如，在一个实施例中，RNAi构建体在反义链的5’端和3’端处包含核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体在有义链的5’端和3’端处包含核苷酸突出端。在一些实施例中，RNAi构建体在有义链的5’端和反义链的5’端处包含核苷酸突出端。在其他实施例中，RNAi构建体在有义链的3’端和反义链的3’端处包含核苷酸突出端。

RNAi构建体可以在双链RNA分子的一端处包含单个核苷酸突出端，且在另一个末端处包含钝端。“钝端”意指有义链与反义链在分子末端处完全碱基配对，并且不存在延伸超过双链体区的未配对核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体在有义链3’端处包含核苷酸突出端，且在有义链5’端和反义链3’端处包含钝端。在其他实施例中，RNAi构建体在反义链3’端处包含核苷酸突出端，且在反义链5’端和有义链3’端处包含钝端。在某些实施例中，RNAi构建体在双链RNA分子两端处包含钝端。在这样的实施例中，有义链和反义链具有相同长度，且双链体区的长度与有义链和反义链相同(即，该分子在其整个长度上为双链)。

有义链和反义链可各自独立地为任何合适的长度，如约15至约30个核苷酸长度、约18至约28个核苷酸长度、约19至约27个核苷酸长度、约19至约25个核苷酸长度、约19至约23个核苷酸长度、约21至约25个核苷酸长度、或约21至约23个核苷酸长度。在某些实施例中，有义链和反义链的长度各自为约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、或约25个核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链具有相同的长度，但形成短于这些链从而使得RNAi构建体具有两个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链3’端和反义链3’端两者处有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链3’端和反义链3’端处有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在其他实施例中，有义链和反义链具有相同长度且在其整个长度上形成双链体区，使得在双链分子的任一端上不存在核苷酸突出端。在一个这样的实施例中，RNAi构建体为钝端的且包含(i)其长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为21个碱基对的双链体区。在另一个实施例中，RNAi构建体为钝端的且包含(i)其长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为23个碱基对的双链体区。

在其他实施例中，有义链或反义链长于另一条链，且两条链形成长度等于较短链长度从而使得RNAi构建体包含至少一个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度为19个核苷酸的有义链、(ii)长度为21个核苷酸的反义链、(iii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链3’端处有2个未配对核苷酸的单个核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度为21个核苷酸的有义链、(ii)长度为23个核苷酸的反义链、(iii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链3’端处有2个未配对核苷酸的单个核苷酸突出端。

本发明的RNAi构建体的反义链可包含表2中列出的任一反义序列的序列。

经修饰的核苷酸

本发明的RNAi构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸。“经修饰的核苷酸”是指具有对核苷、核碱基、戊糖环、或磷酸酯基团的一个或多个化学修饰的核苷酸。如本文所用，经修饰的核苷酸不涵盖含有腺苷一磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷一磷酸和胞苷一磷酸的核糖核苷酸，以及含有脱氧腺苷一磷酸、脱氧鸟苷一磷酸、脱氧胸苷一磷酸和脱氧胞苷一磷酸的脱氧核糖核苷酸。然而，RNAi构建体可包含经修饰的核苷酸、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。将经修饰的核苷酸掺入双链RNA分子的一条或两条链中可以例如通过降低分子对核酸酶和其他降解过程的敏感性来改善RNA分子的体内稳定性。还可通过掺入经修饰的核苷酸来增强RNAi构建体降低靶基因表达的效力。

在某些实施例中，经修饰的核苷酸具有核糖的修饰。这些糖修饰可包括戊糖环的2’和/或5’位置处的修饰以及双环糖修饰。经2’-修饰的核苷酸是指具有戊糖环的核苷酸，该戊糖环在2’位置处具有除H或OH以外的取代基。此类2'修饰包括但不限于2'-O-烷基(例如O-C1-C10或O-C1-C10取代的烷基)、2'-O-烯丙基(O-CH2CH＝CH2)、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-甲基(OCH3)、2'-O-甲氧基乙基(O-(CH2)2OCH3)、2'-OCF3、2'-O(CH2)2SCH3、2'-O-氨基烷基、2'-氨基(例如NH₂)、2'-O-乙胺和2'-叠氮基。在戊糖环的5’位置处的修饰包括但不限于5’-甲基(R或S)、5’-乙烯基和5’-甲氧基。

“双环糖修饰”是指戊糖环的修饰，其中桥将环的两个原子连接而形成第二环从而产生双环糖结构。在一些实施例中，双环糖修饰包含在戊糖环的4’与2’碳之间的桥。包含具有双环糖修饰的糖部分的核苷酸在本文中称为“双环核酸”或“BNA”。示例性双环糖修饰包括但不限于α-L-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’)双环核酸(BNA)；β-D-亚甲基氧基(4'-CH₂-O-2')BNA(也称为锁核酸或LNA)；亚乙基氧基(4’-(CH₂)2-O-2’)BNA；氨基氧基(4’-CH₂-O-N(R)-2’)BNA；氧基氨基(4’-CH₂-N(R)-O-2’)BNA；甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH₃)-O-2’)BNA(也称为受限乙基或cEt)；亚甲基-硫代(4’-CH₂-S-2’)BNA；亚甲基-氨基(4’-CH₂-N(R)-2’)BNA；甲基碳环(4’-CH₂-CH(CH3)-2’)BNA；丙烯碳环(4’-(CH₂)3-2’)BNA；和甲氧基(亚乙基氧基)(4’-CH(CH₂OMe)-O-2’)BNA(也称为受限MOE或cMOE)。可以掺入本发明的RNAi构建体中的这些和其他经糖修饰的核苷酸描述于例如美国专利9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology[化学和生物学],19:937-954(2012)。

在一些实施例中，RNAi构建体包含一个或多个经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-O-甲基修饰的核苷酸、经2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(BNA)、或其组合。在某些实施例中，RNAi构建体包含一个或多个经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-O-甲基修饰的核苷酸、经2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。在一个特定实施例中，RNAi构建体包含一个或多个经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。

RNAi构建体的有义链和反义链均可包含一个或多个经修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在某些实施例中，有义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在一些实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在其他实施例中，反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在某些其他实施例中，有义链中的所有核苷酸和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在这些和其他实施例中，经修饰的核苷酸可为经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。

在一些实施例中，有义链和/或反义链中的腺苷核苷酸之前的所有嘧啶核苷酸均为经修饰的核苷酸。例如，当序列5’-CA-3’或5’-UA-3’出现在任一链中时，胞苷和尿苷核苷酸为经修饰的核苷酸，优选经2’-O-甲基修饰的核苷酸。在某些实施例中，有义链中的所有嘧啶核苷酸均为经修饰的核苷酸(例如经2’-O-甲基修饰的核苷酸)，且在反义链中的序列5’-CA-3’或5’-UA-3’的所有出现中的5’核苷酸为经修饰的核苷酸(例如经2’-O-甲基修饰的核苷酸)。在其他实施例中，双链体区中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在这样的实施例中，经修饰的核苷酸优选为经2’-O-甲基修饰的核苷酸、经2’-氟修饰的核苷酸、或其组合。

在RNAi构建体包含核苷酸突出端的实施例中，突出端中的核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一个实施例中，突出端中的核苷酸为脱氧核糖核苷酸，例如脱氧胸苷。在另一个实施例中，突出端中的核苷酸为经修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，突出端中的核苷酸为经2’-O-甲基修饰的核苷酸、经2’-氟修饰的核苷酸、经2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。

本披露的RNAi构建体还可以包含一个或多个经修饰的核苷酸间键。如本文所用，术语“经修饰的核苷酸间键”是指除天然3’至5’磷酸二酯键外的核苷酸间键。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键为含磷核苷酸间键，如磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如，膦酸甲酯、3’-亚烷基膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如，3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代磷酸酯(P＝S)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一个实施例中，经修饰的核苷酸间键为2’至5’磷酸二酯键。在其他实施例中，经修饰的核苷酸间键为不含磷核苷酸间键，且因此可称为经修饰的核苷间键。这样的不含磷的键包括但不限于吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷键(-O-Si(H)₂-O-)；硫化物、亚砜和砜键；甲酰基和硫代甲酰基键；含烯的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基甲基亚氨基(-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-)和亚甲基肼键；磺酸酯和磺酰胺键；酰胺键；以及具有混合的N、O、S和CH₂组分部分的其他键。在一个实施例中，经修饰的核苷间键为产生肽核酸或PNA的基于肽的键(例如氨基乙基甘氨酸)，如美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262中所述的那些。可以在披露的RNAi构建体中使用的其他合适的经修饰的核苷酸间和核苷间键描述于美国专利6,693,187和9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及Deleavey和Damha，同上中。

在某些实施例中，RNAi构建体包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯核苷酸间键可以存在于RNAi构建体的有义链、反义链或两条链中。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在仍其他实施例中，两条链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。RNAi构建体可以在有义链、反义链或两条链的3’-端、5’-端、或3’-端和5’-端两者处包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，在某些实施例中，RNAi构建体在有义链、反义链、或两条链的3’端处包含约1至约6或更多个(例如约1、2、3、4、5、6或更多个)连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，RNAi构建体在有义链、反义链或两条链的5’端处包含约1至约6或更多个(例如约1、2、3、4、5、6或更多个)连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi构建体在有义链的3'端处包含单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi构建体包含在有义链3’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键和在反义链3’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi构建体包含在有义链的5’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键和在有义链的3’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi构建体包含在反义链5’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键和在反义链3’端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施例中，RNAi构建体在反义链3’端处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即在反义链3’端处的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3’端和5’端两者处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在又另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3’端和5’端两者处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键，且在有义链5’端处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在仍另一个实施例中，RNAi构建体在反义链3’端和5’端两者处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键，且在有义链3’端和5’端两者处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即，在反义链5’端和3’端两者的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键和在有义链5’端和3’端两者处第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在一条或两条链包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键的任何实施例中，链内剩余核苷酸间键可为天然3’至5’磷酸二酯键。例如，在一些实施例中，有义链和反义链中的每个核苷酸间键选自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一个核苷酸间键为硫代磷酸酯。

在RNAi构建体包含核苷酸突出端的实施例中，该突出端中的两个或更多个未配对核苷酸可通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在某些实施例中，反义链和/或有义链的3’端处的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在其他实施例中，反义链和/或有义链的5’端处的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在仍其他实施例中，任何核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。

在某些实施例中，掺入本发明RNAi构建体的一条或两条链中的经修饰的核苷酸具有核碱基(在本文中也称为“碱基”)的修饰。“经修饰的核碱基”或“经修饰的碱基”是指除天然存在的嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)以外的碱基。经修饰的核碱基可为合成的或天然存在的修饰，包括但不限于通用碱基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤(X)、次黄嘌呤(I)、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、和腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

在一些实施例中，经修饰的碱基为通用碱基。“通用碱基”是指在不改变所得到的双链体区的双螺旋结构的情况下，与RNA和DNA中的全部天然碱基不加选择地形成碱基对的碱基类似物。通用碱基对于本领域技术人员而言是已知的，并且包括但不限于肌苷、C-苯基、C-萘基和其他芳香族衍生物、唑酰胺类、和硝基唑衍生物(如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚)。

