JP2000504579A - 高等真核細胞の形質移入のための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高等真核細胞の形質移入用の組成物に関する。該細胞中で発現する核酸及び形質移入の最適状態に及ばない濃度で存在するカチオン性脂質の複合体は、１又は複数の膜活性酸ペプチド及び任意にヘルパー脂質を含有する。組成物中の全正電荷と全負電荷との比は、約０〜約３である。

Description

【発明の詳細な説明】 高等真核細胞の形質移入のための組成物 本発明は、高等真核細胞、特に哺乳類細胞の形質移入に関する。 核酸を生菌に導入する効率的な系が、特に遺伝子治療の範囲内で求められてい る。この場合、遺伝子は、in vivo で治療上効果的な遺伝子産生物を合成するよ うに、細胞中に固定されている。 遺伝子治療において核酸を使用するために最も発展し、かつこれまで最も広く 行きわたっている技術は、ウイルス、特にレトロウイルス及びアデノウイルスに 基づく作用をする細胞(Miller, 1992; Mulligan, 1993; Berkner; 1988) 及びカ チオン性脂質(Behr, 1994)中に遺伝子を移行させる系を利用するものである。遺 伝子を移行させる別の方法は、細胞が輸送巨大分子を利用する機構に基づくもの である。この例としては、レセプター介在エンドサイトーシスを介して細胞中に 遺伝子を移入する方法があげられる（例えば、Wu and Wu, 1987, Wagner et al. , 1990, EP-A1 0388 758）。 ここ10年間で開発されてきた合成遺伝子移行ビヒクルのうち、DNA を複合体化 及び凝縮することができるモノ−及びポリカチオン性両親媒性の脂質は、特に将 来有望であることが分かった(Behr, et al., 1989; Felgner, et al., 1987 and 1994; Leventis, et al., 1990; Gao, et al., 1991; Rose, et al., 1991; Haw ley-Nelson, et al.,1993; Weibel, et al., 1995; Solodin, et al., 1995)。 カチオン性脂質に基づく遺伝子移行方法の性能を向上させる努力は、これまで 、カチオン性脂質、例えば、アシル基、スペーサーアーム又は疎水性部を直接修 飾することにより行われてきた(Remy, et al., 1994; Felgner, et al., 1994) 。そのような方法の結果としての向上した結果にも関わらず、脂質/DNA粒子を細 胞に挿入する機構に関してなお説明できないことが存在する。より最近の刊行物 (Zabner, et al., 1995)には、これらの粒子の主な輸送法は、エンドサイトーシ スを介するものであることが示されているように思われる。 カチオン性脂質は、in vitroで十分に過剰の正電荷により最良の形質移入結果 を示す。従って、例えば、リポスペルミン(lipospermin)DOGS(商品名“トランス フェクタム(Transfectam)”で商業的に入手できるジオクタデシルアミドグリシ ルスペルミン）については、DNA に関して３〜６倍過剰の正電荷は、形質移入効 率について最適レベルを有することがわかっている(Barthel, et al., 1993)。 正電荷は、複合体の結合及びその細胞への吸入を促進する。また、トランスフェ クタムは、エンドソームに緩衝作用を及ぼし（緩衝作用には非常に重要な、リポ スペルミンの少なくとも塩基性の第二アミンのpKa 値は、約5.4 である; Behr, 1994）、それ故、一方では酵素性分解からDNA を保護し、他方では緩衝化エンド ソームの浸透性膨潤及びその後の不安定化を引き起こす。従って、脂質/DNA複合 体上の強い正電荷は、in vivo で使用する場合に、脂質/DNA粒子は非常に短い半 減期を有するという欠点を有している。 小過剰の正電荷（正電荷：負電荷の比≦２、好ましくは0.5〜1.5 ）における リポポリアミンDOGS及びDPPES(パルミトイルホスファチジルエタノールアミン) の効率を向上させるために、リポポリアミン／核酸複合体と会合することができ るアジュバント、例えば、いわゆる“ヘルパー脂質”を添加することが提案され た。 Kamata, et al., 1994は、ファクター３〜５で、過剰の正電荷1.25において、 ペプチドを使用する、リポフェクチン、すなわちモノカチオン性脂質DOTMA（N-[ 1-(2,3-ジオレイル−オキシ) プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリ ド）とヘルパー脂質DOPE（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）との1: 1 混合物を用いて行った遺伝子移行の効率を増加させている。 同様に、国際公開第 95/02698 号公報では、Kamata et.al., 1994 に記載され ているペプチドの１つを使用する、細胞の形質移入のための、コートしたウイル ス、なかでもインフルエンザウイルスの膜活性ペプチド、又は、リポフェクタア ミン、すなわちポリカチオン性脂質 2,3-ジオレイルオキシ-N-[2（スペルミンカ ルボキシアミド）エチル]-N,N-ジメチル-1- プロパンアミニウムトリフルオロア セテート(DOSPA) とDOPEとの3:1 混合物と組み合わせた水疱性口内炎ウイルスの 糖タンパク質から誘導したペプチドと共にカチオン性脂質を使用することが提 案されており、最適レベルである約20の過剰の正電荷によりファクター12までの 形質移入効率の向上が達成されることがわかっている。 一方、カチオン性脂質に、ウイルスの融合(fusogenic)特性又は親核(karyophi lic)特性を与えるために、ウイルス性ペプチドと接合しているカチオン性脂質は 、最適脂質濃度において期待外れの結果をもたらす(Remy et al., 1995)。 本発明の目的は、カチオン性脂質に基づく新規な遺伝子移行系を提供すること である。 この課題を解決するための準備において、第一の疑問、つまり、エンドサイト ーシスの後に、エンドソームから細胞質そして核へのDNA の輸送といった工程が 続き、カチオン性脂質による連続的な遺伝子移行の障害となるかどうかという疑 問が最初に生じた。 膜活性インフルエンザペプチドを添加することにより、トランスフェクタムを 最適濃度で、すなわち大過剰の正電荷で使用すると遺伝子発現がわずかに増加す る(1.5〜５倍) ことが分かった。このことから、遺伝子移行の障害は、エンドサ イトーシスベシクルからもたらされるものではないと結論づけられる。これは、 Kamata, et al., 1994により得られた結果と一致する（上記参照）。 本発明の目的は、高等真核細胞の形質移入用の組成物であって、形質移入のた めには最適状態に及ばない濃度(suboptimum concentration)で、細胞で発現され る核酸、１種以上のカチオン性脂質、並びに任意にヘルパー脂質を含有していて もよい複合体を含有する組成物を使用することによる本発明により達成された。 