JP2002534437A - 核膜を通した核酸の移動のための細胞輸送システムの使用 - Google Patents
核膜を通した核酸の移動のための細胞輸送システムの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、核輸送剤、核輸送剤を含む遺伝子移動システム、核輸送剤を用いて真核細胞の核中にＤＮＡを輸送する方法並びに癌、ウィルス感染、神経系の疾患、移植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺伝性疾患の治療のための遺伝子治療における核輸送剤の使用に関する。
Description
【０００１】 本発明は、核輸送剤、核輸送剤を含む遺伝子輸送システム、ＤＮＡを真核細胞
の核中に核輸送剤を用いて輸送する方法並びに、核輸送剤の、癌、ウィルス感染
、神経系の疾患、移植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺伝性疾患
の治療のための遺伝子治療における使用に関する。
の核中に核輸送剤を用いて輸送する方法並びに、核輸送剤の、癌、ウィルス感染
、神経系の疾患、移植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺伝性疾患
の治療のための遺伝子治療における使用に関する。
【０００２】 核中への活性な輸送は、遺伝物質の意図された発現の前の期間においては分裂
しないすべての細胞中への遺伝物質の輸送に必要である。核酸のための核輸送シ
ステムは、これが、ほとんどまたは全く分裂しない細胞中へのＤＮＡの効率的な
移動を促進するため、極めて重要である(Dowty et al., 1995, Wilke et al., 1
996)。ほとんどの一次細胞(primary cell)は、この群に属する。一次細胞は、２
つの理由により科学的に最も興味深い。第１に、生物から新たに単離した前述の
細胞は、細胞のタイプの機能的な状態を、これに由来する細胞系よりもはるかに
良好に反映する。第２に、これらは、遺伝子治療の標的細胞である。さらに、核
輸送システムは、移動の開始と分析との間の期間中に分裂していなかった細胞が
、移動した遺伝物質を発現することができるようにすることにより、確立された
細胞系中へのＤＮＡ移動の効率を増大させる。
しないすべての細胞中への遺伝物質の輸送に必要である。核酸のための核輸送シ
ステムは、これが、ほとんどまたは全く分裂しない細胞中へのＤＮＡの効率的な
移動を促進するため、極めて重要である(Dowty et al., 1995, Wilke et al., 1
996)。ほとんどの一次細胞(primary cell)は、この群に属する。一次細胞は、２
つの理由により科学的に最も興味深い。第１に、生物から新たに単離した前述の
細胞は、細胞のタイプの機能的な状態を、これに由来する細胞系よりもはるかに
良好に反映する。第２に、これらは、遺伝子治療の標的細胞である。さらに、核
輸送システムは、移動の開始と分析との間の期間中に分裂していなかった細胞が
、移動した遺伝物質を発現することができるようにすることにより、確立された
細胞系中へのＤＮＡ移動の効率を増大させる。
【０００３】 遺伝物質は、核中で活性である。この中の輸送は、核膜が有糸分裂の過程で一
時的に崩壊する際に、細胞分裂の間に同時に発生することができるか、またはこ
れは活発に生じなければならない。
時的に崩壊する際に、細胞分裂の間に同時に発生することができるか、またはこ
れは活発に生じなければならない。
【０００４】 １）核タンパク質は、核中に、核局在シグナルによって輸送される。 核を包む二重膜は、孔を有する。ほとんどの分子は、拡散によりこれらの孔を
通過することができない。核中に進入することができるためには、約５０ｋＤａ
よりも大きいタンパク質が、輸送機構により認識されなければならない核局在シ
グナル（nuclear localization signal;ＮＬＳ）を必要とする。代表的に、十分
なシグナルは、４〜８個のアミノ酸から成り、陽性のアミノ酸であるアルギニン
およびリシンに富んでおり、プロリンを含む。これは、発生において強力に保護
され、従って哺乳類ＮＬＳはまた、酵母において機能的である。異種のＮＬＳは
また、標的分子を核中に輸送するための手段として用いることができる。このた
めに、ＮＬＳを、比較的無秩序な位置において細胞質タンパク質の配列中に導入
することができるか、またはタンパク質、またはさらには金粒子に化学的に結合
させることができる（Gorlich, 1998において論評された）。
通過することができない。核中に進入することができるためには、約５０ｋＤａ
よりも大きいタンパク質が、輸送機構により認識されなければならない核局在シ
グナル（nuclear localization signal;ＮＬＳ）を必要とする。代表的に、十分
なシグナルは、４〜８個のアミノ酸から成り、陽性のアミノ酸であるアルギニン
およびリシンに富んでおり、プロリンを含む。これは、発生において強力に保護
され、従って哺乳類ＮＬＳはまた、酵母において機能的である。異種のＮＬＳは
また、標的分子を核中に輸送するための手段として用いることができる。このた
めに、ＮＬＳを、比較的無秩序な位置において細胞質タンパク質の配列中に導入
することができるか、またはタンパク質、またはさらには金粒子に化学的に結合
させることができる（Gorlich, 1998において論評された）。
【０００５】 ２）多くのウィルスは、細胞の核タンパク質輸送機構を、これらのＤＮＡの核中
への輸送のために用いる。 休止細胞に感染することができるＨＩＶおよび他のレンチウィルスは、ウィル
スタンパク質および細胞輸送機構を用いて、これらのＤＮＡを核中に移動させる
。Ｖｐｒ中のＮＬＳおよびＨＩＶ前統合複合体のマトリックスタンパク質(Galla
y et al., 1996)は、分裂しない細胞の感染に必須である(Naldini et al., 1996
)。ウィルスがいかにしてこれらのゲノムを核中に移動させるかについてほとん
ど知られていないが、ＮＬＳを含むウィルス構造タンパク質の補助はさらに、一
般的な原理であり得る。これはまた、以下の観察により示唆されている：ＨＳＶ
カプシドタンパク質における特定の変異は、ウィルスＤＮＡの核中への輸送を妨
げる(Batterson et al., 1983)。アデノウィルスＤＮＡは、崩壊したカプシドの
ヘキソンタンパク質と共に、核中に輸送される(Greber et al., 1993)。ＳＶ４
０ ＤＮＡの核中への輸送は、ＤＮＡと連結したままであるウィルスタンパク質
（おそらくＶｐ３）により媒介される(Nakanishi et al., 1996)。ＮＬＳを含む
２種の細菌タンパク質は、アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens)Ｔ−ＤＮＡの植物核中への輸送の原因となる(Citovsky et al
., 1994)。
への輸送のために用いる。 休止細胞に感染することができるＨＩＶおよび他のレンチウィルスは、ウィル
スタンパク質および細胞輸送機構を用いて、これらのＤＮＡを核中に移動させる
。Ｖｐｒ中のＮＬＳおよびＨＩＶ前統合複合体のマトリックスタンパク質(Galla
y et al., 1996)は、分裂しない細胞の感染に必須である(Naldini et al., 1996
)。ウィルスがいかにしてこれらのゲノムを核中に移動させるかについてほとん
ど知られていないが、ＮＬＳを含むウィルス構造タンパク質の補助はさらに、一
般的な原理であり得る。これはまた、以下の観察により示唆されている：ＨＳＶ
カプシドタンパク質における特定の変異は、ウィルスＤＮＡの核中への輸送を妨
げる(Batterson et al., 1983)。アデノウィルスＤＮＡは、崩壊したカプシドの
ヘキソンタンパク質と共に、核中に輸送される(Greber et al., 1993)。ＳＶ４
０ ＤＮＡの核中への輸送は、ＤＮＡと連結したままであるウィルスタンパク質
（おそらくＶｐ３）により媒介される(Nakanishi et al., 1996)。ＮＬＳを含む
２種の細菌タンパク質は、アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens)Ｔ−ＤＮＡの植物核中への輸送の原因となる(Citovsky et al
., 1994)。
【０００６】 いくつかのウィルスが休止細胞に感染する能力のために、例えばＨＩＶ、アデ
ノウィルスおよびヘルペスウィルスの突然変異体変種を、遺伝子治療方法の開発
のためのＤＮＡ移動ビヒクルとして用いる。第１に、これは、ウィルス成分への
免疫学的反応の危険を伴い(Friedmann, 1994, 1996)、第２に、ヘルパー細胞系
は、比較的突然変異していないウィルスゲノムの放出を排除することができない
系において用いられる。さらに、これらの系の取り扱いは、困難である。 核局在シグナルを含むペプチドまたはタンパク質によりトランスフェクション
効率を高めることが推測されるいくつかの人工的系が、記載された。
ノウィルスおよびヘルペスウィルスの突然変異体変種を、遺伝子治療方法の開発
のためのＤＮＡ移動ビヒクルとして用いる。第１に、これは、ウィルス成分への
免疫学的反応の危険を伴い(Friedmann, 1994, 1996)、第２に、ヘルパー細胞系
は、比較的突然変異していないウィルスゲノムの放出を排除することができない
系において用いられる。さらに、これらの系の取り扱いは、困難である。 核局在シグナルを含むペプチドまたはタンパク質によりトランスフェクション
効率を高めることが推測されるいくつかの人工的系が、記載された。
【０００７】 Ａ）タンパク質 Kaneda et al. (1989)およびDzauおよびKaneda（1997, 米国特許第５，６３１
，２３７号）には、センダイウィルス、リポソームおよびＤＮＡの核輸送を支持
することを意味する加えられたタンパク質に基づく遺伝子移動系が記載されてい
る。このために、この群は、ＨＭＧ−１（高移動度１群タンパク質）、ＤＮＡに
結合するクロマチンの基本的非ヒストンタンパク質を用いた。ＨＭＧ−１は、長