可以并入本发明RNAi构建体中的其他合适的经修饰碱基包括例如在Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.[反义核酸药物开发],10:297-310(2000)和Peacock等人，J.Org.Chern.[有机化学杂志],76:7295-7300(2011)中描述的那些。本领域技术人员充分了解鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可被其他核碱基(如上述经修饰的核碱基)替代，而基本上不改变包含携带这样的替代核碱基的核苷酸的多核苷酸的碱基配对特性。

在一些实施例中，披露的RNAi构建体的有义链、反义链、或者反义链和有义链两者的5’端包含磷酸酯部分。如本文所用，术语“磷酸酯部分”是指包括未经修饰的磷酸酯(-O-P＝O)(OH)OH)以及经修饰的磷酸酯的末端磷酸酯基团。经修饰的磷酸酯包括如下的磷酸酯，其中O和OH基团中的一个或多个被H、O、S、N(R)或烷基所替代，其中R是H、氨基保护基团或者未经取代或经取代的烷基。示例性磷酸酯部分包括但不限于5’-单磷酸酯；5’二磷酸酯；5’-三磷酸酯；5’-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)；5’-腺苷帽或任何其他经修饰或未经修饰的核苷酸帽结构；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯)；5’-α-硫代三磷酸酯；5’-γ-硫代三磷酸酯、5’-氨基磷酸酯；5’-乙烯基磷酸酯；5’-烷基膦酸酯(其中“烷基”可以为甲基、乙基、异丙基、丙基等)；和5’-烷基醚膦酸酯(其中“烷基醚”可以为甲氧基甲基、乙氧基甲基等)。

可掺入本发明的RNAi构建体中的经修饰的核苷酸可具有本文所述的多于一种化学修饰。例如，经修饰的核苷酸可以具有对核糖的修饰以及对核碱基的修饰。举例而言，经修饰的核苷酸可包含2'糖修饰(例如2'-氟基或2'-甲基)且包含经修饰的碱基(例如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶)。在其他实施例中，经修饰的核苷酸可以包含糖修饰与对5’磷酸的修饰的组合，当将经修饰的核苷酸掺入多核苷酸时，这些修饰将产生经修饰的核苷酸间或核苷间键。例如，在一些实施例中，经修饰的核苷酸可包含糖修饰，如2’-氟修饰、2’-O-甲基修饰、或双环糖修饰、以及5’硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施例中，本发明的RNAi构建体的一条或两条链包含经2'修饰的核苷酸或BNA与硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体的有义链和反义链均包含经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-O-甲基修饰的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。包含经修饰的核苷酸和核苷酸间键的示例性RNAi构建体显示在表2中。

RNAi构建体的功能

本发明的RNAi构建体理想地降低或抑制GPAM在细胞(特别是肝脏细胞)中的表达。因此，在一个实施例中，本发明提供一种通过使细胞与本文所述的任何RNAi构建体接触来降低细胞中的GPAM表达的方法。细胞可以是体外或体内的。可以通过测量GPAM mRNA、GPAM蛋白、或者与GPAM表达有关的另一种生物标志物的量或水平来对GPAM表达进行评估。可以相对于GPAM在未用RNAi构建体处理或用对照RNAi构建体处理的细胞或动物中的表达来确定在用本发明的RNAi构建体处理的细胞或动物中的GPAM表达的降低。例如，在一些实施例中，通过以下步骤来评估GPAM表达的降低：(a)测量用本发明的RNAi构建体处理的肝脏细胞中的GPAM mRNA的量或水平，(b)测量用对照RNAi构建体(例如，针对未在肝脏细胞中表达的RNA分子的RNAi构建体或具有无义或乱序序列的RNAi构建体)处理或不用构建体处理的肝脏细胞中的GPAM mRNA的量或水平，以及(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量GPAMmRNA水平与来自(b)中的对照细胞的经测量GPAM mRNA水平。在比较之前，可以将经处理细胞和对照细胞中的GPAM mRNA水平相对于对照基因的RNA水平(例如18S核糖体RNA)归一化。可以通过多种方法来测量GPAM mRNA水平，这些方法包括RNA印迹分析、核酸酶保护测定、荧光原位杂交(FISH)、逆转录酶(RT)-PCR、实时RT-PCR、定量PCR等。

在其他实施例中，通过以下步骤来评估GPAM表达的降低：(a)测量用本发明的RNAi构建体处理的肝脏细胞中的GPAM蛋白质的量或水平、(b)测量用对照RNAi构建体(例如，针对未在肝脏细胞中表达的RNA分子的RNAi构建体或具有无义或乱序序列的RNAi构建体)处理或不用构建体处理的肝脏细胞中的GPAM蛋白质的量或水平、和(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量GPAM蛋白质水平与来自(b)中的对照细胞的经测量GPAM蛋白质水平。GPAM蛋白水平可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来测量，这些方法包括但不限于蛋白质印迹、免疫测定(例如ELISA)和流式细胞术。任何测量GPAM mRNA或蛋白质的合适的方法可用于评估本发明的RNAi构建体的功效。

在一些实施例中，评估GPAM表达水平的方法在体外在天然表达GPAM的细胞(例如肝脏细胞)或者已被工程化以表达GPAM的细胞中进行。在某些实施例中，这些方法在体外在肝脏细胞中进行。合适的肝脏细胞包括但不限于原代肝细胞(例如人、非人灵长类动物或啮齿动物的肝细胞)、HepAD38细胞、HuH-6细胞、HuH-7细胞、HuH-5-2细胞、BNLCL2细胞、Hep3B细胞或HepG2细胞。在一个实施例中，肝脏细胞为Hep3B细胞。在另一个实施例中，肝脏细胞为HepG2细胞。

在其他实施例中，评估GPAM表达水平的方法在体内进行。例如，可以将RNAi构建体和任何对照RNAi构建体施用至动物(例如啮齿动物或非人灵长类动物)，并且在处理后可在从该动物收获的肝脏组织中对GPAM mRNA或蛋白质水平进行评估。可替代地或另外地，可以在经处理的动物中对与GPAM表达相关的生物标志物或功能表型进行评估。

在某些实施例中，通过本发明的RNAi构建体，使GPAM的表达在肝脏细胞中降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。在一些实施例中，通过本发明的RNAi构建体，使GPAM的表达在肝脏细胞中降低至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少85％。在其他实施例中，通过本发明的RNAi构建体，使GPAM的表达在肝脏细胞中降低约90％或更多，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多。可以通过本文所述的任何方法或本领域中已知的其他方法来测量GPAM表达的降低百分比。例如，在某些实施例中，本发明的RNAi构建体在体外在HepG2细胞(含有GPAM I43V突变)中以5nM将GPAM表达抑制至少45％。在相关实施例中，本发明的RNAi构建体在体外在HepG2细胞中以5nM将GPAM表达抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。在其他实施例中，本发明的RNAi构建体在体外HepG2细胞中以5nM将GPAM表达抑制至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％。可以使用包括例如RNA FISH或微滴式数字PCR在内的多种技术测量GPAM的降低(参见例如，Kamitaki等人，Digital PCR[数字PCR].Methods in MolecularBiology[分子生物学方法],1768:401-422(2018).doi:10.1007/978-1-4939-7778-9_23)。

在一些实施例中，计算IC50值以评估本发明的RNAi构建体抑制GPAM在肝脏细胞中的表达的效力。“IC50值”为实现50％生物或生物化学功能抑制所需的剂量/浓度。任何物质或拮抗剂的IC50值可以通过构建剂量-反应曲线且在任何测定中检查不同浓度的物质或拮抗剂对表达水平或功能活性的影响来确定。给定拮抗剂或物质的IC50值可以通过确定抑制一半最大生物反应或天然表达水平所需的浓度来计算。因此，任何RNAi构建体的IC50值可以通过在任何测定(如免疫测定、RNA FISH测定或微滴式数字PCR测定)中确定抑制肝脏细胞中天然GPAM表达水平(例如对照肝脏细胞中的GPAM表达水平)的一半所需的RNAi构建体的浓度来计算。本发明的RNAi构建体可以以小于约20nM(例如，小于约15nM、10nM、5nM、或1nM)的IC50抑制GPAM在肝脏细胞(例如HepG2细胞)中的表达。例如，所披露的RNAi构建体可以以如下IC50抑制GPAM在肝脏细胞中的表达：约0.001nM至约20nM、约0.001nM至约10nM、约0.001nM至约5nM、约0.001nM至约1nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约5nM、或约0.1nM至约1nM。在某些实施例中，RNAi构建体以约1nM至约10nM的IC50抑制肝细胞(例如HepG2细胞)中的GPAM表达。

本发明的RNAi构建体可使用本领域已知的技术(例如常规核酸固相合成)来容易地制成。RNAi构建体的多核苷酸可使用标准核苷酸或核苷前体(例如亚磷酰胺)在合适的核酸合成仪上组装。自动核酸合成仪由几个供应商商业销售，这些合成仪包括来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)(福斯特城，加利福尼亚州(Foster City,CA))的DNA/RNA合成仪、来自生物自动化公司(BioAutomation)(欧文市，德克萨斯州(Irving,TX))的MerMade合成仪、和来自电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)(匹兹堡市，宾夕法尼亚州(Pittsburgh,PA))的OligoPilot合成仪。

2’甲硅烷基保护基团可与核糖核苷的5’位置处的酸不稳定性二甲氧基三苯甲基(DMT)结合使用，以经由亚磷酰胺化学合成寡核苷酸。已知最终脱保护条件不会显著降解RNA产物。所有合成均可在任何自动或手动合成仪中以大、中或小规模进行。合成还可以在多孔板、柱或载玻片中进行。

2’-O-甲硅烷基基团可以经由暴露于氟离子来去除，这些氟离子可以包括任何氟离子源，例如含有与无机反离子配对的氟离子的那些盐(例如氟化铯和氟化钾)、或含有与有机反离子配对的氟离子的那些盐(例如四烷基氟化铵)。冠醚催化剂可以与无机氟化物组合用于脱保护反应中。示例性氟离子源包括但不限于四丁基氟化铵或氨基氢氟化物(例如，将水性HF与三乙胺组合在偶极非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺)中)。

选择用于亚磷酸三酯和磷酸三酯上的保护基团可以改变三酯对氟化物的稳定性。磷酸三酯或亚磷酸三酯的甲基保护可以稳定与氟离子的键联且改进过程产率。

由于核糖核苷具有反应性2’羟基取代基，因此可能希望用与5’-O-二甲氧基三苯甲基保护基团正交的保护基团(例如对用酸处理稳定的保护基团)保护RNA中的反应性2’位置。甲硅烷基保护基团符合该标准，且可以在最终的氟化物脱保护步骤中容易地去除，这可以导致最少RNA降解。