本発明の組成物は、組成物中の全正電荷と全負電荷との比が約０〜約３である、 １種以上の膜活性酸ペプチドを含有することを特徴とする。 好ましくは、本発明の組成物中の正電荷と負電荷との比は、約０〜約２である 。 “最適状態に及ばない濃度(suboptimum concentration)”は、カチオン性脂質 の正電荷と核酸の負電荷との比が、特定の形質移入のための最適比である比とは 異なるカチオン性脂質の量を意昧し、その結果、カチオン性脂質により、任意に ヘルパー脂質を添加することにより達成される形質移入効率は、最適濃度で達成 されるものよりも低い。用語“最適”は、細胞において形質移入により達成され る核酸の発現（すなわち、抑制RNA を使用するとき、目的の生物学的効果まで） をいう。最適状態に及ばない濃度は、最適濃度よりも高くても低くてもよい。 ヘルパー脂質と混合してもよいカチオン性脂質の最適状態に及ばない濃度は、 形質移入効率が最適濃度におけるよりも少なくとも約２のファクター、好ましく は約５〜約2,000 のファクター低い濃度に対応するのが好ましい。 特定の形質移入のためのカチオン性脂質の最適濃度、又は、形質移入効率が最 適濃度での値のほぼ半分に達する最適状態に及ばない濃度は、細胞のタイプに依 存する；これらの濃度は、場合ごとに、ヘルパー脂質と混合してもよいカチオン 性脂質を使用する滴定により増加する（又は減少する）濃度で決定することがで きる；適切には、レポーター遺伝子、即ちルシフェラーゼ遺伝子を使用して形質 移入効率を測定することができる。 膜活性ペプチドはエンドソーム膜を不安定にする能力により定義される；膜活 性ペプチドはまた、“エンドソーム的に(endosomolytically)活性なペプチド” 、“エンドソーム破壊ペプチド”又は“融合性の”ペプチドとしても公知である 。これらのペプチドは両親媒性を有し、α−ヘリックスを形成することができる ；それらの膜活性特性のために、エンドソームから細胞へ輸送される遺伝物質の 放出が、例えば、レセプター介在エンドサイトーシスによる細胞への核酸の移入 における制限的工程を構成する遺伝子移行方法において使用するのに適している 。 本発明の範囲内の適当な膜活性ペプチドは、天然起源のペプチド又は合成ペプ チド、例えば国際公開第93/07283号公報、Plank et al. 1994又はZauner et al. 1995により記載されているものである。 ペプチドが適当な膜活性特性を有しており、それ故、本発明の範囲内での使用 を考慮できるかどうかの問題は、エンドソームの口を破壊している間に細胞に起 こる方法をまねるアッセイにより決定することができる。適当なアッセイは、例 えばPlank et al., 1994により記載されているリポソーム及び赤血球予備アッセ イである。 好ましい態様において、本発明の組成物は、配列 GLF GAI AGFI ENGW EGMI DG WYG を有するINF6と称されるペプチドを含有する。 別の好ましい態様において、本発明の組成物は、配列 GLF ELA EGLA ELGW EGL A EGWYGCを有するINF10 と称されるペプチドを含有する。 別の好ましい態様において、本発明の組成物は、配列［GLF EAI EGFI ENGW EG nIDG］₂K を有するINF5と称されるペプチドを含有する。 別の好ましい態様において、本発明の組成物は、配列 GLFL GLA EGLA EGLA EG LA EGLA EGL EGLA GGSC を有するEGLA-Iと称されるペプチドを含有する。 別の好ましい態様において、本発明の組成物は、配列 GLF EAI EAFI ENAW EAM I DAWYG を有するINFAと称されるペプチドを含有する。 他の適当なペプチドとしては、配列［GLF EAI EGFI ENGF EGMI DGGG］₂K を有 するINF8と称される合成ペプチド；配列 GLF ELA EGLA ELGA EGLA EGWYGCを有す るINF9と称される合成ペプチド；配列WEA GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA G GSC を有するEGLA-II と称される合成ペプチド；配列 GLF EGA EGLA EGA EGLA E GLA EGWY GACを有するEGLA-IIIと称される合成ペプチド及び配列 GLF EGA EGLA EGW EGLA EGLA EGWY GACを有するEGLA-IV と称される合成ペプチドが挙げられる 。 本発明の範囲内で適当な他の合成膜活性ペプチドとしては、Plank et al., 19 94により記載されているものがあげられ、特に、INF4、INF4DI及びINF7と称され るペプチドである。 本発明の他の態様において、膜活性ペプチドを、脂質、例えばジパルミトイル ホスファチジルエタノールアミル(DPPE)で修飾する；本発明の組成物はまた、修 飾したペプチドも修飾していないペプチドも含有することができる。脂質修飾ペ プチドを使用する場合、ヘルパー脂質を添加する必要がない。 膜活性ペプチドの修飾に使用することができる脂質は、ヘルパー脂質としても 使用される脂質と基本的に同じである；実際的な理由として、反応性基が存在す るために、脂質及びペプチドは一般的に、特に結合方法に関して選ばれる。成分 の結合は、文献から公知の方法により、例えばMartin et al., 1989 又はRemy e t al., 1995 に記載されているようにして行われる。 任意に脂質修飾した、膜活性ペプチドを形質移入複合体に添加する量は、脂質 /DNA複合体の全正電荷並びにペプチドの負電荷の合計及びその分子量に依存する 。カチオン性脂質に関する相対量（当量、mol ペプチド/molカチオン性ペプチド で表される）又は使用される絶対量は、これらのパラメータを使用して各ケース 毎 に計算される(INF6 の場合、例えばトランスフェクタム２電荷当量は６nmolに相 当し、５μg INF6は２nmolに相当する) 。約０〜約３、好ましくは約０〜約２の 正電荷と負電荷との比について、ペプチドの量は、任意に他のペプチドと比較し た場合、まず予備試験において変化し得、このようにして最適の効果的な量を決 定することができる。 ポリカチオン性脂質が一般的に好まれるが、本発明の範囲内において、基本的 にあらゆるモノ又はポリカチオン性脂質を使用することができる。本発明の組成 物の成分として使用できる非常に多くのカチオン性脂質は、先行技術から公知で ある。適当なカチオン性脂質の例としては、例えば国際公開第95/02698号、第91 /16024号公報、並びに刊行物(Remy et al., 1994; Solodin et al., 1995; Felg ner et al., 1994; Ruysschaert et al., 1994; Weibel et al., 1995; LeBol e 'h et al., 1995）に見いだすことができる；ここに、これらの文献は本件明細 書に含まれるものとする。 