WO2008116819A1 - Verfahren zur herstellung einer transformierten zelle - Google Patents

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WO2008116819A1
WO2008116819A1 PCT/EP2008/053363 EP2008053363W WO2008116819A1 WO 2008116819 A1 WO2008116819 A1 WO 2008116819A1 EP 2008053363 W EP2008053363 W EP 2008053363W WO 2008116819 A1 WO2008116819 A1 WO 2008116819A1
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WO
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complex
transition metal
nucleic acid
anion
transformation
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Application number
PCT/EP2008/053363
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thorsten Singer
Jörg DENNIG
Original Assignee
Qiagen Gmbh
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transformed cell, the transformed cell obtainable by this method, the use of a complex of a transition metal in the transformation of cells, a kit for transforming cells, the use of this kit, a therapeutic composition, and the like Use of a complex for the preparation of a therapeutic composition.
  • transformation generally describes the process of introducing nucleic acids, in particular deoxyribonucleic acid (DNA), into any, eukaryotic or prokaryotic cells, and in particular also includes the special case of transfection, in which In particular, the term “transformation” encompasses both the temporary introduction of a DNA, for example a gene, into the cell (transient transformation) and the permanent incorporation of the DNA into the genome of the cell (stable transformation).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • transfection in vivo involves virus-mediated gene transfer using adenoviruses or retroviruses capable of transfecting nonviral DNA into mitotically active cells, and transfection by cationic liposomes linked to the negatively charged phosphate backbone of the DNA interact, used.
  • electroporation in which the cell membrane is made permeable to DNA by electroshocks
  • electroporation in which the cell membrane is made permeable to DNA by electroshocks
  • particle gun in which the foreign DNA is shot into the cell with the help of tiny metal beads on which the DNA has been fixed.
  • these physical methods which are usually very expensive, are suitable for the transfection of cells in vitro and chemical processes, such as the so-called calcium phosphate precipitation in which in a mixture of calcium chloride and sodium phosphate, the DNA to be transferred to the precipitated calcium phosphate binds.
  • liposomal or non-liposomal lipids can also be used for the transfection of cells into cells.
  • An example of an inserted as transfection, non-liposomal lipid, for example, is the commercially available product Effectene ® (Qiagen, Hilden, Germany).
  • enhancers are often cationic peptides or proteins, such as protamine sulfate.
  • the disadvantage of these enhancers on the one hand is that they are often isolated from biological material and therefore relatively expensive and also have to be stored cool.
  • these conventional enhancers require that the nucleic acid must first be preincubated with these enhancers prior to coupling with the enhancers Transfection and the cells is incubated. The method is therefore relatively expensive.
  • a further object of the present invention is to specify a method for producing a transformed cell, the method being characterized by a high transformation efficiency.
  • the process should be feasible with as few process steps as possible and with as inexpensive and easy to handle reagents as possible.
  • a contribution to achieving the abovementioned objects is made by a method for producing a transformed cell, comprising the method steps:
  • the nucleic acid provided in method step i), for which the term polynucleotide can also be used synonymously, may be a ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA) or else a mixed form.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • it may be any type of polynucleotide, which is an N-glycoside or C-glycoside of a purine or pyrimidine base or a modified purine or pyrimidine base, so may contain such bases that do not occur in nature.
  • the sugar residue can also be modified. Included are nucleic acids with modified subunit linkage, such as phosphorothioate or amidate linkages.
  • the nucleic acid may be single, double or multi-stranded, linear or circular. It may correspond to a molecule occurring in a cell, such as genomic DNA or messenger RNA (mRNA), or be generated in vitro, such as Complementary DNA (cDNA), counterstrand RNA (aRNA), or synthetic nucleic acids.
  • the nucleic acid may consist of a few subunits, at least two subunits, preferably eight or more subunits, such as oligonucleotides, several hundred subunits to several thousand subunits, such as certain expression vectors.
  • the nucleic acid contains the coding information for a polypeptide in functional association with regulatory sequences that permit expression of the polypeptide in the cell into which the nucleic acid is introduced.
  • the nucleic acid is an expression vector.
  • it is a pDNA (plasmid DNA), an siRNA, a siRNA
  • siRNA ribonucleic acids with a length of about 22 nucleotides are understood to be formed by cleavage of a double-stranded RNA (dsRNA) by the enzyme "Dicer” and in the enzyme complex "RISC"
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RISC enzyme complex
  • the provision of the nucleic acid optionally comprises the isolation of the DNA from a cell or a tissue by isolation methods known to the person skilled in the art, amplification of the nucleic acid by amplification methods known to the person skilled in the art or, if appropriate, the synthetic production of nucleic acid fragments known in the art synthesis method.
  • the nucleic acid provided in method step i) is incubated with a complex Ki of a transition metal and a transformation reagent other than this complex Ki, a complex Kn being obtained from the nucleic acid, the transformation reagent and the complex Ki of the transition metal.
  • the complex Ki of a transition metal may in principle be a quadratic, tetrahedral or octahedral complex, with octahedral complexes being particularly preferred.
  • the complex Ki of a transition metal is an octahedral complex and is selected from the group consisting of the complexes [M (a) 6 ] x , [M (c) 3] x , [M (c) 2 (a) 2 ] x or [M (c) (a) 4 ] x , where
  • M is a transition metal cation
  • a is an H 2 O molecule, NH 3 molecule, CO molecule, pyridine molecule, NO cation, chloride anion, bromide anion, iodide anion
  • Oxygen atom (nitrito ligand), a hydroxide anion, cyanide anion, a
  • the respective a-ligands may be the same or different,
  • c is a bidentate ligand, preferably a carbonate anion, a nitrate anion, an acetylacetonate anion, a 1,2-diaminoethane molecule
  • x is equal to the charge of the complex Ki, where the amount of x is equal to mn, where n is the sum of the negative charges of all ligands in the octahedral complex and m is the charge of the transition metal cation M, it being particularly preferred according to the invention that x has a value of at least +1, more preferably at least +2, and most preferably a value of +3, thus preferably the complexes Ki have a positive charge
  • the complex Ki of a transition metal is an octahedral cobalt i ⁇ complex, wherein it is moreover preferred that this cobalt i ⁇ complex comprises at least one ammonia molecule, moreover preferably at least two ammonia More preferably, at least three ammonia molecules, more preferably at least four ammonia molecules, and most preferably at least five ammonia molecules as ligands.
  • cobalt complexes according to the invention are, in particular, the following complexes
  • the preparation of the complexes Ki of a transition metal is carried out by the preparation process known to the person skilled in the art. Particularly preferred is the preparation of the complexes Ki in aqueous solution in which the suitable transition metal cations in the form of a water-soluble salt, particularly preferably in the form of a sulfate, chloride, bromide, iodide, acetate, most preferably dissolved in the form of a chloride and be added to this aqueous solution of the transition metal cation of the corresponding ligand or the corresponding ligands.
  • Precise protocols for preparing transition metal complexes can be found, inter alia, in JC Blair, The Chemistry of Coordination Compounds, Reinhold, New York (1956), J.