四唑催化剂可用于标准亚磷酰胺偶联反应。示例性催化剂包括例如四唑、S-乙基-四唑、苄基巯基四唑和对硝基苯基四唑。

合成本文所述的RNAi构建体的另外的方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。另外，各个合成步骤可以交替序列或顺序进行，以得到希望的化合物。其他合成化学转化、保护基团(例如，对于碱基上存在的羟基、氨基等)和可用于合成本文所述RNAi构建体的保护基团方法(保护和脱保护)是本领域已知的且包括例如以下中描述的那些：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH Publishers[VCH出版社](1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis[有机合成中的保护基团]，第2版,John Wiley and Sons[约翰威立父子公司](1991)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis[费塞尔和用于有机合成的费塞尔试剂],John Wiley and Sons[约翰威立父子公司](1994)；以及L.Paquette编辑，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis[有机合成试剂百科全书],John Wiley and Sons[约翰威立父子公司](1995)及其后续版本。RNAi构建体的定制合成还可从几个商业供应商处获得，这些供应商包括Dharmacon公司(Dharmacon,Inc.)(拉斐特，科罗拉多州(Lafayette,CO))、Axo实验室股份有限公司(AxoLabs GmbH)(库尔姆巴赫(Kulmbach)，德国)和Ambion公司(Ambion,Inc.)(福斯特城，加利福尼亚州)。

本发明的RNAi构建体可包含配体。如本文所用，“配体”是指能够与另一种化合物或分子直接地或间接地相互作用的任何化合物或分子。配体与另一种化合物或分子的相互作用可引发生物响应(例如，启动信号转导级联、诱导受体介导的内吞作用)或者可仅为物理缔合。配体可以修饰所附接的双链RNA分子的一种或多种特性，如RNA分子的药效学、药动学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除特性。

配体可包含血清蛋白(例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白)、胆固醇部分、维生素(例如，生物素、维生素E、维生素B12)、叶酸部分、类固醇、胆汁酸(例如胆酸)、脂肪酸(例如棕榈酸、肉豆蔻酸)、碳水化合物(例如葡聚糖、短梗霉聚糖、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)、糖苷、磷脂、或抗体或其结合片段(例如，使RNAi构建体靶向特定细胞类型(如肝脏细胞)的全抗体或结合片段)。配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如，TPPC4、德萨菲林(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如，金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、03-(油酰基)石胆酸、03-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如，触角肽、Tat肽、RGD肽)、烷化剂、聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、PEG-40K)、聚氨基酸和多胺(例如，精胺、亚精胺)。

在某些实施例中，配体具有内体溶解特性。内体溶解配体促进内体裂解和/或本发明的RNAi构建体或其组分自细胞的内体转运到细胞质。内体溶解配体可以是显示出pH依赖性膜活性和融合性的聚阳离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中内体溶解配体促进内体的裂解和/或本发明的RNAi构建体或其组分从内体到细胞质的转运的构象。示例性的内体溶解配体包括GALA肽(Subbarao等人，Biochemistry[生物化学]，第26卷:2964-2972,1987)、EALA肽(Vogel等人，J.Am.Chern.Soc.[美国化学学会杂志]，第118卷:1581-1586,1996)，以及它们的衍生物(Turk等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]，第1559卷:56-68,2002)。在一个实施例中，内体溶解组分可含有化学基团(例如氨基酸)，其响应于pH的变化将经历电荷或质子化的变化。内体溶解组分可为直链或支链的。

在一些实施例中，配体包含脂质或其他疏水分子。在一个实施例中，配体包含胆固醇部分或其他类固醇。据报告经胆固醇缀合的寡核苷酸较其未经缀合的对应物更具活性(Manoharan,Antisense Nucleic Acid Drug Development[反义核酸药物开发]，第12卷:103-228,2002)。包含用于与核酸分子缀合的胆固醇部分和其他脂质的配体也已经描述于美国专利7,851,615、7,745,608、和7,833,992中。在另一个实施例中，配体可包含叶酸部分。与叶酸部分缀合的多核苷酸可以经由受体介导的内吞作用途径被细胞摄取。这样的叶酸-多核苷酸缀合物描述于例如美国专利8,188,247中。

考虑到GPAM在肝脏细胞(例如肝细胞)中被表达，在某些实施例中，希望将RNAi构建体特异性地递送至肝脏细胞。在一些实施例中，RNAi构建体可以通过使用与肝脏细胞表面上表达的蛋白质结合或相互作用的配体而特异性靶向肝脏。例如，在某些实施例中，配体可包含一种或多种特异性结合肝细胞上表达的受体的抗原结合蛋白(例如抗体或其结合片段(例如Fab、scFv))。

在某些实施例中，配体包含碳水化合物。“碳水化合物”是指由一个或多个具有至少6个碳原子(可为直链、支链或环状)和与每个碳原子键合的氧、氮或硫原子的单糖单元构成的化合物。碳水化合物包括但不限于糖(例如单糖、二糖、三糖、四糖和含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)和多糖(如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶)。在一些实施例中，掺入配体中的碳水化合物为选自戊糖、己糖或庚糖的单糖以及包括这样的单糖单元的二糖和三糖。在其他实施例中，掺入配体中的碳水化合物为氨基糖，如半乳糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺。

在一些实施例中，配体包含己糖或己糖胺。己糖可选自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或果糖。己糖胺可选自果糖胺、半乳糖胺、葡糖胺或甘露糖胺。在某些实施例中，配体包含葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺或葡糖胺。在一个实施例中，配体包含葡萄糖、葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。在另一个实施例中，配体包含半乳糖、半乳糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺。在特定实施例中，配体包含N-乙酰基-半乳糖胺。包含葡萄糖、半乳糖和N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)的配体在使化合物靶向肝脏细胞方面特别有效(参见例如，D’Souza和Devarajan,J.ControlRelease[控释杂志]，第203卷:126-139,2015)。可以掺入本发明的RNAi构建体中的含GalNAc或半乳糖的配体的实例描述于美国专利7,491,805；8,106,022；和8,877,917；美国专利公开号2003/0130186；以及WIPO公开号WO 2013/166155中。

在某些实施例中，配体包含多价碳水化合物部分。如本文所用，“多价碳水化合物部分”是指包含能够独立地与其他分子结合或相互作用的两个或更多个碳水化合物单元的部分。例如，多价碳水化合物部分包含两个或更多个由碳水化合物构成的结合结构域，其可以结合两个或更多个不同分子或同一分子上的两个或更多个不同位点。碳水化合物部分的化合价表示该碳水化合物部分内的单个结合结构域的数目。例如，关于碳水化合物部分的术语“一价”、“二价”、“三价”和“四价”分别是指具有一个、两个、三个和四个结合结构域的碳水化合物部分。多价碳水化合物部分可以包含多价乳糖部分、多价半乳糖部分、多价葡萄糖部分、多价N-乙酰基-半乳糖胺部分、多价N-乙酰基-葡糖胺部分、多价甘露糖部分、或多价岩藻糖部分。在一些实施例中，配体包含多价半乳糖部分。在其他实施例中，配体包含多价N-乙酰基-半乳糖胺部分。在这些和其他实施例中，多价碳水化合物部分为二价、三价或四价的。在这样的实施例中，多价碳水化合物部分可为双触角或三触角的。在一个特定实施例中，多价N-乙酰基-半乳糖胺部分为三价或四价的。在另一个特定实施例中，多价半乳糖部分为三价或四价的。用于掺入本发明的RNAi构建体中的示例性含三价和四价GalNAc的配体在下文详细描述。

配体可以直接或间接地附接或缀合到RNAi构建体的RNA分子上。例如，在一些实施例中，配体直接共价附接至RNAi构建体的有义链或反义链。在其他实施例中，配体经由接头共价附接至RNAi构建体的有义链或反义链。配体可以附接到本发明的RNAi构建体的多核苷酸(例如有义链或反义链)的核碱基、糖部分或核苷酸间键。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合或附接可发生在包括环内和环外原子在内的任何位置处。在某些实施例中，嘌呤核碱基的2、6、7或8位置附接至配体。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合或附接也可发生在任何位置处。在一些实施例中，嘧啶核碱基的2、5和6位置可以附接至配体。与核苷酸的糖部分的缀合或附接可以发生在任何碳原子处。糖部分的可附接至配体的示例性碳原子包括2'、3'和5'碳原子。1'位置也可以附接至配体，如在碱性残基中。核苷酸间键也可以支持配体附接。对于含磷键(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，配体可直接附接至磷原子或与磷原子结合的O、N或S原子上。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，配体可附接至胺或酰胺的氮原子或附接至相邻碳原子。

在某些实施例中，配体可以附接至有义链或反义链的3’端或5’端。在某些实施例中，配体共价附接至有义链的5’端。在其他实施例中，配体共价附接至有义链的3’端。例如，在一些实施例中，配体附接至有义链的3’末端核苷酸。在某些这样的实施例中，配体附接在有义链的3’末端核苷酸的3’位置处。在可替代实施例中，配体附接在有义链的3’端附近，但在一个或多个末端核苷酸之前(即在1、2、3或4个末端核苷酸之前)。在一些实施例中，配体附接在有义链的3’末端核苷酸的糖的2’位置处。

在某些实施例中，配体经由接头附接至有义链或反义链。“接头”是使配体共价连接至RNAi构建体的多核苷酸组分的原子或原子团。接头可为从约1至约30个原子长度、从约2至约28个原子长度、从约3至约26个原子长度、从约4至约24个原子长度、从约6至约20个原子长度、从约7至约20个原子长度、从约8至约20个原子长度、从约8至约18个原子长度、从约10至约18个原子长度、和从约12至约18个原子长度。在一些实施例中，接头可以包含双官能连接部分，其通常包含具有两个官能团的烷基部分。选择官能团中的一个以结合目的化合物(例如RNAi构建体的有义链或反义链)，且选择另一个以基本上结合任何选定基团，如本文所述的配体。在某些实施例中，接头包含重复单元(如乙二醇或氨基酸单元)的链结构或寡聚物。典型地用于双官能连接部分的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在一些实施例中，双官能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和度(例如双键或三键)等。

可用于将配体附接至本发明的RNAi构建体中的有义链或反义链的接头包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯、6-氨基己酸、经取代的C₁-C₁₀烷基、经取代的或未经取代的C₂-C₁₀烯基、或者经取代的或未经取代的C₂-C₁₀炔基。这样的接头的优选取代基基团包括但不限于羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

在某些实施例中，接头为可切割的。可切割接头为在细胞外足够稳定，但是在进入靶细胞后经切割以释放接头保持在一起的两个部分的接头。在一些实施例中，可切割接头在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如经选择以模拟或代表细胞内条件)下比在受试者血液中或在第二参考条件(其可以例如经选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)下切割快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍、或至少100倍。

可切割接头易受切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解性分子的存在)影响。通常，切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。这样的降解性试剂的实例包括：经选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂(如硫醇)，其可通过还原来使氧化还原可切割接头降解；酯酶；可形成酸性环境的内体或试剂，例如产生pH为五或更低的那些；可通过充当一般酸来使酸可切割接头水解或降解的酶、肽酶(其可为底物特异性的)、和磷酸酶。