特に好ましいカチオン性脂質は、リポポリアミン、例えば、EP-A1 394 111 に 記載されているもの、特に、商品名“トランスフェクタム”で入手可能なDOGS（ ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。 ヘルパー脂質と混合していてもよいカチオン性脂質は、上述したように、最適 状態に及ばない量で、すなわち、脂質の正電荷と核酸の負電荷との比が、最適の 遺伝子移行効率に使用できる比よりも大きいか又は小さい比で形質移入複合体中 に存在する一方、ヘルパー脂質が存在する場合、形質移入効率に与える影響を、 カチオン性脂質の最適状態に及ばない量の規定について考慮に入れる；例えば、 ヘルパー脂質は、ヘルパー脂質を含有しないわずかに最適状態に及ばない効率を 有するであろう濃度において、達成される形質移入が、最適脂質濃度において得 られるものに対応する程度まで、カチオン性脂質の影響を向上させることができ る；こうして、カチオン性脂質／ヘルパー脂質対の全濃度は、カチオン性脂質自 身の最適状態に及ばない濃度であるにも関わらず、この場合全てにおいて最適で ある。 “へルパー脂質”は、両性イオンすなわち生理的条件下で電荷を有さない（天 然起源又は合成の）中性脂質、例えば、コレステロール、ジオレイルホスファチ ジルエタノールアミン(DOPE)、オレオイルーパルミトイルホスファチジルエタノ ールアミン(POPE)、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール等であ る。他の適当なヘルパー脂質の例としては、とりわけ、国際公開第95/18863号及 び第95/02698号公報に記載されているものがあげられる；これらは本件明細書に 含まれるものとする。 本発明の組成物は、１種以上のヘルパー脂質を含有することができる。 好ましいヘルパー脂質は、脂質DOPE、POPE、DOG(1.2- ジ- オレオイル-rac-グ リセロール) 、MOG(1- モノ- オレオイル-rac- グリセロール) 、EPC(エイホス ファチジルコリン) 、EPE(エイホスファチジルエタノールアミン) である。 ヘルパー脂質は、カチオン性脂質を基準として、0.1〜10当量(mol/mol) の濃 度で使用されるのが好ましい。 細胞に輸送される核酸は、ヌクレオチド配列に制限のない、DNA 又はRNA であ り得る。遺伝子治療にとって、DNA は、主に、細胞中で発現されないか又は十分 に高濃度では発現されない治療上活性な遺伝子産生物を発現するように、細胞中 に取り込まれている遺伝子からなるのが好ましい。治療上の目的については、阻 害効果、例えばアンチセンスRNA 分子又はリボザイム或いはそれらをコードする DNA 分子を有する核酸が考えられる。本発明の範囲内で使用できる核酸の例とし ては、例えば国際公開第93/07283号及び第95/18863号公報に記載されている。 他の観点では、本発明は、高等真核細胞を本発明の組成物に接触させることを 特徴とする、該細胞の形質移入方法に関する。 本発明の方法は、in vitro、ex vivo 又はin vivo で形質移入するために、好 ましくは哺乳類細胞の形質移入のために使用することができる。In vitroにおい て、本発明の方法を、特に、細胞培養物上で（粘着性又は懸濁状態で）使用する 。ex vivo での使用は、細胞を体から採取して、治療上効果的な核酸の分子によ りex corporeで処置又はトランスフェクトし、その後体に再導入する、遺伝子産 生物が発現され、その治療効果が現れる遺伝子治療処置である。ex vivo 処置の 例としては、サイトカイン遺伝子でトランスフェクトした自己細胞からの腫瘍ワ クチンの製造があげられる。 in vivo 適用では、本発明の組成物を、医薬製剤の形態で体に投与する。本発 明はまた、好ましくは静脈内で、又は腫瘤疾患を治療する場合には腫瘍内に適用 される前記医薬製剤に関する。 医薬製剤については、医薬的に許容できる添加剤並びに不活性担体、例えば生 理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水或いは本発明の組成物が溶解できる任意の担 体を本発明の組成物に添加することができる。医薬製剤の処方に関し、参考文献 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980は本件明細書に含まれるものとす る。 核酸として他のアニオン性分子と使用するために、例えば、高等真核細胞にア ニオン性タンパク質を運搬するために、本発明の組成物を修飾することができる 。 驚くべきことに、本発明の範囲内で、カチオン性脂質トランスフェクタムの形 質移入効率(Behr, et al., 1989)は、小過剰の正電荷(1.5及び２電荷当量) で、 すなわち、最適状態に及ばない濃度で使用したときに膜活性酸ペプチドにより有 意に向上させ得ることが分かった。 ペプチドINF6（２μg/1.5電荷当量のトランスフェクタム）の場合、トランス フェクタムの最適濃度（大過剰の正電荷）により得られる遺伝子発現レベルに近 づく、1,000 倍まで向上した。膜活性ペプチドによる遺伝子発現の増加は、数種 のタイプの細胞で観察された。試験した膜活性ペプチドのうち、わずかに酸性の ものによりトランスフェクタムと一緒になって良好な結果が得られた。この知見 は、エンドソームからのDNA の放出を向上させるため、ペプチドが脂質/DNA複合 体と同じエンドサイトーシスのベシクルに位置しなければならないという仮説と 一致し、この仮説は、ペプチドがイオン的に形質移入粒子に結合している場合に 保証される。２電荷当量のトランスフェクタムを使用した場合、ペプチドの性能 の順序は、INF6 > INF10 > EGLA-I > INF5 > INFA > メリッチンであった。検討 したペプチドについてトランスフェクタムにより得られたこれらの結果は、トラ ンスフェリン−ポリリジンを含有する形質移入複合体の対として、レセプター介 在エンドサイトーシスに基づく形質移入系においてペプチドを使用することがで きる場合に得られる知見とは異なる：この系において、INF5は最良のペプチドで あり、INF6よりも約50倍効率的である一方、トランスフェクタムと一緒になった 場合、INF6よりも10倍効率的ではなかった。ペプチド INF5 は、酸性ｐＨレベ ルにおいてのみ膜破壊効果を有する一方、INF6は中性ｐＨレベルにおいて膜活性 であった。ポリリジン接合細胞リガンドに基づく脂質フリー遺伝子移行系におい て、ペプチドの活性は、ペプチドを脂質系において使用したときには観察されな い中性のpH値において毒性の副作用を伴う。合成ペプチド EGLA-I 並びにINF10 は、ポリリジン含有複合体よりも脂質/DNA複合体に対する添加剤としてより適し ていることが分かった。 