  • the complex Ki of the transition metal is brought into contact with the nucleic acid in method step ii), it is furthermore preferred according to the invention for the nucleic acid and the complex Ki to be in a weight ratio nucleic acid: complex of 1: 10,000 to 1: 1, particularly preferably 1: 1,000 to 1:10, and most preferably from 1: 100 to 1:50, depending on the type of nucleic acid and complex Ki, the skilled artisan can determine the optimal weight ratio between the nucleic acid and the complex by simple routine experimentation.
  • the transformation reagent used in method step ii) may be any substance known to the person skilled in the art as a transformation reagent or transfection reagent, in particular a liposomal or a non-liposomal lipid, a polymer, such as a polyethylenimine, a poly-L Lysine, a poly-L-arginine, a polyamide, a polyallylamine, a cationic methacrylate, chitosan to form a poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA), a dendritic cationic polymer such as a polyamidoamine (PAMAM) or a mixture of at least two of these substances.
  • a transformation reagent or transfection reagent in particular a liposomal or a non-liposomal lipid, a polymer, such as a polyethylenimine, a poly-L Lysine, a poly-L-arginine, a
  • the transformation reagent is a compound comprising a lipid, the transformation reagent being free of liposomes.
  • Liposomes are preferably understood to be spheroidal arrangements of lipids in bilayers-structured aqueous solutions which are typically classified into three classifications (see NY Academy Sciences Meeting: “Liposomes and Their Use in Biology and Medicine” of December 1977): Multilamellar Vesicles (MLV, up to 10,000 nm), small unilamellar vesicles (SUV, 20-50 nm), and large unilamellar vesicles (LUV, 600-30,000 nm).
  • the transformation reagent is at least one cationic, non-liposomal lipid includes.
  • Cationic, non-liposomal peptides which are suitable according to the invention are, for example, lipopolyamines, where the polyamines can be linear or branched and contain ethylene, propylene or butylene groups between the amino functions.
  • the polyamines are connected in various ways with a lipophilic radical.
  • lipopolyamines are described, inter alia, by Behr, JP et al. (Proc Natl Acad., USA 86: 6982-6986; 1989; EP-A-0 394 111).
  • the transformation reagent is a compound containing a lipid, the transformation reagent containing liposomes.
  • Erf ⁇ ndungshiel suitable transformation reagents are especially the commercially available products jctPEI ®, ligand koryugiertcs jetPEl ®. so-called ,, Taggcd '' jctPEI ® and DuoFeet ®, which are available from the St. Pinna Midwest Seientific Louis, USA, the product "FuGENE ® 6" from Roche Applied Science, Indianapolis, USA, the product Effectene ® of QIAGEN, Hilden, Germany, the products Lipofectamine ® or Lipofectamine ® 2000 from Invitrogen Life Technologies, Düsseldorf, and the product transPEI ® from EUROGENTEC s. a, Seraing, Belgium.
  • nucleic acid and the transformation reagent in step ii) in a weight ratio of nucleic acid: transformation reagent of 1: 1000 to 10: 1, more preferably from 1: 100 to 1: 1 and most preferably from 1: 20 to 1: 5, whereby the skilled person can determine the optimum weight ratio of these two components by simple routine experiments, depending on the type of nucleic acid and the transformation reagent.
  • the incubation of the nucleic acid with the complex Ki of a transition metal and the transformation reagent is preferably carried out for about 0 to 120 minutes, more preferably 0 to 20 minutes and more preferably 0 to 2 minutes, wherein incubation for at least 30 seconds, at least two minutes and on most preferably for at least 5 minutes may be advantageous. Furthermore, it is preferred that the incubation at a temperature in a range from 4 to 40 0 C, particularly preferably preferably carried out in a range of 10 to 37 ° C and most preferably in a range of 15 to 25 ° C.
  • the nucleic acid can be initially charged in a suitable aqueous buffer solution, for example a physiological saline solution or a nutrient medium, more preferably having a pH in the range of 6.5 to 8.5, most preferably 7 to 8, wherein the concentration of nucleic acid (even during the incubation step) preferably in a range of 0.01 to 1000 ⁇ g / ml, more preferably in a range of 0.2 to 100 ⁇ g / ml, and most preferably in a range of 1 to 10 ⁇ g / ml should be.
  • a suitable aqueous buffer solution for example a physiological saline solution or a nutrient medium, more preferably having a pH in the range of 6.5 to 8.5, most preferably 7 to 8, wherein the concentration of nucleic acid (even during the incubation step) preferably in a range of 0.01 to 1000 ⁇ g / ml, more preferably in a range of 0.2 to 100 ⁇ g / ml,
  • the transformation reagent and the complex are then added to this DNA solution, the concentration of the complex Ki preferably being in a range of 1 ⁇ mol / 1 to 100 mmol / l, preferably in a range of 10 ⁇ mol / mol, during the formation of the complex Kn. 1 to 10 mmol / l and most preferably in a range of 50 ⁇ mol / 1 to 1 mmol / l.
  • the concentration of transformation reagent in particular the amount of cationic, non-liposomal lipid, should preferably be in the range of 0.2 to 2000 ⁇ g / ml, especially during the formation of complex K 11 preferably in a range of 2 to 200 ⁇ g / ml, and most preferably in a range of 10 to 40 ⁇ g / ml.
  • the nucleic acid is not activated with the complex Ki of a transition metal before being brought into contact with the transformation reagent in step ii), wherein "activation” preferably involves incubation of the nucleic acid with the complex Ki (in the absence of the Transformationsreagenzes) for at least five minutes, preferably for at least two minutes and most preferably for at least one minute at a temperature in a range from 4 to 40 0 C, particularly preferably in a range of 10 to 37 ° C and most preferably at 15
  • the complex K n thus obtained from the nucleic acid, the transformation reagent and the complex Ki of a transition metal in step iii) is brought into contact with a cell, bringing it into contact both can be in vivo as well as in vitro, but most preferred in vitro transformation.
  • the cells used in process step iii) can in principle be plant cells, animal cells or microorganisms such as bacteria, Yeasts or fungi, with eukaryotic cells, particularly human cells, being most preferred.
  • the cells may be embedded in a tissue composite, for example in a tissue fragment or a tissue section, but they may also be in the form of an in vitro cell culture, in particular in the form of an adherent cell lawn (adherent cells) or in the form of a cell suspension (suspension cells) ,
  • cells or tissues can be incubated with the complex Kn from the nucleic acid, the transformation reagent and the complex Ki of a transition metal in a suitable medium. If culture cells are to be transformed, the complex Kn or a sterile aqueous buffer solution containing this complex Kn can be added to the culture medium.
  • the method according to the invention is suitable both for cells which grow in suspension in cell culture (suspension cells) and for cells which adhere to substrate surfaces (adherent cells).
  • in the in vitro transformation of the complex Kn with the cell for at least 5 minutes, preferably for at least 15 minutes and more preferably for at least 30 minutes at a temperature in the range from 4 to 37 ° C., particularly preferably at 37 ° C for the purpose of transformation is incubated.
  • the complex Kn or the sterile aqueous solution containing this complex Kn can be administered to an animal or plant organism, including humans.
  • the application can be systemic or topical, in animal organisms in particular parenteral, z.
  • Other application routes, eg. B. oral / enteral application are under suitable conditions and with appropriate Formulations possible.