い基本的領域を通してＤＮＡに結合する。これは、核中に局在するが、既知のＮ
ＬＳを有しない。インビトロで、ＨＭＧ−１タンパク質は、ベクターＤＮＡとの
複合体を形成する。精製されたＨＭＧ−１の生成は、費用がかかり、大きな労働
力を要する。
，２３７号）には、センダイウィルス、リポソームおよびＤＮＡの核輸送を支持
することを意味する加えられたタンパク質に基づく遺伝子移動系が記載されてい
る。このために、この群は、ＨＭＧ−１（高移動度１群タンパク質）、ＤＮＡに
結合するクロマチンの基本的非ヒストンタンパク質を用いた。ＨＭＧ−１は、長
い基本的領域を通してＤＮＡに結合する。これは、核中に局在するが、既知のＮ
ＬＳを有しない。インビトロで、ＨＭＧ−１タンパク質は、ベクターＤＮＡとの
複合体を形成する。精製されたＨＭＧ−１の生成は、費用がかかり、大きな労働
力を要する。
【０００８】 Mistry et al. (1997)は、ＨＭＧ−１媒介核輸送に関する実験を記載している
。この正の電荷のために、ＨＭＧ−１は、ＤＮＡと複合するトランスフェクショ
ン試薬として、ここで細胞膜を通してのＤＮＡの通過のために用いられる。効率
は低い。Wako BioProducts (Richmond, VA, U.S.A)社は、核輸送を媒介するため
のリポフェクション試薬のための添加剤としてのタンパク質ＨＭＧ−１および−
２を販売した(1997)。
。この正の電荷のために、ＨＭＧ−１は、ＤＮＡと複合するトランスフェクショ
ン試薬として、ここで細胞膜を通してのＤＮＡの通過のために用いられる。効率
は低い。Wako BioProducts (Richmond, VA, U.S.A)社は、核輸送を媒介するため
のリポフェクション試薬のための添加剤としてのタンパク質ＨＭＧ−１および−
２を販売した(1997)。
【０００９】 Fritz et al. (1996)は、仔ウシ胸腺ヒストンまたはＳＶ４０ ＮＬＳおよび
ヒトヒストンＨ１から成る組換えタンパク質を用いた同様の方法を繰り返した。
これらのタンパク質は、共に、刊行物に示されたように、明らかにＤＮＡとの大
きい複合体を形成し、細胞膜の通過に適するが、核輸送には適さない。
ヒトヒストンＨ１から成る組換えタンパク質を用いた同様の方法を繰り返した。
これらのタンパク質は、共に、刊行物に示されたように、明らかにＤＮＡとの大
きい複合体を形成し、細胞膜の通過に適するが、核輸送には適さない。
【００１０】 Ｂ）これらの簡単かつ比較的安価な生産のために、ＮＬＳ配列を含む合成ペプチ
ドが、同様に用いられた。 P. Alestromのグループ(Collas et al., 1996, Collas およびAlestrom, 1996
, 1997a, b)は、ＳＶ４０から複合体ＤＮＡまでのＮＬＳペプチドを用いて、こ
れを細胞により核中に輸送した。このＤＮＡ結合は、専ら、この機能のために必
須であるＮＬＳの正に帯電したアミノ酸により発生する。この結果、ＤＮＡがペ
プチドと複合している限りは、核輸送タンパク質のための実際のシグナルの遮蔽
が発生する。蛍光標識したＤＮＡのＮＬＳ依存性輸送は、これらを受精ゼブラフ
ィッシュ卵の溶菌液中でインキュベートした際に、ウニ精子からインビトロで形
成した単離された雄前核において観察することができる。細胞あたり≧１００：
１（ＮＬＳペプチド：ベクター）および≧１，０００ベクターコピーの分子比に
おいて、ルシフェラーゼ発現の増大は、ベクターＤＮＡを細胞の細胞質中にマイ
クロ注入した際に、ゼブラフィッシュの胚において観察することができる。（１
００ペプチド／ベクターおよび１，０００の注入されたベクターにおいて、６倍
の増加が、０ペプチドと比較して得られた。）高い密度により、場合によっては
すべてのＮＬＳがＤＮＡに完全に形成するわけではなく、従って輸送機構にアク
セス可能な部分が残る；これは、効果を完全に認識することができる理由であり
得る（Sebastyen et al., 1998参照）。輸送機構は、おそらく２つのペプチド配
列から構成されるシグナルを認識することができる。(Boulikas, 1993)。
ドが、同様に用いられた。 P. Alestromのグループ(Collas et al., 1996, Collas およびAlestrom, 1996
, 1997a, b)は、ＳＶ４０から複合体ＤＮＡまでのＮＬＳペプチドを用いて、こ
れを細胞により核中に輸送した。このＤＮＡ結合は、専ら、この機能のために必
須であるＮＬＳの正に帯電したアミノ酸により発生する。この結果、ＤＮＡがペ
プチドと複合している限りは、核輸送タンパク質のための実際のシグナルの遮蔽
が発生する。蛍光標識したＤＮＡのＮＬＳ依存性輸送は、これらを受精ゼブラフ
ィッシュ卵の溶菌液中でインキュベートした際に、ウニ精子からインビトロで形
成した単離された雄前核において観察することができる。細胞あたり≧１００：
１（ＮＬＳペプチド：ベクター）および≧１，０００ベクターコピーの分子比に
おいて、ルシフェラーゼ発現の増大は、ベクターＤＮＡを細胞の細胞質中にマイ
クロ注入した際に、ゼブラフィッシュの胚において観察することができる。（１
００ペプチド／ベクターおよび１，０００の注入されたベクターにおいて、６倍
の増加が、０ペプチドと比較して得られた。）高い密度により、場合によっては
すべてのＮＬＳがＤＮＡに完全に形成するわけではなく、従って輸送機構にアク
セス可能な部分が残る；これは、効果を完全に認識することができる理由であり
得る（Sebastyen et al., 1998参照）。輸送機構は、おそらく２つのペプチド配
列から構成されるシグナルを認識することができる。(Boulikas, 1993)。
【００１１】 Sebastyen et al. (1998)は、数百ものＳＶ４０ ＮＬＳペプチドをＤＮＡ分
子に共有結合させ、ＮＬＳは、ＤＮＡらせんの全長にわたり散乱した。この大規
模な変更により、ＤＮＡは、もはや転写することができない。この記事において
討議されているように、ＤＮＡは、立体的な理由により、すべてがＤＮＡの負の
帯電での相互作用により遮蔽されるわけではない多くのＮＬＳペプチドが結合す
る際に、明らかに核中に輸送されるのみである。
子に共有結合させ、ＮＬＳは、ＤＮＡらせんの全長にわたり散乱した。この大規
模な変更により、ＤＮＡは、もはや転写することができない。この記事において
討議されているように、ＤＮＡは、立体的な理由により、すべてがＤＮＡの負の
帯電での相互作用により遮蔽されるわけではない多くのＮＬＳペプチドが結合す
る際に、明らかに核中に輸送されるのみである。
【００１２】 Gopal（米国特許第５，６７０，３４７号）は、ＤＮＡ結合基本的領域、可撓
性ヒンジ領域およびＮＬＳからなるペプチドを記載している。ＤＮＡ結合がまた
この場合においてアミノ酸正電荷により達成されるため、試薬は、細胞膜を通っ
ての輸送と同時に作用することを意味するＤＮＡと複合体を形成する。なぜＮＬ
Ｓ配列がＤＮＡの結合に関与せず、従って核輸送タンパク質のための実際のシグ
ナルが、ペプチドがこれに結合している限りはＤＮＡにより再び同様に遮蔽され
るかは、明らかでない。さらに、発生した複合体は、極めて大きくなることがで
き(Emi et al., 1997, Niidome et al., 1997, Wadhwa et al., 1997, Trubetsk
oy et al., 1998)、これは、核孔を通しての輸送を付与する(Lanford et al., 1
986, Yoneda et al., 1987, 1992)。細胞膜を通してのＤＮＡの通過（Sorgi et
al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997参照）を支持するトランスフェクショ
ン試薬としてのポリカチオンペプチドの既知の機能を超える効果は、示されてい
ない。
性ヒンジ領域およびＮＬＳからなるペプチドを記載している。ＤＮＡ結合がまた
この場合においてアミノ酸正電荷により達成されるため、試薬は、細胞膜を通っ
ての輸送と同時に作用することを意味するＤＮＡと複合体を形成する。なぜＮＬ
Ｓ配列がＤＮＡの結合に関与せず、従って核輸送タンパク質のための実際のシグ
ナルが、ペプチドがこれに結合している限りはＤＮＡにより再び同様に遮蔽され
るかは、明らかでない。さらに、発生した複合体は、極めて大きくなることがで
き(Emi et al., 1997, Niidome et al., 1997, Wadhwa et al., 1997, Trubetsk
oy et al., 1998)、これは、核孔を通しての輸送を付与する(Lanford et al., 1
986, Yoneda et al., 1987, 1992)。細胞膜を通してのＤＮＡの通過（Sorgi et
al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997参照）を支持するトランスフェクショ
ン試薬としてのポリカチオンペプチドの既知の機能を超える効果は、示されてい
ない。
【００１３】 Gerhard et al. (DE-OS 195 41 679)は、遺伝子輸送のためのＮＬＳポリリシ
ン抱合体を示唆している。陽イオン性ポリリシン、陽イオン性ＮＬＳおよびＤＮ
Ａから成る出現する複合体は、これがＤＮＡに結合している限りは核輸送シグナ
ルを遮蔽することは、この場合において真実である。
ン抱合体を示唆している。陽イオン性ポリリシン、陽イオン性ＮＬＳおよびＤＮ
Ａから成る出現する複合体は、これがＤＮＡに結合している限りは核輸送シグナ
ルを遮蔽することは、この場合において真実である。
【００１４】 Szoka（ＰＣＴ １９９３、請求項２３〜２７）は、ＮＬＳペプチドをＤＮＡ
に、挿入剤を介して結合させている。ベクターおよびペプチドをプレインキュベ
ートした後（１：３００の比率）、リポフェクションの効率は、４〜５倍に増大
する。この高度に正の電荷のために、用いられるＳＶ４０ペプチドは、ＤＮＡと
複合することができる。ＤＮＡと陽イオン性ペプチドとの複合は、細胞膜を通し
ての通過の効率を改善することにより、増大したリポフェクション効率を生じる
（Sorgi et al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997参照）。核輸送は、少なく