試験したペプチドが最適状態に及ばない電荷比でカチオン性脂質の形質移入効 率に与える影響は、ヘルパー脂質の効果と同程度のものであることがわかった(R emy, et al., 1995; Zhou, et al., 1994; Felgner, et al., 199 4; Leventis, et al., 1990)。 カチオン性脂質及び膜活性ペプチドを含有する形質移入複合体は、種々の方法 により製造することができる。本発明の試験において、本発明の組成物は３つの 異なる方法により製造することができる。これらは、複合体成分の添加又は混合 順序並びに希釈を行う時が異なる。第一の変形方法において、ペプチドをトラン スフェクタムと混合した後にDNA を添加した；第二の変形方法において、まずト ランスフェクタムをDNA により複合体化し、次にペプチドを添加した。第三の変 形方法において、トランスフェクタム/DNA複合体を希釈した後にペプチドを添加 した。形質移入複合体を製造する方法が形質移入効率の増加にどの程度の影響を 与えるかどうかについて検討した。製造方法が種々のペプチドに異なった影響を 与えることが分かった：INF6については、３つの製造方法は同等であった。INF5 の場合、第二及び第三の方法により製造した形質移入複合体により良好な結果が 得られ、INF10 の場合、第一及び第三の方法が第二の方法より優れていた。 製造方法に関わりなく、全体では負電荷を有する変異体インフルエンザペプチ ドとカチオン性脂質とを混合すると、形質移入粒子の電荷状態が変化するが、変 異体インフルエンザペプチドは全体では負の電荷を有するため（図１の挿入図を 参照のこと）、これらのペプチド含有複合体の幾つかは電気的に中性に近くなる 。 本発明の実験において、低電荷（２電荷当量トランスフェクタム）においてヘ ルパー脂質 DOPE を含有する非常に活性な DNA複合体(Remy, et al., 1995)を、 形質移入効率に関して、膜活性ペプチドを含有する本発明の複合体と比較した。 DOPEにより引き起こされる増加はその融合性状遺伝子を有する活性に起因するた め(Allen, et al., 1990; Litzinger and Huang, 1992)、本発明の範囲内で得ら れるFACSデータ（図３）により、ヘルパー脂質は別の重要な効果を有することが 分かる：形質移入複合体の細胞会合は、1.5 当量のDOPEを２電荷当量のトランス フェクタムに添加した場合、リポスペルミン自身を使用するときよりも非常に顕 著である。膜活性ペプチドは、ヘルパー脂質を含有する最適に効果的な複合体を 全く増加させないが、トランスフェクタムを過剰に（６電荷当量）使用すると、 すなわち、最適状態に及ばない量を使用すると、トランスフェクタム単独の最適 量を使用するときに得られる値と比較して遺伝子発現が有意に増加することがわ かった。 膜活性ペプチドは、血清に対する形質移入複合体の感受性を減少させることも 分かった。これは、in vivo での使用に関連して重要である。 図面の概要 図１：トランスフェクタム／DNA ／ＩNF6複合体の形質移入効率 図２：形質移入効率に与える血清の影響 図３：Ａ：スルーフローサイトメトリー分析 Ｂ：遺伝子発現 図４：形質移入効率に与える種々の膜活性ペプチドの影響 図５：形質移入効率に与える膜活性ペプチドを含有する形質移入複合体製造方法 の影響 図６：種々の細胞系を形質移入する間の膜活性ペプチドを含有する複合体の効率 図７：形質移入効率に与えるバフィロマイシンＡ１の影響 図８：形質移入効率に与えるヘルパー脂質の影響 図９：形質移入効率に与えるトランスフェクタム、ヘルパー脂質及び膜活性ペプ チドの組み合わせの影響 図１０：形質移入効率に与える脂質修飾膜活性ペプチドの影響 以下の実施例において、他に特に記載がなければ、以下の材料及び方法を使用 した： ａ）レポーター遺伝子プラスミドpCMV-Luc ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのコントロール下でルシフェラーゼ遺伝子 を含有するプラスミドpCMV-Lucの濃度は、pCMVL の名称で、国際公開第93/07283 号公報に記載されているとおりである。 ｂ）種々の試薬 リポポリアミンDOGS（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）は、商標名 “トランスフェクタム”でPromega 社から、ヘルパー脂質DOPE (1,2-ジオレオ イル−sn−グリセロ−３−ホスフアエタノールアミン) 、MOG （１−モノ−オ レオイル−rac −グリセロール）、DOG（1,2-ジ−オレオイル−rac −グリセロ ール）、EPE (エイホスファチジルエタノールアミン) 、EPC （エイホスファ チジルコリン）並びにクロロキン、バフィロマイシンＡ１及びメリッチン (melittin)（ハチ毒由来）はSigma 社から入手した。 ｃ）ペプチド合成 ペプチドの名称、それらの起源及びそれらの配列を表に示した。 INF5及び INF6 と称されるペプチドを、Plank, et al., 1994に記載されてい るようにして合成した。 ペプチドINFA及びINF10 及びEGLA-Iを、HBTU活性剤（Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリ アゾール−１−イル）−N,N,N',N' −テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホ スフェート）（Fastmoc(商標),0.25mmol標準）により、Ｆｍｏｃ方法（Ｎ−（９ −フルオレニル）メトキシカルボニル））を使用して、フィードバックモニター を有するアプライドバイオシステムペプチド合成器モデル 433A（Foster city, カルフォルニア）で合成した。各サイクル当たり脱保護工程を３回行った。フィ ードバックモニターによりFmoc 脱保護が定量的でないことがわかった場合、隣 のアミノ酸の二重結合及び（無水酢酸を使用する）末端ＮＨ₂ 基のブロックを以 下の工程で行った。以下のアミノ酸保護基を使用した：(Trt)Asn, (Trt)Cys, (t -BU)CyS, (t-BU)ASP, (t-BU)Glu, (BOC)Lys。７０％ＮＭＰ／３０％ＤＭＦの混 合物を溶媒として使用した。 EGLA-Iについては、HMP 樹脂を使用した(Tentagel R PHB, 0.22mmol/g, RappP olymere)。基Gly-30から離れたところでペプチドを一緒に合成し、半分の量の 樹脂を使用してEGLA-Iを合成した。 ペプチドINF10 及びINFAを、Cys(Trt)−予め帯電させたアミノメチル化ポリス チレン樹脂上で、溶媒として DMFを使用するp-カルボキシトリチルクロライドリ ンカー(0.52mmol/g; PepChem, Tubingen, Germany)により合成した。 INF 二量体と称されるペプチド(Plank et al., 1994 により記載されているペ プチドINF7の二量体) を、アプライドバイオシステムペプチド合成器モデル431 でFmoc法を使用して合成した。