可切割接头可包含易受pH影响的部分。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更高酸性pH，在5.5-6.0范围内，且溶酶体具有约5.0的甚至更高酸性pH。一些接头将具有可切割基团，其在优选pH下切割，从而将RNA分子自配体释放到细胞内，或进入所希望的细胞区室。

接头可包括可由特定酶切割的可切割基团。掺入接头中的可切割基团的类型可取决于待靶向的细胞。例如，靶向肝脏的配体可以通过包括酯基团的接头连接至RNA分子。肝脏细胞富含酯酶，且因此该接头在肝脏细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地切割。富含酯酶的其他类型的细胞包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。当靶向富含肽酶的细胞(如肝脏细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。

通常，可以通过测试降解性试剂(或条件)切割候选接头的能力来评价候选可切割接头的适用性。还希望还测试候选可切割接头在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中第一条件经选择为指示靶细胞中的切割，而第二条件经选择为指示其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。评价可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评价并通过对整个动物进行进一步评价来确认可能是有用的。在一些实施例中，与在血液或血清中(或者在经选择以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选接头在细胞中(或者在经选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割快至少2、4、10、20、50、70或100倍。

在其他实施例中，使用氧化还原可切割接头。氧化还原可切割接头在还原或氧化时被切割。还原性可切割基团的实例为二硫连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割接头是否是合适的“还原性可切割接头”或者例如是否适合与特定RNAi构建体和特定配体一起使用，可以采用本文所述的一种或多种方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域已知的其他还原剂一起孵育来评价候选接头，其模拟将在细胞(例如靶细胞)中观察到的切割速率。也可以在经选择以模拟血液或血清条件的条件下评价候选接头。在特别实施例中，候选接头在血液中被切割至多10％。在其他实施例中，与在血液中(或者在经选择以模仿细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选接头在细胞中(或者在经选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解快至少2、4、10、20、50、70、或100倍。

在又其他实施例中，基于磷酸酯的可切割接头通过降解或水解磷酸酯基团的试剂来切割。水解细胞中的磷酸酯基团的试剂的实例为酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的可切割基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。特定的实施例包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-SP(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。另一特定实施例为-O-P(O)(OH)-O-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评价。

在其他实施例中，接头可包含酸可切割基团，这些基团为在酸性条件下被切割的基团。在一些实施例中，酸可切割基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中被切割，或通过试剂如可充当一般酸的酶来切割。在细胞中，特定的低pH细胞器(如内体和溶酶体)可以为酸可切割基团提供切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可切割基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。特定实施例为当附接至酯的氧(烷氧基)的碳为芳基、经取代的烷基或叔烷基诸如二甲基、戊基或叔丁基时。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评价。

在其他实施例中，接头可包含基于酯的可切割基团，这些基团通过细胞中的酶(如酯酶和酰胺酶)来切割。基于酯的可切割基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基基团的酯。酯可切割基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评价。

在另外的实施例中，接头可以包含基于肽的可切割基团，这些基团通过细胞中的酶(如肽酶和蛋白酶)来切割。基于肽的可切割基团为在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键为在氨基酸之间形成的特殊类型的酰胺键，以产生肽和蛋白质。基于肽的可切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评价。

适合于将配体附接到本文所述的RNAi构建体中的有义链或反义链的其他类型的接头为本领域已知的，且可以包括例如以下中描述的接头：美国专利7,723,509；8,017,762；8,828,956；8,877,917；和9,181,551。

在某些实施例中，共价附接至本发明的RNAi构建体的有义链或反义链的配体包含GalNAc部分，例如多价GalNAc部分。在一些实施例中，多价GalNAc部分为三价GalNAc部分且附接至有义链的3’端。在其他实施例中，多价GalNAc部分为三价GalNAc部分且附接至有义链的5’端。在又其他实施例中，多价GalNAc部分为四价GalNAc部分且附接至有义链的3’端。在仍其他实施例中，多价GalNAc部分为四价GalNAc部分且附接至有义链的5’端。

在一些实施例中，可以通过施用编码和控制RNAi构建体的细胞内表达的载体，将本发明的RNAi构建体递送至目标细胞或组织。“载体”(本文中也称为“表达载体”)是可用于将目的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。载体可以在活细胞中复制，或者其可以以合成方式制成。

通常，用于表达本发明的RNAi构建体的载体将包含一个或多个与编码RNAi构建体的序列可操作地连接的启动子。短语“可操作连接”、“可操作地连接”或“在转录控制下”在本文中可互换使用以指示如下情形：启动子相对于多核苷酸序列处于正确位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录的起始和多核苷酸序列的表达。“启动子”是指由启动基因序列的特异性转录所需的细胞合成机制或经引入的合成机制识别的序列。合适的启动子包括但不限于RNA pol I、pol II、HI或U6 RNA pol III、和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、和劳斯肉瘤病毒长末端重复)。在一些实施例中，采用HI或U6RNApol III启动子。启动子可为组织特异性或诱导型启动子。令人特别感兴趣的是肝脏特异性启动子，如来自人α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、血红素结合蛋白基因和肝脂酶基因的启动子序列。诱导型启动子包括例如由蜕皮激素、雌激素、孕酮、四环素和异丙基-PD1-硫代半乳糖苷(IPTG)调节的启动子。

当RNAi构建体包含siRNA时，两条单独的链(有义链和反义链)可以自单个载体或两个单独的载体表达。例如，在一些实施例中，编码有义链的序列与第一载体上的启动子可操作连接，且编码反义链的序列与第二载体上的启动子可操作连接。在这样的实施例中，将第一载体和第二载体例如通过感染或转染共同引入靶细胞，使得有义链和反义链一旦被转录，将在细胞内杂交以形成siRNA分子。在另一个实施例中，有义链和反义链由位于单个载体中的两个单独的启动子转录。在这样的实施例中，编码有义链的序列可以与第一启动子可操作连接，且编码反义链的序列可以与第二启动子可操作连接，其中第一启动子和第二启动子位于单个载体中。在一个实施例中，载体包含与编码siRNA分子的序列可操作连接的第一启动子和在相反方向上与相同序列可操作连接的第二启动子，使得自该第一启动子转录序列导致siRNA分子的有义链的合成，且自该第二启动子转录序列导致siRNA分子的反义链的合成。

当RNAi构建体包含shRNA时，编码单个至少部分自身互补的RNA分子的序列与启动子可操作连接以产生单个转录物。在一些实施例中，编码shRNA的序列包含通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列，以在转录后产生shRNA的茎和环结构。

在一些实施例中，编码本发明的RNAi构建体的载体为是病毒载体。适合表达本文所述RNAi构建体的各种病毒载体系统包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体、莫洛尼氏鼠白血病病毒)、腺相关病毒载体；单纯疱疹病毒载体；SV40载体；多瘤病毒载体；乳头状瘤病毒载体；微小核糖核酸病毒载体；和痘病毒载体(例如牛痘病毒)。在某些实施例中，病毒载体为逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)。

适用于在本发明中使用的各种载体、用于将编码siRNA或shRNA分子的核酸序列插入载体中的方法、和将载体递送至目的细胞的方法是本领域已知的(参见例如，Dornburg,Gene Therap.[基因疗法]，第2卷:301-310,1995；Eglitis,Biotechniques[生物技术]，第6卷:608-614,1988；Miller,HumGene Therap.[人类基因疗法]，第1卷:5-14,1990；Anderson,Nature[自然]，第392卷:25-30,1998；Rubinson D A等人，Nat.Genet.[自然遗传学]，第33卷:401-406,2003；Brummelkamp等人，Science[科学]，第296卷:550-553,2002；Brummelkamp等人，Cancer Cell[癌细胞]，第2卷:243-247,2002；Lee等人，Nat Biotechnol[自然生物技术]，第20卷:500-505,2002；Miyagishi等人，Nat Biotechnol[自然生物技术]，第20卷:497-500,2002；Paddison等人，GenesDev[基因发育]，第16卷:948-958,2002；Paul等人，Nat Biotechnol[自然生物技术]，第20卷:505-508,2002；Sui等人，Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊]，第99卷:5515-5520,2002；和Yu等人，Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊]，第99卷:6047-6052,2002)。

组合物

本披露还提供组合物和制剂，这些组合物和制剂包含本文所述的RNAi构建体和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。这样的组合物和制剂可用于在有需要的受试者中降低GPAM的表达。当考虑临床应用时，将以适合于预期应用的形式制备药物组合物和制剂。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。

短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂”包括可接受的用于配制药物(如适合于向人施用的药物)的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药学上活性物质的用途为本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的RNAi构建体不兼容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。还可将补充活性成分掺入组合物中，条件是它们不会使组合物的载体或RNAi构建体失活。

用于配制药物组合物的组合物和方法取决于几种标准，包括但不限于施用途径、待治疗的疾病或障碍的类型和程度、以及待施用的剂量。在一些实施例中，基于预期递送途径配制药物组合物。例如，在某些实施例中，配制药物组合物以用于肠胃外递送。肠胃外递送形式包括静脉内、动脉内、皮下、鞘内、腹膜内以及肌内注射或输注。在一个实施例中，配制药物组合物以用于静脉内递送。在这样的实施例中，药物组合物可包括基于脂质的递送媒介物。在另一个实施例中，配制药物组合物以用于皮下递送。在这样的实施例中，药物组合物可包括靶向配体(例如，本文所述的含GalNAc的配体)。

在一些实施例中，药物组合物包含有效量的本文所述的RNAi构建体。“有效量”是足以产生有益或希望的临床结果的量。在一些实施例中，有效量为足以降低GPAM在受试者肝细胞中的表达的量。在一些实施例中，有效量可以是足以仅部分降低GPAM表达(例如，降低至与人杂合子中野生型GPAM等位基因的表达相当的水平)的量。据报道，与非携带者相比，功能丧失的GPAM变体等位基因的人杂合子携带者具有较低非HDL胆固醇血清水平和较低冠状动脉疾病和心肌梗塞风险(Nioi等人，New England Journal of Medicine[新英格兰医学杂志]，第374卷第22期:2131-2141,2016)。因此，不受理论束缚，据信GPAM表达的部分降低可足以实现血清非HDL胆固醇的有益降低以及冠状动脉疾病和心肌梗塞的风险降低。

本发明的RNAi构建体的有效量可为从约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重、约0.05mg/kg体重至约75mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重、约1mg/kg至约30mg/kg体重、约2.5mg/kg体重至约20mg/kg体重、或约5mg/kg体重至约15mg/kg体重。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体的单一有效剂量可为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。包含有效量的RNAi构建体的药物组合物可以每周、每两周、每月、每季度或每半年施用。准确确定有效量和施用频率可以基于几个因素，包括患者的体型、年龄、性别，待治疗的障碍类型(例如心肌梗塞、心力衰竭、冠状动脉疾病、高胆固醇血症)，使用的特定RNAi构建体和施用途径。可以使用常规方法和/或在合适的动物模型中测试来确定本发明的任何特定RNAi构建体的有效剂量和体内半衰期的估计值。

胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒、和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、和脂质体，可以用作本发明的RNAi构建体或编码此类结构的载体的递送媒介物。适用于递送本发明的核酸的可商购脂肪乳液包括NUTRILIPID、和其他类似脂质乳液。用作体内递送媒介物的优选胶体系统是脂质体(即，人工膜囊)。本发明的RNAi构建体可以封装在脂质体中，例如阳离子脂质体。可替代地，本发明的RNAi构建体可以与脂质(如阳离子脂质)复合。合适的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC))、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG))、和阳离子型(例如二油酰基四曱基氨基丙基(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOTMA))。这样的胶体分散系统的制备和使用为本领域熟知的。示例性制剂也披露于例如美国专利5,783,565；5,837,533；5,981,505；6,127,170；6,217,900；6,379,965；6,383,512；6,747,014；7,202,227；和WO 03/093449中。

在一些实施例中，本发明的RNAi构建体完全包封于脂质制剂中，例如，以形成SPLP、pSPLP、SNALP、或其他核酸-脂质颗粒。如本文所用，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如本文所用，术语“SPLP”是指包含包封于脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。SNALP和SPLP典型地含有阳离子脂质、非阳离子脂质、和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对于全身应用特别有用，因为它们在静脉内注射后展现出循环寿命延长，并且在远端部位(例如，与施用部位物理分离的部位)积累。SPLP包括“pSPLP”，其包括PCT公开号WO 00/03683中所阐述的经包封的缩合剂-核酸复合物。核酸-脂质颗粒典型地具有约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、或约70nm至约90nm的平均直径，且基本上无毒。另外，存在于核酸-脂质颗粒中的核酸在水溶液中理想地对用核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法披露于例如美国专利5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；和6,815,432；和PCT公开号WO 96/40964中。

适用于注射的药物组合物包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。通常，这些制剂为无菌的且流动到易于注射的程度。制剂应在制造和储存条件下稳定，且应防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。适合的溶剂或分散介质可以含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和/或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，等渗剂(例如，糖或氯化钠)可以包括在组合物中。可通过包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以通过如下来制备：将适当量的RNAi构建体(单独或与配体复合)连同所希望的任何其他成分(如以上所述)一起掺入溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散液，该无菌媒介物含有基础分散介质和希望的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生一种或多种活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的希望的成分的粉末。

本文提供的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括例如衍生自无机酸(例如，盐酸或磷酸)或衍生自有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(与游离氨基基团一起形成)。与游离羧基基团形成的盐还可衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或衍生自有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

例如，对于水溶液中的肠胃外施用，通常将溶液进行适当地缓冲并且首先用例如足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这样的水溶液可用于例如静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。如本领域技术人员所知，理想地使用无菌水性介质。举例说明，可将单次剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并添加到1000ml皮下注射液中或在所建议输注部位注射(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学]”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。对于人施用，制剂应符合FDA标准所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。在某些实施例中，本发明的药物组合物包含无菌盐水溶液和本文所述的RNAi构建体或由其组成。在其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的RNAi构建体和无菌水(例如注射用水，WFI)或由其组成。在仍其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的RNAi构建体和磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由其组成。

在一些实施例中，本发明的药物组合物与用于施用的装置一起包装或储存于该装置内。用于可注射制剂的装置包括但不限于注射口、预填充注射器、自动注射器、注射泵、随身注射器和注射笔。用于雾化或粉末制剂的装置包括但不限于吸入器、吹入器、吸气器等。因此，本发明包括施用装置，其包含本发明的用于治疗或预防一种或多种本文所述障碍的药物组合物。

用于抑制GPAM表达的方法

本披露还提供了抑制GPAM基因在细胞中的表达的方法。这些方法包括使细胞与有效抑制该细胞内的GPAM表达的量的RNAi构建体、例如双链RNAi构建体接触，从而抑制GPAM在该细胞内的表达。使细胞与RNAi构建体(例如，双链RNAi构建体)接触可以在体外或体内进行。使细胞在体内与RNAi构建体接触包括使受试者(例如，人受试者)内的细胞或细胞群与RNAi构建体接触。接触细胞的体外和体内方法的组合也在本披露的范围内。

本发明提供了用于在有需要的受试者中降低或抑制GPAM表达的方法以及治疗或预防与GPAM表达或活性相关的病症、疾病或障碍的方法。“与GPAM表达相关的病症、疾病或障碍”是指其中GPAM表达水平被改变或者其中GPAM表达水平的升高与患上病症、疾病或障碍的风险增加相关的病症、疾病或障碍。

如上所讨论，接触细胞可为直接的或间接的。此外，可以经由靶向配体实现与细胞接触，该靶向配体包括本文所述或本领域已知的任何配体。在优选的实施例中，靶向配体是碳水化合物部分，例如，GalNAc配体、或三价GalNAc结构(如实例1中所述的)、或者将RNAi构建体引导至目的部位的任何其他配体。

在一个实施例中，使细胞与RNAi接触包括通过促进或实现摄取或吸收到细胞中来“引入”或“将RNAi递送到细胞中”。吸收或摄取RNAi可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。例如，对于体内引入，可以将RNAi注射到组织部位或全身施用。体外引入到细胞中可以使用本领域已知的方法(如电穿孔和脂质转染)来实现。另外的方法在下文中描述和/或在本领域中为已知的。

如本文所用，术语“抑制”与“降低”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语可互换使用，且包括任何水平的抑制。

短语“抑制GPAM的表达”旨在是指对任何GPAM基因(例如小鼠GPAM基因、大鼠GPAM基因、猴GPAM基因、或人GPAM基因)以及GPAM基因的变体或突变体的表达的抑制。因此，GPAM基因可为野生型GPAM基因、突变体GPAM基因(例如产生淀粉样蛋白沉积的突变体GPAM基因)、或遗传操作细胞、细胞群、或有机体背景下的转基因GPAM基因。

“抑制GPAM基因的表达”包括任何水平的GPAM基因的抑制，例如，GPAM基因表达的至少部分阻抑。可以基于与GPAM基因表达相关的任何变量的水平或水平变化，例如GPAMmRNA水平、GPAM蛋白水平、或淀粉样沉积物的数量或程度来评估GPAM基因的表达。可以在单个细胞或细胞群(包括例如衍生自受试者的样品)中评估该水平。

可以通过与GPAM表达相关的一个或多个变量的绝对或相对水平与对照水平相比的降低来评估抑制。对照水平可为本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平、或由未经处理或用对照(例如仅缓冲对照或无活性试剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。在一些实施例中，GPAM基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

GPAM基因表达的抑制可通过减少由第一细胞或细胞群(这样的细胞可存在于例如源自受试者的样品中)所表达mRNA的量来表现，在这些细胞中GPAM基因被转录并且已经经过处理(例如，通过使一个或多个细胞与本发明的RNAi构建体接触，或者通过向正存在或已存在这些细胞的受试者施用本发明的RNAi构建体)，使得与基本上与第一细胞或细胞群相同但尚未经过如此处理的第二细胞或细胞群(对照细胞)相比，GPAM基因的表达被抑制。可以通过使用下式将经处理细胞中的mRNA水平表示为对照细胞中的mRNA水平的百分比来评估抑制：

可替代地，可以根据与GPAM基因表达功能性相关的参数的减小来评估GPAM基因表达的抑制，该参数例如GPAM蛋白表达或Hedgehog途径蛋白活性。可在内源地或重组地表达GPAM的任何细胞中，通过在本领域中已知的任何测定来确定GPAM基因沉默。

GPAM蛋白表达的抑制可通过由细胞或细胞群所表达的GPAM蛋白的水平(例如，在获自受试者的样品中所表达的蛋白质的水平)的降低来表现。如上所解释，为评估mRNA阻抑，经处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比。

可用于对GPAM基因表达的抑制进行评估的对照细胞或细胞群包括尚未与本发明的RNAi构建体接触的细胞或细胞群。例如，在用RNAi构建体对受试者进行治疗之前，对照细胞或细胞群可衍生自单个受试者(例如，人或动物受试者)。

可利用本领域中已知的用于对mRNA表达进行评估的任何方法(如上文提到的那些)来确定由细胞或细胞群所表达的GPAM mRNA的水平或者循环GPAM mRNA的水平。在一些实施例中，通过对转录的多核苷酸或其部分(例如GPAM基因的mRNA)进行检测来确定样品中GPAM的表达水平。在这方面，例如可以使用RNA提取技术自细胞中提取RNA，这些提取技术包括例如酸性酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(普里阿勒蒂克斯公司，瑞士(PreAnalytix，Switzerland))。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连续测定、RT-PCR、RNA酶保护测定(Melton等人，Nuc.Acids Res.[核酸研究]12:7035)、RNA印迹、原位杂交、和微阵列分析。循环GPAM mRNA可以使用WO 2012/177906中描述的方法来检测。

在一个实施例中，使用核酸探针来确定GPAM的表达水平。如本文所用，术语“探针”是指能够与特定GPAM序列选择性结合的任何分子。探针可由本领域普通技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。探针可以经专门设计以被标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

经分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，这些测定包括但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。确定mRNA水平的一种方法涉及使经分离的mRNA与可以与GPAM mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将mRNA固定于固体表面上且与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行经分离的mRNA并将mRNA自凝胶转移至膜(如硝酸纤维素)。在可替代实施例中，将一个或多个探针固定于固体表面上，并使mRNA与一个或多个探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地适应用于确定GPAM mRNA水平的已知mRNA检测方法。

确定样品中GPAM表达水平的可替代方法涉及例如对样品中的mRNA进行核酸扩增和/或应用逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(参见例如，美国专利4,683,202)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:189-193)、自我持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology[生物技术]6:1197)、滚环复制(Lizardi等人，同上；以及美国专利5,854,033)或者任何其他核酸扩增方法，然后利用本领域技术人员熟知的技术对经扩增的分子进行检测。若这样的分子以非常低的数目存在，则这些检测方案尤其可用于检测核酸分子。在本发明的一些方面，通过定量荧光RT-PCR(即，TAQMAN^TM系统)确定GPAM的表达水平。可以使用膜印迹(如用于杂交分析，如RNA印迹、DNA印迹、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合的核酸的任何固体支持物)来监测GPAM mRNA的表达水平(参见例如，美国专利5,445,934；5,677,195；5,770,722；5,744,305；和5,874,219)。GPAM表达水平的确定还可包括使用溶液中的核酸探针。在某些实施例中，使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。

可利用本领域中已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定GPAM蛋白表达的水平。这样的方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。

在一些实施例中，可以通过检测或监测GPAM疾病症状的减轻来监测本发明的方法的功效，例如四肢、面部、喉、上呼吸道、腹部、躯干、和生殖器的水肿肿胀，前驱症状；喉肿胀；非瘙痒性皮疹；恶心；呕吐；或腹痛的减轻。可以使用本领域已知的任何方法在体外或体内评估这些症状。