  • the complex Kn or the sterile aqueous solution containing the complex Kn can also be administered locally directly into a target tissue, such as an organ or a tumor.
  • the complex Kn should be in pharmaceutically acceptable form. It can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the formulation depends on the application mode.
  • the complex Kn may be present, for example, in isotonic saline or in an isotonic buffer such as PBS or Ringer's solution, for pulmonary administration, for example in the form of a pharmaceutically acceptable aerosol.
  • Solid formulations can also be chosen according to the intended use, for example freeze-dried preparations which can be reconstituted with water before administration.
  • nucleic acid can be used as a drug in gene therapy.
  • the dosage is selected by the skilled person depending on the type of disease, the condition of the patient, the therapeutic approach and other factors.
  • the amount of complex administered 11 K in the range of 0.1 ug / kg to 100 ug / kg body weight will be of human application, preferably 2.5 ug / kg to 10 .mu.g / kg body weight.
  • a contribution to the solution of the abovementioned objects is further provided by a transformed cell obtainable by the method described above.
  • kits for the transformation of cells, comprising a contribution to the solution of the above-mentioned tasks
  • kit components such as buffers or reagents to control the transformation efficiency.
  • the complex Ki of a transition metal ( ⁇ 1) can be present in pure form in the kit of the invention, for example in the form of a preferably sterile salt, or in dissolved form, for example in the form of a buffered, preferably sterile solution, wherein the use of the complex Ki in the form a solution is particularly preferred.
  • Most preferred in this context is a sterile aqueous solution of hexaamine cobalt i ⁇ chloride ([Co (NH 3 ) e] Cl 3 ).
  • the concentration of the complex Ki in the aqueous solution is preferably in a range from 0.1 to 10 000 mM / 1, more preferably from 1 to 1000 mM / 1, and most preferably in a range from 10 to 100 mM / 1.
  • the transformation reagent ( ⁇ 2) which is different from the complex Ki of a transition metal ( ⁇ 1) may be any substance known to the person skilled in the art as transformation reagent or transfection reagent, but preferably one of those transformation reagents already mentioned in the beginning in connection with the method according to the invention
  • the transformation reagents may also preferably be in the form of a preferably sterile aqueous buffer solution in the kit according to the invention.
  • the optionally present buffer ( ⁇ 3) may likewise be any desired buffer which may be suitable for the person skilled in the art during the transformation of a cell, the buffer ( ⁇ 3) being in particular a physiological saline solution, PBS (Phosphate Buffered Saline) or a nutrient solution, such as MEM or DMEM, is particularly preferred.
  • a physiological saline solution PBS (Phosphate Buffered Saline) or a nutrient solution, such as MEM or DMEM, is particularly preferred.
  • a contribution to the solution of the abovementioned objects is also provided by a therapeutic composition
  • a therapeutic composition comprising a complex Kn comprising a nucleic acid, a transformation reagent and a complex Ki of a transition metal K 1 , where this complex Kn preferably comprises the complex Kn available in process step ii) is.
  • the therapeutic composition may also include a pharmaceutically acceptable carrier, such as a physiological saline solution.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a physiological saline solution.
  • a method for the treatment of a disease by means of gene therapy comprising the method steps, also contributes to the solution of the abovementioned objects:
  • all cells which are resistant enough to withstand removal, transformation and reimplantation from or into the organism may be used as cells which may be considered for such a gene therapy.
  • the cells should be as long lasting as possible so that the organism can benefit sufficiently from the beneficial properties of the transformed cell, for example from a protein secreted by the transformed cell.
  • Skin cells such as fibroblasts, liver cells, T cells such as T lymphocytes or bone marrow cells are particularly advantageous cells.
  • FIG. 1 shows the results of the transfection of HeLa S3 cells with the plasmid pCMV-beta with and without an enhancer according to the invention.
  • the human cell line HeLa S3 (adherent) was plated at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / well in 100 ⁇ l DMEM medium. Transfection was performed 24 hours after seeding the cells.
  • the plasmid pCMV-beta (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, Calif., USA, an expression plasmid for ⁇ -galactosidase) was used.
  • transfection essentially the protocol of Effectene ® -Trans Stammionsreagenzes was (sa Effectene ® Transfection Reagent Handbook / Stand May 2002 / QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) followed for adherent cells, as comparative examples:
  • the transfection of the cells with the Effectene ® -Trans Stammionsreagenz (EFF) according to the Effectene ® protocol for the transfection of adherent cells was used, but not the Effectene ® enhancer, but Hexaaminkobald i ⁇ chloride in different concentrations (Example D with 100 ⁇ M, Example E with 1 mM and Example F with 10 mM, based on the concentration in the formation of the complex of plasmid DNA and transfection) was used.
  • the cells Treated for about 48 hours after addition of the ® with the Effectene -Trans Stammionsreagenz Enhacer and the DNA, the cells using a lysis buffer (5 mM MgCl 2, 1% NP-40, 100 mM NaCl, 10 mM Tris / HCl, pH 7.4) lysed.
  • the transfection efficiency was determined by means of a ⁇ -galactosidase assay with ONPG (2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) as substrate. The results are shown in FIG.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte: i) Bereitstellen einer Nukleinsäure, ii) Inkubation der Nukleinsäure mit einem Komplex KI eines Übergangsmetalls und einem von diesem Komplex KI verschiedenen Transformationsreagenz unter Erhalt eines Komplexes KII aus Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex KI des Übergangsmetalls, sowie iii) In Kontakt bringen des Komplexes KII aus Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex KI des Übergangsmetalls mit einer Zelle. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Komplexes KI eines Übergangsmetalls bei der Transformation von Zellen, einen Kit zur Transformation von Zellen sowie die Verwendung dieses Kits.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER TRANSFORMIERTEN ZELLE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, die durch dieses Verfahren erhältliche, transformierte Zelle, die Verwendung eines Komplexes eines Übergangsmetalls bei der Transformation von Zellen, einen Kit zur Transformation von Zellen, die Verwendung dieses Kits, eine therapeutische Zusammensetzung sowie die Verwendung eines Komplexes zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung.
Der Begriff „Transformation", wie er hierin verwendet wird, beschreibt ganz allgemein den Vorgang des Einführens von Nukleinsäuren, insbesondere von Desoxyribonukleinsäure (DNA), in beliebige, eukaryontische oder prokaryontische Zellen. Er umfasst insbesondere auch den Sonderfall der Transfektion, bei der Fremd-DNA in eine Zellkulturzelle eingeführt wird. Der Begriff „Transformation" umfasst insbesondere sowohl das nur zeitweilige Einbringen einer DNA, beispielsweise eines Gens, in die Zelle (transiente Transformation) als auch den dauerhaften Einbau der DNA in das Genom der Zelle (stabile Transformation).
Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche unterschiedliche Methoden bekannt, um Fremd-Nukleinsäuren, insbesondere Fremd-DNA in eine Zelle einzubringen. Zur Transfektion in vivo werden insbesondere der Virus-vermittelte Gentransfer unter Verwendung von Adenoviren oder Retroviren, die in der Lage sind, nichtvirale DNA in mitotisch aktive Zellen zu transfizieren, und die Transfektion mittels kationischer Liposomen, die mit dem negativ geladenen Phosphat- Rückgrat der DNA interagieren, eingesetzt. Zur Transfektion in vitro eignet sich insbesondere physikalische in vitro- Transfektionsverfahren, wie etwa die Mikroinjektion, bei der die DNA mit einer Injektionsapperatur direkt in den Zellkern bzw. in die Zelle injiziert wird, die Elektroporation, bei der die Zellmembran durch Elektroschocks für DNA permeabel gemacht wird, sowie das sogenannte "Particle Gun" -Verfahren, bei dem die Fremd-DNA mit Hilfe von winzigen Metallkügelchen, auf denen die DNA fixiert wurde, in die Zelle geschossen wird. Neben diesen physikalischen Verfahren, die in der Regel sehr aufwendig sind, eignen sich zur Transfektion von Zellen in vitro auch chemische Verfahren, wie etwa die sogenannte Calcium- Phosphat-Präzipitation, bei der sich in einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat die zu übertragende DNA an das ausfallendes Calciumphosphat bindet. Die ausgefallenen Kristalle werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen. Weiterhin können auch liposomale oder nicht-liposomale Lipide zur in vztro-Transfektion von Zellen eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein als Transfektionsreagenz eingesetztes, nicht-liposomales Lipid ist beispielsweise das kommerziell erhältliche Produkt Effectene® (QIAGEN, Hilden, Deutschland) dar.
Werden chemische Transfektionsreagenzien wie beispielsweise nicht-liposomale Lipide zur Transformation von Zellen eingesetzt, wie etwa in der WO-A- 97/30024 beschrieben, so ist es häufig erforderlich, die Nukleinsäure, welche in die Zellen eingeschleust werden soll, zunächst mit sogenannten Enhancern vorzuinkubieren, um eine optimale Transfektionseffizienz sicherzustellen. Bei diesen Enhancern handelt es sich häufig um kationische Peptide oder Proteine, wie etwa Protaminsulfat. Der Nachteil dieser Enhancer besteht zum einen darin, dass sie häufig aus biologischem Material isoliert und daher vergleichsweise teuer sind und zudem auch kühl gelagert werden müssen. Zum anderen ist es bei diesen herkömmlichen Enhancern erforderlich, dass die Nukleinsäure zunächst mit diesen Enhancern vorinkubiert werden muss, bevor sie mit dem Transfektionsreagenz und den Zellen inkubiert wird. Das Verfahren ist daher vergleichsweise aufwendig.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile bei der Transformation von Zellen, insbesondere bei der in vzYro-Transformation, zu überwinden.
Ferner lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle anzugeben, wobei das Verfahren durch eine hohe Transformationseffizienz gekennzeichnet ist. Zudem sollte das Verfahren mit möglichst wenigen Verfahrensschritten und mit möglichst kostengünstigen und leicht handhabbaren Reagenzien durchführbar sein.
Einen Beitrag zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte :
i) Bereitstellen einer Nukleinsäure,
ii) Inkubation der Nukleinsäure mit einem Komplex Ki eines Übergangsmetalls und einem von diesem Komplex Ki verschiedenen Transformationsreagenz unter Erhalt eines Komplexes Kn aus Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex Ki des Übergangsmetalls, sowie
iii) In Kontakt bringen des Komplexes Kn aus Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex Ki des Übergangsmetalls mit einer Zelle, wobei das in Kontakt bringen vorzugsweise in vitro erfolgt. Überraschend wurde festgestellt, dass bei der Verwendung von Komplexen eines Übergangsmetalls als Enhancer bei der Transformation von Zellen auf eine Vorinkubation der Nukleinsäure mit dem Enhancer, wie sie bei den aus dem Stand der Technik bekannten Enhancern erforderlich ist, ohne Einbuße bei der Transformationseffizienz verzichtet werden kann.
Die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte Nukleinsäure, für die synonym auch der Begriff Polynukleotid verwendet werden kann, kann eine Ribonukleinsäure (RNA), Deoxyribonukleinsäure (DNA), oder auch gemischte Form sein. Im allgemeinen Fall kann es sich um jeden Typ von Polynukleotid handeln, der ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase darstellt, also auch solche Basen enthalten kann, die in der Natur nicht vorkommen. Außer der Base selbst kann auch der Zuckerrest modifiziert sein. Eingeschlossen sind Nukleinsäuren mit modifizierter Verknüpfung der Untereinheiten, etwa Phosphorothioat- oder amidat- Verknüpfungen. Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- oder mehrsträngig, linear oder zirkulär sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden Molekül entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten- RNA (mRNA), oder in vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA (cDNA), Gegenstrang-RNA (aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren. Die Nukleinsäure kann aus wenigen Untereinheiten, mindestens zwei Untereinheiten, bevorzugt acht oder mehr Untereinheiten bestehen, wie etwa Oligonukleotide, mehreren hundert Untereinheiten bis hin zu mehreren tausend Untereinheiten, wie etwa bestimmte Expressionsvektoren. Bevorzugt enthält die Nukleinsäure die kodierende Information für ein Polypeptid in funktionellem Zusammenhang mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Polypeptids in der Zelle erlauben, in die die Nukleinsäure eingebracht wird. So ist die Nukleinsäure in einer bevorzugten Ausführungsform ein Expressionsvektor. In einer anderen Ausführungsform ist sie eine pDNA (Plasmid-DNA), eine siRNA, eine siRNA-
- A - Duplex oder eine siRNA-hetero-Duplex, wobei unter dem Begriff „siRNA" Ribonukleinsäuren mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden verstanden werden, die durch Spaltung einer doppelsträngigen RNA (dsRNA) durch das Enzym „Dicer" entstehen und in den Enzymkomplex „RISC" (RNA-induced silencing complex) eingebaut werden. Die Bereitstellung der Nukleinsäure umfasst gegebenenfalls die Isolierung der DNA aus einer Zelle oder einem Gewebe durch dem Fachmann bekannte Isolierungsverfahren, die Amplifϊzierung der Nukleinsäure durch dem Fachmann bekannte Amplifϊzierungsverfahren oder aber gegebenenfalls die synthetische Herstellung von Nukleinsäurefragmenten durch dem Fachmann bekannt Syntheseverfahren.
Im Verfahrensschritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte Nukleinsäure mit einem Komplex Ki eines Übergangsmetalls und einem von diesem Komplex Ki verschiedenen Transformationsreagenz inkubiert, wobei ein Komplex Kn aus der Nukleinsäure, dem Transformationsreagenz und dem Komplex Ki des Übergangsmetalls erhalten wird.