システインで予め帯電させた樹脂を使用した(Ten tagel S PHB-Cys)。中心に位置するLys DiFmoc- を、第一アミノ酸として結合さ せた。次に、Ile-18に対して二重結合を形成させた。Met-17からIle-10に単結合 を行った；Phe-9 に単結合を形成させ、次に、結合混合物中で１％トリトンによ りさらに結合を形成させた。Gly-8 から先へ単結合を形成させた。 フェノール、エタンジチオール、チオアニソール、水及びトリフルオロ酢酸の 混合物（0.75:0.25:0.5:0.5:10）を使用して、ペプチドの脱保護及び樹脂からの 切断を行った。粗ペプチドを、エーテルに滴下することにより沈殿させ、次いで 遠心分離にかけた。こうして得られたペプチドをエーテルで３回洗浄し、続いて アルゴン流下で、その後高真空により乾燥した。粗ペプチドを1M TEAB, pH 9 及 び１％β−メルカプトエタノールに溶解させた。 ペプチドの純度を、C-18 カラム(Vydac 218ATP54, 2.1mm×25cm, ５μm)を使 用する分析用逆相HPLCにより測定した。二成分溶媒系（溶媒A: 0.1％トリフルオ ロ酢酸水溶液；溶媒 B: 0.1 ％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を、45分 で0-100 ％の勾配において流量1ml/min で使用した。分析用イオン交換クロマト グラフィー(SuperQ-Toyopearl 650, TosoHaas, 5mm×50mmカラム)を、塩勾配(20 mM HEPES、pH 7.3、60分で0〜1.5M NaCl、流量0.5ml/min)を使用して行った。 ペプチド EGLA-I を、ゲル濾過(Sephadex G10, 20mM TEAA, pH7.3)に供した。 精製したペプチド画分をSpeedvac（Savant）中で凍結乾燥した。分析用逆相クロ マトグラフィーにより、純度約95％であることが分かった。 粗ペプチド INF10及び INFA の溶液を、20mM TEAA, pH 7.3 中で、Sephadex G 10（10mm×300mm カラム）において、ゲル濾過により分画した。ペプチドを親 液性化(lyophilise)した；分析用逆相クロマトグラフィーにより、純度約98又は 95％を得た。 ペプチドINF7二量体を、Sephadex G 10(緩衝液 HBS；カラム10mm×300mm)によ り精製した。次に、イオン交換クロマトグラフィーを行った（カラム：(10mm × 100mm); 装置：Toso Haas Super Q 650S；流量：0.5ml/min；溶離剤 :A: 20mMHe pes 7.3, B: 3M NaCl/20mM Hepes 7.3; 勾配: 0-40分０％ B, 40-140分100 ％B, すなわち１％/min）。ペプチドは、70-80 分で溶離した。イオン交換体を使用 して精製したペプチドを、再度Sephadex G 10 column (10mm×300mm)(緩衝液HBS /50 ％グリセロール) を使用して精製した。 ペプチドの同定を、Plank, et al., 1994 に記載されているようにして行った 。ペプチドを液体窒素中で凍結させた。 リポソーム漏出アッセイを、Plank et al., 1994に記載されているようにして 行った。 d)細胞培養及び培地 培地並びにウシ胎児血清(FCS) 及びウマ血清を、Gibco-BRL から入手した。培 地に、2mMLグルタミン及び抗生物質を補った。使用した細胞は、H225と称される 一次ヒトメラノーマ細胞、細胞系TIB-73のマウス胎仔肝細胞(ATCC BNL CL.2) 、 細胞系A549のヒト肺ガン細胞(ATCC CCL 185)及びマウスメラノーマ細胞系 Cloudman S91の細胞、クローンM3（ATCC No.CCL 53.1）である。H225細胞はRPMI 1640/10 ％ FCS/1mMピルビン酸ナトリウム中で、A549細胞は DMEM/10％FCS中で 、BNL CL.2細胞は高グルコース−DMEM/10 ％ FCS中で、及びM3細胞はHam's F10 培地/15 ％ウマ血清/5％ FCS中で増殖させた。 e)細胞の形質移入 i)カチオン性脂質/DNA複合体の製造 Barthel, et al., 1993 に記載されているように、３μg のプラスミドDNA 及 び適当な量のトランスフェクタムを、75μl の150 mM NaCl に溶解させることに より複合体を製造した。10〜20分後、２つの溶液を一緒にした。さらに10分後、 該混合物を、血清フリー培地により全体積2ml まで希釈した。 用語“電荷当量”により、形質移入に使用するカチオン性脂質の量を規定する 。 １電荷当量は、プラスミドのリン酸基の全ての負電荷を中和するのに必要な量に 対応する。３μg DNA は、９nmolの負電荷に対応する；電荷比を計算するとき、 １mol のトランスフェクタムは、生理学的ｐＨにおいてプロトン化した３つのア ンモニウム基から発生する３mol の正電荷を有することに留意する。約1250のモ ル重量から出発するが、これは、３μgのDNA を使用するとき、６nmol (=7.58μ g)トランスフェクタムを含有する２mMトランスフェクタム溶液３μＬが、２倍過 剰の正電荷（２電荷当量トランスフェクタム/３μgDNA）に必要とされることを 意味する。 ペプチドのHBS 溶液（150mM NaCl, 20mM HEPES含有 HEPES緩衝化生理食塩水、 pH 7.3）を0.5 又は１mg/ml 量で、トランスフェクタム/DNA複合体に添加した。 10〜20分の成熟期後、形質移入体積を培地で2ml にし、得られた形質移入混合物 1ml を細胞の上にピペットで分取した。 ヘルパー脂質DOPE、DOG、EPC、EPE もしくはMOG 又はコレステロールを、微量 のジクロロメタンを含有するエタノール中に希釈した。トランスフェクタム／ヘ ルパー脂質／DNA 複合体を、DNA 溶液で希釈する前に、適当な量のトランスフェ クタム／ヘルパー脂質（使用したヘルパー脂質の量は、トランスフェクタムを基 準として、モル比で表される）を混合することにより製造した。 ii）形質移入及びルシフェラーゼ測定 形質移入の１日前に24ウェルプレートのウェル当たり50,000〜75,000 細胞を 入れた。全実験において形質移入体積は１mlであった。ｉ)において製造した複 合体１mlにより形質移入を行った。３〜４時間後、形質移入培地と、10％ FCSを 含有する新鮮な培地とを交換した。他に記載がなければ、各実験は少なくとも２ 回行った；これらの場合、図に示したペプチドの量は、２回測定するために使用 した全量を示す。 形質移入して24時間後、細胞を収集して150-200 μl の250mM トリス、pH 7.3 、0.5 ％トリトン X-100中に溶解させた。