在一些实施例中，向受试者施用RNAi构建体或包含RNAi构建体的组合物，使得将该RNAi构建体递送至在该受试者内的特定部位。可使用衍生自受试者内特定部位的体液或组织的样品中GPAM mRNA或GPAM蛋白的水平或水平的变化的测量值来评估GPAM表达的抑制。在一些实施例中，可以将RNAi构建体递送至如肝脏、脉络丛、视网膜和胰腺的部位。该部位还可为来自任一上述部位的细胞的子部分或子组。该部位还可包括表达特定类型受体的细胞。

治疗或预防GPAM相关疾病的方法

本发明提供了治疗性和预防性方法，这些方法包括向患有与GPAM相关的疾病、障碍和/或病症或者易于发展出与GPAM相关的疾病、障碍和/或病症的受试者施用如本文所述的RNAi构建体、包含RNAi构建体的组合物(例如药物组合物)、或包含RNAi构建体的载体。GPAM相关疾病的非限制性实例包括例如脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝中的脂肪积累、肝炎症、肝细胞坏死、肝纤维化、肥胖、和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。在一个实施例中，与GPAM相关的疾病是NAFLD。在另一个实施例中，与GPAM相关的疾病是NASH。在另一个实施例中，与GPAM相关的疾病是脂肪肝(脂肪变性)。在另一个实施例中，与GPAM相关的疾病是胰岛素抵抗。在另一个实施例中，与GPAM相关的疾病不是胰岛素抵抗。

在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要患者中降低GPAM表达的方法，该方法包括向患者施用本文所述的任何RNAi构建体。如本文所用，术语“患者”是指哺乳动物，包括人，且与术语“受试者”可互换使用。与未接受RNAi构建体的患者中的GPAM表达水平相比，患者肝细胞中的GPAM表达水平理想地在施用RNAi构建体后降低。

本发明的方法可用于治疗患有GPAM相关疾病的受试者，例如，将受益于GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生降低的受试者。在一个方面，本发明提供降低患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的受试者中线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM)基因的表达水平的方法。在另一方面中，本发明提供了降低患有NAFLD的受试者中GPAM蛋白的水平的方法。本发明还提供降低患有NAFLD的受试者中的hedgehog途径的活性水平的方法。

本发明的治疗方法(和用途)包括向受试者(例如人)施用治疗有效量的所披露的靶向GPAM基因的RNAi构建体、包含该RNAi构建体的药物组合物或包含该RNAi构建体的载体。

在一个方面，本发明提供了在患有NAFLD的受试者中预防至少一种症状的方法，该至少一种症状例如存在hedgehog信号传导途径升高、疲劳、虚弱、体重减轻、食欲不振、恶心、腹痛、蜘蛛样血管、皮肤和眼睛发黄(黄疸)、瘙痒、腿部液体积聚和肿胀(水肿)、腹部肿胀(腹水)、和精神错乱。这些方法包括向受试者施用预防有效量的RNAi构建体(例如dsRNA)、包含该RNAi构建体的药物组合物、或编码该RNAi构建体的载体，从而预防患有将受益于GPAM基因表达降低的障碍的受试者中的至少一种症状。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所希望的预防结果(例如，预防疾病发作)的量。

在另一方面中，本发明提供了治疗有效量的本发明RNAi构建体用于治疗受试者(例如将受益于GPAM基因表达的降低和/或抑制的受试者)的用途。在另外的方面，本发明提供了靶向GPAM基因的本发明的RNAi构建体(例如dsRNA)或包含靶向GPAM基因的RNAi构建体的药物组合物在制造用于治疗受试者的药物中的用途，例如，该受试者是将受益于GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生的降低和/或抑制的受试者，例如患有将受益于GPAM基因表达降低的障碍(例如GPAM相关疾病)的受试者。

本披露提供了本发明的RNAi构建体(例如dsRNA)用于预防患有可受益于GPAM基因表达和/或GPAM蛋白产生的降低和/或抑制的障碍的受试者中的至少一种症状的用途。例如，本披露提供本文所述的RNAi构建体、包含其的组合物以及包含其的载体在治疗NAFLD中的用途。

在另一方面，本发明提供了所披露的RNAi构建体、包含其的组合物或包含其的载体在制造药物中的用途，该药物用于预防患有受益于GPAM基因表达和/或GPAM蛋白质产生的降低和/或抑制的障碍例如GPAM相关疾病的受试者中的至少一种症状。

在一个实施例中，向患有与GPAM相关的疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))的受试者施用靶向GPAM的RNAi构建体，使得当向该受试者施用该RNAi构建体时，GPAM基因例如在该受试者的细胞、组织、血液或其他组织或体液中的表达降低至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者至少约99％或更多。

本发明的方法和用途包括施用本文所述的组合物，使得靶GPAM基因的表达的降低持续任何合适的时间量，如约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或约80小时。在一个实施例中，靶GPAM基因的表达降低持续延长的时间，例如，至少约二、三、四、五、六、七天或更长，例如，约一周、两周、三周、或约四周或更长。

根据本发明的方法和用途的RNAi构建体的施用，可导致在患有GPAM相关疾病(例如NAFLD)的患者的这类疾病或障碍的严重性、体征、症状和/或标志物的降低。在此上下文中，“降低”意指这样的水平的统计学显著降低。降低可为例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物或适用于所治疗或靶向以预防的给定疾病的任何其他可测量参数的水平来评估治疗或预防疾病的功效。通过测量这样的参数中的任一个或任何参数组合来监测治疗或预防功效在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以例如通过定期监测NAFLD症状、肝脏脂肪水平或下游基因的表达来评估治疗NAFLD的功效。后续读数与初始读数的比较为医师提供治疗是否有效的指示。通过测量这样的参数中的任一个或任何参数组合来监测治疗或预防功效在本领域普通技术人员的能力范围内。关于靶向GPAM的RNAi或其药物组合物的施用，“有效针对”与GPAM相关的疾病表明以临床上适当的方式施用导致在至少统计学上显著部分的患者中的有益效果，如症状的改善、治愈、疾病的减轻、生命的延长、生活质量的改善、或者通常被熟悉治疗NAFLD和/或与GPAM相关的疾病及相关原因的医生认为是积极的其他效果。

当疾病症态的一个或多个参数得到统计学显著改善时，或者由于未能恶化或未发展出在其他情况下预期会出现的症状时，治疗或预防效果明显。作为实例，在可测量疾病参数中，至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％或更多有利变化可以指示有效治疗。还可以使用本领域已知的针对给定疾病的实验动物模型来判断给定RNAi药物或该药物的制剂的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学显著降低时，证明了治疗功效。

可以向受试者施用任何治疗有效量的RNAi构建体。RNAi构建体的示例性治疗有效量包括但不限于0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg dsRNA、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或约50mg/kg。在一个实施例中，可以向受试者施用0.5mg/kg的RNAi构建体。所述值的中间值和范围也包括在本披露中。

RNAi构建体或包含其的组合物的施用可以将GPAM蛋白水平(例如，在患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中)的存在降低至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。

在施用全剂量RNAi之前，可以向患者施用较小剂量(如5％输注)，并监测不良反应(如过敏反应)。在另一个实例中，可以监测患者的不想要的免疫刺激效果，如提高的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平。

由于对GPAM表达的抑制作用，根据本发明的组合物或由其制备的药物组合物可以提高生活质量。

本发明的RNAi可以“裸”形式施用，其中经修饰或未经修饰的RNAi构建体直接悬浮在水性或合适的缓冲溶剂中，作为“游离RNAi”。在不存在药物组合物的情况下施用游离RNAi。游离RNAi可以处于合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐、或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有RNAi的缓冲溶液的pH和渗透压(osmolality)，使其适用于向受试者施用。

可替代地，本发明的RNAi可以作为药物组合物，例如dsRNA脂质体制剂施用。

受益于GPAM基因表达的降低和/或抑制的受试者是如本文所述，患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或GPAM相关疾病或障碍的那些受试者。

对将受益于GPAM基因表达的降低和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性和预防性治疗。

本发明进一步提供了RNAi构建体或其药物组合物与其他药物和/或其他治疗性方法(例如与已知的药物和/或已知的治疗性方法，例如像目前用于治疗这些障碍的那些)的组合用于治疗将从GPAM基因表达的降低和/或抑制中受益的受试者(例如患有GPAM相关疾病的受试者)的方法和用途。

例如，在某些实施例中，靶向GPAM基因的RNAi与例如可用于治疗GPAM相关疾病的药剂组合施用。例如，适用于治疗将从GPAM表达的降低中受益的受试者(例如，患有与GPAM相关的疾病的受试者)的另外的治疗剂和治疗性方法包括靶向GPAM基因的不同部分的RNAi构建体、治疗剂、和/或用于治疗与GPAM相关的疾病的程序、或任何前述项的组合。在某些实施例中，靶向GPAM基因的第一RNAi构建体与靶向GPAM基因的不同部分的第二RNAi构建物组合施用。例如，第一RNAi构建体可以包含形成双链区的第一有义链和第一反义链，其中所述第一有义链的基本上所有的核苷酸和该第一反义链的基本上所有的核苷酸是经修饰的核苷酸，其中所述第一有义链缀合至在3’-末端处附接的配体，并且其中该配体是通过二价或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物；并且第二RNAi构建体可包含形成双链区的第二有义链和第二反义链，其中第二有义链的基本上全部的核苷酸和第二反义链的基本上全部的核苷酸是经修饰的核苷酸，其中第二有义链缀合至在3'-末端所附接的配体，并且其中配体是经由二价或三价分支状接头而附接的一种或多种GalNAc衍生物。在一个实施例中，第一和第二有义链的所有核苷酸和/或第一和第二反义链的所有核苷酸均包含修饰。经修饰的核苷酸可以是本文所述的经修饰的核苷酸中的任一种或组合。