とも大きい複合体が発生する際に、これによりむしろ損なわれる（上記参照）。
用いられるＮＬＳペプチドが、これらの電荷によりＤＮＡに結合するため、核輸
送機構による輸送シグナルの認識が損なわれる（上記参照）。例に記載された突
然変異誘発挿入剤の使用は、適用性を制限する。Szokaは、またＤＮＡに非共有
結合的および非特異的に結合するが、前述のように、ＮＬＳペプチド自体がＤＮ
Ａに結合し、これを複合化するのを防止することができないトランスフェクショ
ンのための追加の分子を提案している。ＮＬＳペプチドとＤＮＡとの直接的な関
連の問題は、討議されていない。
に、挿入剤を介して結合させている。ベクターおよびペプチドをプレインキュベ
ートした後（１：３００の比率）、リポフェクションの効率は、４〜５倍に増大
する。この高度に正の電荷のために、用いられるＳＶ４０ペプチドは、ＤＮＡと
複合することができる。ＤＮＡと陽イオン性ペプチドとの複合は、細胞膜を通し
ての通過の効率を改善することにより、増大したリポフェクション効率を生じる
（Sorgi et al., 1997, Hawley-Nelson et al., 1997参照）。核輸送は、少なく
とも大きい複合体が発生する際に、これによりむしろ損なわれる（上記参照）。
用いられるＮＬＳペプチドが、これらの電荷によりＤＮＡに結合するため、核輸
送機構による輸送シグナルの認識が損なわれる（上記参照）。例に記載された突
然変異誘発挿入剤の使用は、適用性を制限する。Szokaは、またＤＮＡに非共有
結合的および非特異的に結合するが、前述のように、ＮＬＳペプチド自体がＤＮ
Ａに結合し、これを複合化するのを防止することができないトランスフェクショ
ンのための追加の分子を提案している。ＮＬＳペプチドとＤＮＡとの直接的な関
連の問題は、討議されていない。
【００１５】 Hawley-Nelson et al.（米国特許第５，７３６，３９２号）は、同様の系を記
載している。ＮＬＳペプチドを、直接、またはＤＮＡ結合分子との共有結合の後
に、ベクターＤＮＡと混合する。次に、生じた複合体を、リポフェクション（ま
たは他のトランスフェクション）に用いる。この系において、ＮＬＳを有しない
ポリカチオンペプチドの添加により、陽イオン性ＮＬＳの添加よりも、トランス
フェクション効率が増大する。スペルミジンのＮＬＳペプチドへの結合の結果、
トランスフェクション効率がさらに増大する。従って、またこの場合において、
増幅効果は単に、ＤＮＡを陽イオン性ペプチドを介して複合させることにより、
説明される。ＮＬＳの存在によってトランスフェクション効率がさらには増大し
ないため、核輸送機構のための認識配列が、この場合同様に遮蔽されることが推
測されるべきである。
載している。ＮＬＳペプチドを、直接、またはＤＮＡ結合分子との共有結合の後
に、ベクターＤＮＡと混合する。次に、生じた複合体を、リポフェクション（ま
たは他のトランスフェクション）に用いる。この系において、ＮＬＳを有しない
ポリカチオンペプチドの添加により、陽イオン性ＮＬＳの添加よりも、トランス
フェクション効率が増大する。スペルミジンのＮＬＳペプチドへの結合の結果、
トランスフェクション効率がさらに増大する。従って、またこの場合において、
増幅効果は単に、ＤＮＡを陽イオン性ペプチドを介して複合させることにより、
説明される。ＮＬＳの存在によってトランスフェクション効率がさらには増大し
ないため、核輸送機構のための認識配列が、この場合同様に遮蔽されることが推
測されるべきである。
【００１６】 TIB Molbiol社（リーフレット、１９９８）は、選択された遺伝子の発現を特
定的に抑制するための、Ｃ末端ＮＬＳペプチドを有するＰＮＡオリゴヌクレオチ
ドの輸送を記載している。ＮＬＳは、ＰＮＡオリゴヌクレオチドの核中への輸送
の役割を有し、従ってこれらを次にこれらの標的配列とハイブリッド形成するこ
とができる。 現在まで、ＤＮＡの核中への輸送のための既知の剤は、効率が極めて低いとい
う欠点を有する。この低い効率は、休止細胞をトランスフェクト可能にするのに
は不十分である。
定的に抑制するための、Ｃ末端ＮＬＳペプチドを有するＰＮＡオリゴヌクレオチ
ドの輸送を記載している。ＮＬＳは、ＰＮＡオリゴヌクレオチドの核中への輸送
の役割を有し、従ってこれらを次にこれらの標的配列とハイブリッド形成するこ
とができる。 現在まで、ＤＮＡの核中への輸送のための既知の剤は、効率が極めて低いとい
う欠点を有する。この低い効率は、休止細胞をトランスフェクト可能にするのに
は不十分である。
【００１７】 従って、本発明の下にある課題は、ＤＮＡの核中への効率的な輸送を促進し、
従ってまた休止細胞または極めてゆっくりと分割している細胞だけが有用な程度
にトランスフェクト可能になるようにする核輸送剤を提供することである。
従ってまた休止細胞または極めてゆっくりと分割している細胞だけが有用な程度
にトランスフェクト可能になるようにする核輸送剤を提供することである。
【００１８】 この課題は、２つのモジュールＡおよびＢから成り、モジュールＡがＤＮＡに
特異的に結合し、非特異的結合による２つ以上のＤＮＡ分子を含む複合体の形成
を生じず、モジュールＢがＤＮＡに非特異的に結合しない核局在シグナルまたは
非ＮＬＳシグナルを含む核輸送剤により、解決される。本発明の好ましい核輸送
剤は、配列をＤＮＡと特異的に結合させ、および／またはＤＮＡ末端に特異的に
結合するモジュールＡを含む。特に好ましいのは、モジュールＡが合成ペプチド
、タンパク質またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である核輸送剤である。
特異的に結合し、非特異的結合による２つ以上のＤＮＡ分子を含む複合体の形成
を生じず、モジュールＢがＤＮＡに非特異的に結合しない核局在シグナルまたは
非ＮＬＳシグナルを含む核輸送剤により、解決される。本発明の好ましい核輸送
剤は、配列をＤＮＡと特異的に結合させ、および／またはＤＮＡ末端に特異的に
結合するモジュールＡを含む。特に好ましいのは、モジュールＡが合成ペプチド
、タンパク質またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である核輸送剤である。
【００１９】 本発明の核輸送剤の他の態様において、モジュールＢは、この電荷によってＤ
ＮＡと複合体を形成しない伸長核局在シグナル(extended nuclear localization
signal)を含む。モジュールＢが、ほぼ中性の正味電荷を有する伸長核局在シグ
ナルを含む核輸送剤が好ましい。モジュールＢが、核局在シグナルおよび側方の
負に帯電したアミノ酸を含む伸長核局在シグナルを含む核輸送剤が、特に好まし
い。ＮＬＳ配列は、天然に存在するＮＬＳ配列と同一である必要はなく、またこ
れがＮＬＳとして機能的である限りは、理論的考慮に基づくアミノ酸配列である
ことができる。さらに、モジュールＢは、核局在シグナルまたは伸長核局在シグ
ナルに直接属さないペプチド配列または非ペプチド成分を含むことができる。好
ましいのは、核局在シグナルとモジュールＡとの間の距離を増大する成分である
。
ＮＡと複合体を形成しない伸長核局在シグナル(extended nuclear localization
signal)を含む。モジュールＢが、ほぼ中性の正味電荷を有する伸長核局在シグ
ナルを含む核輸送剤が好ましい。モジュールＢが、核局在シグナルおよび側方の
負に帯電したアミノ酸を含む伸長核局在シグナルを含む核輸送剤が、特に好まし
い。ＮＬＳ配列は、天然に存在するＮＬＳ配列と同一である必要はなく、またこ
れがＮＬＳとして機能的である限りは、理論的考慮に基づくアミノ酸配列である
ことができる。さらに、モジュールＢは、核局在シグナルまたは伸長核局在シグ
ナルに直接属さないペプチド配列または非ペプチド成分を含むことができる。好
ましいのは、核局在シグナルとモジュールＡとの間の距離を増大する成分である
。
【００２０】 さらに、本発明は、本発明の核輸送剤および陽イオン性脂質、ペプチド、ポリ
アミンまたは陽イオン性重合体を含む、遺伝子輸送システムに関する。 さらに、本発明は、ＤＮＡを真核細胞、好ましくは一次細胞の核中に輸送する
方法において、細胞が、輸送されるべきＤＮＡおよび本発明の核輸送剤で当業者
に知られている方法によりトランスフェクトされる、前記方法に関する。 他の態様は、本発明の核輸送剤の、特に癌、ウィルス感染、神経系の疾患、移
植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺伝性疾患の治療のための遺伝
子治療における使用に関する。
アミンまたは陽イオン性重合体を含む、遺伝子輸送システムに関する。 さらに、本発明は、ＤＮＡを真核細胞、好ましくは一次細胞の核中に輸送する
方法において、細胞が、輸送されるべきＤＮＡおよび本発明の核輸送剤で当業者
に知られている方法によりトランスフェクトされる、前記方法に関する。 他の態様は、本発明の核輸送剤の、特に癌、ウィルス感染、神経系の疾患、移
植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺伝性疾患の治療のための遺伝
子治療における使用に関する。
【００２１】 本発明において用いる「核局在シグナルのＤＮＡへの非特異的結合」という表
現は、核局在シグナルが核輸送機構に対して完全に認識可能であることを防止す
る関連を示す。 本発明において用いる「モジュールＡのＤＮＡへの特異的結合」という表現は
、第１に、ＤＮＡヌクレオチドの配列が相互作用について決定的である配列特異
的結合および第２にＤＮＡ一重または二重らせん末端により媒介されたＤＮＡと
の共有結合を示す。
現は、核局在シグナルが核輸送機構に対して完全に認識可能であることを防止す
る関連を示す。 本発明において用いる「モジュールＡのＤＮＡへの特異的結合」という表現は
、第１に、ＤＮＡヌクレオチドの配列が相互作用について決定的である配列特異
的結合および第２にＤＮＡ一重または二重らせん末端により媒介されたＤＮＡと
の共有結合を示す。
【００２２】 本発明において用いる「伸長核局在シグナル」という表現は、核局在シグナル