次に、細胞ライセートを1.5ml エッペ ンドルフチューブに移し、細片をペレットにするのに５分間、14,000g で遠心分 離した。国際公開第93/7283 号公報に記載されているようにしてルシフェラーゼ 活性を測定した。ルシフェラーゼ光単位は、新しく調製したルシフェリン溶液を 注 入し、累積して10秒後の一定量の上澄み(20 μl)から測定した。ルシフェラーゼ バックグラウンド(150-250光単位) は、各値から減じた；形質移入効率は、２回 測定の平均を表す全光単位として表した。タンパク質含有量は、ブラッドフォー ドアッセイ (Bio-Rad)を使用して定量的に測定した。 ｆ)スルーフローサイトメトリー スルーフローサイトメトリーについて、プラスミド DNAをインターカレート蛍 光染料YOYO-1(Rye, et al., 1992；Hirons, et al., 1994 により記載、モレキ ュラープローブから入手可能；300bp 当たり約１分子染料) と共にインキュベー トし、次に、複合体を上述のようにして製造した。複合体を、６ウェルプレート のウェル当たり300,000 個の H225 細胞を添加し、次いで、該プレートを４℃（ 細胞表面会合）又は37℃（細胞表面会合及び細胞への取込み）のいずれかにおい て４時間インキュベートした。次に、細胞を冷たい PBSで２回洗浄し、1mMEDTA のPBS 溶液により収集し、FACScan 装置(Becton Dickinson)により分析した。 実施例１ トランスフェクタム/DNA/INF6 複合体の形質移入効率 増加する量のインフルエンザウイルスから発生した膜活性酸ペプチド INF6 と 一緒にしたpCMV-Luc ３μｇ当たりのトランスフェクタムの１、1.5 、２又は４ 電荷当量物から複合体を製造し、次に、RPMI 1640培地と混合した。得られた複 合体を、H225細胞（24 ウェルプレートのウェル当たり75,000細胞) 上においた 。４時間後、形質移入培地と、10％ FCSを含有する新鮮なRPMI培地とを交換した 。実験結果は図１に示した（点線に菱形：１当量(eq.) トランスフェクタム /x μg INF6；実線に円：トランスフェクタム1.5eq./xμg INF6；破線に四角：トラ ンスフェクタム2eq./xμg INF6；実線に△：トランスフェクタム4eq．/xμg INF 6)。２又は1.5 電荷当量脂質を使用する場合、ルシフェラーゼ活として測定され る形質移入効率が100 〜1,000 倍増加したことがわかった。使用した条件がすで に最適である場合（４電荷当量のカチオン性脂質）、わずかに増加しただけであ った（約1.5 〜５倍）。ペプチド INF6 がpH 7において負電荷４を有するので、 静電的相互作用によりカチオン性脂質/DNA立子と会合することができる。中性粒 子を使用した場合（１電荷当量）、増加は全く観察されなかったが、これは、２ 、 ３のペプチドのみがこれらの複合体に結合することができるからであろう。残り の正電荷がペプチドとの会合によりマスクされるので、細胞膜との相互作用が妨 げられることもある。図１に挿入したのは、複合体の理諭的な電荷比に対してプ ロットしたトランスフェクタム/DNA/INF6 複合体の形質移入効率を示したもので ある。ほとんど全部のペプチドが形質移入粒子に結合すると仮定すると、電気的 に中性の（又はほとんど中性の）脂質ベクターに高いルシフェラーゼ発現が現れ る。 実施例２ 形質移入効率に与える血清の影響 H225細胞の形質移入を、図２に（電荷当量で）示した量のトランスフェクタム 及びペプチド INF6 を用いて行った。一つは全く血清を使用せずに（白色の棒） 形質移入を行い、あとの２つは、10％（点付きの棒）又は20％（灰色の棒）の非 加熱不活性化 FCSを使用して行った（図２）。ペプチド含有複合体は、血清に対 して感受性が低いことが分かった。 実施例３ トランスフェクタム/DNA複合体の会合及び発現割合 ａ)形質移入複合体のスルーフローサイトメトリー分析 方法の欄に記載したようにしてH225細胞の分析を行った。図３に示したように 、トランスフェクタム/DNA複合体と細胞表面との会合は、電荷比により明らかに 変化する：２電荷当量により、異種細胞群が見つかり、４電荷当量により、従来 のガウス曲線がみつかった。２（又は４）電荷当量のトランスフェクタムに膜活 性ペプチドを添加しても、４℃又は37℃のいずれにおいてもグラフの曲線に大き な変化は現れなかった。 ｂ)遺伝子発現 ａ)において行った試験と平行して、異なる形質移入複合体を４℃又は37℃に おいてインキュベーションした後に、300,000 細胞の遺伝子発現を測定した（細 胞は、４℃又は37℃でインキュベートし、４時間後 PBSで２回洗浄し、10％ FCS を含有する新鮮な培地と混合し、５％ CO₂下において37℃において20時間インキ ュベートした）。ペプチドの存在により（1.5 μｇ/ウェル；この実験において は、 測定回数は１回である）、４℃で混合した場合に発現は約15倍増加し、37℃で混 合すると発現は100 倍増加した（図3B；白色の棒：４℃でインキュベーション後 の遺伝子発現；黒色の棒：37℃でインキュベーション後の遺伝子発現）。 実施例４ 種々のペプチドの影響 方法の欄において記載したように、トランスフェクタム/DNA複合体を、３μgD NA 当たり２電荷当量のトランスフェクタムから製造した。幾つかの実験におい て、図４において規定したペプチドを、記載した量で複合体に添加した。良好な 溶血性活性を有し、低pH値については著しい特異性を有さない、ペプチドINF6、 INFA及びメリッチン(Melittin)は、異なる特性を示した： INFA 及び ＩＮＦ６ は、ファクター10又は200 で、２電荷当量のトランスフェクタムの形質移入効率 を増加させた。一方、メリッチンはわずかにルシフェラーゼ発現を増加させた。 さらに、メリッチンは２回の測定当たり５μｇの量で非常に有毒であった。リポ ソーム漏出試験において pH 5.0 でカルセインを効率的に放出するインフルエン ザペプチド変異体 INF5 及び INF10(Plank, et al., 1994) では、INFAよりも良 好な結果が得られたが、INF6よりは効率的ではなかった。また、インフルエンザ ウイルスのHA2 配列から誘導されたものではない、EGLA-Iと称されるペプチドを 試験したところ、GALA 反復におけるアラニン基の一つが(Parente, et al., 198 8)グリシン基により置換されていた。このペプチドは、INF5と同様の良好な結果 を示した。 実施例５ トランスフェクタム/DNA/ ペプチド複合体の製造方法がH225細胞の形質移入効 率に与える影響 ３つの異なる方法で複合体を製造した（図５）： ａ)DNA と複合体形成する前にペプチドと脂質とを混合する（点付きの棒） ｂ)培地で希釈する前にトランスフェクタム/DNA複合体を形成し、ペプチドを添 加する（150 μl 体積；灰色の棒） ｃ)培地で複合体を希釈した後にペプチドを添加する（２ml体積；黒色の棒） 図５の結果から、製造方法が遺伝子発現割合に与える影響は、ペプチド配列に 依存することがわかる。