在其他实施例中，将靶向GPAM基因的第一RNAi构建体与靶向不同于GPAM基因的基因的第二RNAi构建体组合施用。例如，靶向GPAM基因的RNAi构建体可以与靶向SCAP基因的RNAi构建体组合施用。SCAP(SREBP切割激活蛋白)是SREBP家族的转录因子的仅有的已知调控因子。SREBP(固醇反应元件结合蛋白)家族在对于从头脂肪生成和甘油三酯(TG)在肝内累积的调控中发挥了重要作用。靶向GPAM基因的第一RNAi构建体和靶向不同的基因(例如SCAP基因)的第二RNAi构建物可以作为同一药物组合物的一部分施用。可替代地，靶向GPAM基因的第一RNAi构建体和靶向不同的基因(例如SCAP基因)的第二RNAi构建物可以作为不同药物组合物的一部分施用。此外或可替代地，靶向GPAM基因的第一RNAi构建体可以与靶向含Patatin样磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因的第二RNAi构建体组合施用，或与靶向SCAP的第二RNAi和靶向PNPLA3的第三RNAi组合施用。含Patatin样磷脂酶结构域3(PNPLA3)，以前称为脂联素(ADPN)和钙非依赖性磷脂酶A2-ε(iPLA(2)ε)，为一种II型跨膜蛋白(Wilson等人(2006)J Lipid Res[脂类研究杂志]47(9):1940-9；Jenkins等人(2004)J Biol Chem[生物化学杂志]279(47):48968-75)。最初在脂肪细胞中鉴定为在小鼠脂肪形成期间诱导的膜相关性脂肪富集蛋白，其现在已充分表征为在其他组织(包括肝脏)中表达(Wilson等人，同上；Baulande等人(2001)J Biol Chem[生物化学杂志]276(36):33336-44；Moldes等人(2006)Eur J Endocrinol[欧洲内分泌学杂志]155(3):461-8；Faraj等人(2006)JEndocrinol[内分泌杂志]191(2):427-35；Liu等人(2004)J Clin Endocrinol Metab[临床内分泌与代谢杂志]89(6):2684-9；Lake等人(2005)J Lipid Res[脂类研究杂志]46(11):2477-87)。在无细胞生化系统中，重组PNPLA3蛋白可以表现出三酰甘油脂肪酶或转酰基化活性(Jenkins等人，同上；Kumari等人(2012)Cell Metab[细胞代谢]15(5):691-702；He等人(2010)J Biol Chem[生物化学杂志]285(9):6706-15)。在肝细胞中，PNPLA3在内质网和脂质膜上表达，且主要表现出三酰甘油水解酶活性(He等人，同上；Huang等人(2010)Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]107(17):7892-7；Ruhanen等人(2014)JLipid Res[脂类研究杂志]55(4):739-46；Pingitore等人(2014)Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学报]1841(4):574-80)。尽管缺乏分泌信号，但数据表明PNPLA3得以分泌且可在人血浆中作为二硫键依赖性多聚体出现(Winberg等人(2014)Biochem BiophysRes Commun[生物化学和生物物理学研究通讯]446(4):1114-9)。

RNAi构建体和另外的治疗剂和/或治疗可在相同时间和/或在相同组合中例如进行肠胃外施用，或者可以将另外的治疗剂作为单独的组合物的一部分或者在单独的时间和/或通过本领域中已知或本文所述的另一种方法施用。

本发明还提供了使用本发明的RNAi构建体和/或含有本发明的RNAi构建体的组合物来降低和/或抑制GPAM在细胞中的表达(基因或蛋白质表达)的方法。在又其他方面，提供了本发明的RNAi构建体和/或包含本发明RNAi构建体的组合物在制造用于降低和/或抑制GPAM基因在细胞中的表达的药物中的用途。在仍其他方面，本发明提供了用于降低和/或抑制细胞中GPAM蛋白产生的本发明的RNAi和/或包含本发明的RNAi构建体的组合物。在又其他方面，提供了本发明的RNAi构建体和/或包含本发明RNAi构建体的组合物在制造用于降低和/或抑制细胞中GPAM蛋白产生的药物中的用途。这些方法和用途包括使细胞与本发明的RNAi构建体(例如dsRNA)接触，并且将细胞维持足够的时间以获得GPAM基因的mRNA转录物的降解，从而在细胞中抑制GPAM基因表达或抑制GPAM蛋白产生。基因表达的降低可以通过本领域已知的或本文所述的用于确定mRNA或蛋白质水平的任何方法来评估。

在本发明的方法和用途中，细胞可以在体外或体内进行接触，即细胞可以在受试者外(例如，在细胞培养物中)或在受试者体内。适用于使用本发明的方法进行处理的细胞可为表达GPAM基因的任何细胞，例如来自患有NAFLD的受试者的细胞或包含含有GPAM基因或GPAM基因的部分的表达载体的细胞。用于所披露的方法中的合适细胞包括例如哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(例如人细胞或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(如牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞、或水牛细胞)、鸟类细胞(例如鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，细胞是人细胞。

在细胞中GPAM基因表达可被抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％。

在细胞中GPAM蛋白产生可被抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％。

本发明的体内方法和用途可包括向受试者施用含有RNAi构建体的组合物，其中该RNAi构建体包括与受试者的GPAM基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗的生物为人时，组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包括但不限于皮下、静脉内、口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、实质内和鞘内)、肌内、透皮、气道(气溶胶)、鼻腔、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在某些实施例中，组合物通过皮下或静脉内输注或注射施用。在一个实施例中，组合物通过皮下注射施用。

在一些实施例中，经由长效注射施用。长效注射可以在延长的时间段内以一致方式释放RNAi构建体。因此，长效注射可减少获得希望的效果(例如，希望的GPAM抑制、或治疗性或预防性效果)所需的给药频率。长效注射还可以提供更一致的血清浓度。长效注射可包括皮下注射或肌内注射。在一些实施例中，长效注射为皮下注射。

在一些实施例中，经由泵施用。泵可为外部泵或手术植入泵。在某些实施例中，泵为皮下植入渗透泵。在其他实施例中，泵为输注泵。输注泵可用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，输注泵为皮下输注泵。在其他实施例中，泵为将RNAi递送至受试者的外科植入泵。

可以基于是否希望局部或全身治疗并基于待治疗的区域来选择施用方式。可以选择施用途径和施用部位以增强靶向。

这些方法和用途包括向哺乳动物(例如人)施用包含靶向哺乳动物细胞中的GPAM基因的RNAi构建体(例如，siRNA)的组合物，并且维持该哺乳动物足够时间以获得该GPAM基因的mRNA转录物的降解，从而抑制该GPAM基因在该哺乳动物中的表达。可以通过本领域已知或本文所述的任何方法在获自施用了RNAi构建体的受试者的样品中评估基因表达和/或蛋白质表达的降低。在一个实施例中，将组织样品用作用于监测GPAM基因和/或蛋白质表达降低的组织材料。在另一个实施例中，将血液样品用作用于监测GPAM基因和/或蛋白质表达降低的组织材料。

在一些实施例中，可以通过执行5'-RACE或本领域中已知方案的修改来评估在施用RNAi构建体后RISC介导的靶mRNA(例如，GPAM mRNA)体内切割的验证(Lasham A等人，(2010)Nucleic Acid Res.[核酸研究],38(3)p-el9；和Zimmermann等人(2006)Nature[自然]441:111-4)。

应当理解，本文披露的所有核糖核酸序列可以通过用胸腺嘧啶碱基取代序列中的尿嘧啶碱基而转化为脱氧核糖核酸序列。同样地，本文披露的所有脱氧核糖核酸序列可以通过用尿嘧啶碱基取代序列中的胸腺嘧啶碱基而转化为核糖核酸序列。本发明涵盖了脱氧核糖核酸序列、核糖核酸序列和含有本文披露的所有序列的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的序列。

另外地，本文披露的任何核酸序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域普通技术人员将容易理解，在某些情况下，描述经修饰的多核苷酸的命名如“RNA”或“DNA”为任意的。例如，可以将包含在核糖上具有2’-OH取代基的核苷酸和胸腺嘧啶碱基的多核苷酸描述为具有经修饰的糖的DNA分子(对于DNA的天然2’-H为2’-OH)或描述为具有经修饰的碱基的RNA分子(对于RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))。

因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中阐述的那些)旨在涵盖含有天然或经修饰的RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括但不限于具有经修饰核苷碱基的这样的核酸。作为另外的实例且为非限制性，具有序列“ATCGATCG”的多核苷酸涵盖具有经修饰或未经修饰的这样的序列的任何多核苷酸，包括但不限于包含RNA碱基的这样的化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些化合物、和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基的那些化合物(如“AUCGATCG”)、以及具有其他经修饰碱基的多核苷酸(如“ATmeCGAUCG”)，其中meC指示在5-位置处包含甲基的胞嘧啶碱基。

以下实例(包括所进行的实验和所实现的结果)仅出于说明目的而提供，并且不应解释为限制所附权利要求书的范围。

实例

本文描述的所有动物实验均经过美商安进公司的动物保护和使用委员会(IACUC)批准，并根据实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)第8版(美国国家研究委员会(National Research Council(U.S.)))进行护理。实验室动物护理与使用指南更新委员会(Committee for the Update of the Guide forthe Care and Use of Laboratory Animals)，美国实验室动物研究所(Institute forLaboratory Animal Research(U.S.))，和美国国家科学院出版社(National AcademiesPress(U.S.))(2011)Guide for the care and use of laboratory animals[实验室动物的护理与使用指南].第8版，国家科学院出版社(National Academies Press)，华盛顿特区。将小鼠在有十二小时光照、十二小时黑暗周期(0600-1800小时)的22℃±2℃空调房内单独收容。除非另有指明，否则动物可随意获得常规食物(Envigo公司，2920X；或如另外说明的食物)并经由自动浇水系统获得水(经反渗透纯化)。在结束时，在深度麻醉下通过心脏穿刺收集血液，且然后根据实验室动物护理评估和认证协会(Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的指南，通过二次物理方法实施安乐死。

实例1：经修饰的GPAM siRNA分子的选择、设计和合成

使用人GPAM转录物(GenBank登录号XM_005269998.1)的生物信息学分析进行鉴定，鉴定和选择靶向线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM)的治疗性siRNA分子的最佳序列。表1列出了GPAM mRNA靶序列，其在有义链的3'端处附加有一个倒置的无碱基核苷酸，被鉴定为具有治疗特性。

表1.针对GPAM的siRNA序列

为提高GPAM siRNA序列的效力和体内稳定性，将化学修饰掺入GPAM siRNA分子中。特别地，将核糖的2'-O-甲基和2'-氟修饰掺入GPAM siRNA内的特定位置。硫代磷酸酯核苷酸间键还掺入在反义序列和/或有义序列的末端处。

产生的反义和有义siRNA序列显示在表2中。表2和本申请其他部分中的核苷酸序列根据以下符号列出：A、U、G、和C＝对应的核糖核苷酸；dT＝脱氧胸苷；dA＝脱氧腺苷；dC＝脱氧胞苷；dG＝脱氧鸟苷；invDT＝反向的脱氧胸苷；invDA＝反向的脱氧腺苷；invDC＝反向的脱氧胞苷；invDG＝反向的脱氧鸟苷；a、u、g、和c＝对应的2’-O-甲基核糖核苷酸；Af、Uf、Gf、和Cf＝对应的2’-脱氧-2’-氟(“2’-氟”)核糖核苷酸；Ab＝无碱基；invAb＝反向无碱基；MeO-I＝2’甲氧基肌苷；GNA＝二醇核酸；sGNA＝具有3’硫代磷酸酯的二醇核酸；LNA＝锁核酸。在序列中“s”的插入指示两个相邻的核苷酸通过硫代磷酸二酯基团(例如硫代磷酸酯核苷酸间键)连接。除非另有指明，否则所有其他核苷酸通过3’-5’磷酸二酯基团连接。表2中的每个siRNA化合物均包含19-21个碱基对的双链体区，其在两条链的3'端具有2个核苷酸的突出端或者在一个末端或两个末端具有钝端。各[磷酸酯]已连接至下列的GalNAc结构(sGalNAc3)：

，其中X＝O或S。

表2.针对具有修饰的GPAM的siRNA序列

实例2：在RNA FISH测定中所选择GPAM siRNA分子的功效

制备了来自实例1的一组完全化学修饰的siRNA，并在体外测试了mRNA敲低的效力和选择性。各siRNA双链体由两条链组成，即有义链或“过客”链和反义链或“指导”链。