Bei dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls kann es sich grundsätzlich um einen quadratischen, tetraedrischen oder oktaedrischen Komplex handeln, wobei oktaedrische Komplexe besonders bevorzugt sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls um einen Komplex ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kobatiπ-Komplexen, Kobalt11- Komplexen, Manganπ-Komplexen, Manganiπ-Komplexen, ManganIV-Komplexen, Kupferπ-Komplexen, Nickelπ-Komplexen, Chromiπ-Komplexen, Eisen11- Komplexen, Eiseniπ-Komplexen, Rhodiumiπ-Komplexen, Rhodiumπ-Komplexen, Iridiumiπ-Komplexen, Zinkπ-Komplexen, TitanIV-Komplexen, Palladium11- Komplexen und Platinπ-Komplexen, wobei Kobaltπ-Komplexe, Kobalt111- Komplexe, Rhutheniumπ-Komplexe, Rutheniumiπ-Komplexe, Eisenπ-Komplexe, Eiseniπ-Komplexe und Nickelπ-Komplexe besonders bevorzugt, Kobalt11- Komplexe und Kobaltiπ-Komplexe darüber hinaus bevorzugt und Kobalt111- Komplexe am meisten bevorzugt sind.
Weiterhin ist es erfϊndungsgemäß bevorzugt, dass der Komplex Ki eines Übergangsmetalls ein oktaedrischer Komplex ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Komplexen [M(a)6]x, [M(c)3]x, [M(c)2(a)2]x oder [M(c)(a)4]x, wobei
M ein Übergangsmetall-Kation,
a ein H2O-Mo lekül, ein NH3-Molekül, ein CO-Molekül, ein Pyridin-Molekül, ein NO-Kation, ein Chlorid- Anion, ein Bromid-Anion, ein Iodid-Anion, ein
Nitrit-Anion, gebunden über das Stickstoffatom (Nitro-Ligand) oder das
Sauerstoffatom (Nitrito-Ligand), ein Hydroxid-Anion, Cyanid-Anion, ein
NCS-Anion, gebunden über das Stickstoffatom (Isothiocyanat) oder über das Schwefelatom (Thiocyanat), ein Sulfϊd-Anion, ein Thiosulfat-Anion oder ein Sulfat-Anion, wobei, wenn mehr als ein a-Ligand in einem
Komplex vorliegt, die jeweiligen a-Liganden gleich oder verschieden sein können,
c ein zweizähniger Ligand, vorzugsweise ein Carbonat-Anion, ein Nitrat- Anion, ein Acetylacetonat- Anion, ein 1,2-Diaminoethan-Molekül, ein
Bipyridin- Molekül oder ein Phenanthrolin- Molekül, und
x gleich der Ladung des Komplexes Ki ist, wobei der Betrag von x gleich m-n ist, wobei n die Summe der negativen Ladungen aller Liganden im oktaedrischen Komplex und m die Ladung des Übergangsmetall-Kations M ist, wobei es erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist, dass x einen Wert von mindestens +1, besonders bevorzugt mindestens +2 und am meisten bevorzugt einen Wert von +3 aufweist, die Komplexe Ki somit vorzugsweise eine positive Ladung aufweisen
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls um einen oktaedrischen Kobaltiπ-Komplex, wobei es darüber hinaus bevorzugt ist, dass dieser Kobaltiπ-Komplex mindestens ein Ammoniak-Molekül, darüber hinaus bevorzugt mindestens zwei Ammoniak-Moleküle, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens drei Ammoniak-Moleküle, noch mehr bevorzugt mindestens vier Ammoniak-Moleküle und am meisten bevorzugt mindestens fünf Ammoniak-Moleküle als Liganden umfasst.
Als erfindungsgemäß besonders bevorzugte Kobaltiπ-Komplexe kommen insbesondere folgende Komplexe
a) [Cora(NH3)5H2O]3+, b) [Coπi(NH3)4(H2O)2]3+, c) [Coπi(NH3)3(H2O)3]3+,
Figure imgf000009_0001
e) [Coπi(NH3)2(H2O)4]3+, f) [Coiπ(NH3)i(H2O)5]3+, g) [Coiπ(NH3)5Cl]2+, h) [Coiπ(NH3)4Cl2]+, i) [Coiπ(NH3)3Cl3], j) [CoIII(NH3)2Cl4]", k) [CoIII(NH3)1Cl5]2-, 1) [COIΠ(NH3)4C1(H2O)]2+, m) [Coπi(NH3)5NO2]2+, n) [Coπi(NH3)4(NO2)2]+, o) [Coπi(NH3)3(NO2)3], p) [Coπi(NH3)2(NO2)4]", q) [CoIII(NH3)1(NO2)5]2" und r) [Coiπ(NH3)5(SO4)]+
in Betracht, wobei unter diesen Komplexen Ki diejenigen mit einer positiven Gesamtladung (= Komplexe a), b). c), d), e), f), g), h), 1), n) und r)) besonders bevorzugt und der [Co(NH3)6]3+-Komplex am meisten bevorzugt ist.
Die Herstellung der Komplexe Ki eines Übergangsmetalls erfolgt durch die dem Fachmann bekannten Herstellungsverfahren. Besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung der Komplexe Ki in wässriger Lösung, in dem die geeigneten Übergangsmetall-Kationen in Form eines wasserlöslichen Salzes, besonders bevorzugt in Form eines Sulfates, Chlorides, Bromides, Iodides, Acetates, am meisten bevorzugt jedoch in Form eines Chlorides gelöst und zu dieser wässrigen Lösung des Übergangsmetall-Kations der entsprechende Ligand bzw. die entsprechenden Liganden zugesetzt werden. Genaue Vorschriften zur Herstellung von Übergangsmetallkomplexen können unter anderem J. C. Blair, „The Chemistry of Coordination Compounds", Reinhold, New York (1956), J. Lewis und R. G. Wilkins (Hrsg.), ,Modern Coordination Chemistry", Wiley, New York (1960), D. P. Graddon, „An introduction to Coordination Chemistry", Pergamon Press, London (1968), F. Basolo und R. C. Johnson, "Coordination Chemistry, the Study ofMetal Complexes", Benjamin, New York (1965-1970) sowie M-Becke- Goehring und H. Hoffmann, "Komplexchemie", Springer, Berlin (1970) entnommen werden. Wenn der Komplex Ki des Übergangsmetalls im Verfahrensschritt ii) mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird, ist es weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Nukleinsäure und der Komplex Ki in einem Gewichtsverhältnis Nukleinsäure : Komplex von 1 : 10.000 bis 1 : 1 besonders bevorzugt von 1 : 1.000 bis 1 : 10 und am meisten bevorzugt von 1 : 100 bis 1 : 50 eingesetzt werden, wobei der Fachmann in Abhängigkeit von der Art der Nukleinsäure und des Komplexes Ki das optimale Gewichtsverhältnis zwischen der Nukleinsäure und dem Komplex durch einfache Routineversuche bestimmen kann.