プラスミドと複合体を形成する前にペプチドとトランス フェクタムを混合することにより、ペプチドが反対方向に挙動するようになった ；一方、INF6については遺伝子発現割合は変化せず、INF10 については、上述の ようにして製造した複合体の性能は、標準方法（方法の欄参照）により製造した 複合体よりも５倍よかった。対照的に、この方法で複合体を製造した INF5 では 、遺伝子発現が著しく減少した。 実施例６ 種々の細胞系の形質移入効率に与えるペプチドの影響 脂質による遺伝子移行に与えるペプチドの影響が、特定の細胞タイプには制限 されないが一般的な現象であるという事実は、図６に示される種々の細胞系の細 胞による実験から明らかとなった(H225 細胞：白色の棒；BNLCL.2 細胞：点付き の棒；A549細胞：明るい灰色の棒；M3細胞：暗い灰色の棒）。トランスフェクタ ムから複合体を製造し、pCMV-Luc ５μg INF6及び細胞に与える複合体の効率を 試験した（試験した全ての細胞に最も高い値を与えるものではないが、比較とし て、４電荷当量の過剰の電荷でトランスフェクタムを使用した）。全ての細胞系 について、形質移入複合体が膜活性ペプチドを含有するとき、形質移入効率が増 加することが分かった。 実施例７ トランスフェクタム/DNA複合体の形質移入効率に与えるバフィロマイシンA1の影 響の検討 空胞プロトンポンプバフィロマイシン A1 の特異的阻害剤(Bowman, et al., 1 988; Yoshimori, et al., 1991) が、H225細胞の形質移入中に200 nMの濃度（２ 電荷当量のトランスフェクタム又は２電荷当量のトランスフェクタムにINF10 又 はINF6を加えたものを使用した；４時間インキュベーション後、培地を10％ FCS を含有する新鮮な培地と交換した）で存在すると、それぞれファクター７、５及 び1.5 で遺伝子発現を減少させた（図７；白色の棒：バフィロマイシンA1を全く 添加しなかった；点付きの棒：200nM のバフィロマイシンA1存在）。４電荷当量 のトランスフェクタムを使用した場合、バフィロマイシンは遺伝子移行を減少さ せることができなかった。 実施例８ トランスフェクタム/DNA複合体効率に与えるヘルパー脂質の影響の検討 ａ)ヘルパー脂質によるトランスフェクタムの影響の増加 図８に規定したヘルパー脂質を、２電荷当量のトランスフェクタムに対して１ 〜３当量のヘルパー脂質のモル比で使用した。これにより、DOPE、EPE 又はDOG については遺伝子発現が10〜20倍高くなった（図3Bもまた参照のこと）。MOG で はファクター約４で発現は増加したが、EPC 及びコレステロールではH225 細胞 上での形質移入効率を増加させることができなかった。 １mol/％ DOGとトランスフェクタム/DOPE 組成物とを混合した場合、７倍まで のさらなる増加を達成することができた；これは、とりわけ、融合を誘発するDO G の能力に帰することができるためであろう(Siegel, et al., 1989)。 ヘルパー脂質 DOPE（1.5 mol／２mol トランスフェクタム；すなわち９nmolDO PE, 6.7μg に対応）を含有する形質移入複合体について、実施例3a）に記載し たようにしてスルーフローサイトメトリを行った。FACScan 曲線(Fig.3A)とは明 かな変化がある：細胞群はより均一であり、細胞会合（並びに、図示してはいな いが、37℃における細胞への取込み）は、ヘルパー脂質を含有しないよりもさら に示強性であった。２電荷当量のトランスフェクタム及び 1.5当量のDOPEについ て、４℃で実験してから24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したところ、DOPE 含有複合体は、４及び２電荷当量のカチオン性脂質単独(Fig.3B)よりもそれぞれ ８及び280 倍良好であることがわかった。実験を37℃で行ったところ、ルシフェ ラーゼ発現の差異はそれぞれ２及び640 倍であった。 ｂ)ヘルパー脂質及び膜活性ペプチドによるトランスフェクタムの影響の増加 トランスフェクタム/DNA/DOPE 複合体を製造した後、増加量のINF10 を添加し た。10-20 分成熟後、血清フリー培地を添加して全体積２mlにした；１mlの形質 移入混合物を２回測定用に各ウェルに施した。これらの試験結果は図９に示した (白色の棒：トランスフェクタム；点付きの棒：トランスフェクタム６当量、ト ランスフェクタム/DOPE 0.36当量；黒色の棒：トランスフエクタム６当量、トラ ンスフェクタム/DOPE 0.36当量/xμg INF10)。膜活性ペプチドが存在してもさら に増加することはなかったが、複合体の場合には高い効率であった（トランスフ ェクタム２当量/INF10 3μg, 5μｇ 又は 7.5μg/1.5 当量 DOPE）（図９には示 さず）。しかしながら、過剰のトランスフェクタム（６電荷当量）と共にペプチ ドを使用した場合、最適量のトランスフェクタム/DOPE を用いて得られた値と比 較して、遺伝子発現は有意に増加し得た；６当量トランスフェクタム/0.36 当量 DOPE/10μg INF10 を用いて得られた値は、２当量トランスフェクタム/1.5当量 DOPE/7.5 μg INF10 を用いて得られた値よりも６倍良かった。 実施例９ 形質移入効率に与える脂質修飾膜活性ペプチドの影響 ａ)修飾ペプチド（DPPE-INF7 二量体）の製造 INF7二量体と称されるペプチド（表参照）、すなわちPlank, et al., 1994 に より記載されたペプチドINF7の二量体を、0.95当量のペプチド (80mnol；約450 μg)を、1.3ml のジエタノールアミン緩衝液(pH 9.5/エタノール;9/1;v/v) に希 釈した脂質に添加することにより、脂質誘導体 DPPE-（ジパルミトイルホスファ チジルエタノールアミル）ブルモアセトアミド（ヘキサデカン酸-3-((2-(2-(2-( 2-(2-(2- ブロモアセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)-アセチルアミノ )エトキシ)ヒドロキシホスフォリルオキシ)-2-ヘキサデカノイルオキシプロピル エステル）に結合させた。室温で３時間後、チオール基の定量的な測定のために エルマン(Ellman)試験を行った。次に、残りのブロモアセトアミド基を破壊する ために、β−メルカプトエタノールを添加した。得られた脂質修飾ペプチドをさ らに精製せずに使用した。 ｂ）BNL CL.2 細胞の形質移入 1.5 当量のトランスフェクタムを、0.15M NaCl 75 μl に希釈し、完全に混合 し、次いで、図10において規定される量のDPPE-INF7 二量体を添加した（図に記 載されている値は、トランスフェクタムの全量を基準にして、モル％である）。 次にこれを完全に混合し、10分後に75μl NaClに溶解させた３μg DNA を添加し 、該混合物を再度混合し、さらに10分後、全形質移入体積２mlまで培地を補給し た。