が追加の側方のアミノ酸を有することを示す。好ましいのは、２〜４０個、好ま
しくは４〜２０個の追加の側方のアミノ酸を有する伸長核局在シグナルである。 本発明において用いる「この電荷によってＤＮＡと複合体を形成しない伸長核
局在シグナル」という表現は、モジュールＢが、これがＤＮＡと非特異的に反応
せず、従って核輸送機構について完全にアクセス可能なままであるように電荷が
分布する核局在シグナルを含むことを示す。
が追加の側方のアミノ酸を有することを示す。好ましいのは、２〜４０個、好ま
しくは４〜２０個の追加の側方のアミノ酸を有する伸長核局在シグナルである。 本発明において用いる「この電荷によってＤＮＡと複合体を形成しない伸長核
局在シグナル」という表現は、モジュールＢが、これがＤＮＡと非特異的に反応
せず、従って核輸送機構について完全にアクセス可能なままであるように電荷が
分布する核局在シグナルを含むことを示す。
【００２３】 本発明において用いる「ほぼ中性の正味電荷」という表現は、核局在シグナル
の伸長された部分が、負に帯電したアミノ酸を有して、実際の核局在シグナルの
正電荷を埋め合わせ、従って３つ以下の正の余剰の電荷が伸長核局在シグナルの
全体の領域において発生することを示す。
の伸長された部分が、負に帯電したアミノ酸を有して、実際の核局在シグナルの
正電荷を埋め合わせ、従って３つ以下の正の余剰の電荷が伸長核局在シグナルの
全体の領域において発生することを示す。
【００２４】 本発明の核輸送剤は、これがＤＮＡとの複合に至らないという利点を有する。
核局在シグナルが、核輸送機構に自由にアクセス可能なままであることは、他の
利点である。本発明の核輸送剤を用いる際の核輸送機構への核局在シグナルの核
輸送およびアクセス可能性を損なう大きいＤＮＡ複合体を回避すると、ＤＮＡの
核中への明らかに一層効率的な輸送に至る。 本発明において、ＤＮＡ結合部分（モジュールＡ）も核局在シグナル（モジュ
ールＢ）も、大きいＤＮＡ複合体の形成に至らない。
核局在シグナルが、核輸送機構に自由にアクセス可能なままであることは、他の
利点である。本発明の核輸送剤を用いる際の核輸送機構への核局在シグナルの核
輸送およびアクセス可能性を損なう大きいＤＮＡ複合体を回避すると、ＤＮＡの
核中への明らかに一層効率的な輸送に至る。 本発明において、ＤＮＡ結合部分（モジュールＡ）も核局在シグナル（モジュ
ールＢ）も、大きいＤＮＡ複合体の形成に至らない。
【００２５】モジュールＡ モジュールＡは、ＤＮＡに特異的に結合し、２つ以上のＤＮＡ分子との複合体
の形成に至らない。モジュールＡは、配列に特異的に結合するか（即ち、正の電
荷のためのみに非特異的ではなく）またはＤＮＡ末端に共有結合する。
の形成に至らない。モジュールＡは、配列に特異的に結合するか（即ち、正の電
荷のためのみに非特異的ではなく）またはＤＮＡ末端に共有結合する。
【００２６】 モジュールＡは、種々の長さのペプチドまたはタンパク質またはＰＮＡ配列(N
ielson et al., 1991)または配列特異的様式で核酸に結合する他の物質であるこ
とができる。さらに、モジュールＡは、ＤＮＡに特異的に結合する組換えタンパ
ク質、例えばｌａｃレプレッサーまたはこの高アフィニティー突然変異体である
(Kolkhof, 1992, Fieck et al., 1992)か、またはＤＮＡ末端に特異的に配列に
結合するレトロウィルスインテグラーゼ（ＬＴＲ核配列を有する）(Ellisonおよ
びBrown, 1994)であることができる。
ielson et al., 1991)または配列特異的様式で核酸に結合する他の物質であるこ
とができる。さらに、モジュールＡは、ＤＮＡに特異的に結合する組換えタンパ
ク質、例えばｌａｃレプレッサーまたはこの高アフィニティー突然変異体である
(Kolkhof, 1992, Fieck et al., 1992)か、またはＤＮＡ末端に特異的に配列に
結合するレトロウィルスインテグラーゼ（ＬＴＲ核配列を有する）(Ellisonおよ
びBrown, 1994)であることができる。
【００２７】 直線状ＤＮＡらせんの末端が、「自殺基質(suicid substrate)」である配列を
有し、トポイソメラーゼによる開列を可能にするが、所属がない場合には、ＤＮ
Ａらせんの末端への共有結合は、生物学的に、例えばポックスウィルスのトポイ
ソメラーゼＩにより媒介することができる(Shuman, 1994)。
有し、トポイソメラーゼによる開列を可能にするが、所属がない場合には、ＤＮ
Ａらせんの末端への共有結合は、生物学的に、例えばポックスウィルスのトポイ
ソメラーゼＩにより媒介することができる(Shuman, 1994)。
【００２８】モジュールＢ モジュールＢは、ＤＮＡに非特異的に結合しない核局在シグナルまたは非ＮＬ
Ｓシグナルである。 本発明の非ＮＬＳシグナルの用語は、核局在シグナルではないシグナルを示す
が、トランスフェクションについては、遺伝子治療またはＤＮＡワクチン化は、
ＤＮＡの細胞中への輸送または細胞内のＤＮＡの輸送の役割を有する。
Ｓシグナルである。 本発明の非ＮＬＳシグナルの用語は、核局在シグナルではないシグナルを示す
が、トランスフェクションについては、遺伝子治療またはＤＮＡワクチン化は、
ＤＮＡの細胞中への輸送または細胞内のＤＮＡの輸送の役割を有する。
【００２９】 以下は、非ＮＬＳシグナルに属する：ＤＮＡ取り込み、例えば受容体媒介ＤＮ
Ａ取り込みを媒介することができる細胞表面構造のためのリガンド；例えばエン
ドソームからのＤＮＡの早発の出口を促進するための、膜を不安定化するペプチ
ド；細胞結合において媒介して構造を核への好ましい細胞内輸送に輸送するシグ
ナル。
Ａ取り込みを媒介することができる細胞表面構造のためのリガンド；例えばエン
ドソームからのＤＮＡの早発の出口を促進するための、膜を不安定化するペプチ
ド；細胞結合において媒介して構造を核への好ましい細胞内輸送に輸送するシグ
ナル。
【００３０】 核局在シグナルは、好ましくは、この電荷またはＤＮＡ結合モジュールＡへの
空間的配向のためにＤＮＡと複合体を形成しない伸長核局在シグナル（前に定義
したように）である。核局在シグナルは、合成的に生成することができるか、ま
たはタンパク質の一部であることができる。
空間的配向のためにＤＮＡと複合体を形成しない伸長核局在シグナル（前に定義
したように）である。核局在シグナルは、合成的に生成することができるか、ま
たはタンパク質の一部であることができる。
【００３１】 本発明の核輸送剤において用いる核局在シグナルにおいて、これらの正電荷に
よりＤＮＡに結合しないシグナル配列−側方配列を有する、および有しない−を
用いて、ほとんどの核局在シグナルの必須の部分であるこれらの電荷が、核輸送
機構のためのシグナルとして遮蔽されるようにする。
よりＤＮＡに結合しないシグナル配列−側方配列を有する、および有しない−を
用いて、ほとんどの核局在シグナルの必須の部分であるこれらの電荷が、核輸送
機構のためのシグナルとして遮蔽されるようにする。
【００３２】 核局在シグナルまたは非ＮＬＳシグナルに加えて、モジュールＢは、核局在シ
グナルまたは伸長核局在シグナルの一部ではないペプチド配列および非ペプチド
成分を含み得る。好ましくは、これらは、核局在シグナルの一層良好な立体的配
置、特にＤＮＡ分子への増大した距離を可能にする。
グナルまたは伸長核局在シグナルの一部ではないペプチド配列および非ペプチド
成分を含み得る。好ましくは、これらは、核局在シグナルの一層良好な立体的配
置、特にＤＮＡ分子への増大した距離を可能にする。
【００３３】 クラシックＮＬＳの伸長配列は、ペプチドの正味の電荷を、側方の負に帯電し
たアミノ酸によりほとんど埋め合わせることができる場合には、良好に適合され
る。これらのアミノ酸は、タンパク質中のこれらの位置において天然に存在する
ことができるか、または構造の考慮に基づいて導入されていることができる。本
来的な意味で、負のアミノ酸は、多くのＮＬＳ核配列に隣接して位置する(Xiao
et al., 1997)。最も完全に調査されたＮＬＳであるＳＶ４０からのＮＬＳにつ
いて、これらの側方の配列は、核輸送の効率を明らかに増大させることを示すこ
とができる(RihsおよびPeters, 1989, Rihs et al., 1991, Chen et al., 1991,
Jans et al., 1991, Xiao et al., 1997)。大きいタンパク質（ＩｇＭ）は、こ
れを、隣接する配列により伸長されたＳＶ４０ ＮＬＳに化学的に結合させた後
であるが、これをＳＶ４０核ＮＬＳペプチドに結合させた後ではないときに、核
中に輸送された(Yoneda et al., 1992)。
たアミノ酸によりほとんど埋め合わせることができる場合には、良好に適合され
る。これらのアミノ酸は、タンパク質中のこれらの位置において天然に存在する
ことができるか、または構造の考慮に基づいて導入されていることができる。本
来的な意味で、負のアミノ酸は、多くのＮＬＳ核配列に隣接して位置する(Xiao
et al., 1997)。最も完全に調査されたＮＬＳであるＳＶ４０からのＮＬＳにつ
いて、これらの側方の配列は、核輸送の効率を明らかに増大させることを示すこ
とができる(RihsおよびPeters, 1989, Rihs et al., 1991, Chen et al., 1991,
Jans et al., 1991, Xiao et al., 1997)。大きいタンパク質（ＩｇＭ）は、こ
れを、隣接する配列により伸長されたＳＶ４０ ＮＬＳに化学的に結合させた後
であるが、これをＳＶ４０核ＮＬＳペプチドに結合させた後ではないときに、核
中に輸送された(Yoneda et al., 1992)。
【００３４】 ＮＬＳが、ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の一部である場合には、ＤＮ
Ａにより遮蔽されるこれらの配列（単数または複数）に伴う危険は、比較的低い
。しかし、一層高い効率のために、伸長されたＮＬＳ配列はまた、この場合にお
いて用いることができる。 非クラシックＮＬＳ、例えば大過剰の正の電荷を有しないかまたは輸送の従来
の経路を介して核に達しないインフルエンザウィルス核タンパク質(Wang et al.