Bei dem im Verfahrensschritt ii) eingesetzten Transformationsreagenz kann es sich um eine beliebige, dem Fachmann als Transformationsreagenz bzw. Transfektionsreagenz bekannte Substanz handeln, insbesondere um ein liposomales oder ein nicht-liposomales Lipid, um ein Polymer, wie etwa ein Polyethylenimin, ein Poly-L-Lysin, ein PoIy-L- Arginin, ein Polyamid, ein Polyallylamin, ein kationisches Methacrylat, Chitosan, um ein Poly(D,L-Lactid- co-Glycolid) (PLGA), um ein dendritisches kationisches Polymer, wie etwa ein Polyamidoamin (PAMAM) oder um eine Mischung aus mindestens zwei dieser Substanzen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Transformationsreagenz um eine Verbindung beinhaltend ein Lipid, wobei das Transformationsreagenz frei von Liposomen ist. Unter Liposomen werden vorzugsweise kugelartige Anordnungen von Lipiden in wässrigen Lösungen mit "Bilay er- Struktur" verstanden, welche typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt werden (siehe N. Y. Academy Sciences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medicine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 10 000 nm), kleine unilamellare Vesikel (SUV, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30.000 nm). In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Transformationsreagenz mindestens ein kationisches, nicht-liposomales Lipid umfasst. Erfϊndungsgemäß geeignete, kationische, nicht-liposomale Peptide sind beispielsweise Lipopolyamine, wobei die Polyamine linear oder verzweigt aufgebaut und Ethylen-, Propylen- oder Butylengruppen zwischen den Aminofunktionen enthalten können. Die Polyamine sind auf unterschiedlichste Weise mit einem lipophilen Rest verbunden. Solche Lipopolyamine sind unter anderem von Behr, J. P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; 1989; EP-A-O 394 111) beschrieben worden.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Transformationsreagenz um eine Verbindung beinhaltend ein Lipid, wobei das Transformationsreagenz Liposomen beinhaltet.
Erfϊndungsgemäß geeignete Transformationsreagenzien sind insbesondere die kommerziell erhältlichen Produkte jctPEI®, Ligand-koryugiertcs jetPEl®. sogenanntes ,,Taggcd'' jctPEI® sowie DuoFeet®, welche von der Pinna Midwest Seientific, St. Louis, USA, erhältlich sind, das Produkt „FuGENE® 6" der Firma Roche Applied Science, Indianapolis, USA, das Produkt Effectene® der Firma QIAGEN, Hilden, Deutschland, die Produkte Lipofectamine® oder Lipofectamine®2000 der Firma Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, sowie das Produkt transPEI® der Firma EUROGENTEC s. a, Seraing, Belgien.
Weiterhin ist es erfϊndungsgemäß bevorzugt, dass die Nukleinsäure und das Transformationsreagenz im Verfahrensschritt ii) in einem Gewichtsverhältnis Nukleinsäure : Transformationsreagenz von 1 : 1.000 bis 10 : 1, besonders bevorzugt von 1 : 100 bis 1 : 1 und am meisten bevorzugt von 1 : 20 bis 1 : 5 in Kontakt gebracht werden, wobei auch hier der Fachmann in Abhängigkeit von der Art der Nukleinsäure und des Transformationsreagenzes das optimale Gewichtsverhältnis dieser beiden Komponenten durch einfache Routineversuche bestimmen kann. Die Inkubation der Nukleinsäure mit dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls und dem Transformationsreagenz erfolgt vorzugsweise für etwa 0 bis 120 Minuten, besonders bevorzugt 0 bis 20 Minuten und darüber hinaus bevorzugt 0 bis 2 Minuten, wobei eine Inkubation für mindestens 30 Sekunden, mindestens zwei Minuten und am meisten bevorzugt für mindestens 5 Minuten vorteilhaft sein kann. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Inkubation bei einer Temperatur in einem Bereich von 4 bis 400C, besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 37°C und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 15 bis 25°C erfolgt.
Die Reihenfolge, in der die einzelnen Komponenten beim Inkubationsschritt ii) miteinander in Kontakt gebracht werden können, ist beliebig. So kann beispielsweise zunächst die Nukleinsäure in einer geeigneten wässrigen Pufferlösung, beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem Nährmedium, besonders bevorzugt mit einem pH- Wert in einem Bereich von 6,5 bis 8,5, am meisten bevorzugt 7 bis 8, vorgelegt werden, wobei die Konzentration an Nukleinsäure (auch während des Inkubationsschrittes) vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 1.000 μg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,2 bis 100 μg/ml und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 10 μg/ml liegen sollte.
Anschließend wird zu dieser DNA-Lösung das Transformationsreagenz und der Komplex zugegeben, wobei die Konzentration des Komplexes Ki während des Bildung des Komplexes Kn vorzugsweise in einem Bereich von 1 μMol/1 bis 100 mMol/1, besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 μMol/1 bis 10 mMol/1 und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 50 μMol/1 bis 1 mMol/1 liegen sollte. Die Konzentration an Transformationsreagenz, insbesondere die Menge an kationischem, nicht-liposomalem Lipid sollte während der Bildung des Komplexes K11 vorzugsweise in einem Bereich von 0,2 bis 2.000 μg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2 bis 200 μg/ml und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 40 μg/ml liegen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird die Nukleinsäure vor dem in Kontakt bringen mit dem Transformationsreagenz im Verfahrensschritt ii) nicht mit dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls aktiviert, wobei unter „Aktivierung" vorzugsweise eine Inkubation der Nukleinsäure mit dem Komplex Ki (in Abwesenheit des Transformationsreagenzes) für mindestens fünf Minuten, vorzugsweise für mindestens zwei Minuten und am meisten bevorzugt für mindestens eine Minute bei einer Temperatur in einem Bereich von 4 bis 400C, besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 37°C und am meisten bevorzugt bei 15 bis 25°C, beispielsweise bei Raumtemperatur, verstanden wird. Es ist demnach bei dieser besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass, wenn Nukleinsäure und Komplex Ki zunächst miteinander inkubiert werden und erst dann das Transformationsreagenz zugesetzt wird, diese Vorinkubation aus Komplex Ki und Nukleinsäure für nicht mehr als 5 Minuten, besonders bevorzugt für nicht mehr als 2 Minuten und am meisten bevorzugt für nicht mehr als eine Minute durchgeführt wird.
Nach der Inkubation der Nukleinsäure mit dem Transformationsreagenz und dem Komplex Ki des Übergangsmetalls wird der so erhaltene Komplex Kn aus der Nukleinsäure, dem Transformationsreagenz und dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls im Verfahrensschritt iii) mit einer Zelle in Kontakt gebracht, wobei dieses in Kontakt bringen sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen kann, die in vzYro-Transformation jedoch am meisten bevorzugt ist.
Bei den im Verfahrensschritt iii) eingesetzten Zellen kann es sich grundsätzlich um pflanzliche Zellen, tierische Zellen oder um Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen oder Pilze handeln, wobei eukaryontische Zellen, insbesondere menschliche Zellen, am meisten bevorzugt sind. Dabei können die Zellen in einen Gewebeverbund eingebettet sein, beispielsweise in einem Gewebefragment oder einem Gewebeschnitt, sie können jedoch auch in Form einer in vzYro-Zellkultur, insbesondere in Form eines adhärenten Zellrasens (adhärente Zellen) oder in Form einer Zellsuspension (Suspensionszellen), vorliegen.