进行了RNA FISH(荧光原位杂交)测定，以通过测试siRNA来测量GPAM mRNA敲低。将HepG2细胞(ATCC HB-8065)在补充有10％胎牛血清(FBS，西格玛公司(Sigma))和1％青霉素-链霉素(P-S，康宁公司(Corning))的伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)(30-2003^TM)中培养。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))通过反向转染将siRNA转染到细胞中。通过Bravo自动化液体处理平台(安捷伦公司)将1μL的测试siRNA(10个数据点，用于从500nM最终浓度开始以1:3稀释的剂量)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物和4μL不含补充物的普通EMEM添加到PDL包被的CellCarrier-384Ultra测定板(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中。然后，通过MultidropCombi试剂分配器(赛默飞世尔科技公司)，将在不含补充物的普通EMEM中预稀释(在5μLEMEM中0.06μL的RNAiMAX)的5μL的Lipofectamine RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司)分配到测定板中。在室温(RT)下孵育siRNA/RNAiMAX混合物20分钟后，使用Multidrop Combi试剂分配器，将补充有10％ FBS和1％ P-S的EMEM中的30μLHepG2细胞(每孔2000个细胞)添加至转染复合物中。将测定板在RT下孵育20min，然后置于培养箱中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时。

RNA FISH测定在siRNA转染后72小时在内部组装的自动FISH测定平台上使用制造商的测定试剂和方案(来自赛默飞世尔科技公司的ViewRNA HC筛选测定)进行。简言之，将细胞在4％甲醛(赛默飞世尔科技公司)中在室温下固定15分钟，在室温下用洗涤剂透化3分钟，且然后在室温下用蛋白酶溶液处理10分钟。将靶特异性探针(赛默飞世尔科技公司，VA6-3170392-VC(GPAM)和VA1-10148-VC(PPIB))或媒介物(不含靶探针的靶探针稀释剂，作为阴性对照)孵育3小时，而将前置放大器、放大器和标记探针分别孵育1小时。所有杂交步骤均在40℃下在Cytomat 2C-LIN自动培养箱(赛默飞世尔科技公司)中进行。

在杂交反应后，将细胞用Hoechst和CellMask Blue(赛默飞世尔科技公司)染色30min，且然后在Opera Phenix高含量筛选系统(珀金埃尔默公司)上成像。使用Columbus图像数据存储和分析系统(珀金埃尔默公司)对图像进行分析，以获得每个细胞的平均斑点计数。使用高(具有靶探针的PBS)和低(没有靶探针的PBS)对照孔对每个细胞的平均斑点计数进行归一化。高和低对照分别具有100和0的归一化值。使用基因数据公司(Genedata)的Screener数据分析软件(基因数据公司，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))将相对于测试siRNA浓度的归一化值拟合到4参数S形模型以获得IC50值和最大活性。

测定的结果显示在表3中。GPAM敲低提供与对照样品相比的敲低百分比。负值指示GPAM水平降低。

表3.使用人/食蟹猴跨GPAM siRNA进行的RNA FISH测定

实例3：在含有人PNPLA3序列的基于AAV的小鼠模型中进行的选定PNPLA3siRNA分子的功效筛选

将稀释在磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司，14190-136)中的腺相关腺病毒(AAV；血清型AAVDJ8；无内毒素，由美商安进公司(Amgen)内部制备)以1x10¹²个病毒颗粒/动物施用到C57BL/6NCrl雄性或雌性小鼠(查尔斯河实验室公司(Charles RiverLaboratories Inc.))的尾静脉中以驱动人GPAM序列在肝中的表达。从GPAM_XM_005269998.1转录物设计五个AAV构建体用于体内筛选；一个包含GPAM^I43V的全长编码序列，以及四个增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告构建体包含一段5’非翻译区、编码区和3’非翻译区(核苷酸(nt)1-1700、nt 1600-3300、nt3200-4900、和nt 4800-6527(AAV-A、AAV-B、AAV-C、和AAV-D)。含eGFP的构建体还包含基准siRNA靶序列，用于比较siRNA介导的跨AAV和研究的敲低功效。

表4中所示的GalNAc缀合的siRNAs针对GPAM^I43V、AAV-A、AAV-B、AAV-C、或AAV-D测试。AAV注射后两周，通过皮下注射以0.5、1.0或3.0毫克/千克动物用稀释在磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司，14190-136)中的单剂量siRNA治疗小鼠(通常为10-12周龄，每组n＝3-4只动物)。siRNA注射后28天后，对动物实施安乐死，并从动物身上收集肝并快速冷冻在液氮中。根据制造商的说明，使用QIACube HT仪器(凯杰公司(Qiagen)，9001793)和RNeasy 96 QIACube HT试剂盒(凯杰公司，74171)处理肝的一部分以获得纯化的RNA。使用QIAxpert系统(凯杰公司(Qiagen)，9002340)分析样品。用RQ1无RNA酶的DNA酶(普洛麦格公司(Promega)，M6101)处理RNA，且使用TAQMAN^TM RNA-to-CT^TM 1-Step试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，4392653)制备实时qPCR。实时qPCR在QuantStudio Real-TimePCR机器上运行。结果基于以下的基因表达：人GPAM(英杰公司(Invitrogen)，Hs00326039)、GFP2(IDT定制测定：正向引物：TCATCTGCACCACTGGAAAG(有义；SEQ ID NO:2801)，反向引物：CTGCTTCATATGGTCTGGGTATC(反义；SEQ ID NO:2802)，探针：5’-6FAMCCAACACTGGTCACTACCCTCACC TAMRA-3’(有义；SEQ ID NO:2803))和/或牛生长激素聚腺苷酸化(BghpA，其包含在每个AAV构建体中；IDT定制测定：正向：5’-GCCAGCCATCTGTTGT-3’(SEQ ID NO:2804)，反向：5’-GGAGTGGCACCTTCCA-3’(SEQ ID NO:2805)，探针：5’-6FAM-TCCCCCGTGCCTTCCTTGACC TAMRA-3’(SEQ ID NO:2806))，归一化为小鼠TATA结合蛋白(Tbp)(IDT，Hex Mm.PT.39a.22214839)，并表示为与媒介物处理的对照动物相比归一化为小鼠Tbp的人GPAM、GFP和/或BghpA mRNA表达的相对敲低百分比。阴性结果指示敲低。(nd＝未确定)。

表4.第28天GPAM敲低测定

本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用并入的相同的程度。然而，本文对参考文献的引用不应解释为承认这样的参考文献为本发明的先前技术。在通过引用并入的参考文献中所提供的任何定义或术语与在本文中所提供的术语和讨论不同的情况下，以本发明术语和定义为准。

认为前述书面说明足以能够使本领域普通技术人员来实践本发明。前述描述和实例详述本发明的某些优选实施例，且描述由诸位发明人所考虑的最佳模式。然而，将理解的是无论前述内容可如何详细地出现在文本中，本发明可以按多种方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求书及其任何等同物来解释。

Claims (42)

1.一种RNAi构建体，其包含有义链和反义链，其中该反义链包含与表1中列出的线粒体甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(GPAM)mRNA序列互补的区域，并且其中该RNAi构建体抑制GPAM的表达。

2.如权利要求1所述的RNAi构建体，其包含具有与在表2中列出的反义序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的区域。

3.如权利要求1或权利要求2所述的RNAi构建体，其中该反义链与表1中列出的GPAMmRNA序列杂交。

4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链包含与该反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。

5.如权利要求4所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约17至约24个碱基对。

6.如权利要求4所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约19至约21个碱基对。

7.如权利要求6所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为19个碱基对。

8.如权利要求6所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为20个碱基对。

9.如权利要求6所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为21个碱基对。

10.如权利要求4-10中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自为约15至约30个核苷酸。

11.如权利要求10所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自为约19至约27个核苷酸。

12.如权利要求10所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自为约21至约25个核苷酸。

13.如权利要求12所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自为约21至约23个核苷酸。

14.如权利要求1至13中任一项所述的RNAi构建体，其包含至少一个钝端。

15.如权利要求1至13中任一项所述的RNAi构建体，其包含至少一个具有1至4个未配对核苷酸的核苷酸突出端。

16.如权利要求15所述的RNAi构建体，其中该核苷酸突出端具有两个未配对核苷酸。

17.如权利要求15或16所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3’端、该反义链的3’端、或者该有义链和该反义链两者的3’端处包含核苷酸突出端。

18.如权利要求15-17中任一项所述的RNAi构建体，其中该核苷酸突出端包含5'-UU-3'二核苷酸或5'-dTdT-3'二核苷酸。

19.如权利要求1至18中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含至少一个经修饰的核苷酸。

20.如权利要求19所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是经2’-修饰的核苷酸。

21.如权利要求19所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-O-甲基修饰的核苷酸、经2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(BNA)、乙二醇核酸、反向碱基、或其组合。

22.如权利要求21所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是经2’-O-甲基修饰的核苷酸、经2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2’-氟修饰的核苷酸、或其组合。

23.如权利要求19所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。

24.如权利要求23所述的RNAi构建体，其中这些经修饰的核苷酸是经2'-O-甲基修饰的核苷酸、经2'-氟修饰的核苷酸、或其组合。

25.如权利要求1至24中任一项所述的RNAi构建体，其包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。

26.如权利要求25所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3'端处包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。

27.如权利要求25所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3'和5’端两者处包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。

28.如权利要求1-27中任一项所述的RNAi构建体，其中该反义链包含选自表2中列出的反义序列的序列。

29.如权利要求28所述的RNAi构建体，其中该有义链包含选自表2中列出的有义序列的序列。

30.如权利要求1-29中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是表2中列出的双链体化合物中的任一种。

31.如权利要求1-30中任一项所述的RNAi构建体，其中与已经与对照RNAi构建体一起孵育的肝脏细胞中的GPAM表达水平相比，在与该RNAi构建体一起孵育之后，该RNAi构建体降低肝脏细胞中的GPAM表达水平。

32.如权利要求31所述的RNAi构建体，其中这些肝脏细胞为HepG2细胞。

33.如权利要求1-32中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在体外在HepG2细胞中以5nM将GPAM表达抑制至少10％。

34.如权利要求1-33中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体以小于约1nM的IC50抑制GPAM在HepG2细胞中的表达。

35.如权利要求1-34中任一项所述的RNAi构建体，该RNAi构建体进一步包含与肝脏细胞表面上表达的一种或多种蛋白质结合的配体。

36.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-35中任一项所述的RNAi构建体和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

37.一种用于在有需要的患者中降低GPAM的表达的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求1-36中任一项所述的RNAi构建体。

38.一种用于在有需要的患者中降低GPAM的表达的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求36所述的组合物。

39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中与未接受该RNAi构建体的患者中的GPAM表达水平相比，在施用该RNAi构建体后的患者中GPAM在肝细胞中的表达水平降低。

40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中该患者患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。

41.如权利要求40所述的方法，其中该患者患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

42.如权利要求1-35中任一项所述的RNAi构建体或如权利要求36所述的组合物，用于在治疗NAFLD中使用。