, 1997, Neumann et al., 1997)からのＮＬＳもまた、用いることができる。
Ａにより遮蔽されるこれらの配列（単数または複数）に伴う危険は、比較的低い
。しかし、一層高い効率のために、伸長されたＮＬＳ配列はまた、この場合にお
いて用いることができる。 非クラシックＮＬＳ、例えば大過剰の正の電荷を有しないかまたは輸送の従来
の経路を介して核に達しないインフルエンザウィルス核タンパク質(Wang et al.
, 1997, Neumann et al., 1997)からのＮＬＳもまた、用いることができる。
【００３５】 ここで意図されるＮＬＳの（不完全な）概観は、T. Boulikas (1993, 1996, 1
997)により示されている。 最後に、核輸送機構自体の成分、例えばインポーチン(importin)αのインポー
チンβ結合ドメイン（ＩＢＢ）から採取した核輸送シグナルを、用いることがで
きる。このドメインを介して、ＮＬＳ結合タンパク質であるインポーチンαを、
核輸送機構の残りに結合させる(Gorlich et al., 1996, Weiss et al., 1996)。
997)により示されている。 最後に、核輸送機構自体の成分、例えばインポーチン(importin)αのインポー
チンβ結合ドメイン（ＩＢＢ）から採取した核輸送シグナルを、用いることがで
きる。このドメインを介して、ＮＬＳ結合タンパク質であるインポーチンαを、
核輸送機構の残りに結合させる(Gorlich et al., 1996, Weiss et al., 1996)。
【００３６】 他の好ましい態様において、ＰＮＡを介しての非ＮＬＳシグナル（モジュール
Ａとして）を、在来のベクター配列に結合させる。ＰＮＡとベクターとの間の結
合は、配列特異的である。これにより、このような非ＮＬＳシグナルの、これら
を修正する必要なしに、ほとんどすべての従来の発現ベクターへの結合が可能に
なる。 ＰＮＡのＤＮＡへの配列特異的結合について、ベクターのこれらのＤＮＡ配列
のみを用い、ＰＮＡによる遮蔽は、ＤＮＡの意図された目的をほとんど損なわな
い。
Ａとして）を、在来のベクター配列に結合させる。ＰＮＡとベクターとの間の結
合は、配列特異的である。これにより、このような非ＮＬＳシグナルの、これら
を修正する必要なしに、ほとんどすべての従来の発現ベクターへの結合が可能に
なる。 ＰＮＡのＤＮＡへの配列特異的結合について、ベクターのこれらのＤＮＡ配列
のみを用い、ＰＮＡによる遮蔽は、ＤＮＡの意図された目的をほとんど損なわな
い。
【００３７】 発現ベクターの場合において、特にほとんどの従来の発現ベクター（例えばア
ンピシリン耐性遺伝子のプロモーター）中に存在するプラスミド主鎖における配
列を用いる。しかし、発現領域の非コードらせん中の結合もまた可能である。配
列特異性結合の利点は、ＰＮＡ−ペプチドハイブリッドのＤＮＡへの簡単かつ迅
速な結合である。例２は、例えば、ＰＮＡ−ペプチドハイブリッドの二重らせん
ＤＮＡへの簡単かつ迅速な結合反応（５分、６５℃）を例示する。ＰＮＡ部分と
実際のシグナルとの間に、スペーサーが存在し得る。スペーサーは、シグナルの
ＤＮＡへの距離を増大させる、例えば立体障害を減少させる作用を有し得る。ス
ペーサーはまた、所定の破壊点を導入する、例えばＤＮＡがエンドサイトーシス
された(endocytosed)細胞表面受容体に結合するエンドソーム環境においてリガ
ンドの分離を可能にする作用を有し得る。
ンピシリン耐性遺伝子のプロモーター）中に存在するプラスミド主鎖における配
列を用いる。しかし、発現領域の非コードらせん中の結合もまた可能である。配
列特異性結合の利点は、ＰＮＡ−ペプチドハイブリッドのＤＮＡへの簡単かつ迅
速な結合である。例２は、例えば、ＰＮＡ−ペプチドハイブリッドの二重らせん
ＤＮＡへの簡単かつ迅速な結合反応（５分、６５℃）を例示する。ＰＮＡ部分と
実際のシグナルとの間に、スペーサーが存在し得る。スペーサーは、シグナルの
ＤＮＡへの距離を増大させる、例えば立体障害を減少させる作用を有し得る。ス
ペーサーはまた、所定の破壊点を導入する、例えばＤＮＡがエンドサイトーシス
された(endocytosed)細胞表面受容体に結合するエンドソーム環境においてリガ
ンドの分離を可能にする作用を有し得る。
【００３８】 初めて、本発明は、休止細胞または緩徐に分割する細胞を、その後の分析を可
能にする百分率にトランスフェクト可能にする。動物またはヒトの体から新たに
単離したほとんどの細胞（一次細胞）は、全く分裂しないかまたは、ＤＮＡが、
これが、核に達して発現することができる前に、細胞膜を通して好首尾に輸送さ
れた後に不活性化される程度に、低く分裂する。現在、これにより、一次細胞が
、これらが人工的に刺激されて培養中で増殖しない場合には、トランスフェクト
不能になる。この不可避的な結果は、これらの細胞が、次にこれらの最初の状態
から逸脱することである。一次細胞のトランスフェクションの方法により、体細
胞の最初の状態下での遺伝物質の分析が可能になる。これは、遺伝子機構の調査
および体細胞の内側のプロセスの研究のために、最高に重要である。
能にする百分率にトランスフェクト可能にする。動物またはヒトの体から新たに
単離したほとんどの細胞（一次細胞）は、全く分裂しないかまたは、ＤＮＡが、
これが、核に達して発現することができる前に、細胞膜を通して好首尾に輸送さ
れた後に不活性化される程度に、低く分裂する。現在、これにより、一次細胞が
、これらが人工的に刺激されて培養中で増殖しない場合には、トランスフェクト
不能になる。この不可避的な結果は、これらの細胞が、次にこれらの最初の状態
から逸脱することである。一次細胞のトランスフェクションの方法により、体細
胞の最初の状態下での遺伝物質の分析が可能になる。これは、遺伝子機構の調査
および体細胞の内側のプロセスの研究のために、最高に重要である。
【００３９】 一次細胞をトランスフェクト可能にする本発明の教示はまた、遺伝子治療のた
めの完全に人工的な遺伝子移動系に対する必須の段階である。このような遺伝子
移動系は、３つの機能的な成分を有しなければならない：１つの成分は、陽イオ
ン性脂質および他の陽イオン性重合体が比較的適切であることが明らかになった
、細胞膜を通してのＤＮＡの通過のための成分である。これは、ＤＮＡを（通常
非分裂）標的細胞の核中に移動させるための他の成分および、ＤＮＡのゲノム中
への統合を媒介する第３の成分を有しなければならない。本発明において初めて
、第２の成分として作用することができる有効な剤を記載する。遺伝子治療にお
いて用いることができる完全な人工的な遺伝子移動ビヒクルは、一層容易かつ一
層安価に製造され、現在用いられているウィルス系よりも容易に取り扱われるこ
とが予測され、これは、これらの系の内在的な危険に曝されない。遺伝子治療方
法は、例えば、癌、ＡＩＤＳおよび種々の遺伝性疾患の治療のために提案され、
薬において重要な役割を有する。
めの完全に人工的な遺伝子移動系に対する必須の段階である。このような遺伝子
移動系は、３つの機能的な成分を有しなければならない：１つの成分は、陽イオ
ン性脂質および他の陽イオン性重合体が比較的適切であることが明らかになった
、細胞膜を通してのＤＮＡの通過のための成分である。これは、ＤＮＡを（通常
非分裂）標的細胞の核中に移動させるための他の成分および、ＤＮＡのゲノム中
への統合を媒介する第３の成分を有しなければならない。本発明において初めて
、第２の成分として作用することができる有効な剤を記載する。遺伝子治療にお
いて用いることができる完全な人工的な遺伝子移動ビヒクルは、一層容易かつ一
層安価に製造され、現在用いられているウィルス系よりも容易に取り扱われるこ
とが予測され、これは、これらの系の内在的な危険に曝されない。遺伝子治療方
法は、例えば、癌、ＡＩＤＳおよび種々の遺伝性疾患の治療のために提案され、
薬において重要な役割を有する。
【００４０】 本発明に従って記載する核輸送剤はまた、現在まで、細胞を、細胞膜を通って
のＤＮＡの通過と分析との間の期間に分裂しないＤＮＡの取り込みにアクセス可
能にすることによりすでにトランスフェクト可能であった培養した細胞において
、トランスフェクション効率を増大させる。これは、多くの確立された細胞系に
ついて、トランスフェクション効率の増大により、分析が促進され、必要とされ
る細胞物質の減少した量により一層低い費用が補助されるため、重要である。当
然、このことはまた、一次細胞と確立された細胞系との間のすべての段階につい
て真実である。
のＤＮＡの通過と分析との間の期間に分裂しないＤＮＡの取り込みにアクセス可
能にすることによりすでにトランスフェクト可能であった培養した細胞において
、トランスフェクション効率を増大させる。これは、多くの確立された細胞系に
ついて、トランスフェクション効率の増大により、分析が促進され、必要とされ
る細胞物質の減少した量により一層低い費用が補助されるため、重要である。当
然、このことはまた、一次細胞と確立された細胞系との間のすべての段階につい
て真実である。
【００４１】 以下の例は、本発明を例示し、この範囲を限定することを意図しない。例１ ：ＰＮＡ−ペプチドハイブリッド ＮＬＳ ＰＮＡ核輸送剤を用いた。ＤＮＡ二重らせんに侵入することができる
ＰＮＡ配列を用いた（Nielson et al., 1991, Nielson, 米国特許第５，５３９
，０８２号）。 ほとんどすべての発現ベクターのプラスミド主鎖において、ＰＮＡとの高親和
性会合のために良好に適合された２つの配列を、アンピシリン耐性遺伝子および
複製の起源中に配置した。
ＰＮＡ配列を用いた（Nielson et al., 1991, Nielson, 米国特許第５，５３９
，０８２号）。 ほとんどすべての発現ベクターのプラスミド主鎖において、ＰＮＡとの高親和
性会合のために良好に適合された２つの配列を、アンピシリン耐性遺伝子および
複製の起源中に配置した。
【００４２】 ペプチド成分として、用いたペプチドは：
【数１】 （ペプチド１；配列番号１）、または
【数２】 （ペプチド２；配列番号２） のいずれかを含む。
【００４３】 以下のＰＮＡ配列は、各ペプチドのＮ末端に位置する。
【数３】 （配列番号３）、または