Bei der in vzYro-Transformation können Zellen oder Gewebe mit dem Komplex Kn aus der Nukleinsäure, dem Transformationsreagenz und dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls in einem geeigneten Milieu inkubiert werden. Sollen Kulturzellen transformiert werden, kann der Komplex Kn bzw. eine sterile wässrige Pufferlösung beinhaltend diesen Komplex Kn zum Kulturmedium gegeben werden. Geeignet ist das erfmdungsgemäße Verfahren sowohl für Zellen, die in Zellkultur in Suspension wachsen (Suspensionszellen) als auch für Zellen, die an Substratoberflächen adhärent wachsen (adhärente Zellen). Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass bei der in vzYro-Transformation der Komplex Kn mit der Zelle für mindestens 5 Minuten, vorzugsweise für mindestens 15 Minuten und darüber hinaus bevorzugt für mindestens 30 Minuten bei einer Temperatur in einem Bereich von 4 bis 37°C, besonders bevorzugt bei 37°C zum Zwecke der Transformation inkubiert wird.
Zur Transformation in vivo kann der Komplex Kn bzw. die sterile wässrige Lösung beinhaltend diesen Komplex Kn in einen tierischen oder pflanzlichen Organismus einschließlich des Menschen appliziert werden. Die Applikation kann dabei systemisch oder topisch erfolgen, bei tierischen Organismen insbesondere parenteral, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intra- oder subkutane Injektion, intravenöse Infusion, pulmonare, buccale, nasale, dermale oder transdermale Applikation. Auch andere Applikationswege, z. B. orale / ente- rale Applikation sind unter geeigneten Bedingungen und mit entsprechenden Formulierungen möglich. Der Komplex Kn bzw. die sterile wässrige Lösung beinhaltend den Komplex Kn kann auch lokal direkt in ein Zielgewebe, etwa ein Organ oder einen Tumor, appliziert werden. Zur Applikation in vivo sollte der Komplex Kn in pharmazeutisch verträglicher Form vorliegen. Er kann dafür mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert werden. Die Formulierung richtet sich dabei nach dem Applikationsmodus. Zur Injektion oder Infusion kann der Komplex Kn beispielsweise in isotonischer Kochsalzlösung oder in einem isotonischen Puffer wie PBS oder Ringers Lösung vorliegen, zur pulmo naren Verabreichung zum Beispiel in Form eines pharmazeutisch verträglichen Aerosols. Auch feste Formulierungen können je nach Verwendungszweck gewählt werden, beispielsweise gefriergetrocknete Präparate, die vor Verabreichung mit Wasser rekonstituiert werden können. Dem Fachmann sind geeignete pharmazeutische Träger und Formulierungen bekannt, zum Beispiel aus Gennaro (Hrsg.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Ausgabe, 1995, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA. Auf diese Weise kann die Nukleinsäure als Arzneimittel in der Gentherapie eingesetzt werden.
Die Dosierung wählt der Fachmann in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, dem Zustand des Patienten, dem therapeutischen Ansatz sowie weiteren Faktoren. Im Allgemeinen wird bei humaner Anwendung die Menge des verabreichten Komplexes K11 im Bereich von 0.1 μg/kg bis 100 μg/kg Körpergewicht liegen, vorzugsweise 2.5 μg/kg bis 10 μg/kg Körpergewicht.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin eine transformierte Zelle, welche durch das vorstehende beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Weiterhin leistet auch die Verwendung eines Komplexes Ki eines Übergangsmetalls, vorzugsweise eines Komplexes Ki eines Übergangsmetalls, wie er im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingangs beschrieben worden ist, bei der Transformation einer Zelle, insbesondere als sogenannten „Enhancer" bei der Transformation einer Zelle, einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet darüber hinaus ein Kit (zur Transformation von Zellen), umfassend
(ßl) einen Komplex Ki eines Übergangsmetalls, vorzugsweise eines Komplexes K1, wie er im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingangs beschrieben worden ist,
(ß2) ein von dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls (ßl) verschiedenes
Transformationsreagenz, sowie
(ß3) gegebenenfalls weitere Kit-Komponenten, wie etwa Puffer oder Reagenzien zur Kontrolle der Transformationseffizienz.
Der Komplex Ki eines Übergangsmetalls (ßl) kann dabei in reiner Form im erfindungsgemäßen Kit vorliegen, beispielsweise in Form eines vorzugsweise sterilen Salzes, oder aber in gelöster Form, beispielsweise in Form einer gepufferten, vorzugsweise sterilen Lösung, wobei der Einsatz der Komplexes Ki in Form einer Lösung besonders bevorzugt ist. In diesem Zusammenhang am meisten bevorzugt ist eine sterile wässrige Lösung von Hexaaminkobaltiπ-Chlorid ([Co(NH3)e]Cl3). Die Konzentration des Komplexes Ki in der wässrigen Lösung liegt dabei vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mM/1, besonders bevorzugt von 1 bis 1.000 mM/1 und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 bis lOO mM/1. Bei dem von dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls (ßl) verschiedenen Transformationsreagenz (ß2) kann es sich um jede dem Fachmann als Transformationsreagenz bzw. als Transfektionsreagenz bekannte Substanz handeln, vorzugsweise jedoch um eines derjenigen Transformationsreagenzien, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt worden ist, wobei auch die Transformationsreagenzien vorzugsweise in Form einer vorzugsweise sterilen wässrigen Pufferlösung in dem erfindungsgemäßen Kit vorliegen können.
Bei dem gegebenenfalls vorliegenden Puffer (ß3) kann es sich ebenfalls um einen beliebigen, dem Fachmann bei der Transformation einer Zelle gegebenenfalls geeignet erscheinenden Puffer handeln, wobei als Puffer (ß3) insbesondere eine physiologische Kochsalzlösung, PBS (Phosphate Buffered Saline) oder eine Nährlösung, wie etwa MEM oder DMEM, besonders bevorzugt ist.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Kits in einem Verfahren zur Transformation einer Zelle, insbesondere jedoch in dem erfmdungsgemäßen Verfahren.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch eine therapeutische Zusammensetzung, beinhaltend einen Komplex Kn umfassend eine Nukleinsäure, ein Transformationsreagenz sowie einen Komplex Ki eines Übergangsmetalls K1, wobei es sich bei diesem Komplex Kn vorzugsweise um den im Verfahrensschritt ii) erhältlichen Komplex Kn handelt. Neben diesem Komplex Kn kann die therapeutische Zusammensetzung insbesondere auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie etwa eine physiologische Kochsalzlösung, beinhalten. Ebenso leistet auch die Verwendung dieses Komplexes Kn zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet schließlich auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit mittels Gentherapie, umfassend die Verfahrensschritte:
I) Entnahme einer Körperzelle aus einem Lebewesen,
II) Transformation der entnommenen Körperzelle durch das erfindungsgemäße Verfahren, sowie
III) Zurückführung der transformierten Körperzelle in das Lebewesen.
Als Zellen, die für eine solche Gentherapie in Betracht kommen, können insbesondere alle Zellen eingesetzt werden, die widerstandsfähig genug sind, um die Entnahme, die Transformation sowie die Wiedereinpflanzung aus dem bzw. in den Organismus zu überstehen. Auch sollten die Zellen möglichst langlebig sein, damit der Organismus ausreichend von den vorteilhaften Eigenschaften der transformierten Zelle, beispielsweise von einem durch die transformierte Zelle sezernierten Protein, profitieren kann. Besonders vorteilhaft als Zellen sind insbesondere Hautzellen wie Fibroblasten, Leberzellen, T-Zellen wie T- Lymphocyten, oder Knochenmarkszellen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Beispiele und Figuren näher erläutert.