得られた形質移入組成物を、ウェル当たり１m1細胞に添加した。図10に示し た結果から、含有量7.5mol％のDPPE-INF7 二量体を用いて得られた値が最も増加 していることがわかる。 表 膜活性ペプチドの配列及び起源 n:ノルロイシン 文献 Allen, T. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 メヒトラー カルル オーストリア アー2126 ラーデンドルフ キルヒェンツァイレ 22 (72)発明者 キクレール アントワーヌ フランス エフ―45000 オルレアン リ ュー グリソン 13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 形質移入には最適状態に及ばない濃度で、細胞中で発現する核酸並びに１種 以上のカチオン性脂質を、任意にヘルパー脂質と共に含有する複合体を含有す る高等真核細胞を形質移入するための組成物であって、該組成物が、１種以上 の膜活性酸ペプチドを含有し、組成物中の正電荷の全数と負電荷の全数との比 が約０〜約３であることを特徴とする前記組成物。 2. 組成物の正電荷と負電荷との比が約０〜約２であることを特徴とする請求項 １記載の組成物。 3. ヘルパー脂質と混合していてもよいカチオン性脂質の最適状態に及ばない濃 度が、形質移入効率が最適濃度における効率よりも少なくともファクター約２ 低い濃度に対応することを特徴とする請求項１記載の組成物。 4. 配列 GLF GAI AGFI ENGW EGMI DGWYG を有するINF6と称されるペプチドを含 有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 5. 配列 GLF ELA EGLA ELGW EGLA EGWYGCを有するINF 10と称されるペプチドを 含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 6. 配列［GLF EAI EGFI ENGW EGnIDG］₂Kを有するINF 5と称されるペプチドを 含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 7. 配列 GLFL GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC を有するEGLA-Iと称さ れるペプチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の 組成物。 8. 配列 GLF EAI EAFI ENAW EAMI DAWYG を有するINFAと称されるペプチドを含 有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 9. 配列［GLF EAI EGFI ENGF EGMI DGGG］₂K を有するINF8と称されるペプチド を含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 10．配列 GLF ELA EGLA ELGA EGLA EGWYGCを有するINF9と称されるペプチドを含 有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。 11．配列 WEA GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSCを有するEGLA-II と称さ れるペプチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の 組成物。 12．配列 GLF EGA EGLA EGA EGLA EGLA EGWY GACを有するEGLA-IIIと称されるペ プチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物 。 13．配列 GLF EGA EGLA EGW EGLA EGLA EGWY GACを有するEGLA-IV と称されるペ プチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物 。 14．配列［GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYG］₂ KC を有するINF7二量体と称され るペプチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組 成物。 15．膜活性ペプチドが脂質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜14 いずれか１項記載の組成物。 16．前記ペプチドが、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミル（DPPE） により修飾されていることを特徴とする請求項１５記載の組成物。 17．カチオン性脂質がリポポリアミンであることを特徴とする請求項１〜16いず れか１項記載の組成物。 18．リポポリアミンがジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）である ことを特徴とする請求項17記載の組成物。 19．ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセリン及びジアシル グリセリンを含む群から選ばれる１種以上のヘルパー脂質を含有することを特 徴とする請求項１〜18いずれか１項記載の組成物。 20．ヘルパー脂質としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を 含有することを特徴とする請求項19記載の組成物。 21．ヘルパー脂質としてオレオイル−パルミトイルホスファチジルエタノールア ミン（POPE）を含有することを特徴とする請求項１９記載の組成物。 22．ヘルパー脂質として１−モノ−オレオイル−rac −グリセロール (MOG)を含 有することを特徴とする請求項19記載の組成物。 23．ヘルパー脂質として1,2-ジ−オレオイル−rac −グリセロール (DOG)を含有 することを特徴とする請求項19記載の組成物。 24．ヘルパー脂質としてエイホスファチジルコリン (EPC)を含有することを特徴 とする請求項19記載の組成物。 25．ヘルパー脂質としてエイホスファチジルエタノールアミン (EPE)を含有する ことを特徴とする請求項19記載の組成物。 26．ヘルパー脂質としてコレステロールを含有することを特徴とする請求項19記 載の組成物。 27．活性成分として請求項１〜25いずれか１項記載の組成物を含有する医薬製剤 。 28．高等真核細胞の形質移入方法であって、該細胞を請求項１〜26いずれか１項 記載の組成物と接触させることを特徴とする前記方法。 29．in vitro又はex vivo における哺乳類細胞への請求項28記載の方法の使用。