【数４】 （配列番号４）、または Ｃ）平均発現ベクター中に約３０個の結合部位を有するペプチド−ＰＮＡハイ ブリッド配列
【数５】 （配列番号５）（５ｋｂ）（Ｇ＝アミノ酸グリシン）。
【００４４】 水に可溶化されたベクターＤＮＡ５μｇを、１０μｌの２５μＭ ＮＬＳ−Ｐ
ＮＡ中で１０分間６０℃でインキュベートした。次に反応混合物を、ＲＰＭＩで
２５０μｌに調整した。 ６０〜８０％コンフルエントである５×１０６個のチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡで分離し、１５ｍｌのＰＢＳ（５０×ｇで
１０分間遠心分離した）で洗浄した。ペレットを、２５０μｌのＲＰＭＩで再懸
濁させ、予めインキュベートしたＤＮＡと混合し、エレクトロポレーションキュ
ベット（ギャップ幅０．４ｃｍ）に移送し、室温で１０分間インキュベートした
。エレクトロポレーション（２１０Ｖ、９７５μＦ、バイオラッドジーンパルサ
ー(BioRad Gene Pulser)）の後、キュベットを、３７℃でさらに１０分間インキ
ュベートし、その後細胞を、予め加温した培地中に播種した。
ＮＡ中で１０分間６０℃でインキュベートした。次に反応混合物を、ＲＰＭＩで
２５０μｌに調整した。 ６０〜８０％コンフルエントである５×１０６個のチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡで分離し、１５ｍｌのＰＢＳ（５０×ｇで
１０分間遠心分離した）で洗浄した。ペレットを、２５０μｌのＲＰＭＩで再懸
濁させ、予めインキュベートしたＤＮＡと混合し、エレクトロポレーションキュ
ベット（ギャップ幅０．４ｃｍ）に移送し、室温で１０分間インキュベートした
。エレクトロポレーション（２１０Ｖ、９７５μＦ、バイオラッドジーンパルサ
ー(BioRad Gene Pulser)）の後、キュベットを、３７℃でさらに１０分間インキ
ュベートし、その後細胞を、予め加温した培地中に播種した。
【００４５】 実験の開始と分析との間に分裂しなかった細胞をトランスフェクトしたことを
明白に示すために、細胞を、記載された方法によりｐＭＡＣＳ４．１（ヒトＣＤ
４のための発現ベクター）でトランスフェクトし、細胞分裂を、以下のようにし
て評価した：トランスフェクションの前に、細胞を、１μＭのカルボキシフルオ
レセイン二酢酸スクシンイミドエステル（ＣＦＤＡ，ＳＥ）(Molecular Probes,
Eugene, U.S.A.)中でインキュベートすることにより緑色蛍光で標識した。細胞
の明るさは、細胞分裂により５０％まで減少した。フローサイトメーター(FACSC
alibur)を用いて、分裂しなかった細胞（１００％緑色蛍光）が、トランスフェ
クトされた遺伝子（Ｃｙ５に結合した抗ＣＤ４抗体で染色した後の暗赤色蛍光）
を発現したことを、単細胞レベルで決定した。
明白に示すために、細胞を、記載された方法によりｐＭＡＣＳ４．１（ヒトＣＤ
４のための発現ベクター）でトランスフェクトし、細胞分裂を、以下のようにし
て評価した：トランスフェクションの前に、細胞を、１μＭのカルボキシフルオ
レセイン二酢酸スクシンイミドエステル（ＣＦＤＡ，ＳＥ）(Molecular Probes,
Eugene, U.S.A.)中でインキュベートすることにより緑色蛍光で標識した。細胞
の明るさは、細胞分裂により５０％まで減少した。フローサイトメーター(FACSC
alibur)を用いて、分裂しなかった細胞（１００％緑色蛍光）が、トランスフェ
クトされた遺伝子（Ｃｙ５に結合した抗ＣＤ４抗体で染色した後の暗赤色蛍光）
を発現したことを、単細胞レベルで決定した。
【００４６】例２：ＰＮＡ−ＮＬＳの在来のベクター配列への迅速な結合 ＰＮＡ−ペプチドハイブリッドを、二重らせんＤＮＡに結合させた。 在来のベクター配列を、ＰＮＡを介してほとんど定量的に（＞９０％）ＮＬＳ
−ペプチドで５分以内に標識することができる。ＰＮＡを介しての熱不安定成分
の結合を達成するために、３７℃での１時間のインキュベーションが、ＤＮＡの
ほとんどを標識するために十分である（表１）。
−ペプチドで５分以内に標識することができる。ＰＮＡを介しての熱不安定成分
の結合を達成するために、３７℃での１時間のインキュベーションが、ＤＮＡの
ほとんどを標識するために十分である（表１）。
【００４７】 １００ｎｇの発現ベクターを、２５μＭの異なるＰＮＡ−ペプチドハイブリッ
ドを有するＴＥ（ｐＨ７．８）中で、６５℃または３７℃のいずれかで５分〜３
時間インキュベートした。ここで用いたＰＮＡ配列
ドを有するＴＥ（ｐＨ７．８）中で、６５℃または３７℃のいずれかで５分〜３
時間インキュベートした。ここで用いたＰＮＡ配列
【数６】 （配列番号６）は、アンピシリン耐性遺伝子のプロモーターに結合する。
【００４８】 Ｃ末端において、２１個のアミノ酸のペプチド（ペプチド１）または２７個の
アミノ酸のペプチド（ペプチド２）または２７個のアミノ酸が続く１０個のＡＥ
ＥＡユニットのスペーサー(Fmoc-AEEA-OH Spacer, PerSeptive Biosystems, Inc
., Framingham, USA)（ペプチド３）のいずれかを位置させた。その後、結合ア
ッセイを、制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩと共にインキュベートした。制限Ｄ
ＮＡを、ＹＯＹＯ(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)で染色し、アガ
ロースゲル上で分離し、蛍光スキャナー（Image Plate Reader FLA 2000, 分析
ソフトウェアＬ−プロセス、バージョン１．６、富士写真フィルム社、東京）で
定量した。制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩによるＤＮＡの開裂を、ＰＮＡ結合
部位において阻害した。追加のＥａｒＩ制限部位は、反応の内部制御として作用
する。
アミノ酸のペプチド（ペプチド２）または２７個のアミノ酸が続く１０個のＡＥ
ＥＡユニットのスペーサー(Fmoc-AEEA-OH Spacer, PerSeptive Biosystems, Inc
., Framingham, USA)（ペプチド３）のいずれかを位置させた。その後、結合ア
ッセイを、制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩと共にインキュベートした。制限Ｄ
ＮＡを、ＹＯＹＯ(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)で染色し、アガ
ロースゲル上で分離し、蛍光スキャナー（Image Plate Reader FLA 2000, 分析
ソフトウェアＬ−プロセス、バージョン１．６、富士写真フィルム社、東京）で
定量した。制限エンドヌクレアーゼＥａｒＩによるＤＮＡの開裂を、ＰＮＡ結合
部位において阻害した。追加のＥａｒＩ制限部位は、反応の内部制御として作用
する。
【００４９】
【表１】 表１：投入ＤＮＡの百分率として示すペプチド標識ＤＮＡの部分
【００５０】 ＰＮＡのＤＮＡへの結合反応は、簡単、強固および迅速である。結合は、ほと
んど不可逆的であり、従って細胞輸送プロセスに適する。タンパク質と比較して
、ペプチドおよびＰＮＡは、比較的安価に合成することができ、比較的容易に、
および比較的長時間貯蔵することができる。
んど不可逆的であり、従って細胞輸送プロセスに適する。タンパク質と比較して
、ペプチドおよびＰＮＡは、比較的安価に合成することができ、比較的容易に、
および比較的長時間貯蔵することができる。
【００５１】例３：ＰＮＡ−ＮＬＳを用いたトランスフェクション 細胞系を分割するにあたり、トランスフェクトしたＤＮＡの活性核輸送は、輸
送していないＤＮＡと比較して、一層迅速な発現を誘発した。トランスフェクト
したＤＮＡが、細胞質中で十分長時間生存する場合には、核輸送剤を有するかま
たは有しない迅速に分裂する細胞中のトランスフェクトしたＤＮＡの発現速度は
、少しずつ近似しなければならない。この理由は、細胞質中に残留するトランス
フェクトしたＤＮＡが、細胞分裂中に核に到達することができるという事実であ
る。アフィジコリンを用いて、細胞の分裂活性およびトランスフェクション能力
を、強力に低下させることができる。活性核輸送は、低下したトランスフェクシ
ョン効率のこの効果を消失させる。
送していないＤＮＡと比較して、一層迅速な発現を誘発した。トランスフェクト
したＤＮＡが、細胞質中で十分長時間生存する場合には、核輸送剤を有するかま
たは有しない迅速に分裂する細胞中のトランスフェクトしたＤＮＡの発現速度は
、少しずつ近似しなければならない。この理由は、細胞質中に残留するトランス
フェクトしたＤＮＡが、細胞分裂中に核に到達することができるという事実であ
る。アフィジコリンを用いて、細胞の分裂活性およびトランスフェクション能力
を、強力に低下させることができる。活性核輸送は、低下したトランスフェクシ
ョン効率のこの効果を消失させる。
【００５２】 エレクトロポレーションのために、水に溶解した５μｇの直線化ベクター−Ｄ
ＮＡを、２５μＭのＰＮＡ−ＮＬＳ
ＮＡを、２５μＭのＰＮＡ−ＮＬＳ
【数７】 を有するかまたは有しない１０μｌの最終容積において、１０分間６５℃でイン
キュベートした。他の手順は、例１に記載した通りであった。
キュベートした。他の手順は、例１に記載した通りであった。
【００５３】 リポフェクションのために、水に溶解した３μｇのベクター−ＤＮＡを、２５
μＭのＰＮＡ−ＮＬＳ（ペプチド３）を有するかまたは有しない１０μｌの最終
容積において、１０分間６５℃でインキュベートした。リポフェクタミン(Life
Technologies GmbH, Karlsruhe)でのトランスフェクションを、製造者の指示に
従って実施した。 ＣＨＯ細胞の分裂をほぼ阻害するために、細胞を、血清なしで２４時間インキ
ュベートし、続いて血清および２０μｇ／ｍｌのアフィジコリン(Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Deisenhofen)を用いて１２時間インキュベートした。リポフェク