Es zeigt die Figur 1 (Fig. 1) die Ergebnisse der Transfektion von HeLa S3-Zellen mit dem Plasmid pCMV-beta mit und ohne erfindungsgemäßen Enhancer. BEISPIELE
Kultivierung der Zellen
Die humane Zellinie HeLa S3 (adhärent) wurde in einer Dichte von 2x 104 Zellen/Well in je 100 μl DMEM-Medium ausplattiert. 24 Stunden nach Aussaat der Zellen wurde die Transfektion durchgeführt.
Transfektion der Zellen
Zur Transfektion wurden das Plasmid pCMV-beta (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA; ein Expressionsplasmid für ß-Galaktosidase) eingesetzt. Bei der Transfektion wurde im Wesentlichen das Protokoll des Effectene®-Transfektionsreagenzes (s. a. Effectene® Transfection Reagent Hand- book / Stand May 2002 / der QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) für adhärente Zellen befolgt, wobei als Vergleichsbeispiele:
A) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz (EFF) und dem Effectene®-Enhancer gemäß dem Effectene®-Protokoll für die Transfektion adhärenter Zellen (Standard),
B) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz und dem Effectene®-Enhancer, jedoch ohne Vorinkubation des Plasmids mit dem Enhancer und
C) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz, jedoch ohne den Effectene®-Enhancer
dienten. Als erfindungsgemäße Beispiele diente die Transfektion der Zellen mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz (EFF) gemäß dem Effectene®-Protokoll für die Transfektion adhärenter Zellen, wobei jedoch nicht der Effectene®-Enhancer, sondern Hexaaminkobaldiπ-Chlorid in verschiedenen Konzentrationen (Beispiel D mit 100 μM, Beispiel E mit 1 mM und Beispiel F mit 10 mM, bezogen auf die Konzentration bei der Bildung des Komplexes aus Plasmid-DNA und Transfektionsreagenz) eingesetzt wurde.
Etwa 48 Stunden nach Zugabe der mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz und dem Enhacer behandelten DNA wurden die Zellen mittels eines Lysepuffers (5 mM MgCl2, 1% NP-40, 100 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4) lysiert. Die Transfektionseffizienz wurde mittels eines ß-Galaktosidase-Assays mit ONPG (2- Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) als Substrat bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt.
Aus der Figur 1 ist ersichtlich, dass mit 10 mM Hexaaminkobaltiπ-Chlorid als Enhancer (Beispiel F) eine vergleichbar hohe Transfektionseffizienz erreicht wird wie mit der Effectene®-Standard-Transfektion (Vergleichbeispiel A). Eine Kontrollinfektion ohne Kobalt-Komplex und ohne Peptid-Enhancer (Effectene®- Enhancer) - wie im Vergleichsbeispiel C gezeigt - erlaubte nur eine sehr niedrige Transfektionseffizienz. Desgleichen erlaubt die Transfektion mit dem Effectene®- Transfektionsreagenz und dem Peptid-Enhancer, aber ohne Vorinkubation von Plasmid-DNA und Enhancer, nur eine sehr geringe Transfektionseffizienz (Vergleichsbeispiel B). Die Vorinkubation der DNA mit dem Peptid-Enhancer ist somit unerlässlich, während eine solche Vorinkubation bei Verwendung des Kobalt-Komplexes entfallen kann.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, umfassend die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer Nukleinsäure,
ii) Inkubation der Nukleinsäure mit einem Komplex Ki eines Übergangsmetalls und einem von diesem Komplex Ki verschiedenen
Transformationsreagenz unter Erhalt eines Komplexes Kn aus
Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex Ki des
Übergangsmetalls, sowie
iii) In Kontakt bringen des Komplexes Kn aus Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex Ki des Übergangsmetalls mit einer Zelle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Komplex Ki ein oktaedrischer Komplex ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Komplex Ki ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Komplexen [M(a)6]x, [M(c)3]x, [M(c)2(a)2]x und [M(c)(a)4]x, wobei
M ein Übergangsmetall-Kation,
a ein H2O-Mo lekül, ein NH3-Molekül, ein CO-Molekül, ein Pyridin- Molekül, ein NO-Kation, ein Chlorid- Anion, ein Bromid-Anion, ein Iodid-Anion, ein Nitrit-Anion, gebunden über das Stickstoffatom (Nitro -Ligand) oder das Sauerstoffatom (Nitrito-Ligand), ein Hydroxid-Anion, Cyanid-Anion, ein NCS-Anion, gebunden über das Stickstoffatom (Isothiocyanat) oder über das Schwefelatom (Thiocyanat), ein Sulfϊd-Anion, ein Thiosulfat-Anion oder ein Sulfat-
Anion,
c ein zweizähniger Ligand, und
x gleich der Ladung des Komplexes Ki ist, wobei der Betrag von x gleich m-n ist, wobei n die Summe der negativen Ladungen aller Liganden im oktaedrischen Komplex und m die Ladung des Übergangsmetall- Kations M ist und einen Wert von mindestens +1 aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Komplex Ki eines Übergangsmetalls ein oktaedrischer Kobaltiπ-Komplex ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Kobaltiπ-Komplex mindestens ein Ammoniak-Molekül als Liganden umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Kobaltiπ-Komplex ausgewählt ist aus den Komplexen a) [Coiπ(NH3)5H2O]3+, b) [Coπi(NH3)4(H2O)2]3+, c) [Coπi(NH3)3(H2O)3]3+, d) [Co iπ(NH 3) e) [Co iπ(NH 3) 2(H 2O)4 ]3+, f) [Co iπ(NH 3) i(H 2O)5 ]3+, g) [Coπi(NH3)5Cl]2+, h) [COΠI(NH3)4C12]+,
Figure imgf000024_0001
j) [CoIII(NH3)2Cl4]", k) [Co111CNH3)JCl5]2-,
1) [Coiπ(NH3)4Cl(H2O)]2+, m) [Coiπ(NH3)5NO2]2+, n) [Coπi(NH3)4(NO2)2]+, o) [Coiπ(NH3)3(NO2)3],
P) [Coπi(NH3)2(NO2)4]", q) [Coπi(NH3)i(NO2)5]2" und
Figure imgf000024_0002
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Kobaltiπ-Komplex ein [Co(NH3)6]3+- Komplex ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure und der Komplex Ki eines Übergangsmetalls in einem Gewichtsverhältnis Nukleinsäure : Komplex Ki von 1 : 10.000 bis 1 : 1 eingesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transformationsreagenz frei von Liposomen ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Transformationsreagenz Liposomen beinhaltet.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transformationsreagenz ein kationisches Polymer beinhaltet.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure vor dem in Kontakt bringen mit dem Transformationsreagenz nicht mit dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls aktiviert wird.
13. Kit umfassend
(ßl) einen Komplex Ki eines Übergangsmetalls, wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 definiert,
(ß2) ein von dem Komplex Ki eines Übergangsmetalls (ßl) verschiedenes
Transformationsreagenz, wie in einem der Ansprüche 9, 10 oder 11 definiert, sowie
(ß3) gegebenenfalls weitere Kit-Komponenten.
14. Verwendung des Kits nach Anspruch 13 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
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