ションのすべてのその後の段階を、２０μｇ／ｍｌのアフィジコリンの存在下で
実施した。トランスフェクションの結果を、図１に示す。
μＭのＰＮＡ−ＮＬＳ（ペプチド３）を有するかまたは有しない１０μｌの最終
容積において、１０分間６５℃でインキュベートした。リポフェクタミン(Life
Technologies GmbH, Karlsruhe)でのトランスフェクションを、製造者の指示に
従って実施した。 ＣＨＯ細胞の分裂をほぼ阻害するために、細胞を、血清なしで２４時間インキ
ュベートし、続いて血清および２０μｇ／ｍｌのアフィジコリン(Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Deisenhofen)を用いて１２時間インキュベートした。リポフェク
ションのすべてのその後の段階を、２０μｇ／ｍｌのアフィジコリンの存在下で
実施した。トランスフェクションの結果を、図１に示す。
【００５４】 ほとんどの発現ベクター中に存在する配列と結合した２つの電気的に中性のＮ
ＬＳは、トランスフェクションの直後にトランスフェクトされた細胞の百分率を
２倍にすることができるが、数個の細胞が分裂するのみである。アフィジコリン
を用いた細胞分裂速度の減少により生じたトランスフェクション効率の低下を、
このようにして消失させることができる。
ＬＳは、トランスフェクションの直後にトランスフェクトされた細胞の百分率を
２倍にすることができるが、数個の細胞が分裂するのみである。アフィジコリン
を用いた細胞分裂速度の減少により生じたトランスフェクション効率の低下を、
このようにして消失させることができる。
【００５５】例４：配列特異的結合ＮＬＳ−融合タンパク質 大腸菌ｌａｃレプレッサーの高親和性結合突然変異体を、配列特異性ＤＮＡ結
合タンパク質として用いた。この突然変異体は、ｌａｃオペレーター配列につい
て１０−１５Ｍの結合定数を有する(Kolkhof, 1992)。高い親和性は、セリン６
１のロイシンへのアミノ酸置換により達成される。
合タンパク質として用いた。この突然変異体は、ｌａｃオペレーター配列につい
て１０−１５Ｍの結合定数を有する(Kolkhof, 1992)。高い親和性は、セリン６
１のロイシンへのアミノ酸置換により達成される。
【００５６】 ここで用いる核輸送タンパク質は、最後の３０個のＣ末端アミノ酸（位置３３
１〜３６０）の欠失および位置３３０におけるロイシンのセリンへの置換を有す
る。これらの突然変異タンパク質は、ホモ四量体の代わりにホモ二量体を形成し
、従って２つの部位の代わりに１つの単一ＤＮＡ結合部位を含む。しかしまた、
四量体を、本発明の核輸送剤として用いることができる。
１〜３６０）の欠失および位置３３０におけるロイシンのセリンへの置換を有す
る。これらの突然変異タンパク質は、ホモ四量体の代わりにホモ二量体を形成し
、従って２つの部位の代わりに１つの単一ＤＮＡ結合部位を含む。しかしまた、
四量体を、本発明の核輸送剤として用いることができる。
【００５７】 二量体変種は各々、Ｎ末端において１つのＮＬＳについて伸長された：
【数８】
【数９】 （ＮＬＳ配列は、太字で示し、それぞれ配列番号８および配列番号９に対応する
。配列
。配列
【数１０】 は、前に特定した大腸菌ｌａｃレプレッサーを示す。）
【００５８】 ＮＬＳ１は、ＳＶ４０ウィルス大Ｔ抗原のＮＬＳに対応する。ＮＬＳ２は、Ｓ
Ｖ４０−ＮＬＳから成る中性の正味電荷を有するハイブリッドおよびポリオーマ
ウィルスＶＰ−２タンパク質からのＮＬＳのＮ末端側方領域を示す。 ｌａｃオペレーター配列は、多くの発現ベクター中に見出すことができ、ＰＣ
Ｒプライマーの拡張として任意の配列に容易に接合することができる。
Ｖ４０−ＮＬＳから成る中性の正味電荷を有するハイブリッドおよびポリオーマ
ウィルスＶＰ−２タンパク質からのＮＬＳのＮ末端側方領域を示す。 ｌａｃオペレーター配列は、多くの発現ベクター中に見出すことができ、ＰＣ
Ｒプライマーの拡張として任意の配列に容易に接合することができる。
【００５９】例５：ＮＬＳを含むｌａｃレプレッサー突然変異体のＤＮＡ結合 以下のｌａｃ−オペレーター配列を、結合アッセイに用いた。 天然に存在するオペレーター：
【数１１】 および完全にパリンドロームである(palindromic)のオペレーター配列：
【数１２】
【００６０】 長さ１ｋｂの放射活性に標識したＤＮＡフラグメント０．７ｎｇを、長さ９１
４ｂｐおよび８６ｂｐのフラグメント中に制限ヌクレオチド鎖切断消化により開
裂し、次に、それぞれ、ｌａｃ−レプレッサーＮＬＳ−１−二量体またはＮＬＳ
−２−二量体と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、フラグメントを
、ポリアクリルアミドゲル上で分離した（図２）。ｌａｃ−オペレーターを含む
８６ｂｐフラグメントを、特異的結合により阻害する。非特異的結合の結果、ｌ
ａｃ−オペレーターを欠く９１４ｂｐ−フラグメントが阻害された。完全な特異
的結合の場合において、非特異的結合は、ほとんど観察されなかった。
４ｂｐおよび８６ｂｐのフラグメント中に制限ヌクレオチド鎖切断消化により開
裂し、次に、それぞれ、ｌａｃ−レプレッサーＮＬＳ−１−二量体またはＮＬＳ
−２−二量体と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、フラグメントを
、ポリアクリルアミドゲル上で分離した（図２）。ｌａｃ−オペレーターを含む
８６ｂｐフラグメントを、特異的結合により阻害する。非特異的結合の結果、ｌ
ａｃ−オペレーターを欠く９１４ｂｐ−フラグメントが阻害された。完全な特異
的結合の場合において、非特異的結合は、ほとんど観察されなかった。
【００６１】 さらなる実験は、安定な結合が、種々の条件を用いて、例えば細胞培養培地Ｒ
ＰＭＩ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、１０ｍＭの塩化カリウムおよび３ｍＭの酢酸マグネシウムから成る緩衝液
において、両方の試験したオペレーター配列と共に達成されることを例証した。
ＰＭＩ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、１０ｍＭの塩化カリウムおよび３ｍＭの酢酸マグネシウムから成る緩衝液
において、両方の試験したオペレーター配列と共に達成されることを例証した。
【００６２】例６：ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳによるＤＮＡの核輸送 約８μｇ（１００pmol）のｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳ−突然変異体を、長
さ３０ｂｐの二重らせんＤＮＡ２μｇ（１００pmol）と共にインキュベートし、
両方の末端において蛍光染料Ｃｙ５で３０分間室温で、１０ｍＭのトリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭの酢酸Ｍｇおよび５０μｇ／ｍｌ
のＢＳＡの合計容積３００μｌ中で標識した。非結合ＤＮＡを、マイクロコンフ
ィルター(Microcon-filter)(Amicon)を通しての遠心分離により分離した。次に
、試料の緩衝液を、細胞注入緩衝液（７６ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１７ｍＭのＫＨ ２ ＰＯ４、１４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２））に交換した。
さ３０ｂｐの二重らせんＤＮＡ２μｇ（１００pmol）と共にインキュベートし、
両方の末端において蛍光染料Ｃｙ５で３０分間室温で、１０ｍＭのトリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭの酢酸Ｍｇおよび５０μｇ／ｍｌ
のＢＳＡの合計容積３００μｌ中で標識した。非結合ＤＮＡを、マイクロコンフ
ィルター(Microcon-filter)(Amicon)を通しての遠心分離により分離した。次に
、試料の緩衝液を、細胞注入緩衝液（７６ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１７ｍＭのＫＨ ２ ＰＯ４、１４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２））に交換した。
【００６３】 ｌａｃ−レプレッサー突然変異体に結合したＤＮＡおよびフルオレセイン標識し
たＢＳＡ（ＢＳＡ−ＦＩＴＣ）から成る混合物を、それぞれ５０のＮＩＨ３Ｔ３
細胞中に微量注入(microinjection)した（Femtotipsを有するEppendorf Transje
ktor 5246、直径０．５μｍ、注入の圧力５５ｈＰａ、注入の時間０．５秒）。
注入の１０〜１５分後に、細胞を、蛍光顕微鏡法により分析した（図３）。細胞
質中への好首尾の注射に続いて、ＢＳＡ−ＦＩＴＣは、細胞質中に独占的に存在
する（１ａ、２ａおよび３ａ）。ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳ突然変異体への
結合の結果、分析することができるほとんどすべての細胞において、細胞質中に
ＤＮＡをほとんど残さずに、それぞれ１５分以内（ＮＬＳ１−二量体、２ｂ）お
よび１０分以内（ＮＬＳ２−二量体、３ｂ）にＤＮＡの核中への輸送が生じた。
対照は、結合タンパク質を有しない標識したＤＮＡが細胞質中に残留することを
例証する（１ｂ）。
たＢＳＡ（ＢＳＡ−ＦＩＴＣ）から成る混合物を、それぞれ５０のＮＩＨ３Ｔ３
細胞中に微量注入(microinjection)した（Femtotipsを有するEppendorf Transje
ktor 5246、直径０．５μｍ、注入の圧力５５ｈＰａ、注入の時間０．５秒）。
注入の１０〜１５分後に、細胞を、蛍光顕微鏡法により分析した（図３）。細胞
質中への好首尾の注射に続いて、ＢＳＡ−ＦＩＴＣは、細胞質中に独占的に存在
する（１ａ、２ａおよび３ａ）。ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳ突然変異体への
結合の結果、分析することができるほとんどすべての細胞において、細胞質中に
ＤＮＡをほとんど残さずに、それぞれ１５分以内（ＮＬＳ１−二量体、２ｂ）お
よび１０分以内（ＮＬＳ２−二量体、３ｂ）にＤＮＡの核中への輸送が生じた。
対照は、結合タンパク質を有しない標識したＤＮＡが細胞質中に残留することを
例証する（１ｂ）。
【００６４】例７：ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳでのトランスフェクション 完全発現カセットおよび完全なパリンドロームであるｌａｃ−オペレーター配
列が続くポリアデニル化配列を含む、長さ１．１ｋｂの直線状ＤＮＡ１μｇを、
５０μｌの等張０．５×ＲＰＭＩ（リポフェクションについて）または１５０ｍ
ＭＮａＣｌ（ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションについて）中で
、３０分間室温で、種々の濃度のｌａｃ−レプレッサータンパク質（それぞれ約
２．５μｇ、０．３μｇおよび０，１５μｇの二量体および５μｇ、０．６μｇ
および０．３μｇの四量体）と共にインキュベートした。試料を、リポフェクタ
ミン(Life Technologies)またはポリエチレンイミン(PEI, ExGen 500, Fermenta
s)と、製造者の指示に従って複合させ、コンフルエントなＮＩＨ３Ｔ３細胞に加
えた。結果を図４に示す。
列が続くポリアデニル化配列を含む、長さ１．１ｋｂの直線状ＤＮＡ１μｇを、
５０μｌの等張０．５×ＲＰＭＩ（リポフェクションについて）または１５０ｍ
ＭＮａＣｌ（ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションについて）中で
、３０分間室温で、種々の濃度のｌａｃ−レプレッサータンパク質（それぞれ約
２．５μｇ、０．３μｇおよび０，１５μｇの二量体および５μｇ、０．６μｇ
および０．３μｇの四量体）と共にインキュベートした。試料を、リポフェクタ
ミン(Life Technologies)またはポリエチレンイミン(PEI, ExGen 500, Fermenta
s)と、製造者の指示に従って複合させ、コンフルエントなＮＩＨ３Ｔ３細胞に加
えた。結果を図４に示す。
【００６５】 トランスフェクションの４時間後に決定されたトランスフェクション効率を、
ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳにより、３〜４倍増大させることができる。ここ
に記載する例において、付着ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、トランスフェクションの前に
集密的に培養し、細胞分裂の広範囲の阻害を生じさせた。トランスフェクション
の４時間後、少数の細胞のみが分裂した。本例においていずれにしても限定され
た分裂速度が、トランスフェクションと関連するものとなった期間は、エンドサ
イトーシスにより取り込まれたトランスフェクトされたＤＮＡが、これが発現さ
れるべき核に輸送されることができる前に、エンドソームおよびその後陽イオン
性トランスフェクション試薬との複合体を残さなければならないという事実によ
り、さらに減少する。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体は、おそらくポリエチレ
ンイミンとのＤＮＡ複合体よりも顕著に長く存続し、リポフェクタミンを用いた
ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳの比較的明らかでない効果を生じる。２４時間後
にほとんどの細胞が分裂した後、核輸送試薬を有するおよび有しないトランスフ
ェクトされたＤＮＡの発現速度は、次第に近似する。
ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳにより、３〜４倍増大させることができる。ここ
に記載する例において、付着ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、トランスフェクションの前に
集密的に培養し、細胞分裂の広範囲の阻害を生じさせた。トランスフェクション
の４時間後、少数の細胞のみが分裂した。本例においていずれにしても限定され
た分裂速度が、トランスフェクションと関連するものとなった期間は、エンドサ
イトーシスにより取り込まれたトランスフェクトされたＤＮＡが、これが発現さ
れるべき核に輸送されることができる前に、エンドソームおよびその後陽イオン
性トランスフェクション試薬との複合体を残さなければならないという事実によ
り、さらに減少する。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体は、おそらくポリエチレ
ンイミンとのＤＮＡ複合体よりも顕著に長く存続し、リポフェクタミンを用いた
ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳの比較的明らかでない効果を生じる。２４時間後
にほとんどの細胞が分裂した後、核輸送試薬を有するおよび有しないトランスフ
ェクトされたＤＮＡの発現速度は、次第に近似する。
【００６６】
【外１】
【００６７】
【外２】
【００６８】
【外３】
【００６９】
【外４】
【００７０】
【外５】
【配列表】
【図１】ＰＮＡ−ＮＬＳを用いたトランスフェクションの結果を示す図である
。
。
【図２】ＮＬＳを含むｌａｃレプレッサー突然変異体のＤＮＡ結合の結果を示
す図である。
す図である。
【図３】ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳによるＤＮＡの核輸送を示す細胞の蛍
光顕微鏡による観察を示す図である。
光顕微鏡による観察を示す図である。
【図４】ｌａｃ−レプレッサー−ＮＬＳでのトランスフェクションの結果を示
す図である。
す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月２日（２００１．３．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 41/00 41/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 HA17 4C076 AA95 BB11 CC01 CC07 CC27 CC41 EE41 EE59 FF68 4C084 AA13 NA13 NA14 ZA011 ZB071 ZB212 ZB261 ZB331 ZC412
Claims (17)
- 【請求項１】 ２つのモジュールＡおよびＢから成り、モジュールＡが、Ｄ
ＮＡに特異的に結合し、２つ以上のＤＮＡ分子を含む複合体の形成を生じず、モ
ジュールＢが、核輸送剤のＤＮＡへの非特異的結合を媒介しない核局在シグナル
を含む、核輸送剤。 - 【請求項２】 モジュールＡが、配列をＤＮＡと特異的に結合させ、請求項
１に記載の核輸送剤。 - 【請求項３】 モジュールＡが、ＤＮＡ末端と特異的に結合する、請求項１
に記載の核輸送剤。 - 【請求項４】 モジュールＡが、ペプチド、タンパク質またはＰＮＡ（ペプ
チド核酸）である、請求項１〜３のいずれかに記載の核輸送剤。 - 【請求項５】 モジュールＢが、この電荷によってＤＮＡと複合体を形成し
ない伸長核局在シグナルを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の核輸送剤。 - 【請求項６】 モジュールＢが、ほぼ中性の正味電荷を有する伸長核局在シ
グナルを含む、請求項５に記載の核輸送剤。 - 【請求項７】 モジュールＢが、核局在シグナルおよび側方の負に帯電した
アミノ酸を含む伸長核局在シグナルを含む、請求項６に記載の核輸送剤。 - 【請求項８】 モジュールＢが、核局在シグナルまたは伸長核局在シグナル
に加えて、核局在シグナルに直接属さない追加のペプチド配列または非ペプチド
成分を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の核輸送剤。 - 【請求項９】 モジュールＡがＰＮＡであり、モジュールＢがＮＬＳシグナ
ルの代わりにまたはＮＬＳシグナルに加えて非ＮＬＳシグナルを含む、請求項１
に記載の核輸送剤。 - 【請求項１０】 モジュールＡがＤＮＡに配列特異的方式で結合するタンパ
ク質であり、モジュールＢがＮＬＳシグナルの代わりにまたはＮＬＳシグナルに
加えて非ＮＬＳシグナルを含む、請求項１に記載の核輸送剤。 - 【請求項１１】 非ＮＬＳシグナルが、ＤＮＡ取り込みを媒介することがで
きる細胞表面構造のためのリガンド、膜を不安定化するペプチドおよび細胞中で
輸送構造への結合を媒介するシグナル、並びに核中で保持を生じるシグナルから
成る群から選択されている、請求項９に記載の核輸送剤。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核輸送剤および陽イオ
ン性脂質、ペプチド、ポリアミンまたは陽イオン性重合体を含む、遺伝子輸送シ
ステム。 - 【請求項１３】 ＤＮＡを真核細胞の核中に輸送する方法において、該細胞
が、輸送されるべきＤＮＡおよび請求項１〜１１のいずれかに記載の核輸送剤で
トランスフェクトされる、前記方法。 - 【請求項１４】 真核細胞が、一次細胞である、請求項１３に記載の方法。
- 【請求項１５】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核輸送剤を含む、医薬
組成物。 - 【請求項１６】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核輸送剤の、遺伝子治
療における使用。 - 【請求項１７】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核輸送剤の、癌、ウィ
ルス感染、神経系の疾患、移植片拒絶反応および単一遺伝子または多遺伝子性遺
伝性疾患の治療のための遺伝子治療における使用。
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